JP4105535B2

JP4105535B2 - Antiviral substance

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Publication number: JP4105535B2
Application number: JP2002357913A
Authority: JP
Inventors: 公紀長山; 武志木村; 泉平山; 孝中村; 善利岩村; 伸介江副; 明弘銀永
Original assignee: Chemo Sero Therapeutic Research Institute Kaketsuken; Kumamoto Prefecture
Current assignee: Chemo Sero Therapeutic Research Institute Kaketsuken; Kumamoto Prefecture
Priority date: 2002-12-10
Filing date: 2002-12-10
Publication date: 2008-06-25
Anticipated expiration: 2022-12-10
Also published as: JP2004189648A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明はフロロタンニンを主成分とする抗ウイルス剤に関する。さらに詳細には、エコール（eckol）、フロロフコフロエコールＡ（phlorofucofuroeckl A）、ダイエコール（dieckol）または８,８'−バイエコール（8,8'-biekcol）から選択されるいずれか１つまたは２つ以上を含むフロロタンニンを主成分とする抗ウイルス剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
人間社会およびそれを取り巻く動植物社会においてウイルス病との闘いは古来より多大な労力と経済的コストを費やし続け、いまだに多くのウイルス病に悩まされ続ける現状がある。
畜産分野では主要なウイルス病対策は予防ワクチンと飼育環境衛生管理の是非にかかっており、水産養殖においてもウイルス病対策の遅れが産業の発展を大いに阻害している。
【０００３】
ウイルス病治療薬はヒトにおいてはヘルペス、インフルエンザ、ＨＩＶ、サイトメガロウイルス病など少数の限られたウイルス病に対してのみであり、世界に蔓延しているウイルス病に対してはほんの一握りにすぎない。これは細菌性疾病用の抗菌剤の種類と数に比較すると極端に少ない。それはウイルスの多様な生態、生活環が抗ウイルス剤の開発を極めて難しいものにしているからである。開発されているウイルス病治療剤はウイルスが増殖する宿主細胞内における核酸合成、転写にかかわる酵素阻害などの局面をターゲットとしたものに集中している。
【０００４】
一方、ウイルスは感染の過程で宿主細胞から遊離し、また吸着されるように粒子が露出する過程がある。そのような局面に対しては塩素系消毒剤やヨード剤などが使用されるが、それら既存の薬剤は環境保全、生体への安全性、刺激性、金属腐食、異臭、持続性などの問題を抱えており、実際には適用に限界がある。そのような観点から抗ウイルス剤の探求が未知の天然素材に向けられるところがある。
【０００５】
自然界に生する植物には自らを病害微生物から守るために組織内に抗微生物成分を多少なりとも有している。一般に種々の植物からの化学的抽出物において、抗ウイルス作用を有したとする例は多々あるが、残念なことに化学的に物質の特定がされていない段階が殆どである。しかしながら、粗雑な段階の抽出物であれば一般には植物組織を構成する多くの雑多な組成物が混在するので、求める活性の本体が定かでなくなる問題がある。ときにその本体は微量成分であったりもする。
【０００６】
例えばポリフェノールはそのような役割を担うものがあると考えられているが、その膨大な種類の中で、どのような植物の、どのような種類のポリフェノールが、またどのような化学構造を有するものが抗ウイルス活性を有するのか実証された例は殆どないのが現状である。数種類のウイルスを用いて茶カテキン等の抗ウイルス作用が示されている程度であり（例えば、非特許文献１参照）、その他の化学的に特定されたポリフェノールについては抗ウイルス作用が報告された例はほとんどない。
【０００７】
一方、本発明者らは、褐藻類のクロメ、アラメ、カジメ等からアルコール抽出により得られるポリフェノールの１種であるフロロタンニンが強い抗菌作用を有することを見出し、フロロタンニンを主成分とする抗菌剤について特許出願した（特願２００２−８３３１６）。
フロロタンニンの生理作用については、これまで抗酸化作用（例えば、非特許文献２参照）やヒアルロニダーゼ阻害活性（例えば、非特許文献３参照）などが知られていたが、抗ウイルス作用を有することについては全く知られていなかった。
【０００８】
【非特許文献１】
岡田文雄、「チャカテキンの植物体内への吸収とウイルスの病斑形成阻害作用」、茶業研究報告、１９７８年、第４８号、ｐ．５２−５６、
【非特許文献２】
タカシ・ナカムラ（Takashi Nakamura）ら、「褐藻エイセニア・ビシクリスから単離したフロロタンニンの抗酸化活性」（Antioxidant Activity of Phlorotannins Isolated from the Brown Alga Eisenia bicyclis）、フィッシャリーズ・サイエンス（Fisheries Science）、１９９６年、第６２巻、第６号、ｐ．９２３−９２６
【非特許文献３】
トシユキ・シバタ（Toshiyuki Shibata）ら、「ヒアルロニダーゼに対する褐藻フロロタンニンの阻害作用」（Inhibitory activity of brown algal phlorotannins against hyaluronidase）、インターナショナル・ジャーナル・オブ・フード・サイエンス・アンド・テクノロジー（International Journal of Food Science and Technology）、２００２年、第３７巻、ｐ．７０３−７０９
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
このように、多種多様なウイルスを相手に、各分野で効率的にウイルス病からの健康、経済的被害を解決していくために、さらなる特徴を有した種々の抗ウイルス性物質の発見、抗ウイルス剤の開発が強く求められている。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
そこで本発明者らは、上記課題を解決すべく、先に抗菌作用を見出したフロロタンニンの生理作用について鋭意研究を重ねた結果、褐藻類のクロメ、カジメ等からアルコール抽出により得られるフロロタンニンが多くのカテゴリーのウイルスに対して強い抗ウイルス活性を有することを見出し、本発明を完成するに至った。さらに、本発明者らは、フロロタンニンの単離成分の中でもエコール、フロロフコフロエコールＡ、ダイエコール、８,８'−バイエコールが強い抗ウイルス活性を有することを見出した。
【００１１】
本発明はフロロタンニンを主成分とする抗ウイルス剤に関する。本明細書において「フロロタンニン」とは、海藻類、特に褐藻類から抽出して得られるポリフェノール成分の総称をいう。好ましくは、本発明においてフロロタンニンは、エコール、フロロフコフロエコールＡ、ダイエコールまたは８,８'−バイエコールから選択される１つまたは２つ以上を含有する天然抽出物をいう。
フロロタンニンは海藻類、特に褐藻類のクロメまたはカジメ等を乾燥処理後、アルコール抽出、さらにクロロホルム抽出等を行うことにより得ることができる。
【００１２】
本発明のフロロタンニンの具体例であるエコール、フロロフコフロエコールＡ、ダイエコールまたは８,８'−バイエコールは、単独もしくは適宜混合して使用することができる。これらの各フロロタンニンの構造式を図１に示す。
本発明のフロロタンニンが図１に示す構造を有することから、この構造をもとに化学合成等により合成することも可能であるし、該構造を適宜改変・修飾して化学合成による新たな抗ウイルス剤の開発の出発物質とすることもできる。
【００１３】
これまでに知られた多くの抗ウイルス剤が細胞内での核酸合成・転写系に作用することによって抗ウイルス作用を発現するのに対し、本発明のフロロタンニンを主成分とする抗ウイルス剤は、ウイルス粒子に対して直接的に作用し、その感染性を失わせることを特徴とし、それゆえ幅広い抗ウイルススペクトルを有している。本発明のフロロタンニンを主成分とする抗ウイルス剤はまた、エンベロープを有するウイルスに対して一層強い抗ウイルス作用を発現する。
【００１４】
上記のように、本発明のフロロタンニンは、様々なカテゴリーに属する病原ウイルスに対して強くかつスペクトルの広い抗ウイルス活性を有する。例えば、本発明のフロロタンニンは、ヘルペスウイルス科、ラブドウイルス科、ブンヤウイルス科、アーテリウイルス科、フラビウイルス科、コロナウイルス科、パラミクソウイルス科、オルビウイルス科、ビルナウイルス科等の多種のウイルスに対して強い抗ウイルス活性を有する。中でも、ヘルペスウイルス科、ラブドウイルス科、ブンヤウイルス科、アーテリウイルス科、フラビウイルス科のウイルスに対して特に強いウイルス活性を示す。本発明のフロロタンニンはまた、供試したウイルスのうちエンベロープを有するウイルスについては全て抗ウイルス活性を示したことから、エンベロープウイルスに対して特に顕著な抗ウイルス活性を有する。
