JP4108741B2 - Rnaバイナリ・プローブとrna向けrnaリガーゼを使用したrnaの診断検定法およびそのキット - Google Patents
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Description
本発明は、RNAを検出するための核酸ハイブリダイゼーション検定法に関する。このような検定法は、ヒトまたは動物の病気または状態の診断、生物学的サンプルにおける病原体の検定法、及び食品、農産物または環境における生物体またはウイルスの検定法といった広範な応用を有する。
発明の背景
種々のタイプの核酸ハイブリダイゼーション検定法が、知られている。一対のDNAプローブと、このプローブをDNAリガーゼで連結する段階(この連結反応は、前記プローブが標的上に互いに隣接してハイブリダイズすることを必要とする)とを利用した、いくつかの検定法がある。本出願では、核酸標的に互いに隣接してハイブリダイズした一対のプローブを連結する段階を有する一般的な検定法を指すために“バイナリ・プローブ検定法”という用語を使用する。一対のプローブが、標的に隣接してハイブリダイズする必要性は、連結反応が“標的依存”であること意味する。この一対のプローブを“バイナリ・レポーター・プローブ”または“バイナリ・プローブ”と称する。
バイナリ・プローブ検定法の一つは、リガーゼチェーン反応(“LCR”)である(Barany, 1991)。LCRにおいては、第一組のDNAバイナリ・プローブが、DNA標的の一つの相補鎖にハイブリダイズし、そこでDNA向けDNAリガーゼにより連結されて第一連結生成物を形成し、第二組のDNAバイナリ・プローブが第一連結生成物にハイブリダイズし、同様に連結されて第二連結生成物を形成する。反応温度を循環させて、融解、プローブのアニーリングおよび連結反応の段階を繰り返し、指数的に増幅された生成物、すなわち連結されたプローブを生成し、これを検出する。ときとして、プローブそのものと区別するために、連結されたプローブを“レポーター分子”と称する。
DNA標的に対する他のバイナリ・プローブ検定法は、一対のDNAバイナリ・プローブを利用し、その一方が固体表面に標的を固定し、かつその他方が放射性原子または蛍光物質を含有する(Landegrenら., 1988)。この検定法は、RNA標的に適用するという報告があるが(DNAバイナリ・プローブを使用)、一つの実施例も報告されていない(LandegrenとHood, 1991)。
DNA標的に対する第三の検定法は、一対のDNAバイナリ・プローブを利用し、その一方が固体表面に標的を固定し、そこでレポーター分子が、バクテリオファージQβレプリカーゼ等のRNA向けRNAポリメラーゼによって指数的に増幅される鋳型(テンプレート)とされる(Martinelliら., 1992)。このレポーター分子は、それ自身がQβレプリカーゼの鋳型とされるDNA分子であってもよく(直接的増幅)、Qβレプリカーゼ用のRNA鋳型を生成する、バクテリオファージT7 RNAポリメラーゼによる転写の鋳型とされてもよい(間接的増幅)。
上述の検定法は、ここに関係するいくつかの欠点を有している。そのほとんどは、例えば、DNAを標的とすることである。これが欠点とされるのは、検出に適したRNA標的が、ほとんどの場合に、サンプル中に、それと対応するDNA標的より非常に豊富にあるためである。全ての上記検定法が、DNAバイナリ・プローブを使用している。LCRは、増幅のために温度循環およびサーモサイクラー必要とし、ゲル電気泳動等の生成物検定法を必要とする。Landegrenら., 1988およびLandegrenとHood, 1991によるDNAバイナリ・プローブ検定法は、増幅を含まないため感度のよい検定法ではない。Qβレプリカーゼによる指数的増幅を用いる検定法において(Martinelliら,1992)、DNAプローブを使用することは、感度を制限してしまう:コストを増大させ、さらに時間を要し、かつ感度がより低い、転写という付加的な段階を必要とする、あるいは、感度が低いDNAレポーター分子を直接増幅する必要があり、これはDNAがQβレプリカーゼの本来の鋳型ではないことから、非常に効率が悪い。
P. Lizardi, 本出願人,U. Landegren, F. KramerおよびJ. Szostakによって本出願と同日に出願された、RNAバイナリ・プローブおよびリボザイムリガーゼを使用したRNAの診断検定法に関する米国特許出願第08/005893号に、RNAバイナリ・プローブとリボザイムリガーゼを用いたRNA標的の検出に関する核酸ハイブリダイゼーション検定法が記載されており、DoudnaとSzostak, 1989に記載されたようなRNA分子が記載されている。前記出願に開示されたリボザイムリガーゼを利用した検定法は、いくつかの欠点を備えている。SunYリボザイムリガーゼは、不正確にハィブリダイズしたプローブを許容してしまうことが開示されている。テトラヒメナのリボザイムリガーゼは、9個以下のハイブリダイゼーション長(プローブ切片)を有する一つのプローブを必要とし、このため検定法の特異性を減少させがちなハイブリダイゼーションおよび洗浄条件を必要とする。本発明は、リボザイムリガーゼを使用しない。
