JP4092110B2 - DNA fragment having promoter activity and method of using the same - Google Patents

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、植物において転写活性を有するDNA配列、すなわちプロモーターとして機能するポリヌクレオチドおよびその利用に関する。
【０００２】
本明細書においては、下記用語を以下のように定義する。
「ポリヌクレオチド」には、１本鎖ＤＮＡ、当該１本鎖ＤＮＡの相補鎖である１本鎖ＤＮＡ、両者が水素結合した２本鎖ＤＮＡ、及びこれらＤＮＡの転写産物であるＲＮＡも含まれる。
「１若しくは複数の塩基が欠失、置換若しくは付加されたDNA配列」とは、元のDNA配列のうち、１個の塩基が欠失、置換若しくは付加されたDNA配列および、複数の塩基、好ましくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加されているが、実質的に同等の機能を有するDNA配列をいう。すなわち、これら１または複数の塩基の欠失、置換、付加によってプロモーターの機能に実質的な変化のないもの、およびプロモーターの機能が減少するものも含む。例えば５'−上流から欠失変異を取った場合に、転写活性が変化しないか、または、転写活性が減少するプロモーターを含む意味である。なお、５'−上流から欠失変異を作成することは当業者に周知の技術である。シスエレメントとしての機能を有しないスペーサー領域の欠失、置換、付加は実質的にプロモーター活性を変化させない場合が多く、かかるスペーサー領域が欠失、置換または付加されたＤＮＡ配列も上記用語に含まれる。また、機能を有するシスエレメントを欠失させ、プロモーター活性を減少させるか、あるいは、組織特異性を減少させるものも含まれる。これらの条件を満たす限り、「複数の塩基」とは２塩基から数百塩基までを含むものとする。プロモーター活性を上昇させ、あるいは、組織特異性を変化させるような実質的に機能を変化させる欠失、置換、付加は含まれない。
【０００３】
「ストリンジェントな条件」とは、本明細書中では、95〜100％の相同性を有するDNAがハイブリダイズする条件をいう。例えば2XSSC, 65℃、16〜20時間もしくは0.5Mチャーチリン酸バッファー、1ｍM EDTA、7％ SDS、65℃、16〜20時間等の条件が用いられるが、これらに限られない。
「プロモーター」とは、遺伝子からRNAを転写する活性を有するDNAを言う。本発明においては、主として植物において転写活性を有するプロモーターを意味するが、これに限定されず、機能する限り動物、細菌、酵母、カビ等で使用される場合も含まれる。
「発現ベクター」とは、プロモーターの下流にクローニング用の制限酵素部位を挿入したプラスミドベクターをいう。Tiプラスミド由来のベクターも含まれる。制限酵素部位の下流にポリA付加信号を連結する場合が多い。
「植物細胞」とは、本発明にかかるプロモーターが転写活性を発揮する植物細胞を意味するが、常に転写活性を発揮する必要は無く、いずれかの組織に分化した場合にのみ転写活性を発揮する場合の植物細胞も含まれる。
「キク」とは、本発明にかかるプロモーターがその転写活性を発揮するキク植物細胞およびキク植物体を意味するが、全ての組織において転写活性を発揮するという意味ではなく、一部の組織で転写活性を発揮するキクも含まれる。
「形質転換によらないポリヌクレオチド」とは、その生物がもともと有しているゲノムのポリヌクレオチドを意味する。本発明のプロモーターをもともと有している生物に本発明のプロモーターを連結したキメラ遺伝子を導入した場合には、その導入したプロモーターは「形質転換によらないポリヌクレオチド」ではない。
【０００４】
【従来の技術】
近年の植物分子生物学の発展に伴い、遺伝子のセンスRNA、アンチセンスRNA、2本鎖RNAあるいはリボザイムRNAを植物細胞内で発現させ、病虫害抵抗性、除草剤耐性、ストレス耐性、有用物質生産、新規な花色、新規な形態等の有用形質を備えた植物新品種を分子育種することが可能となってきた。即ち、植物で発現可能なプロモーターの3'-側に目的の遺伝子断片をセンス方向もしくはアンチセンス方向にまたは2本鎖RNAを形成できるように連結し、あるいはリボザイムRNAを転写できるように連結してキメラ遺伝子を作成し、これらをベクターを用い、あるいは直接、植物細胞の染色体に導入することにより、その目的形質の遺伝子を発現または抑制するというものである。かかる手法を応用することにより、例えば、Bacillus thuringensis由来の殺虫性ＢＴ毒素遺伝子のセンスRNAを発現する虫害抵抗性植物（D.A.Fischhoff等、Bio/Technology、vol.232:738、1987）や、トマト果実の登熟に関するポリガラクツロナーゼ遺伝子のアンチセンスRNAを発現する日持ち良好なトマト（C.J.Smith等、Nature、vol.334:724、1988）等が作出されている。
【０００５】
