JP4122580B2 - Hexulose phosphate isomerase gene - Google Patents

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ヘキシュロースリン酸イソメラーゼをコードするＤＮＡ及びヘキシュロースリン酸イソメラーゼを製造する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
メチロトローフ細菌のＣ１代謝には、リブロースモノリン酸経路が知られている。この経路は、リブロース ５−リン酸によるホルムアルデヒドの固定に始まり、フルクトース ６−リン酸の開裂、リブロース ５−リン酸の再生の３つの段階により構成されている。リブロースモノリン酸経路は、いくつかの代謝系と共役した経路であり、この経路に関与する各酵素の遺伝子構造に興味が持たれていたが、本経路に関する報告は少なく、遺伝子的な解析もほとんどなされていない。
【０００３】
リブロースモノリン酸経路の初発反応を触媒する３−ヘキシュロース−６−リン酸シンターゼ（3-hexulose-6-phosphate synthase、以下「ＨＰＳ」ともいう。）については、グラム陰性の偏性メタノール資化菌であるメチロモナス アミノファシエンス（Methylomonas aminofaciens）において既に精製され、これをコードする遺伝子がクローニングされ、一次構造が報告されている（Yanase, H. et al., FEMS Microbiol. Lett., 135, 201-205 (1996)）。
【０００４】
ところで、目的化合物分子上の特異的な位置が、安定同位元素炭素13（¹³C）で標識されている生化学物質は、生物代謝経路の研究に役立つ。更に近年、代謝産物の生体内での様子を、炭素13-NMRの技術を用いて調べる事は、いろいろな病気の診断や日々の健康診断において、大変重要な手法になってきている。その様な新しい技術には、ある目的の位置を炭素13で標識した化合物が、安価に提供できる事が必要であり、また望まれていた。
【０００５】
本発明者らは、メタノール資化菌のホルムアルデヒド固定経路を利用し、炭素13標識のメタノールから、［1-¹³C］Ｄ−グルコース ６−リン酸の調製方法を確立していたが、目的化合物の合成収率はあまり高くなかった（Biosci.Biotech.Biochem.57,308-312 (1993)）。
【０００６】
そこで、目的産物のみを効率よく生産させる系が望まれていた。そのような系の一つとして、標識ホルムアルデヒドとリブロース ５−リン酸を用い、標識Ｄ−フルクトース ６−リン酸を合成する一連の各酵素を調製し、これらを用いた反応系で、効率よい目的標識化合物の調製を行うという方法が考えられる。その反応の最初の酵素であるＨＰＳは、上述したようにメチロモナス アミノファシエンスではその遺伝子が単離され、構造も明らかとなっている。しかし、その次の段階の反応を触媒する酵素であるヘキシュロースリン酸イソメラーゼ（hexulose-phosphate isomerase、以下「ＨＰＩ」ともいう。あるいは、本酵素は、phospho-3-hexuloisomerase、ホスホ−３−ヘキシュロイソメラーゼ、（ＰＨＩ）ともいう。）は、部分的に精製されていたに過ぎず、そのアミノ酸配列も遺伝子構造も知られていない。さらに、グラム陽性の通性メタノール資化菌であるマイコバクテリウム属細菌では、ＨＰＳ及びＨＰＩのいずれの酵素についてもアミノ酸配列及び遺伝子構造は報告されていない。
【０００７】
この様な状況下では、効率よい目的標識化合物の調製系の確立の為には、ＨＰＩをコードする遺伝子を単離し、それを用いて効率よくＨＰＩを製造する方法が望まれていた。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は上記観点からなされたものであり、ＨＰＩをコードするＤＮＡ及び該ＤＮＡの利用法を提供することを課題とする。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、グラム陽性の通性メタノール資化菌であるマイコバクテリウムガストリ（Mycobacterium gastri）における、リブロースモノホスフェート経路、特にＨＰＳ及びその遺伝子について研究をしていたところ、偶然に、この株のＨＰＩをコードする遺伝子を発見し、本発明に至った。
すなわち本発明は、下記（Ａ）又は（Ｂ）に示すタンパク質をコードするＤＮＡである。
（Ａ）配列表の配列番号１３に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質。
（Ｂ）配列表の配列番号１３に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、ヘキシュロースリン酸イソメラーゼ活性を有するタンパク質。
【００１０】
前記ＤＮＡとして具体的には、下記（ａ）又は（ｂ）に示すＤＮＡが挙げられる。
（ａ）配列表の配列番号１２に記載の塩基配列のうち、少なくとも塩基番号６０８〜１２０４からなる塩基配列を含むＤＮＡ。
（ｂ）配列表の配列番号１２に記載の塩基配列のうち、少なくとも塩基番号６０８〜１２０４からなる塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ヘキシュロースリン酸イソメラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【００１１】
また、本発明は、前記ＤＮＡが、該ＤＮＡがコードするヘキシュロースリン酸イソメラーゼが発現可能な形態で導入された細胞を提供する。
【００１２】
本発明はさらに、前記細胞を培地で培養し、ヘキシュロースリン酸イソメラーゼを培養物中に生成蓄積させ、該培養物よりヘキシュロースリン酸イソメラーゼを採取することを特徴とするヘキシュロースリン酸イソメラーゼの製造法を提供する。
【００１３】
尚、本発明において、「ヘキシュロースリン酸イソメラーゼ活性」とは、３−ヘキシュロース ６−リン酸とフルクトース ６−リン酸との間の異性化反応を触媒する活性をいう。
【００１４】
【発明の実施の形態】
以下、本発明について、詳細に説明する。
【００１５】
＜１＞本発明のＤＮＡ
本発明のＤＮＡは、後記実施例に示すように、マイコバクテリウム ガストリ染色体ＤＮＡから次のようにして取得したものである。
まず、マイコバクテリウム ガストリ MB19株から、ＨＰＳを精製する。ＨＰＳは、MB19株の無細胞抽出液から、DEAE−セファロースカラムクロマトグラフィー、フェニルセファロースカラムクロマトグラフィー、DEAE−セファロースカラムクロマトグラフィーにより、SDS-PAGE上で単一バンドになるまで精製することができる。各精製工程において、ＨＰＳ活性は、Methods in Enzymology Vol.188，397-401 (1990年)に記載の方法にて測定することができる。
【００１６】
次に、精製ＨＰＳの部分アミノ酸配列を決定し、得られるアミノ酸配列情報を基に、ＰＣＲ（ポリメラーゼ・チェイン・リアクション）用のオリゴヌクレオチドプライマーを合成し、マイコバクテリウム ガストリ MB19株より調製したゲノムDNAを鋳型とするＰＣＲを行う。ゲノムDNAは、Saitoらの方法（Biochim. Biophys. Acta, 72, 619-629 (1963)に記載）により取得することができる。ゲノム調製に用いる菌体を得るための培養は、メタノールを炭素源とし、さらに1%のグリシンを添加した培地を用いると、菌体量が多く取れ、溶菌操作が容易となる。また、溶菌酵素としては、リゾチームのみでは十分な溶菌に至らないが、Ｎ−アセチルムラミダーゼ(N-acethylmuramidase) SGを用いると効果的である。
【００１７】
プライマーとして、配列表の配列番号８及び配列番号９に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを用いると、上記ＰＣＲによって約400bpのDNA断片が得られる。
【００１８】
次に、上記のようにしてＰＣＲにより増幅されるDNA断片をDNAプローブに用いて、マイコバクテリウム ガストリ MB19株ゲノムＤＮＡのPstI切断断片ライブラリーに対してコロニーハイブリダイゼーションを行い、ポジティブクローンを取得する。
【００１９】
上記のようにして得られた約4.1kbの長さのクローン断片のうち、約3kbについて塩基配列を決定した結果を配列表配列番号12に示す。この領域内には３つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）が存在する。各ＯＲＦがコードするアミノ酸配列を、５’末端側から順に、配列番号13〜15に示す。これらのうち、２番目のＯＲＦ（ORF-2）は、ＨＰＳの部分アミノ酸配列と完全に一致したことから、ＨＰＳをコードする遺伝子（以下、「ｈｐｓ」ともいう）であることが示された。一方、一番目のＯＲＦ（ORF-1）は、このＯＲＦを発現させて得られるタンパク質の活性を調べることによって、ＨＰＩをコードする遺伝子（以下、「ｈｐｉ」ともいう）、すなわち本発明のＤＮＡであることが確認された。
【００２０】
上記のように、本発明のＤＮＡは、ＨＰＳの精製及びｈｐｓの単離に付随して偶然取得されたものであるが、本発明のＤＮＡの取得は、ORF-1がＨＰＩをコードしているのではないかとの着想に基づき、ORF-1を発現させ、発現産物の活性を確認することによりなされたものである。ORF-1がコードするアミノ酸配列について、既知の種々のデータベース検索を行ったが、機能が良く知られたポリペプチドとの高い相関は見い出せなかった。
【００２１】
尚、本発明のＤＮＡの単離に用いたマイコバクテリウム ガストリはグラム陽性の通性メタノール資化菌であり、すでにｈｐｓが単離されているメチロモナスアミノファシエンスはグラム陰性の偏性メタノール資化菌であって、両者は分類学的には全く異なる。
【００２２】
