JP4095248B2 - 顕微鏡スライド - Google Patents
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Description
【技術分野】
本発明は、顕微鏡スライドに関する。より具体的には、本発明は、生物学的流体及び組織を超生体染色する設計とされた改良に係る顕微鏡スライドに関する。
【0002】
【背景技術】
細胞の異常形態及び微生物の感染に関して生物学的試料を分析するために、現在、使用されている方法は、共に、時間がかかり且つ経済的でない。例えば、針生検体及び吸引物のような患者から採取した組織試料は、典型的に、化学的に固定し且つ染色し、また、多くの場合、断片化し、次に、検査する前に、顕微鏡スライド上にて作製しなければならない。更に、多くの環境下にて、上述の処理ステップの前に、最初に生物学的試料を培養しなければならない。別の問題点は、作製過程中、通常、形成される試料自体が固定及び分画化によって実質的に変化することに関するものである。
【0003】
別の問題点は、同様に、時間及び労力等を浪費する不必要な手順に関する。例えば、典型的な尿の分析において、試料は患者から得て且つ「ディップスティック」検査法を行う。次に、尿を遠心分離させた後、沈殿物を光顕微鏡による検査を行う。これらの検査に何らかの異常な結果があるならば、その試料は、結果を得るには、典型的に、24乃至48時間、又はそれ以上の時間を必要とする。微生物の培養及び抗生物質の感受性検査のため試験所に運ぶ。しかしながら、多くの場合、培養及び感受性試験に供される尿試料の80%もの多くが、臨床的に有意義な細菌の存在を検出されず、このため、貴重な技師の時間及び試験所の材料等が浪費されることになる。更に、地方又は第三世界の国において、試料は、典型的に、評価のため遠方の地に運ばなければならず、このことは、追加的な輸送及び取り扱いのコストに加えて、追加的な時間的遅れに起因して問題点を拡大する可能性がある。現在、生物学的試料(例えば、尿)の更なる検査が必要であるかどうかを確認するための迅速な(例えば、5分以内)現場での検査方法は存在しない。
【0004】
本発明は、感染又は細胞の異常形態の存在を現場にて決定するための検査器具として使用される顕微鏡スライドを改変することにより、臨床的医療の実施に使用されている標準的な微生物学的及び形態学的試験の新発展を図るものである。本発明のスライドは、従来のスライドの作製に関係する時間を解消するものであり、また、細菌及びその他の微生物を検出するために使用されるグラム(Gram)組織化学染色材、菌及びイースト菌の検査に使用される水酸化ナトリウム(KOH)調整法、及びマイコプラズマ、他のモリキューテス(mollicutes)、レジオネラ(legionella)等のような、直径すなわち大きさが1マイクロメートル(μM)以下のスピロヘータ及びその他の微生物の検出に使用される暗視野検査法のような、現在利用されている顕微鏡検査方法のより簡単で且つより経済的な代替法を更に提供するものである。
【0005】
【発明の開示】
本発明の1つの目的は、生物学的流体又は組織の試料中の細胞を超生体染色し得るようにされた自己染色式の顕微鏡スライドを提供することである。
【0006】
本発明の別の目的は、生物学的流体又は組織の試料を直ちに現場にて検査することを可能にする自己染色式の顕微鏡スライドを提供することである。
本発明の更に別の目的は、エピ蛍光顕微鏡(epi−fluorescent microscope)で見たとき、染色した試料の視覚可能性を著しく向上 させることを可能にする自己染色式の顕微鏡スライドを提供することである。
【0007】
本発明の別の目的は、固定及び試料の分画化に起因する人為的構造(artifact)の問題点を解決する、自己染色式の顕微鏡スライドを提供することである。
【0008】
本発明の別の目的は、顕微鏡の焦点決めを容易にするための基準を含む自己染色式の顕微鏡スライドを提供することである。
本発明の更に別の目的は、スライドの観察部分を試料に対して配置し、移し替え装置又は破損し易いガラス構成要素を必要とせずに、試料を直接、得ることができるように、スライドを折り重ねることを可能にする可撓性の顕微鏡スライドを提供することである。
【0009】