このような形質転換植物に導入される遺伝子のプロモーターとしては、多くの場合、カリフラワーモザイクウィルス（CaMV）の35Ｓプロモーター（以下単に35Ｓプロモーターという）が用いられている。この35Ｓプロモーターは、多くの双子葉植物で遺伝子からRNAを強力に転写する働きを有し、多くの組織で強く発現することから形質転換植物において最も広く使われている。しかしながら、35Ｓプロモーターには以下のような問題がある。1) 単子葉植物においてはそれほど発現が強力でない。2) 単子葉、双子葉を問わず、多くの植物で後代を取ると、発現が見られなくなる個体が出現する。3) 35Ｓプロモーターには高頻度に組換えを引き起こす配列が含まれており（A. KohliらPlant J 1999 Mar;17(6):591-601）、プロモーター配列自体の染色体上における安定性に問題がある。したがって、これらの問題点を解決できるプロモーターが望まれていた。
【０００６】
キクについても、上記と同様の理由から、35Ｓプロモーターを用いて外来遺伝子の発現が試みられてきた。ところが、キクにおいては、35Sプロモーターを用いた場合、外来遺伝子を発現する個体は得られにくく、また発現が見られる個体が得られたとしてもその発現レベルは低く、しかも成長するにつれて発現が弱くなり、最終的には発現が見られなくなることが知られている（Y. TakatsuらPlant Biotechnology, 2000, 17 (3), 241-245）。すなわち、35Ｓプロモーターはキクにおいて外来遺伝子を発現させる場合の安定性に問題があり、キクにおいて効率良く安定発現できるプロモーターが望まれていた。また、35Ｓプロモーターはキクにおいて発現が見られる場合でも非常に弱い発現しか見られないことから、高発現できるプロモーターも望まれていた。
【０００７】
キクにおいて外来遺伝子の発現が不安定となる現象の原因については未だ解明されていないが、メチル化により35Ｓプロモーターが不活性化されることが原因の１つではないかと推測されている。すなわち、キクは多くの場合、６倍体等の高い倍数性を持つため染色体DNAの大部分がメチル化されており、35Ｓプロモーターもメチル化されることにより不活性化される可能性が考えられる。実際、35Sプロモーターによる遺伝子発現が抑制（サイレンシング）されたキク形質転換体に脱メチル化剤であるアザシチジンを添加すると、発現が回復する場合があることから、メチル化が関与している可能性が高い。なお、サイレンシングには、転写の抑制と転写後の抑制があるが、ここでは転写の抑制を意味する。メチル化によるサイレンシングはキクに限らず他の植物においても問題となっている。したがって、メチル化等によるサイレンシングを受けずに植物において安定発現可能なプロモーターも望まれていた。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、安定的に遺伝子を発現させることができるプロモーター、特に植物体、より好ましくはキクにおいて、いずれかの組織で安定的に遺伝子を発現させるプロモーター、およびその利用方法を提供することを目的とする。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
キクの内在性遺伝子は上述のようなサイレンシングを受けずに正常に発現することから、キクの内在性の遺伝子のプロモーターを利用して、キクにおける外来遺伝子を発現させることにより、メチル化等によるサイレンシングを回避して、安定的に高発現できる可能性がある。
【００１０】
そこで、以下のようにして、キク由来の強いプロモーターを検索し、クローン化した。リュウノウギクの葉からCTAB-Li法（島本功、佐々木卓治監修 新版植物のPCR実験プロトコール60-62頁、秀潤社1997）を用いて全RNAを抽出し、cDNAライブラリーを構築した。このcDNAライブラリーについて約100クローンのプラスミドを調製し、EST（expressed sequence tag）解析を行い、出現頻度の高い遺伝子（クロロフィルa/b結合蛋白質遺伝子、以下cabという）のEST配列および多数の組織で発現すると考えられる遺伝子（tublin）のESTを配列を見いだした。これらのEST配列に基づき、プライマーを合成し、TAIL-PCR法により、その上流域のプロモーターをクローン化した。既知配列との比較から、翻訳開始コドンを推定し、この翻訳開始コドンの１塩基上流からプロモーターを含む上流領域までの配列をクローン化するために、5'-上流側プライマーの5'-上流側に制限酵素Hind III切断部位、3'-下流側プライマーの5'-上流（プロモーターから見れば3'-下流側）にBam HI切断部位と開始コドンのアンチセンス（CAT）とを付加するようにデザインしたプライマーを用いて、プロモーター及び5'-非翻訳領域をPCRにより増幅した。得られたプロモーターと5'-非翻訳領域を含むPCR断片を制限酵素で切断し、イントロンの入ったβ−グルクロニダーゼ（GUS）遺伝子に連結し、キクに形質転換後8ヶ月目〜10ヶ月目にGUS活性測定を行った。その結果、リュウノウギクより単離したcabプロモーターが形質転換キク植物体の葉において長期間（少なくとも8ヶ月間）安定的に高発現できることを見出した。
【００１１】
tublin遺伝子のプロモーターについても同様にレポーター遺伝子であるGUS遺伝子に連結し、キクに形質転換して安定性、プロモーターの強度を検討した。その結果、tublinプロモーターについては、葉における安定発現は観察されなかったが、花弁において高頻度に発現が観察された。