【００１５】
本発明のフロロタンニンはまた、クルマエビ類急性ウイルス血症（Penaeid Acute Viremia：ＰＡＶ）の原因ウイルスであるＰＲＤＶ（penaeid rod-shaped DNA virus：クルマエビの桿状ＤＮＡウイルス：直径111〜152nmの桿状でエンベロープを有する）に対しても強い抗ウイルス活性を有している。クルマエビ類急性ウイルス血症（ＰＡＶ）は９０年代初めに発生して以来、養殖エビ産業の存立、経営に毎年深刻な打撃を与え続けているが、このような病害によるダメージの大きいＰＡＶ対策としても本発明のフロロタンニンを適用できることが明らかとなった。
【００１６】
さらに、本発明のフロロタンニンは、豚オーエスキー病ウイルス（ＡＤＶ）に対しても強い抗ウイルス活性を有する。オーエスキー病は養豚業においては産業上非常に重要なウイルス病の一つであり、その病害対策としてはワクチンによる発症予防と養豚環境の衛生管理において多大の労力、経費コストが費やされ続けている。豚オーエスキー病に限らず、産業界、医療社会においてのウイルス病対策はワクチン予防が主であり、周辺の衛生管理対策に膨大なコストを投じている。ここに、このような病害ウイルスに対して生体周辺領域（感染経路）でフロロタンニンとの接触機会を作れば、少なくとも細胞表面もしくは遊離したウイルスは撲滅されると考えられる。
【００１７】
上記抗ウイルス作用は、図１に示したフロロタンニンの構造体を有すれば表１に示すような多種のウイルスに対して有効に作用することから、将来的にはこのような物質の化学合成への効率的な道筋を開くものであり、天然抽出物から精製して得たフロロタンニンが新たなタイプの合成抗ウイルス剤の開発に寄与することができる。
【００１８】
本発明のフロロタンニンはさまざまな病害ウイルス粒子を直接もしくは吸着段階で作用する特徴を有することから、用途においてはこの特徴を活かすことが効率的であるといえる。すなわち、本発明のフロロタンニンは起因ウイルスに対して強い抗ウイルス活性を有していることから、フロロタンニンを経口的、経皮的、あるいは浸漬等、直接、間接的に接触する機会を設定することで、生物のウイルス病を効果的に感染阻止・抑制ができる。
【００１９】
とりわけ、下記実施例７に示すように、日常的にフロロタンニンを体内に摂取した動物においてウイルス病の感染防御が可能であることから、フロロタンニンを経口的に摂取し、常時刺激を受けさせることによりウイルス感染抵抗力を高揚させることができる。従って、本発明のフロロタンニンは、ウイルスに対する直接作用のみならず生体に対して、適切な体内・体表刺激を与える間接的作用としても効果を有する。このように、本発明のフロロタンニンは経口摂取のみならず、呼吸器、体表粘膜、筋肉内等生体への適切な刺激を施すことで、感染・侵入経路の異なるウイルスに対しても一定のウイルス病感染防御対策として活用できる。
【００２０】
さらに本発明のフロロタンニンは、以下に記載する安全性試験の結果から明らかなように（実施例９）、高濃度のフロロタンニン添加水を飲用し続けても、あるいは一時に大量に飲み込んでも何ら異常は認められず、生体に安全で、また環境負荷の小さい極めて稀有な抗ウイルス性物質であることがわかっている。したがって、本発明のフロロタンニンは呼吸器系のウイルス病をモデルにした実施例７で日常から経口的に摂取された場合でもウイルス感染防御力が高まることが示されたことと相俟って、フロロタンニンの有効な使用方法の態様として、医薬品のみならず飲食品添加物、飼料添加物などへの応用が可能である。
本発明のフロロタンニンは対象とするウイルス病対策への用法と効率性から、実施例２および３のようにこれらの各成分を適量混合した状態で用いる場合と、さらに効果を極めるための特定の単離フロロタンニンを用いる場合など、その必要性に応じて用途ごとに選択し、組み合わせる使い方ができる。
【００２１】
このような基本的、具体的活性から本発明のフロロタンニンは以下の用途に使用できる：
（１）農畜水産愛玩動物分野における各種ウイルス病の防除：使用法としては、例えば、飼料成分、飼料添加剤、飲水混和剤、予防・治療薬・生産環境における殺ウイルス剤、消毒剤、種苗生産管理；
（２）一般生活環境における衛生管理；
（３）医療分野における衛生管理、予防・治療薬；
（４）食品素材、機能性食品・飲料素材；
（５）特定ウイルス病の化学合成による特効薬開発における基本構造物質。
【００２２】
【実施例】
以下に本発明を実施例によりさらに詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
《実施例１：フロロタンニン抽出法・種類・性状・成分》
褐藻類のクロメ（Ecklonia kurome）を乾燥して粉砕した。得られたクロメの粉末（水分約１０％、800ｇ）をメタノール（2,400 mL）とともに５℃で４８時間振とう（90 rev min-1）して抽出した。抽出物を減圧下で濃縮し、メタノール（240 mL）、クロロホルム（480 mL）、水（180 mL）を加え、上層と下層に分かれさせて、上層を酢酸エチル（300 mL）で２回抽出した。酢酸エチル層を減圧下で濃縮したものをフロロタンニン抽出物とした。クロメの粉末からのフロロタンニン抽出物の収量は約３％であった。
【００２３】
上記フロロタンニン抽出物は、フロログルシノール（phloroglucinol：２％）、エコール（９％）、フロロフコフロエコールＡ（２８％）、ダイエコール（２４％）、8,8'-バイエコール（７％）、その他（３０％）で構成されており（図１参照）、ケイ酸カラムクロマトグラフィー（15 mm i.d.×150 cm, Wakogel C-300HG, 和光純薬化学工業）で、クロロホルム：メタノール：水（80:20:2, v/v）によって各フロロタンニンを分離した。分離した画分が、それぞれエコール、フロロフコフロエコールＡ、ダイエコール、8,8'−バイエコールの単一成分であることは、薄層クロマトグラフィー（Silica Gel 60 F_２５４, Merck）をクロロホルム：メタノール：水：酢酸 (50:25:4:3, v/v)で展開して確認した。
フロログルシノールは和光純薬化学工業製（水和物、純度９８％以上）のものを以下の試験に使用した。
【００２４】
《実施例２：フロロタンニンの抗ウイルス活性》
各産業分野において問題となっている代表的なウイルス病の起因ウイルスについて、フロロタンニンの抗ウイルス活性についてウイルス中和法を用いて検討した。
実施方法は各ウイルスの特性に応じた評価用材料（培養細胞、培地等）および判定法（ＣＰＥ、プラーク等）を適用した。実施例１で調製したフロロタンニン抽出物の濃度の２倍階段希釈系列と１００ＴＣＩＤ_５０／ｍＬ相当のウイルス液を等量ずつ混合し、１時間反応後にその反応液をそれぞれの評価系（培養細胞、プラーク法等）に一定量ずつ１時間吸着処理し、その後それぞれの培養条件下に培養を行い、接種後７日目（ＨＶＴＶは５日目）のウイルス力価をＣＰＥまたはプラーク数などを指標に判定し、各評価系において５０％有効量（ＴＣＩＤ_５０、プラーク減少等）をプロビット法により求めた。
【００２５】
各ウイルスに用いた株化細胞等の種類、判定法等は表１の各欄に示した。なお、反応およびその後の培養温度は、牛呼吸器病ウイルス（ＢＲＳＶ：３４℃）、マダイイリドウイルス（ＩＲＤＶ：２５℃）、マリンビルナウイルス（ＭＡＢＶ：２０℃）、伝染性膵臓壊死症ウイルス（ＩＰＮＶ：１８℃）、伝染性造血器壊死症ウイルス（ＩＨＮＶ：１８℃）とし、その他は３７℃で実施した。
【００２６】
その結果、フロロタンニンは、供試したウイルスの中で、七面鳥ヘルペスウイルス（ＨＶＴＶ）、豚オーエスキー病ウイルス（ＡＤＶ）、牛伝染性鼻気管炎ウイルス（ＩＢＲＶ）（いずれもヘルペスウイルス科）、牛流行熱病ウイルス（ＢＥＦＶ）、サケ・マス類の伝染性造血器壊死症ウイルス（ＩＨＮＶ）（いずれもラブドウイルス科）、アカバネ病ウイルス、アイノ病ウイルス（いずれもブンヤウイルス科）、豚の繁殖・呼吸障害症候群ウイルス（ＰＲＲＳＶ）（アーテリウイルス科）、日本脳炎ウイルス（ＪＥＶ）、牛ウイルス性下痢・粘膜病ウイルス（ＢＶＤＶ）（いずれもフラビウイルス科）、牛カスバ病ウイルス（オルビウイルス科）に対して強い抗ウイルス活性を有した。これらのウイルスのほとんどはエンベロープウイルスであった。
【００２７】
また、上記ほどではないが、鶏の伝染性咽頭気管炎ウイルス（ＩＬＴＶ）（ヘルペスウイルス科）、鶏の伝染性気管支炎ウイルス（ＩＢＶ）（コロナウイルス科）、牛呼吸器病ウイルス（ＢＲＳＶ）（パラミクソウイルス科）、牛イバラキ病ウイルス（オルビウイルス科）、サケ・マス類の伝染性膵臓壊死症ウイルス（ＩＰＮＶ）、海産魚マリンビルナウイルス（ＭＡＢＶ）（いずれもビルナウイルス科）にも抗ウイルス活性が認められた。なお、イリドウイルス科のマダイイリドウイルス（ＩＲＤＶ）に対しては、本発明のフロロタンニンは抗ウイルス活性を示さなかった。
【００２８】
従って、本発明のフロロタンニンはウイルスの各カテゴリーを超えた広い範囲に強い抗ウイルス活性を有するものである。フロロタンニンの有用性においては上記の評価を基本にし、その他のファクターを考慮して、ウイルス病全般に対応した用途あるいは特定のウイルス病対策に用いる用途と効率性、効果の面から用途目的に応じたよく選択された利用ができる。
【００２９】
【表１】

