JP4101467B2 - Antisense oligonucleotide having an inhibitory action on drebrin A expression - Google Patents

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ドレブリンＡ発現抑制作用を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドやその誘導体、それらを担持したベクター、ドレブリンＡの過剰発現・機能亢進に起因する疾病の治療薬等に関する。
【０００２】
【従来の技術】
神経細胞は、他の体細胞には見られない非常に複雑な形状を有し、核をもつ原形質部分である細胞体からは、樹状突起と軸索突起という２種類の突起が伸びている。樹枝状に伸びる樹状突起はスパイン（spine）と呼ばれる無数の棘構造を有し、他の細胞からの情報を受け取る機能をもつシナプス後部を形成している。この神経細胞特異的形態は、神経特異的なアクチン結合タンパクにより決定される。他方、本発明者らは、発生過程の神経細胞に多量発現するアクチン結合タンパクドレブリン（Drebrin）を世界に先駆けて発見し（J. Neurochem. 44, 1210-1216(1985)、J. Biochem. 117, 231-236 (1995)）、このドレブリンがアクチンファイバーの性状を変えることにより神経細胞の形態形成、特に突起形成に関わっていること（J. Neurosci. Res. 38: 149-159 (1994) 、Exp. Cell Res. 215:145-153 (1994) 、J. Biol. Chem. 269:29928-29933 (1994)）や、発生中で移動している神経細胞では、細胞体と突起全体に存在するが、成熟した神経細胞では棘構造中に特異的に存在すること（J. Neurosci. 15: 7161-7170 (1996)、Dev. Brain Res. 29, 233-244 (1986)、Brain Res. 413, 374-378 (1987)）を既に証明している。ドレブリンには、胚性型（embryonic type）のドレブリンＥと成体型（adult type）のドレブリンＡという２つのアイソフォームが存在しており（J. Biochem. 117, 231-236 (1995)）、成熟した神経細胞のスパインに特異的に見られるドレブリンＡは、神経細胞にしか発現しないという特徴を有している（Dev. Brain Res. 29, 233-244 (1986)、Brain Res. 413, 374-378 (1987)）。ドレブリンＡはalternative splicing機構によりドレブリンＥに“ｉｎｓ２”と呼ばれる領域が加わった配列をしている。すなわち、５′側から９５６ｂａｓｅ〜１０９３ｂａｓｅにｇｔｃｇｔｃｃｇｔａｃｔｇｃｃｃｔｔｔｃａｔａａａｇｇｃａｔｃｇｇａｃａｇｔｇｇｇｃｃｔｔｃｃｔｃｃｔｃｃｔｃｃｔｃｔｔｃｃｔｃｃｔｃｔｔｃｃｃｃｔｃｃａｃｇｇａｃｔｃｃｃｔｔｔｃｃｃｔａｔａｔｃａｃｃｔｇｃｃａｃｃｇｃａｃｃｃｃａａａｃｃｔｃｔｃｔｔｃｃｔｃｃｃｔｃｃｃａｔ）［配列番号１］が挿入されて発現したものである（Mol. Brain Res. 19, 101-114 (1993)、Neuroreport 3, 109-112 (1992)）。
【０００３】
また最近、本発明者らは、ドレブリンＡを初代培養神経細胞に発現させると自動的に樹状突起スパインに集まり、しかもその長さを長くしたり、ある一つのタンパク合成量を変化させることによってスパインの形態を変化させることができることを報告している（J. Neurosci. 19, 3918-3925 (1999)）。その他、ドレブリンの所属するタンパクファミリーに関して、ドレブリンがADF Homology Domainをもったアクチン結合タンパクの一種に分類できる可能性が示唆されている（Mol. Biol. Cell 9, 1951-1959 (1998)）。また、ドレブリンのホモローグとしてＳＨ３Ｐ７が発見されているが、ＳＨ３Ｐ７の機能が明らかになりつつある（Mol. Cell. Biol. 19, 1539-1546 (1999) 、Nature Biotech. 14, 741-744 (1996)）。
【０００４】
その他、神経栄養因子ＢＤＮＦ（Brain-derived neurotrophic factor）を特異ノックアウトするアンチセンスオリゴヌクレオチドを作製し、外来性のＢＤＮＦがスパイン密度をインビボ及びインビトロで増加させるエストラジオールの効果を遮断し、選択的なアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いたＢＤＮＦの発現抑制がエストラジオールに似た効果をもたらし、抗ＢＤＮＦ抗体によりスパイン密度が増加するなど、スパイン密度の調節に関与するＢＤＮＦの役割が明らかにされている（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 11412-11417, 1998）。また、脆弱Ｘ症候群（fragile X syndrome）は、Ｘ染色体にフラジャイル・サイトが存在するため起こる遺伝性の精神遅滞の原因としては最も頻度の高い病気であり、Ｘ染色体上の遺伝子ＦＭＲ１の発現異常、主に発現欠損により引き起こされ、ＦＭＲ１の発現異常は脳神経系の形態異常を伴うが、かかる脆弱Ｘ症候群などの脳神経疾患の治療法は、現在のところ見つかっていない。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、脆弱Ｘ症候群の治療薬等としての有用性が期待できる、ドレブリンＡの発現を特異的に抑制することができるアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供することにある。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、発生過程の神経細胞に多量発現するアクチン結合タンパクドレブリンを世界に先駆けて発見して依頼、ドレブリンに関する研究を包括的かつ多面的に行っている。最近、本発明者らはマウスドレブリンＡのゲノミック遺伝子（Ｄｂｎ１）を世界で初めて単離し、その配列を決定した。配列番号２で示される塩基配列からなるマウスＤｂｎ１のエクソン−イントロン構成を図１として示す。第１エクソンが６７６７番目から始まる全長２０６７４ｂｐのマウスＤｂｎ１は、図２に示される染色体地図から、染色体１３番のほぼ中央に位置し、近くにインターロイキン−９（Il9）やpaired-like homeodomein transcription factor（Pitx1）が存在することがわかる。