一方、35Sプロモーターについては、葉における安定発現は認められなかったことから、キク由来のプロモーターである、cabプロモーターおよびtublinプロモーターについては、葉および花弁でそれぞれ組織特異的に安定発現することが証明された。tublinプロモーターについては、葉由来のESTを基にプライマーをデザインし、TAIL-PCR法によりクローン化したわけであるが、予想に反し、葉では安定発現できず、花弁でのみ安定発現が認められた。
【００１２】
このことは、ある植物の組織で発現している遺伝子のプロモーターをクローン化して、同じ植物種に形質転換したとしても、必ずしも予想される組織で安定に発現するとは限らないことを意味する。つまり、その植物自身のプロモーターを利用するという戦略は当業者が容易に考えつくものであるが、その効果は必ずしも予想通りにはならず、予測できない有利な効果を奏する場合もある。実際、この戦略によっては、葉で安定発現できるプロモーターが得られるものと予想されたが、かかる特性を有するcabプロモーターのみならず、葉では安定発現できないプロモーター（tublinプロモーター）も同様に得られた。そして、どのプロモーターがどの組織で安定発現できるかは当業者は必ずしも予測できない。何故なら、tublin遺伝子はノザン解析のコントロールとしても使われるもので、多くの組織で普遍的に発現すると考えられている。このように多くの組織で発現すると言うことは、組織特異的なサイレンシングを受けず、安定的に発現できる機構が備わっているものと考えられる。しかし、このtublinプロモーターを用いた場合には、キクの葉における安定発現は難しかった。また、cabプロモーターは高発現するプロモーターとして知られているが、かかる高発現プロモーターはある閾値を超える発現量を示した場合、サイレンシング（転写後のサイレンシング）を受けやすいと考えられているため、安定発現は通常期待し難いと考えられる。しかし、予想に反し、かかる高発現プロモーターが安定発現を示した。これらは発明者らの予想外のことであった。したがって、このことから、宿主植物自身のプロモーターを用いる場合でも組織によっては安定発現できる場合とできない場合があり、その判断は当業者の予測できる範囲を超えていると考えられる。以上より、本発明にかかるcabプロモーターおよびtublinプロモーターは当業者の予想できない有利な効果を奏するものである。
【００１３】
即ち、本発明の上記課題はこのcabプロモーターおよびtublinプロモーター、具体的には、配列番号１および配列番号２に示すDNA配列を有するポリヌクレオチドにより解決される。
【００１４】
本発明のプロモーターとしては、配列番号１または２で表されるDNA配列を有するポリヌクレオチドであれば制限なく使用できる。また、このDNA断片とストリンジェントな条件（例えば、2XSSC, 65℃、16時間〜20時間）でハイブリダイズするDNA断片でプロモーター活性を有するものも、本発明において使用できる。本発明で得られたcabプロモーター、tublinプロモーターについてGenBank DatabaseにおいてBlast検索したところでは、類似する配列は認められなかった。cab ESTについては類似性が認められ、アミノ酸レベルでは、Lactuca Sativaのcabタンパク質と局所的には74%の相同性を示した。したがって、このESTをcabのESTと同定した。tublin ESTのアミノ酸部分についてはチコリのtublinのアミノ酸配列とN末端50アミノ酸が完全に一致したことからtublinと同定した。
【００１５】
かかるcabプロモーターまたはtublinプロモーターとハイブリダイズするポリヌクレオチドは、その由来を問わない。他の植物、例えばキク科の他の植物より定法（CTAB法等）を用いて単離したDNAを用いることもできるが、これらに限られず、いかなる生物種のDNAでもよい。また化学合成したDNAを用いることもできる。
【００１６】
すなわち、本発明は、
（１） 配列番号１で表されるDNA配列からなるポリヌクレオチド、
（２） 配列番号１で表されるDNA配列において、１若しくは複数の塩基が欠失、置換若しくは付加されたDNA配列からなり、かつプロモーター活性を有するポリヌクレオチド、
（３） 配列番号１で表されるDNA配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつプロモーター活性を有するポリヌクレオチド、
（４） 配列番号１のDNA配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつキクの１以上の組織において安定発現可能なプロモーター活性を有するポリヌクレオチド、
に関する。
【００１７】
（５） 前記（１）ないし（４）に記載のポリヌクレオチドのうち、いずれかを有する発現ベクター、
（６） 前記（１）ないし（４）に記載のポリヌクレオチドのうち、いずれかのポリヌクレオチドと構造遺伝子とからなるキメラ遺伝子、
（７） 前記（１）ないし（４）に記載のポリヌクレオチドのうち、いずれかのポリヌクレオチド、または前記（６のキメラ遺伝子を有する植物細胞、ただし、形質転換によらないポリヌクレオチドを有する植物細胞は除く、
（８） 前記（１）ないし（４）に記載のポリヌクレオチドのうち、いずれかのポリヌクレオチド、または前記（６）に記載のキメラ遺伝子を有する植物個体、ただし、形質転換によらないポリヌクレオチドを有する植物個体は除く、
