JP4106215B2 - Polymer thin film, method for producing polymer thin film, and biochip - Google Patents

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、生体検査分野、医療分野などに有用な新規な高分子薄膜からなるバイオチップ用の結合剤、およびその製造方法と、これを利用した遺伝子の発現、遺伝子の変異、遺伝子の多型等の解析に特に有用なバイオチップに関する。
【０００２】
【従来の技術】
医療分野等において使用する機器、例えばカテーテル等は、生体内に挿入され使用される。このように、生体内に異物である医療機器を導入することにより、生体免疫機構、生体防御機構などとの適合性が問題となる。
【０００３】
例えば、血栓症は、血液採集および処理システムのような医療機器の開発、使用において、最も障害となる問題の一つである。血液が異質の表面に接触するときに、体液および細胞の変化が起こる。このような材料の生体適合性を改善するために、抗凝固剤の固定化と、重合体表面上に生物学的に活性な抗凝血性物質を固定化することが必要とされている。
【０００４】
一方、細胞や組織における遺伝子発現の様態の解析は、これまで種々の細胞や組織からＲＮＡを調製し、そのＲＮＡをメンブレン上に固定し、解析対象の遺伝子の特異的プローブを用いてハイブリダイゼーションを行うノーザンブロット（もしくは、ドットブロット）法や、解析対象の遺伝子に特異的なプライマを用いたＲＴ−ＰＣＲ法などによって行われてきた。
【０００５】
一方、遺伝子の研究の進展により解析を必要とする遺伝子の数が急速に増加し、さらに、ゲノムプロジェクトの進展や、医療分野への応用などの進行に伴って、多数の遺伝子を一度に解析する必要性が高まっている。
【０００６】
このような要望に対して、最近、マイクロアレイ法もしくはＤＮＡチップ法が開発されつつある。これらの技術の特徴は、ガラス製の基板上に、互いに異なる数千種類のＤＮＡ断片を固定し（ＤＮＡチップまたはバイオチップという。）、この固定ＤＮＡ断片と極少量の標識されたターゲットＤＮＡ断片とのハイブリダイゼーションを行い、高感度でターゲットＤＮＡ断片を検出することである。
【０００７】
上記の方法を用いることによって、ヒト等のほ乳類や数千個の遺伝子を有する微生物の全遺伝子を数枚のＤＮＡチップ等を用いて解析することができ、標識ＲＮＡによる全遺伝子を対象とした発現量の解析を行うこともできる。また、ゲノムＤＮＡを標識することによって遺伝子欠損等の変異の解析も可能である。
【０００８】
ＤＮＡチップ等の作製において、「オン・チップ」法（基板表面上に固定するＤＮＡ断片を、直接、基板表面上で合成する方法）によらない場合には、ＤＮＡ断片は、予め調製したものを基板表面に点着し、次いで静電的相互作用あるいは共有結合によって基板表面に固定する。
【０００９】
図２は、この従来の方法の原理を説明する図である。図２（ａ）に示すように、複数種類のプローブＤＮＡ２１が入っているマイクロプレート２２を用意する。一方、図２（ｂ）に示すように、プレート２３としてガラス板を用意しておき、図２（ｃ）で示すように、プレート２３の表面にpoly-l-Lysine等のＤＮＡとガラスの結合剤２４をコーティングする。この後、マイクロプレート２２に入っているプローブＤＮＡ２１をピンに付着させ、表面にＤＮＡとガラスの結合剤（poly-l-Lysine）２４がコーティングしてあるガラスプレート２３の上に、ピンに付着させたプローブＤＮＡ２１を接触させてスポットする。マイクロプレート２２に入っている全てのプローブＤＮＡ２１をスポットし終わるまでこの作業を繰り返し、図２（ｄ）に示すＤＮＡチップを製造していた。このように、従来はプレートに予めＤＮＡとガラスの結合剤を全面コーティングし、その上にＤＮＡをプロットしてＤＮＡチップを製造していた。
【００１０】
ＤＮＡチップのハイブリダイゼーション工程は、プローブＤＮＡが結合剤でガラスのプレートにスポットされているＤＮＡチップと、蛍光物質で標識したサンプルＤＮＡを、ともにハイブリダイゼーション溶液に入れてハイブリダイズさせる。ハイブリダイゼーション溶液は、ホルムアルデヒド、ＳＳＣ（NaCl, trisodiumcitrate）、ＳＤＳ（sodium dodecyl sulfate）、ＥＤＴＡ（ethylenediamidetetraacetic acid）、蒸留水などからなる混合液であり、混合比率は使用するＤＮＡの性質により異なる。
【００１１】
このとき、サンプルＤＮＡとＤＮＡチップ上のプローブＤＮＡが相補鎖ＤＮＡであれば、両者は二重らせん構造をとり結合する。一方、両者が相補鎖でなければ結合することはなく、蛍光物質で標識したサンプルＤＮＡは、そのままハイブリダイゼーション溶液に残留するか、そのごく一部はガラスのプレート上にコーティングされている結合剤と結合し、ガーベージとして残る場合もある。
【００１２】
その後、ガラスのプレート上に残った蛍光物質で標識したサンプルＤＮＡを水槽等の中に入れて洗い流すと、プローブＤＮＡと結合していないサンプルＤＮＡは排出される。その後、プローブＤＮＡと結合しているサンプルＤＮＡに標識している蛍光物質を、所定の光源からの光エネルギーで励起させ、蛍光物質が励起して発光する光をＣＣＤなどの光センサーで検出することでハイブリダイゼーションの検出を行う。
【００１３】
しかし、poly-l-Lysine等のＤＮＡとガラスの結合剤は、ＤＮＡに対する結合力が十分でないため、上記水洗い工程の際、基板との結合が外れ、ハイブリダイズした資料まで洗い流されてしまう場合があった。このような、不十分な結合に由来するプローブＤＮＡおよびサンプルＤＮＡの損失は、多いときには７０％以上にも達し、高価なプローブＤＮＡや、貴重なサンプルＤＮＡを徒に浪費しているのが現状であった。
【００１４】
このような問題を解消すべく、結合材として種々の材料が検討されているが、未だ有効な材料が得られていない。
【００１５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、生体適合性を付与するための組織適合剤、免疫、生体反応抑制剤の固定化基質として有用な高分子薄膜と、その製造方法、および水洗い工程等においてプロ−ブ物質、サンプル物質の損失が少なく、これらのプローブ、サンプルを有効に活用することのできるバイオチップを提供することである。
【００１６】
【課題を解決するための手段】
すなわち上記目的は、以下の本発明の構成により達成される。
（１）下記構造式（Ｉ）で表される原料を蒸発させ、加熱してモノマーとした後、所定の真空度の蒸着室に導入して基材上に堆積、重合させた高分子薄膜からなるバイオチップ用の結合剤の製造方法。
【００１７】
【化３】

【００１８】
〔上記式（Ｉ）において、Ｒ_１，Ｒ_２は、−ＣＨ_２ＮＨ_２基、またはＨを表し、少なくともＲ_１，Ｒ_２のいずれかは−ＣＨ_２ＮＨ_２基である。〕
（２）少なくとも基材上に下記式（II）で表される構造単位を有する高分子薄膜からなるバイオチップ用の結合剤。
【００１９】
【化４】