【０００７】
マウスドレブリンＡのｃＤＮＡ（アクセッション番号；AF187147）と、配列番号３で示されるラットドレブリンＡのｃＤＮＡとの一致率は９４．０７％であり、マウスドレブリンＡと、配列番号４で示されるラットドレブリンＡとのアミノ酸レベルでの一致率は９５．３５％であるが、第１１エクソンを構成するマウスｉｎｓ２配列はラットｉｎｓ２配列と完全（１００％）に一致していた。本発明者らは、ドレブリンＥに存在せず、ドレブリンＡに特異的に存在し、動物種を超えてその配列がよく保存されているｉｎｓ２領域に注目し、このｉｎｓ２領域に対する４種類のアンチセンス鎖を作製し、神経細胞におけるドレブリンＡの発現を特異的に抑制する実験を行ったところ、ラットドレブリンＡのｃＤＮＡの５′側から９８０ｂ〜１００３ｂにかけたａｇｇｃａｔｃｇｇａｃａｇｔｇｇｇｃｃｔｔｃｃｔ［配列番号５］の領域のアンチセンス鎖である２４−ｍｅｒのＳ−オリゴ（５′−ＡＧＧＡＡＧＧＣＣＣＡＣＴＧＴＣＣＧＡＴＧＣＣＴ−３′）［配列番号６］がドレブリンＡの発現量を顕著に低下させることを見い出し、本発明を完成するに至った。
【０００８】
すなわち本発明は、配列番号６に示される塩基配列からなるアンチセンスオリゴヌクレオチド（請求項１）や、配列番号５に示される塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつドレブリンＡ発現抑制作用を有するアンチセンスオリゴヌクレオチド（請求項２）や、請求項１又は２記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドのリン酸エステル基をチオリン酸エステル基或いはメチルホスホネート基で置換したもの、及び、請求項１又は２記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドのリボース部分の水酸基をメトキシ或いはアリロキシからなるアルコキシ基、アミノ基、又はフッ素原子で置換したもの、から選択される請求項１又は２記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドの誘導体（請求項３）や、請求項１又は２記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド及び／又は請求項３記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドの誘導体を担持したベクター（請求項４）や、配列番号７に示されるアミノ酸配列からなるペプチドを特異的に認識する抗体（請求項５）や、モノクローナル抗体であることを特徴とする請求項５記載の抗体（請求項６）や、請求項１又は２記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド及び／又は請求項３記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドの誘導体を有効成分とするドレブリンＡの過剰発現・機能亢進に起因する疾病の治療薬（請求項７）や、請求項１又は２記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド及び／又は請求項３記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドの誘導体と薬学的に許容される細胞内導入試薬とからなるドレブリンＡの過剰発現・機能亢進に起因する疾病の治療薬（請求項８）に関する。
【０００９】
【発明の実施の形態】
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドとしては、配列番号６に示される塩基配列（５′−ＡＧＧＡＡＧＧＣＣＣＡＣＴＧＴＣＣＧＡＴＧＣＣＴ−３′）からなるＤＮＡや、配列番号５に示される塩基配列（ａｇｇｃａｔｃｇｇａｃａｇｔｇｇｇｃｃｔｔｃｃｔ）とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつドレブリンＡ発現抑制作用を有するアンチセンスオリゴヌクレオチド（アンチセンスＤＮＡ又はアンチセンスＲＮＡ）であれば特に制限されるものではないが、生体に投与した際の安定性がより高いという理由でアンチセンスＤＮＡの方が好ましい。本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドはドレブリンＡの発現を顕著に抑制することができる上に、その選択的ハイブリダイズ特性からしてプローブとしても使用可能であり、他の脊椎動物のｃＤＮＡライブラリーから該プローブとハイブリダイズする当該動物におけるドレブリンＡ遺伝子のホモログ遺伝子であるｃＤＮＡを取得することもできる。
【００１０】
また、上記ストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーションの条件としては、例えば、４２℃でのハイブリダイゼーション、及び１×ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳを含む緩衝液による４２℃での洗浄処理や、６５℃でのハイブリダイゼーション、及び０．１×ＳＳＣ，０．１％のＳＤＳを含む緩衝液による６５℃での洗浄処理を挙げることができる。なお、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響を与える要素としては、上記温度条件以外に種々の要素があり、当業者であれば、種々の要素を適宜組み合わせて、上記例示したハイブリダイゼーションのストリンジェンシーと同等のストリンジェンシーを実現することが可能である。このようにして得られるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、１２塩基以上３９塩基以下、特に１５塩基以上２５塩基以下のアンチセンスＤＮＡ又はアンチセンスＲＮＡが好ましい。
【００１１】
本発明のアンチセンスオリゴヌクオレチドの合成方法としては、特に限定されないが、例えば、ＤＮＡ合成機（Applied Biosystems Inc.社製「３８１Ａ」）やＤＮＡ／ＲＮＡ合成機（Applied Biosystems Inc.社製「３９４」）等の通常の合成機を用いるホスホロアミダイト法、ホスホロチオエート法、ホスホトリエステル法等を挙げることができる。この場合、ＤＮＡ合成機等に添付されている説明書にしたがって操作を行い、得られた合成産物を逆相クロマトグラフィー等を用いたＨＰＬＣ法により精製することによって、目的のアンチセンスポリヌクレオチドやその誘導体を得ることができる。
【００１２】