（９） 前記（１）ないし（４）に記載のポリヌクレオチドのうち、いずれかのポリヌクレオチド、または前記（６）に記載のキメラ遺伝子を有するキク植物細胞またはキク植物体、ただし、形質転換によらないポリヌクレオチドを有するキク植物細胞またはキク植物体は除く、
に関する。
【００１８】
（１０） 配列番号２で表されるDNA配列からなるポリヌクレオチド、
（１１） 配列番号２で表されるDNA配列において、１若しくは複数の塩基が欠失、置換若しくは付加されたDNA配列からなり、かつプロモーター活性を有するポリヌクレオチド、
（１２） 配列番号２で表されるDNA配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつプロモーター活性を有するポリヌクレオチド、
（１３） 配列番号２のDNA配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつキクの１以上の組織において安定発現可能なプロモーター活性を有するポリヌクレオチド、
に関する。
【００１９】
また、本発明は、
（１４） 前記（１０）ないし（１３）に記載のポリヌクレオチドのうち、いずれかのポリヌクレオチドを有する発現ベクター、
（１５） 前記（１０）ないし（１３）に記載のポリヌクレオチドのうち、いずれかのポリヌクレオチドと構造遺伝子からなるキメラ遺伝子、
（１６） 前記（１０）ないし（１３）に記載のポリヌクレオチドのうち、いずれかのポリヌクレオチド、または前記（１５）に記載のキメラ遺伝子を有する植物細胞、ただし、形質転換によらないポリヌクレオチドを有する植物細胞は除く、
（１７） 前記（１０）ないし（１３）に記載のポリヌクレオチドのうち、いずれかのポリヌクレオチド、または前記（１５）に記載のキメラ遺伝子を有する植物個体、ただし、形質転換によらないポリヌクレオチドを有する植物個体は除く、
（１８） 前記（１０）ないし（１３）に記載のポリヌクレオチドのうち、いずれかのポリヌクレオチド、または前記（１５）に記載のキメラ遺伝子を有するキク植物細胞またはキク植物体、ただし、形質転換によらないポリヌクレオチドを有するキク植物細胞またはキク植物体は除く、
に関する。
【００２０】
【発明の実施の形態】
本発明のプロモーターにより制御すべき遺伝子は、プロモーターの3'-側の下流領域に連結する。そのため、プロモーターの3'-下流側に適当な制限酵素切断部位を挿入した発現ベクターを構築する。望ましくは、制限酵素切断部位の下流にポリA付加信号を含む、転写終結領域を連結する。所望により、適当な選択マーカー遺伝子を連結する。例えば、実施例1および図1に示す、pIGcab1, pIGtub13においては、BamHIとSacIにより、イントロン付GUS遺伝子を切り出すことができ、代わりに任意の遺伝子が挿入可能になっている。植物における選択マーカーとしては、特に限定されないが、カナマイシン、ハイグロマイシン等が利用可能となっている。必要な場合には、適当なエンハンサーをプロモーターの上流域に連結、またはイントロン内に挿入することによりプロモーター活性を上昇させることができる。発現を安定させたい場合、インシュレーターやMatrix Attatchment Region等が利用できる。また、プロモーターと翻訳開始コドンの間に翻訳のエンハンサーを挿入することにより、翻訳効率を上昇させることも可能である。さらに、ＡＴＧ翻訳開始コドンの下流の、このコドンと制御すべき構造遺伝子との間に、構造遺伝子の第一イントロンを含む一部を連結することで、発現効率をさらに向上させることができる場合もある。
【００２１】
本発明において、植物細胞への遺伝子導入は、上記のようにしてプロモーターとこれによりその転写を制御すべき遺伝子とを連結してベクターを作成し、このベクターを用い、定法により行うことができる。即ち、ベクターとしてTiプラスミド由来のベクターを用いる場合には、植物に感染する細菌アグロバクテリウム・ツメファシエンス（以下、Ａ．ツメファシエンスと略す。）、アグロバクテリウム・リゾジェネシス等を媒介として植物細胞への遺伝子導入を行うことができる。また、マイクロインジェクション法、エレクトロポレーション法、ポリエチレングリコール法、リポソーム融合法、遺伝子銃、カルシウムカーバイドウィスカー法等の物理的・化学的手法により、直接的に植物細胞への遺伝子導入を行うこともできる（K. Lindsey: Transgenic Plant Research, Harwood academic publishers: p.1-33 (1998)）がこれらの方法に限られない。
【００２２】
更に、これらの方法等により遺伝子が導入された植物細胞からは、その植物の種類等に応じた適当な条件下で培養することにより、植物体を再分化させることもできる。また、茎頂に導入することにより、あるいはInPlanta形質転換法を用いることにより、再分化技術を用いることなく、形質転換植物を得ることもできる。このようにして得られた植物細胞・植物体は、本発明のプロモーターによりその転写が制御された遺伝子が導入されている植物細胞であり、植物体である。
【００２３】