本発明の目的は、DNAバイナリ・プローブを用いた既存のバイナリ・プローブ検定法の限界を克服することである。
本発明の他の目的は、両方がその標的に対して高度に特異的とされた一対のRNAプローブの使用を可能にすることである。
本発明のさらなる目的は、連結された場合に、RNA向けRNAポリメラーゼを用いたインキュベーションにより直接的かつ効率的に増幅されるレポーター分子を形成する、高度に特異的なバイナリ・プローブの使用を可能にすることである。
本発明の上記および他の目的は、以下の記載に明確にする。
発明の概要
本発明の検定法は、RNAバイナリ・プローブと、特異的かつ効率的なRNA向けRNAリガーゼタンパク質とを用いた、RNA標的用の核酸ハイブリダイゼーション検定法である。
好ましい実施態様は、シグナル生成用に単一の温度での指数的増幅を含む検定法であって、Qβレプリカーゼ等のRNA向けRNAポリメラーゼによって最も好ましく増幅される(Lizardiら,1988; Lomeliら,1989)。
好ましい実施態様は、サンドウィッチハイブリダイゼーション検定法である(Syvanenら,1986)。
また、好ましい実施態様は、例えば、リバーシブル標的キャプチャーのようなバックグラウンドを減少させる技術を使用する(Morrisseyら,1989; Hunsakerら,1989)。
特に好ましい実施態様は、本出願人,U. Landegren, P. LizardiおよびF. Kramerによって本出願と同日に出願された、感度のよい核酸サンドウィッチハイブリダイゼーション検定法およびキットに関する、米国特許出願第08/006078号(以下、Tyagiらの米国特許出願第08/006073号)に開示されたバックグラウンド減少技術を利用する。
本発明の検定法において効率的なRNA向けRNAリガーゼとして機能する、あるタンパク質を見いだした。好ましいRNA向けRNAリガーゼは、バクテリオファージT4 DNAリガーゼである。これは、標的依存性であって、標的が欠如する場合には低い結合反応効率を有し;誤ったハイブリッド、特に連結反応の接合点における誤りに対して許容しないと考えられ;標的配列に対する特異性が確かな長いプローブ配列を有する両方のプローブを許容し;十分に効率的、すなわち極端に敏感な検定法を可能にする。本発明の検定法に有用なリガーゼであるタンパク質は、実施例1の検定法において、100000標的分子の検出を行うものである。
候補のタンパク質を素早く同定する簡単な試験を開発した。
本発明は、一対のRNAバイナリ・プローブ、タンパク質であるリガーゼ、および本発明に基づいた検定法を行う手段を含んだ、予め選択された標的に対する診断キットをも含んでいる。より好ましいキットの中に、他の薬剤が含まれていてもよい。
特に好ましい実施態様を含む、本発明の好ましい実施態様に関する詳細な説明は、次の詳細な説明に記載されている。詳細な説明も実施例も、本発明もしくは添付の請求の範囲の範囲を制限するものではない。
【図面の簡単な説明】
図1は、実施例1の検定法を表す。
図2は、実施例1のプローブの配列を示す。
図3は、実施例1のバイナリ・プローブの調製を表す。
図4は、候補のリガーゼ、すなわちT4 DNAリガーゼに関する実施例1に基づく試験検定法の結果を示す。
図5は、T4 DNAリガーゼを用いた実施例1に基づく感染細胞の検定結果を示す。
図6は、既知の量の感染した細胞に対する実施例1に基づく他の検定で得られた結果を示す。
図7は、実施例2に基づくスクリーニング試験の結果を示すオートラジオグラムである。
詳細な説明
本発明に基づく検定法に、潜在的に使用できるタンパク質を同定するための確かなスクリーニング試験を開発した。この試験は、以下の実施例2に記載されている。これは、RNA標的と、両方が標的に対して高度に特異的で、特異性が保証されている一対のRNAバイナリ・プローブとを利用する。一つの試験の結果、すなわち試験生成物のオートラジオグラムを、図7に示す。この試験は、RNA向けRNAリガーゼとして試験される一つのタンパク質(またはいくつかのタンパク質)だけでなく、リガーゼが使用されていない比較例も含んでいる。もしオートラジオグラムによって、リガーゼを含まない比較例の反応より、特定のタンパク質を含む反応で、裸眼で識別できるような十分に増幅された生成物が示されるなら、そのタンパク質は、本発明の検定法においてリガーゼとして使用できるかどうかを調べる次の試験のための候補とされる。
図7は、二つのタンパク質、T4 DNAリガーゼおよび大腸菌DNAリガーゼが、リガーゼを含まない比較例より十分に生成を行うことを示している。これらは、次なる試験に対して十分に効率的である。しかしながら、T4 RNAリガーゼも、Thermus aquaticusDNAリガーゼも、スクリーニング試験において見込みを示さなかった。これらは、次の試験の候補ではない。T4 DNAリガーゼは、視覚的に、大腸菌DNAリガーゼより効率的であり、より好ましいと考えて、実施例1の検定法に使用した。
