JP4097492B2

JP4097492B2 - Sample cell, electrochemical analyzer and electrochemical analysis method

Info

Publication number: JP4097492B2
Application number: JP2002269651A
Authority: JP
Inventors: 仁珠玖; 卓夫白石; 智一末永; 宏之阿部; 宏良星; 重夫青柳; 昌昭松平; 陽介内海
Original assignee: Japan Science and Technology Agency; National Institute of Japan Science and Technology Agency
Current assignee: Japan Science and Technology Agency; National Institute of Japan Science and Technology Agency
Priority date: 2002-09-17
Filing date: 2002-09-17
Publication date: 2008-06-11
Anticipated expiration: 2022-09-17
Also published as: JP2004108863A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、哺乳動物胚等の生体試料を配置する検体セル、及びこの検体セルを用いて生体試料の評価等を行う電気化学的分析装置と電気化学的分析方法に関するものであり、例えば生体試料として培養されたプロトプラストやウシ胚等の代謝活性量や形態変化等を分析する際に用いて好適なものである。
【０００２】
【従来の技術】
近年、家畜繁殖および体外培養技術の進歩により、牛などの家畜における体内および体外受精卵移植を行う研究機関や普及実施機関が増加し、市場に出回る受精卵移植家畜の生産頭数は増加の一途にある。一方、受胎卵移植による受胎率は、人工受精に比べてまだ十分とはいえず、移植や凍結保存に適した受精卵や核移植されたクローン胚の選択において、信頼性の高い品質分析方法および装置の確立が要望されている。
【０００３】
体外培養された哺乳動物受精卵の発生が正常に進行していることを判断する方法は、主に形態観察に依存しているのが現状である。実際に、形態観察に基づく受精卵の品質ランク判定は広く適用され、ルーチン化されている。
【０００４】
しかし、形態的判定により低品質と評価された受精卵が受胎したり、高品質と判定された受精卵が受胎しない事例が報告されている。また、判定者の主観により判定結果が一致しない恐れがある問題も指摘されている。
【０００５】
このような状況を踏まえて、試料溶液中に含まれる検体（分析対象物質）の濃度を自動的・連続的に定量するために適用されているマルチタイタープレートを備えた装置（以下、マルチ式分析装置と称する）を用い、前記のマルチタイタープレートに形成された複数個のウェル内に哺乳動物胚等の検体をそれぞれ配置し、その各検体において代謝活性量（例えば、溶存酸素量）等を電気化学的分析する方法（Electrochemistry，67−5479−483，1999）が検討されている。広く市販されているマルチ式分析装置は、吸光，蛍光，発光計測を検出原理とし、例えば容積が１００μｌ〜３ｍｌのマイクロウェルが１２〜９６個形成される。
【０００６】
このマルチ式分析装置による検体の電気化学的分析は、図５（ウェル５１の拡大図）に示すように、外壁５１ａで隔離された各ウェル５１内に対し、作用電極５２ａ，参照電極５２ｂ，対電極５２ｃを印刷等により形成し、各電極を内壁５３によって隔離して形成したマルチタイタープレート５０を、計測溶液（生体試料等の検体の生命を維持できる培養液等；図示省略）に浸し（各ウェル５１の各電極を計測溶液に浸し）、各ウェル５１の作用電極５２ａ上に検体をそれぞれ培養して、その培養された検体の経時的変化を電流変化として検出することにより行われる。なお、分析精度の観点から、前記各ウェル５１内における計測溶液の濃度分布はそれぞれ均一にする必要がある。
【０００７】
しかしながら、前記のマルチ式分析装置により電気化学的分析する場合、マルチタイタープレート５０の各ウェル５１に対して作用電極５２ａ，参照電極５２ｂ，対電極５２ｃをそれぞれ形成する必要があるため、分析装置の構成が複雑になってしまう。また、前記の各ウェル５１内における検体の経時的変化を電流変化として検出する場合、作用電極５２ａ表面では計測溶液の濃度分布が不均一になってしまうが、作用電極５２ａの周囲の濃度においては均一に保つ必要がある。さらに、前記の各ウェル５１の形状は極めて微小であるため、それら各ウェル５１に対して検体を配置する際にはマニピュレータ，マイクロインジェクタ，実体顕微鏡等を必要とし手間がかかってしまう。
【０００８】
そこで最近では、特開２００２−１２２５６８号公報（哺乳動物胚の無侵襲的品質評価方法及びその装置）として、走査型電気化学顕微鏡（電気化学顕微鏡）を用いることにより、個々のウシ胚における形態を観察したり酸素消費量を基準に胚の正常性を判定する方法および装置（以下、電気化学的分析装置と称する）による品質評価方法が提案されている。
【０００９】
この電気化学的分析装置は、単一哺乳動物胚の形態観察を行うための（倒立）顕微鏡と、単一哺乳動物胚の酸素消費量の計測を行う電気化学顕微鏡計測装置と、培養液に準ずる計測溶液とを用いて単一胚近傍の酸素濃度変化を高空間分解能で定量する手段と、あらかじめ作出した哺乳動物胚の大きさと酸素消費量の関係および哺乳動物胚のその後の発生結果を集計する手段と、両手段による結果に基づいて哺乳動物胚の正常性を判定する手段とを具備して構成されている。
【００１０】
この電気化学的分析装置において、電気化学顕微鏡計測装置は図６に示すように、顕微鏡ステージ６９ｂ上に設置した微小電極（作用電極６１ａ，参照電極／対電極６１ｂ）、電極位置決め装置６４ａ、微小電流計測装置（ポテンショスタット）６４ｃ、及びこれらの制御等を行うコンピュータ６４ｂと、恒温循環槽等から成る温度制御装置６６、ガス（酸素、二酸化炭素）ボンベ６７ａ，バブラー６７ｂ等を有する培養気相条件制御装置、倒立顕微鏡６９ａ等から構成され、顕微鏡ステージ６９ｂ上に配置されるディッシュ型セル（平底容器）６２ｂ内の培地／計測溶液６２ａに、試料保持装置（キャピラリーガラス６５ａ，シリコンチューブ６５ｂ，マイクロインジェクタ６５ｃ）６５によって保持された検体（例えば、胚試料）６３の分析・評価等を行うものである。なお、６８はグローブボックスである。
【００１１】
このように構成された電気化学的分析装置において、試料保持装置６５を操作し検体６３をディッシュ型セル６２ｂ内における顕微鏡（倒立顕微鏡６９ａ）視野の中心に配置し、作用電極６２を検体６３の周囲を走査し電流変化を検出することにより、前記検体６３の形態および酸素消費量等の分析が行われる。
【００１２】
【非特許文献１】
新井潤一郎，加藤英夫著「酸素電極法による微生物の呼吸測定を指標とした薬剤スクリーニング」The Electrochemical Society出版、１９９９年、６７−５のｐ．４７９−４８３。