【００３０】
《実施例３：単離フロロタンニンの抗ウイルス活性》
フロロタンニンを実施例１に記載の方法で単離精製すると５種類の単離フロロタンニンが得られる。これら各単離フロロタンニンはそれぞれ化学構造式が異なるため、このような化学構造の違いが抗ウイルス活性の程度にどのように影響するか検討する必要がある。代表として伝染性造血器壊死症ウイルス（ＩＨＮＶ）、オーエスキー病ウイルス（ＡＤＶ）および牛呼吸器病ウイルス（ＢＲＳＶ）を用いて各単離フロロタンニンの抗ウイルス活性を調べた（表２）。表２の結果から明らかなように、フロロフコフロエコールＡ、ダイエコールおよび８,８'−バイエコールが強い抗ウイルス活性を示し、エコールも抗ウイルス活性を示した。しかしながら、フロログルシノールでは効果が認められなかった。
【００３１】
【表２】

【００３２】
《実施例４：クルマエビ類急性ウイルス血症に対する感染防止効果》
クルマエビ類急性ウイルス血症（ＰＡＶ）の原因ウイルスであるＰＲＤＶ（penaeid rod-shaped DNA virus：クルマエビの桿状ＤＮＡウイルス）の感染防止効果をフロロタンニンが持つか否かを調べた。
ウイルス液は、平成１３年度に熊本県でＰＡＶにより死亡したクルマエビのリンパ様器官を集めて１０倍量の滅菌海水でホモジナイズ後、遠心分離（3000 rpm×15 min）で得られた上清を0.45μmのフィルターろ過したものを滅菌海水で10⁶倍に希釈して調製した。なお、このウイルス液を５尾のエビに0.1mL筋肉注射したところ、エビは全て４日以内に死亡し、ウイルス液の感染力が保持されていることを確認した。
【００３３】
実施例１で調製した所定濃度のフロロタンニン抽出物の溶液と前述のウイルス液を混合して２５℃で１時間放置した。反応時のフロロタンニン濃度は、０mg/L、0.8mg/L、1.6mg/L、3.1mg/L、6.3mg/L、12.5mg/L、25mg/L、50mg/Lの８区を用いた。各区の混合液0.1ｍLをエビ（ｎ＝１０）に筋肉注射し、注射後のエビを各区別々の水槽で８日間給餌飼育を行ない死亡率を調べた。その結果、対照区（フロロタンニン０mg/L）のエビが全て死亡したにもかかわらず、フロロタンニン濃度1.6mg/L以上の全ての区が６０％以上の生残率であり、フロロタンニンがＰＲＤＶの感染防止効果を持つことが確認できた（図２）。したがって、フロロタンニンをこの危害ウイルスがエビに浸襲する過程に与えれば効率的に本ウイルスの被害を防御でき、それらの機会はエビの浸漬、体表、経口（餌料）、注射等を状況に応じて選択できる。なお、フロロタンニンは400mg/Lの濃度で筋肉注射してもエビが死亡しないことを確認した。
【００３４】
《実施例５：フロロタンニンの豚オーエスキー病ウイルスに対する有効性》
強毒豚オーエスキー病ウイルス（ＡＤＶ：ＹＳ−８１）は豚以外にも感染力があり、マウスなどのげっ歯類に感染すれば死亡することが知られている。そこで、このＡＤＶのマウス感染系を用いてフロロタンニンがウイルスの感受性動物に対して実際に有効かどうかを検討した。
【００３５】
致死量（１０ＬＤ_５０）のＡＤＶ液とフロロタンニン抽出液（実施例１で調製したもの；各濃度）を試験管内で等量混和後３分および１時間（２７℃）にマウス（ＳＰＦ、ｄｄｙ系、オス、４週令；以下の実施例においても同規格を使用）腹腔内に0.5mLずつ投与し、７日間生残効果を観察した（１群７〜８匹供試）。その結果、図３に示すように、対照群が全例感染死したのに対して、20〜500mg/Lフロロタンニンと投与前１時間接触させた各群はいずれも100％生残した。また、フロロタンニンは同様に３分間の短時間接触系の場合でも、20mg/Lで50％生残し（その他は100％生残）、ＡＤＶのマウス感染死を明らかに阻止した（図３ＡはフロロタンニンとＡＤＶを混和３分後に腹腔内投与した場合、図３Ｂは混和１時間後に腹腔内投与した場合を示す）。
このように、フロロタンニンは試験管内あるいは生体内外環境において感受性ウイルスと直接接触・共存の機会を作ることで、ウイルス病の感染防御に有効に作用することが示された。
【００３６】
《実施例６：フロロタンニンのＡＤＶ経鼻感染系における有効性》
野外でのオーエスキー病ウイルスは動物の呼吸器系で感染するため、マウス経鼻ルートでフロロタンニンおよびＡＤＶ投与系を用いて、フロロタンニンの感染防御効果を検討した。供試マウスを軽度にエーテル麻酔後、2000mg/L濃度のフロロタンニン（実施例１で調製したフロロタンニン抽出物）を綿棒に浸し、マウスの鼻孔に塗布（20μL／マウス）後３分にウイルス液（１０および１ＬＤ_５０）を同様に塗布し、その後の生残率を７日間観察した（１群７〜８匹）。その結果、図４に示した通り、フロロタンニンは呼吸器系ルートでのマウスＡＤＶ感染に対して防御効果を示した。この結果はフロロタンニンが生物社会において、一般に起こりうる外界からの同様な感染経路もしくは体表等から感染する感受性ウイルスに対する有効なウイルス病防除手段として適用できることを示唆している。
【００３７】
《実施例７：フロロタンニンの経口摂取によるＡＤＶ感染防御》
日常的にフロロタンニンを体内に摂取した動物において、フロロタンニンによるウイルス病の感染防御が可能かどうかを以下の方法で検討した。即ち、マウス常用の飲水中に実施例１で調製したフロロタンニン抽出物を８００、２００、および０（ＰＢＳ）ｍｇ/Ｌ含有させ、ウイルスの感染３日前から攻撃試験観察終了日までの１０日間自由に与え続けたマウスにおいて、実施例６で示したＡＤＶ経鼻感染系による評価を行った。その結果、図５に示すように、フロロタンニンを与えた場合、フロロタンニン未摂取の場合に比べて明らかに高い生残率が観察された。
【００３８】
《実施例８：フロロタンニンのＡＤＶ感染における予防および治療効果》
フロロタンニンの予防および治療的投与効果を実施例６および７に示すＡＤＶのマウス経鼻感染系を用いて検討した。即ち、本系におけるＡＤＶ感染時の１時間前（−１ｈ）、３分前（直前）を予防的投与、およびＡＤＶ感染の３分後（直後）、１時間後（＋１ｈ）を治療的投与としてフロロタンニン抽出物（実施例１で調製したもの）を投与した試験群、さらに試験管内で同フロロタンニン抽出物とウイルス液を等量混合後直ちに投与（０）した試験群、およびＰＢＳ対照群を設けた（１群７〜８匹）。
【００３９】
その結果、図６に示すように、フロロタンニンは予防的投与および治療的投与のいずれにおいてもウイルス病に対する感染防御効果が認められた。これら結果は、フロロタンニンをウイルス病流行期の予防薬や治療薬として用いることが可能であることを示している。したがって、フロロタンニンは宿主生物のウイルス病防除に用いる時、実施例７に示す間接効果のみならず、フロロタンニンと対象ウイルスとの接触機会を生体内外で効率的に作りだすことが効果をより鮮明にする傾向にあることを示している。
【００４０】
《実施例９：フロロタンニンの安全性》
フロロタンニンは呼吸器系のウイルス病をモデルにした実施例７で日常から経口的に摂取された場合でもウイルス感染防御力が高まることが示された。これはヒトおよび動物が常用する飲食物などを介して適切なフロロタンニン摂取を施すことでウイルス病の予防、治療の一つの効果的手段とすることができることを意味する。そこで、フロロタンニンの哺乳類への安全性を確認する目的で以下の試験を実施した。
【００４１】
フロロタンニンを生体に接触もしくは取り込み利用するには様々な形態が考えられる。例えば、飲食物、添加物、化粧品、洗浄除菌剤、消毒剤、医薬、日常生活用品等が考えられるが、まず、生体における安全性について小動物を用いて試験を行った。ＩＣＲ系雌雄マウス（４週齢）を用いて実施例１で調製したフロロタンニン抽出物を飼育用水に添加し、１４日間の自由飲水、および経口投与（単回大量投与）して、その後の健康状態を体重の推移により検討した。
その結果、図７に示すように、雌雄を問わず、高濃度のフロロタンニン添加水を飲用し続けても、あるいは一時に大量に飲み込んでも、いずれの場合も増体重に異常はなかった。また、一般状態においても何ら異常は示さなかった。
【００４２】
本実施例で体内に取り込まれたフロロタンニンは１４日間の飲水投与では、雄1500mg/kg/day、雌1286mg/kg/day、単回投与では雄168.2mg/kg/day、雌193.7mg/kg/dayに相当し、この摂取量は通常の生活では得られない大量のものであり、生体への実際の応用域において安全性が高いことが示された。
このことは、フロロタンニンを病害ウイルスによる健康阻害や、感染症に対する予防および治療目的に生体内に取り込むことに支障がないことを示すものであり、フロロタンニンの有効な使用方法の態様として、医薬品に加えて飲食品添加物、飼料添加物などへの応用が可能であることを示唆するものである。
【００４３】
実施例２から９に示すように、本発明において、フロロタンニンが社会生活上問題になっているウイルス病防除において有効な物質であることが明らかとなった。さらに、本物質の応用においては、対象とするウイルス病の特徴、性状に応じて、当該ウイルス病宿主の体内外域で直接的または間接的に接触する機会を効率よく導き、構築することが不可欠となる。
【００４４】
【発明の効果】
上記のように本発明のフロロタンニンは、以下の特徴を有する：
（１）フロロタンニンは海藻の褐藻類クロメ等に含まれる抗ウイルス作用を有する成分の本体である；
（２）フロロタンニンは新たな抗ウイルス性物質として、その化学構造とともに明らかにされた。各単離フロロタンニンのうち４種類の単離フロロタンニン、すなわちエコール、フロロフコフロエコールＡ、ダイエコールおよび８,８'−バイエコールがそれぞれに抗ウイルス活性を有することが分かった。これらの単離品は用途に応じて２種類以上組み合わせて用いることができる；
（３）これら抗ウイルス活性を有する化学構造体は、将来化学合成等による新たなタイプの抗ウイルス剤開発の方向性・可能性を示唆することに寄与する；
（４）本発明のフロロタンニンは問題となっている宿主生物のウイルス病防除策に新たな解決手段を提供する。本物質は対象ウイルスに直接作用させることでその効果を顕著に現出させる。本物質は細胞遊離ウイルス、細胞吸着段階のウイルスに効率よく作用し、生体への投与法においては対象ウイルス病の感染経路を考慮した注射、経口、経皮、および呼吸器系等を選択することができる；
（５）既存の多くの抗ウイルス剤が細胞内での核酸合成・転写系に作用するのに対し、本発明のフロロタンニンはウイルス粒子に対して直接的に作用し、その感染性を失わせることから、幅広い抗ウイルススペクトルを有する。またエンベロープを有するウイルスにその効果が強い傾向にあることがわかった。さらに本物質は生体に安全で、また環境負荷の小さい極めて稀有な抗ウイルス性物質である；
（６）本発明のフロロタンニンは様々なウイルス（病）のうち、ヘルペスウイルス科、ラブドウイルス科、ブンヤウイルス科、フラビウイルス科、アーテリウイルス科のウイルスに対して特に感受性が高く、特効薬となる素地を有している；
（７）本発明のフロロタンニンはウイルス病に悩まされ、かつ十分な制御が出来ない様々な社会生活において有用である。それは宿主を取り巻く環境衛生管理（公衆衛生・医療、農畜水産業、建築施設）、生活用品、機能性食品・飲料添加素材、産業動物の飼料添加物、植物防疫、および医薬・医薬部外品などに適用できる；
（８）本発明のフロロタンニンは種々のウイルス病対策において、これまでにない新たなタイプのウイルス病防除用材料と手段になる。本物質と既存のウイルス病対策手段とを組み合わせて特徴を活かした相互補完により、今までにない総合的なウイルス病対策を講じることが可能となる。その結果、種々の生物のウイルス病被害およびそれに付随した経済的損失の改善が可能となる；
（９）本発明のフロロタンニンは、とりわけクルマエビ類の急性ウイルス血症の起因ウイルスであるＰＲＤＶ対策に新たな防除手段として用いることができる。その適用法は状況に応じて経口投与（飼料添加物）、浸漬投与、スプレー投与、もしくは注射法などが効果的である。また、養殖環境における感染源対策として飼育海水・土壌・生息生物付着ウイルス・器材消毒にも用いることができる。このような用法は本物質がＰＲＤＶに直接作用させることで抗ウイルス効果があり、かつ海水環境保全との調和も既存の化学消毒剤に比べて優れているからである；
（１０）本発明のフロロタンニンはまた、豚のオーエスキー病ウイルス（ＡＤＶ）に対して新たな防疫手段を提供する。具体的には感染機会を極力抑制するために、養豚飼育環境の消毒、豚への直接噴霧、飲水・飼料添加物、および予防・治療薬としての適用ができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】各フロロタンニンの構造式を示す図。
【図２】フロロタンニンとＲＰＤＶの混和液を投与したクルマエビの生残率の経時変化を示すグラフであり、フロロタンニンのＰＲＤＶに対する感染防御効果を示す。
【図３】フロロタンニンのマウスを用いたオーエスキー病ウイルス（ＡＤＶ）感染防御効果（注射）を示すグラフ。Ａは、フロロタンニンとＡＤＶを混和３分後に腹腔内投与した場合、Ｂは、混和１時間後に腹腔内投与した場合をそれぞれ示し、いずれの場合も攻撃ウイルス量は１０ＬＤ_５０である。
【図４】フロロタンニンのマウスを用いたオーエスキー病ウイルス（ＡＤＶ）経鼻感染系における感染防御効果（呼吸器感染）を示すグラフ（攻撃ウイルス量は１０ＬＤ_５０）。
【図５】フロロタンニンのマウスを用いたオーエスキー病ウイルス（ＡＤＶ）感染防御効果（経口摂取）を示すグラフ（攻撃ウイルス量は１０ＬＤ_５０）。