本発明のcabプロモーターおよびtublinプロモーターは、下記の実施例で用いたβ−グルクロニダーゼ遺伝子のみならず、他の様々なタンパク質をコードする遺伝子、アンチセンス遺伝子、２本鎖RNA又はリボザイムRNA等の発現を制御することができる。従って、本発明においては、プロモーターの下流に連結させる遺伝子としては、目的に応じて、以下のものが考えられるがこれらに限られない。農業的に優れた形質を付与する遺伝子としては、例えば、耐病性、耐虫性、耐ウイルス性、除草剤抵抗性、抗生物質抵抗性、細菌抵抗性、カビ抵抗性、ストレス耐性、花色関連遺伝子、形態形成に関与する遺伝子、生理活性物質の生合成系遺伝子、有用物質生産遺伝子等がある。医薬品や農薬産業等において有用な物質の生産に関与する遺伝子としては、ワクチン遺伝子、抗体遺伝子、医薬原料生産遺伝子、除虫菊成分等の殺虫物質生合成系遺伝子等が挙げられる。化学工業等において有用な物質の生産に関与する遺伝子としては、例えば、油脂の生合成系遺伝子、工業用酵素遺伝子等が考えられる。研究目的に使用される遺伝子として、遺伝子発現機構の研究に必要とされる遺伝子（転写因子遺伝子等）、レポーター遺伝子等が考えられる。これらは自然界の生物からクローン化した遺伝子、化学合成遺伝子、あるいはそれらの組み合わせやそれらの改変遺伝子でも良い。また、導入する遺伝子の数も１個に限らず複数でもよい。
【００２４】
また、本発明のプロモーターを使用することのできる植物の種類も特に限定されない。前記植物としては、キクが好ましいが、キク以外でも、例えば、タバコを始め、イネ、トウモロコシ、シロイヌナズナ、ペチュニア、ダイズ、サツマイモ等の草本植物、あるいは、ヤマナラシ、ポプラ、アカシア、スギ、マツ、ユーカリ、ゴム等の木本植物にも本発明のプロモーターを使用することができるが、これらの植物に限られない。
【００２５】
【実施例】
以下の実施例によって本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
［実施例１］プロモーター活性測定用ベクターの構築
プロモーター活性の測定に用いたpIG101HmBは以下のようにして構築した。まず、pBI101Hm（Akama, K. et al. Plant Cell Rep., 12: 7-11. (1992)）をBamHIで部分分解し、クレノウ酵素で末端をfill inし、そのまま連結し、形質転換した。出現したコロニーを培養し、プラスミドを調製して、制限酵素の切断パターンを調べることにより、pBI101Hmのハイグロマイシン遺伝子の下流のBamHIサイトが欠失したプラスミドを得、これをpBI101HmBと名付けた。次にpBI101HmBをSacIで切断後、フェノール／クロロフォルム抽出を行い、エタノール沈殿後、BamHIで切断し、ゲル電気泳動により分画してベクター側の長いDNA断片をゲルから回収した。ゲル回収にはPrepA Gene DNA Purification Kit (BioRad社製)を用いた。次に、pIG121Hm（Y. Hiei et al. Plant J. 6, 271-282 (1994)）をSacIとBamHIで同様にして切断し、イントロン-GUS遺伝子を含むBamHI-SacI断片をアガロースゲルから回収した。この、pBI101HmBのBamHI-SacIの長い断片と、イントロン-GUS遺伝子を含むBamHI-SacI断片を連結し、pBI101HmBのGUS遺伝子部分をpIG121Hmのイントロン-GUS遺伝子と置き換えたプラスミドを構築し、pIG101HmBと名付けた。
【００２６】
［実施例2］キクRNAの調製
キク全RNAの調製は以下のようにして行った（島本功、佐々木卓治監修 新版植物のPCR実験プロトコール60-62頁、秀潤社1997）。圃場で栽培したリュウノウギクの葉1グラムを乳鉢、乳棒を用いて液体窒素中で細かくなるまで粉砕し、2ＸCTAB溶液（80℃）10mlと混合し、65℃で10分間保温した。等量のクロロフォルム／イソアミルアルコール（24：1）を加え、5分間攪拌し、遠心分離（3500回転、室温）後、水層（上層）を回収した。クロロフォルム／イソアミルアルコール抽出を中間層が出なくなるまで繰り返し行い、水層を回収し、1/4倍量の10M塩化リチウム液を加え、少なくとも2時間-20℃に放置した。15000回転、10分間、4℃で遠心し、上清を捨て、沈殿を回収した。沈殿を1mlのTE緩衝液に溶解し、15000回転、10分間、4℃で遠心し、上清を回収した。上清に等量のTE飽和フェノール（pH9.0）を加えて攪拌し、15000回転、10分間、4℃で遠心し、水層を回収した。水層に等量のフェノール／クロロフォルム／イソアミルアルコール（25：24：1）を加え攪拌し、15000回転、10分間、4℃で遠心し、水層を回収した。この操作を2回繰り返した。水層に等量のクロロフォルム／イソアミルアルコール（24：1）を加え攪拌し、15000回転、10分間、4℃で遠心し、水層を回収した。水層に1/4倍量の10M塩化リチウム液を加え、少なくとも2時間-20℃に放置した。15000回転、10分間、4℃で遠心し、沈殿を回収した。沈殿を70%エタノールで洗浄し、乾燥後、RNaseフリーの滅菌水30μlに溶解した。
【００２７】
ポリARNAの調製はFAST Track mRNA Isolation Kit（InVitrogen社製）を用いて行った。方法はキットに添付のマニュアルに従って行った。このmRNAを用いて、Gibco BRL社製のSuperScriptcDNA合成キットを用いてcDNAを合成し、pBluescript II KS (-)（StrataGene社製）のEcoRV部位にクローン化した。得られたコロニー105クローンについてそれぞれアンピシリン50μg/mlを含むLB培地で終夜培養し、クラボウ社のプラスミド抽出装置PI-100Σを用いてプラスミドを抽出した。これらのプラスミドについてBigDye cycle sequencing Kit（Applied BioSystems社製）を用いて反応させ、ABI PRISM 310シーケンサーを用いてDNA配列を決定した。