好ましくは、エピ蛍光顕微鏡により、生物学的流体及び組織の試料中の細胞を直ちに染色し且つ観察し得るような設計とされた自己染色式の顕微鏡スライドを使用することにより、本発明の上記及びその他の目的が実現される。作製した顕微鏡スライドは、透明なテープ又は膜を上に重ねた超生体の蛍光染色材を有することが好ましい。使用中、共に相互に混合するように、試料をその上に付与することができるよう膜を剥ぎ取って、染色材を露出させる。次に、その膜は、染色した試料の上に再配置し、直ちに観察するためのカバースリップとして機能するようにする。生存する細胞及び微生物は、顕著に観察可能とされ、また、細胞の異常形態を容易に観察することができる。固定し且つ断片化した試料を作製することに伴う時間及びコストを完全に解消すると共に、固定作製法にて見られる人為的構造及び試料の分画化の問題が解消される。該スライドは、顕微鏡の焦点決めを容易にし且つ細胞及び微生物の測定を可能にするため基準となる標準を含むことができる。1つの代替的な実施の形態は、移し替え装置を必要とせずに、直接試料を得ることができ、このため、生物学的危険を軽減する、スライドの観察部分を試料に対して配置することができるように折り重ね可能である、可撓性の顕微鏡スライドを提供するものである。この新規なスライドは、感染媒体(例えば、マイコプラズマ大のモリキューテス、スピロヘータ、菌、寄生虫等)の存在に関して、任意の生物学的流体又は組織の試料(例えば、尿、血液、痰、脊髄液、羊水、汗、針吸引物、***、組織の接触作製物、植物の樹液等)をほんの数分間にて治療地点の現場で検査することを可能にする。
【0010】
本発明の上記及びその他の目的並びに有利な点は、本発明の好適な実施の形態に関する以下の詳細な説明から明らかになるであろう。
本発明の特徴を具体化する顕微鏡スライドについて、本明細書の一部を構成する添付図面に関して説明する。
【0011】
【本発明を実施するための形態】
添付図面を参照することにより、本発明がより完全に理解されよう。本発明は、生物学的流体又は組織の試料内の細胞及び微生物を超生体染色する設計とされ且つ染色した細胞を直ちに視覚的に又は器具により検査し得るようにされた自己染色式の顕微鏡スライドである。英語のアメリカンヘリテージ辞書(The American Heritage Dictionary)(1992年、第3版)は、「超生体(supravital)」を生存中又は死んだ直後の器官から除去した後に、生きた細胞を染色すること、又は染色することができることに関する語として定義している。このため、本発明は、複数の状態について予備的に診断し得るように直ちに観察することができる生物学的試料から固定されていない細胞を直ちに、現場にて染色することを可能にする。超生体染色は、作製したスライド内に含まれるため、試料の乾燥、化学的固定及び/又は断片化に要する時間及びコストを完全に解消することができる。
【0012】
図1及び図2に図示した本発明の好適な実施の形態は、観察領域12と、生物学的試料14を染色するため観察領域12に付与された染色剤13と、弱い接着剤(図示せず)によってスライド11に取り付けられた可撓性の透明なテープ又は膜16とを有する顕微鏡スライド11を備えている。膜16は、観察領域12を露出させるため後方に剥ぐことができ、染色剤13と相互に混合し得るように生物学的試料14を配置し、また、元の位置に配置して、染色した試料を顕微鏡にて観察することができる。これと代替的に、染色剤13は、スライド11の観察領域12と反対側の位置にて膜16に付与してもよい。例えば、染色剤は、膜の上の接着剤と混合させることができる。
【0013】
顕微鏡スライドは、硬くし又は可撓性の何れかであるようにすることができる。硬いスライドは、当該技術分野にて周知であり、典型的に、ガラス又は硬化プラスチックで出来ているが、可撓性のスライドは、当該技術分野にて従来、公知ではなかった。可撓性のスライドは、スライド11を折り重ね又は曲げることを可能にし、このため、図5に図示するように、試料を得ることができるように、観察領域12を試料に、又は疑わしい組織の病変部分21(例えば、梅毒性下疳)に直接、接触するように提供される。このことは、綿棒のような移し替え手段を不要とし、移し替え装置の屑の処分の増加に伴う危険性及びその処分の必要性を軽減することになる。可撓性のスライドは、例えば、ガラススライド及びカバースリップが試料を採取する人間への危険性を増す、***渉感染病の臨床装置のような、暗視野顕微鏡によって現在検査している試料を採取するのに最適である。また、可撓性のスライドは、硬いスライド又はカバースリップにより容易に到達できない困難な解剖学的箇所にアクセスし得るという有利な点もある。可撓性のスライドは、ポリカーボネート、セルロースアセテート、ポリ塩化ビニル、又はその他のポリマー及びポリマー凝縮製品のような透明なプラスチック材料から成ることが好ましい。