【００２０】
（３） 基板上に上記（２）の高分子薄膜を結合剤として有するバイオチップ。
（４） 前記バイオチップの結合剤にはプロ−ブ物質が結合している上記（２）または（３）のバイオチップ。
（５） 前記バイオチップ用結合剤含有層は、蒸着法により形成されている上記（２）〜（４）のいずれかのバイオチップ。
（６） 前記結合剤含有層は、マスキングによりパターン形成されている上記（２）〜（５）のいずれかのバイオチップ。
【００２１】
【発明の実施の形態】
本発明の高分子薄膜は、下記構造式（Ｉ）で表される原料を蒸発させ、加熱してモノマーとした後、所定の真空度の蒸着室に導入して基材上に堆積、重合させて製造することができる。
【００２２】
【化５】

【００２３】
上記式（Ｉ）において、Ｒ₁ ，Ｒ₂ は、−ＣＨ₂ＮＨ₂ 基、またはＨを表し、少なくともＲ₁ ，Ｒ₂ のいずれかは−ＣＨ₂ＮＨ₂ 基である。Ｒ₁ ，Ｒ₂ は双方とも−ＣＨ₂ＮＨ₂ 基であってもよい。
【００２４】
このような原料化合物を用い、これを蒸発させ、基板上に堆積、重合させると、下記構造式（II）で示されるような構造単位を有する高分子薄膜が得られる。
【００２５】
【化６】

【００２６】
上記式（II）において、ｎ，ｍは整数であり、ｎ＝０であってもよいが、ｍ＝０となることはない。ｍ／ｍ＋ｎは１に近いほどフィルム中の−ＣＨ₂ＮＨ₂ 基が多いこととなり、望ましいといえるが、特に限定されるものではない。
【００２７】
上記高分子薄膜を基材上に形成することにより、生体適合性を付与するための組織適合剤、免疫、生体反応抑制剤の固定化基質として有用に機能し、種々の生化学物質、タンパク、プローブ等を良好に固定することができる。このため、医療機器の表面にこの高分子膜を形成し、免疫抑制剤、血液凝固抑制剤等を固定すれば、生体適合性を有する機器が得られる。
【００２８】
さらに、この高分子薄膜を適当な基材、基板上に形成することにより、水洗い工程等においてプロ−ブ物質、サンプル物質の損失が少なく、これらのプローブ、サンプルを有効に活用することのできるバイオチップを得ることができる。
【００２９】
このようなバイオチップは、基板とプロ−ブ、特にＤＮＡとをより確実に結合させることができ、水洗い工程等でもプローブ、サンプルが基板から流れ落ちることなく、プローブ、サンプルを有効に活用することができる。
【００３０】
構造式（Ｉ）で表される化合物は、好ましくは蒸着法、特にＣＶＤ法により、蒸発、分解させて、これを基板上に重合・堆積させることで、ガラス等の基板と良好に接着すると共に、構造式中に存在するアミノ基（ＮＨ₂ ）がプローブと良好に結合して、プローブを基板上に強固に固定することができる。特に、プローブにＤＮＡを用いた場合、ＤＮＡ断片のリン酸基（ＰＯ₄ ）と結合して、プローブＤＮＡを基板上に良好に固定することができる。
【００３１】
また、アミノ基がメチレン基（−ＣＨ₂ −）を介してキシリレン主鎖に結合しているので、アミノ基が直接結合している場合に比べ塩基性が増し、ＤＮＡ等との静電結合が強まる。
【００３２】
式（Ｉ）の化合物は、以下の方法により製造することができる。
【００３３】
先ず、［２．２〕−パラシクロファンを、塩化メチレン等の溶剤中で、鉄、ヨウ素などの触媒の存在下、臭素を滴下することによって臭素化する。また、必要によって冷却してもよい。反応の進行状況は、ガスクロマトグラフィーで追跡し、所定の組成に達したら反応を終了し、過剰の臭素は亜硫酸ナトリウム水溶液等ので中和する。その後、溶剤を留去し、残った結晶を再結晶により生成し、ブロモ−［２，２］−パラシクロファンを得る。
【００３４】
得られたブロモ−［２，２］−パラシクロファンと、当量よりやや過剰のシアン化銅を、Ｎ−メチルピロリドン等の溶媒中、２００〜２５０℃に加熱反応する。その後、アンモニア水を加え、銅化合物を溶解すると共に目的物を沈殿させる。得られた粗結晶を、再結晶あるいは昇華、またはこれらの組み合わせにより精製し、シアノ−［２，２］−パラシクロファンを得る。
【００３５】
次いで、シアノ−［２，２］−パラシクロファンを、接触還元、あるいはテトラヒドロフラン等の溶媒中で水素化リチウムアルミニウム等の還元剤を用いて還元し、アミノメチル−［２，２］−パラシクロファンを得る。
【００３６】
このようにして得られた構造式（Ｉ）のアミノメチル−［２，２］−パラシクロファンは、以下の化学蒸着法を用いて、基材上に高分子膜として成膜することができる。
【００３７】
先ず、図１に示すように、蒸発部１１、分解部１２、蒸着部１３とを有する蒸着装置を用意する。なお、図１において、蒸発部１１には蒸発材料を導入する開口部シャッタ１１ａを有し、さらに蒸発部１３にはトラップ１４を介して真空ポンプ１５が接続されている。
【００３８】
図示例の蒸着装置において、先ず蒸発部１１に固体状の蒸発材料モノアミノメチル−［２，２］−パラシクロファンを導入する。蒸発部１１の温度を、モノアミノメチル−［２，２］−パラシクロファンが気化する温度、好ましくは８０〜２００℃、特に１００〜１８０℃に加熱すると、蒸発材料が気化してダイマーガスとなり、原料ガスが生成する。
【００３９】
次いで、原料のダイマーガスを分解部１２に導入する。この分解部１２では、導入された原料ガスをその分解温度、好ましくは６００〜７５０℃、特に６５０〜７００℃まで加熱し、原料ガスを熱分解してモノマーガスとする。
【００４０】
次に、得られた原料モノマーガスを、蒸着室１３内に導入する。蒸着室１３内は、所定の真空度、好ましくは１０〜５０mTorr、特に２０〜３５mTorrに保持されている。そして、導入された原料ガスが基板に接触すると、その界面で重合し、高分子膜が形成される。
【００４１】
このようにして得られた高分子は、下記構造式（II）で表されるものである。
【００４２】
【化７】

