JP4113252B2 - 植物繊維溶解酵素が増強された液体麹の製造方法、該方法により得られた液体麹およびその用途 - Google Patents

Description

本発明は、セルロース分解酵素やキシラン分解酵素などの植物繊維溶解酵素が増強された液体麹の製造方法、該方法により得られた液体麹およびその用途に関する。

酒類等の製造に用いられる麹は、蒸煮等の処理後の原料に糸状菌の胞子を接種して培養する固体麹と、水に原料及びその他の栄養源を添加して液体培地を調製し、これに麹菌の胞子又は前培養した菌糸等を接種して培養する液体麹がある。

従来の酒類などの発酵飲食品、例えば、日本酒、焼酎、しょうゆ、みそ、みりん等の製造では、固体培養法により製麹された、いわゆる固体麹が広く利用されている。この固体培養法は、アスペルギルス・カワチ（Aspergillus kawachii）、アスペルギルス・アワモリ（Aspergillus awamori）、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）、アスペルギルス・オリーゼ（Aspergillus oryzae）、アスペルギルス・ソーヤ（Aspergillus sojae）等の麹菌の胞子を、蒸煮した穀類等の固体原料へ散布し、その表面で麹菌を増殖させる培養方法である。

例えば、焼酎の製造では、アスペルギルス・カワチ（Aspergillus kawachii）やアスペルギルス・アワモリ（Aspergillus awamori）等の固体麹が広く用いられている。しかしながら、固体培養法は、原料や麹菌が不均一に分散する培養系であるため、温度や水分含量、各種栄養成分といった因子を均一にすることが困難であり、その培養制御は大変煩雑である。また、開放状態で製麹されることも多く、この場合は、雑菌による汚染といった品質管理面での注意も要する。そのため、大規模製造には不向きな方法とも言える。

これに対して、液体培養法は、培養制御や品質管理が容易であり、効率的な生産に適した培養形態である。
しかしながら、例えば、焼酎醸造に必要な酵素活性が十分に得られない等の理由から、麹菌を液体培養して得られる培養物を、実際に焼酎麹として用いた例は少ない。

液体培養法で得られる培養物が焼酎等の発酵飲食品の製造に利用されない大きな理由として、上記理由の他に、液体培養では麹菌のアミラーゼ、セルラーゼ等の酵素生産挙動が固体培養と大きく異なるばかりか、全般的に生産性が低下することが知られている（非特許文献１，２参照）。

通常、焼酎をはじめとする酒類の製造では、並行複発酵によりアルコールが生成される。従って、麹菌へのグルコース供給に影響を与える麹菌の糖質分解関連酵素、特にグルコアミラーゼや耐酸性α−アミラーゼは、アルコール発酵における鍵酵素である。しかしながら、液体培養法で得られる培養物において、グルコアミラーゼの活性は著しく低く、生産挙動も固体培養とは大きく異なることが知られている（非特許文献３−６参照）。

麹菌のグルコアミラーゼ活性を向上させる方法として、菌糸の生育にストレスを与えながら麹菌を培養する方法（特許文献１参照）や焙焼した穀類を麹菌培養液に添加する方法(特許文献２参照)が報告されている。特許文献１に開示の方法は、多孔性膜上又は空隙を有する包括固定化剤中で培養してグルコアミラーゼをコードする新規遺伝子ｇｌａＢを発現させて同酵素活性を高めるもので、厳密な制御又は特殊な培養装置が必要であり、実用的ではない。また、特許文献２に開示の方法は、原料の少なくとも一部に焙焼した穀類を用いた液体培地で麹菌を培養するもので、穀類を焙焼するという、新たな製造工程が加わることになる。

そこで、本発明者らは、麹菌にとって難分解性の糖質を含有する液体培地を用いた麹菌の培養方法に関する発明を提案した（特許文献３参照）。この発明によれば、麹菌の液体培養において、酒類などの発酵飲食品の製造に使用可能な、グルコアミラーゼ等の糖質分解関連酵素の活性が高い麹菌培養物を、簡便、且つ安価に得ることができる。

一方、耐酸性α−アミラーゼについては、最近、分子生物学的な解析が詳細に行なわれ始めている(非特許文献７参照)。それによれば、白麹菌は非耐酸性α−アミラーゼと耐酸性α−アミラーゼという性質の異なる２種類のアミラーゼ遺伝子を有しているが、その発現様式は大きく異なっており、液体培養においては、非耐酸性α−アミラーゼは十分に生産されるものの、焼酎醸造の鍵酵素である耐酸性α−アミラーゼはほとんど生産されないことが報告されている。

焼酎製造では、焼酎もろみの腐造防止のために低pH環境下で醸造する。しかし、非耐酸性α一アミラーゼは、低pH条件では速やかに失活してしまうため、焼酎醸造の糖質分解にはほとんど貢献しない。そのため、焼酎醸造の糖質分解に寄与していると考えられる耐酸性α−アミラーゼを、麹菌の液体培養で大量に生成させることが、焼酎製造のために不可欠である。

過去には、麹菌の液体培養における耐酸性α−アミラーゼの生産挙動を詳細に検討した報告があるものの、その方法はペプトンやクエン酸緩衝液を含む合成培地を用いている上に、培養時間が１００時間以上かかるなど、実際の焼酎醸造に適用できるような液体麹の製造方法であるとは言い難い（非特許文献８−１０参照）。

そこで、本発明者らは、培養原料として、表面が穀皮で覆われた穀類を含む液体培地で白麹菌及び／又は黒麹菌を培養して、培養物中にグルコアミラーゼと耐酸性α−アミラーゼとを同時に生成、蓄積させることにより、焼酎醸造に必要なグルコアミラーゼ及び耐酸性α−アミラーゼ活性を充分に含有する液体麹を製造する方法を既に開発し、この液体麹を用いた焼酎の製造に初めて成功した（例えば、特願２００４−３５０６６１号明細書参照）。

一方、清酒や焼酎製造における更なる生産性の向上を目的に、麹の生産する植物繊維溶解酵素に関する研究が行なわれており、清酒製造の際に植物繊維溶解酵素であるセルロース溶解酵素、キシラン溶解酵素、ペクチン溶解酵素を添加すると、清酒モロミの原料利用率が向上することが報告されている（非特許文献１１，１２参照）
また、トリコデルマ・ビリデ（Trichoderma viride）のセルロース溶解酵素遺伝子を導入した遺伝子組換え焼酎麹菌を造成し、それを用いた焼酎製造で焼酎のアルコール収量が向上することも報告されている（非特許文献１３参照）。

このように清酒や焼酎製造に使用する植物繊維溶解酵素群の生産性を向上させることは、清酒や焼酎製造など発酵飲食品製造の効率化において大変重要であることが広く知られている。
しかしながら、清酒製造の際に高価な植物繊維溶解酵素製剤を添加することはコストアップにもつながり好ましくない。
また、遺伝子組換え焼酎麹菌の使用は安全性などの点における消費者からの懸念も予想され、やはり好ましくない。

ところで、工業用アルコールとしてエタノールは、みりん、食酢などの飲食品製造原料や、香料、洗剤などの化学工業原料に用いられており、さらには近時、石油などの化石燃料に代わる新たなエネルギー源としても期待されている。例えば、ガソリンに３％のエタノールを混合したＥ３ガソリンなど、アルコール燃料の研究・開発が進んでいる。