【図６】フロロタンニンのマウスを用いたオーエスキー病ウイルス（ＡＤＶ）感染防御効果（予防・治療的投与）を示すグラフ（経鼻感染７日後；攻撃ウイルス量は１０ＬＤ_５０）。
【図７】フロロタンニンを経口摂取したマウスの増体重率を示すグラフ。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to an antiviral agent containing phlorotannin as a main component. More particularly, any one selected from eckol, phlorofucofuroeckl A, dieckol or 8,8'-biekcol or The present invention relates to an antiviral agent mainly containing phlorotannin including two or more.
[0002]
[Prior art]
In human society and the animal and plant society surrounding it, the fight against viral diseases has spent a great deal of labor and economic costs since ancient times, and is still suffering from many viral diseases.
In the livestock field, the main countermeasures against viral diseases depend on the pros and cons of preventive vaccines and breeding environmental hygiene management, and the delay in countermeasures against viral diseases in aquaculture has greatly hindered industrial development.
[0003]
Viral disease treatments are limited to a few limited viral diseases in humans, such as herpes, influenza, HIV, cytomegalovirus disease, and only a handful of viral diseases that are prevalent in the world. Absent. This is extremely small compared to the type and number of antibacterial agents for bacterial diseases. This is because the diverse ecology and life cycle of viruses make it difficult to develop antiviral drugs. The therapeutic agents for viral diseases that have been developed are concentrated on those targeting aspects such as nucleic acid synthesis and enzyme inhibition related to transcription in the host cell where the virus grows.
[0004]
On the other hand, the virus is released from the host cell during the infection process, and there is a process in which the particles are exposed to be adsorbed. Chlorine disinfectants and iodine agents are used for such situations, but these existing drugs have problems such as environmental protection, safety to the living body, irritation, metal corrosion, off-flavor, and sustainability. In fact, there is a limit to application. From such a point of view, the search for antiviral agents is directed to unknown natural materials.
[0005]
Naturally occurring plants have some antimicrobial components in their tissues to protect themselves from diseased microorganisms. In general, there are many examples of chemical extracts from various plants that have antiviral activity, but unfortunately most of them are not chemically identified. However, if the extract is in a rough stage, generally, many miscellaneous compositions constituting the plant tissue are mixed, so that there is a problem that the main body of activity to be sought cannot be determined. Sometimes the body is a minor component.
[0006]
For example, polyphenols are considered to have such a role, but among the vast variety, what kind of plant, what kind of polyphenol, and what chemical structure At present, there are almost no examples of whether or not has antiviral activity. An example in which antiviral activity such as tea catechin has been shown using several types of viruses (see, for example, Non-Patent Document 1), and antiviral activity has been reported for other chemically specified polyphenols. There is almost no.
[0007]
On the other hand, the present inventors have found that fluorotannin, which is one of polyphenols obtained by alcohol extraction from brown algae, such as chrome, arame, cajime and the like, has a strong antibacterial action, and an antibacterial agent mainly composed of phlorotannin. (Patent application No. 2002-83316).
Regarding the physiological action of phlorotannins, antioxidative action (for example, see Non-patent Document 2) and hyaluronidase inhibitory activity (for example, see Non-Patent Document 3) have been known so far. Was not known at all.
[0008]
[Non-Patent Document 1]
Fumio Okada, “Absorption of Chacatechin into Plants and Viral Spot Formation Inhibition”, Tea Industry Research Report, 1978, No. 48, p. 52-56,
[Non-Patent Document 2]
Takashi Nakamura et al., “Antioxidant Activity of Phlorotannins Isolated from the Brown Alga Eisenia bicyclis”, Fisheries Science, 1996. 62, No. 6, p. 923-926
[Non-Patent Document 3]
Toshiyuki Shibata et al., “Inhibitory activity of brown algal phlorotannins against hyaluronidase”, International Journal of Food Science and Technology. Technology), 2002, 37, p. 703-709
[0009]
[Problems to be solved by the invention]
In this way, the discovery of various antiviral substances with additional features, anti-viral effects, in order to efficiently resolve the health and economic damage from viral diseases in various fields against a wide variety of viruses. There is a strong demand for the development of viral agents.
[0010]
[Means for Solving the Problems]
Therefore, in order to solve the above-mentioned problems, the present inventors have conducted extensive research on the physiological action of fluorotannin, which has previously been found to have antibacterial action. As a result, fluorotannin obtained by alcohol extraction from brown algae, such as chrome, cajime, etc. It has been found that it has strong antiviral activity against many categories of viruses, and the present invention has been completed. Furthermore, the present inventors have found that among the isolated components of fluorotannin, equol, Fluorocofloecole A, diacor, and 8,8′-bayecol have strong antiviral activity.
[0011]
The present invention relates to an antiviral agent containing phlorotannin as a main component. In the present specification, “phlorotannin” is a general term for polyphenol components obtained by extraction from seaweeds, particularly brown algae. Preferably, in the present invention, fluorotannin refers to a natural extract containing one or more selected from equol, florofcofurecole A, diecol or 8,8′-bayecol.