【００４３】
上記式（II）において、ｍ、ｎは整数であり、ｎは０であってもよい。
【００４４】
成膜された、高分子膜はその膜厚が１分子分でもよいが、通常０．０５〜１０μm 、好ましくは０．１〜１μm 程度である。なお、この薄膜は、［２，２］−パラシクロファンあるいはクロロ−［２，２］−パラシクロファンからのフィルムに積層することもできる。
【００４５】
また、成膜時に所定パターンのマスクを用い、マスク蒸着を行ってもよい。このように、マスク蒸着を行うことにより、精度よく結合剤含有層パターンを形成することができ、不必要な部分にプローブや試料、例えばＤＮＡが付着してガーベージとして残り、Ｓ／Ｎを悪化させることを防止することができる。
【００４６】
本発明の高分子膜は、生体適合性を付与するための組織適合剤、免疫、生体反応抑制剤の固定化基質として有用である。また、ＤＮＡ等のプローブを固定したバイオチップの固定化基質として有用である。組織適合剤、免疫、生体反応抑制剤、プローブとしては具体的にはタンパク、抗原、レセプター、ＤＮＡ断片、ＲＮＡ断片等を挙げることができる。なかでも、ＤＮＡ等の遺伝子を固定化すると優れたバイオチップが得られる。
【００４７】
本発明で得られた高分子膜の固定化基質、つまり結着層として有するバイオチップは、プローブとの結合が良好であり、水洗い工程等においてもプローブが剥がれ落ちることもなく、原料を有効に活用することができる。
【００４８】
基材の材質は、透明なガラス、シリコンまたはポリエチレンテレフタレート、酢酸セルロース、ビスフェノールＡ等のポリカーボネート、ポリスチレン、ポリメチルメタクリレート等のポリマーであることが好ましい。なかでもガラスもしくはシリコンであることが特に好ましい。これは、表面処理の容易さや蛍光スキャニング装置による解析の容易さによるものである。シリカ表面層を持つガラスも好ましく用いられる。基板の厚さとしては、１００〜２０００μｍの範囲にあることが好ましい。なお、本発明の結着層と基材との結合性を考えると、上記ポリマーなどの樹脂材料も好ましく、さらに結合性を改善するために基材との間にカップリング剤を介在させてもよい。
【００４９】
プローブとして用いられるＤＮＡ断片は、目的によって二通りに分けることができる。遺伝子の発現を調べるためには、ｃＤＮＡ、ｃＤＮＡの一部、ＥＳＴ等のポリヌクレオチドを使用することが好ましい。これらのポリヌクレオチドは、その機能が未知であってもよいが、一般的にはデータベースに登録された配列を基にしてｃＤＮＡのライブラリー、ゲノムのライブラリーあるいは全ゲノムをテンプレートとしてＰＣＲ法によって増幅して調製する（以下「ＰＣＲ産物」という。）。あるいは、ＰＣＲ法によって増幅しないものも使用することができる。また、遺伝子の変異や多型を調べるには、標準となる既知の配列をもとにして、変異や多型に対応する種々のオリゴヌクレオチドを合成し、これを使用することが好ましい。さらに、塩基配列分析の場合には、４n（ｎは、塩基の長さ）種のオリゴヌクレオチドを合成すし、これを使用することが好ましい。ＤＮＡ断片の塩基配列は、既知であることが好ましい。
【００５０】
ＤＮＡ断片の点着は、ＤＮＡ断片を水性媒体に溶解あるいは分散した水性液を、プラスチックプレートに分注し、分注された水性液をスポッター装置を用いて基板上に滴下して行うことが好ましい。
【００５１】
点着されるＤＮＡ断片は、基板表面に対して、１０² 〜１０⁵ 種類／cm² の範囲にあることが好ましい。ＤＮＡ断片の量は、１〜１０^-15 モルの範囲にあり、重量としては数ｎｇ以下であることが好ましい。点着によって、ＤＮＡ断片の水性液は、基板表面にドットの形状で固定されるが、そのドット間の距離は、０〜１．５ｍｍの範囲にあることが好ましく、特に１００〜３００μｍの範囲にあることが好ましい。１つのドットの大きさは、直径が５０〜３００μｍの範囲にあることが好ましい。点着する量は、１００ｐＬ〜１μＬの範囲にあることが好ましく、特に１〜１００ｎＬの範囲にあることが好ましい。
【００５２】
アミノ基に対するＤＮＡの固定化には、静電相互作用を利用する方法、ＵＶクロスリンカーを用いる方法などがあるが、本発明では何れのものを用いてもよい。
【００５３】
点着後は、必要に応じて乾燥し、固定されなかったＤＮＡ断片を洗浄して除去することが好ましい。
【００５４】
前記記載の基板表面上のドットの形状は、ほとんど円形である。形状に変動がないことは、遺伝子発現の定量的解析や一塩基変異を解析するために重要である。
【００５５】
上記のようにして作製されたＤＮＡチップの寿命は、ｃＤＮＡが固定されたｃＤＮＡチップで数週間、オリゴＤＮＡが固定されたオリゴＤＮＡチップではさらに長期間である。これらのＤＮＡチップは、遺伝子発現のモニタリング、塩基配列の決定、変異解析、多型解析等に利用される。検出原理は、標識した標的核酸とのハイブリダーゼーションである。
【００５６】
サンプルである標的核酸としては、その配列や機能が未知であるＤＮＡ断片試料あるいはＲＮＡ断片試料を用いることが好ましい。
【００５７】
標的核酸は、遺伝子発現を調べる目的では、真核生物の細胞や組織サンプルから単離することが好ましい。標的がゲノムならば、赤血球を除く任意の組織サンプルから単離することが好ましい。赤血球を除く任意の組織は、抹消血液リンパ球、皮膚、毛髪、***等であることが好ましい。標的がｍＲＮＡならば、ｍＲＮＡが発現される組織サンプルから抽出することが好ましい。ｍＲＮＡは、逆転写反応により標識ｄＮＴＰ（「ｄＮＴＰ」は、塩基がアデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）もしくはチミン（Ｔ）であるデオキシリボヌクレオチドを意味する。）を取り込ませて標識ｃＤＮＡとすることが好ましい。ｄＮＴＰとしては、化学的な安定性のため、ｄＣＴＰを用いることが好ましい。１回のハイブリダイゼーションに必要なｍＲＮＡ量は、液量や標識方法によって異なるが、数μｇ以下であることが好ましい。なお、ＤＮＡチップ上のＤＮＡ断片がオリゴＤＮＡである場合には、標的核酸は低分子化しておくことが望ましい。原核生物の細胞では、ｍＲＮＡの選択的な抽出が困難なため、全ＲＮＡを標識することが好ましい。