また、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドの安定性や細胞に対する親和性を高めるために、その活性を著しく低下させない範囲で、リン酸エステル基又はリボース部分の水酸基を他の安定な基に置換した誘導体として用いることもできる。このようなアンチセンスオリゴヌクレオチドの誘導体の具体例としては、リン酸エステル基をチオリン酸エステル基やメチルホスホネート基等で置換したもの、リボース部分の水酸基をメトキシやアリロキシ等のアルコキシ基、アミノ基、またはフッ素原子等で置換したもの等を挙げることができる。
【００１３】
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドやその誘導体は、神経細胞におけるドレブリンＡの発現を抑制するものであるため、神経細胞におけるドレブリンＡタンパクの過剰発現および機能亢進が原因の一つと考えられている疾患、例えばフラジャイルＸ症候群（脆弱Ｘ症候群）等を有効に治療することができる可能性が大きい。かかるドレブリンＡタンパクの過剰発現および機能亢進が原因の一つと考えられている疾患の治療に際しては、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド又はその誘導体０．０１〜１００μＭ、好ましくは０．１〜１０μＭを投与することができ、また必要に応じて薬学的に許容される細胞内導入試薬、例えば、リポフェクチン試薬、リポフェクトアミン試薬、ＤＯＴＡＰ試薬、Ｔｆｘ試薬、人工合成脂質ベジクル、リポソーム、膜融合試薬、高分子ミセル化試薬、高分子坦体、またはその他の細胞内導入試薬とともに投与することができる。この場合、発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、単独でも投与可能であるが、薬学的に許容される通常の担体、結合剤、安定化剤、賦形剤、希釈剤、ｐＨ緩衝剤、崩壊剤、可溶化剤、溶解補助剤、等張剤などの各種調剤用配合成分を添加することができる。またかかる治療剤は、経口的又は非経口的に投与することができる。すなわち通常用いられる投与形態、例えば粉末、顆粒、カプセル剤、シロップ剤、懸濁液等の剤型で経口的に投与することができ、あるいは、例えば溶液、乳剤、懸濁液等の剤型にしたものを注射の型で非経口に局所に投与することができる。例えば、注射剤とする場合には、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドを水、生理食塩水またはブドウ糖溶液等に溶解させて調製することができ、必要に応じて緩衝剤、保存剤あるいは安定化剤等を含有させてもよい。投与量は、各疾患の症状の度合いや投与方法等に依存して変わりうるが、目安として、静脈内投与では体重当たり１ｍｇ／ｋｇから１ｇ／ｋｇ、好ましくは５ｍｇ／ｋｇから５００ｍｇ／ｋｇを例示することができる。
【００１４】
また、細胞への取り込みの促進や標的とする細胞への指向性を高める目的で、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド配列を発現させるようにデザインされたプラスミドやウイルスベクターを遺伝子治療用のベクターとして用いることもできる。このようなベクターとしては、ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）ベクター、アデノウイルスベクター、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）ベクター等のウイルスベクターを好適に挙げることができるが、これらウイルスベクターの中でもＨＳＶベクターが好ましい。ＨＳＶベクターは、神経親和性が高く、ＨＳＶが細胞の染色体ＤＮＡに組み込まれないため安全であり、また、導入遺伝子の発現期間を調節することが可能である。また、ウイルスベクターを用いる場合、リコンビナーゼが認識する逆方向反復配列、例えば大腸菌Ｐ１ファージ由来のｌｏｘＰ配列又は酵母サッカロミセス・セレビッシェ由来の野生型ＦＲＴ配列を利用すると、所望の時期に本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドを発現させることができる。
【００１５】
本発明の抗体は、配列番号５に示される塩基配列（ａｇｇｃａｔｃｇｇａｃａｇｔｇｇｇｃｃｔｔｃｃｔ）を含む塩基配列（ａａｇｇｃａｔｃｇｇａｃａｇｔｇｇｇｃｃｔｔｃｃｔｃｃ）（ラットドレブリンＡのｃＤＮＡの５′側から９７９ｂ〜１００５ｂ）の翻訳ペプチドであるＫＡＳＤＳＧＰＳＳ［配列番号７］又はこのペプチドを含む領域を特異的に認識する抗体であれば特に制限されるものではなく、かかる本発明の抗体としては、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、キメラ抗体、一本鎖抗体、ヒト化抗体等の免疫特異的な抗体を具体的に挙げることができ、これらは上記ＫＡＳＤＳＧＰＳＳを抗原として用いて慣用のプロトコールに従い常法により作製することができるが、その中でもモノクローナル抗体がその特異性の点でより好ましい。かかるモノクローナル抗体等のＫＡＳＤＳＧＰＳＳに特異的に結合する抗体は、例えば、ドレブリンＡの変異又は欠失に起因する疾病の診断をする上で、また、神経細胞におけるドレブリンＡタンパクの過剰発現および機能亢進が原因の一つと考えられている疾患の治療上有用である。
【００１６】
【実施例】
以下に、実施例を挙げてこの発明を更に具体的に説明するが、この発明の範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
実施例１（神経細胞の培養）
妊娠２０日のSprague-Dawleyラットをエーテル麻酔し、断頭後、胎仔を取り出した。大脳皮質を摘出して髄膜を剥がし、パパイン添加ＣＧＢＤ溶液に入れて、３７℃恒温槽で１５分間放置した。上清を吸引除去し、ＭＥＭ培地５ｍｌで洗浄し、再度上清を吸引除去した後、ＭＥＭ培地３ｍｌと馬血清２ｍｌを加えてピペッティングし、神経細胞含有溶液をフィルター濾過してから遠心し、上清を捨て、５％牛血清、５％馬血清を含むＭＥＭ培地で攪拌し、直径３．５ｃｍのディッシュ内に３．０×１０⁶／２ｍｌ（ウェスタンブロット用）、又は２．０×１０⁶／２ｍｌ（免疫染色用）の濃度で２ｍｌずつそれぞれ注入した。これらディッシュ内の神経細胞をＣＯ₂インキュベーター内で３７℃で培養した。５日目以降、ＡｒａＣ５μＭ入りグリアコンディション培地を用い、週に２回、培地を半量ずつ交換して培養を継続した。
【００１７】
実施例２（アンチセンスオリゴヌクレオチドの投与）
培養開始１２日目に、以下の４種類のアンチセンスオリゴヌクレオチドを最終濃度が１０μＭになるように培地内に投与し、その２日後に神経細胞を回収し、免疫染色とウェスタンブロットを行った。