【００１３】
【特許文献１】
特開２００２−１２２５６８号公報（段落［００３５］〜［００３９］，図１）。
【００１４】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、従来の電気化学的分析装置の場合は、検体６３を試料保持装置６５で操作しながら分析する必要があるため、分析工程が煩雑になってしまうこと、その分析に要する時間は装置の使用者の修練度によって大きく左右されてしまうこと、また検体１個を分析する毎に一つの試料保持装置６５を必要とするため、複数個の検体を分析する装置としては不適格であること、さらには試料の保持をガラスキャピラリー６５ａおよびマイクロインジェクタ６５ｃによって構成される前記試料保持装置６５により行っているため、検体に損傷等のダメージを与えてしまう危険性があること、そして前述の各問題点の影響等により分析精度が低下することも考えられる。
【００１５】
本発明は前記課題に基づいてなされたものであり、検体に損傷を与えることなく保持できる検体セルを提供すると共に、既存の電気化学的分析装置（無侵襲的分析装置）において、１個又は複数個の検体を簡便な方法および高精度で連続的に分析することを可能にした電気化学的分析装置を提供することにある。
【００１６】
【課題を解決するための手段】
本発明は、前記課題の解決を図るために、請求項１の発明においては電気化学顕微鏡計測装置と、電気化学顕微鏡計測装置により分析する検体である生体試料を配置する検体セルを用いた装置であって、前記検体セルは、平板状部材の一面側に検体である生体試料を配置するための逆錐形状のウェルを１個または複数個形成するとともに、前記平板上に前記ウェルの周囲を囲む壁部を立設して液槽を形成したものであり、前記ウェルは、ウェル内周面の傾斜が垂直方向に対して３０°〜６０°となるよう形成したしたものであり、前記検体セルの液槽内に計測溶液を充填した状態で、前記電気化学顕微鏡計測装置の作用電極を計測溶液内で移動自在且つウェル内に侵入可能に構成すると共に、前記計測溶液内でウェルから所定距離を隔てた位置に参照電極／対極を配置して構成したことを特徴とする。ここで、逆錐形状とは、略逆円錐形状の他、例えば略逆三角錐形状，逆四角錐形状等を示す。なお、ここで電気化学顕微鏡計測装置とは、顕微鏡ステージ上に設置した微小電極（作用電極，参照電極／対電極）、電極位置決め装置、微小電流計測装置（ポテンショスタット）、及びこれらの制御等を行うコンピュータと、恒温循環槽等から成る温度制御装置、ガス（酸素、二酸化炭素）ボンベ，バブラー等を有する培養気相条件制御装置、及び倒立顕微鏡等から構成されている。
【００１８】
請求項２の発明は、請求項１の発明におけるウェルが、底部に微小平面部を有することを特徴とする。
【００１９】
請求項３の発明は、請求項１または２の何れかの発明における検体セルを、透明な材料により形成したことを特徴とする。ここで透明な材料とはアクリルやポリスチレン等の透視可能な材料をいう。
【００２２】
請求項４の発明は、請求項１〜３の何れかに記載の電気化学的分析装置を用い、計測溶液が充填された検体セル上方から検体である生体試料を投入してウェル内に静止させ、ウェル内において作用電極が検体周囲を移動して走査することにより、前記検体周囲の電流変化を検出し、この検出結果に基づいて検体の分析，評価等をすることを特徴とする。
【００２３】
請求項５の発明は、請求項１〜３の何れかに記載の電気化学的分析装置を用いると共に、分析する検体である生体試料が配置される検体セルとして複数個のウェルが形成された多検体セルを用い、計測溶液が充填された多検体セル上方から検体である生体試料を投入して各ウェル内に各々静止させ、作用電極がウェル内において検体周囲を移動して走査する工程を各ウェル毎に順次自動的に行って、各検体周囲の電流変化を各々検出し、各検出結果に基づいて各検体を各々自動的に分析，評価することを特徴とする。
【００２４】
【発明の実施の形態】
本実施の形態は、複数個の生体試料などの検体を保持することが可能な検体セル（以下、多検体セルと称する）と、この多検体セルを用いた電気化学的分析装置を開発し、各検体に損傷を与えることなく保持し、代謝活性量や形態等を分析すると共に、各検体を簡便な方法および高精度で連続的に分析することを検討したものである。
【００２５】
以下、本発明の実施の形態における多検体セル、及び電気化学分析装置を図面に基づいて詳細に説明する。
【００２６】
図１Ａ（概略図），Ｂ（断面図），Ｃ（ウェルの拡大図）は、本発明の実施の形態に係る多検体セルの概略説明図を示すものである。図１Ａ〜Ｃにおいて、多検体セル１１はアクリルやポリスチレン等の透視可能（例えば、後述するウェル内に配置された検体を他端面側から透視可能）な材料を射出成形することで、基板の一端面側に検体を配置するためのウェル（逆円錐形状の穴）１１ａが複数個それぞれ所定距離を隔てて形成すると共に、各ウェル１１ａの周囲には各ウェル１１ａ周囲を囲む壁部１１ｂが立設されており、これにより基板上には各ウェル１１ａを含めた壁部１１ｂ内が試料溶液で満たされる液槽を形成して構成したものである。
【００２７】
本実施形態においては、長さ６０ｍｍ，幅３０ｍｍ，厚さ３ｍｍのアクリル製基板に、開口半径２ｍｍ，深さ２ｍｍの逆円錐形状のウェル１１ａを２ｍｍ間隔で６個形成され、基板上縁部にはこれら各ウェル１１ａを囲むようにアクリルから成る厚さ５ｍｍ，高さ５ｍｍの壁部１１ｂが立設され、壁部１１ｂ内には長さ５０ｍｍ、幅２０ｍｍ、深さ５ｍｍの液槽が形成されている。なお、ウェル１１ａの底部には、図１（Ｃ）に示すように必要に応じて微小平面部１１ｃを形成しても良く、この実施形態においては直径０．０５ｍｍの微小平面部１１ｃが形成されている。
【００２８】
以上のように構成した多検体セル１１に、検体である生体試料として細胞や胚などの検体を配置する場合には、ウェル１１ａを目印に、その上方より単に簡易なインジェクター等による滴下等で検体を落とし込むことで、検体を適切な位置、即ちウェル１１ａ内に容易に納めることができるので、検体にダメージを与える恐れは無い。
【００２９】
この時、ウェル１１ａ開口範囲内であれば微小のズレがあったとしても、検体はウェル１１ａの傾斜により案内され、速やかにウェル１１ａの頂部に納まって静止するので、厳密な（例えば、マニピュレータ，マイクロインジェクタ，実態顕微鏡等を用いた）位置調整等を行う必要もない。
【００３０】
そして、検体がウェル１１ａ内に納まった状態においては、多検体セル１１に多少の振動が加えられても、検体が所定の位置から移動するようなことはない。
【００３１】
なお、本実施形態においては、ウェル１１ａの底部に微小平面部１１ｃを形成していることにより、検体の下面側がこの微小平面部１１ｃによって支持されるため、検体をより安定して支持することが可能であるが、この微小平面部１１ｃは必要に応じて形成すれば良いものである。
【００３２】
また、多検体セル１１は、滑らかな表面となるように射出成型等により形成することが好ましいが、他の既知の方法によって形成しても良く、また射出成形により形成するにあたっては、壁部１１ａも含めて一体的に形成しても良い。
【００３３】