【００５８】
標的核酸は、遺伝子の変異や多型を調べる目的では、標識プライマーもしくは標識ｄＮＴＰを含む反応系で標的領域のＰＣＲを行って得ることが好ましい。
【００５９】
標識方法としては、ＲＩ法と非ＲＩ法とがあるが、非ＲＩ法を用いることが好ましい。非ＲＩ法としては、蛍光標識法、ビオチン標識法、化学発光法等が挙げられるが、蛍光標識法を用いることが好ましい。蛍光物質としては、核酸の塩基部分と結合できるものであれば何れも用いることができるが、シアニン色素（例えば、Ｃｙ ＤｙｅTMシリーズのＣｙ３、Ｃｙ５等）、ローダミン６Ｇ試薬、Ｎ−アセトキシ−Ｎ₂ −アセチルアミノフルオレン（ＡＡＦ）、ＡＡＩＦ（ＡＡＦのヨウ素誘導体）などを使用することが好ましい。
【００６０】
ハイブリダイゼーションは、プラスチックプレートに分注しておいた、標識した標的核酸が溶解あるいは分散された水性液を、上記で作製したバイオチップ上に点着することが好ましい。点着の量は、１〜１００ｎＬの範囲にあることが好ましい。ハイブリダイゼーションは、室温〜７０℃の温度範囲で、そして６〜２０時間の範囲で実施することが好ましい。ハイブリダイゼーション終了後、界面活性剤と緩衝液との混合溶液を用いて洗浄を行い、未反応の標的核酸を除去することが好ましい。界面活性剤としては、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を用いることが好ましい。緩衝液としては、クエン酸緩衝液、リン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、トリス緩衝液、グッド緩衝液等を用いることができるが、クエン酸緩衝液を用いることが好ましい。
【００６１】
バイオチップを用いるハイブリダイゼーションの特徴は、標識した核酸の使用量が非常に少ないことである。そのため、基板に固定するＤＮＡ断片の鎖長や標識した標的核酸の種類により、ハイブリダーゼーションの最適条件を設定する必要がある。遺伝子発現の解析には、低発現の遺伝子も十分に検出できるように、低い厳密度で長時間のハイブリダイゼーションを行うことが好ましい。一塩基変異の検出には、高い厳密度で短時間のハイブリダイゼーションを行うことが好ましい。また、互いに異なる蛍光物質によって標識した標的核酸を二種類用意し、これらを同時にハイブリダイゼーションに用いることにより、同一のバイオチップ上で発現量の比較や定量ができる特徴もある。
【００６２】
【実施例】
〔実施例１〕
＜モノブロモ−［２，２］−パラシクロファンの合成＞
［２．２〕−バラシクロファン７５g と、塩化メチレン３．７Ｌの溶液に還元鉄３．０g と水０．３g を加え、３０℃以下で、撹拌下、臭素７３．５g を滴下した。反応は、ガスクロマトグラフィーで追跡し、未反応の［２，２］−パラシクロファンが３．０％まで減少した時点で、８０g チオ硫酸ナトリウム／１．５Ｌ水の溶液を加えた。
【００６３】
次に、塩化メチレン層を分取し、水酸化ナトリウム水溶液を加え、塩化メチレンを留去した。析出した沈殿を濾取、洗浄、乾燥し、１０５．５g の粗結晶を得た。これを３２０g のトルエンに加熱溶解、熱時濾過し、不溶物を除去した。さらに、このトルエン溶液を濃縮し、冷却した。析出した沈殿を濾取、乾燥して、８１．０g のモノブロモ−［２，２］−パラシクロファンを得た。
【００６４】
この化合物の、ガスクロマトグラフィー分析による組成は以下の通りであった。
［２，２］−パラシクロファン ４．０％
モノブロモ−［２，２］−パラシクロファン ９４．９％
ジブロモ−［２，２］−パラシクロファン １．０％
【００６５】
＜モノシアノ−［２，２］−パラシクロファンの合成＞
上記化合物３５g に、シアン化銅１６．４g 、Ｎ−メチルピロリドン２００mlを加え、１９５〜２０５℃で２０時間撹拌した。その後、１０％アンモニア水１．０Ｌを加え、析出した沈殿を濾取、洗浄、乾燥し、３８．９g の粗結晶を得た。これを、３０g のアセトンに加熱溶解、熱時濾過して不溶物を除去した。溶液は蒸発乾固して、２６．４g の粗結晶を得た。これを昇華精製し、６０g のエタノールで再結晶を行い、２２．３g のモノシアノ−［２，２］−パラシクロファンを主成分とする化合物を得た。
【００６６】
この化合物の、ガスクロマトグラフィー分析による組成は以下の通りであった。
［２，２］−パラシクロファン ３．０％
モノシアノ−［２，２］−パラシクロファン ９４．５％
ジシアノ−［２，２］−パラシクロファン １．８％
【００６７】
＜モノアミノメチル−［２，２］−パラシクロファンの合成＞
氷浴中で冷却した、テトラヒドロフラン５００g 中に水素化リチウムアルミニウム１５ｇを加え、２で得た化合物１５g をテトラヒドロフラン１００g に溶解させた溶液を撹拌しつつ、２０℃以下で滴下した。
【００６８】
その後、ガスクロマトグラフィーによる分析で、未反応のモノシアノ−［２，２］−パラシクロファンが１％以下になるまで、室温で撹拌を継続した。反応終了後、氷浴中で冷却しながら水１００g を加え、析出した不溶分を濾別、除去した。溶液は蒸発乾固した。得られた粗結晶に３００g のメタノールを加え、加熱溶解、室温まで冷却後、不溶物を濾別、除去した。この溶液を蒸発乾固して、１３．８g のモノアミノメチル−［２，２］−パラシクロファンを主成分とする化合物を得た。
【００６９】
この化合物の、ガスクロマトグラフィー分析による組成は以下の通りであった。
［２，２］−パラシクロファン ３．０％
モノアミノメチル−［２，２］−パラシクロファン ９４．１％
ジアミノメチル−［２，２］−パラシクロファン １．１％
【００７０】
＜高分子薄膜の形成＞
図１に示すように、蒸発部１１、分解部１２、蒸着部１３とを有する蒸着装置を用意した。
【００７１】
図示例の蒸着装置において、蒸発部１１に、式（Ｉ）の構造を有する固体状の蒸着材料モノアミノメチル−［２，２］−パラシクロファンを導入した。蒸発部１１の温度を、１００〜１５０℃に加熱すると、蒸発材料が気化して下記構造のダイマーガスとなり、原料ガスが生成した。
【００７２】
【化８】