工業用アルコール製造において、原料に穀類や芋類等を用いて発酵法により行う場合、高い酵素活性からも酵素剤（液化酵素、糖化酵素）の使用がかかせない（例えば、非特許文献１４参照）。

しかしながら、酵素剤の使用はコストが嵩む他、高濃度仕込みができないという問題がある。酵素剤を使用して製造したもろみのアルコール度数は、一般に８％程度であり、生産性向上の観点から、より高濃度仕込みが要望されていた。
そこで、酵素剤の代わりに、穀類や豆類の表面上に麹菌を生育させた固体麹を用いることが考えられるが、固体麹は固体培養という特殊な培養形態で製造されるため、大規模製造に不向きである。

一方、液体培地で麹菌を培養することにより得られる液体麹は、培養制御が容易であることから、効率的な生産に適した培養形態であると言える。
しかし、この液体麹は、アルコール発酵に必要な酵素活性が十分に得られないことが当業者に知られているため、これまで実製造に使用された例はない。

Iwashita K. et a1：Biosci. Biotechno1. Bioche.，62，1938-1946(1998) 山根雄一ら:日本醸造協会誌.，99，84-92(2004) Hata Y. et. Al.：J. Ferment. Bioeng.，84，532-537(1997) Hata Y. et. a1.：Gene.，207，127-134(1998) Ishida H. et. al.：J. Ferment. Bioeng.，86，301-307(1998) Ishida H. et. a1:Curr. Genet.，37，373-379(2000) Nagamine K. et.a1.：Biosci. Biotechno1. Biochem.，67，2194-2202(2003) Sudo S. et al：J. Ferment. Bioeng.，76，105-110(1993) Sudo S. et al：J. Ferment. Bioeng.，77，483-489(1994) 須藤茂俊ら:日本醸造協会誌，89，768-774(1994) 吉沢ら,日本醸造協会誌,76,284-286（1981） 福田ら,生物工学会誌,79,299-302(2001) Nomachi W. et.al. ,J. Biosci. Bioeng.,93(4) p382-387,2002） 醸造の事典、第３５２〜３７１頁、株式会社朝倉書店、１９８８年１１月１０日初版発行 特開平１１−２２５７４６号公報 特開２００１−３２１１５４号公報 特開２００３−２６５１６５号公報

本発明者らは、上記従来の問題点を解消するため、鋭意検討を重ねた。
その結果、本発明者らは、本発明者らが既に開発している、培養原料として、表面が穀皮が覆われた穀類を含む液体培地で白麹菌及び／又は黒麹菌を培養して、培養物中にグルコアミラーゼと耐酸性α−アミラーゼとを同時に生成、蓄積させることにより、グルコアミラーゼ及び耐酸性α−アミラーゼ活性の高い液体麹を製造する方法（例えば、特願２００４−３５０６６１号明細書参照）において、前記液体培地中における培養原料の使用量を調整することにより、植物繊維溶解酵素が増強された液体麹を製造することができることを見出し、この知見に基づいて本発明を完成するに至った。

なお、特願２００４−３５０６６１号明細書にて開示した、穀皮のついた原料を用いた液体麹の製造における、植物繊維溶解酵素の生産挙動や高生産方法については知られていないし、それらを用いた焼酎製造については、これまで全く報告されていない。

請求項１に係る本発明は、高価な植物繊維溶解酵素製剤を用いたり、或いは遺伝子組換え菌を使用したりすることなく、しかも固体培養ではなく液体培養によって、植物繊維溶解酵素が増強された液体麹を製造する方法を提供することを目的とするものである。
さらに、請求項１に係る本発明は、そのような植物繊維溶解酵素が増強された液体麹を用いて、効率よく焼酎などの発酵飲食品を製造する方法を提供することを目的とするものである。

ところで、液体麹は液状であるが故に、ポンプ移送などハンドリングが容易なことがメリットであるが、さらにこの液体麹を真空乾燥などの方法により処理した乾燥品でも、同様の発酵性が得られれば、焼酎などの発酵飲食品製造における更なる効率化に貢献できると考えられる。

請求項３に係る本発明は、焼酎などの発酵飲食品製造における更なる効率化に貢献することのできる液体麹乾燥品を製造する方法を提供することを目的とするものである。
すなわち、請求項３に係る本発明は、グルコアミラーゼ、耐酸性α−アミラーゼ、及び植物繊維溶解酵素活性が高く、しかもハンドリング性に一層優れた液体麹乾燥品を製造する方法を提供することを目的とするものである。
さらに、請求項３に係る本発明は、上記のような液体麹乾燥品を用いて、効率よく焼酎などの発酵飲食品を製造する方法を提供することを目的とするものである。

そして、請求項１２に係る本発明の目的は、アルコール発酵に必要な酵素活性を十分に有する液体麹を開発し、当該液体麹を使用して、発酵法による工業用アルコール（エタノール）の効率的な製造方法を確立することである。

工業用アルコール（エタノール）の製造に使用する液体麹には、糖質分解関連酵素であるグルコアミラーゼや耐酸性α−アミラーゼと、植物繊維溶解酵素の活性が高いことが必要である。しかしながら、かかる酵素活性の高い液体麹を、液体培地で麹菌を培養して得るという技術は未だ開示されていない。すなわち、この耐酸性α−アミラーゼは、液体培養では生成されない酵素であると一般的に言われており、これまでに耐酸性α−アミラーゼの活性が高い液体麹は開発されていない。

従って、請求項１２に係る本発明の目的は、上記したように、グルコアミラーゼや耐酸性α−アミラーゼ、植物繊維溶解酵素の活性が高い液体麹を開発して、当該液体麹を用いた発酵法による工業用アルコール（エタノール）の効率的な製造方法を確立することである。

請求項１に係る本発明は、表面の全部が穀皮で覆われた大麦、裸麦または小麦を含む液体培地で白麹菌又は黒麹菌を培養する際に、前記液体培地中における大麦、裸麦または小麦の使用量を１．４〜１．８％（ｗ／ｖｏｌ）とすることにより、麹菌培養物中に少なくともグルコアミラーゼと、耐酸性α−アミラーゼと、セルロース分解酵素と、キシラン分解酵素と、を同時に生成、蓄積させることを特徴とする、セルロース分解酵素及びキシラン分解酵素が増強された液体麹の製造方法を提供するものである。
請求項２に係る本発明は、表面の全部が穀皮で覆われた大麦、裸麦または小麦を含む液体培地で白麹菌又は黒麹菌を培養する際に、培養条件を３７℃、４２時間とすることにより、麹菌培養物中に少なくともグルコアミラーゼと、耐酸性α−アミラーゼと、セルロース分解酵素と、キシラン分解酵素と、を同時に生成、蓄積させることを特徴とする、請求項１に記載の液体麹の製造方法を提供するものである。

請求項３に係る本発明は、請求項１又は２に記載の方法により液体麹を得て、当該液体麹を乾燥処理することを特徴とする、液体培地を用いた液体麹乾燥品の製造方法を提供するものである。
請求項４に係る本発明は、請求項１又は２に記載の方法により液体麹を得て、当該液体麹を用いる酵素製剤の製造方法を提供するものである。