【0014】
好適な実施の形態は、軽量であり且つガラス製スライドのように破損し易くないためプラスチック製スライドを利用する。プラスチック製スライドは、処分のため容易に滅菌処理することができる(例えば、オートクレーブ又は電子レンジにより)。更に、これらのスライドは、生物学的屑を少なくし得るようにリサイクルすることができる。プラスチック製スライドの軽量な特徴は、輸送及び格納を容易にする。1つの表面側は、当該技術分野にて周知の特徴である、「つや消し」の外観(図示せず)を実現し得るように、へこみを付け、又は粗面とすることが好ましい。このことは、スライド表面上でのその分散及び表面への接着を促進することにより且つ保管目的のため、スライドに容易に標識することを許容することにより、超生体染色材の付与に役立つことを含む、幾つかの有利な点を有する。
【0015】
超生体染色剤は、適正に緩衝させた濃縮物中におけるアクリジンオレンジ、アクリジンイエロー等のような水溶性の蛍光色素であることが好ましい。蛍光で染色した試料を見るため、蛍光又はエピ蛍光顕微鏡が必要とされ、つや消しスライドが使用されるならば、このエピ蛍光顕微鏡が使用され、それは、つや消しスライドは、全体に亙って蛍光を分散させるからである。試料を蛍光色素にて染色し且つ観察のためエピ蛍光顕微鏡を利用することにより、相コントラスト又は同様の光顕微鏡にて観察する場合と比較して、試料中の構造体の視覚化は著しく向上する。このことは、昼間に月を見る場合と夜に月を見る場合とを比較することに類似している。活性な染色剤は細胞を死滅させることなく、生物の細胞又は微生物内に拡散し、細胞中に存在するDNA、グリコサミノグリカン、リポ多糖類等のような巨大分子と錯体化する。この染色剤−巨大分子の錯体は、蛍光性とされ、水銀灯、ハロゲン灯、タングステン灯からの適当な光周波数にて励起させた後に観察することができる。
【0016】
膜16は、スコッチ(Scotch)(登録商標名)テープ(スリーエムカンパニー(3M Company))のような片側に接着剤を有する可撓性の透明な材料から成っており、スライド11のつや消し表面の上に配置され、接着面がスライドのつや消し表面と接触するようにする。1つの代替的な実施の形態において、染色剤に重なり合う接着剤が存在しないように、膜の縁部に沿ってのみ接着剤を付与することができる。膜16は、少なくとも一端にて接着剤が存在しない部分17を有し、該部分17が膜16を取り扱う把持部として機能するようにすることが好ましい。膜16は、スライド11のつや消し表面にのみ付与するか、又は膜16の少なくとも一端がスライド11の側部又は下面(図示せず)に重なり合うように付与することができる。
【0017】
有利であるその他の特徴は、公知の寸法(例えば、1μM)の蛍光微小球のような寸法基準をスライド又は膜の表面に取り付け、それら微小球が試料の焦点界と一致するようにすることである。例えば、微小球を膜の上の接着剤に付与し、又は微小球は、その後に乾燥した染色剤と共に、スライドに対して保持されるように、染色剤をスライドに付与する前に、染色剤内に配置することができる。培養基23の表面に付与された微小球24が図4に図示されている。このことは、顕微鏡の焦点決めを容易にし且つ寸法に関する内部の基準標準を提供し、この標準は、顕微鏡写真撮影又はビデオ像の捕獲のために保存される。サイズ分けし且つ細胞、微生物等の定量化を可能にし得るようにスライド又は膜の表面にエッチング処理し又は写真で複製することにより、サイズ分けグリッド19等のような他の基準標準を含めることもできる。
【0018】
好適な実施の形態の自己染色式スライドを作製するため、所定の寸法のプラスチック製顕微鏡スライド11を選択する。好ましくは、アクリジンオレンジのような緩衝した蛍光色素のような染色剤13をスライド11の「つや消し」表面の所定の観察領域12の上に付与し且つ乾燥させる。つや消し表面は、平滑な面よりも表面積が大きく、このため、染色剤がその上で乾燥するためのより広い面積を提供する。従って、再水和化のため、より多量の染色剤が利用可能となる。上述したように、染色剤は、代替的に、膜の上の接着剤に含ませてもよい。透明な膜16をスライド11のつや消し面の上に配置する。