【００７３】
上記式（Ｉ）において、Ｒ₁ ，Ｒ₂ は、−ＣＨ₂ＮＨ₂ 基、またはＨを表し、少なくともＲ₁ ，Ｒ₂ のいずれかは−ＣＨ₂ＮＨ₂ 基である。Ｒ₁ ，Ｒ₂ は、双方とも−ＮＨ₂ 基であってもよい。
【００７４】
次いで、原料のダイマーガスを分解部１２に導入した。この分解部１２では、下記式に示すように、導入された原料ガスを、その分解温度７００℃まで加熱し、原料ガスを熱分解してモノマーガスとした。
【００７５】
【化９】

【００７６】
次に、得られた原料モノマーガスを、蒸着室１３内に導入した。蒸着室１３内は、最大３０．１mmTorrの真空度に保持されている。そして、導入された原料ガスがガラス基板界面で重合し、下記構造の高分子膜が形成された。なお、このとき高分子膜とガラス基板との結合性を改善するために、ガラス基板表面をシランカップリング剤で処理してもよい。
【００７７】
【化１０】

【００７８】
次に、プローブＤＮＡとして、５’末端にＣｙ３またはＣｙ５が標識された３０mer の合成ＤＮＡの１００μＭ水溶液を用意した。マイクロプレート２２に入っているプローブＤＮＡをピンに付着させ、前記高分子膜が形成されたガラスプレート２３の上に、ピンに付着させたプローブＤＮＡを接触させてスポットした。プローブＤＮＡをスポットし終わるまでこの作業を繰り返し、図２（ｄ）に示すようなＤＮＡチップを製造した。
【００７９】
アミノ基に対するＤＮＡの固定化は、静電相互作用を利用する方法と、ＵＶクロスリンカーを利用する方法の双方を試みた。静電相互作用を利用する場合、調湿チャンバーにて一晩放置し、その後８０℃で一晩乾燥し、ＵＶクロスリンカーを用いる場合には、２分間ＵＶクロスリンカー内に放置した。さらに、各サンプルを蒸留水にて一晩洗浄した。
【００８０】
得られた各サンプルについて、ＤＮＡ固定化前（スポット時）と、固定化／水洗後の蛍光を観察し、プローブの固定状体を評価した。
【００８１】
本発明サンプルは、スポット後、ＵＶ照射後に均一なスポットが確認できた。また、洗浄後、過剰なＤＮＡがスポット部位以外にも付着する場合があり、この結着層が容易に、しかも極めて強固にＤＮＡと結合することがわかった。このため、背景の雑音を低減するためには、実際の使用にあたって、スポット部位以外にマスクするか、結着層自体をマスク蒸着するか、蛍光観察領域をスポット部位だけに限定することが望ましい。
【００８２】
【発明の効果】
以上のように本発明によれば、生体適合性を付与するための組織適合剤、免疫、生体反応抑制剤の固定化基質として有用な高分子薄膜と、その製造方法、および水洗い工程等においてプロ−ブ物質、サンプル物質の損失が少なく、これらのプローブ、サンプルを有効に活用することのできるバイオチップを提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明のバイオチップを製造するための装置の概略構成を示したブロック図である。
【図２】バイオチップの製造工程を示した模式図である。
【符号の説明】
１１ 蒸発部
１２ 分解部
１３ 蒸着部
１４ トラップ
１５ 真空ポンプ
２１ ＤＮＡ
２２ マイクロプレート
２３ 基板
２４ 結合剤含有層[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention provides a novel useful in the field of biopsy, medical field, etc. Binder for biochip made of polymer thin film And a manufacturing method thereof, and a biochip particularly useful for analysis of gene expression, gene mutation, gene polymorphism and the like using the same.
[0002]
[Prior art]
Devices used in the medical field, such as catheters, are inserted into living bodies and used. Thus, by introducing a medical device that is a foreign substance into a living body, compatibility with a biological immune mechanism, a biological defense mechanism, or the like becomes a problem.
[0003]
For example, thrombosis is one of the most problematic problems in the development and use of medical devices such as blood collection and processing systems. Changes in body fluids and cells occur when blood contacts a foreign surface. In order to improve the biocompatibility of such materials, it is necessary to immobilize anticoagulants and immobilize biologically active anticoagulants on the polymer surface.
[0004]
On the other hand, analysis of gene expression in cells and tissues has so far been conducted by preparing RNA from various cells and tissues, immobilizing the RNA on a membrane, and performing hybridization using a specific probe of the gene to be analyzed. It has been performed by Northern blot (or dot blot) method or RT-PCR method using a primer specific to the gene to be analyzed.
[0005]
On the other hand, the number of genes that need to be analyzed increases rapidly due to the progress of gene research, and many genes are analyzed at once as the genome project progresses and its application to the medical field, etc. There is a growing need.
[0006]
Recently, a microarray method or a DNA chip method is being developed in response to such a demand. The feature of these technologies is that thousands of different DNA fragments are immobilized on a glass substrate (referred to as a DNA chip or biochip), and this immobilized DNA fragment and a very small amount of labeled target DNA fragment And the target DNA fragment is detected with high sensitivity.
[0007]
By using the above method, it is possible to analyze all genes of mammals such as humans and microorganisms having thousands of genes using several DNA chips, etc., and expression for all genes by labeled RNA Quantity analysis can also be performed. In addition, mutations such as gene defects can be analyzed by labeling genomic DNA.
[0008]
When producing a DNA chip or the like, if it is not based on the “on-chip” method (a method of directly synthesizing a DNA fragment immobilized on the substrate surface on the substrate surface), the DNA fragment must be prepared in advance. It is spotted on the substrate surface and then fixed to the substrate surface by electrostatic interaction or covalent bonding.
[0009]
FIG. 2 is a diagram for explaining the principle of this conventional method. As shown in FIG. 2 (a), multiple types of probe DNA 21 Microplate containing 22 Prepare. On the other hand, as shown in FIG. In ,plate 23 Prepare a glass plate as shown in Fig. 2 (c) 23 DNA-glass binder such as poly-l-lysine on the surface 24 Coating. After this, the microplate 22 Probe DNA contained in 21 Is attached to the pin and the DNA-glass binder on the surface (poly-l-Lysine) 24 Coated glass plate 23 On top of the probe DNA attached to the pin 21 Touch to spot. Microplate 22 All probe DNA in 21 This operation was repeated until spotting was completed, and the DNA chip shown in FIG. Thus, conventionally, a DNA chip and a glass binder are coated on a plate in advance, and DNA is plotted thereon to manufacture a DNA chip.
[0010]
In the DNA chip hybridization step, a DNA chip in which probe DNA is spotted on a glass plate with a binder and a sample DNA labeled with a fluorescent substance are both put in a hybridization solution and hybridized. The hybridization solution is a mixed solution composed of formaldehyde, SSC (NaCl, trisodium citrate), SDS (sodium dodecyl sulfate), EDTA (ethylenediamidetetraacetic acid), distilled water, and the like, and the mixing ratio varies depending on the properties of the DNA used.
[0011]
At this time, if the sample DNA and the probe DNA on the DNA chip are complementary strand DNAs, the two take a double helix structure and bind to each other. On the other hand, if the two are not complementary strands, they will not bind, and the sample DNA labeled with a fluorescent substance will remain in the hybridization solution as it is, or a small part of it will be bound with a binder coated on a glass plate. It may combine and remain as garbage.
[0012]
Thereafter, when the sample DNA labeled with the fluorescent substance remaining on the glass plate is placed in a water tank or the like and washed away, the sample DNA not bound to the probe DNA is discharged. After that, the fluorescent substance labeled on the sample DNA bound to the probe DNA is excited by light energy from a predetermined light source, and the light emitted by the fluorescent substance is detected by a photosensor such as a CCD. Detect hybridization with.
[0013]
However, DNA-glass binders such as poly-l-lysine do not have sufficient binding power to DNA, and thus the binding to the substrate may be lost during the water washing step, and even the hybridized material may be washed away. there were. The loss of probe DNA and sample DNA resulting from such inadequate binding reaches 70% or more at present, and at present, expensive probe DNA and valuable sample DNA are wasted. there were.
[0014]
In order to solve such a problem, various materials have been studied as a binder, but an effective material has not yet been obtained.
[0015]
[Problems to be solved by the invention]
An object of the present invention is to provide a polymer thin film useful as an immobilization substrate for a tissue compatibility agent, immunity, and biological reaction inhibitor for imparting biocompatibility, a manufacturing method thereof, a probe substance in a washing step, etc. To provide a biochip capable of effectively using these probes and samples with little loss of sample material.
[0016]
[Means for Solving the Problems]
That is, the above object is achieved by the following configuration of the present invention.
(1) The raw material represented by the following structural formula (I) is evaporated and heated to a monomer, and then introduced into a vapor deposition chamber having a predetermined degree of vacuum and deposited on a substrate. Of biochip consisting of polymerized polymer thin film Production method.
[0017]
[Chemical 3]

[0018]
[In the above formula (I), R ₁ , R ₂ Is -CH ₂ NH ₂ Represents a group or H, at least R ₁ , R ₂ Any of -CH ₂ NH ₂ It is a group. ]
(2) having at least a structural unit represented by the following formula (II) on the substrate Binder for biochip made of polymer thin film .
[0019]
[Formula 4]

[0020]
(3) A biochip having the polymer thin film of (2) above as a binder on a substrate.
(4) The biochip according to (2) or (3), wherein a probe substance is bound to the biochip binder.
(5) The biochip binder biolayer according to any one of (2) to (4), wherein the biochip binder-containing layer is formed by a vapor deposition method.
(6) The biochip according to any one of (2) to (5), wherein the binder-containing layer is patterned by masking.
[0021]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
In the polymer thin film of the present invention, the raw material represented by the following structural formula (I) is evaporated and heated to a monomer, and then introduced into a vapor deposition chamber having a predetermined degree of vacuum to be deposited and polymerized on a substrate. Can be manufactured.
[0022]
[Chemical formula 5]