Fluorotannin can be obtained by subjecting seaweeds, especially brown algae chrome or scallops to drying treatment, followed by alcohol extraction and further chloroform extraction.
[0012]
Specific examples of the fluorotannins of the present invention, equol, Fluorocofloe col A, diacor or 8,8′-baye col can be used alone or in admixture. The structural formula of each of these fluorotannins is shown in FIG.
Since the fluorotannin of the present invention has the structure shown in FIG. 1, it can be synthesized by chemical synthesis or the like based on this structure. It can also be a starting material for the development of viral agents.
[0013]
Whereas many antiviral agents known so far exert an antiviral action by acting on a nucleic acid synthesis / transcription system in a cell, the antiviral agent based on the fluorotannin of the present invention is It is characterized by acting directly on virus particles and causing their infectivity to be lost, and therefore has a broad antiviral spectrum. The antiviral agent based on phlorotannin of the present invention also exhibits a stronger antiviral action against viruses having an envelope.
[0014]
As described above, the fluorotannin of the present invention has strong and broad spectrum antiviral activity against pathogenic viruses belonging to various categories. For example, the phlorotannins of the present invention include herpesviridae, rhabdoviridae, bunyaviridae, arteriviridae, flaviviridae, coronaviridae, paramyxoviridae, orbiviridae, virnaviridae, etc. Strong antiviral activity against other viruses. Among them, particularly strong viral activity is exhibited against viruses of herpesviridae, rhabdoviridae, bunyaviridae, arteriviridae, and flaviviridae. The phlorotannins of the present invention also have antiviral activity particularly against enveloped viruses because all of the viruses tested had enveloped viruses.
[0015]
The phlorotannins of the present invention also have a PRDV (penaeid rod-shaped DNA virus), a causal virus of Penaeid Acute Viremia (PAV). It has a strong antiviral activity against Shrimp acute viremia (PAV) has been seriously affecting the existence and management of the aquaculture shrimp industry every year since it occurred in the early 90s. It was revealed that the fluorotannin of the present invention can be applied.
[0016]
Furthermore, the fluorotannin of the present invention has a strong antiviral activity against porcine Auersky disease virus (ADV). Aujeszky's disease is one of the most important viral diseases in the pig farming industry. As countermeasures against the disease, vast efforts and cost costs continue to be spent in the prevention of vaccine onset and the hygiene management of the pig farming environment. Yes. Vaccine prevention is the main countermeasure against viral diseases not only in swine ooeskey disease but also in the industrial world and the medical community, and enormous costs are spent on surrounding hygiene management measures. Here, it is considered that at least the cell surface or free virus is eradicated if an opportunity to contact such a disease virus with phlorotannin in the peripheral region (infectious route) of the living body.
[0017]
The antiviral action is effective against various viruses as shown in Table 1 if the phlorotannin structure shown in FIG. 1 is provided. Fluorotannin obtained by purification from natural extracts can contribute to the development of a new type of synthetic antiviral agent.
[0018]
Since the phlorotannins of the present invention have characteristics that act on various diseased virus particles directly or in the adsorption stage, it can be said that it is efficient to make use of these characteristics in applications. That is, since the fluorotannin of the present invention has a strong antiviral activity against the causative virus, an opportunity for direct or indirect contact with the fluorotannin, such as orally, transdermally, or immersed is set. In this way, it is possible to effectively prevent and control the viral diseases of organisms.
[0019]
In particular, as shown in Example 7 below, since it is possible to protect against viral disease in animals that have been routinely ingested with phlorotannins, they should be taken orally and constantly stimulated. Can enhance the resistance to virus infection. Therefore, the phlorotannins of the present invention are effective not only for direct action against viruses but also as an indirect action for giving appropriate internal / body surface stimulation to living bodies. Thus, the fluorotannin of the present invention is not limited to oral ingestion, but can be applied to viruses with different infection / invasion routes by applying appropriate stimuli to living bodies such as respiratory organs, body mucous membranes, and muscles. It can be used as a countermeasure against virus diseases.
[0020]
Furthermore, as is apparent from the results of the safety test described below (Example 9), the fluorotannin of the present invention can be obtained by continuing to drink high-concentration fluorotannin-added water or swallowing a large amount at a time. No abnormalities are observed, and it is known to be an extremely rare antiviral substance that is safe for the living body and has a small environmental load. Therefore, in combination with the fact that the fluorotannin of the present invention has been shown to increase the virus infection protection power even when taken orally from the daily routine in Example 7 which is modeled on viral diseases of the respiratory system, As an aspect of an effective method for using fluorotannin, it can be applied not only to pharmaceuticals but also to food and drink additives, feed additives and the like.