更に、各ウェル１１ａの形状，大きさ，数等は、前記の寸法等に限ることなく、検体の形状，大きさ，数等に応じて任意に形成すれば良く、例えばウェル１１ａの形状も、ウェル１１ａ内に検体を投入した際に検体が速やかにウェル１１ａ内に納まるよう、略逆錐形状とすることが好ましく、例えば、前述の略逆円錐形状に限らず例えば略逆三角錐形状，逆四角錐形状等であっても良い。この時、ウェル１１ａの内周面を図１（Ｃ）に示すように垂直方向に対して４５°、即ち図１（Ｃ）中の断面が９０°になるように形成すると、ウェル１１ａの深さと開口半径とを同じにバランス良く確保できるため、種々の形状，大きさの検体に対する汎用性の面で好ましいと思われるが、用途に応じて例えば垂直方向に対して３０°〜６０°の範囲で任意の傾斜を選択することができる。
【００３４】
以上の説明は全て、多数の検体を対象とする多検体セルについて説明しているが、単一の検体用として、ウェル１１ａを１個だけ有する検体セルとしても良いことは勿論である。
【００３５】
なお、この検体ウェルは、前述のように射出成型により製造することで、同一の形状でばらつきなく生産できるので、大量生産に好適である。
【００３６】
次に、本実施の形態に係る電気化学分析装置について説明する。本実施の形態に係る電気化学的分析装置は、図６に示す従来の電気化学顕微鏡計測装置において、ディッシュ型セル６２ｂに代えて前記の検体セル（特に本実施の形態においては多数のウェル１１を有する多検体セル１１）を用いたものであるため、電気化学顕微鏡計測装置についての説明は省略する。
【００３７】
図２は、図６のディッシュ型セル６２ｂに代えて設置された多検体セル１１を用いて行う検体の分析等について説明するための概略説明図である。なお、図１に示すものと同様なものには同一符号を用いて、その詳細な説明を省略する。
【００３８】
多検体セル１１の壁部１１ｂ内に計測溶液（例えば、無血清培養液）２１が充填され、各ウェル１１ａ内には検体２２がそれぞれ投入されており、必要に応じて培養が行われる。２３は作用電極（図６においては符号６１ａ）であり、各ウェル１１内を含む計測溶液２１内に対して電極位置決め装置（図６においては符号６４ａ）により移動自在に配置されている。２４は、計測溶液２１内で各ウェル１１ａから所定距離を隔てた任意の位置に配置された参照電極／対電極（図６においては６１ｂ）である。なお、前記の検体２２と一対の作用電極２３および参照電極／対電極２４とは、計測溶液２１を介して電気的に接続される。
【００３９】
そして、図２に示すように各ウェル１１内における検体２２の上方（検体２２から所定距離を隔てた上方の位置）に作用電極２３を移動させ、ウェル１１ａ内にて作用電極２３を走査させて電流変化をそれぞれ検出して分析が行われる。この分析工程は、各ウェル１１ａ内の各検体２２に対して順次行われる。
【００４０】
この時、本実施の形態においては、ディッシュ型セルに代えてウェル１１ａを有する多検体セル１１を用いたことで、試料保持装置等は用いることなく前述通りに検体２２を容易に所定の位置に保持することができ、また検体２２が事前に位置確認のできるウェル１１の頂部位置（決まった位置）に保持されることから、作用電極２３の位置制御，走査等の各種操作はウェル１１の頂部位置を目標に行えば良いので、使用者の修練度等に左右されることなく、誰もが短時間で容易に分析を行うことができる。
【００４１】
なお、前記の作用電極２３，参照電極／対電極２４には、検体や電気化学的装置の大きさに応じて例えば微小電流計測用のものを用いることが好ましい。
【００４２】
次に、以下に示す方法により検体として藻類ハネモのプロトプラスト，ウシ胚を各々作成し、電気化学的分析装置としてディッシュ型セル６２ｂを用いた場合（従来の電気化学顕微鏡計測装置）と、多検体セル１１を用いた場合（本実施の形態に係る電気化学的分析装置）とで、各々前記検体の酸素消費量の指標となる酸素濃度差（μＭレベル）等を検出し、両者の比較を行った。
【００４３】
なお、本実施例では、作用電極６１ａとして電極半径１μｍの白金ディスク電極を用い、参照電極／対電極６１ｂにはＡｇ／ＡｇＣｌ電極を用いた。
【００４４】
（プロトプラストの作成）
検体として用いるプロトプラストの作成について説明する。まず人工海水（１リットル当たりの成分；ＮａＣｌ…２３．９０ｇ，ＮａＨＣＯ₃…０．１９５ｇ，ＣａＣｌ₂…１．２３４ｇ，ＭｇＣｌ₂…４．９８９ｇ）が充填されたシャーレ（例えば、キムワイプ（登録商標）上に載置されたシャーレ）を用意し、海水中でハネモの先端部を切断して採取し前記シャーレ内に移す。次に、前記シャーレ内にてハネモの先端部をピンセットで保持しながら、他のピンセットにより前記ハネモ内のプロトプラストを搾り出す。そして、前記シャーレ内を倒立顕微鏡で観察しながら光を約３０分間照射し、球状（半径１５０μｍ程度の球状）になったものを検体（以下、プラスト検体と称する）として用いた。
【００４５】
（ウシ胚の作成）
次に、検体として用いるウシ胚は、体外受精させたウシ胚を無血清培養液（ＩＶＤ１０１；機能性ペプチド研究所製）中に浸し、低酸素雰囲気（Ｏ₂…５％，ＣＯ₂…５％，Ｎ₂…９０％、湿度１００％、温度３８．５℃）下にて発生培養させて、これを検体（以下、ウシ検体と称する）として用いた。
【００４６】
（従来の無侵襲的試験装置による分析）
まず、検体（プラスト検体またはウシ検体）を計測溶液（人口海水または無血清培養液）と共にディッシュ型セル６２ｂに移し電気化学顕微鏡計測装置の所定位置（図６のディッシュ型セルの位置）に配置する。そして、前記の検体を試料保持装置６５により固定し参照電極／対電極６１ｂに対する作用電極６１ａの電位を−０．６Ｖに設定すると共に、前記の検体表面および検体表面から所定距離隔てた領域（１０μｍ〜１７０μｍ）において前記作用電極６１ａを走査速度１４．７μｍ／秒で走査し電流変化を検出することにより、前記検体表面と検体表面から所定距離隔てた領域との酸素濃度差ΔＣ（ディッシュ型セルを用いた場合はΔＣ_Sとする）をそれぞれ求めた。
【００４７】
前記のように酸素濃度差ΔＣを求めることにより、下記の計算式によって酸素消費速度Ｆを算出することができる。なお、下記（１）式のＤは酸素拡散係数（２．１×１０⁵ｃｍ²／ｍｏｌ）、ｒ_Sは検体（透明体を含む検体）の半径を示すものとする。
【００４８】
Ｆ＝４π・Ｄ・ｒ_S・ΔＣ …… （１）
そして前記（１）式より明らかなように、ΔＣは酸素消費速度Ｆの定量化、すなわち酸素消費量の指標となることが判る。
【００４９】
（本実施の形態に係る電気化学的分析装置による分析）
次に、検体（プラスト検体またはウシ検体）を、前述の方法により多検体セル１１のウェル１１ａ（複数個のウェルのうち何れか一つ）内に配置し、前記ディッシュ６２ｂを用いた場合と同様の方法で作用電極６１ａ（図２中の作用電極２３）を走査し電流変化を検出することにより、前記検体表面と検体表面から所定距離隔てた領域との酸素濃度差ΔＣ（多検体セルを用いた場合はΔＣ_Pとする）をそれぞれ求めた。
【００５０】
前記のようにディッシュ，多検体セルを用いて得られた各々の酸素濃度差の結果を、図３（プラスト検体），図４（ウシ検体）の酸素濃度差ΔＣ_SとΔＣ_Pとの相関特性図に示した。
【００５１】
図３，４に示す結果から、検体の種類，大きさに関係なく、下記の関係式が成り立つことが読み取れる。