[0023]
In the above formula (I), R ₁ , R ₂ Is -CH ₂ NH ₂ Represents a group or H, at least R ₁ , R ₂ Any of -CH ₂ NH ₂ It is a group. R ₁ , R ₂ Are both -CH ₂ NH ₂ It may be a group.
[0024]
When such a raw material compound is used, evaporated, deposited on a substrate and polymerized, a polymer thin film having a structural unit represented by the following structural formula (II) is obtained.
[0025]
[Chemical 6]

[0026]
In the above formula (II), n and m are integers, and n = 0 may be satisfied, but m = 0 is not reached. As m / m + n is closer to 1, -CH in the film ₂ NH ₂ Although there are many groups, it can be said that it is desirable, but it is not particularly limited.
[0027]
By forming the polymer thin film on a base material, it functions usefully as an immobilization substrate for tissue compatibility agent, immunity, biological reaction inhibitor for imparting biocompatibility, various biochemical substances, proteins, A probe etc. can be fixed well. For this reason, if this polymer film is formed on the surface of a medical device and an immunosuppressive agent, a blood coagulation inhibitor, or the like is fixed, a device having biocompatibility can be obtained.
[0028]
Furthermore, by forming this polymer thin film on a suitable base material or substrate, there is little loss of the probe material and sample material in the water washing process, etc., and the bio that can effectively use these probes and samples. Chips can be obtained.
[0029]
Such a biochip can more reliably bind the substrate and the probe, particularly DNA, and can effectively utilize the probe and sample without causing the probe and sample to flow off the substrate even in a washing process or the like. it can.
[0030]
The compound represented by the structural formula (I) preferably adheres to a substrate such as glass by evaporating and decomposing by a vapor deposition method, particularly a CVD method, and polymerizing and depositing the compound on the substrate. , Amino groups present in the structural formula (NH ₂ ) Can bind well to the probe, and the probe can be firmly fixed on the substrate. In particular, when DNA is used as a probe, a phosphate group (PO _Four The probe DNA can be well immobilized on the substrate.
[0031]
In addition, the amino group is a methylene group (—CH ₂ Since it is bonded to the xylylene main chain via-), the basicity is increased as compared with the case where the amino group is directly bonded, and the electrostatic bond with DNA or the like is strengthened.
[0032]
The compound of the formula (I) can be produced by the following method.
[0033]
First, [2.2] -paracyclophane is brominated by dropwise addition of bromine in a solvent such as methylene chloride in the presence of a catalyst such as iron or iodine. Moreover, you may cool as needed. The progress of the reaction is monitored by gas chromatography. When the predetermined composition is reached, the reaction is terminated, and excess bromine is neutralized with an aqueous sodium sulfite solution or the like. Thereafter, the solvent is distilled off, and the remaining crystals are formed by recrystallization to obtain bromo- [2,2] -paracyclophane.
[0034]
The obtained bromo- [2,2] -paracyclophane and a slight excess of copper cyanide are heated to 200 to 250 ° C. in a solvent such as N-methylpyrrolidone. Thereafter, aqueous ammonia is added to dissolve the copper compound and precipitate the target product. The obtained crude crystals are purified by recrystallization or sublimation, or a combination thereof to obtain cyano- [2,2] -paracyclophane.
[0035]
Next, cyano- [2,2] -paracyclophane is reduced by catalytic reduction or using a reducing agent such as lithium aluminum hydride in a solvent such as tetrahydrofuran, and aminomethyl- [2,2] -paracyclo Get a fan.
[0036]
The aminomethyl- [2,2] -paracyclophane having the structural formula (I) thus obtained can be formed as a polymer film on a substrate using the following chemical vapor deposition method. .
[0037]
First, as shown in FIG. 1, a vapor deposition apparatus having an evaporation unit 11, a decomposition unit 12, and a vapor deposition unit 13 is prepared. In FIG. 1, the evaporation unit 11 has an opening shutter 11 a for introducing an evaporation material, and a vacuum pump 15 is connected to the evaporation unit 13 through a trap 14.
[0038]
In the illustrated vapor deposition apparatus, first, a solid evaporation material monoaminomethyl- [2,2] -paracyclophane is introduced into the evaporation section 11. When the temperature of the evaporation unit 11 is heated to a temperature at which monoaminomethyl- [2,2] -paracyclophane vaporizes, preferably 80 to 200 ° C., particularly 100 to 180 ° C., the evaporation material is vaporized to become dimer gas. The raw material gas is generated.
[0039]
Next, the raw material dimer gas is introduced into the decomposition unit 12. In the decomposition section 12, the introduced raw material gas is heated to its decomposition temperature, preferably 600 to 750 ° C., particularly 650 to 700 ° C., and the raw material gas is thermally decomposed into a monomer gas.
[0040]
Next, the obtained raw material monomer gas is introduced into the vapor deposition chamber 13. The inside of the vapor deposition chamber 13 is maintained at a predetermined degree of vacuum, preferably 10 to 50 mTorr, particularly 20 to 35 mTorr. When the introduced source gas comes into contact with the substrate, it is polymerized at the interface to form a polymer film.
[0041]
The polymer thus obtained is represented by the following structural formula (II).
[0042]
[Chemical 7]