The phlorotannins of the present invention are used for the purpose of countermeasures against viral diseases, and when used in a state where these components are mixed in appropriate amounts as in Examples 2 and 3, and for specific effects for further enhancing the effects. For example, when using isolated fluorotannin, it can be selected and combined according to the necessity according to the necessity.
[0021]
Because of such basic and specific activities, the fluorotannin of the present invention can be used for the following applications:
(1) Control of various viral diseases in the field of agricultural, livestock and fisheries: Usage methods include, for example, feed ingredients, feed additives, drinking water admixtures, preventive / therapeutic drugs, and virus-killing agents in the production environment, disinfectants, seedlings Production control;
(2) Hygiene management in the general living environment;
(3) Hygiene management, preventive and therapeutic drugs in the medical field;
(4) Food materials, functional food / beverage materials;
(5) Basic structural substances in the development of specific drugs by chemical synthesis of specific viral diseases.
[0022]
【Example】
The present invention will be described in more detail with reference to the following examples, but the present invention is not limited thereto.
<< Example 1: Fluorotannin Extraction Method / Type / Property / Ingredient >>
Brown algae chrome (Ecklonia kurome) Was dried and ground. The obtained chrome powder (water content: about 10%, 800 g) was extracted by shaking with methanol (2,400 mL) at 5 ° C. for 48 hours (90 rev min-1). The extract was concentrated under reduced pressure, methanol (240 mL), chloroform (480 mL) and water (180 mL) were added, and the mixture was separated into an upper layer and a lower layer, and the upper layer was extracted twice with ethyl acetate (300 mL). . A phlorotannin extract was obtained by concentrating the ethyl acetate layer under reduced pressure. The yield of the fluorotannin extract from the chrome powder was about 3%.
[0023]
The above phlorotannin extract is composed of phloroglucinol (2%), equol (9%), florofcofurecol A (28%), diacol (24%), 8,8'-bayecol (7%) ), And other (30%) (see Fig. 1), silica gel chromatography (15 mm id x 150 cm, Wakogel C-300HG, Wako Pure Chemical Industries), chloroform: methanol: water ( 80: 20: 2, v / v) to separate each phlorotannin. The separated fractions are each a single component of equol, Fluorocofloe col A, diacor, and 8,8'-bayecol.₂₅₄, Merck) was developed with chloroform: methanol: water: acetic acid (50: 25: 4: 3, v / v).
Phloroglucinol manufactured by Wako Pure Chemical Industries (hydrate, purity of 98% or more) was used for the following tests.
[0024]
Example 2: Antiviral activity of phlorotannins
The virus causing causative virus, which is a problem in each industrial field, was examined using the virus neutralization method for the antiviral activity of phlorotannin.
For the implementation method, evaluation materials (cultured cells, medium, etc.) and determination methods (CPE, plaques, etc.) corresponding to the characteristics of each virus were applied. Two-fold serial dilution series of the concentration of the fluorotannin extract prepared in Example 1 and 100 TCID₅₀Equal volume of virus solution equivalent to / mL is mixed, and after reaction for 1 hour, the reaction solution is adsorbed to each evaluation system (cultured cells, plaque method, etc.) for 1 hour and then subjected to the respective culture conditions. Culture is performed, and the virus titer on the 7th day after inoculation (HVTV is the 5th day) is determined using CPE or the number of plaques as an index, and 50% effective dose (TCID) in each evaluation system₅₀, Plaque reduction, etc.) were determined by the probit method.
[0025]
The types of cell lines used for each virus, the determination method, etc. are shown in each column of Table 1. In addition, reaction and subsequent culture | cultivation temperature are a bovine respiratory disease virus (BRSV: 34 degreeC), a madai iridovirus (IRDV: 25 degreeC), a marine birnavirus (MABV: 20 degreeC), an infectious pancreatic necrosis virus ( IPNV: 18 ° C), infectious hematopoietic necrosis virus (IHNV: 18 ° C), and the others were performed at 37 ° C.
[0026]
As a result, among the tested viruses, phlorotannin was found to be turkey herpesvirus (HVTV), porcine Auersky disease virus (ADV), bovine infectious rhinotracheitis virus (IBRV) (both herpesviridae), cattle Epidemic fever virus (BEFV), salmon and trout infectious hematopoietic necrosis virus (IHNV) (all Rhabdoviridae), Akabane virus, Aino disease virus (all Bunyaviridae), breeding and respiration of pigs Disorder syndrome virus (PRRSV) (Arteriviridae), Japanese encephalitis virus (JEV), bovine viral diarrhea / mucosal disease virus (BVDV) (both Flaviviridae), bovine Kasuba disease virus (Orbiviridae) And strong antiviral activity. Most of these viruses were enveloped viruses.
[0027]
In addition, although not as described above, chicken infectious pharyngeal tracheitis virus (ILTV) (herpesviridae), chicken infectious bronchitis virus (IBV) (coronaviridae), bovine respiratory disease virus (BRSV) ( Paramyxoviridae), bovine ibaraki disease virus (Orbiviridae), salmon trout infectious pancreatic necrosis virus (IPNV), marine fish marine birnavirus (MABV) (both Virnaviridae) Antiviral activity was observed. In addition, the flurotannin of this invention did not show antiviral activity with respect to the red sea bream family's red sea bream virus (IRDV).
[0028]
Therefore, the fluorotannin of the present invention has a strong antiviral activity in a wide range that exceeds each category of viruses. The usefulness of phlorotannins is based on the above evaluation, and considering other factors, depending on the purpose of use from the standpoint of use corresponding to virus disease in general or use for specific virus disease countermeasures, efficiency, and effect Can be used well selected.
[0029]
[Table 1]