5′-TTATGAAAGGGCAGTACGGACGAC-3′［配列番号８］
5′-AGGAAGGCCCACTGTCCGATGCCT-3′［配列番号６］
5′-TATAGGGAAAGGGAGTCCGTGGAG-3′［配列番号９］
5′-GGTTTGGGGTGCGGTGGCAGGTGA-3′［配列番号１０］
また、ポジティブコントロールとして、上記アンチセンス鎖の配列を逆向きにした４種類のreversedアンチセンス鎖を用いた。
【００１８】
実施例３（ウエスタンブロット分析）
アンチセンス鎖投与２日後における神経細胞内のドレブリンＡタンパクの発現量を調べるために、ウエスタンブロット分析を行った。神経細胞の抽出液をＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動法により分離し、分離したタンパク質をメンブレンフィルター（MILIPORE社製「Immobilon transfer membranes」）にブロッティングした。このブロッティングした膜を、５％スキムミルクを含むＴＢＳで５倍希釈した坑ドレブリンＡ抗血清（Exp. Cell Res. 215, 145-153 (1994)；坑ドレブリンＡポリクローナル抗体）含有溶液中、室温で６０分間インキュベーションした。０．０５％のツイーン２０を含むＴＢＳで洗浄後、５％スキムミルクを含むＴＢＳで希釈したＨＲＰ標識化抗ラビットＩｇＧ抗体のＦ(ａｂ′)₂フラグメント（カッペル社製）溶液に上記インキュベーションした膜を浸した。抗原特異的ＨＲＰ反応により生じた化学ルミネッセンスをKodak Scientific Imaging Film（X-OMAT AR, Kodak）とECL detection kit（Amersham Pharmacia Biotech）により視覚化した。その結果、５′側から９８０ｂａｓｅ〜１００３ｂａｓｅ目にかけた、ａｇｇｃａｔｃｇｇａｃａｇｔｇｇｇｃｃｔｔｃｃｔの領域に対するアンチセンス鎖５′−ＡＧＧＡＡＧＧＣＣＣＡＣＴＧＴＣＣＧＡＴＧＣＣＴ−３′投与の場合、アンチセンス鎖未投入のコントロールやreversedアンチセンス鎖投与のポジティブコントロールの場合に比べて、ドレブリンＡの発現量を特異的に低下させることに有効であることがわかった（図３）が、他の３種類のアンチセンス鎖では、ドレブリンＡの発現が抑制されていなかった。
【００１９】
実施例４［免疫染色］
アンチセンス鎖５′−ＡＧＧＡＡＧＧＣＣＣＡＣＴＧＴＣＣＧＡＴＧＣＣＴ−３′投与２日後における神経細胞を、３．５％のパラホルムアルデヒドを添加したＰＢＳにより４℃で１５分間振盪固定した後、ＴＢＳ中で室温にて５分間洗浄し、３％のＢＳＡを含むＰＢＳ中で室温にて１０分間ブロッキングし、坑ドレブリンＡ抗血清（Exp. Cell Res. 215, 145-153 (1994)；坑ドレブリンＡポリクローナル抗体）を３％のＢＳＡを含むＰＢＳで希釈して調製した溶液を用いて、室温で６０分間反応させた。これら反応させた標本をＰＢＳ中で室温にて５分間×３回振盪して洗浄した後、３％のＢＳＡを含むＰＢＳで１００倍希釈したＦＩＴＣ標識化抗マウスＩｇＧ抗体（カッペル社製）を用いて室温にて３０分間染色した。これら染色物を遮光したままＰＢＳ中で室温にて５分間×３回振盪して洗浄した後、パーマフロー（シャンドン社製）で封入し、蛍光顕微鏡で観察した。この結果を図４に示す。
【００２０】
また、免疫染色による細胞内のドレブリンＡの分布をＤｉＩ染色による神経細胞形態と比較して調べたところ、正常の発達をしている神経細胞では、樹状突起の棘構造であるスパインに局在するドレブリンＡがスパインではなく樹状突起に存在し、未熟な神経細胞と同様な局在を示しており、神経系の発達の遅れが示唆された。さらに、１ニューロン当たり４０〜６３のスパインをカウントし、各ニューロンのスパイン長を測定した。結果を図５に示す。図５から、アンチセンス鎖５′−ＡＧＧＡＡＧＧＣＣＣＡＣＴＧＴＣＣＧＡＴＧＣＣＴ−３′投与群（AS）では、コントロールであるアンチセンス鎖未投入群（Cont）やポジティブコントロールであるreversedアンチセンス鎖投与群（RAS）の場合に比べて、スパイン長が統計学上有意に短くなっていた。また、１樹状突起当たりのスパイン密度についても測定した。結果を図６に示す。図６からわかるように、スパイン密度については、アンチセンス鎖５′−ＡＧＧＡＡＧＧＣＣＣＡＣＴＧＴＣＣＧＡＴＧＣＣＴ−３′投与群（AS）と、コントロールであるアンチセンス鎖未投入群（Cont）やポジティブコントロールであるreversedアンチセンス鎖投与群（RAS）との間に統計学上有意な差を見い出すことができなかった。
【００２１】
【発明の効果】
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いると、ドレブリンＡタンパク質の発現量が顕著に低下し、またかかるドレブリンＡの発現量が低下した神経細胞では、神経細胞において重要な構造である樹状突起の棘構造の長さが短くなることから、神経シナプス機能の調節を行うことが可能となり、精神・神経疾患や神経損傷の治療に応用できる。
【００２２】
【配列表】

【図面の簡単な説明】
【図１】マウスドレブリンＡのゲノミック遺伝子のエクソン−イントロン構成を示す図である。
【図２】染色体１３番におけるマウスドレブリンＡのゲノミック遺伝子（Ｄｂｎ１）の染色体地図を示す図である。
【図３】アンチセンス鎖５′−ＡＧＧＡＡＧＧＣＣＣＡＣＴＧＴＣＣＧＡＴＧＣＣＴ−３′を投与した場合のウエスタンブロットの結果を示す図である。
【図４】アンチセンス鎖５′−ＡＧＧＡＡＧＧＣＣＣＡＣＴＧＴＣＣＧＡＴＧＣＣＴ−３′を投与した場合の免疫染色の結果を示す図である。
【図５】アンチセンス鎖５′−ＡＧＧＡＡＧＧＣＣＣＡＣＴＧＴＣＣＧＡＴＧＣＣＴ−３′を投与した場合のスパイン長の測定結果を示す図である。
【図６】アンチセンス鎖５′−ＡＧＧＡＡＧＧＣＣＣＡＣＴＧＴＣＣＧＡＴＧＣＣＴ−３′を投与した場合のスパイン密度の測定結果を示す図である。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to an antisense oligonucleotide having a drebrin A expression inhibitory effect or a derivative thereof, a vector carrying them, a therapeutic drug for a disease caused by overexpression / function enhancement of drebrin A, and the like.