本発明のＤＮＡは、上記のようにして取得されたものであるが、本発明によりその塩基配列及びコードするアミノ酸配列が明らかとなったので、これらの塩基配列又はアミノ酸配列に基づいて作製したオリゴヌクレオチドをプローブとするハイブリダイゼーションによって、マイコバクテリウム属細菌、例えばマイコバクテリウム ガストリ MB19株のゲノムＤＮＡライブラリーから取得することができる。また、上記オリゴヌクレオチドをプライマーとし、マイコバクテリウム属細菌のゲノムＤＮＡを鋳型とするＰＣＲを行うことによっても、本発明のＤＮＡは得られる。
【００２３】
ゲノムＤＮＡライブラリーの作製、ハイブリダイゼーション、ＰＣＲ、プラスミドＤＮＡの調製、ＤＮＡの切断及び連結、形質転換等の方法は、Sambrook,J.,Fritsch,E.F.,Maniatis,T.,Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press,1.21(1989)に記載されている。
【００２４】
後記実施例で得られた、本発明のＤＮＡを含み、かつ、トリプトファンオペロンプロモーターの制御下でＨＰＩを発現するプラスミドpT-HPIS-1を含むエシェリヒア コリ（Escherichia coli） JM1O9/pT-HPIS-1は、プライベートナンバーAJ13363が付与され、平成９年８月４日より通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（郵便番号３０５−８５６６ 日本国茨城県つくば市東一丁目１番３号）にＦＥＲＭ Ｐ−１６３６３の受託番号で寄託され、平成１０年１月１６日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、ＦＥＲＭ ＢＰ−６２２５の受託番号で寄託されている。
【００２５】
本発明のＤＮＡは、コードされるＨＰＩの活性が損なわれない限り、１若しくは複数の位置での１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むＨＰＩをコードするものであってもよい。ここで、「数個」とは、アミノ酸残基のタンパク質の立体構造における位置や種類によっても異なる。それは、イソロイシンとバリンのように、アミノ酸によっては、類縁性の高いアミノ酸が存在し、そのようなアミノ酸の違いが、蛋白質の立体構造に大きな影響を与えないことに由来する。具体的には、前記「数個」は、より好ましくは２から１０個である。
【００２６】
上記のようなＨＰＩと実質的に同一のタンパク質をコードするＤＮＡは、例えば部位特異的変異法によって、特定の部位のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むように塩基配列を改変することによって得られる。また、上記のような改変されたＤＮＡは、従来知られている変異処理によっても取得され得る。変異処理としては、ＨＰＩをコードするＤＮＡをヒドロキシルアミン等でインビトロ処理する方法、及びＨＰＩをコードするＤＮＡを保持する微生物、例えばエシェリヒア属細菌を、紫外線照射またはN−メチル−N'−ニトロ−N−ニトロソグアニジン（NTG）もしくは亜硝酸等の通常変異処理に用いられている変異剤によって処理する方法が挙げられる。
【００２７】
また、上記のような塩基の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位等には、ｈｐｉを保持する微生物の個体差、種や属の違いに基づく場合などの天然に生じる変異（mutant又はvariant）も含まれる。
【００２８】
上記のような変異を有するＤＮＡを、適当な細胞で発現させ、発現産物のＨＰＩ活性を調べることにより、ＨＰＩと実質的に同一のタンパク質をコードするＤＮＡが得られる。また、変異を有するＨＰＩをコードするＤＮＡまたはこれを保持する細胞から、例えば配列表の配列番号12に記載の塩基配列のうち、塩基番号６０８〜１２０４からなる塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ＨＰＩ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡを単離することによっても、ＨＰＩと実質的に同一のタンパク質をコードするＤＮＡが得られる。ここでいう「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。
【００２９】
このような条件でハイブリダイズする遺伝子の中には途中にストップコドンが発生したものや、活性中心の変異により活性を失ったものも含まれるが、それらについては、市販の活性発現ベクターにつなぎＨＰＩ活性を前記の方法で測定することによって容易に取り除くことができる。
【００３０】
＜２＞ヘキシュロースリン酸イソメラーゼの製造
上記の本発明のＤＮＡを、適当な宿主−ベクター系を用いて発現させることにより、ＨＰＩを製造することができる。
ｈｐｉ遺伝子を発現させるための宿主としては、エシェリヒア コリ（Escherichia coli）をはじめとする種々の原核細胞、サッカロマイセス セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）をはじめとする種々の真核細胞、動物細胞、植物細胞が挙げられるが、これらの中では原核細胞、特にエシェリヒア コリが好ましい。
【００３１】
上記の宿主にｈｐｉ遺伝子を導入するためのベクターとしては、例えばpUC19、pUC18、pBR322、pHSG299、pHSG298、pHSG399、pHSG398、RSF1010、pMW119、pMW118、pMW219、pMW218等が挙げられる。他にもファージＤＮＡのベクターも利用できる。これらのベクターにｈｐｉ遺伝子を連結して得られる組換えベクターで上記宿主を形質転換することによって、ｈｐｉ遺伝子を導入することができる。また、ｈｐｉ遺伝子を、トランスダクション、トランスポゾン（Berg,D.E. and Berg,C.M.,Bio/Technol.,1,417(1983)）、Ｍｕファージ（特開平２−１０９９８５号）または相同性組換え（Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Lab.(1972)）を用いた方法で宿主のゲノムに組み込んでもよい。
【００３２】
また、ｈｐｉ遺伝子の発現を効率的に実施するために、ＨＰＩをコードするＤＮＡ配列の上流に、宿主細胞内で働くｌａｃ、ｔｒｐ、Ｐ_L等のプロモーターを連結してもよい。ベクターとして、プロモーターを含むベクターを用いると、ｈｐｉ遺伝子と、ベクター及びプロモーターとの連結を一度に行うことができる。このようなベクターとしては、ｔｒｐプロモーターを含むpT13sNco（J. Biochem. 104, 30-34 (1988)に記載）が挙げられる。
【００３３】
形質転換は、例えば、エシェリヒア コリ K-12について報告されているような、受容菌細胞を塩化カルシウムで処理してＤＮＡの透過性を増す方法（ Mandel,M.and Higa,A.,J.Mol.,Biol.,53,159(1970) ）や、バチルス ズブチリスについて報告されているような、増殖段階の細胞からコンピテントセルを調製してＤＮＡを導入する方法（ Duncan,C.H.,Wilson,G.A.and Young,F.E.,Gene,1,153(1977) ）を用いることができる。あるいは、バチルス ズブチリス、放線菌類および酵母について知られているような、ＤＮＡ受容菌の細胞を、組換えＤＮＡを容易に取り込むプロトプラストまたはスフェロプラストの状態にして組換えＤＮＡをＤＮＡ受容菌に導入する方法（ Chang,S.and Choen,S.N.,Molec.Gen.,Genet.,168.111(1979);Bibb,M.J.,Ward,J.M.and Hopwood,O.A.,Nature,274,398(1978);Hinnen,A.,Hicks,J.B.and Fink,G.R.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,75 1929(1978)）も応用できる。これらの方法は、宿主として用いる細胞に応じて適宜選択すればよい。
【００３４】
ｈｐｉ遺伝子としては、発現した時にＨＰＩ活性を有するものであればすべて含まれるが、好ましくは、配列表の配列番号13記載のアミノ酸配列をコードするＤＮＡを含む遺伝子、又は配列表の配列番号12記載の塩基配列のうち塩基番号６０８〜１２０４で表される塩基配列を含むＤＮＡが挙げられる。また、前述のように、コードされるＨＰＩの活性が損なわれない限り、１若しくは複数の位置での１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むＨＰＩをコードするＤＮＡを含むものであってもよい。
【００３５】
上記のようにしてｈｐｉ遺伝子を導入された細胞を培地で培養し、ＨＰＩを培養物中に生成蓄積させ、該培養物よりＨＰＩを採取することにより、ＨＰＩを製造することができる。培養に用いる培地は、用いる宿主に応じて適宜選択すればよい。宿主としてエシェリヒア コリを用い、ｈｐｉをｔｒｐプロモーターで発現させる場合には、M9−カザミノ酸−グルコース培地が好ましい。培養は、37℃で行い、培養開始後数時間後に、ｔｒｐプロモーターの誘導剤であるインドールアクリル酸（IAA）を終濃度25μg/mlになるよう添加し、更に培養を続けると、菌体内にＨＰＩが蓄積する。また、適当な分泌系を用いてＨＰＩを細胞外に分泌生産させる場合には、ＨＰＩは培地中に蓄積する。
【００３６】
上記のようにして製造されるＨＰＩは、必要に応じて、菌体抽出液又は培地からイオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー、溶媒沈殿等、通常の酵素の精製法を用いて精製することができる。
【００３７】