もし、スクリーニング試験からあるタンパク質が候補のリガーゼであることが分かれば、“効率的なリガーゼ”すなわち本発明の検定法で使用されるものであるかどうかを決定するために、実施例1の検定法に用いることができる。添付された請求の範囲を含む本発明の目的のために、効率的なリガーゼを、実施例1の検定法で100000の標的分子を検出するものと定義する。実施例1の検定法で一定の数の標的分子を検出する能力は、タンパク質の標的依存連結反応効率と、バックグラウンドを増大させる標的依存連結反応に対するタンパク質の傾向の両方によって決まる。好ましいリガーゼは、実施例1の検定法で1000の標的分子を検出するものである。最も好ましいリガーゼは、実施例1の検定法で100分子を検出するものである。T4 DNAは、最も好ましいリガーゼである。これは、実施例1の検定法で100の標的分子を検出する。この検定法において、T4 DNAリガーゼは、10±2%の連結反応効率を有すると評価している。もちろん、特定のタンパク質が効率的なリガーゼであるかどうかを直接的に決定するために、実施例1の検定法を用いて、実施例2に基づくスクリーニング試験を省いてもよい。
本発明の検定法は、RNA標的用である。これらは、RNAバイナリ・プローブと、効率的なRNA向けRNAリガーゼであるタンパク質を必要とする。このような制限の範囲で、任意の適切な検定法のプロトコルを用いることができる。ここでRNA“レポーター分子”と称される連結された生成物は、DNAバイナリ・プローブを用いた既知の検定法に類似した検定法で、それ自身で、すなわち増幅されずに検定することもできる(Landegrenら,1988; LandegrenとHood, 1991)。他には、RNAバイナリ・プローブを、連結反応によって生成したレポーター分子が、増幅され得るように、すなわちQβレプリカーゼ等のRNA向けRNAポリメラーゼ用の鋳型となるように設計してもよい(適切なRNA分子としては、Lizardiら,1988; Lomeliら,1989; PritchardとStefano, 1991; Martinelliら,1992を参照)。
本発明の検定法は、上記文献のいくつかと同様に、DNAプローブに対して行ったような、固体表面に標的分子を固定するRNAバイナリ・レポーター・プローブの一つを利用してもよい。
本発明に係る好ましい検定法は、双方が標的に対して“高度に特異的”なバイナリ・プローブを利用するものであって、これはプローブが、標的配列に対してハイブリダイズする少なくとも15個の核酸のプローブ切片を有することを意味する。
本発明に係る好ましい検定法は、上述したようなRNA向けRNAポリメラーゼによるRNAレポーター分子の指数的増幅を利用する。さらに、本発明に係る検定法の好ましい実施態様は、例えばリバーシブル標的キャプチャー等の、バックグラウンドを減少する技術を利用する(Morrisseyら,1989; Hunsaker, 1989)。
本発明に係る検定法の最も好ましい実施態様は、特にQβレプリカーゼによるレポーター分子の指数的複製と併せて、ここに参照として取り込まれたTyagiらの米国特許出願第08/006073号に開示されたバックグラウンド減少技術を利用する。バックグラウンド減少技術は、別のキャプチャー・プローブを使用することであり、このキャプチャー・プローブは、バイナリ・レポーター・プローブがハイブリダイズする標的配列とは別の部位で標的にハイブリダイズし、キャプチャー・プローブ-標的-レポーター・プローブハイブリッドを形成し、このハイブリッドの固定化し、およびリボヌクレアーゼH(RNアーゼH)等によって、切断されてキャプチャー・プローブからレポーター・プローブ-標的ハイブリッドを放出する。実施例1は、最も好ましいと考えられる検定法を開示する。
RNA向けRNAリガーゼタンパク質は、例えば、核酸構成成分の全てがRNAであるリガーゼチェーン反応のような、増幅段階としてリガーゼチェーン反応を含む検定法にも有用である。タンパク質が、熱安定性でない場合には、タンパク質をLCRサイクルごとに添加する必要がある。
上述したように、本発明は、この発明に係る検定法を行うためのキットも含んでいる。好ましいキットは、以下の項目のいくつかまたは全てを含有することができる。
1.臨床サンプル中の細胞の溶解のための5Mのグアニジンチオシアナート(GuSCN)バッファー;
2.予め選択されたRNA標的に対するRNAバイナリ・レポーター・プローブ、好ましくは高度に特異的なバイナリ・プローブ、および好ましくはDNAキャプチャー・プローブを含む混合物;
3.ストレプトアビジンを共有結合させた計量棒、反応管、または常磁性粒子のような固体;
4.磁気分離装置;
5.ヌクレオチド;
6.本発明で使用できる効率的なリガーゼ、好ましくはT4 DNAリガーゼ;
7.RNアーゼHおよびQβレプリカーゼ;