ΔＣ_P＝２・ΔＣ_S …… （２）
すなわち、本実施の形態のように多検体セルを用いることにより、従来のディッシュ型セルおよび試料保持装置を用いた場合と比較して、検体の酸素濃度差を２倍程度増幅させて分析でき、例えば細胞の呼吸に由来する検体周辺の酸素濃度変化を効率的に捕捉できることが判った。
【００５２】
なお、本実施の形態の検体セル（又は多検体セル）は、アクリル，ポリスチレン等の透視可能な材料により形成されていることにより、従来の無侵襲的試験装置と同様に、倒立顕微鏡（図６中の６９ａ）により、下方より検体の形態観察を行うことができる。
【００５３】
そして、本実施の形態に係る電気化学的分析装置においても、顕微鏡観察により検体の大きさを計測し形態的評価を行うと共に、検体の酸素消費量の計測を行い、予め記録した検体の大きさと酸素消費量の関係や、検体のその後の成長過程等を基に設定した判定基準を参照することで、検体の品質を判定することができることは、従来の無侵襲的試験装置と同様である。
【００５４】
また、本実施の形態の電気化学分析装置において多検体セルを用いる場合、各検体が事前に位置確認のできる決まった位置（ウェルの頂部位置）に保持され、作用電極の位置制御，走査等の各種操作を決まった位置を目標に行うことができるので、各検***置における走査等の分析のための操作等を自動的に行ようコンピュータ（例えば図６中のコンピュータ６４ｄ）にプログラムしておくことで、多検体セルに保持された複数の検体の分析を順次自動的に行う自動化が可能である。
【００５５】
以上、本発明において、記載された具体例に対してのみ詳細に説明したが、本発明の技術思想の範囲で多彩な変形および修正が可能であることは、当業者にとって明白なことであり、このような変形および修正が特許請求の範囲に属することは当然のことである。
【００５６】
【発明の効果】
以上示したように本発明の検体セルによれば、検体にダメージを与える恐れも無く、マニピュレーター，マイクロインジェクタ等の特殊な試料保持装置を用いることなく、例えば簡易なインジェクター等により、検体を適切な位置（ウェル内）に容易に納め保持することができる。
【００５７】
そして、検体がウェル内に納まった状態においては、検体セルに多少の振動が加えられても、検体が所定の位置から移動するようなことはない。
【００５８】
更に、ウェルの底部に微小平面部を形成することにより、検体の下面側がこの微小平面部によって支持され、検体をより安定して支持することが可能である。
【００５９】
なお、検体セルは透視可能な材料により形成されているので、倒立顕微鏡等による検体の形態観察を行うこともできる。
【００６０】
また、本発明の電気化学的分析装置によれば、セルに多検体セルを用いたことで、試料保持装置等は用いることなく前述通りに検体を容易に所定の位置に保持することができるので、装置としての小型化が図れ、検体が事前に位置確認のできるウェルの頂部位置（決まった位置）に保持されることから、作用電極の位置制御，走査等の各種操作はウェルの頂部位置を目標に行えば良いので、使用者の修練度等に左右されることなく、誰もが短時間で容易に分析，評価等を行うことができる。
【００６１】
そして、従来法と比較して検出電流を略2倍の増幅して計測できることより、検体のの呼吸に由来する検体周辺の酸素濃度変化を効率的捕捉でき、ウシ胚等の検体における酸素消費量を基準にした正常性等の評価，判定する際、より確度が高い情報を得ることができる。
【００６２】
更に、多検体セルを用いた場合には、生体試料である検体を複数同時に保持できるので、その都度検体の保持作業を行うことなく、保持した検体を短時間で順次連続して分析，評価することが可能である。
【００６３】
更にまた、多検体セルを用いる場合、各検体が事前に位置確認のできる決まった位置（ウェルの頂部位置）に保持され、作用電極の位置制御，走査等の各種操作を決まった位置を目標に行うことができるので、各検***置における走査等の分析のための操作等を自動的に行ようコンピュータにプログラムしておくことで、多検体セルに保持された複数の検体の分析を順次自動的に行う自動化が可能である。
【図面の簡単な説明】
【図１】本実施の形態における検体セルの概略説明図。
【図２】本実施の形態の概略説明図
【図３】プラスト検体における酸素濃度差ΔＣ_SとΔＣ_Pとの相関特性図。
【図４】ウシ検体における酸素濃度差ΔＣ_SとΔＣ_Pとの相関特性図。
【図５】マルチ式分析装置の概略説明図。
【図６】従来の電気化学的分析装置の概略説明図。
【符号の説明】
１１…多検体セル
１１ａ…ウェル
１１ｂ…壁部
１１ｃ…微小平面部
２１…計測溶液
２２…検体
２３…作用電極
２４…参照電極／対電極[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a specimen cell in which a biological sample such as a mammalian embryo is placed, and an electrochemical analysis apparatus and an electrochemical analysis method for evaluating the biological sample using the specimen cell. It is suitable for use in analyzing metabolic activity, morphological changes, etc. of protoplasts and bovine embryos cultured as
[0002]
[Prior art]
In recent years, with the progress of livestock breeding and in vitro culture technology, the number of research institutions and implementation agencies that carry out in-vivo and in-vitro fertilized egg transplantation in livestock such as cattle has increased, and the number of fertilized egg-transplanted livestock on the market has been increasing is there. On the other hand, the conception rate by embryo transfer is still not sufficient compared to artificial fertilization, and in the selection of fertilized eggs suitable for transplantation and cryopreservation and clone embryos that have undergone nuclear transfer, a reliable quality analysis method and Establishment of a device is desired.