[0030]
Example 3: Antiviral activity of isolated phlorotannins
Isolating and purifying fluorotannin by the method described in Example 1 gives five types of isolated fluorotannin. Since each of these isolated fluorotannins has a different chemical structural formula, it is necessary to examine how such a difference in chemical structure affects the degree of antiviral activity. The antiviral activity of each isolated phlorotannin was examined using infectious hematopoietic necrosis virus (IHNV), Aujeszky's disease virus (ADV) and bovine respiratory disease virus (BRSV) as representative (Table 2). As is apparent from the results in Table 2, Fluorocofloecole A, Daiecol and 8,8′-bayecol showed strong antiviral activity, and Ecole also showed antiviral activity. However, no effect was observed with phloroglucinol.
[0031]
[Table 2]

[0032]
<< Example 4: Infection preventing effect against prawns acute viremia >>
It was examined whether or not phlorotannin has an infection-preventing effect of PRDV (penaeid rod-shaped DNA virus), which is a causative virus of prawn acute viremia (PAV).
The virus solution was collected by collecting the shrimp lymphoid organs that died of PAV in Kumamoto Prefecture in 2001, homogenizing with 10 times the amount of sterilized seawater, and then centrifuging (3000 rpm x 15 min) to obtain 0.45 supernatant. 10 μm filtered with 10 μm sterilized seawater⁶Prepared by doubling. When 0.1 mL of this virus solution was injected intramuscularly into 5 shrimps, all the shrimps died within 4 days, and it was confirmed that the infectivity of the virus solution was maintained.
[0033]
The solution of the fluorotannin extract having a predetermined concentration prepared in Example 1 and the above virus solution were mixed and allowed to stand at 25 ° C. for 1 hour. Fluorotannin concentration during the reaction was 8 mg / L, 0.8 mg / L, 1.6 mg / L, 3.1 mg / L, 6.3 mg / L, 12.5 mg / L, 25 mg / L, 50 mg / L. . 0.1 mL of the mixed solution in each section was intramuscularly injected into shrimp (n = 10), and the shrimp after the injection was fed in each distinct water tank for 8 days and examined for mortality. As a result, despite the fact that all shrimp in the control plot (phlorotannin 0 mg / L) died, all plots with a flurotannin concentration of 1.6 mg / L or higher had a survival rate of 60% or higher, and fluorotannin was PRDV. (Fig. 2). Therefore, if phlorotannins are given to the process in which the harmful viruses invade the shrimp, the damage of this virus can be effectively protected, and those opportunities are related to shrimp soaking, body surface, oral (food), injection, etc. You can choose according to your needs. In addition, it was confirmed that shrimp did not die even when intramuscularly injected with fluorotannin at a concentration of 400 mg / L.
[0034]
Example 5 Efficacy of phlorotannin against porcine Auersky disease virus
The highly toxic porcine Aujeszky's disease virus (ADV: YS-81) is known to be infectious in addition to pigs and die if infected with rodents such as mice. Therefore, using this ADV mouse infection system, it was examined whether or not phlorotannin was actually effective against virus-sensitive animals.
[0035]
Lethal dose (10LD₅₀) ADV solution and fluorotannin extract (prepared in Example 1; each concentration) were mixed in an equal amount in a test tube in 3 minutes and 1 hour (27 ° C) in mice (SPF, ddy system, male, 4 weeks) The same standard was also used in the following examples) 0.5 mL each was intraperitoneally administered and the survival effect was observed for 7 days (7 to 8 animals per group). As a result, as shown in FIG. 3, all the control groups died from infection, whereas each group contacted with 20 to 500 mg / L fluorotannin for 1 hour before administration survived 100%. Similarly, fluorotannin survived 50% at 20 mg / L even in the case of a short-term contact system for 3 minutes (others were 100% survival), and clearly inhibited ADV mouse infection death (FIG. 3A is fluoro). When tannin and ADV were mixed intraperitoneally 3 minutes after mixing, FIG. 3B shows the case where intraperitoneal administration 1 hour after mixing).
Thus, phlorotannins have been shown to effectively act to protect against viral diseases by creating opportunities for direct contact and coexistence with susceptible viruses in vitro or in vitro and in vivo.
[0036]
Example 6 Efficacy of Florotannin in ADV Nasal Infection System
Since the Aujeszky's disease virus in the field is infected in the respiratory system of animals, the protective effect of phlorotannin was examined using the phlotannin and ADV administration system in the mouse nasal route. The test mice were lightly anesthetized with ether, and 2000 mg / L of fluorotannin (fluorotannin extract prepared in Example 1) was soaked in a cotton swab and applied to the nostrils of the mice (20 μL / mouse). (10 and 1LD₅₀) Was applied in the same manner, and the subsequent survival rate was observed for 7 days (7-8 animals per group). As a result, as shown in FIG. 4, phlorotannin showed a protective effect against mouse ADV infection in the respiratory route. This result suggests that phlorotannin can be applied as an effective viral disease control means against susceptible viruses that are transmitted from the same external infection path or body surface that can generally occur in the biological society.
[0037]
<< Example 7: Prevention of ADV infection by oral ingestion of phlorotannin >>
The following methods were used to examine whether or not flurotannin can protect against viral diseases in animals that have been routinely ingested. That is, 800, 200, and 0 (PBS) mg / L of the phlorotannin extract prepared in Example 1 was contained in normal drinking water for mice, and free for 10 days from 3 days before the virus infection until the end of the observation of the attack test. In the mice that continued to be fed to, the ADV nasal infection system shown in Example 6 was evaluated. As a result, as shown in FIG. 5, when phlorotannin was given, a significantly higher survival rate was observed than when phlorotannin was not taken.
[0038]
<< Example 8: Prevention and treatment effect of fluorotannin in ADV infection >>
The prophylactic and therapeutic effects of phlorotannins were examined using the ADV mouse nasal infection system shown in Examples 6 and 7. That is, 1 hour before ADV infection in this system (-1 h), 3 minutes before (immediately before) as prophylactic administration, and 3 minutes after ADV infection (immediately after), 1 hour (+1 h) as therapeutic administration A test group to which a fluorotannin extract (prepared in Example 1) was administered, a test group to which an equal amount of the same fluorotannin extract and a virus solution were mixed in a test tube and immediately administered (0), and a PBS control group Provided (7-8 animals per group).
[0039]
As a result, as shown in FIG. 6, phlorotannin was found to have an infection-protecting effect against viral diseases in both prophylactic and therapeutic administration. These results indicate that phlorotannin can be used as a prophylactic or therapeutic agent during viral disease epidemics. Therefore, when phlorotannins are used for controlling viral diseases of host organisms, not only the indirect effects shown in Example 7 but also the efficient creation of opportunities for contact between phlorotannins and the target virus in vivo and in vitro becomes clearer. It shows that there is a tendency to.
[0040]
<< Example 9: Safety of fluorotannin >>
It has been shown that phlorotannin has an increased ability to protect against viral infection even when taken orally from day to day in Example 7 modeled on viral diseases of the respiratory system. This means that it can be an effective means of preventing and treating viral diseases by giving appropriate phlorotannins through foods and foods that are used regularly by humans and animals. Therefore, the following tests were conducted for the purpose of confirming the safety of phlorotannins to mammals.
[0041]
Various forms are conceivable for using or taking in and taking in florotannin. For example, foods and drinks, additives, cosmetics, cleaning disinfectants, disinfectants, medicines, daily life products, and the like are conceivable. First, tests were conducted using small animals for safety in living bodies. Fluorotannin extract prepared in Example 1 using ICR male and female mice (4 weeks old) was added to the breeding water, allowed to drink freely for 14 days, and orally administered (single large dose). The state was examined by the change in body weight.
As a result, as shown in FIG. 7, there was no abnormality in weight gain in either case, regardless of whether the male or female continued to drink high-concentration phlorotannin-added water or swallowed a large amount at a time. Also, no abnormality was shown in the general state.
[0042]
The fluorotannin taken into the body in this example was 1500 mg / kg / day for males and 1286 mg / kg / day for females after 14 days of drinking water, 168.2 mg / kg / day for males and 193.7 mg / kg for females after a single dose. This intake is equivalent to / day, and this intake is a large amount that cannot be obtained in normal life.
This indicates that there is no hindrance to taking phlorotannin into the living body for the purpose of health inhibition by disease virus and prevention and treatment for infectious diseases. This suggests that it can be applied to food and drink additives, feed additives and the like.
[0043]
As shown in Examples 2 to 9, in the present invention, it was revealed that phlorotannin is an effective substance for controlling viral diseases that are a problem in social life. Furthermore, in the application of this substance, it is indispensable to efficiently guide and construct opportunities for direct or indirect contact with the viral disease host in the body or the external region, depending on the characteristics and properties of the target viral disease. Become.
[0044]
【The invention's effect】
As mentioned above, the fluorotannin of the present invention has the following characteristics:
(1) Phlorotannin is a main component of an antiviral component contained in seaweed brown algae chrome, etc .;
(2) Phlorotannin was clarified as a new antiviral substance along with its chemical structure. Of each isolated fluorotannin, it was found that four types of isolated fluorotannins, namely equol, florofoflor equol A, diacor and 8,8'-bayecol each have antiviral activity. These isolated products can be used in combination of two or more depending on the application;
(3) These chemical structures having antiviral activity contribute to suggesting the direction and possibility of developing new types of antiviral agents by chemical synthesis and the like in the future;
(4) The fluorotannin of the present invention provides a new solution to the virus disease control measures of host organisms in question. This substance exerts its effect remarkably by acting directly on the target virus. This substance acts efficiently on cell-free viruses and viruses in the cell adsorption stage, and in the method of administration to the living body, select injection, oral, transdermal, respiratory system, etc. considering the infection route of the target viral disease. Can do;
(5) Whereas many existing antiviral agents act on nucleic acid synthesis / transcription systems in cells, the fluorotannin of the present invention acts directly on virus particles and loses its infectivity. As such, it has a broad antiviral spectrum. Moreover, it turned out that the effect has a strong tendency with the virus which has an envelope. Furthermore, this substance is a very rare antiviral substance that is safe for the living body and has a low environmental impact;
(6) Of the various viruses (diseases), the fluorotannin of the present invention is particularly sensitive to viruses of the herpesviridae, rhabdoviridae, bunyaviridae, flaviviridae, and arteriviridae. Has a base of;
(7) The fluorotannin of the present invention is useful in various social life suffering from viral diseases and incapable of sufficient control. Environmental hygiene management (public health / medicine, agriculture, livestock and fisheries industry, building facilities), living products, functional food / beverage additive materials, industrial animal feed additives, plant protection, and pharmaceutical / quasi drugs Applicable to
(8) The fluorotannin of the present invention is a new type of virus disease control material and means that have never been used in various virus disease countermeasures. By combining this substance with existing virus disease countermeasures and complementing each other by taking advantage of its features, it becomes possible to take comprehensive virus disease countermeasures that have never been seen before. As a result, it is possible to improve the viral disease damage and associated economic losses of various organisms;
(9) The fluorotannin of the present invention can be used as a new control means, particularly for the countermeasure against PRDV, which is a virus causing acute viremia in prawns. As the application method, oral administration (feed additive), immersion administration, spray administration, or injection method is effective depending on the situation. It can also be used to disinfect breeding seawater, soil, habitats, and equipment as a countermeasure against infection sources in aquaculture environments. This is because the substance has an antiviral effect by directly acting on the PRDV, and the harmony with seawater environment conservation is superior to existing chemical disinfectants;
(10) The fluorotannin of the present invention also provides a new means of prevention against swine Aujeszky's disease virus (ADV). Specifically, in order to suppress infection opportunities as much as possible, it can be applied as disinfection of pig breeding environment, direct spraying on pigs, drinking water / feed additives, and preventive / therapeutic agents.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a diagram showing a structural formula of each fluorotannin.
FIG. 2 is a graph showing the change over time in the survival rate of tiger shrimp administered with a mixture of fluorotannin and RPDV, showing the protective effect of fluorotannin on PRDV.
FIG. 3 is a graph showing the protective effect (injection) of Aujeszky's disease virus (ADV) infection using phlorotannins in mice. A shows the case where phlorotannin and ADV are mixed intraperitoneally 3 minutes after mixing, and B shows the case where intraperitoneal administration is performed 1 hour after mixing.₅₀It is.
FIG. 4 is a graph showing the protective effect (respiratory infection) in the nasal infection system of Aujeszky's disease virus (ADV) using phlorotannin mice (the amount of attack virus is 10 LD).₅₀).
FIG. 5 is a graph showing the protective effect (oral intake) of Aujeszky's disease virus (ADV) infection using phlorotannins in mice (the amount of attack virus is 10 LD).₅₀).
FIG. 6 is a graph showing the protective effect (prophylaxis / therapeutic administration) of Aujeszky's disease virus (ADV) infection using phlorotannin mice (7 days after nasal infection; the amount of attack virus is 10 LD)₅₀).
FIG. 7 is a graph showing the rate of weight gain of mice orally ingesting phlorotannins.