8.リゲーション及び増幅のためのバッファー;
9.放射活性アルファ-P32-シチジン三リン酸またはヨウ化プロピジウム(propidium iodide)のような、増幅したレポーターを検出する試薬;
10.本発明の検定法を実施するインストラクション。
基本となるキットは、項目2、6および10のみを含有するものとすることができる。より完全なキットは、少なくとも項目1、3および7も含有するものである。少なくとも項目1−2及び5−10を含み、固体が計量棒または反応管であるキットは、設備の整った研究所の外で実施される検定に特に有効である。
実施例
実施例1:RNA標的、RNAバイナリ・プローブ、DNAキャプチャー・プローブ、リボヌクレアーゼH切断剤およびT4 DNAリガーゼ
T4 DNAリガーゼを採用したこの実施態様は、RNA標的、ここでは、ヒト免疫不全ウイルス(“HIV”)RNAによって例示するが、その検出に対して図1に一般的に示したような非常に高感度の検定法を導く。標的1の標的配列2は、HIV RNAのインテグラーゼ領域に位置する。検定は、サンプルを5Mのグアニジンチオシアナート(GuSCN)に溶解することから始める。次いで、4つの異なる核酸プローブの混合物をサンプルに加える。これらのプローブは、図1に示したように、HIV RNAにハイブリダイズする。プローブのうちの2つは、DNAからなるキャプチャー・プローブ3、4である。各キャプチャー・プローブは、その3’末端にハイブリダイゼーション配列5または6を有し、これらは標的1に相補的である。また、キャプチャー・プローブ3、4は、その5’末端にビオチン分子7を有している。他の2つのプローブ8、9は、RNAからなる高度に特異的なバイナリ・レポーター・プローブである。ハイブリダイゼーションの後、ハイブリッドはストレプトアビジン11で被覆された常磁性粒子10の表面に捕捉され、ストレプトアビジン11は、キャプチャー・プローブのピオチン分子7に強く結合する。次いで、常磁性粒子10は強力に洗浄されてハイブリダイズしていないバイナリ・プローブが除去される。両方のバイナリ・プローブが高度に特異的であるため、1MGuSCN等のより希釈された溶液よりも、2MのGuSCNを用いた厳しい洗浄を使用することができる。次に、キャプチャー・プローブにハイブリダイズしている領域において標的RNAを切断するために、RNアーゼHを添加する。標的RNAの切断によって、バイナリ・プローブ−標的ハイブリッド12(図1に連結反応後のものが示されている)がキャプチャー・プローブから自由になる。
開裂放出過程は、定量的であり特異的である。DNAキャプチャー・プローブまたは常磁性粒子の表面(即ち、バックグラウンドシグナルの源)に非特異的に結合したバイナリ・プローブは、この切断によって放出されない。常磁性粒子10は廃棄される。
上澄み中において、標的上に互いに隣接して正確にハイブリダイズしたバイナリ・プローブの対は、リガーゼタンパク質、ここではT4 DNAリガーゼを使用した標的に依存した方法で互いに連結される。連結されたプローブ13は、次いでQβレプリカーゼとインキュベートすることにより増幅される。増幅されたシグナルは、標的の存在に厳密に依存しており、時間の関数としての信号レベルは、最初のサンプル中にあるHIV RNAの分子数の定量的な決定に用いられる。
A.プローブの合成
この実施例で使用されるキャプチャー・プローブ(図2)は、3つの機能部分を有している。予め選択された標的にハイブリダイズする40−50ヌクレオチドのヘッド、およそ4ヌクレオチドのスペーサー、及び固体表面に強く結合するテイルである。我々は、テイルにビオチン分子を選び、それを各キャプチャー・プローブの5’末端に共有結合させた。ビオチン分子は、キャプチャー・プローブの3’末端及び内部を含むあらゆる位置に結合させることが可能である。テイルは、ホモポリヌクレオチドのような他の親和性試薬から形成してもよい。
図1は、キャプチャー・プローブ3、4が標的1に結合する方法を示している。捕捉の効率を上げ、バイナリ・プローブ−標的複合体の放出の厳重さを向上させるために、1つではなく2つの異なるキャプチャー・プローブを使用した。二つのキャプチャー・プローブ3、4は、標的1に、バイナリ・プローブが結合する標的配列2の両側において結合する。キャプチャー・プローブ3のハイブリダイゼーション配列5は、HIVゲノムRNAの4415−4458領域に対して相補的であり、キャプチャー・プローブ4のハイブリダイゼーション配列6は、HIVゲノムRNAの4808−4852領域に対して相補的である。図2は、この実施例で用いた2つのキャプチャー・プローブ3、4の配列を示している。下線は、標的RNAに相補的なハイブリダイゼーション配列5、6を示す。両方のキャプチャー・プローブが、DNA合成器で調製された。