[0002]
[Prior art]
Nerve cells have a very complex shape that cannot be found in other somatic cells, and two types of protrusions, dendrites and axons, extend from the cell body, which is a protoplasm part with a nucleus. Yes. Dendrites extending in a dendritic manner have innumerable spine structures called spines, and form a posterior synapse that functions to receive information from other cells. This nerve cell specific morphology is determined by the nerve specific actin binding protein. On the other hand, the present inventors have discovered the world's first actin-binding protein drebrin (J. Neurochem. 44, 1210-1216 (1985), J. Biochem. 117) that is highly expressed in developing neurons. , 231-236 (1995)), that this drebrin is involved in neuronal morphogenesis, particularly protrusion formation, by changing the properties of actin fibers (J. Neurosci. Res. 38: 149-159 (1994), Exp. Cell Res. 215: 145-153 (1994), J. Biol. Chem. 269: 29928-29933 (1994)) and in developing and migrating neurons, it is present throughout the cell body and processes. However, in mature neurons, it exists specifically in the spine structure (J. Neurosci. 15: 7161-7170 (1996), Dev. Brain Res. 29, 233-244 (1986), Brain Res. 413, 374-378 (1987)) has already been proved. There are two isoforms of drebrin: embryonic type drebrin E and adult type drebrin A (J. Biochem. 117, 231-236 (1995)). Drebrin A, which is specifically found in the spine of the nerve cells, is characterized by being expressed only in the nerve cells (Dev. Brain Res. 29, 233-244 (1986), Brain Res. 413, 374- 378 (1987)). Drebrin A has a sequence in which a region called “ins2” is added to drebrin E by an alternative splicing mechanism. That, 5 'gtcgtccgtactgccctttcataaaggcatcggacagtgggccttcctcctcctcctcttcctcctcttcccctccacggactccctttccctatatcacctgccaccgcaccccaaacctctcttcctccctcccat) to 956base~1093base from side [SEQ ID NO: 1] is one that was expressed is inserted (Mol. Brain Res. 19, 101-114 (1993), Neuroreport 3, 109-112 (1992) ).
[0003]
Recently, the present inventors have also gathered dendritic spines automatically when drebrin A is expressed in primary cultured neurons, and by increasing the length or changing the amount of protein synthesis. It has been reported that spine morphology can be changed (J. Neurosci. 19, 3918-3925 (1999)). In addition, regarding the protein family to which drebrin belongs, it has been suggested that drebrin can be classified as a kind of actin-binding protein having an ADF Homology Domain (Mol. Biol. Cell 9, 1951-1959 (1998)). Further, SH3P7 has been discovered as a homologue of drebrin, but the function of SH3P7 is becoming clear (Mol. Cell. Biol. 19, 1539-1546 (1999), Nature Biotech. 14, 741-744 (1996). ).
[0004]
In addition, an antisense oligonucleotide that specifically knocks out the neurotrophic factor BDNF (Brain-derived neurotrophic factor) is prepared, and the exogenous BDNF blocks the effect of estradiol which increases the spine density in vivo and in vitro. The role of BDNF involved in the regulation of spine density has been elucidated, such as suppression of BDNF expression using sense oligonucleotides has an effect similar to estradiol, and the spine density is increased by anti-BDNF antibody (Proc. Natl Acad. Sci. USA 95, 11412-11417, 1998). Fragile X syndrome is the most common cause of hereditary mental retardation caused by the presence of fragile sites on the X chromosome, and is an abnormal expression of the gene FMR1 on the X chromosome. Although it is mainly caused by expression deficiency and abnormal expression of FMR1 is accompanied by abnormal morphology of the cranial nervous system, no therapeutic method for such cranial nerve diseases such as fragile X syndrome has been found.
[0005]
[Problems to be solved by the invention]
An object of the present invention is to provide an antisense oligonucleotide capable of specifically suppressing the expression of drebrin A, which can be expected to be useful as a therapeutic drug for fragile X syndrome.
[0006]
[Means for Solving the Problems]
The present inventors have discovered and commissioned the world's first actin-binding protein drebrin that is highly expressed in developing neurons, and have comprehensively and multifacetedly researched on drebrin. Recently, the present inventors isolated the genomic gene (Dbn1) of mouse drebrin A for the first time in the world and determined its sequence. FIG. 1 shows an exon-intron configuration of mouse Dbn1 consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 2. The mouse Dbn1, which has a total length of 20664 bp starting from the 6767th exon, is located approximately at the center of chromosome 13 from the chromosomal map shown in FIG. 2, and is adjacent to interleukin-9 (Il9) and paired-like homeodomein transcription factor. It can be seen that (Pitx1) exists.
[0007]
The concordance rate between the mouse drebrin A cDNA (accession number; AF187147) and the rat drebrin A cDNA represented by SEQ ID NO: 3 is 94.07%. Mouse drebrin A and rat drebrin represented by SEQ ID NO: 4 The concordance rate at the amino acid level with A was 95.35%, but the mouse ins2 sequence constituting exon 11 was completely (100%) identical to the rat ins2 sequence. The present inventors have focused on the ins2 region that is not present in drebrin E but is specifically present in drebrin A, and its sequence is well conserved across animal species, and four types of antisense to this ins2 region. An experiment was carried out to produce a chain and specifically suppress the expression of drebrin A in nerve cells. As a result, antisense of the region of aggcatcggacagtggggccttcct [SEQ ID NO: 5] from 980b to 1003b from the 5 'side of rat drebrin A cDNA It was found that the 24-mer S-oligo (5′-AGGAAGGCCCACTGTCCGATGCCT-3 ′) [SEQ ID NO: 6], which is a chain, significantly reduces the expression level of drebrin A, and the present invention has been completed.