【００２８】
その結果、もっともEST出現頻度が高かったcabとノザン解析のポジティブコントロールに使用されるβ-tublinの2遺伝子を選択し、これらのDNA配列を元にTAIL-PCRのプライマーを合成した。
【００２９】
キクからの全DNAの抽出はCTAB法を用いて定法により行った。
【００３０】
TAIL-PCRの方法については、島本功、佐々木卓治監修、新版植物のPCR実験プロトコール、秀潤社刊、1997年、p83〜p89にしたがって行った。任意プライマーについては、同p85の図2のB：任意プライマー、1：5'-NGTCGA(G/C)(A/T)GANA(A/T)GAA-3'、2：5'-GTNCGA(G/C)(A/T)CANA(A/T)GTT-3'、3：5'-(A/T)GTGNAG(A/T)ANCANAGA-3'を用いた。遺伝子特異的プライマーとしては、cab遺伝子については、配列番号3: 5'-CCGTACCATGGGCTTCCTGAT-3'、配列番号4: 5'-AACTCTTCCATTTCCGAGAAGCT-3'、配列番号5: 5'-GAGCCATGGTTGAAGAAGCCARR-3'を用いた。TAIL-PCRの結果、任意プライマー1、2、3の全ての区で約3kbの明瞭なバンドが増幅された。そこで、TAIL-PCR産物をpBluescript II KS (-)のEcoRV部位にクローン化し、得られた組換えプラスミドのDNA配列を決定した。その結果、任意プライマー3を用いて得られたクローンNo.19が遺伝子特異的プライマーである配列番号5の配列を含み、かつ、その上流のcabのDNA配列と一致し、さらに、上流の末端側に任意プライマー3の配列が存在した。そこで、このクローンNo.19をcabのプロモーターを含む上流領域と同定した。
【００３１】
次にこのNo.19の配列を元に、翻訳開始コドン（ATG）のすぐ上流からプロモーターを含む領域を増幅させ、レポーター遺伝子（β-グルクロニダーゼ遺伝子：GUS遺伝子）に連結するために、以下のプライマーを合成した。配列番号6: 5'-AAAGCTTTATATCTTCATCTCTCATGGCTA-3'、配列番号7: 5'-AGGATCCATTTGTTGAAATTGGTTGGAAGA-3' これらのプライマーを用いて以下の条件でTAIL-PCRを行った。94℃2分→（94℃30秒→50℃±10℃1分→72℃2分）Ｘ5サイクル→（94℃30秒→55℃±10℃1分→72℃3分）Ｘ30サイクル→72℃7分30秒→4℃。このPCR反応により得られた約1.8kbの断片をInVitrogen社のTOPO TA cloning Kitを用いてクローン化し、出現したコロニーを培養後、プラスミドを調製してEcoRI切断により1.9kbの断片が挿入されていることを確認した。このプラスミドをHindIII, BamHIで切断したところ、0.9kb, 1.0kbの2本のバンドが観察された。この2本のバンドをまとめてゲルから回収し、pIG101HmBのHindIII、BamHI間に連結した。このプラスミドをpIGcab1と名付けた（図１）。
【００３２】
Tublinプロモーターについても同様に以下のプライマーを合成し、TAIL-PCRによりクローン化した。すなわち、1st PCR primer配列番号8: 5'-CTCCACTCGCTTCGTTGTAGTAGACATTGA-3'、 2nd PCR primer配列番号9: 5'-GATGCGTTCTAGCTGGAGTTCTGAGTCT-3'、 3rd PCR primer配列番号10: 5'-GGAAGTGAAGGATTTCTCTCATTTTTGGTT-3'をこの順にTAIL-PCRを行った。TAIL-PCRの方法は、上述の方法のままではバンドが多数出現したので、3rd PCR以外は上記と同様であるが、3rd PCRについては、2nd PCR産物を10倍希釈したものを1μl用い、全体で100μl の容量で（94℃2分→44℃1分→72℃3分）X20サイクル→72℃5分→4℃のサイクルで通常のPCRを行った。得られたPCR産物をフェノール／クロロフォルム抽出し、プラスミドpBluescript KS(-)のEcoRV切断物と連結し大腸菌に形質転換した。得られたクローンについて、DNA配列を両鎖について確認後、上記と同様に上流側にHindIII部位、翻訳開始コドン直前にBamHI部位の付加されたプライマー配列番号11: 5'-AAAGCTTCGAGAGAGAAGAACAAACAAA-3'配列番号12: 5'-AGGATCCATTTTTGGTTTTGGTTAGTGTGT-3'を合成して再度PCRを行い、TAクローニングを行った。制限酵素によるスクリーニングで得られたクローンのプラスミドをHindIII、BamHIで切断後、プロモーターを含む断片をゲルより回収し、pIG121HmBのHindIII, BamHI間に挿入することにより、pIGtub13を作成した。プロモーター領域のDNA配列はこのTAクローニングのクローンを用い、両鎖についてABI3100シーケンサーを用いて、BigDye Cycle Sequence法によって決定し、DNASISにより連結した。Cabプロモーターについても同様にしてDNA配列を決定した。cabプロモーターについては翻訳開始コドンから上流300塩基のAT含有率が約80％と非常に高い価を示した。このことからCpG配列のメチル化によるサイレンシングを回避できる可能性がある。tublinプロモーターについては翻訳開始コドンから上流300塩基のAT含有率は約60％であった。