[0043]
In the above formula (II), m and n are integers, and n may be 0.
[0044]
The formed polymer film may have a film thickness of one molecule, but is usually 0.05 to 10 μm, preferably about 0.1 to 1 μm. This thin film can also be laminated on a film from [2,2] -paracyclophane or chloro- [2,2] -paracyclophane.
[0045]
Further, mask deposition may be performed using a mask having a predetermined pattern during film formation. Thus, by performing mask vapor deposition, a binder-containing layer pattern can be formed with high accuracy, and a probe or sample, such as DNA, adheres to unnecessary portions and remains as garbage, thereby deteriorating S / N. This can be prevented.
[0046]
The polymer membrane of the present invention is useful as an immobilization substrate for a tissue compatibility agent, immunity, and biological reaction inhibitor for imparting biocompatibility. Moreover, it is useful as an immobilization substrate for a biochip on which a probe such as DNA is immobilized. Specific examples of the tissue compatibility agent, immunity, biological reaction inhibitor, and probe include proteins, antigens, receptors, DNA fragments, RNA fragments, and the like. In particular, when a gene such as DNA is immobilized, an excellent biochip can be obtained.
[0047]
The biochip having a polymer membrane immobilization substrate obtained by the present invention, that is, a biochip as a binding layer, has good binding with the probe, and the probe is not peeled off even in a washing step, etc. Can be used.
[0048]
The material of the base material is preferably a transparent glass, silicon or polyethylene terephthalate, polycarbonate such as cellulose acetate or bisphenol A, or a polymer such as polystyrene or polymethyl methacrylate. Of these, glass or silicon is particularly preferable. This is due to the ease of surface treatment and the ease of analysis using a fluorescence scanning device. Glass having a silica surface layer is also preferably used. The thickness of the substrate is preferably in the range of 100 to 2000 μm. In view of the bondability between the binding layer of the present invention and the base material, resin materials such as the above-mentioned polymers are also preferable, and a coupling agent may be interposed between the base material and the base material in order to further improve the bondability. Good.
[0049]
DNA fragments used as probes can be divided into two types according to the purpose. In order to examine gene expression, it is preferable to use cDNA, a part of cDNA, or a polynucleotide such as EST. The functions of these polynucleotides may be unknown, but they are generally amplified by PCR using a cDNA library, genomic library or whole genome as a template based on sequences registered in a database. (Hereinafter referred to as “PCR product”). Or what is not amplified by PCR method can also be used. In order to examine gene mutations and polymorphisms, it is preferable to synthesize various oligonucleotides corresponding to mutations and polymorphisms based on known standard sequences and use them. Furthermore, in the case of base sequence analysis, it is preferable to synthesize and use 4n (n is the length of the base) type oligonucleotide. The base sequence of the DNA fragment is preferably known.
[0050]
The spotting of DNA fragments is performed by dispensing an aqueous liquid in which a DNA fragment is dissolved or dispersed in an aqueous medium onto a plastic plate and dropping the dispensed aqueous liquid onto a substrate using a spotter device. preferable.
[0051]
The DNA fragment to be spotted is 10 ² -10 ^Five Type / cm ² It is preferable that it exists in the range. The amount of DNA fragment is 1 to 10 ^-15 It is in the range of moles, and the weight is preferably several ng or less. The aqueous solution of DNA fragments is fixed to the substrate surface in the form of dots by spotting, but the distance between the dots is preferably in the range of 0 to 1.5 mm, particularly in the range of 100 to 300 μm. Preferably there is. The size of one dot is preferably in the range of 50 to 300 μm in diameter. The amount to be spotted is preferably in the range of 100 pL to 1 μL, particularly preferably in the range of 1 to 100 nL.
[0052]
Examples of immobilization of DNA to an amino group include a method using electrostatic interaction and a method using a UV crosslinker, and any of them may be used in the present invention.
[0053]
After the spotting, it is preferable to dry as necessary and wash and remove the DNA fragments that have not been fixed.
[0054]
The shape of the dot on the substrate surface described above is almost circular. The absence of variation in shape is important for quantitative analysis of gene expression and single nucleotide mutation analysis.
[0055]
The lifetime of the DNA chip produced as described above is several weeks for the cDNA chip to which the cDNA is immobilized, and is longer for the oligo DNA chip to which the oligo DNA is immobilized. These DNA chips are used for gene expression monitoring, nucleotide sequence determination, mutation analysis, polymorphism analysis, and the like. The detection principle is hybridization with a labeled target nucleic acid.
[0056]
As the target nucleic acid as a sample, it is preferable to use a DNA fragment sample or RNA fragment sample whose sequence and function are unknown.
[0057]
For the purpose of examining gene expression, the target nucleic acid is preferably isolated from a eukaryotic cell or tissue sample. If the target is a genome, it is preferably isolated from any tissue sample except red blood cells. Arbitrary tissues other than red blood cells are preferably peripheral blood lymphocytes, skin, hair, semen and the like. If the target is mRNA, it is preferably extracted from a tissue sample in which the mRNA is expressed. mRNA is labeled by incorporating labeled dNTP ("dNTP" means deoxyribonucleotide whose base is adenine (A), cytosine (C), guanine (G) or thymine (T)) by reverse transcription reaction. It is preferable to use cDNA. As dNTP, it is preferable to use dCTP because of chemical stability. The amount of mRNA required for one hybridization depends on the amount of liquid and the labeling method, but is preferably several μg or less. When the DNA fragment on the DNA chip is an oligo DNA, it is desirable to make the target nucleic acid low in molecular weight. In prokaryotic cells, since selective extraction of mRNA is difficult, it is preferable to label total RNA.
[0058]
For the purpose of examining gene mutation and polymorphism, the target nucleic acid is preferably obtained by PCR of the target region in a reaction system containing a labeled primer or labeled dNTP.
[0059]
The labeling method includes an RI method and a non-RI method, but it is preferable to use a non-RI method. Examples of the non-RI method include a fluorescence labeling method, a biotin labeling method, a chemiluminescence method, and the like, but it is preferable to use a fluorescence labeling method. Any fluorescent substance can be used as long as it can bind to the base moiety of the nucleic acid, but cyanine dyes (eg, Cy Dye ™ series Cy3, Cy5 etc.), rhodamine 6G reagent, N-acetoxy-N ₂ -It is preferable to use acetylaminofluorene (AAF), AAIF (iodine derivative of AAF) or the like.
[0060]
For the hybridization, it is preferable to spot an aqueous liquid, which has been dispensed on a plastic plate, in which a labeled target nucleic acid is dissolved or dispersed, on the biochip prepared above. The amount of spotting is preferably in the range of 1 to 100 nL. Hybridization is preferably performed in the temperature range of room temperature to 70 ° C. and in the range of 6 to 20 hours. After completion of hybridization, washing with a mixed solution of a surfactant and a buffer is preferably performed to remove unreacted target nucleic acid. As the surfactant, sodium dodecyl sulfate (SDS) is preferably used. As the buffer solution, a citrate buffer solution, a phosphate buffer solution, a borate buffer solution, a Tris buffer solution, a Good buffer solution, or the like can be used, and a citrate buffer solution is preferably used.
[0061]
A feature of hybridization using a biochip is that the amount of labeled nucleic acid used is very small. Therefore, it is necessary to set optimum conditions for hybridization according to the length of the DNA fragment immobilized on the substrate and the type of the labeled target nucleic acid. For gene expression analysis, it is preferable to perform long-term hybridization with low stringency so that low-expressing genes can be sufficiently detected. For detection of single nucleotide mutations, it is preferable to perform hybridization with high stringency for a short time. In addition, two types of target nucleic acids labeled with different fluorescent substances are prepared and simultaneously used for hybridization, whereby the expression level can be compared and quantified on the same biochip.
[0062]
【Example】
[Example 1]
<Synthesis of monobromo- [2,2] -paracyclophane>
[2.2] -Varacyclophane and 75 g of methylene chloride were added to a solution of 3.0 g of reduced iron and 0.3 g of water, and 73.5 g of bromine was added dropwise at 30 ° C. or lower with stirring. The reaction was followed by gas chromatography. When the amount of unreacted [2,2] -paracyclophane decreased to 3.0%, a solution of 80 g sodium thiosulfate / 1.5 L water was added.
[0063]
Next, the methylene chloride layer was separated, an aqueous sodium hydroxide solution was added, and methylene chloride was distilled off. The deposited precipitate was collected by filtration, washed and dried to obtain 105.5 g of crude crystals. This was dissolved by heating in 320 g of toluene and filtered while hot to remove insoluble matters. Further, the toluene solution was concentrated and cooled. The deposited precipitate was collected by filtration and dried to obtain 81.0 g of monobromo- [2,2] -paracyclophane.
[0064]
The composition of this compound by gas chromatography analysis was as follows.
[2,2] -Paracyclophane 4.0%
Monobromo- [2,2] -paracyclophane 94.9%
Dibromo- [2,2] -paracyclophane 1.0%
[0065]
<Synthesis of monocyano- [2,2] -paracyclophane>
To 35 g of the above compound, 16.4 g of copper cyanide and 200 ml of N-methylpyrrolidone were added and stirred at 195 to 205 ° C. for 20 hours. Thereafter, 1.0 L of 10% aqueous ammonia was added, and the deposited precipitate was collected by filtration, washed and dried to obtain 38.9 g of crude crystals. This was dissolved in 30 g of acetone by heating and filtered while hot to remove insoluble matters. The solution was evaporated to dryness to obtain 26.4 g of crude crystals. This was purified by sublimation and recrystallized from 60 g of ethanol to obtain a compound containing 22.3 g of monocyano- [2,2] -paracyclophane as a main component.
[0066]
The composition of this compound by gas chromatography analysis was as follows.
[2,2] -Paracyclophane 3.0%
Monocyano- [2,2] -paracyclophane 94.5%
Dicyano- [2,2] -paracyclophane 1.8%
[0067]
<Synthesis of monoaminomethyl- [2,2] -paracyclophane>
15 g of lithium aluminum hydride was added to 500 g of tetrahydrofuran cooled in an ice bath, and a solution prepared by dissolving 15 g of the compound obtained in 2 in 100 g of tetrahydrofuran was added dropwise at 20 ° C. or lower while stirring.
[0068]
Thereafter, stirring was continued at room temperature until the unreacted monocyano- [2,2] -paracyclophane was 1% or less by analysis by gas chromatography. After completion of the reaction, 100 g of water was added while cooling in an ice bath, and the precipitated insoluble matter was separated by filtration and removed. The solution was evaporated to dryness. To the obtained crude crystals, 300 g of methanol was added, dissolved by heating, cooled to room temperature, and then insoluble matters were filtered and removed. This solution was evaporated to dryness to obtain a compound containing 13.8 g of monoaminomethyl- [2,2] -paracyclophane as a main component.
[0069]
The composition of this compound by gas chromatography analysis was as follows.
[2,2] -Paracyclophane 3.0%
Monoaminomethyl- [2,2] -paracyclophane 94.1%
Diaminomethyl- [2,2] -paracyclophane 1.1%
[0070]
<Formation of polymer thin film>
As shown in FIG. 1, a vapor deposition apparatus having an evaporation unit 11, a decomposition unit 12, and a vapor deposition unit 13 was prepared.
[0071]
In the illustrated vapor deposition apparatus, a solid vapor deposition material monoaminomethyl- [2,2] -paracyclophane having a structure of the formula (I) was introduced into the evaporation section 11. When the temperature of the evaporation unit 11 was heated to 100 to 150 ° C., the evaporation material was vaporized to become a dimer gas having the following structure, and a raw material gas was generated.
[0072]
[Chemical 8]