[0003]
At present, the method for judging whether the development of a mammalian fertilized egg cultured in vitro is proceeding normally depends mainly on morphological observation. In fact, fertilized egg quality rank determination based on morphology observation is widely applied and routineized.
[0004]
However, cases have been reported in which fertilized eggs evaluated as low quality by morphological determination are not fertilized, or fertilized eggs determined as high quality are not fertile. In addition, a problem has been pointed out that the judgment results may not match due to the subjectivity of the judge.
[0005]
Based on this situation, a device equipped with a multi-titer plate (hereinafter referred to as multi-type analysis) applied to automatically and continuously quantify the concentration of the sample (analyte) contained in the sample solution. (Referred to as “device”), specimens such as mammalian embryos are placed in a plurality of wells formed on the multititer plate, and the metabolic activity (for example, dissolved oxygen) is electrically measured in each specimen. Methods for chemical analysis (Electrochemistry, 67-5479-483, 1999) have been studied. Widely available multi-type analyzers have absorption, fluorescence, and luminescence measurement as detection principles, and, for example, 12 to 96 microwells with a volume of 100 μl to 3 ml are formed.
[0006]
As shown in FIG. 5 (enlarged view of the well 51), the electrochemical analysis of the specimen by this multi-type analyzer is performed on the working electrode 52a, the reference electrode 52b, and the pair in each well 51 isolated by the outer wall 51a. The multi-titer plate 50 formed by forming the electrodes 52c by printing or the like and separating each electrode by the inner wall 53 is immersed in a measurement solution (a culture solution or the like capable of maintaining the life of a specimen such as a biological sample; not shown). Each electrode of the well 51 is immersed in a measurement solution), a specimen is cultured on the working electrode 52a of each well 51, and a change with time of the cultured specimen is detected as a current change. From the viewpoint of analysis accuracy, the concentration distribution of the measurement solution in each well 51 needs to be uniform.
[0007]
However, when electrochemical analysis is performed by the multi-type analyzer, it is necessary to form the working electrode 52a, the reference electrode 52b, and the counter electrode 52c for each well 51 of the multi-titer plate 50. The configuration becomes complicated. In addition, when the temporal change of the specimen in each well 51 is detected as a current change, the concentration distribution of the measurement solution becomes non-uniform on the surface of the working electrode 52a, but the concentration around the working electrode 52a is It must be kept uniform. Furthermore, since the shape of each of the wells 51 is extremely small, manipulators, microinjectors, stereomicroscopes, and the like are required to place a sample in each of the wells 51.
[0008]
Therefore, recently, as disclosed in Japanese Patent Application Laid-Open No. 2002-122568 (Non-invasive quality evaluation method and apparatus for mammalian embryos), by using a scanning electrochemical microscope (electrochemical microscope), the morphology of individual bovine embryos can be changed. A quality evaluation method using a method and an apparatus (hereinafter referred to as an electrochemical analyzer) for observing or determining normality of an embryo based on oxygen consumption has been proposed.
[0009]
This electrochemical analyzer is based on the (inverted) microscope for observing the morphology of a single mammalian embryo, the electrochemical microscope measuring device for measuring the oxygen consumption of a single mammalian embryo, and a culture solution. Using a measurement solution, a means for quantifying changes in oxygen concentration in the vicinity of a single embryo with high spatial resolution, the relationship between the size and oxygen consumption of a pre-produced mammalian embryo, and the subsequent development results of the mammalian embryo And means for determining the normality of the mammalian embryo based on the results of both means.
[0010]
In this electrochemical analyzer, as shown in FIG. 6, the electrochemical microscope measuring device includes a microelectrode (working electrode 61a, reference electrode / counter electrode 61b), an electrode positioning device 64a, a microcurrent installed on a microscope stage 69b. Culture gas phase condition control having a measuring device (potentiostat) 64c, a computer 64b for controlling these, a temperature control device 66 comprising a constant temperature circulation tank, a gas (oxygen, carbon dioxide) cylinder 67a, a bubbler 67b, etc. A sample holding device (capillary glass 65a, silicon tube 65b, microinjector 65c) is added to the medium / measurement solution 62a in the dish type cell (flat bottom container) 62b, which is composed of an apparatus, an inverted microscope 69a, etc., and is arranged on the microscope stage 69b. ) Of the specimen (eg, embryo sample) 63 held by 65 And performs the analysis and evaluation. Reference numeral 68 denotes a glove box.
[0011]
In the electrochemical analyzer configured as described above, the sample holding device 65 is operated to place the specimen 63 in the center of the field of view of the microscope (inverted microscope 69a) in the dish cell 62b, and the working electrode 62 is disposed around the specimen 63. , And the change in current is detected to analyze the configuration of the sample 63 and the oxygen consumption.
[0012]
[Non-Patent Document 1]
Junichiro Arai and Hideo Kato, “Drug Screening Using Respiratory Measurement of Microorganisms by Oxygen Electrode Method”, The Electrochemical Society, 1999, 67-5, p. 479-483.
[0013]
[Patent Document 1]
JP 2002-122568 A (paragraphs [0035] to [0039], FIG. 1).
[0014]
[Problems to be solved by the invention]
However, in the case of a conventional electrochemical analysis device, it is necessary to analyze the specimen 63 while operating the sample 63 with the sample holding device 65, so that the analysis process becomes complicated and the time required for the analysis is the use of the device. It is largely unsatisfactory as an apparatus for analyzing a plurality of specimens, since it requires a single specimen holding device 65 each time a specimen is analyzed. Since the sample is held by the sample holding device 65 constituted by the glass capillary 65a and the microinjector 65c, there is a risk of damaging the specimen, and the above-described problems. It is also conceivable that the analysis accuracy decreases due to the influence or the like.
[0015]
The present invention has been made based on the above problems, and provides a sample cell that can be held without damaging the sample. In addition, one or more existing electrochemical analyzers (non-invasive analyzers) are provided. It is an object of the present invention to provide an electrochemical analyzer capable of continuously analyzing individual specimens with a simple method and high accuracy.
[0016]
[Means for Solving the Problems]
In order to solve the above problems, the present invention is an apparatus using an electrochemical microscope measurement device and a specimen cell in which a biological sample, which is a specimen to be analyzed by the electrochemical microscope measurement apparatus, is arranged. In the specimen cell, one or a plurality of inverted cone-shaped wells for placing a biological sample as a specimen is formed on one surface side of a flat plate member, and the periphery of the well is surrounded on the flat plate. A liquid tank is formed by erecting a wall portion , and the well is formed so that an inclination of an inner peripheral surface of the well is 30 ° to 60 ° with respect to a vertical direction, and the sample cell The working electrode of the electrochemical microscope measuring device is configured to be movable in the measuring solution and to be able to enter the well in a state where the measuring solution is filled in the liquid tank, and a predetermined distance from the well is set in the measuring solution. Remote position The reference electrode / counter electrode is arranged in the structure . Here, the inverted pyramid shape indicates, for example, a substantially inverted triangular pyramid shape, an inverted quadrangular pyramid shape, etc. in addition to the substantially inverted cone shape. Here, the electrochemical microscope measuring device includes a microelectrode (working electrode, reference electrode / counter electrode), an electrode positioning device, a microcurrent measuring device (potentiostat) installed on the microscope stage, and control thereof. It is composed of a computer to be performed, a temperature control device comprising a constant temperature circulation tank, a culture gas phase condition control device having a gas (oxygen, carbon dioxide) cylinder, a bubbler, and an inverted microscope.