請求項５に係る本発明は、表面の全部が穀皮で覆われた大麦、裸麦または小麦を含む液体培地で白麹菌又は黒麹菌を培養する際に、前記液体培地中における大麦、裸麦または小麦の使用量を１．４〜１．８％（ｗ／ｖｏｌ）とすることにより、麹菌培養物中に少なくともグルコアミラーゼと、耐酸性α−アミラーゼと、セルロース分解酵素と、キシラン分解酵素と、を同時に生成、蓄積させることを特徴とする、グルコアミラーゼ、耐酸性α−アミラーゼ、セルロース分解酵素及びキシラン分解酵素から選ばれた少なくとも１種の酵素の製造方法を提供するものである。
請求項６に係る本発明は、表面の全部が穀皮で覆われた大麦、裸麦または小麦を含む液体培地で白麹菌又は黒麹菌を培養する際に、培養条件を３７℃、４２時間とすることにより、麹菌培養物中に少なくともグルコアミラーゼと、耐酸性α−アミラーゼと、セルロース分解酵素と、キシラン分解酵素と、を同時に生成、蓄積させることを特徴とする、請求項５に記載のグルコアミラーゼ、耐酸性α−アミラーゼ、セルロース分解酵素及びキシラン分解酵素から選ばれた少なくとも１種の酵素の製造方法を提供するものである。

請求項７に係る本発明は、請求項１又は２に記載の方法により液体麹を得て、当該液体麹を用いる発酵飲食品の製造方法である。
請求項８に係る本発明は、発酵飲食品が、焼酎である、請求項７に記載の発酵飲食品の製造方法である。
請求項９に係る本発明は、請求項３に記載の方法により液体麹乾燥品を得て、当該液体麹乾燥品を用いる発酵飲食品の製造方法である。
請求項１０に係る本発明は、請求項４に記載の方法により酵素製剤を得て、当該酵素製剤を用いる発酵飲食品の製造方法である。
請求項１１に係る本発明は、請求項５又は６に記載の方法によりグルコアミラーゼ、耐酸性α−アミラーゼ、セルロース分解酵素及びキシラン分解酵素から選ばれた少なくとも１種の酵素を得て、当該酵素を用いる発酵飲食品の製造方法である。

請求項１２に係る本発明は、請求項１又は２に記載の方法により液体麹を得て、当該液体麹を用いるエタノールの製造方法である。
請求項１３に係る本発明は、請求項３に記載の方法により液体麹乾燥品を得て、当該液体麹乾燥品を用いるエタノールの製造方法である。
請求項１４に係る本発明は、請求項４に記載の方法により酵素製剤を得て、当該酵素製剤を用いるエタノールの製造方法である。
請求項１５に係る本発明は、請求項５又は６に記載の方法によりグルコアミラーゼ、耐酸性α−アミラーゼ、セルロース分解酵素及びキシラン分解酵素から選ばれた少なくとも１種の酵素を得て、当該酵素を用いるエタノールの製造方法である。

請求項１に係る本発明によれば、高価な植物繊維溶解酵素製剤を用いたり、或いは遺伝子組換え菌を使用したりすることなく、しかも固体培養ではなく液体培養によって、セルロース分解酵素（セルラーゼ）やキシラン分解酵素などの植物繊維溶解酵素が増強された液体麹を製造することができる。
さらに、請求項１に係る本発明によれば、そのような植物繊維溶解酵素が増強された液体麹を用いて、効率よく焼酎などの発酵飲食品を製造する方法が提供される。
請求項１に係る本発明によれば、例えば発酵飲食品として焼酎を製造する場合、焼酎モロミの粘度低下が期待でき、作業性を格段に向上させることができる。しかも、アルコール収量増加などの原料利用率向上も期待でき、焼酎など発酵飲食品製造の更なる効率化が図られる。

また、請求項３に係る本発明によれば、グルコアミラーゼ、耐酸性α−アミラーゼ、及び植物繊維溶解酵素活性が高く、しかもハンドリング性に一層優れた液体麹乾燥品を製造することができる。
しかも、乾燥品であることから、突発的な製造にもタイムリーに対応できるというメリットがある。
さらに、これらの特色を有するため、液体麹乾燥品を用いて、種々の発酵飲食品を効率的に製造することができる。
例えば、請求項３に係る本発明により製造した液体麹乾燥品を用いると、未乾燥の液体麹並びに従来の固体麹を用いた焼酎もろみと同程度の発酵性が得られ、製造された焼酎は、未乾燥の液体麹並びに固体麹を用いて製造された焼酎と同程度の品質を有し、官能的にも遜色ないものとなる。

その上、請求項１２に係る本発明によれば、液体麹を用いた発酵法によるエタノールの製造方法が提供される。
この方法によれば、従来の固体麹を用いた発酵法によるエタノールの製造法により得られるエタノールと同程度の高いアルコール度数のもろみを製造することが可能となる。従って、このように高いアルコール度数のもろみを製造することにより、スケールの縮小化や省エネルギーに貢献することができる。
請求項１２に係る本発明の方法によれば、アルコール発酵に必要な酵素活性を十分に有する液体麹を使用して、発酵法により工業用アルコール（エタノール）を効率よく製造することができる。

実施例２における、玄麦使用量の異なる液体麹を用いた麦焼酎製造における発酵経過を示すグラフである。 実施例２における、玄麦使用量の異なる液体麹を用いた麦焼酎モロミのモロミ粘度の測定結果を示すグラフである。 実施例４の未乾燥区と乾燥区とにおける、重量減少積算による発酵経過を示すグラフである。

以下、本発明について具体的に説明する。
本発明は、植物繊維溶解酵素が増強された液体麹の製造方法に関し、培養原料として、表面の全部又は一部が少なくとも穀皮で覆われた穀類を含む液体培地と、表面が外皮で覆われた豆類及び／又は芋類を含む液体培地と、細砕や粉砕などの前処理をしないアマランサス及び／又はキヌアを含む液体培地と、から選ばれた少なくとも１種の液体培地で麹菌を培養する際に、前記液体培地中における培養原料の使用量を調整することにより、麹菌培養物中に少なくともグルコアミラーゼと、耐酸性α−アミラーゼと、植物繊維溶解酵素と、を同時に生成、蓄積させることを特徴とするものである。

本発明においては、培養原料として、表面の全部又は一部が少なくとも穀皮で覆われた穀類を含む液体培地と、表面が外皮で覆われた豆類及び／又は芋類を含む液体培地と、細砕や粉砕などの前処理をしないアマランサス及び／又はキヌアを含む液体培地と、から選ばれた少なくとも１種の液体培地を用い、このような液体培地で麹菌を培養している。そのため、当該穀類等中のでん粉の糖化に時間がかかり、培養系への糖の放出速度が抑制され、液体麹の酵素活性が増強される。

本発明においては、液体麹の培養原料として用いる穀類としては、大麦、裸麦、米、小麦、そば、ヒエ、アワ、キビ、コウリャン、トウモロコシ等を挙げることができる。これらの原料の形状としては、表面の全部又は一部が少なくとも穀皮で覆われていることが必要であって、未精白物、または少なくとも穀皮が穀粒の表面に残されている程度までに精白された精白歩合以上のもの等を用いることができ、玄米、玄麦なども使用できる。米の場合には、玄米は勿論のこと、籾殻が全部付いているものでもよいし、籾殻が一部付いているものでもよい。
例えば、穀類が大麦の場合、未精白の精白歩合１００％のもの、或いは未精白の精白歩合を１００％とし、この未精白の精白歩合（１００％）から大麦の穀皮歩合（一般的には７〜８％）を差し引いた割合、すなわち９２〜９３％程度の精白歩合以上のものである。