この特別な実施態様で望まれるレポーター分子は、図1に示すように、2つのバイナリ・プローブのリゲーションを必要とする。バイナリ・プローブを使用することは、好ましい実施態様である。図1は、高度に特異的なバイナリ・レポーター・プローブ8、9の設計を例示している。プローブ8の5’末端14は、我々の以前の研究(Lomeli等,1989)で使用したHIVに対して複製可能なプローブの最初の69ヌクレオチドからなる。次の23ヌクレオチドは、プローブ配列15であり、HIVゲノムRNAの4596−4618領域に相補的である。プローブ9の5’末端は、19ヌクレオチドのプローブ配列17からなり、HIVゲノムRNAの4577−4595領域に相補的である。プローブ9の残りの部分(remainder)16は、我々の以前の研究(Lomeli等,1989)で使用したHIVに対して複製可能なプローブのヌクレオチド95−280に相当する。図2は、バイナリ・プローブ8、9の配列を示す。下線は、標的配列に相補的な、ハイブリダイゼーション配列15、17を示す。ハイブリダイゼーション配列15、17の両方が、長さにして少なくとも15ヌクレオチドであるため、プローブ8、9は、本発明でいう“高度に特異的”である。これらの分子は、Qβレプリカーゼとインキュベートするときは、いずれも良好なレプリケーターではないが、互いに連結されれば、指数的に複製可能なレポーター分子を形成する。
バイナリ・プローブ8、9は、図3に示すポリメラーゼチェーン反応(PCR)で生成されたDNA鋳型から転写された。Lomeli等1989の1827頁に記載されたプラスミド20を我々はpT7MDVHIV20と呼んでいるが、これをPCR反応におけるMDV配列の源として用いた。プラスミドの関連部分を図3に示した。これは、当然に二本鎖である。4つのPCRプライマー21、22、23及び24は、プラスミド20には存在しないが必要とされるPCR生成物27、28への付加的配列に貢献するように設計された。PCR生成物27は、プライマー21、22から生成された。PCR生成物28は、プライマー23、24から生成された。プライマー22は、プローブ8の鋳型に末端の23のヌクレオチド25を与える。プライマー23は、プローブ9の鋳型の5’末端にT7プロモーター26を与える。(プラスミド20は、プライマー21の領域にT7プロモーターを与える。)プローブ8は、通常の方法で、そのPCR鋳型から転写されるが、プローブ9の合成は、T7RNAポリメラーゼによる転写の条件下での修飾を必要とする。連結反応におけるリン酸基のドナーは、プローブ9の場合、その5’末端に単一のリン酸を有していなければならない。転写によって調製されたRNA分子は、通常その5’末端に三リン酸を有している。5’末端に単一のリン酸基を有するプローブ9を調製するために、ヌクレオシド5’-三リン酸の10倍過剰なグアノシン5’-一リン酸を転写反応に含んだ。これにより、プローブ9の第1位に、グアノシン5’-一リン酸を組み入れることができる。結果として、プローブ9のコピーは、その5’末端に、必要とされる一リン酸を有する。転写の後、各バイナリ・プローブRNA8、9を、合成したポリアクリルアミドゲル電気泳動によって精製した。RNAを、そのゲル切片から、2Mのグアニジンチオシアナート(GuSCN)溶液中に直接溶離した。
この実施例を行うことにより、我々は、上述のように10倍過剰ではなく、20倍過剰のグアノシン5’-一リン酸を用いることにより、プローブ9がさらに改善されることを見い出した。さらに過剰量を用いると、RNA向けRNAリガーゼとしてT4DNAリガーゼを用いた連結反応の効率が、10%から30%に、3倍になった。
B.ハイブリダイゼーション、捕捉、洗浄、及び放出
本実施例の検定法は、既知量のHIV RNA分子を含むサンプルに対して実施した。この検定法は、ある特定のタンパク質が、本発明に係る検定法に使用できる“効率的なリガーゼ”であるか否かを確かめるために用いられる。T4DNAリガーゼの試験について記載する。HIVのインテグラーゼ遺伝子のmRNAに相当するRNAを、モデル標的として用いた。このRNAは、我々の実験室で調製した、線形化した(linearized)プラスミドpGEM−インテグラーゼから転写することによって調製した。異なる量、例えば、10000000、1000000、100000、10000、1000、100、10及び0分子のインテグラーゼRNAを含む50マイクロリットルの2MのGuSCNを入れた8本のチューブを、厳格な希釈によって用意した。各キャプチャー・プローブの1013分子と、各バイナリ・プローブ2×1010分子とを含む2MのGuSCN溶液(50マイクロリットル)を、各チューブに添加した。ハイブリッド形成は、摂氏37度で1時間インキュベートすることによって行った。次いで、ストレプトアビジンで被覆された常磁性粒子の懸濁液(Promega)300マイクロリットルを、このハイブリダイゼーション混合液に添加した。摂氏37度で10分間インキュベートすることにより、プローブ−標的ハイブリッドを、常磁性粒子表面に捕捉した。その粒子を、2MのGuSCNで4回、300mMのKClで3回、そして最後に、lXリガーゼバッファー(66mMのTris−HCl、pH7.5、5mMのMgCl2、1mMのDTT、1mMのATP)で2回洗浄した。洗浄後、50マイクロリットルのlXリガーゼバッファーに溶解した1単位の大腸菌 RNアーゼH(Pharmacia)を添加した。摂氏37度で10分間インキュベートすることにより、バイナリ・プローブ−標的ハイブリッドは、常磁性粒子表面から放出された。この混合物を含むチューブを、磁性分離装置によって与えられた磁場に移し、常磁性粒子を試験管の壁面に引き寄せた。次いで、アスピレーションによって上澄みを常磁性粒子から分離し、新しいチューブに入れた。