【００３３】
次いで、pIGcab1, pIGtub13をアグロバクテリウム法により、キク（Dendranthema grandiflorum (Ramat.) Kitamura, 品種 セイマリン）に導入した。即ち、pIGcab1, pIGtub13をエレクトロポレーション法によりＡ．ツメファシエンスＥＨＡ１０５に導入した（１０％グリセロール中、電気パルスとして２５００Ｖ、２５μＦを付与。バイオラッド社製 GENE PULSERII を使用。）後、このＡ．ツメファシエンスをカナマイシン５０ｍｇ／ｌを含むＬＢ寒天培地（トリプトン１％、食塩０．５％、酵母エキス０．５％）で２８℃、２日間培養することにより選抜し、これをカナマイシン５０ｍｇ／ｌを含むLB培地で終夜液体培養したものを無菌培養したキクの葉に感染させた。
【００３４】
キクの形質転換は以下の手順で行った。キク品種‘セイマリン’の無菌植物の葉を5mm角程度に切り外植片とした。この外植片（葉切片）をアグロバクテリウム懸濁液に約３０分つけた後、余分な菌液をろ紙で除いて共存培養培地（ムラシゲ・スクーグ基本培地（以下、ＭＳと略す。）、３％しょ糖、０．８％寒天、２mg/lナフタレン酢酸、１mg/lベンジルアデニン、1g/l カザミノ酸、100μM/l アセトシリンゴン）に葉の裏側を上向きにして置き、22℃・暗黒下で２日間共存培養した。共存培養終了時には、外植片をカルベニシリン 300mg/l、Tween 20 １％を含む10mM硫酸マグネシウム溶液中で、25℃１時間振とうして除菌した。次に、外植片を、選抜培地Ａ（ＭＳ、３％しょ糖、０．８％寒天、２mg/lナフタレン酢酸、１mg/lベンジルアデニン、300mg/l カルベニシリン、25mg/l パロモマイシン）に移し、20℃、低照度（7μmol/s/m²）で培養した。２週間後、新しい選抜培地Ａに移し、さらに２週間後、選抜培地Ｂ（ＭＳ、３％しょ糖、０．８％寒天、0.02mg/lナフタレン酢酸、１mg/lベンジルアデニン、10.0mg/l ジベレリン酸、300mg/l カルベニシリン、25mg/lパロモマイシン）に移した。次いで、２週間ごとに新しい選抜培地Ｂに移し、シュートが2-3mm長になった時点でシュートをかきとり伸長培地（無機塩濃度が1/2のMS、300mg/lカルベニシリン）に移した。さらに、伸長培地上で伸長したシュートの葉を5mm角に切り選抜培地Ａで培養して抗生物質抵抗性を確認した。
【００３５】
得られたpIGcab1あるいは pIGtub13導入キク植物、即ちキクcabプロモーター-GUS融合遺伝子あるいはキクtublinプロモーター-GUS融合遺伝子を有するキクについて、Jefferson et al. （EMBO J. 1987, 6, 3901 - 3907）の方法に基づき、GUS遺伝子の発現試験を行った。定量的分析には、培養器内で育成した再分化から約８ヶ月経過した形質転換体の展開葉から打ち抜いた直径約7 mmの葉片を材料とし、4-methylumbelliferyl-β-D-glucuronide (MUG) を基質として用いた。葉片をすりつぶして得た抽出液を、50 mM リン酸ナトリウム（pH 7.0）、10 mM メルカプトエタノール、10 mM EDTA、0.1 % N-ラウロイルサルコシン酸ナトリウム、0.1 % Triton X-100、20 % メタノール、1 mM MUGの反応液中で37℃、30分間処理した。処理後、反応液中に存在する4-methylumbelliferone (4-MU)の量を分光蛍光光度計によって定量的に測定した。GUS活性は、葉片抽出液中のタンパク質1 mg当りに生成された4-MUの量（pmol 4-MU/min/ mg protein）で表した。なお、タンパク質の濃度は、Protein assay kit（Bio-Rad Laboratories, California, USA）を用いて定量した。花弁については再分化から１２ないし１８ヶ月後の温室植物体の舌状花の花弁部分を用いて上記と同様の方法でGUS活性を測定した。また、組織化学的分析には、培養器内で育成した再分化から約8ヶ月経過した形質転換体の全体を材料とし、5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D- glucuronic acid (X-GLUC)を基質として用いた。植物材料を、100 mM リン酸ナトリウム（pH 7.0）、0.5 mM フェロシアン化カリウム、0.5 mM フェリシアン化カリウム、10 mM EDTA、0.1 % Triton X-100、20 % メタノール、1 mM X-GLUCの反応液に浸漬し、37℃条件下に16時間置いた。反応処理後、７０％エタノール溶液に浸して葉緑素を脱色しGUS活性を示す濃青色の部分の分布を調査した。定量的分析の結果、キク形質転換体の葉において、キクcabプロモーターは35Sプロモーター及びキクtublinプロモーターに比べて強いGUS発現の個体が多く、形質転換体中に占めるGUS活性を有する個体の割合も高いことが示された（表１）。すなわち、その機能は、これが本来プロモーターとして作用する構造遺伝子とは全く異なるGUS構造遺伝子のプロモーターとして用いた場合でも、発揮されることが示された。