ここで、精白歩合とは、穀類を精白して残った穀類の割合を言い、例えば精白歩合９０％とは、穀類の表層部の穀皮等を１０％削り取ることを意味する。また、本発明において、玄麦とは、未精白の麦から穀皮が穀粒の表面に残されている程度までに精白されたものであり、精白歩合９０％以上のものを含む。また、穀皮とは、穀類の粒の表面を覆っている外側部位のことを言う。

本発明において、液体麹の培養原料として用いる豆類や芋類としては、大豆、小豆、サツマイモ等を挙げることができる。これらの培養原料は、外皮の汚れを洗い落とすのみで、裁断、粉砕処理などの加工は全く行なわないものである。

本発明において、液体麹の培養原料として用いるアマランサスは、ヒユ科ヒユ属植物の総称で、穀類のなかでは蛋白質含量が高く、アミノ酸の一つであるリジンの含量は大豆に匹敵する。また、精白米に比べても、カルシウム、鉄分、繊維質を多く含む高栄養価穀物であり、原産国は、中南米諸国、インド、ヒマラヤ、ネパールの特定地域である。一方、キヌアは、アガサ科の一年草であり、主にペルー南部やボリビア西部のアンデス山脈などの高地で栽培されており、ミネラル、ビタミン、蛋白質、食物繊維を豊富に含んでいる。
培養原料のアマランサスとキヌアは、単独で用いてもよく、或いは組み合わせて用いてもよい。これらは、細砕や粉砕などの前処理をすることなく、液体培地の調製に用いる。

上記の培養原料は、単独で、或いは２種以上を組み合わせて、以下の液体培地の調製に用いる。
すなわち、上記の培養原料は、水と混合して液体培地を調製する。

本発明においては、この液体培地中における培養原料の使用量を調整することが必要である。
通常は、グルコアミラーゼ及び耐酸性α−アミラーゼがバランスよく生成、蓄積されるのに好適な使用量よりも若干低めの使用量にて、セルロース分解酵素（セルラーゼ）やキシラン分解酵素（キシラナーゼ）などの植物繊維溶解酵素が増強される。
液体培地中における培養原料の使用量は、麹菌の培養中にグルコアミラーゼ及び耐酸性α−アミラーゼが選択的に生成、蓄積されると共に、セルロース分解酵素（セルラーゼ）やキシラン分解酵素などの植物繊維溶解酵素が増強される範囲である。

具体的には例えば、大麦または裸麦を培養原料とした場合には、水に対して大麦または裸麦を１〜２０％（ｗ／ｖｏｌ）添加した液体培地に調製される。また、無精白の大麦または裸麦を用いた場合には、さらに好ましくは８〜１０％（ｗ／ｖｏｌ）添加した液体培地に調製され、９５％精白した大麦または裸麦を原料とした場合には、さらに好ましくは１〜４％（ｗ／ｖｏｌ）添加した液体培地に調製される。
また、培養条件が３７℃、４２時間である場合には、水に対して大麦または裸麦を１．４〜１．８％（ｗ／ｖｏｌ）、好ましくは１．４〜１．７％（ｗ／ｖｏｌ）添加した液体培地に調製される。無精白の大麦または裸麦を用いた場合や、９５％精白した大麦または裸麦を原料とした場合も同様である。

次に、籾殻を除いた玄米を培養原料とした場合には、水に対して玄米を１〜２０％（ｗ／ｖｏｌ）、好ましくは５〜１３％（ｗ／ｖｏｌ）、より好ましくは８〜１０％（ｗ／ｖｏｌ）を添加した液体培地に調製される。

豆類を培養原料とした場合には、水に対して豆類を１〜１０％（ｗ／ｖｏｌ）、好ましくは大豆であれば８〜１０％（ｗ／ｖｏｌ）、小豆であれば１〜２％（ｗ／ｖｏｌ）添加した液体培地に調製される。また、芋類を培養原料とした場合には、水に対して芋類を１〜１０％（ｗ／ｖｏｌ）添加した液体培地に調製される。

また、例えば、アマランサスを培養原料とした場合は、水に対して１．５〜１５％（ｗ／ｖｏｌ）、好ましくは２〜１０％（ｗ／ｖｏｌ）、より好ましくは２〜８％（ｗ／ｖｏｌ）を添加した液体培地に調製される。一方、キヌアの場合は、水に対して１．５〜７％（ｗ／ｖｏｌ）、好ましくは２〜６％（ｗ／ｖｏｌ）、より好ましくは２〜４％（ｗ／ｖｏｌ）を添加した液体培地に調製される。

さらに、使用する培養原料の種類や培養原料の精白度等によって、最適な配合使用量は異なるので、適宜選択すればよい。

上記範囲内の培養原料を添加した液体培地で麹菌を培養すると、焼酎などの発酵飲食品製造に使用するのに十分な酵素活性（グルコアミラーゼ及び耐酸性α−アミラーゼ活性）を有すると同時に、セルロース分解酵素（セルラーゼ）やキシラン分解酵素（キシラナーゼ）などの植物繊維溶解酵素が増強された液体麹が製造される。

なお、培養原料の使用量が上限値を超えると、セルロース分解酵素（セルラーゼ）やキシラン分解酵素（キシラナーゼ）などの植物繊維溶解酵素が増強された液体麹を得ることができない。さらに、培養液の粘性が高くなり、麹菌を好気培養するために必要な酸素や空気の供給が不十分となり、培養物中の酸素濃度が低下して、培養が進み難くなるので好ましくない。一方、培養原料の使用量が下限値に満たないと、目的とする酵素が高生産されない。

上記原料に含まれるでん粉は、培養前に予め糊化しておいてもよい。でん粉の糊化方法については特に限定はなく、蒸きょう法、焙炒法等、常法に従って行なえばよい。後述する液体培地の殺菌工程において、高温高圧滅菌等により、でん粉の糊化温度以上に加熱する場合は、この処理によりでん粉の糊化も同時に行なわれる。

液体培地には、前述の原料の他に、栄養源として有機物、無機塩等を適宜添加するのが好ましい。
これらの添加物は、麹菌の培養に一般に使用されているものであれば特に限定はないが、有機物としては米糠、小麦麩、コーンスティープリカー、大豆粕、脱脂大豆等を、無機塩としてはアンモニウム塩、硝酸塩、カリウム塩、酸性リン酸塩、カルシウム塩、マグネシウム塩等の水溶性の化合物を挙げることができ、２種類以上の有機物及び／又は無機塩を同時に使用してもよい。これらの添加量は、麹菌の増殖を促進する程度であれば特に限定はないが、有機物としては０．１〜５％（ｗ／ｖｏｌ）程度、無機塩としては０．１〜１％（ｗ／ｖｏｌ）程度添加するのが好ましい。
このようにして得られる麹菌の液体培地は、必要に応じて滅菌処理を行なってもよく、処理方法には特に限定はない。例としては、高温高圧滅菌法を挙げることができ、１２１℃で１５分間行なえばよい。

滅菌した液体培地を培養温度まで冷却後、麹菌を液体培地に接種する。
本発明で用いる麹菌は、糖質分解酵素生産能を有する麹菌、好ましくはグルコアミラーゼ生産能、耐酸性α−アミラーゼ生産能を有する麹菌であり、例えば、アスペルギルス・カワチ（Aspergillus kawachii）等に代表される白麹菌、アスペルギルス・アワモリ（Aspergillus awamori）やアスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）等に代表される黒麹菌、アスペルギルス・オリーゼ（Aspergillus oryzae）やアスペルギルス・ソーヤ（Aspergillus sojae）等に代表される黄麹菌などが挙げられる。
なお、白麹菌、黒麹菌及び黄麹菌は、それぞれ単独で用いてもよいし、或いは両者を併用してもよい。好ましくは、白麹菌と黒麹菌をそれぞれ単独或いは両者を併用する。