スライドの使用の準備が整ったとき、透明な膜16を後方に剥いで、その上に染色剤13を有する観察領域12を露出させ、生物学的流体又は組織の接触作製(tissue touch preparation)の試料14(典型的に、25乃至50μl)を染色剤13を含む領域内にてスライドに付与し、接着剤膜16をその密封した状態に復帰させ、カバースリップとして機能するようにする。組織接触作製の場合、針生検からの細長片(スライバー)のような組織の試料を典型的に、スライド上に配置し且つ軽く圧縮して、細胞及び多分微生物を含む組織の流体をスライドの表面に押し出す。また、活性な染色剤の再水和化を促進するため、緩衝溶液を使用することもできる。顕微鏡の浸漬油を観察領域12の外側にて膜16の上に配置し、典型的に、40x又は100xの油浸漬対物レンズを使用するエピ蛍光顕微鏡を使用して試料を観察する。
【0019】
採取した生物学的流体の試料(例えば、血液、尿、痰、気管支又は胃の洗浄物、脊髄液、滑液、頚管の塗沫標本、***、前立腺の浸出液、涙、針生検試料、羊膜液、植物の樹液等)は乾燥せず又は化学的に固定されないため、無疵の細胞及び/又は微生物の形態学及び易動性が維持される。生きた細胞の核形態学は、直ちに視覚的(又は像)分析のために保存され、悪性の異常形態が存在し又は存在するかどうかの決定を容易にする。同様に、細胞中に異常な巨大分子の「貯蔵所」(例えば、羊膜液、白血球、培養した線維芽細胞)が存在するかどうかを容易に観察することができる。DNAを含む全ての細胞は蛍光色素により非特定的に染色されるが、存在する全ての微生物の大きさ、形状及び動作パターンは、その微生物の準備的な同定に役立つ。更に、ウィルス封入体の存在の有無を観察することができ、このことは、口腔内及び鼻の塗抹標本を検査するときにある程度、重要である。
【0020】
別の有利な特徴は、図3乃至図4に図示するように、その内部に培養基23(例えば、菌に対するサブロの寒天)を有するウェル22を内蔵することにより培養及び/又は移し替えのためスライドを改変し得ることである。任意の寸法又は形状のウェルを形成することができる。更に、培養基内に染色剤を内蔵させることもできる。スライドは、スクリーニングのために使用し、次に、培養及び/又は最終的な同定のため中央試験所に送ることもできる。
【0021】
今日、自動車のバッテリーによってさえも駆動することのできる持ち運び可能な蛍光顕微鏡が利用可能になるに伴い、スライドを使用し得る可能性を開発途上国、地方の診療所、移動車両等にて現場で使用し得るように容易に応用可能である。視覚的な検査の結果、細菌の存在又は菌の感染又は寄生虫侵襲が確認されたならば、現場の検査に使用したものと同一の特別に作製したスライドを試料の輸送に使用することができる。補助の又は基準の試験所に輸送し得ることは、組織化学の研究又はDNA分析(例えば、PCR、ELISA、単クローン抗体の研究)を介して更なる培養を行い且つ最終的な同定を行うことを可能にする。スライドは微生物を無傷の状態に保ち、最適な成長に適した適正な培養基がスライド内に内蔵されるならば、培養のため第二の試料を採取する必要性は解消され、また、基準の試験所における二次的な培養の必要性を回避することもできる。更に、顕微鏡写真又はデジタル画像技術は、エピ蛍光顕微鏡にて観察することのできる像を恒久的に捕獲することが可能である。これらデジタル像を評価のため遠方の中央試験所に伝送することもまた可能である。
【0022】
これらスライドを手術室で利用することにより、生検組織の接触作製又は針生検物の検査は、現在の急速凍結組させた織部分の研究に現在、必要とされる高価なマイクロトーム及び細胞技師を不要にすることが可能であろう。また、結果が出る迄の所要時間を著しく速めることも可能である。試験を現場で行うとき、試料の採取と試験所の結果の報告との間に遅れが生ずることはなく、このことは、試験が完了したならば、外科医が直ちに行動することを可能にする。このため、この方法は、外科医が試験所の試験を命令するための臨床的なプラクティス指針を著しく改善することになる。例えば、現在のスライドにおける遠心分離されず超生体的に染色した尿の試料は、エピ蛍光顕微鏡により直ちに観察し、治療の構造のより優れた観察を可能にし、尿管感染の診断の正確性を著しく向上させることになる。この原理及び方法は、科学的に正確であり且つ再現可能で、非専門的な試験所の職員に対してさえも容易に教え且つ容易に学ぶことができる。また、このスライドは、微生物の感染等についても植物の樹液のような植物試料を検査するために使用することもできる。
【0023】