本発明により得られるＨＰＩは、炭素13標識のメタノールから、［1-¹³C］Ｄ−グルコース ６−リン酸を調製するのに利用することができる。この［1-¹³C］Ｄ−グルコース ６−リン酸の調製は、例えば次のようにして行うことができる。メタノール資化酵母キャンヂタ ボイヂニーより調製したアルコールオキシダーゼを用いてメタノールをホルムアルデヒドに酸化する。得られたホルムアルデヒドはＨＰＳの作用で、リブロース ５−リン酸とアルドール縮合してアラビノ−３−ヘキシュロース ６−リン酸を生成させる。この場合、リブロース ５−リン酸は不安定であるので、同じ反応系内でリボース ５−リン酸よりホスホリボイソメラーゼの作用でリブロース ５−リン酸に異性化し、ＨＰＳ反応に供する。上記反応で生成したアラビノ−３−ヘキシュロース ６−リン酸はＨＰＩの作用で、フルクトース ６−リン酸に変換され、更に、これはグルコース ６−リン酸イソメラーゼの作用で、グルコース ６−リン酸に変換される。一般に、メタノール資化性細菌のＨＰＩ含量は、ＨＰＳに比べて著しく低いため、ＨＰＩを上記反応に利用することは困難であったが、本発明によりｈｐｉが単離され、効率よくＨＰＩを製造する方法が提供されたので、上記反応を実用化することが可能となった。
【００３８】
【実施例】
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。
【００３９】
【実施例１】
マイコバクテリウム ガストリ MB19株のｈｐｉ遺伝子のクローニング及びＨＰＩの発現
＜１＞３−ヘキシュロース−６−リン酸シンターゼの精製
マイコバクテリウム ガストリ MB19株を、炭素源がメタノールのみの基本培地〔組成：1%(v/v)メタノール，0.2% NaNO₃，0.2%（NH₄)₂SO₄，0.2% K₂HPO₄，0.1% KH₂PO₄，0.02% MgS0₄・7H₂0，0.02% 酵母エキス，0.2%(v/v)ビタミン溶液（40mgパントテン酸カルシウム塩，20mgイノシトール，40mg ニコチン酸，20mg p-アミノ安息香酸塩，40mg ピリドキシン塩酸塩，0.2mg ビオチン，40mgチアミン塩酸塩を蒸留水100mlに溶解したもの），1%(v/v)微量金属塩溶液（0.2g CaCl₂・2H₂O，0.2g MnS0₄・7H₂0，0.2g ZnS0₄・7H₂0，0.02g CuS0₄・5H₂0，0.1g FeS0₄・7H₂0，0.05g Na₂MoO₄・2H₂0，0.25g H₃B0₃，0.05g KIを蒸留水100mlに溶解したもの）〕にて30℃、24時間、10リッター（L）ジャー培養装置で培養を行い、その培養液10Lから集菌（6500×g にて連続遠心）し、湿菌体80gを得た。
【００４０】
上記菌体を、濃度が10%(w/v)になるように緩衝液Ａ（10mM Tris-HCl(pH8.2)，1mM ジチオスレイトール，5mM 塩化マグネシウム，0.15mM フェニルメチルスルフォニルフルオライド）に懸濁した。次に、その懸濁液中の菌体を、180Wの強度にて超音波破砕し、それを120,000×gにて60分、超遠心分離した後、その上清画分を無細胞抽出液として得た。これを緩衝液Ａで平衡化したDEAE−セファロースイオン交換カラムクロマトグラフィーに供した。この条件で、目的のＨＰＳ蛋白質は、前記カラムに吸着した。そこで、このカラムに対して、高いTris-HCl濃度を含む緩衝液（100mM Tris-HCl(pH8.2)、1mM ジチオスレイトール、5mM 塩化マグネシウム、0.15mM フェニルメチルスルフォニルフルオライド）を用いて、緩衝剤の濃度勾配をかけることで目的ＨＰＳ蛋白質を溶出し、酵素活性画分を回収した結果、約19倍に精製されたＨＰＳ標品を得ることができた。
【００４１】
次に、上記ＨＰＳ標品を、3M NaCl，1mMジチオスレイトール，5mM 塩化マグネシウム，0.15mM フェニルメチルスルフォニルフルオライドを含む10mM リン酸カリウム緩衝液（pH7.0）（緩衝液Ｂ）に対して透析し、同緩衝液で平衡化したフェニルセファロースカラムによる疎水クロマトグラフィーに供した。この条件で、ＨＰＳは吸着した。次に、エチレングリコールを含む緩衝液（50% エチレングリコール、1mM ジチオスレイトール、5mM 塩化マグネシウム、0.15mM フェニルメチルスルフォニルフルオライド、10mM リン酸カリウム緩衝液（pH7.0））を用いて、このカラムに対して、濃度勾配をかけることでタンパク質を溶出し、ＨＰＳ活性を示す画分を集めた。この段階でＨＰＳを31倍に精製できた。
【００４２】
更に、標品の純度を上げる為に、再度、前記と同様の平衡化、溶出条件にて、DEAE−セファロースカラムに供することで、ＨＰＳを収率47%、比活性42倍で、SDS-PAGE上で単一バンドになるまで精製することができた。
【００４３】
なお、各精製工程において、ＨＰＳ活性は、基本的には Methods in Enzymology Vol.188，397-401 (1990年)に記載の方法にて測定した。具体的な方法は以下の通りである。酵素反応キュベットの中に、0.5Mリン酸カリウム緩衝液（pH7.5）0.05ml，50mM 塩化マグネシウム 0.05ml，50mM リボース ５−リン酸 0.05ml，100U/ml ホスホリボイソメラーゼ（シグマ社製）0.05ml，水 0.15mlを入れ、そこへ活性測定の標品を0.05ml添加し、混合した。これを30℃で２分間、プレインキュベーションした後、10mM ホルムアルデヒドを 0.1ml加え、酵素反応を開始した。30℃で5分間の反応後、0.1mlの0.5M HClをその反応液へ添加することで、反応を停止した。そして、その反応溶液を20倍に希釈したものへ、Nash 試薬（Biochem. J., 55, 416 (1953)に記載）を2ml添加し、溶液中のホルムアルデヒドの減少の程度を測定した。なお、対照実験としては、上記のリボース ５−リン酸の代わりに水を加えた反応系を用いた。
【００４４】
＜２＞ｈｐｓ遺伝子のクローニング
上記のようにして得られた精製ＨＰＳをプロテインシーケンサーにかけ、Ｎ末端配列を30残基決定した（MKLQVAIDLLSTEAALELAGKVAEYVDIIE(配列番号１)）。また、リジルエンドベプチダーゼで精製ＨＰＳを処理し、その分解ペプチド断片産物を逆相HPLCにて分画し、各々を上記同様にプロテインシーケンサーにより解析することで、ＨＰＳの内部アミノ酸配列を決定した（VAEYVDIIELGTPLIK(配列番号２)、IVFADMK(配列番号３)、ATRAQEVRALGAK(配列番号４)、FVEMHAGLDEQAK(配列番号５)、ARVPFSVAGGVK(配列番号６)、VATIPAVQK(配列番号７)）。
【００４５】
これらのアミノ酸配列情報を基に、ｈｐｓ遺伝子をＰＣＲにより増幅するためのＮ末端プライマーとして、配列番号８に記載の塩基配列（5'-ATGAARYTICARGTNGCIATHGA-3'）を有するオリゴヌクレオチドを、 そして内部プライマーとして配列番号９に記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチド（5'-CCNGCRTGCATYTCNACRAA‐3'）を化学合成した。これらをプライマーとして用い、マイコバクテリウム ガストリ MB19株より調製したゲノムDNAを鋳型とするＰＣＲを行い、約400bpのDNA断片を得た。鋳型に用いたゲノムDNAの取得は、Saitoらの方法（Biochim. Biophys. Acta, 72, 619-629 (1963)に記載）を参考に行った。培養は、菌体量が多く取れるエタノールを炭素源とした基本培地で行ったが、そのままでは溶菌操作に苦労するということが判明した為、培養液に1%のグリシンを添加した。更に、リゾチームのみでは、十分な溶菌に至らなかったので、種々の可溶化酵素を検討したところ、Ｎ−アセチルムラミダーゼ(N-acethylmuramidase) SGが効果的であったので、これを用いた。またＰＣＲは、宝酒造（株）製のEX Taq-DNA polymeraseを用い、95℃：１分、55℃：１分、72℃：１分という条件の反応を２５回行った。
【００４６】
こうして、上記のようにして得られたDNA断片を、改めてDNAプローブに用いて、各種制限酵素処理を行ったマイコバクテリウム ガストリ MB19株ゲノムDNAに対してジェノミックサザン解析を行ったところ、このプローブは、ゲノムDNAをPstI処理することによって切り出される約4.1kb の大きさのDNA断片とハイブリダイズすることが判った。そこで、この結果を基に、pUC118をベクターとして、これにPstIで切断したマイコバクテリウム ガストリ MB19株ゲノムDNA断片を連結して作製したゲノムライブラリーに対して、先のDNAプローブを用いたコロニーハイブリダイゼーションを行い、ポジティブクローンを取得した。そしてこのクローンより約7.2kbpのプラスミドを得た。このプラスミドをpUHM1と命名した。
【００４７】
＜３＞ｈｐｓ遺伝子の塩基配列決定
次に、プラスミドpUHM1上の挿入DNA断片のDNA塩基配列を約3kb決定した。結果を配列表の配列番号12に示す。その結果、この領域内には３つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）が存在した。各ＯＲＦがコードするアミノ酸配列を、５’末端側から順に、配列番号13〜15に示す。
【００４８】
２番目のＯＲＦ（ORF-2）がコードするタンパク質は、207アミノ酸残基からなるもので、これより求めた分子量は21000であった。この値は、精製ＨＰＳのサブユニットより求めた分子量24000とほぼ一致した。また、ORF-2によってコードされるアミノ酸配列（配列番号14）は、精製した蛋白質から得られた７種のアミノ酸配列（Ｎ末端アミノ酸配列および内部アミノ酸配列）と完全に一致し、これがＨＰＳをコードしている遺伝子（ｈｐｓ）であることが示された。
【００４９】
一方、このｈｐｓ上流のＯＲＦ（ORF-1）のアミノ酸配列を、Blast（Basic Local Alignment Search Tool）プログラムを用いて既知の種々のデータベースに対して検索したところ、機能が良く知られたポリペプチドとの高い相関は見い出せなかった。
【００５０】
＜４＞ORF‐1の発現
上記で得られたｈｐｓの上流にあるORF‐1を強制発現させ、コードされるタンパク質の活性を調べることを試みた。２種のオリゴヌクレオチド、5'-CGAAATCGATAAAAATGACGCAAGCCGCAGAAGCCGACGGCG-3'（配列番号１０）及び(5'-AATTCCAGCTCTAGACAAGGCGGTACGGCG-3'（配列番号１１）を合成し、これらをプライマーとし、プラスミドpUHM1を鋳型としてＰＣＲを行い、ORF-1を含み、その上流末端がClaI部位、そして、下流末端がXbaIであるDNA断片（A）を調製した。