これらの麹菌は、一種類の菌株による培養、又は同種若しくは異種の二種類以上の菌株による混合培養のどちらでも用いることができる。これらは、胞子又は前培養により得られる菌糸のどちらの形態のものを用いても問題はないが、菌糸を用いる方が対数増殖期に要する時間が短くなるので好ましい。麹菌の液体培地への接種量には特に制限はないが、液体培地１ｍｌ当り、胞子であれば１×１０^４〜１×１０^６個程度、菌糸であれば前培養液を０．１〜１０％程度接種することが好ましい。

麹菌の培養温度は、生育に影響を及ぼさない限りであれば特に限定はないが、好ましくは２５〜４５℃、より好ましくは３０〜４０℃で行なうのがよい。培養温度が低いと麹菌の増殖が遅くなるため雑菌による汚染が起きやすくなる。培養時間は２４〜７２時間で培養するのが好ましい。
培養装置は液体培養を行なうことができるものであればよいが、麹菌は好気培養を行なう必要があるので、酸素や空気を培地中に供給できる好気的条件下で行なう必要がある。また、培養中は培地中の原料、酸素、及び麹菌が装置内に均一に分布するように撹拌をするのが好ましい。撹拌条件や通気量については、培養環境を好気的に保つことができる条件であればいかなる条件でもよく、培養装置、培地の粘度等により適宜選択すればよい。

上記の培養法で培養することにより、グルコアミラーゼ、及び耐酸性α−アミラーゼの酵素が同時にバランスよく生成され、しかも同時にセルロース分解酵素（セルラーゼ）やキシラン分解酵素などの植物繊維溶解酵素が増強された液体麹が得られる。
尚、本発明において液体麹とは、培養したそのものの他に、培養物を遠心分離等することにより得られる培養液、それらの濃縮物又はそれらの乾燥物等も包含するものとする。

上述の通り、上記の培養法によれば、グルコアミラーゼ、耐酸性α−アミラーゼ、セルロース分解酵素、及びキシラン分解酵素などの酵素を高生産することができる。
したがって、請求項５に記載の酵素の製造方法は、上記した液体麹の製造方法と同様である。

請求項１に係る本発明の製造法で得られた液体麹は、発酵飲食品（例えば、焼酎、清酒、しょうゆ、みそ、みりん等）の製造に好適に用いることができる。
例えば、焼酎を製造する場合には、もろみ仕込み段階において、清酒を製造する場合には、酒母や各もろみ仕込み段階において、醤油を製造する場合には、盛り込みの段階において、味噌を製造する場合には、仕込み段階において、みりんを製造する場合は、仕込み段階において、液体麹を固体麹の代わりに用いることができる。

また、上記した液体麹を用いて発酵飲食品を製造する場合には、基本的に全工程を液相で行なうことができる。全工程を液相で行なう発酵飲食品の製造方法としては、例えば、焼酎を製造する場合には、トウモロコシ、麦、米、いも、さとうきび等を掛け原料に用い、該原料を約８０℃の高温で耐熱性酵素剤を使用して溶かして液化した後、これに上記した液体麹、及び酵母を添加することでアルコール発酵させたもろみを、常圧蒸留法又は減圧蒸留法等により蒸留して製造する方法が挙げられる。

請求項１に係る本発明の方法で得られた液体麹は、その高い酵素活性から、酵素製剤、並びに消化剤などの医薬品等としての利用も可能である。この場合、得られた麹菌培養物を所望の程度に濃縮・精製し、適当な賦形剤、増粘剤、甘味料などを添加して常法により添加すればよい。

請求項３に記載の本発明は、上記のようにして得られた液体麹を乾燥処理することを特徴とする、液体麹乾燥品の製造方法を提供するものである。
乾燥処理法としては、凍結乾燥が好ましく、特に酵素失活がほとんど起こらないことから、真空凍結乾燥がより好ましい。真空凍結乾燥は常法により行えばよい。真空凍結乾燥の条件は、特に限定されるものではないが、通常は、−１０〜−４０℃の温度にて１〜６時間予備凍結した後、５〜３０℃にて、真空度１Ｔｏｒｒ以下、好ましくは０．７Ｔｏｒｒ以下にて、１０〜３０時間乾燥すればよい。

このようにして目的とする液体麹乾燥品を製造することができる。
請求項３に係る本発明の製造方法で得られた液体麹乾燥品は、発酵飲食品の製造に好適に用いることができる。
例えば、清酒を製造する場合には、酒母や各もろみ仕込み段階において、焼酎を製造する場合には、もろみ仕込み段階において、醤油を製造する場合には、盛り込みの段階において、味噌を製造する場合には、仕込み段階において、みりんを製造する場合は、仕込み段階において、液体麹乾燥品を固体麹や液体麹の代わりに用いることができる。

なお、液体麹乾燥品を用いて発酵飲食品を製造する場合には、そのまま酵素剤的に液体麹乾燥品を用いてもよいし、或いは蒸麦や酵母菌体と液体麹とを予め混合した後に乾燥したものを用いてもよいし、さらには乾燥したこれら各種原料を混合し製剤化したものを用いることもできる。このように一種キット化しておくと、汲水を添加するだけで、焼酎などの発酵飲食品が製造可能な、簡易なスターターとなる。

上記した液体麹乾燥品を用いて発酵飲食品を製造する場合には、基本的に全工程を液相で行なうことができる。全工程を液相で行なう発酵飲食品の製造方法としては、例えば、焼酎を製造する場合には、トウモロコシ、麦、米、いも、さとうきび等を掛け原料に用い、該原料を約８０℃の高温で耐熱性酵素剤を使用して溶かして液化した後、これに上記した液体麹乾燥品、及び酵母を添加することでアルコール発酵させたもろみを、常圧蒸留法又は減圧蒸留法等により蒸留して製造する方法が挙げられる。

また、上記の製造方法で得られた液体麹は、請求項１２に記載の本発明に係る発酵法によるエタノールの製造に用いられる。エタノールの製造にあたり、固体麹の代わりに当該液体麹を用いること以外は、既知の工業用アルコール（エタノール）の製造方法に従って工業用アルコール（エタノール）を製造することができる。

発酵法によるエタノールの製造法の一例を以下に示す。
エタノールの製造に用いられる原料としては、デンプン質原料であればよく、大麦、裸麦、米、小麦、そば、ヒエ、アワ、キビ、コウリャン、トウモロコシ等の穀類；サツマイモ（甘藷）、キャッサバ等の芋類；などを挙げることができる。

発酵法によるエタノールの製造は、例えば低温連続蒸煮装置等の連続蒸煮装置などを用いて行うことができ、まず前記液体麹に、焼酎用酵母などのエタノール生産能を有する酵母、上記原料、さらに水を加えて仕込みを行う。必要に応じて乳酸を用いることもできる。
仕込み後は、低温で蒸煮した後、２０〜３０℃程度の温度で発酵させ、一次仕込み後、二次仕込みを行うことができる。