標的に正確にハイブリダイズしたバイナリ・プローブを連結させるために、プローブ−標的ハイブリッドを、候補のタンパク質であるT4DNAリガーゼとともにインキュベートした。リゲーションは、40マイクロリットルの上澄み中で、40単位のT4DNAリガーゼを添加し、このタンパク質にとって適切とされる摂氏37度で1時間インキュベートすることにより行った。
また、本実施例の検定法は、既知量のHIV感染した細胞を含むサンプルに対してもT4DNAリガーゼを用いて実施した。臨床的サンプルでこの検定法の特異性及び感度を示すために、ヒト末梢リンパ球をHIVに感染させた。これらの感染した細胞は、未感染のヒト末梢リンパ球で厳密に希釈した。異なる量、例えば、600000、60000、6000、600、60、6、0及び0個の感染した細胞を含む8本のチューブを用意した。これらのチューブは、すべて同じ数、例えば600000個の細胞を含んでいる。チューブを遠心分離して、上澄みを除去した。各チューブに、240マイクロリットルの5MのGuSCNを添加した。次いで、細胞を溶解するために、各チューブを37℃で2時間インキュベートした。溶解した後、各チューブから40マイクロリットルずつを検定した。4つすべてのプローブを含む60マイクロリットルの溶液を、溶解産物に添加した。この溶液の添加は、溶解産物中のGuSCNの濃度を2Mまで低下させた。ハイブリダイゼーション及び引き続くすべての反応は、前の段落に記載したのと同様に行った。
C.増幅
連結したバイナリ・プローブからなるレポーター分子は、次いで、Qβレプリカーゼとインキュベートすることによって増幅された。増幅に先立って、レポーター分子−標的ハイブリッドを解離する必要はない。複製反応のすべての成分を含む混合物を、8本のチューブ各々に添加した。最終反応混合物(120マイクロリットル)は、45mMのTris−HCl(pH8)、10mMのMgCl2、400マイクロモルのATP、400マイクロモルのGTP、400マイクロモルのUTP、400マイクロモルのアルファ-P32-CTP、及び1ミリリットル当たり50マイクログラムのQβレプリカーゼを含む。各反応は、摂氏37℃でインキュベートされ、各反応から、インキュベーションの10分から31分の間、1分間隔で4マイクロリットルずつのサンプルを取り出した。各サンプルを、45マイクロリットルの停止溶液(120mMのNaCl、20mMのEDTA、及び1ml当たり3マイクログラムのプロテイナーゼK)と混合した。この溶液は、必要なマグネシウムイオンを隔離することによって複製を停止させる。停止溶液は、サンプルに添加する前に、タイタープレート(titerplates)に準備した。各停止した反応液中のRNAは、RNAを酸性溶液(360mMリン酸、20mMピロリン酸ナトリウム、及び2mMのEDTA)中で沈降させ、その沈降物をブロッティング膜(ゼータ・プローブ(Zeta probe)、バイオラド(Biorad))に捕捉し、その膜を酸性溶液で洗浄することにより、組み込まれていないヌクレオシド三リン酸から分離した。ブロットのRNAをオートラジオグラフィーで観察した。
D.結果
結果は、T4 DNAリガーゼが、本発明に係る検定法で使用するのに“効率的リガーゼ”であることを示している。図4は、HIVインテグラーゼRNA分子の一連の希釈液に対する上述した検定法の典型的な結果を示す図である。図4はオートラジオグラムである。各行は、示されているように、経時的な与えられたサンプルのからのシグナルを示している。図4における各ドットの強度は、サンプルを取り出したときにチューブ内に存在するRNA量に比例している。オートラジオグラムに最初にRNAが見られる時間は、存在する標的の数に依存している。標的の数が増えるに従って、シグナルが現れるのが早くなる。標的の数が1/10になるごとに、少なくとも2分の遅れが生ずる。100個の標的までは明瞭なシグナルを発する。10標的分子または標的無しでは、さらに8分間インキュベーションしてもシグナルを発しなかった(図示せず)。HIV RNA標的の100分子は、明らかに検出可能であり、それ以下ではシグナルを発しなかった。
上述したように、T4 DNAリガーゼを用いた検定法における検出可能な標的の最小数は100分子である。他の実験から、連結反応の効率は10±2%であると判断した。我々の実験と図7に基づいて、この検定法における大腸菌DNAリガーゼの連結反応効率が約1%であると評価したが、他の実験でその効率を判断していない。連結反応効率を3倍にする、上述のプローブ9の合成における改良は、さらにこの検定法の感度を改良するが、候補のリガーゼが、本発明に係る検定法で使用できる“効率的なリガーゼ”であるか否かを決定するために、この実施例で実際に使用されたプローブを、使用することができる。