【００５１】
一方、上記DNA断片（A）を発現させるための高発現用プラスミドとして、トリプトファンプロモーターを有するpT13sNco（J. Biochem. 104, 30-34 (1988)に記載）を用いた。pT13sNcoを制限酵素ClaI及びXbaIにて切断し、得られる大きいDNA断片（B）を調製した。これに、上記のDNA断片（A）をT4 DNAリガーゼにて連結することで、ORF-1の発現プラスミドpT-HPIS-1を構築した。
【００５２】
このpT-HPIS-1を用いてエシェリヒア コリ JM1O9株を常法により形質転換し、形質転換体JM109/pT-HPIS-1を得た。一方、DNA断片（A）を含まないプラスミドで形質転換した対照株としては、pT13sNcoのベクター部分である pTTNcoを保持するエシェリヒア コリ JM109株（JM109/pTTNco）を用いた。
【００５３】
これらの形質転換体を、M9−カザミノ酸−グルコース培地で、37℃にて振盪培養し、約２時間後に、トリプトファンプロモーターからの転写の誘導剤であるインドールアクリル酸（IAA）を終濃度25μg/mlになるよう添加し、更に培養を４時間続け、その後、培養液1.5mlを集菌した。この菌体へ、0.1Mリン酸カリウム緩衝液（pH7.5）を 0.5ml添加し、懸濁した。次に、菌体を超音波破砕後、遠心分離（15000rpm×５分）し、可溶性画分を酵素標品とした。
【００５４】
上記酵素標品について、ＨＰＩ活性の測定を行った。活性測定法は、ホルムアルデヒドの同化を、最終的にグルコース−６−リン酸脱水素酵素による酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸の還元化を測定するという方法をとった。
【００５５】
具体的には、反応液〔20mMリン酸カリウム（pH7.5），1mM塩化マグネシウム，1mM リボース ５−リン酸、0.8mM NADP⁺（酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸），3U/ml ホスホリボイソメラーゼ（シグマ社製）、3.5U/ml ホスホグルコイソメラーゼ（ベーリンガー社製），3.5U/ml グルコース−６−リン酸脱水素酵素（ベーリンガー社製）、3U/ml ＨＰＳを、0.9mlずつ分光光度計用のキュベット（標品用と対照用）に入れ、その後、各々のキュベットに菌体可溶性画分を0.05mlづつ加え、混合した。30℃で２分間保温後、対照用のキュベットには水0.05mlを、標品用のキュベットには0.1Mホルムアルデヒドを0.05ml加えることで反応を開始し、NADP⁺の還元に伴う340nm波長光の吸光度上昇を指標にＨＰＩ活性を測定した。尚、この活性測定に用いたＨＰＳは、FEMS microbiology letter 135,201-205 (1996)に記載された公知の方法で、メチロモナス アミノファシエンス 77a株由来のｈｐｓ遺伝子をエシェリヒア コリに組み込んだ株を用いて量産化したＨＰＳを、Agric.Biol.Chem.,41,1133-1140 (1997)に記載の公知の方法にて精製したものを用いた。
【００５６】
その結果、対照株（JM109/pTTNco）から得られた細胞抽出液を用いた場合は、ＨＰＩ酵素活性は全く示さなかったが、JMIO9/pT-HPIS-1の抽出液を用いた場合は、明らかなＨＰＩ酵素活性を偶然にも検出できた。このことから、ORF-1は、ＨＰＩをコードする遺伝子であることが示された。
【００５７】
上記のように取得されたマイコバクテリウム ガストリ MB19株のｈｐｉ遺伝子と、メチロモナス アミノファシエンス 77a株から上記と同様にしてクローニングされたｈｐｉ遺伝子について、コードされるＨＰＩのアミノ酸を比較したところ、相同性が認められた。全く同一のアミノ酸における相同性は約30%、類似するアミノ酸も含めた相同性は約69%であった。
【００５８】
【実施例２】
バチルス ズブチリス 168株のｈｐｉ遺伝子の同定
＜１＞ＨＰＳアミノ酸配列のデータベース検索
上記の実施例１のごとく取得したマイコバクテリウム ガストリ MB19株のＨＰＩのアミノ酸配列について、既存のアミノ酸配列のデータバンクに対して、機能未知なＯＲＦも含めて相同性検索を行った。なお、この検索は、データバンクはSWISS-PROT Rel.34を用い、Genetyx-Mac（ソフトウエア開発株式会社）の検索システムにて行った。その結果、マイコバクテリウム ガストリ MB19株のｈｐｉ遺伝子のアミノ酸配列と高度に相同性のあるものは、バチルス ズブチリス 168株の機能未知遺伝子であるyckF（配列番号16）であった。
【００５９】
マイコバクテリウム ガストリ MB19株のＨＰＩのアミノ酸配列とバチルス ズブチリス 168株のyckFがコードするアミノ酸配列（配列番号17）を比較したところ、全く同一のアミノ酸における相同性は約３５％、類似するアミノ酸も含めた相同性は約７６％であった。このように、本来、メタノールなどのＣ１化合物の資化とは無関係なバチルス ズブチリスに、ＨＰＩと相同性の高いタンパク質をコードする遺伝子が存在していたことは予想外であった。そこで、このyckFがＨＰＩ活性を保持しているかどうかを調べるために、yckF遺伝子をバチルス ズブチリスより単離し、これを発現ベクターに組み込み、得られた組換えベクターをエシェリヒア コリ細胞中へ導入し、細胞粗抽出液中のＨＰＩ活性を測定した。
【００６０】
＜２＞バチルス ズブチリスのyckF遺伝子のクローニング
既に、バチルス ズブチリスの全ゲノム塩基配列は決定されているため（Nature, Vol.390, pp249, 1997）、その塩基配列情報を基に、yckFを含むDNA断片をPCRにて増幅した。用いたDNAプライマーは、Ｎ末端側の上流に制限酵素ClaI切断部位を有するプライマーとして、配列番号18に記載の塩基配列(5'-AAGCATCGATAAAATGAAAACGACTGAATACGTAGCGGAA-3') を有するオリゴヌクレオチドを、そしてＣ末端側の下流に制限酵素BamHI切断部位を有するプライマーとして配列番号19に記載の塩基配列(5'-ATCTTGGATCCGGTTGTGTGATGTTATTCAAGGTTTGCG-3') を有するオリゴヌクレオチドを化学合成した。これをプライマーとしてバチルス ズブチリス 168株より調製したゲノムDNAを鋳型とするPCRを行い、約550bpの大きさの増幅されたDNA断片を得た。なお、鋳型に用いたゲノムDNAの取得は、Saito らの方法（Biochim. Biophys. Acta, 72, 619-629 (1963)に記載）を参考に行った。またＰＣＲは、宝酒造（株）製のLA-Taq酵素を用い、94℃、90秒の熱処理後、98℃：10秒、58℃：20秒、70℃：60秒という条件の反応を２８回行い、その後、70℃、3分間の反応を行った。
【００６１】
上記のようにして得られたDNA断片を、フェノール処理、アルコール沈澱等で精製した後、適当な酵素反応用の緩衝液に溶解し、制限酵素ClaI及びBamHIを添加し、37℃にて１時間処理した。そして、この反応液を0.8%アガロースのゲル電気泳動に供し、両端に各々、ClaI、BamHI切断端をもつDNA断片を分離した。その後、このアガロースゲルより目的のDNA断片を精製し、yckFを含むDNA断片を得た。
【００６２】
＜２＞バチルス ズブチリスのyckF遺伝子の発現及び酵素活性の確認
上記のようにして得られたyckF遺伝子を発現させるため為の高発現用プラスミドとして、実施例１と同じく、トリプトファンプロモーターを有するpT13sNcoを用いた。pT13sNcoを制限酵素ClaI及びBamHIにて切断し、得られる大きいDNA断片を調製した。これに、上記のyckFを含むDNA断片をT4-DNAリガーゼにて連結することで、yckFの発現プラスミドpT-Bsb-yckF1を構築した。
【００６３】
このpT-Bsb-yckFを用いて、エシェリヒア コリ JM109株を常法により形質転換し、形質転換体JM109/ pT-Bsb-yckF1を得た。尚、JM109/ pT-Bsb-yckF1は、プライベートナンバーAJ13441が付与され、平成１０年５月８日より、通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（郵便番号３０５−８５６６ 日本国茨城県つくば市東一丁目１番３号）に寄託されており、受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−６３４５が付与されている。
【００６４】
一方、yckFを含むDNA断片を含まないプラスミドで形質転換した対照株としては、pT13sNcoのベクター部分であるpTTNcoを保持するエシェリヒア コリ JM109株(JM109/pTTNco)を用いた。
【００６５】
これらの形質転換体を、M9-カザミノ酸-グルコース培地で、37℃にて振盪培養し、約２時間後に、トリプトファンプロモーターからの転写の誘導剤であるインドールアクリル酸を終濃度25μg/ml になるよう添加し、更に培養を８時間続けた。その後、培養液を集菌し、実施例１と同様にして、菌体の可溶性画分を調製した後、HPI活性を測定した。
【００６６】
その結果、対照株(JM109/pTTNco)から得られた細胞抽出液を用いた場合は、ＨＰＩ酵素活性は見られなかったが、JM109/pT-Bsb-yckF1の抽出液を用いた場合には、明らかなＨＰＩ活性を検出した。このことから、バチルス ズブチリス 168株中の機能未知ＯＲＦであるyckF（配列番号16）は、ＨＰＩをコードするものであることが、はじめて明らかになった。また、バチルス ズブチリスはメタノール等のＣ１化合物を資化することができないため、ｈｐｉ遺伝子を有するとは考えられていなかったが、該遺伝子を有することが明らかとなった。
【００６７】
【発明の効果】
本発明方法によれば、ヘキシュロースリン酸イソメラーゼをコードするＤＮＡが得られ、該酵素を効率よく生産することが可能となり、ひいては、医療や生化学的基礎研究に重要で必要となる標識化合物を大量に安価に提供できることになる。
【００６８】
【配列表】