請求項１２に記載の本発明の場合、酵素剤を使用せず、液体麹のみを用いているにもかかわらず、発酵終了したもろみは、１８〜２０％という高いアルコール度数のものとなっている。
発酵終了したもろみを精密蒸留機などの蒸留機、好ましくは連続蒸留機にて蒸留して不純物を除き濃縮することにより、９５％以上の高品質工業用アルコール（エタノール）を製造することができる。
請求項１２に記載の本発明においては、発酵終了時のもろみが既に１８〜２０％という高いアルコール度数を有していることから、スケールの縮小化や省エネルギー効果を得ることができる。

以下、本発明を実施例によってより具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。

実施例１（植物繊維溶解酵素が増強された麹菌培養物（液体麹）の製造）
（Ｉ）麹菌培養物（液体麹）の製造
１）前培養方法；65％精白麦（オーストラリア産スターリング種）8gと水100mlを500mlバッフル付三角フラスコに張り込み、121℃、15分間オートクレーブ滅菌を行って、前培養培地とした。この前培養培地に白麹菌［アスペルギルス・カワチ（Aspergillus kawachii ）NBRC4308］胞子を1×10⁶個／ｍｌになるように植菌し、37℃、24時間、100rpmで振とう培養することにより、前培養液を得た。

２）本培養方法；玄麦[95％精白麦（オーストラリア産スターリング種）］を、表１に示すように2.0、1.9、1.8、1.7、1.6、1.5、1.4％（w/vol）の割合で、それぞれ硝酸カリウム0.2％（w/vol）、リン酸２水素カリウム0.3％（w/vol）を添加した水に加えて、７種類の液体培地を調製した。
それぞれの液体培地について、調製した液体培地3000mlを容量5000mlのジャーファーメンター（丸菱バイオエンジ製）に張り込み、121℃、15分間オートクレーブ滅菌して本培養培地とした。この本培養培地へ、上記の前培養液を30ml接種した。
その後、温度37℃、攪拌速度300rpm、通気量0.5vvmにて42時間培養を行い、麹菌培養物（液体麹）を得た。

（ＩＩ）酵素活性の測定
前記（Ｉ）で得られた麹菌培養物（液体麹）について、グルコアミラーゼ（GA）、耐酸性α−アミラーゼ（ASAA）、セルラーゼ（CEL）、キシラナーゼ（XYL）の生成量を測定した。表１に、玄麦の使用量別の液体培地で培養して得られた麹菌培養物（液体麹）のグルコアミラーゼ（GA）、及び耐酸性α−アミラーゼ（ASAA）、セルラーゼ（CEL）、キシラナーゼ（XYL）の生成量を示した。

尚、グルコアミラーゼ（GA）の酵素活性の測定には、糖化力分別定量キット（キッコーマン製）を用いた。また、耐酸性α−アミラーゼ（ASAA）の酵素活性の測定は、「Sudo S. et al: J. Ferment. Bioeng.，76,105-110(1993)、Sudo S. et al: J. Ferment. Bioeng.，77，483-489(1994)、須藤茂俊ら：日本醸造協会誌.，89，768-774(1994)」に記載の方法を若干改良し、培養物を酸処理することで非耐酸性α−アミラーゼを失活させた後、α−アミラーゼ測定キット（キッコーマン製）を用いて耐酸性α−アミラーゼを測定した。より具体的には、培養液1mlに9mlの100mM酢酸緩衝液（ｐH３）を添加し、37℃で１時間酸処理を行なった後に、α−アミラーゼ測定キット（キッコーマン製）を用いて測定した。

また、植物繊維溶解酵素として、セルラーゼ活性とキシラナーゼ活性を測定した。
まず、セルラーゼ活性（CEL）は、カルボキシメチルセルロース（以下、CMCと略）を基質とした酵素加水分解により生成する還元糖をDNS（3,5−ジニトロサリチル酸）と反応させ、540nmの吸光度の増加で定量する方法により測定した。より具体的には、1％CMC基質溶液（シグマ社製low viscosityを100ｍM酢酸緩衝液（pH5）に溶解）1mlに培養液1mlを加えて、40℃にて正確に10分間酵素反応を行なわせた後、DNS試薬（ジニトロサリチル酸0.75％、水酸化ナトリウム1.2％、酒石酸ナトリウムカリウム４水和物22.5％、乳糖１水和物0.3％を含む）４ｍｌを加えてよく混合し、反応を停止した。反応停止液に含まれる還元糖量を定量するために、反応停止液を沸騰水浴中で１５分間正確に加熱した。続いて、室温まで冷却した後、540nmの吸光度を測定することでグルコースに相当する還元糖量として定量した。１単位のセルラーゼ活性（CEL）は、１分間に１μmolのグルコースに相当する還元糖を生成する酵素量として表した。１単位のセルラーゼ活性は、40℃、10分間の反応条件下で、1分間に１μmolのグルコースに相当する還元糖を生成する酵素量として表した。

次に、キシラナーゼ活性（XYL）は、oat spelts由来のキシランを基質とした酵素加水分解により生成した還元糖をDNSと反応させ、540nmの吸光度の増加で定量した。より具体的には1％キシラン基質溶液［シグマ社製Xylan,from oat speltsを200ｍM酢酸緩衝液（pH4.5）に溶解］1.9ｍｌに培養液0.1ｍｌを加えて、40℃にて正確に10分間酵素反応を行なわせた後、DNS試薬（ジニトロサリチル酸0.75％、水酸化ナトリウム1.2％、酒石酸ナトリウムカリウム４水和物22.5％、乳糖１水和物0.3％を含む）4mlを加えてよく混合し、反応を停止した。反応停止液に含まれる還元糖量を定量するために、反応停止液を沸騰水浴中で15分間正確に加熱した。続いて、室温まで冷却した後、540nmの吸光度を測定することでキシロースに相当する還元糖量として定量した。1単位のキシラナーゼ活性は、40℃、10分間の反応条件下で、1分間に1μmolのキシロースに相当する還元糖を生成する酵素量として表した。

表１に示すように、玄麦の使用量に従って、各種酵素の生成バランスが変化することがわかった。特にセルラーゼ（CEL）やキシラナーゼ（XYL）は、玄麦使用量1.8％以下の試験区で顕著に増加する傾向にあることを見出した。特に、1.7％試験区では、グルコアミラーゼ（GA）、耐酸性α−アミラーゼ（ASAA）もバランスよく高生産させながら、セルラーゼ（CEL）、キシラナーゼ（XYL）もバランスよく生成していた。
このように、玄麦使用量を微調整することで、グルコアミラーゼ（GA）、耐酸性α−アミラーゼ（ASAA）以外の酵素、特にセルラーゼ（CEL）、キシラナーゼ（XYL）などの植物繊維溶解酵素を増強できることが示された。

実施例２（植物繊維溶解酵素が増強された麹菌培養物（液体麹）を用いたアルコール発酵）
実施例１において、玄麦を2.0％（w/vol）、1.7％（w/vol）、1.4％（w/vol）加えて調製した液体培地で培養して得られた麹菌培養物（液体麹）を用いてアルコール発酵を行った。
すなわち、実施例１における玄麦を、それぞれ対照区；2.0％（w/vol）、本発明１区；1.7％（w/vol）、本発明２区；1.4％（w/vol）添加して調製された液体培地で培養して得られた麹菌培養物（液体麹）の70mlを用いて、表２に示した仕込み配合にて、総麦184.6ｇの仕込みを行ない、発酵温度を25℃に保ち、一次仕込み５日間、二次仕込み２日間、三次仕込み13日間の三段仕込みを行なった。
尚、掛け麦としては、オーストラリア産スターリング種を65％精白したものを水で洗浄後、60分間浸漬、水切り30分間行なった後、35分間蒸きょうしたものを用いた。また、一次仕込みにおいて、掛麦42.4ｇを仕込んだ。なお、酵母は焼酎酵母（鹿児島酵母）を用い、YPD培地で30℃、48時間静置培養したものを50μL植菌した。