[0008]
That is, the present invention hybridizes with an antisense oligonucleotide comprising the base sequence shown in SEQ ID NO: 6 (Claim 1) or the base sequence shown in SEQ ID NO: 5 under stringent conditions, and suppresses drebrin A expression. An antisense oligonucleotide having an action (Claim 2), a substance obtained by substituting the phosphate group of the antisense oligonucleotide according to Claim 1 or 2 with a thiophosphate group or a methylphosphonate group, and Claim 1 or The derivative of the antisense oligonucleotide according to claim 1 or 2, wherein the hydroxyl group of the ribose moiety of the antisense oligonucleotide according to 2 is substituted with an alkoxy group composed of methoxy or allyloxy, an amino group, or a fluorine atom (3). Claim 3) and the ann according to claim 1 or 2 A vector carrying a sense oligonucleotide and / or a derivative of the antisense oligonucleotide according to claim 3 (claim 4), or an antibody specifically recognizing a peptide comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 7 (claim 5) ) Or a monoclonal antibody, the antibody according to claim 5 (claim 6), the antisense oligonucleotide according to claim 1 or 2, and / or the derivative of the antisense oligonucleotide according to claim 3. Therapeutic agent for diseases caused by overexpression / function enhancement of drebrin A containing as an active ingredient (Claim 7), the antisense oligonucleotide according to claim 1 or 2, and / or the antisense oligonucleotide according to claim 3. Overexpression and function enhancement of drebrin A consisting of a derivative of and a pharmaceutically acceptable intracellular introduction reagent Due to disease of the therapeutic agent about (claim 8).
[0009]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
The antisense oligonucleotide of the present invention includes a DNA consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 6 (5'-AGGAAGGCCCACTGTCCGATGCCCT-3 ') and the base sequence shown in SEQ ID NO: 5 (aggcatcggacagtggggccttcct) under stringent conditions. Although it is not particularly limited as long as it is an antisense oligonucleotide (antisense DNA or antisense RNA) that hybridizes and has an action of suppressing drebrin A expression, the reason is that it is more stable when administered to a living body. Antisense DNA is preferred. The antisense oligonucleotide of the present invention can remarkably suppress the expression of drebrin A, and can also be used as a probe because of its selective hybridizing properties. From the cDNA library of other vertebrates, the antisense oligonucleotide of the present invention can be used. It is also possible to obtain cDNA that is a homolog gene of the drebrin A gene in the animal that hybridizes with the probe.
[0010]
The hybridization conditions under the above stringent conditions include, for example, hybridization at 42 ° C., and washing treatment at 42 ° C. with a buffer containing 1 × SSC and 0.1% SDS, Examples include hybridization at 65 ° C. and washing treatment at 65 ° C. with a buffer containing 0.1 × SSC and 0.1% SDS. In addition, there are various factors other than the above temperature conditions as factors affecting the stringency of hybridization, and those skilled in the art will be able to combine various components as appropriate to achieve the same stringency of hybridization as exemplified above. Stringency can be realized. The antisense oligonucleotide thus obtained is preferably an antisense DNA or antisense RNA having 12 to 39 bases, particularly 15 to 25 bases.
[0011]
The method for synthesizing the antisense oligonucleotide of the present invention is not particularly limited. For example, a DNA synthesizer (Applied Biosystems Inc. “381A”) or a DNA / RNA synthesizer (Applied Biosystems Inc. “ 394 ") and the like, and the phosphoramidite method, phosphorothioate method, phosphotriester method and the like. In this case, the procedure is performed according to the instructions attached to the DNA synthesizer, etc., and the synthesized product obtained is purified by HPLC using reverse phase chromatography etc. Derivatives can be obtained.
[0012]
In addition, in order to increase the stability of the antisense oligonucleotide of the present invention and the affinity for cells, a derivative in which the phosphate group or the hydroxyl group of the ribose moiety is substituted with another stable group within a range that does not significantly reduce its activity. Can also be used. Specific examples of such antisense oligonucleotide derivatives include those in which the phosphate group is substituted with a thiophosphate group or a methylphosphonate group, the hydroxyl group of the ribose moiety is an alkoxy group such as methoxy or allyloxy, an amino group, Or the thing substituted by the fluorine atom etc. can be mentioned.
[0013]
The antisense oligonucleotide or derivative thereof of the present invention suppresses the expression of drebrin A in nerve cells, and therefore is considered to be one of the causes caused by overexpression and hyperfunction of drebrin A protein in nerve cells, For example, there is a high possibility that Fragile X syndrome (fragile X syndrome) can be effectively treated. In the treatment of a disease considered to be one of the causes due to overexpression and hyperfunction of such drebrin A protein, 0.01 to 100 μM, preferably 0.1 to 10 μM, of the antisense oligonucleotide of the present invention or a derivative thereof is administered. Pharmaceutically acceptable intracellular introduction reagents such as lipofectin reagent, lipofectamine reagent, DOTAP reagent, Tfx reagent, artificially synthesized lipid vesicle, liposome, membrane fusion reagent, polymer It can be administered together with a micellization reagent, a polymer carrier, or other intracellular introduction reagent. In this case, the antisense oligonucleotide of the invention can be administered alone, but a normal pharmaceutically acceptable carrier, binder, stabilizer, excipient, diluent, pH buffer, disintegrant, Various preparation compounding ingredients such as a solubilizer, a solubilizer, and an isotonic agent can be added. Such therapeutic agents can be administered orally or parenterally. That is, it can be administered orally in commonly used dosage forms, such as powders, granules, capsules, syrups, suspensions, etc., or, for example, in dosage forms such as solutions, emulsions, suspensions, etc. Can be administered parenterally in the form of injections parenterally. For example, in the case of an injection, it can be prepared by dissolving the antisense oligonucleotide of the present invention in water, physiological saline, glucose solution or the like, and a buffer, preservative or stabilizer as necessary. Etc. may be included. The dose may vary depending on the degree of symptoms of each disease, the administration method, etc., but as a guide, for intravenous administration, 1 mg / kg to 1 g / kg, preferably 5 mg / kg to 500 mg / kg is exemplified per body weight can do.