【００７０】

【００７１】

【００７２】

【００７３】

【００７４】

【００７５】

【００７６】

【００７７】

【００７８】

【００７９】

【００８０】

【００８１】

【００８２】

【００８３】

Leu Gln
【００８４】

【００８５】

【００８６】

【００８７】

[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a DNA encoding hexulose phosphate isomerase and a method for producing hexulose phosphate isomerase.
[0002]
[Prior art]
The ribulose monophosphate pathway is known for the C1 metabolism of methylotrophic bacteria. This pathway begins with immobilization of formaldehyde with ribulose 5-phosphate, and consists of three stages: cleavage of fructose 6-phosphate and regeneration of ribulose 5-phosphate. The ribulose monophosphate pathway is a pathway coupled to several metabolic systems, and was interested in the gene structure of each enzyme involved in this pathway. Not done.
[0003]
About 3-hexulose-6-phosphate synthase (hereinafter also referred to as “HPS”), which catalyzes the initial reaction of the ribulose monophosphate pathway, is a gram-negative obligate methanol-utilizing bacterium. Already purified in one Methylomonas aminofaciens, the gene encoding it has been cloned and the primary structure has been reported (Yanase, H. et al., FEMS Microbiol. Lett., 135, 201-205). (1996)).
[0004]
By the way, the specific position on the target compound molecule is stable isotope carbon 13 (¹³Biochemicals labeled with C) are useful for studying biological metabolic pathways. In recent years, investigating the state of metabolites in vivo using carbon 13-NMR technology has become a very important technique in the diagnosis of various diseases and daily health examinations. Such a new technique requires and is desired that a compound labeled with carbon 13 at a certain target position can be provided at low cost.
[0005]
The present inventors have utilized the formaldehyde fixation pathway of methanol-utilizing bacteria, and from carbon-13-labeled methanol, [1-¹³C] Although the preparation method of D-glucose 6-phosphate was established, the synthesis yield of the target compound was not so high (Biosci. Biotech. Biochem. 57, 308-312 (1993)).
[0006]
Therefore, a system that efficiently produces only the target product has been desired. As one of such systems, a series of enzymes for synthesizing labeled D-fructose 6-phosphate are prepared using labeled formaldehyde and ribulose 5-phosphate, and the reaction system using them prepares an efficient purpose. A method of preparing a labeled compound is conceivable. As described above, HPS, which is the first enzyme in the reaction, has been isolated in Methylomonas aminofaciens, and its structure has been clarified. However, hexulose-phosphate isomerase (hereinafter also referred to as “HPI”), which is an enzyme that catalyzes the reaction of the next step. Alternatively, this enzyme is phospho-3-hexuloisomerase, phospho-3-hexase. Schroisomerase (also referred to as (PHI)) was only partially purified, and its amino acid sequence and gene structure are not known. Furthermore, in the genus Mycobacterium, which is a Gram-positive facultative methanol-utilizing bacterium, no amino acid sequence or gene structure has been reported for any of the HPS and HPI enzymes.
[0007]
Under such circumstances, in order to establish an efficient preparation system for a target labeling compound, a method for isolating a gene encoding HPI and using it efficiently to produce HPI has been desired.
[0008]
[Problems to be solved by the invention]
This invention is made | formed from the said viewpoint, and makes it a subject to provide the usage method of DNA which codes HPI, and this DNA.
[0009]
[Means for Solving the Problems]
The present inventors have studied the ribulose monophosphate pathway, particularly HPS and its gene, in Mycobacterium gastri, a Gram-positive facultative methanol-utilizing bacterium. A gene encoding the HPI of the strain was discovered and the present invention was achieved.
That is, the present invention is a DNA encoding the protein shown in the following (A) or (B).
(A) A protein having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 13 in the sequence listing.
(B) a hexulose phosphate isomerase consisting of an amino acid sequence comprising one or several amino acid substitutions, deletions, insertions, additions or inversions in the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 13 in the sequence listing Protein with activity.
[0010]
Specific examples of the DNA include DNAs shown in the following (a) or (b).
(A) DNA containing a base sequence consisting of at least base numbers 608 to 1204 among the base sequences set forth in SEQ ID NO: 12 in the sequence listing.
(B) a protein that hybridizes under stringent conditions with at least the nucleotide sequence consisting of nucleotide numbers 608 to 1204 among the nucleotide sequences set forth in SEQ ID NO: 12 in the sequence listing and has hexulose phosphate isomerase activity DNA encoding
[0011]
The present invention also provides a cell into which the DNA is introduced in a form in which the hexulose phosphate isomerase encoded by the DNA can be expressed.
[0012]
The present invention further comprises culturing the cells in a medium, causing hexulose phosphate isomerase to be produced and accumulated in the culture, and collecting hexulose phosphate isomerase from the culture. A method for producing acid isomerase is provided.
[0013]
In the present invention, “hexulose phosphate isomerase activity” refers to an activity of catalyzing an isomerization reaction between 3-hexulose 6-phosphate and fructose 6-phosphate.
[0014]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
Hereinafter, the present invention will be described in detail.
[0015]
<1> DNA of the present invention
The DNA of the present invention is obtained from Mycobacterium gastri chromosomal DNA as follows, as shown in Examples below.
First, HPS is purified from Mycobacterium gastri strain MB19. HPS can be purified from a cell-free extract of the MB19 strain to a single band on SDS-PAGE by DEAE-Sepharose column chromatography, phenyl Sepharose column chromatography, DEAE-Sepharose column chromatography. In each purification step, the HPS activity can be measured by the method described in Methods in Enzymology Vol. 188, 397-401 (1990).
[0016]
Next, the partial amino acid sequence of purified HPS was determined, and based on the obtained amino acid sequence information, an oligonucleotide primer for PCR (polymerase chain reaction) was synthesized, and genomic DNA prepared from Mycobacterium gastri MB19 strain Perform PCR using as a template. Genomic DNA can be obtained by the method of Saito et al. (Described in Biochim. Biophys. Acta, 72, 619-629 (1963)). In the culture for obtaining cells used for genome preparation, if a medium containing methanol as a carbon source and further containing 1% glycine is used, the amount of cells can be increased and the lysis operation is facilitated. As lytic enzyme, lysozyme alone does not lead to sufficient lysis, but it is effective to use N-acetylmuramidase SG.
[0017]
When an oligonucleotide having the nucleotide sequences shown in SEQ ID NO: 8 and SEQ ID NO: 9 in the sequence listing is used as a primer, a DNA fragment of about 400 bp is obtained by the PCR.
[0018]
Next, using the DNA fragment amplified by PCR as described above as a DNA probe, colony hybridization is performed on a PstI-cleaved fragment library of Mycobacterium gastri MB19 strain genomic DNA to obtain a positive clone .
[0019]
Among the clone fragments of about 4.1 kb obtained as described above, the result of having determined the base sequence of about 3 kb is shown in SEQ ID NO: 12 of the Sequence Listing. There are three open reading frames (ORFs) in this region. The amino acid sequences encoded by each ORF are shown in SEQ ID NOs: 13 to 15 in order from the 5 'end side. Of these, the second ORF (ORF-2) completely matched the partial amino acid sequence of HPS, indicating that it is a gene encoding HPS (hereinafter also referred to as “hps”). On the other hand, the first ORF (ORF-1) is a gene encoding HPI (hereinafter also referred to as “hpi”), that is, the DNA of the present invention, by examining the activity of a protein obtained by expressing this ORF. It was confirmed that there was.
[0020]
As described above, the DNA of the present invention was obtained by chance accompanying the purification of HPS and the isolation of hps. However, in the acquisition of the DNA of the present invention, ORF-1 encodes HPI. Based on the idea that it may be, it was made by expressing ORF-1 and confirming the activity of the expression product. Various known database searches were performed on the amino acid sequence encoded by ORF-1, but no high correlation with a polypeptide whose function was well known was found.
[0021]
The Mycobacterium gastri used for isolation of the DNA of the present invention is a Gram-positive facultative methanol-utilizing bacterium, and Methylomonas aminofaciens for which hps has already been isolated is a Gram-negative obligate methanol. They are assimilating bacteria, and they are taxonomically different.
[0022]
The DNA of the present invention was obtained as described above. Since the base sequence and the amino acid sequence encoded by the present invention have been clarified, oligos prepared based on these base sequences or amino acid sequences were obtained. It can be obtained from a genomic DNA library of Mycobacterium genus bacteria such as Mycobacterium gastri MB19 strain by hybridization using nucleotides as probes. The DNA of the present invention can also be obtained by performing PCR using the above oligonucleotide as a primer and genomic DNA of Mycobacterium bacteria as a template.
[0023]
For methods such as genomic DNA library preparation, hybridization, PCR, plasmid DNA preparation, DNA cleavage and ligation, transformation, etc., Sambrook, J., Fritsch, EF, Maniatis, T., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1.21 (1989).
[0024]
The Escherichia coli JM1O9 / pT-HPIS-1 containing the plasmid pT-HPIS-1 containing the DNA of the present invention and expressing HPI under the control of the tryptophan operon promoter, obtained in the Examples below, is , Private number AJ13363 was granted, and from August 4, 1997, FERM P was established at the Institute of Biotechnology, Institute of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry (Postal Code: 305-8565, 1-3 1-3 Higashi, Tsukuba, Ibaraki, Japan). It was deposited with a deposit number of -16363, transferred to an international deposit under the Budapest Treaty on January 16, 1998, and deposited with a deposit number of FERM BP-6225.
[0025]
The DNA of the present invention encodes an HPI containing a substitution, deletion, insertion, addition, or inversion of one or several amino acids at one or more positions, as long as the activity of the encoded HPI is not impaired. It may be a thing. Here, “several” differs depending on the position and type of the amino acid residue in the three-dimensional structure of the protein. This is because, depending on the amino acid, there are highly related amino acids such as isoleucine and valine, and such amino acid differences do not significantly affect the three-dimensional structure of the protein.The IngredientsPhysically, the "several"IsMore preferably, the number is 2 to 10.
[0026]
A DNA encoding a protein substantially identical to the HPI as described above may contain a substitution, deletion, insertion, addition, or inversion of an amino acid residue at a specific site, for example, by site-specific mutagenesis It is obtained by modifying the base sequence. The modified DNA as described above can also be obtained by a conventionally known mutation treatment. Mutation treatment includes in vitro treatment of DNA encoding HPI with hydroxylamine or the like, and microorganisms holding DNA encoding HPI, such as bacteria belonging to the genus Escherichia, by ultraviolet irradiation or N-methyl-N′-nitro-N -A method of treating with a mutating agent usually used for mutating treatment such as nitrosoguanidine (NTG) or nitrous acid.
[0027]
In addition, the substitution, deletion, insertion, addition, or inversion of the base as described above may include naturally occurring mutations (mutant or variant).
[0028]