その発酵経過を図１に示した。各試験区とも発酵経過は順調であったが、特に各種酵素がバランスよく生成された1.7％使用区の発酵が旺盛であった。得られた最終モロミのアルコール度数は、2.0％使用区（対照区）が18.0％、1.7％使用区（本発明１）が19.2％、1.4％使用区（本発明２）が18.6％であり、1.7％使用区（本発明１）で高いアルコール収量となった。
また、熟成モロミの粘度を回転式粘度計にて測定した結果を図２に示した。図２から明らかなように、セルラーゼ（CEL）やキシラナーゼ（XYL）が増強された1.7％使用区（本発明１）や1.4％使用区（本発明２）では、2.0％使用区（対照区）に比べて、粘度が顕著に低下していた。これは、原料である大麦に大量に含まれる植物繊維素が、セルラーゼ（CEL）やキシラナーゼ（XYL）の作用により分解されたことに起因すると推察された。モロミの粘度低下は、モロミの流動性向上や、送液の容易化、蒸留作業の効率化など大きな効果をもたらすと考えられる。

以上の結果より、培養原料として、表面の全部又は一部が少なくとも穀皮で覆われた穀類等を含む液体培地で麹菌を培養する際に、前記原料の使用量を調整することにより、麹菌培養物中に少なくともグルコアミラーゼ、耐酸性α−アミラーゼと共に、セルラーゼ（CEL）やキシラナーゼ（XYL）などの植物繊維溶解酵素を同時に生成、蓄積させることが可能なことが明らとなった。これら植物組織溶解酵素が増強された麹菌培養物（液体麹）を用いてアルコール発酵を行なうと、アルコール取得量が向上するばかりか、モロミの粘度も低下することが示され、製造作業の大幅な効率化の可能性が広がった。
引き続き、これらのモロミを用いて単式蒸留を行えば麦焼酎を製造することが可能であるし、連続蒸留を行えば工業アルコール（エタノール）を容易に回収することができる。

実施例３（麹菌培養物乾燥品の製造）
（Ｉ）麹菌培養物（液体麹）の製造
１）前培養方法；65％精白麦（オーストラリア産スターリング種）8gと水100mlを500mlバッフル付三角フラスコに張り込み、121℃、15分間オートクレーブ滅菌を行って、前培養培地とした。この前培養培地に白麹菌［アスペルギルス・カワチ（Aspergillus kawachii ）NBRC4308］を分生子数が1×10⁶個／mlになるように植菌し、37℃、24時間、100rpmで振とう培養することにより、前培養液を得た。

２）本培養方法；98％精白麦（オーストラリア産スターリング種）2.0％（w/vol）、硝酸カリウム0.2％（w/vol）、リン酸二水素カリウム0.3％（w/vol）の液体培地3000mlを調製し、容量5000mlのジャーファーメンター（丸菱バイオエンジ製）に張り込み、121℃、15分間オートクレーブ滅菌して本培養培地とした。この本培養培地へ上記の前培養液を30ml接種した。その後、温度37℃、攪拌速度300rpm、通気量0.5vvmにて42時間培養を行い、麹菌培養物（液体麹）を得た。

（ＩＩ）麹菌培養物（液体麹）乾燥品の製造
前記（Ｉ）で得られた麹菌培養物（液体麹）200mlを-30℃で2時間予備凍結後、25℃、真空度0.5Torrにて24時間乾燥することにより、麹菌培養物（液体麹）乾燥品（麹菌培養物真空凍結乾燥品）2.7gを得た。

（ＩＩＩ）酵素活性の測定
前記（Ｉ）で得られた未乾燥の麹菌培養物（液体麹）（未乾燥品）と前記（ＩＩ）で得られた麹菌培養物（液体麹）乾燥品（乾燥品）とについて、グルコアミラーゼ（ＧＡ）と耐酸性α−アミラーゼ（ＡＳＡＡ）の生成量を測定した。
尚、グルコアミラーゼの酵素活性の測定には、糖化力分別定量キット（キッコーマン製）を用いた。また、耐酸性α−アミラーゼの酵素活性の測定は、「Sudo S. et al：J. Ferment. Bioeng.，76，105-110(1993)、Sudo S. et al：J. Ferment. Bioeng.，77，483-489(1994)、須藤茂俊ら:日本醸造協会誌，89，768-774(1994)」に記載の方法を若干改良し、培養物を酸処理することで非耐酸性α−アミラーゼを失活させた後、α−アミラーゼ測定キット（キッコーマン製）を用いて耐酸性α−アミラーゼ活性を測定した。より具体的には、培養液１ｍｌに９ｍｌの１００ｍＭ酢酸緩衝液（ｐH3）を添加して３７℃で１時間酸処理を行なった後に、α−アミラーゼ測定キット（キッコーマン製）を用いて測定した。
また、麹菌培養物（液体麹）乾燥品（乾燥品）の酵素活性測定は、麹菌培養物（液体麹）乾燥品（乾燥品）270mgを10mM酢酸緩衝液（pH5）20mlに溶解したものを用いて測定した。

前記（Ｉ）で得られた未乾燥品と前記（ＩＩ）で得られた乾燥品の酵素活性測定結果を以下の表３に示す。
表３によれば、凍結乾燥しても酵素失活は殆ど起こらず、焼酎仕込みにも充分に使用可能であることが示された。

実施例４（麹菌培養物（液体麹）を用いたアルコール発酵）
実施例３において得られた未乾燥品と乾燥品とをそれぞれ用いてアルコール発酵を行った（それぞれ未乾燥区と乾燥区）。

すなわち、実施例３において得られた未乾燥品100ml又は乾燥品1.35gを用いて、表４又は表５に示した仕込み配合にて、総麦3.7gの仕込みを行った。発酵温度は25℃に保ち、一次仕込み４日間、二次仕込み17日間の二段仕込みを行った。
なお、掛け麦としては、オーストラリア産スターリング種を65％精白したものを水で洗浄後、60分間浸漬し、水切り30分間行った後、35分間蒸きょうしたものを用いた。酵母は、焼酎酵母（鹿児島酵母）を用い、YPD培地で30℃、48時間静置培養したものを50μL植菌した。

未乾燥区と乾燥区とにおける、重量減少積算によるもろみ発酵経過を図３に示す。
その結果、図３から明らかなように、未乾燥区である未乾燥品仕込みと、乾燥区である乾燥品仕込みとで、発酵経過に差は殆ど認められなかった。
また、得られた最終もろみのアルコール度数は、未乾燥区19.6％、乾燥区19.4％であり、両試験区とも良好に発酵した。

実施例５（玄米麹菌培養物（液体麹）を用いたエタノールの製造）
（Ｉ）玄米麹菌培養物（液体麹）の製造
１）前培養方法；90％精白米（こしひかり）8gと水100mlを500mlバッフル付三角フラスコに張り込み、121℃、15分間オートクレーブ滅菌を行って、前培養培地とした。この前培養培地に白麹菌［アスペルギルス・カワチ（Aspergillus kawachii）NBRC4308］を分生子数が1×10⁶個／mlになるように植菌し、37℃、24時間、100rpmで振とう培養することにより、前培養液を得た。