Claims

フロロタンニンを主成分とする抗ウイルス剤。 Antiviral agent mainly composed of phlorotannin.

当該フロロタンニンが、エコール、フロロフコフロエコールＡ、ダイエコールまたは８,８'−バイエコールから選択される１つまたは２つ以上を含む請求項１に記載の抗ウイルス剤。 The antiviral agent according to claim 1, wherein the fluorotannin comprises one or more selected from equol, florofcophore A, diacor or 8,8′-bayecol.

当該フロロタンニンが海藻由来のフロロタンニンである請求項１または２に記載の抗ウイルス剤。 The antiviral agent according to claim 1 or 2, wherein the phlorotannin is a seaweed-derived phlorotannin.

当該海藻由来のフロロタンニンが褐藻類のクロメ、またはカジメから選択される海藻に由来するフロロタンニンである請求項３に記載の抗ウイルス剤。 The antiviral agent according to claim 3, wherein the fluoroaltanine derived from seaweed is a fluoroaltanine derived from a seaweed selected from brown algae chrome or kajime.

エンベロープウイルスによるウイルス感染症の治療および予防用である請求項１から４のいずれかに記載の抗ウイルス剤。 The antiviral agent according to any one of claims 1 to 4, which is used for treatment and prevention of a viral infection caused by an envelope virus.

ヘルペスウイルス科、ラブドウイルス科、ブンヤウイルス科、アーテリウイルス科、フラビウイルス科、コロナウイルス科、パラミクソウイルス科、オルビウイルス科またはビルナウイルス科に属するウイルスによるウイルス感染症の治療および予防用である、請求項１から４のいずれかに記載の抗ウイルス剤。 For the treatment and prevention of viral infections caused by viruses belonging to the herpesviridae, rhabdoviridae, bunyaviridae, arteriviridae, flaviviridae, coronaviridae, paramyxoviridae, orbiviridae or birnaviridae The antiviral agent according to any one of claims 1 to 4, wherein

ＰＲＤＶ（penaeid rod-shaped DNA virus）によるウイルス感染症であるクルマエビ類急性ウイルス血症の治療および予防用である、請求項１から４のいずれかに記載の抗ウイルス剤。 The antiviral agent according to any one of claims 1 to 4, which is used for treatment and prevention of prawn acute viremia which is a viral infection caused by PRDV (penaeid rod-shaped DNA virus).

豚オーエスキー病の治療および予防用である、請求項１から４のいずれかに記載の抗ウイルス剤。 The antiviral agent according to any one of claims 1 to 4, which is used for treatment and prevention of porcine Auersky disease .