[0014]
In addition, a plasmid or viral vector designed to express the antisense oligonucleotide sequence of the present invention is used as a gene therapy vector for the purpose of promoting uptake into cells or enhancing directivity to target cells. You can also. Suitable examples of such vectors include viral vectors such as herpes virus (HSV) vectors, adenovirus vectors, and human immunodeficiency virus (HIV) vectors. Among these viral vectors, HSV vectors are preferred. HSV vectors have high neurophilicity, are safe because HSV is not integrated into the chromosomal DNA of cells, and can regulate the expression period of the transgene. When a viral vector is used, an inverted repeat sequence recognized by recombinase, for example, a loxP sequence derived from Escherichia coli P1 phage or a wild-type FRT sequence derived from yeast Saccharomyces cerevisiae, is used at the desired time. Nucleotides can be expressed.
[0015]
The antibody of the present invention has a nucleotide sequence (aaggcatcggacaggtgggccttcctcc) containing the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 5 (aggcatcggacagtggggccttcct) (KADSDSGPSS, which is a translated peptide of 579 from the 5 'side of the rat drebrin A cDNA [SEQ ID NO: 7] The antibody of the present invention is not particularly limited as long as it is an antibody that specifically recognizes a region containing this peptide. Examples of the antibody of the present invention include a monoclonal antibody, a polyclonal antibody, a chimeric antibody, a single-chain antibody, and a humanized antibody. The above-mentioned immunospecific antibodies can be specifically mentioned, and these can be prepared by a conventional method using the above-mentioned KASDSGPSS as an antigen according to a conventional protocol. Among them, a monoclonal antibody has its specificity. In a more preferred. An antibody that specifically binds to KASDSGPSS, such as such a monoclonal antibody, is useful for diagnosing diseases caused by mutation or deletion of drebrin A, and for overexpression and hyperfunction of drebrin A protein in nerve cells. It is useful for the treatment of diseases considered to be one of the causes.
[0016]
【Example】
Hereinafter, the present invention will be described more specifically with reference to examples. However, the scope of the present invention is not limited to these examples.
Example 1 (culture of nerve cells)
Sprague-Dawley rats on day 20 of gestation were anesthetized with ether, and after decapitation, fetuses were removed. The cerebral cortex was removed, the meninges were peeled off, placed in a papain-added CGBD solution, and left in a 37 ° C. constant temperature bath for 15 minutes. The supernatant is removed by aspiration, washed with 5 ml of MEM medium, and the supernatant is again removed by aspiration. Then, 3 ml of MEM medium and 2 ml of horse serum are added and pipetted, and the nerve cell-containing solution is filtered and centrifuged. Discard the supernatant and stir in MEM medium containing 5% bovine serum, 5% horse serum, and 3.0 × 10 6/2 ml (for Western blot) or 2.0 × 10 ⁶ in a dish with a diameter of 3.5 cm. They were respectively injected by 2ml at a concentration of ⁶ / 2ml (for immunostaining). The neurons in these dishes were cultured at 37 ° C. in a CO ₂ incubator. From the fifth day onward, the culture was continued by using a glia-conditioning medium containing 5 μM of AraC and changing the medium half by half twice a week.
[0017]
Example 2 (Administration of antisense oligonucleotide)
On the 12th day from the start of the culture, the following four types of antisense oligonucleotides were administered into the medium so that the final concentration was 10 μM. Two days later, the neurons were collected, and immunostaining and Western blotting were performed.
5′-TTATGAAAGGGCAGTACGGACGAC-3 ′ [SEQ ID NO: 8]
5′-AGGAAGGCCCACTGTCCGATGCCT-3 ′ [SEQ ID NO: 6]
5′-TATAGGGAAAGGGAGTCCGTGGAG-3 ′ [SEQ ID NO: 9]
5′-GGTTTGGGGTGCGGTGGCAGGTGA-3 ′ [SEQ ID NO: 10]
As positive controls, four types of reversed antisense strands having the antisense strand sequence reversed were used.
[0018]
Example 3 (Western blot analysis)
In order to examine the expression level of drebrin A protein in neurons two days after administration of the antisense strand, Western blot analysis was performed. The nerve cell extract was separated by SDS-polyacrylamide electrophoresis, and the separated protein was blotted on a membrane filter ("Immobilon transfer membranes" manufactured by MILIPORE). The blotted membrane was incubated at room temperature in a solution containing anti-drebrin A antiserum (Exp. Cell Res. 215, 145-153 (1994); anti-drebrin A polyclonal antibody) diluted 5-fold with TBS containing 5% skim milk. Incubated for minutes. After washing with TBS containing 0.05% Tween 20, the incubated membrane was added to a solution of HRP-labeled anti-rabbit IgG antibody F (ab ′) ₂ fragment (manufactured by Kappel) diluted with TBS containing 5% skim milk. Soaked. Chemiluminescence generated by antigen-specific HRP reaction was visualized by Kodak Scientific Imaging Film (X-OMAT AR, Kodak) and ECL detection kit (Amersham Pharmacia Biotech). As a result, when the antisense strand 5'-AGGAAGGCCCACTGTCCGATGCCT-3 'was administered to the region of aggcatcggacaggtggggccttcct from the 5' side to the 980 base to 1003 base, when the antisense strand was not injected or when the reversed antisense chain was positively controlled It was found that this was effective in specifically reducing the expression level of drebrin A (FIG. 3), but the expression of drebrin A was not suppressed in the other three types of antisense strands. .