２）本培養方法；籾殻のみを取り除いた玄米（こしひかり）8g、KNO₃ 0.2g、KH₂PO₄ 0.3gと水100mlを500mlバッフル付三角フラスコに張り込み、121℃、15分間オートクレーブ滅菌して本培養培地とした（５本準備した）。この本培養培地へ上記の前培養液を1mlずつ植菌し、37℃、72時間、100rpmで振とう培養して、玄米麹菌培養物（液体麹）を得た。

得られた玄米麹菌培養物（液体麹）の酵素活性を以下の表６に示す。
表６によれば、得られた玄米麹菌培養物（液体麹）は、グルコアミラーゼ活性、耐酸性α−アミラーゼ活性、共に良好であることが分かる。

（ＩＩ）仕込み・発酵
仕込み配合は表７の通りとした。酵母は、焼酎用酵母（鹿児島酵母）を10mlのYPD培地にて３０℃で1日間培養した後、培養液1mlを遠心分離し、沈殿した酵母を２回滅菌水で洗浄し、回収した酵母全量を用いた。
連続蒸煮装置を用い、これに前記（Ｉ）で得られた玄米麹菌培養物（液体麹）、上記酵母、掛米（こしひかりの白米）、90％乳酸及び水を投入した。発酵条件は、25℃一定とし、16日間発酵させた。一次仕込み3日後、二次仕込みを行った。

上記のようにして得られた、発酵終了後の玄米麹菌培養物（液体麹）仕込みのもろみのアルコール度数は１９．１％であった。

（ＩＩＩ）工業用アルコール（エタノール）の製造
上記（ＩＩ）で得られた、発酵終了後の玄米麹菌培養物（液体麹）仕込みのもろみを、精密蒸留機（柴田科学株式会社製、ＨＰ−１０００Ｔ特型）にて連続蒸留し、工業用アルコール（エタノール）を回収した。
得られた工業用アルコール（エタノール）のアルコール度数は９５．３％であった。

さらに、上記麹菌培養物（液体麹）の原料として玄麦を用いた麹菌培養物（液体麹）を使用した場合にも、同様に高いアルコール度数のもろみを製造することができ、その結果、品質的に全く問題のない工業用アルコール（エタノール）を製造することができた。

以上から、本発明によれば、麹菌培養物（液体麹）を用いて工業用アルコール（エタノール）を製造することが可能であることが明らかとなった。

請求項１に係る本発明によれば、高価な植物繊維溶解酵素製剤を用いたり、或いは遺伝子組換え菌を使用したりすることなく、しかも固体培養ではなく液体培養によって、セルロース分解酵素（セルラーゼ）やキシラン分解酵素などの植物繊維溶解酵素が増強された液体麹を製造することができる。
また、請求項３に係る本発明によれば、グルコアミラーゼ、耐酸性α−アミラーゼ、及び植物繊維溶解酵素活性が高く、しかもハンドリング性に一層優れた液体麹乾燥品を製造することができる。しかも、乾燥品であることから、突発的な製造にもタイムリーに対応できるというメリットがある。
請求項１２に係る本発明の方法によれば、アルコール発酵に必要な酵素活性を十分に有する液体麹を使用して、発酵法により工業用アルコール（エタノール）を効率よく製造することができる。
従って、本発明は、飲食品製造分野や、化学工業分野、さらにはエネルギー産業分野などにおいて有効に利用することが期待される。

Claims (15)

1. 表面の全部が穀皮で覆われた大麦、裸麦または小麦を含む液体培地で白麹菌又は黒麹菌を培養する際に、前記液体培地中における大麦、裸麦または小麦の使用量を１．４〜１．８％（ｗ／ｖｏｌ）とすることにより、麹菌培養物中に少なくともグルコアミラーゼと、耐酸性α−アミラーゼと、セルロース分解酵素と、キシラン分解酵素と、を同時に生成、蓄積させることを特徴とする、セルロース分解酵素及びキシラン分解酵素が増強された液体麹の製造方法。
2. 表面の全部が穀皮で覆われた大麦、裸麦または小麦を含む液体培地で白麹菌又は黒麹菌を培養する際に、培養条件を３７℃、４２時間とすることにより、麹菌培養物中に少なくともグルコアミラーゼと、耐酸性α−アミラーゼと、セルロース分解酵素と、キシラン分解酵素と、を同時に生成、蓄積させることを特徴とする、請求項１に記載の液体麹の製造方法。
3. 請求項１又は２に記載の方法により液体麹を得て、当該液体麹を乾燥処理することを特徴とする、液体培地を用いた液体麹乾燥品の製造方法。
4. 請求項１又は２に記載の方法により液体麹を得て、当該液体麹を用いる酵素製剤の製造方法。
5. 表面の全部が穀皮で覆われた大麦、裸麦または小麦を含む液体培地で白麹菌又は黒麹菌を培養する際に、前記液体培地中における大麦、裸麦または小麦の使用量を１．４〜１．８％（ｗ／ｖｏｌ）とすることにより、麹菌培養物中に少なくともグルコアミラーゼと、耐酸性α−アミラーゼと、セルロース分解酵素と、キシラン分解酵素と、を同時に生成、蓄積させることを特徴とする、グルコアミラーゼ、耐酸性α−アミラーゼ、セルロース分解酵素及びキシラン分解酵素から選ばれた少なくとも１種の酵素の製造方法。
6. 表面の全部が穀皮で覆われた大麦、裸麦または小麦を含む液体培地で白麹菌又は黒麹菌を培養する際に、培養条件を３７℃、４２時間とすることにより、麹菌培養物中に少なくともグルコアミラーゼと、耐酸性α−アミラーゼと、セルロース分解酵素と、キシラン分解酵素と、を同時に生成、蓄積させることを特徴とする、請求項５に記載のグルコアミラーゼ、耐酸性α−アミラーゼ、セルロース分解酵素及びキシラン分解酵素から選ばれた少なくとも１種の酵素の製造方法。
7. 請求項１又は２に記載の方法により液体麹を得て、当該液体麹を用いる発酵飲食品の製造方法。
8. 発酵飲食品が、焼酎である、請求項７に記載の発酵飲食品の製造方法。
9. 請求項３に記載の方法により液体麹乾燥品を得て、当該液体麹乾燥品を用いる発酵飲食品の製造方法。
10. 請求項４に記載の方法により酵素製剤を得て、当該酵素製剤を用いる発酵飲食品の製造方法。
11. 請求項５又は６に記載の方法によりグルコアミラーゼ、耐酸性α−アミラーゼ、セルロース分解酵素及びキシラン分解酵素から選ばれた少なくとも１種の酵素を得て、当該酵素を用いる発酵飲食品の製造方法。
12. 請求項１又は２に記載の方法により液体麹を得て、当該液体麹を用いるエタノールの製造方法。
13. 請求項３に記載の方法により液体麹乾燥品を得て、当該液体麹乾燥品を用いるエタノールの製造方法。
14. 請求項４に記載の方法により酵素製剤を得て、当該酵素製剤を用いるエタノールの製造方法。
15. 請求項５又は６に記載の方法によりグルコアミラーゼ、耐酸性α−アミラーゼ、セルロース分解酵素及びキシラン分解酵素から選ばれた少なくとも１種の酵素を得て、当該酵素を用いるエタノールの製造方法。

Images