図5及び6は、HIV感染したヒト末梢リンパ球を含有するサンプルに対する、T4 DNAリガーゼを用いた本実施例に係る検定法の結果を示す。図5及び6は、図4について示したようなオートラジオグラムである。2つの実験結果をまとめて考慮すると、100000個の未感染細胞を含むサンプル中の1つの感染細胞が検出でき、感染細胞を含まないサンプルではシグナルが得られないことが示された。これらの実験において、各サンプルは、合計100000個の細胞を含んでいる。最初の実験(図5)における結果によると、サンプル中の感染細胞の数と、シグナルが現れる時間との間には明瞭な関係が見られる。感染細胞の数が増加すると、シグナルの出現が早くなる。よって、この検定法は定性的でも定量的でもある。各々100000個の未感染細胞を含む(感染細胞を含まない)2つの比較例は、シグナルを発しなかった。しかし、1個の感染細胞を含むチューブもまたシグナルを与えなかった。我々は、溶菌の後、サンプルは完全に混合されないと仮定した。溶菌されたサンプルは(細胞DNAの存在によって)極度に粘性が高く、240マイクロリットル容の溶解産物中に約6個の感染細胞しか存在しないので、検定のためにサンプルから取り出される40マイクロリットルのサンプル中にHIV RNAをサンプリングしない可能性が高い。そのような可能性をなくすために、次の実験に使用する前に、サンプルを冷凍し、解かし、次いで強力に撹拌した。これらの良く撹拌したサンプルについても検定を繰り返した。結果は、図6の下側の6サンプルに示したように、我々の仮説が正しく、適当な撹拌の後では、約1個の感染細胞からの核酸を含むチューブでも適当な遅延時間をおいて強いシグナルを発することが示された。
第2の実験の他の目的は、各感染細胞中のHIV RNA分子の数を見積もることである。この目的のために、2つの標準を用意した。第1の標準チューブである標準1は、1000000個のHIVインテグラーゼmRNA転写物を含む。第2の標準チューブである標準2は、100000個の未感染細胞からの溶解産物及び1000000分子のHIVインテグラーゼmRNA転写物を含む。実験結果は、図6の上側の2つのサンプルに示したように、未感染細胞からの溶解産物の存在は、わずかなクエンチング効果を有することが示された。この内部標準から得られたシグナルから、我々は、各感染細胞が約3000のHIV標的分子を含むことを見積もることができる。
注意書きは規則通りである。我々の実験室は、空気によって運ばれる汚染源となる傾向を有する複製可能なRNA分子についての研究に使用されている。上記の検定法の試験において、ひとつのチューブにおいて異常なシグナルを得た。増幅したRNAの電気泳動分析により、それはレポーターではないことが示された。Qβレプリカーゼは、多くのRNAを増幅し、我々のサンプルは汚染されてしまった。
実施例2:適切なリガーゼの選択
候補のタンパク質のRNA向けRNAリガーゼ活性を同定するための、極めて感度のよいスクリーニング方法を開発した。この方法で、RNA向けRNA連結反応を触媒する少なくとも二つのタンパク質を同定した。以下は、このスクリーニング方法についての記載である。
100億のHIVインテグラーゼnRNA分子を、大過剰のRNAバイナリ・プローブとDNAキャプチャー・プローブにハイブリダイズさせた。次いで、実施例1に記載したような方法で、レポーター・プローブ−ハイブリッドを捕捉し、洗浄して、RNアーゼHとインキュベートしてキャプチャー・プローブから放出させた。放出させた物質は、5つのアリコートに分注した。候補のタンパク質を4つの各アリコートに添加したので、5つのアリコートは、リガーゼを含まないもの、T4 DNAリガーゼ、T4 RNAリガーゼ、大腸菌DNAリガーゼ、および好熱性生物Thermus aquaticusから単離したDNAリガーゼを含有する。また、最後の二つのリガーゼの反応混合物は、必要とされる補助因子である、1mMのNADも含有する。最初の4つの反応を、摂氏37度でインキュベートしたが、最後の反応は、摂氏55度でインキュベートした。全ての反応を、1時間インキュベートした。連結反応後、連結されたバイナリ・プローブを、摂氏37度で15分間Qβレプリカーゼとインキュベートして増幅した。生成物を、ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分画した。
図7は、得られたオートラジオグラムである。これは、各アリコートの増幅されたレポーター分子に対応するゲルフラクション50を示している。T4 DNAリガーゼは、十分に効率的であり、本発明で使用するための候補とされる。これは、最大量の連結された生成物の合成を触媒する。大腸菌DNAリガーゼもよく作用し、候補と見なされた。T. aquaticus由来のDNAリガーゼは、リガーゼを含まない比較例と視覚的に区別できない結果をもたらした。これは、作用せず、少なくとも本発明で使用する候補としては十分に効率的とは言えなかった。