[0019]
Example 4 [Immunostaining]
Two days after administration of the antisense strand 5′-AGGAAGGCCCCACTGTCCGATGCCT-3 ′, nerve cells were fixed with shaking in PBS containing 3.5% paraformaldehyde at 4 ° C. for 15 minutes, and then washed in TBS at room temperature for 5 minutes. Block in PBS containing 3% BSA at room temperature for 10 minutes, and add anti-drebrin A antiserum (Exp. Cell Res. 215, 145-153 (1994); anti-drebrin A polyclonal antibody) with 3% BSA. The solution prepared by diluting with PBS containing was reacted at room temperature for 60 minutes. These reacted specimens were washed by shaking in PBS at room temperature for 5 minutes × 3 times, and then FITC-labeled anti-mouse IgG antibody (manufactured by Kappel) diluted 100-fold with PBS containing 3% BSA was used. And stained for 30 minutes at room temperature. These dyed products were washed by shaking in PBS at room temperature for 5 minutes × 3 times with light shielding, sealed with Permaflow (manufactured by Chandon), and observed with a fluorescence microscope. The result is shown in FIG.
[0020]
In addition, when the distribution of intracellular drebrin A by immunostaining was examined in comparison with the neuronal morphology by DiI staining, it was found that in normally developing neurons, they were localized in spines that are dendritic spines. Drebrin A is present in dendrites, not spines, and shows the same localization as immature neurons, suggesting a delay in the development of the nervous system. Furthermore, 40-63 spines per neuron were counted, and the spine length of each neuron was measured. The results are shown in FIG. From FIG. 5, in the antisense strand 5′-AGGAAGGCCCACTGTCCGATGCCT-3 ′ administration group (AS), in the case of the antisense strand non-injection group (Cont) as a control and the reversed antisense strand administration group (RAS) as a positive control. In comparison, the spine length was statistically significantly shorter. The spine density per dendrite was also measured. The results are shown in FIG. As can be seen from FIG. 6, regarding the spine density, the antisense strand 5′-AGGAAGGCCCACTGTCCGATGCCT-3 ′ administration group (AS), the antisense strand non-injection group (Cont) as a control, and the reversed antisense strand as a positive control No statistically significant difference was found between the administration group (RAS).
[0021]
【The invention's effect】
When the antisense oligonucleotide of the present invention is used, the expression level of drebrin A protein is remarkably reduced, and in the nerve cell in which the expression level of drebrin A is reduced, dendritic spines that are important structures in the nerve cell are used. Since the length of the structure is shortened, it becomes possible to regulate the nerve synapse function, and it can be applied to the treatment of psychiatric / neurological diseases and nerve damage.
[0022]
[Sequence Listing]

[Brief description of the drawings]
BRIEF DESCRIPTION OF DRAWINGS FIG. 1 is a diagram showing an exon-intron configuration of a mouse drebrin A genomic gene.
FIG. 2 is a diagram showing a chromosomal map of the mouse drebrin A genomic gene (Dbn1) on chromosome 13;
FIG. 3 shows the results of Western blotting when antisense strand 5′-AGGAAGGCCCACTGTCCGATGCCT-3 ′ is administered.
FIG. 4 shows the results of immunostaining when antisense strand 5′-AGGAAGGCCCACTGTCCGATGCCT-3 ′ is administered.
FIG. 5 is a view showing the measurement results of spine length when antisense strand 5′-AGGAAGGCCCACTGTCCGATGCCT-3 ′ is administered.
FIG. 6 is a diagram showing the measurement results of spine density when an antisense strand 5′-AGGAAGGCCCACTGTCCGATGCCT-3 ′ is administered.

Claims (8)

配列番号６に示される塩基配列からなるアンチセンスオリゴヌクレオチド。  An antisense oligonucleotide consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 6. 配列番号５に示される塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつドレブリンＡ発現抑制作用を有するアンチセンスオリゴヌクレオチド。  An antisense oligonucleotide that hybridizes with the base sequence shown in SEQ ID NO: 5 under stringent conditions and has an action of suppressing drebrin A expression. 請求項１又は２記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドのリン酸エステル基をチオリン酸エステル基或いはメチルホスホネート基で置換したもの、及び、請求項１又は２記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドのリボース部分の水酸基をメトキシ或いはアリロキシからなるアルコキシ基、アミノ基、又はフッ素原子で置換したもの、から選択される請求項１又は２記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドの誘導体。 The phosphoester group of the antisense oligonucleotide according to claim 1 or 2 is substituted with a thiophosphate group or a methylphosphonate group, and the hydroxyl group of the ribose moiety of the antisense oligonucleotide according to claim 1 or 2 is methoxylated. Or the derivative | guide_body of the antisense oligonucleotide of Claim 1 or 2 selected from the thing substituted by the alkoxy group which consists of allyloxy, an amino group, or a fluorine atom . 請求項１又は２記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド及び／又は請求項３記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドの誘導体を担持したベクター。  A vector carrying the antisense oligonucleotide according to claim 1 and / or the derivative of the antisense oligonucleotide according to claim 3. 配列番号７に示されるアミノ酸配列からなるペプチドを特異的に認識する抗体。Antibodies that specifically recognize a peptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 7. モノクローナル抗体であることを特徴とする請求項５記載の抗体。  6. The antibody according to claim 5, which is a monoclonal antibody. 請求項１又は２記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド及び／又は請求項３記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドの誘導体を有効成分とするドレブリンＡの過剰発現・機能亢進に起因する疾病の治療薬。  The therapeutic agent of the disease resulting from the overexpression and hyperfunction of drebrin A which uses the antisense oligonucleotide of Claim 1 or 2 and / or the derivative of the antisense oligonucleotide of Claim 3 as an active ingredient. 請求項１又は２記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド及び／又は請求項３記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドの誘導体と薬学的に許容される細胞内導入試薬とからなるドレブリンＡの過剰発現・機能亢進に起因する疾病の治療薬。  Due to overexpression / function enhancement of drebrin A comprising the antisense oligonucleotide according to claim 1 and / or the derivative of the antisense oligonucleotide according to claim 3 and a pharmaceutically acceptable reagent for introduction into cells. Disease remedy.

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