By expressing the DNA having the mutation as described above in an appropriate cell and examining the HPI activity of the expression product, DNA encoding a protein substantially the same as HPI can be obtained. Further, stringent conditions with DNA having a nucleotide sequence consisting of nucleotide numbers 608 to 1204 among DNA sequences encoding HPI having a mutation or cells holding the same, for example, among the nucleotide sequences set forth in SEQ ID NO: 12 of the Sequence Listing DNA that encodes a protein that is substantially identical to HPI can also be obtained by isolating DNA that hybridizes underneath and encodes a protein having HPI activity. The term “stringent conditions” as used herein refers to conditions under which so-called specific hybrids are formed and non-specific hybrids are not formed.Yeah.
[0029]
Genes that hybridize under such conditions include those in which a stop codon has occurred in the middle, and those that have lost activity due to mutations in the active center, but these are linked to a commercially available active expression vector and HPI. The activity can be easily removed by measuring by the above method.
[0030]
<2> Production of hexulose phosphate isomerase
HPI can be produced by expressing the DNA of the present invention using an appropriate host-vector system.
Examples of hosts for expressing the hpi gene include various prokaryotic cells including Escherichia coli, various eukaryotic cells including Saccharomyces cerevisiae, animal cells, and plant cells. However, among these, prokaryotic cells, particularly Escherichia coli, are preferable.
[0031]
Examples of the vector for introducing the hpi gene into the host include pUC19, pUC18, pBR322, pHSG299, pHSG298, pHSG399, pHSG398, RSF1010, pMW119, pMW118, pMW219, pMW218 and the like. In addition, phage DNA vectors can also be used. The hpi gene can be introduced by transforming the host with a recombinant vector obtained by linking the hpi gene to these vectors. In addition, the hpi gene can be transformed into transduction, transposon (Berg, DE and Berg, CM, Bio / Technol., 1,417 (1983)), Mu phage (Japanese Patent Laid-Open No. 2-109985) or homologous recombination (Experiments in Molecular Genetics). , Cold Spring Harbor Lab. (1972)).
[0032]
In addition, in order to efficiently carry out the expression of the hpi gene, lac, trp, P working in the host cell are upstream of the DNA sequence encoding HPI._LA promoter such as When a vector containing a promoter is used as the vector, the hpi gene can be linked to the vector and the promoter at a time. Examples of such a vector include pT13sNco (described in J. Biochem. 104, 30-34 (1988)) containing a trp promoter.
[0033]
Transformation can be accomplished, for example, by treating recipient cells with calcium chloride to increase DNA permeability, as reported for Escherichia coli K-12 (Mandel, M. and Higa, A., J. Mol. ., Biol.,53159 (1970)), and methods for preparing competent cells from cells at the growth stage and introducing DNA as reported for Bacillus subtilis (Duncan, C.H., Wilson, G.A. and Young, F.E., Gene,1, 153 (1977)). Alternatively, DNA-receptive cells, such as those known for Bacillus subtilis, actinomycetes, and yeast, are introduced into the DNA-receptor cells in a protoplast or spheroplast state that readily incorporates recombinant DNA. Method (Chang, S. and Choen, SN, Molec. Gen., Genet.,168.111 (1979); Bibb, M.J., Ward, J.M. and Hopwood, O.A., Nature,274, 398 (1978); Hinnnen, A., Hicks, J. B. and Fink, G. R., Proc. Natl. Acad. Sci. USA,75 1929 (1978)) can also be applied. These methods may be appropriately selected depending on the cell used as the host.
[0034]
The hpi gene includes all genes having HPI activity when expressed, but preferably a gene containing DNA encoding the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 13 in the Sequence Listing, or described in SEQ ID NO: 12 in the Sequence Listing DNA containing the base sequence represented by base numbers 608 to 1204 among these base sequences. In addition, as described above, unless the activity of the encoded HPI is impaired, an HPI containing a substitution, deletion, insertion, addition, or inversion of one or several amino acids at one or a plurality of positions is encoded. It may contain the DNA to do.
[0035]
HPI can be produced by culturing cells into which the hpi gene has been introduced as described above in a medium, generating and accumulating HPI in the culture, and collecting HPI from the culture. What is necessary is just to select the culture medium used for culture | cultivation suitably according to the host to be used. When Escherichia coli is used as the host and hpi is expressed by the trp promoter, M9-casamino acid-glucose medium is preferred. Incubation is carried out at 37 ° C., and several hours after the start of the culture, indoleacrylic acid (IAA), which is an inducer of trp promoter, is added to a final concentration of 25 μg / ml. Accumulates. When HPI is secreted and produced extracellularly using an appropriate secretion system, HPI accumulates in the medium.
[0036]
The HPI produced as described above can be obtained from the bacterial cell extract or culture medium by using usual enzyme purification methods such as ion exchange chromatography, gel filtration chromatography, adsorption chromatography, solvent precipitation, and the like. Can be purified.
[0037]
The HPI obtained according to the present invention is obtained from carbon-13-labeled methanol from [1-¹³C] D-glucose 6-phosphate can be used to prepare. This [1-¹³C] D-glucose 6-phosphate can be prepared, for example, as follows. Methanol assimilating yeast candidate Methanol is oxidized to formaldehyde using alcohol oxidase prepared from Boydny. The obtained formaldehyde is subjected to aldol condensation with ribulose 5-phosphate by the action of HPS to produce arabino-3-hexulose 6-phosphate. In this case, since ribulose 5-phosphate is unstable, it is isomerized from ribose 5-phosphate to ribulose 5-phosphate by the action of phosphoriboisomerase in the same reaction system, and used for the HPS reaction. The arabino-3-hexulose 6-phosphate produced by the above reaction is converted to fructose 6-phosphate by the action of HPI, and this is further converted to glucose 6-phosphate by the action of glucose 6-phosphate isomerase. Is done. In general, since the HPI content of methanol-assimilating bacteria is significantly lower than that of HPS, it has been difficult to utilize HPI in the above reaction. However, hpi is isolated and the HPI is efficiently produced by the present invention. Since a method has been provided, it has become possible to put the above reaction into practical use.
[0038]
【Example】
Hereinafter, the present invention will be described more specifically with reference to examples.
[0039]
[Example 1]
Cloning of hpi gene and expression of HPI of Mycobacterium gastri MB19 strain
<1> Purification of 3-hexulose-6-phosphate synthase
Mycobacterium gastrie MB19 strain, a basic medium containing only methanol as the carbon source [Composition: 1% (v / v) methanol, 0.2% NaNO_Three, 0.2% (NH_Four)₂SO_Four, 0.2% K₂HPO_Four, 0.1% KH₂PO_Four, 0.02% MgS0_Four・ 7H₂0, 0.02% yeast extract, 0.2% (v / v) vitamin solution (40 mg calcium pantothenate, 20 mg inositol, 40 mg nicotinic acid, 20 mg p-aminobenzoate, 40 mg pyridoxine hydrochloride, 0.2 mg biotin, 40 mg thiamine hydrochloride Salt dissolved in distilled water 100ml), 1% (v / v) trace metal salt solution (0.2g CaCl₂・ 2H₂O, 0.2g MnS0_Four・ 7H₂0, 0.2g ZnS0_Four・ 7H₂0, 0.02g CuS0_Four・ 5H₂0, 0.1g FeS0_Four・ 7H₂0, 0.05g Na₂MoO_Four・ 2H₂0, 0.25g H_ThreeB0_Three, 0.05 g KI dissolved in 100 ml of distilled water)] at 30 ° C for 24 hours in a 10-liter (L) jar culture device, and collected from 10 L of the culture (continuous centrifugation at 6500 xg) 80 g of wet cells were obtained.
[0040]
The above cells are added to buffer A (10 mM Tris-HCl (pH 8.2), 1 mM dithiothreitol, 5 mM magnesium chloride, 0.15 mM phenylmethylsulfonyl fluoride) so that the concentration becomes 10% (w / v). Suspended. Next, the bacterial cells in the suspension were ultrasonically disrupted at an intensity of 180 W, and after ultracentrifugation at 120,000 × g for 60 minutes, the supernatant fraction was used as a cell-free extract. Obtained. This was subjected to DEAE-Sepharose ion exchange column chromatography equilibrated with buffer A. Under this condition, the target HPS protein was adsorbed on the column. Therefore, this column is buffered with a buffer containing high Tris-HCl concentration (100 mM Tris-HCl (pH 8.2), 1 mM dithiothreitol, 5 mM magnesium chloride, 0.15 mM phenylmethylsulfonyl fluoride). The target HPS protein was eluted by applying a concentration gradient of the agent, and the enzyme activity fraction was collected. As a result, an HPS preparation purified about 19 times could be obtained.
[0041]
Next, the HPS sample was dialyzed against 10 mM potassium phosphate buffer (pH 7.0) (buffer B) containing 3 M NaCl, 1 mM dithiothreitol, 5 mM magnesium chloride, 0.15 mM phenylmethylsulfonyl fluoride. And subjected to hydrophobic chromatography using a phenyl sepharose column equilibrated with the same buffer. Under this condition, HPS was adsorbed. Next, this column was used with a buffer containing ethylene glycol (50% ethylene glycol, 1 mM dithiothreitol, 5 mM magnesium chloride, 0.15 mM phenylmethylsulfonyl fluoride, 10 mM potassium phosphate buffer (pH 7.0)). On the other hand, the protein was eluted by applying a concentration gradient, and fractions showing HPS activity were collected. At this stage, HPS could be purified 31 times.
[0042]
Furthermore, in order to increase the purity of the sample, it was again subjected to the DEAE-Sepharose column under the same equilibration and elution conditions as described above, so that HPS was obtained at a yield of 47% and specific activity of 42 times. The above could be purified to a single band.
[0043]
In each purification step, HPS activity was basically measured by the method described in Methods in Enzymology Vol. 188, 397-401 (1990). A specific method is as follows. In the enzyme reaction cuvette, 0.05 ml of 0.5 M potassium phosphate buffer (pH 7.5), 0.05 ml of 50 mM magnesium chloride, 0.05 ml of 50 mM ribose 5-phosphate, 0.05 ml of 100 U / ml phosphoriboisomerase (manufactured by Sigma) , 0.15 ml of water was added, and 0.05 ml of a sample for activity measurement was added thereto and mixed. This was preincubated for 2 minutes at 30 ° C., and 0.1 ml of 10 mM formaldehyde was added to start the enzyme reaction. After 5 minutes of reaction at 30 ° C., the reaction was stopped by adding 0.1 ml of 0.5M HCl to the reaction. Then, 2 ml of Nash reagent (described in Biochem. J., 55, 416 (1953)) was added to the reaction solution diluted 20 times, and the degree of reduction of formaldehyde in the solution was measured. As a control experiment, a reaction system in which water was added instead of the ribose 5-phosphate was used.
[0044]
<2> Cloning of hps gene
The purified HPS obtained as described above was applied to a protein sequencer to determine 30 residues of the N-terminal sequence (MKLQVAIDLLSTEAALELAGKVAEYVDIIE (SEQ ID NO: 1)). In addition, purified HPS was treated with lysyl endopeptidase, the decomposed peptide fragment product was fractionated by reverse phase HPLC, and each was analyzed by a protein sequencer in the same manner as described above to determine the internal amino acid sequence of HPS ( VAEYVDIIELGTPLIK (SEQ ID NO: 2), IVFADMK (SEQ ID NO: 3), ATRAQEVRALGAK (SEQ ID NO: 4), FVEMHAGLDEQAK (SEQ ID NO: 5), ARVPFSVAGGVK (SEQ ID NO: 6), VATIPAVQK (SEQ ID NO: 7)).
[0045]