本発明で使用する候補リガーゼとして見なされるために、上述したように、タンパク質は結果、すなわち増幅された生成物50を与えなければならず、リガーゼのない比較例の生成物(バックグラウンド)より多いことを、裸眼で容易に調べることができる。この極端に感度のよい方法に基づいて、T4 DNAリガーゼを我々の検定法に使用する候補として選択した。これを実施例1の検定法に用いて、本発明に基づく検定法に使用できる“効率的なリガーゼ”であることを見いだした。実際に、100分子の検出を行う最も好ましいリガーゼであることがわかった。また、このリガーゼは、RNA標的にハイブリダイズしたDNAバイナリ・プローブの連結反応に特に“効率的”であることも分かった。
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Claims (14)
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a.該サンプルを、標的配列に相補的な一組のRNAバイナリ・レポーター・プローブとともにインキュベートして、レポーター・プローブ-標的ハイブリッドを形成する工程であって、ここで前記プローブは、一方のプローブの3’末端が他方のプローブの5’末端と隣り合うようにハイブリダイズする工程、
b.レポーター・プローブ−標的ハイブリッドをT4 DNAリガーゼまたは大腸菌DNAリガーゼとインキュベートして、RNAレポーター分子を形成する工程、および、
c.前記標的の存在を指示するものとして前記RNAレポーター分子を検出する工程
を含む核酸ハイブリダイゼーション検定法。 - 前記一組のバイナリ・プローブの一方が標的を固体表面に固定するために働き、他方の前記バイナリ・プローブが検出し得るものである、請求項1記載の検定法。
- 前記レポーター分子が、RNA向けRNAポリメラーゼの鋳型であって、さらに前記レポーター分子をRNA向けRNAポリメラーゼとインキュベートする工程を含む、請求項1記載の検定法。
- さらに工程aの後でかつ工程bの前にリバーシブル標的捕捉の工程を有する、請求項3記載の検定法。
- 前記バイナリ・プローブの両方が、前記標的配列とのハイブリダイズに寄与する少なくとも15ヌクレオチドの長さを有する、請求項3記載の検定法。
- 前記バイナリ・プローブの両方が、前記標的配列とのハイブリダイズに寄与する少なくとも15ヌクレオチドの長さを有する、請求項1記載の検定法。
- 標的配列を含有する予め選択されたRNA標的の、サンプルにおける存在を検出する、核酸ハイブリダイゼーションバイナリ・プローブ検定法であって、
a.サンプルを、固体表面に標的を固定するキャプチャー・プローブおよび固定されたレポーター・プローブ−標的ハイブリッドを形成する第一および第二RNAバイナリ・プローブとインキュベートし、ここで前記第一および第二RNAバイナリ・プローブは、一方のプローブの3’末端が他方のプローブの5’末端と隣り合うようにハイブリダイズし、
b.固定されたプローブ−標的ハイブリッドを洗浄し、
c.レポーター・プローブ−標的ハイブリッドを、増幅されるレポーター分子を形成するT4 DNAリガーゼまたは大腸菌DNAリガーゼとインキュベートし、
d.前記レポーター分子を、RNA向けRNAポリメラーゼとインキュベートして、増幅された生成物を形成し、および
e.前記標的の存在を示すものとして前記増幅された生成物の存在を検出する工程を有する検定法。 - 前記バイナリ・プローブの両方が、前記標的配列とのハイブリダイズに寄与する少なくとも15ヌクレオチドの長さを有する、請求項7記載の検定法。
- 前記RNA向けRNAポリメラーゼが、Qβレプリカーゼである、請求項8記載の検定法。
- 工程bとcとの間に、キャプチャー・プローブから、レポーター・プローブ−標的ハイブリッドを切断して、放出する工程を有する、請求項8記載の検定法。
- 標的配列を含有する予め選択されたRNA標的のバイナリ・プローブハイブリダイゼーション検定法を行うための試薬類のキットであって、
a.前記標的配列に相補的な一組のRNAバイナリ・プローブであって、一方のプローブの3’末端が他方のプローブの5’末端と隣り合うようにハイブリダイズするプローブ、
b.T4 DNAリガーゼまたは大腸菌DNAリガーゼ、および
c.検定法を行うためのインストラクション
を有するキット。 - 前記バイナリ・プローブの両方が、前記標的配列とのハイブリダイズに寄与する少なくとも15ヌクレオチドの長さを有する、請求項11記載のキット。
- 前記バイナリ・プローブが連結された生成物を指数的に増幅することのできるRNA向けRNAポリメラーゼをさらに含有する、請求項11記載のキット。
- 前記ポリメラーゼが、Qβレプリカーゼである請求項13記載のキット。
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