[0018]
The invention of claim 2 is characterized in that the well in the invention of claim 1 has a micro-planar portion at the bottom.
[0019]
A third aspect of the invention is characterized in that the sample cell according to the first or second aspect of the invention is formed of a transparent material. Here, the transparent material means a transparent material such as acrylic or polystyrene.
[0022]
A fourth aspect of the invention uses the electrochemical analyzer according to any one of the first to third aspects , and puts a biological sample as a specimen from above the specimen cell filled with the measurement solution and makes it stand still in the well. In the well, the working electrode moves around the specimen and scans to detect a change in the current around the specimen, and the specimen is analyzed and evaluated based on the detection result.
[0023]
The invention of claim 5 uses the electrochemical analyzer according to any one of claims 1 to 3 and is a multi-well in which a plurality of wells are formed as a specimen cell in which a biological sample which is a specimen to be analyzed is placed. using a sample cell, the measurement solution is respectively stationary biological sample to within each well put a sample from a multi-analyte cell above which is filled, the working electrode a step of scanning by moving the sample around in the wells each It is characterized in that it is automatically performed for each well in order to detect current changes around each specimen, and each specimen is automatically analyzed and evaluated based on each detection result.
[0024]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
The present embodiment has developed a specimen cell (hereinafter referred to as a multiple specimen cell) capable of holding specimens such as a plurality of biological samples, and an electrochemical analyzer using the multiple specimen cell, While maintaining each specimen without damaging it, analyzing the amount of metabolic activity, the form, etc., and analyzing each specimen continuously with a simple method and high accuracy were studied.
[0025]
Hereinafter, a multi-sample cell and an electrochemical analyzer according to embodiments of the present invention will be described in detail with reference to the drawings.
[0026]
1A (schematic diagram), B (sectional view), and C (enlarged view of a well) show schematic explanatory diagrams of a multi-sample cell according to an embodiment of the present invention. 1A to 1C, a multi-specimen cell 11 is formed by injection-molding a material such as acrylic or polystyrene that can be seen through (for example, a specimen placed in a well to be described later can be seen through from the other end face side). A plurality of wells (inverted conical holes) 11a for arranging the specimen on the end surface side are formed at a predetermined distance, and a wall portion 11b surrounding each well 11a is erected around each well 11a. Thus, a liquid tank is formed on the substrate so that the inside of the wall 11b including each well 11a is filled with the sample solution.
[0027]
In the present embodiment, six inverted conical wells 11a having an opening radius of 2 mm and a depth of 2 mm are formed on an acrylic substrate having a length of 60 mm, a width of 30 mm, and a thickness of 3 mm at intervals of 2 mm, and are formed on the upper edge of the substrate. A wall portion 11b made of acrylic and having a thickness of 5 mm and a height of 5 mm is erected so as to surround each well 11a, and a liquid tank having a length of 50 mm, a width of 20 mm, and a depth of 5 mm is formed in the wall portion 11b. ing. As shown in FIG. 1C, a microplanar portion 11c may be formed on the bottom of the well 11a as needed. In this embodiment, a microplanar portion 11c having a diameter of 0.05 mm is formed. ing.
[0028]
When a specimen such as a cell or an embryo is placed as a biological specimen as a specimen in the multi-sample cell 11 configured as described above, the specimen is simply dropped from above with a simple injector or the like with the well 11a as a mark. Since the sample can be easily placed in an appropriate position, that is, in the well 11a, there is no possibility of damaging the sample.
[0029]
At this time, even if there is a slight deviation within the opening range of the well 11a, the specimen is guided by the inclination of the well 11a and quickly settles on the top of the well 11a, so that it is strictly (for example, a manipulator, There is no need to adjust the position (using a microinjector, actual microscope, etc.).
[0030]
In the state in which the sample is stored in the well 11a, the sample does not move from a predetermined position even if some vibration is applied to the multi-sample cell 11.
[0031]
In the present embodiment, since the minute flat surface portion 11c is formed at the bottom of the well 11a, the lower surface side of the sample is supported by the minute flat surface portion 11c, so that the sample can be supported more stably. Although it is possible, the minute planar portion 11c may be formed as necessary.
[0032]
The multi-specimen cell 11 is preferably formed by injection molding or the like so as to have a smooth surface, but may be formed by other known methods, and in forming by injection molding, the wall portion 11a. And may be formed integrally.
[0033]
Further, the shape, size, number, and the like of each well 11a are not limited to the above-described dimensions, and may be arbitrarily formed according to the shape, size, number, etc. of the specimen. It is preferable to have a substantially inverted pyramid shape so that the sample quickly fits into the well 11a when the sample is put into the well 11a. For example, the shape is not limited to the aforementioned substantially inverted cone shape. It may be a quadrangular pyramid shape or the like. At this time, if the inner peripheral surface of the well 11a is formed so as to be 45 ° with respect to the vertical direction as shown in FIG. 1C, that is, the cross section in FIG. And the opening radius can be secured in a well-balanced manner, which is preferable in terms of versatility with respect to specimens of various shapes and sizes. However, depending on the application, for example, a range of 30 ° to 60 ° with respect to the vertical direction. You can select any slope.
[0034]
All the above explanations have described multi-sample cells for a large number of samples, but it is of course possible to use a sample cell having only one well 11a for a single sample.
[0035]
The specimen well can be produced in the same shape without variation by manufacturing by injection molding as described above, which is suitable for mass production.
[0036]
Next, the electrochemical analyzer according to the present embodiment will be described. The electrochemical analysis apparatus according to the present embodiment is the same as the conventional electrochemical microscope measurement apparatus shown in FIG. 6 except that the above-described sample cell (in particular, a large number of wells 11 in this embodiment) is used instead of the dish cell 62b. Since the multi-sample cell 11) is used, the description of the electrochemical microscope measurement apparatus is omitted.
[0037]
FIG. 2 is a schematic explanatory diagram for explaining sample analysis and the like performed using the multi-sample cell 11 installed in place of the dish-type cell 62b of FIG. In addition, the same code | symbol is used for the thing similar to what is shown in FIG. 1, and the detailed description is abbreviate | omitted.