Based on these amino acid sequence information, as an N-terminal primer for amplifying the hps gene by PCR, an oligonucleotide having the base sequence described in SEQ ID NO: 8 (5′-ATGAARYTICARGTNGCIATHGA-3 ′), and an internal primer An oligonucleotide (5′-CCNGCRTGCATYTCNACRAA-3 ′) having the base sequence shown in SEQ ID NO: 9 was chemically synthesized. Using these as primers, PCR was carried out using genomic DNA prepared from Mycobacterium gastri MB19 strain as a template to obtain a DNA fragment of about 400 bp. Genomic DNA used as a template was obtained by referring to the method of Saito et al. (Described in Biochim. Biophys. Acta, 72, 619-629 (1963)). Cultivation was performed in a basic medium using ethanol as a carbon source, which can take a large amount of cells, but it was found that it would be difficult to perform the lysis operation as it was, so 1% glycine was added to the culture solution. Furthermore, since lysozyme alone did not lead to sufficient lysis, various solubilizing enzymes were examined, and N-acetylmuramidase SG was effective and used. In addition, PCR was performed 25 times using EX Taq-DNA polymerase manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd. under the conditions of 95 ° C .: 1 minute, 55 ° C .: 1 minute, 72 ° C .: 1 minute.
[0046]
Using the DNA fragment obtained as described above as a DNA probe, a genomic Southern analysis was performed on the genomic DNA of Mycobacterium gastri MB19 strain that had been subjected to various restriction enzyme treatments. Was found to hybridize with a DNA fragment having a size of about 4.1 kb excised by treating the genomic DNA with PstI. Therefore, based on this result, a colony library using the previous DNA probe was compared with a genomic library prepared by linking pUC118 as a vector and Mycobacterium gastri MB19 genomic DNA fragment cleaved with PstI. Hybridization was performed to obtain a positive clone. A plasmid of about 7.2 kbp was obtained from this clone. This plasmid was named pUHM1.
[0047]
<3> Determination of nucleotide sequence of hps gene
Next, the DNA base sequence of the inserted DNA fragment on the plasmid pUHM1 was determined to be about 3 kb. The results are shown in SEQ ID NO: 12 in the sequence listing. As a result, there were three open reading frames (ORF) in this region. The amino acid sequences encoded by each ORF are shown in SEQ ID NOs: 13 to 15 in order from the 5 'end side.
[0048]
The protein encoded by the second ORF (ORF-2) consists of 207 amino acid residues, and the molecular weight determined from this was 21,000. This value almost coincided with the molecular weight of 24,000 determined from the purified HPS subunit. In addition, the amino acid sequence encoded by ORF-2 (SEQ ID NO: 14) completely coincides with the seven amino acid sequences (N-terminal amino acid sequence and internal amino acid sequence) obtained from the purified protein, and this encodes HPS. Gene (hps).
[0049]
On the other hand, when the amino acid sequence of the ORF (ORF-1) upstream of the hps was searched against various known databases using the Blast (Basic Local Alignment Search Tool) program, No high correlation was found.
[0050]
<4> Expression of ORF-1
An attempt was made to forcibly express ORF-1 upstream of hps obtained above and to examine the activity of the encoded protein. Two oligonucleotides, 5'-CGAAATCGATAAAAATGACGCAAGCCGCAGAAGCCGACGGCG-3 '(SEQ ID NO: 10) and (5'-AATTCCAGCTCTAGACAAGGCGGTACGGCG-3' (SEQ ID NO: 11), were synthesized, and PCR was performed using these as primers and plasmid pUHM1 as a template. A DNA fragment (A) containing ORF-1, the upstream end of which was a ClaI site and the downstream end of XbaI was prepared.
[0051]
On the other hand, as a high expression plasmid for expressing the DNA fragment (A), pT13sNco (J. Biochem.104, 30-34 (1988)). pT13sNco was cleaved with restriction enzymes ClaI and XbaI to prepare a large DNA fragment (B). To this, the above DNA fragment (A) was ligated with T4 DNA ligase to construct an ORF-1 expression plasmid pT-HPIS-1.
[0052]
Escherichia coli JM1O9 strain was transformed with this pT-HPIS-1 by a conventional method to obtain a transformant JM109 / pT-HPIS-1. On the other hand, Escherichia coli JM109 strain (JM109 / pTTNco) carrying pTTNco, which is a vector portion of pT13sNco, was used as a control strain transformed with a plasmid not containing DNA fragment (A).
[0053]
These transformants were cultured with shaking in M9-casamino acid-glucose medium at 37 ° C. After about 2 hours, indoleacrylic acid (IAA), an inducer of transcription from the tryptophan promoter, was added at a final concentration of 25 μg / The culture was continued for 4 hours, and then 1.5 ml of the culture broth was collected. 0.5 ml of 0.1 M potassium phosphate buffer (pH 7.5) was added to the cells and suspended. Next, the bacterial cells were ultrasonically disrupted and then centrifuged (15000 rpm × 5 minutes), and the soluble fraction was used as an enzyme preparation.
[0054]
The enzyme preparation was measured for HPI activity. The activity was measured by measuring the assimilation of formaldehyde and finally the reduction of oxidized nicotinamide adenine dinucleotide phosphate by glucose-6-phosphate dehydrogenase.
[0055]
Specifically, the reaction solution [20 mM potassium phosphate (pH 7.5), 1 mM magnesium chloride, 1 mM ribose 5-phosphate, 0.8 mM NADP⁺(Oxidized nicotinamide adenine dinucleotide phosphate), 3U / ml phosphoriboisomerase (Sigma), 3.5U / ml phosphoglucoisomerase (Boehringer), 3.5U / ml glucose-6-phosphate dehydrogenase (Boehringer), 3 U / ml HPS, 0.9 ml each in a spectrophotometer cuvette (for standard and control), then add 0.05 ml of cell-soluble fraction to each cuvette and mix did. After incubating at 30 ° C for 2 minutes, the reaction was started by adding 0.05 ml of water to the control cuvette and 0.05 ml of 0.1M formaldehyde to the standard cuvette.⁺The HPI activity was measured using the increase in absorbance of light at a wavelength of 340 nm as a result of reduction of. The HPS used for this activity measurement is the FEMS microbiology letter135, 201-205 (1996), HPS mass-produced using a strain in which the hps gene derived from Methylomonas aminofaciens strain 77a was incorporated into Escherichia coli, Ag. Biol. Chem.,41, 1133-1140 (1997), and purified by a known method.
[0056]
As a result, when the cell extract obtained from the control strain (JM109 / pTTNco) was used, HPI enzyme activity was not shown at all. However, when the extract of JMIO9 / pT-HPIS-1 was used, it was obvious. HPI enzyme activity could be detected by chance. From this, it was shown that ORF-1 is a gene encoding HPI.
[0057]
When the hpi gene of Mycobacterium gastri MB19 obtained as described above and the hpi gene cloned in the same manner as described above from Methylomonas aminofaciens 77a were compared, the amino acids of the encoded HPI were compared. Was recognized. The homology of exactly the same amino acid was about 30%, and the homology including similar amino acids was about 69%.
[0058]
[Example 2]
Identification of hpi gene of Bacillus subtilis 168 strain
<1> HPS amino acid sequence database search
Regarding the amino acid sequence of HPI of Mycobacterium gastri MB19 strain obtained as in Example 1 above, homology search was performed on the existing amino acid sequence data bank, including ORFs with unknown functions. This search was conducted with the search system of Genetyx-Mac (Software Development Co., Ltd.) using SWISS-PROT Rel.34 as the data bank. As a result, the highly homologous amino acid sequence of the hpi gene of Mycobacterium gastri MB19 strain was yckF (SEQ ID NO: 16), a function-unknown gene of Bacillus subtilis 168 strain.
[0059]
When comparing the amino acid sequence of HPI of Mycobacterium gastri MB19 strain and the amino acid sequence encoded by yckF of Bacillus subtilis 168 strain (SEQ ID NO: 17), the homology in the completely same amino acid is about 35%, including similar amino acids The homology was about 76%. Thus, it was unexpected that a gene encoding a protein having high homology with HPI was originally present in Bacillus subtilis unrelated to the assimilation of C1 compounds such as methanol. Therefore, in order to examine whether or not this yckF retains the HPI activity, the yckF gene was isolated from Bacillus subtilis, incorporated into an expression vector, and the resulting recombinant vector was introduced into Escherichia coli cells. The HPI activity in the crude extract was measured.
[0060]
<2> Cloning of yckF gene of Bacillus subtilis
Since the entire genome base sequence of Bacillus subtilis has already been determined (Nature, Vol. 390, pp249, 1997), a DNA fragment containing yckF was amplified by PCR based on the base sequence information. The DNA primer used was an oligonucleotide having the base sequence described in SEQ ID NO: 18 (5'-AAGCATCGATAAAATGAAAACGACTGAATACGTAGCGGAA-3 ') as a primer having a restriction enzyme ClaI cleavage site upstream of the N-terminal side, and the C-terminal side. An oligonucleotide having the base sequence described in SEQ ID NO: 19 (5′-ATCTTGGATCCGGTTGTGTGATGTTATTCAAGGTTTGCG-3 ′) was chemically synthesized as a primer having a restriction enzyme BamHI cleavage site downstream. Using this as a primer, PCR was performed using genomic DNA prepared from Bacillus subtilis 168 strain as a template to obtain an amplified DNA fragment having a size of about 550 bp. The genomic DNA used as a template was obtained by referring to the method of Saito et al. (Described in Biochim. Biophys. Acta, 72, 619-629 (1963)). In addition, PCR was performed 28 times using the LA-Taq enzyme manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd., after heat treatment at 94 ° C. for 90 seconds, and 98 ° C. for 10 seconds, 58 ° C. for 20 seconds, and 70 ° C. for 60 seconds. Then, reaction was performed at 70 ° C. for 3 minutes.
[0061]
The DNA fragment obtained as described above is purified by phenol treatment, alcohol precipitation, etc., dissolved in an appropriate enzyme reaction buffer, and added with restriction enzymes ClaI and BamHI for 1 hour at 37 ° C. Processed. Then, this reaction solution was subjected to gel electrophoresis with 0.8% agarose to separate DNA fragments having ClaI and BamHI cut ends at both ends, respectively. Thereafter, the target DNA fragment was purified from this agarose gel to obtain a DNA fragment containing yckF.
[0062]
<2> Expression of yckF gene of Bacillus subtilis and confirmation of enzyme activity
As in Example 1, pT13sNco having a tryptophan promoter was used as a high expression plasmid for expressing the yckF gene obtained as described above. pT13sNco was cleaved with restriction enzymes ClaI and BamHI to prepare a large DNA fragment. The yckF expression plasmid pT-Bsb-yckF1 was constructed by ligating the above-described DNA fragment containing yckF with T4-DNA ligase.
[0063]
Using this pT-Bsb-yckF, Escherichia coli JM109 strain was transformed by a conventional method to obtain a transformant JM109 / pT-Bsb-yckF1. JM109 / pT-Bsb-yckF1 is assigned a private number AJ13441, and from May 8, 1998, Institute of Biotechnology, Institute of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry It is deposited at City East 1-chome 1-3) and is assigned the deposit number FERM BP-6345.
[0064]
On the other hand, Escherichia coli JM109 strain (JM109 / pTTNco) carrying pTTNco, which is the vector portion of pT13sNco, was used as a control strain transformed with a plasmid containing no DNA fragment containing yckF.
[0065]
These transformants were cultured with shaking in M9-casamino acid-glucose medium at 37 ° C., and after about 2 hours, indoleacrylic acid, an inducer of transcription from the tryptophan promoter, was brought to a final concentration of 25 μg / ml. The culture was continued for 8 hours. Thereafter, the culture broth was collected, and a soluble fraction of the cells was prepared in the same manner as in Example 1, and then HPI activity was measured.
[0066]
As a result, when the cell extract obtained from the control strain (JM109 / pTTNco) was used, HPI enzyme activity was not observed, but when using the extract of JM109 / pT-Bsb-yckF1, Obvious HPI activity was detected. From this, it was revealed for the first time that yckF (SEQ ID NO: 16), an unknown function ORF in Bacillus subtilis 168 strain, encodes HPI. In addition, Bacillus subtilis cannot assimilate C1 compounds such as methanol, and thus was not considered to have the hpi gene, but it has been found to have the gene.
[0067]
【The invention's effect】
According to the method of the present invention, DNA encoding hexulose phosphate isomerase can be obtained, and the enzyme can be efficiently produced. As a result, a labeling compound that is important for medical and biochemical basic research is necessary. Can be provided in large quantities at low cost.
[0068]
[Sequence Listing]