[0073]
In the above formula (I), R ₁ , R ₂ Is -CH ₂ NH ₂ Represents a group or H, at least R ₁ , R ₂ Any of -CH ₂ NH ₂ It is a group. R ₁ , R ₂ Are both -NH ₂ It may be a group.
[0074]
Next, the raw material dimer gas was introduced into the decomposition section 12. In this decomposition part 12, as shown in the following formula, the introduced raw material gas was heated to its decomposition temperature of 700 ° C., and the raw material gas was thermally decomposed into a monomer gas.
[0075]
[Chemical 9]

[0076]
Next, the obtained raw material monomer gas was introduced into the vapor deposition chamber 13. The inside of the vapor deposition chamber 13 is maintained at a maximum vacuum of 30.1 mm Torr. The introduced source gas was polymerized at the glass substrate interface, and a polymer film having the following structure was formed. At this time, the surface of the glass substrate may be treated with a silane coupling agent in order to improve the bonding between the polymer film and the glass substrate.
[0077]
[Chemical Formula 10]

[0078]
Next, as a probe DNA, a 100 μM aqueous solution of 30-mer synthetic DNA labeled with Cy3 or Cy5 at the 5 ′ end was prepared. The probe DNA contained in the microplate 22 was attached to the pins, and the probe DNA attached to the pins was spotted on the glass plate 23 on which the polymer film was formed. This operation was repeated until the probe DNA was spotted to produce a DNA chip as shown in FIG.
[0079]
For immobilization of DNA to amino groups, both a method using electrostatic interaction and a method using UV crosslinker were tried. When utilizing electrostatic interaction, it was left overnight in a humidity control chamber and then dried overnight at 80 ° C. When UV crosslinker was used, it was left in the UV crosslinker for 2 minutes. Furthermore, each sample was washed overnight with distilled water.
[0080]
For each of the obtained samples, the fluorescence before immobilization of DNA (at the time of spotting) and after immobilization / washing with water was observed to evaluate the immobilized state of the probe.
[0081]
The sample of the present invention was able to confirm a uniform spot after spotting and after UV irradiation. Further, it was found that after washing, excessive DNA may adhere to other than the spot site, and this binding layer binds to DNA easily and extremely firmly. For this reason, in order to reduce background noise, in actual use, it is desirable to mask other than the spot site, or to vapor-deposit the binding layer itself, or to limit the fluorescence observation region to only the spot site.
[0082]
【The invention's effect】
As described above, according to the present invention, a polymer thin film useful as an immobilization substrate for a tissue compatibility agent, immunity, and biological reaction inhibitor for imparting biocompatibility, a production method thereof, a washing process, etc. -A biochip capable of effectively using these probes and samples can be provided with little loss of the sample material and sample material.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a block diagram showing a schematic configuration of an apparatus for producing a biochip of the present invention.
FIG. 2 is a schematic view showing a biochip manufacturing process.
[Explanation of symbols]
11 Evaporator
12 Disassembly part
13 Deposition section
14 Trap
15 Vacuum pump
21 DNA
22 Microplate
23 Substrate
24 Binder-containing layer

Claims (6)

下記構造式（Ｉ）で表される原料を蒸発させ、加熱してモノマーとした後、所定の真空度の蒸着室に導入して基材上に堆積、重合させた高分子薄膜からなるバイオチップ用の結合剤の製造方法。

〔上記式（Ｉ）において、Ｒ_１，Ｒ_２は、−ＣＨ_２ＮＨ_２基、またはＨを表し、少なくともＲ_１，Ｒ_２のいずれかは−ＣＨ_２ＮＨ_２基である。〕A biochip comprising a polymer thin film obtained by evaporating and heating a raw material represented by the following structural formula (I) to a monomer and then introducing the polymer into a vapor deposition chamber having a predetermined degree of vacuum and depositing and polymerizing on a base material For producing a binder for use in an automobile.

[In the above formula (I), R ₁ and R ₂ represent a —CH ₂ NH ₂ group or H, and at least _one of R ₁ and R ₂ is a —CH ₂ NH ₂ group. ] 少なくとも基材上に下記式（II）で表される構造単位を有する高分子薄膜からなるバイオチップ用の結合剤。

A biochip binder comprising a polymer thin film having a structural unit represented by the following formula (II) on at least a substrate.

基板上に請求項２の高分子薄膜を結合剤として有するバイオチップ。  A biochip having the polymer thin film of claim 2 as a binder on a substrate. 前記バイオチップの結合剤にはプロ−ブ物質が結合している請求項３のバイオチップ。The biochip of claim 3 , wherein a probe substance is bound to the biochip binder. 前記バイオチップ用結合剤含有層は、蒸着法により形成されている請求項３又は４のバイオチップ。The biochip of claim 3 or 4, wherein the biochip binder-containing layer is formed by a vapor deposition method. 前記結合剤含有層は、マスキングによりパターン形成されている請求項３〜５のいずれかのバイオチップ。The biochip according to any one of claims 3 to 5, wherein the binder-containing layer is patterned by masking.

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