[0038]
The wall portion 11b of the multi-sample cell 11 is filled with a measurement solution (for example, serum-free culture solution) 21, and the sample 22 is loaded into each well 11a, and culture is performed as necessary. Reference numeral 23 denotes a working electrode (reference numeral 61a in FIG. 6), which is movably disposed in the measurement solution 21 including each well 11 by an electrode positioning device (reference numeral 64a in FIG. 6). Reference numeral 24 denotes a reference electrode / counter electrode (61b in FIG. 6) arranged at an arbitrary position in the measurement solution 21 at a predetermined distance from each well 11a. The specimen 22 and the pair of working electrode 23 and reference / counter electrode 24 are electrically connected via the measurement solution 21.
[0039]
Then, as shown in FIG. 2, the working electrode 23 is moved above the sample 22 in each well 11 (above a predetermined distance from the sample 22), and the working electrode 23 is scanned in the well 11a. Each change in current is detected and analyzed. This analysis step is sequentially performed on each specimen 22 in each well 11a.
[0040]
At this time, in the present embodiment, by using the multi-sample cell 11 having the well 11a instead of the dish type cell, the sample 22 can be easily placed in a predetermined position as described above without using a sample holding device or the like. Since the specimen 22 is held at the top position (predetermined position) of the well 11 where the position can be confirmed in advance, various operations such as position control and scanning of the working electrode 23 are performed on the top of the well 11. Since it is only necessary to set the position as a target, anyone can easily perform analysis in a short time without being influenced by the user's skill level.
[0041]
For the working electrode 23 and the reference / counter electrode 24, for example, those for measuring a minute current are preferably used according to the size of the specimen or the electrochemical device.
[0042]
Next, when a protoplast of algae and a bovine embryo are prepared as specimens by the method described below and the dish type cell 62b is used as an electrochemical analyzer (conventional electrochemical microscope measuring apparatus), a multi-specimen cell is used. 11 was used (electrochemical analyzer according to the present embodiment), and oxygen concentration difference (μM level) or the like serving as an index of oxygen consumption of each specimen was detected and compared. .
[0043]
In this example, a platinum disk electrode having an electrode radius of 1 μm was used as the working electrode 61a, and an Ag / AgCl electrode was used as the reference electrode / counter electrode 61b.
[0044]
(Protoplast creation)
The creation of a protoplast used as a specimen will be described. First artificial seawater (ingredients per _{liter; NaCl ... 23.90g, NaHCO 3 ...} 0.195g, CaCl 2 ... 1.234g, MgCl 2 ... 4.989g) petri dishes filled (eg, Kimwipe (registered trademark) A petri dish placed on top is prepared, and the tip of the honey is cut and collected in seawater and transferred to the petri dish. Next, while holding the tip of the honey under the tweezers in the petri dish, the protoplast in the honey is squeezed out with the other tweezers. Then, light was irradiated for about 30 minutes while observing the inside of the petri dish with an inverted microscope, and a spherical shape (spherical shape having a radius of about 150 μm) was used as a specimen (hereinafter referred to as a plast specimen).
[0045]
(Creation of bovine embryo)
Next, bovine embryos used as specimens were immersed in a serum-free culture solution (IVD101; manufactured by Functional Peptide Institute) in vitro fertilized, and a low oxygen atmosphere (O ₂ ... 5%, CO ₂ ... 5% , N ₂ ... 90%, humidity 100%, temperature 38.5 ° C.) and used as a specimen (hereinafter referred to as a bovine specimen).
[0046]
(Analysis using conventional non-invasive test equipment)
First, the specimen (plast specimen or bovine specimen) is transferred to the dish type cell 62b together with the measurement solution (artificial seawater or serum-free culture solution) and placed at a predetermined position (position of the dish type cell in FIG. 6) of the electrochemical microscope. . The specimen is fixed by the sample holding device 65, the potential of the working electrode 61a with respect to the reference electrode / counter electrode 61b is set to −0.6 V, and the specimen surface and a region (10 μm) separated from the specimen surface by a predetermined distance. ˜170 μm), the working electrode 61a is scanned at a scanning speed of 14.7 μm / second to detect a change in current, whereby an oxygen concentration difference ΔC (dish cell) between the sample surface and a region separated from the sample surface by a predetermined distance is detected. When used, ΔC _S ) was obtained.
[0047]
By obtaining the oxygen concentration difference ΔC as described above, the oxygen consumption rate F can be calculated by the following calculation formula. In the following formula (1), D represents an oxygen diffusion coefficient (2.1 × 10 ⁵ cm ² / mol), and r _S represents a radius of a specimen (a specimen including a transparent body).
[0048]
F = 4π · D · r _S · ΔC (1)
As can be seen from the equation (1), it can be seen that ΔC is a quantification of the oxygen consumption rate F, that is, an index of oxygen consumption.
[0049]
(Analysis by the electrochemical analyzer according to the present embodiment)
Next, the specimen (plast specimen or bovine specimen) is placed in the well 11a (any one of the plurality of wells) of the multi-sample cell 11 by the above-described method, and the same as in the case where the dish 62b is used. By scanning the working electrode 61a (the working electrode 23 in FIG. 2) and detecting a change in current by the above method, an oxygen concentration difference ΔC (using a multi-sample cell) between the sample surface and a region separated from the sample surface by a predetermined distance is detected. In this case, ΔC _P is obtained).
[0050]
As described above, the results of the difference in oxygen concentration obtained using the dish and the multi-sample cell are shown as the correlation characteristics between the oxygen concentration differences ΔC _S and ΔC _P in FIG. 3 (plast sample) and FIG. 4 (bovine sample). Shown in the figure.
[0051]
From the results shown in FIGS. 3 and 4, it can be seen that the following relational expression holds regardless of the type and size of the specimen.
ΔC _P = 2 ・ ΔC _S (2)
That is, by using a multi-sample cell as in the present embodiment, the oxygen concentration difference of the sample can be amplified by about twice as compared with the case where a conventional dish type cell and sample holding device are used, For example, it was found that changes in oxygen concentration around the specimen derived from cell respiration can be efficiently captured.
[0052]
Note that the sample cell (or multi-sample cell) of the present embodiment is formed of a transparent material such as acrylic and polystyrene, so that an inverted microscope (FIG. 6) is used as in the conventional non-invasive test apparatus. The specimen morphology can be observed from below by 69a).
[0053]
In the electrochemical analyzer according to the present embodiment, the specimen size is measured by microscopic observation and morphological evaluation is performed, the oxygen consumption of the specimen is measured, and the specimen size recorded in advance is measured. Similar to the conventional non-invasive test apparatus, the quality of the specimen can be judged by referring to the judgment criteria set based on the relationship between the oxygen consumption and the subsequent growth process of the specimen.
[0054]
In addition, when using a multi-sample cell in the electrochemical analyzer of the present embodiment, each sample is held at a predetermined position (the top position of the well) where the position can be confirmed in advance, such as position control of the working electrode, scanning, etc. Since various operations can be performed at a predetermined position, a computer (for example, a computer 64d in FIG. 6) is programmed to automatically perform operations for analysis such as scanning at each sample position. Thus, it is possible to automate the sequential automatic analysis of a plurality of samples held in the multi-sample cell.