[0070]

[0071]

[0072]

[0073]

[0074]

[0075]

[0076]

[0077]

[0078]

[0079]

[0080]

[0081]

[0082]

[0083]

Leu Gln
[0084]

[0085]

[0086]

[0087]

Claims (4)

下記（Ａ）又は（Ｂ）に示すタンパク質をコードするＤＮＡ。
（Ａ）配列表の配列番号１３に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質。
（Ｂ）配列表の配列番号１３に記載のアミノ酸配列において、１〜１０個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、ヘキシュロースリン酸イソメラーゼ活性を有するタンパク質。DNA encoding the protein shown in (A) or (B) below.
(A) A protein comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 13 in the sequence listing.
(B) A hexulose phosphate isomerase consisting of an amino acid sequence comprising 1-10 amino acid substitutions, deletions, insertions, additions, or inversions in the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 13 in the Sequence Listing. Protein with activity. 下記（ａ）又は（ｂ）に示すＤＮＡ。
（ａ）配列表の配列番号１２に記載の塩基配列のうち、少なくとも塩基番号６０８〜１２０４からなる塩基配列を含むＤＮＡ。
（ｂ）配列表の配列番号１２に記載の塩基配列のうち、少なくとも塩基番号６０８〜１２０４からなる塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ヘキシュロースリン酸イソメラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。DN A shown in (a) or (b) below .
(A) DNA containing a base sequence consisting of at least base numbers 608 to 1204 among the base sequences set forth in SEQ ID NO: 12 in the sequence listing.
(B) a protein that hybridizes under stringent conditions with at least the nucleotide sequence consisting of nucleotide numbers 608 to 1204 among the nucleotide sequences set forth in SEQ ID NO: 12 in the sequence listing and has hexulose phosphate isomerase activity DNA encoding 請求項１又は２記載のＤＮＡが、該ＤＮＡがコードするヘキシュロースリン酸イソメラーゼが発現可能な形態で導入された細胞。 A cell into which the DNA according to claim 1 or 2 is introduced in a form in which the hexulose phosphate isomerase encoded by the DNA can be expressed. 請求項３記載の細胞を培地で培養し、ヘキシュロースリン酸イソメラーゼを培養物中に生成蓄積させ、該培養物よりヘキシュロースリン酸イソメラーゼを採取することを特徴とするヘキシュロースリン酸イソメラーゼの製造法。 A cell according to claim 3, wherein said cell is cultured in a medium, hexulose phosphate isomerase is produced and accumulated in the culture, and hexulose phosphate isomerase is collected from said culture. Method for producing isomerase.