本発明のスライドは、細菌及びその他の微生物の検出に使用されるグラム組織的染材色、菌及びイースト菌の検査に使用される水酸化カリウム(KOH)製法、スピロヘータの検出に使用される暗視野検査のような、現在利用されている顕微鏡検査方法に対するより簡単で且つより経済的な代替的方法を提供するものである。更に、これらスライドは、標準的な光透過式顕微鏡では観察することができない。マイコプラズマ種及びその他のモリキューテス(細胞壁を有しない既知の最小の細菌)の検出を可能にする。
【0024】
プラスチック製及び/又は膜ガラス−培養(vita−cult)検査用スライドの製造コストは、ガラス顕微鏡用スライド及びガラスカバースリップの製造コストよりも経済的でなければならない。破損して、臨床職員を感染させる危険性を減少させなければならない。必要とされる培養基の量は、現在、従来のペトリ皿培養プレート又は傾斜管培養装置で使用されているものよりも著しく少ない。スライドの重量は、ガラススライド又は培養プレートの重量よりも遥かに軽く、このため、輸送及び貯蔵を容易にする。重要なことは、これらと同時に、試験室の屑が少なくなることである。
【0025】
図示した本発明の形態は、その1つの好適な形態であり、特許請求の範囲に記載した本発明の精神又は範囲から逸脱せずに、色々な変更例及び改変例を為すことが可能であることを理解すべきである。
【図面の簡単な説明】
【図1】 本発明の分解斜視図である。
【図2】 試料をスライドに付与することができるように後方に剥いだカバー膜を示す本発明の斜視図である。
【図3】 本発明の1つの代替的な実施の形態の斜視図である。
【図4】 図3の実施の形態の断面図である。
【図5】 本発明の別の代替的な実施の形態の斜視図である。
Claims (13)
- 顕微鏡で観察すべく生物学的試料を染色する装置において、
a)観察領域(12)を有する顕微鏡スライド(11)と、
b)生物学的試料(14)を染色する染色剤(13)と、
c)接着剤により前記スライド(11)に取り付けられた可撓性の透明な膜(16)であって、前記染色剤(13)が前記スライド(11)と前記膜(16)との間にて前記観察領域(12)と接触しており、前記膜(16)が除去されて、前記観察領域(12)が露出され、生物学的試料(14)をその上に配置して生物学的試料(14)を顕微鏡にて観察し得るように前記膜(16)が再配置されるような、前記膜(16)と、
を備えることを特徴とする、装置。 - 請求項1による装置において、前記スライド(11)が、粗面化した面を有するプラスチック材料から成る、装置。
- 請求項1による装置において、前記染色剤(13)が、蛍光色素を含む、装置。
- 請求項3による装置において、前記蛍光色素がアクリジンオレンジを含む、装置。
- 請求項1による装置において、前記染色剤(13)が顕微鏡の焦点決めを支援し得るように基準マーカ(24)を含む、装置。
- 請求項1による装置において、試料(14)中の細胞又は微生物の大きさ及び量を測定する基準標準を更に備える、装置。
- 請求項6による装置において、前記基準標準が前記膜(16)に印刷されたグリッド(19)を備える、装置。
- 請求項6による装置において、前記基準標準が前記スライド(11)に印刷されたグリッド(19)を備える、装置。
- 請求項1による装置において、前記観察領域(12)が、前記スライド(11)に形成されたウェル(22)を備える、装置。
- 請求項9による装置において、前記ウェル(22)がその内部に培養基(23)を有する、装置。
- 請求項10による装置において、前記培養基(23)が該培養基と混合させた前記染色剤を有する、装置。
- 請求項1による装置において、前記スライド(11)が可撓性であり、前記スライド(11)を折り重ね、前記観察領域(12)を試料(21)に対して配置し、直接、試料が得られるようにした、装置。
- 観察のため超生体試料を直ちに提供する顕微鏡スライドにおいて、
a)顕微鏡の観察領域内に配置し得るように試料(14)を支持する手段(11)と、
b)前記支持手段(11)の第一の面及び該支持手段の上に支持された前記試料(14)を再密封可能に覆う可撓性の透明な手段(16)と、
c)前記試料(14)を蛍光色素で染色する手段(13)であって、前記支持手段(11)と前記可撓性の透明な手段(16)との間に介在され、前記試料(14)が前記支持手段(11)の上に配置されたとき、前記染色を生じさせるようにする染色手段(13)とを備えることを特徴とする、顕微鏡スライド。
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