[0055]
Although the present invention has been described in detail only for the specific examples described above, it is obvious to those skilled in the art that various changes and modifications are possible within the scope of the technical idea of the present invention. Such variations and modifications are naturally within the scope of the claims.
[0056]
【The invention's effect】
As described above, according to the sample cell of the present invention, there is no possibility of damaging the sample, and the sample is appropriately collected by using a simple injector or the like without using a special sample holding device such as a manipulator or a microinjector. It can be easily stored and held in position (in the well).
[0057]
In the state where the sample is stored in the well, the sample does not move from the predetermined position even if some vibration is applied to the sample cell.
[0058]
Furthermore, by forming a microplanar part at the bottom of the well, the lower surface side of the specimen is supported by the microplanar part, and the specimen can be supported more stably.
[0059]
Since the specimen cell is formed of a material that can be seen through, the specimen morphology can be observed with an inverted microscope or the like.
[0060]
In addition, according to the electrochemical analyzer of the present invention, since a multi-sample cell is used as the cell, the sample can be easily held at a predetermined position as described above without using a sample holding device or the like. Since the device can be miniaturized and the specimen is held at the top position (predetermined position) where the position can be confirmed in advance, various operations such as position control of the working electrode, scanning, etc. Since it suffices to achieve the target, anyone can easily perform analysis, evaluation, etc. in a short time without being influenced by the user's training level.
[0061]
Compared with the conventional method, the detection current can be amplified and measured approximately twice, so that changes in oxygen concentration around the specimen resulting from the breathing of the specimen can be captured efficiently, and oxygen consumption in specimens such as bovine embryos When evaluating and judging normality and the like based on the above, information with higher accuracy can be obtained.
[0062]
Further, when a multi-sample cell is used, a plurality of biological samples can be simultaneously held, and the held samples are sequentially analyzed and evaluated in a short time without having to hold the samples each time. It is possible.
[0063]
Furthermore, when using a multi-sample cell, each sample is held at a fixed position (the top position of the well) where the position can be confirmed in advance, and various operations such as position control and scanning of the working electrode are targeted. Since it is possible to perform the analysis for scanning, etc. at each sample position, it is possible to automatically analyze the multiple samples held in the multiple sample cells by programming the computer. Can be automated.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a schematic explanatory diagram of a sample cell in the present embodiment.
FIG. 2 is a schematic explanatory diagram of the present embodiment. FIG. 3 is a correlation characteristic diagram between oxygen concentration differences ΔC _S and ΔC _P in a plast specimen.
FIG. 4 is a correlation characteristic diagram between oxygen concentration differences ΔC _S and ΔC _P in bovine specimens.
FIG. 5 is a schematic explanatory diagram of a multi-type analyzer.
FIG. 6 is a schematic explanatory diagram of a conventional electrochemical analyzer.
[Explanation of symbols]
DESCRIPTION OF SYMBOLS 11 ... Multi-analyte cell 11a ... Well 11b ... Wall part 11c ... Micro plane part 21 ... Measurement solution 22 ... Sample 23 ... Working electrode 24 ... Reference electrode / counter electrode

Claims

電気化学顕微鏡計測装置と、電気化学顕微鏡計測装置により分析する検体である生体試料を配置する検体セルを用いた装置であって、
前記検体セルは、平板状部材の一面側に検体である生体試料を配置するための逆錐形状のウェルを１個または複数個形成するとともに、前記平板上に前記ウェルの周囲を囲む壁部を立設して液槽を形成したものであり、
前記ウェルは、ウェル内周面の傾斜が垂直方向に対して３０°〜６０°となるよう形成したしたものであり、
前記検体セルの液槽内に計測溶液を充填した状態で、前記電気化学顕微鏡計測装置の作用電極を計測溶液内で移動自在且つウェル内に侵入可能に構成すると共に、前記計測溶液内でウェルから所定距離を隔てた位置に参照電極／対極を配置して構成したことを特徴とする電気化学的分析装置。 An apparatus using a specimen cell for placing an electrochemical microscope measurement device and a biological sample which is a specimen to be analyzed by the electrochemical microscope measurement device ,
The specimen cell is formed with one or a plurality of inverted-conical wells for arranging a biological sample as a specimen on one surface side of a flat plate member, and a wall portion surrounding the well on the flat plate. A liquid tank is formed by standing,
The well is formed so that the inclination of the inner peripheral surface of the well is 30 ° to 60 ° with respect to the vertical direction.
While filling the measuring solution in the liquid tank of the sample cell, the entering can configure the working electrode of the electrochemical microscope measuring device movable and the wells in the measurement solution, from the measured solution in a well An electrochemical analyzer characterized in that a reference electrode / counter electrode is arranged at a position separated by a predetermined distance.

前記ウェルが、底部に微小平面部を有することを特徴とする請求項１記載の電気化学的分析装置。The electrochemical analysis apparatus according to claim 1 , wherein the well has a micro-planar portion at the bottom.

請求項１または２記載の検体セルは、透明な材料により形成されていることを特徴とする電気化学的分析装置。 3. The electrochemical analyzer according to claim 1, wherein the specimen cell is made of a transparent material.

請求項１〜３の何れかに記載の電気化学的分析装置を用い、計測溶液が充填された検体セル上方から検体である生体試料を投入してウェル内に静止させ、ウェル内において作用電極が検体周囲を移動して走査することにより、前記検体周囲の電流変化を検出し、この検出結果に基づいて検体を分析，評価することを特徴とする電気化学的分析方法。Using the electrochemical analyzer according to any one of claims 1 to 3 , a biological sample, which is a specimen, is introduced from above the specimen cell filled with the measurement solution and is allowed to stand still in the well. An electrochemical analysis method characterized by detecting a change in current around the specimen by moving around the specimen and scanning, and analyzing and evaluating the specimen based on the detection result.

請求項１〜３の何れかに記載の電気化学的分析装置を用いると共に、分析する検体が配置される検体セルとして複数個のウェルが形成された多検体セルを用い、計測溶液が充填された多検体セル上方から検体である生体試料を投入して各ウェル内に各々静止させ、作用電極がウェル内において検体周囲を移動して走査する工程を各ウェル毎に順次自動的に行って各検体周囲の電流変化を各々検出し、各検出結果に基づいて各検体を各々自動的に分析，評価することを特徴とする電気化学的分析方法。While using the electrochemical analyzer according to any one of claims 1 to 3, a multi-sample cell in which a plurality of wells are formed is used as a sample cell in which a sample to be analyzed is arranged, and the measurement solution is filled by introducing the biological sample is a sample from a multi-analyte cell upward to respective stationary in each well, each performed step of the working electrode is scanned by moving the sample around in the wells sequentially automatically for each well sample An electrochemical analysis method characterized in that each change in ambient current is detected and each specimen is automatically analyzed and evaluated based on each detection result.