【００３６】
植物体全体についてGUS染色による組織化学的分析を行った結果、35Sプロモーター／GUS（表１の≧100の個体）は葉の葉脈のみ薄く染色され、tublinプロモーター／GUS（表１の≧100の個体）は葉の葉脈のみが濃く染色され、cabプロモーター／GUS（表１の≧1000の個体）は葉の全体が濃く染色された。このことからcabプロモーターは葉の全体で強く発現するが、tublinプロモーターは葉脈でのみ強く発現し、35Sプロモーターは葉脈で弱く発現し、他の組織ではほとんど発現しないと考えられた。
【００３７】
【表１】

なお、表中のＧＵＳ活性レベルは、pmol 4MU/min/mg proteinで示した。
【００３８】
【表２】

なお、表中のＧＵＳ活性レベルは、pmol 4MU/min/mg proteinで示した。
【００３９】
以上の結果より、本発明のプロモーター、即ち、キクcabプロモーターとして単離された配列番号１に示すDNA配列を有するポリヌクレオチドは、キク形質転換体の葉において、これが本来プロモーターとして作用する構造遺伝子とは全く異なる構造遺伝子に対しても、発現を促進できることが明らかとなった。また、tublinプロモーターについても、キク形質転換体の葉においては活性がほとんど検出されなかったが（表1）、花弁においては中程度の活性が認められた（表２）。このことはtublinプロモーターについても、本来の構造遺伝子以外の遺伝子についても活性を有することを意味している。
【００４０】
【発明の効果】
本発明のcabプロモーター、即ち、配列番号１に示すDNA配列を有するポリヌクレオチドは、キク形質転換体において、その制御下に置かれた構造遺伝子を少なくとも8ヶ月間以上、葉において安定的かつ強力に発現させる能力を有する。つまり、このプロモーターを使用することにより、キクにおいてサイレンシングを回避して外来遺伝子を長期間安定に高発現させることが可能となる。しかも、このプロモーターは、使用できる構造遺伝子の種類を問わない。
【００４１】
従って、目的に応じて適切なDNA配列を選択し、これを本発明のプロモーターの制御下に置いてベクターを作成し、このベクターを用いてキクの形質転換を行えば、キクにおいてそのDNA配列由来のRNAを安定的かつ強力に発現させることができるので、目的とする形質を付与することが可能である。
【００４２】
本発明で得られたcabプロモーターは、キク植物体において35Sプロモーターに比べ、約10倍程度強い発現を示す。タバコ、ペチュニアにおいては、35Sプロモーターがcabプロモーターよりも3〜10倍程度高い活性を示すが、キクにおいては、キクcabプロモーターは逆に35Sプロモーターよりも10倍程度高い活性を示した。このことは発明者らが全く予想できなかった有利な効果である。
【００４３】
また、35Sプロモーターはキクにおいては、幼植物においては発現が見られる場合があるものの、成長するにつれて発現が弱くなり、最終的に発現が見られなくなる。これに対し、cabプロモーターはキク形質転換体が成長後も約8ヶ月にわたって、安定的に強い発現を維持していた。tublinプロモーターについても長期間栽培後の花弁において高頻度に発現が見られた。
【００４４】
キク由来プロモーターがキクにおいて安定発現することは容易推考とも考えられる。しかし、本発明時と同時期にクローン化したキク由来のtublinプロモーターについては、葉においては安定発現は認められなかった。tublinプロモーターは多くの組織で普遍的に発現するプロモーターであることから、ノザン解析においてコントロールとして使われるものである。かかる多くの組織で安定的に発現しているプロモーターはその近傍に発現を抑制する配列を持たず、ほとんどの組織で安定発現するものと期待される。しかしながら、tublinプロモーターについては葉における安定発現は見られず、花弁においてのみ発現が観察された。
【００４５】
これに対し、cabプロモーターは光誘導性の組織特異的な高発現プロモーターであることから、安定的に発現するとは必ずしも予想できないものである。高発現プロモーターはサイレンシングが起きやすいからである。しかしながら、cabプロモーターについては葉において安定発現が認められた。このことは、当業者の予想できる範囲を超えており、予想外の効果と言える。
【００４６】
さらにcabプロモーターは約80%のアデニン・チミン含量（AT含量）を有していたが、これは非常に高いAT含量であり、このような高いAT含量のプロモーターが存在することは当業者の予想外であると考えられる。AT含量が高いということは、メチル化を受けるシトシンおよびグアニンが少ないことを意味し、そのためにメチル化の影響を受けにくいのではないか、とも考えられる。したがって、かかるAT含量の高い配列が安定高発現に寄与している可能性があるが、もしそうであれば、この点についても当業者の予想外の効果と考えられる。tublinプロモーターについてはかかる高いAT含量は認められなかったが、それにもかかわらず、花弁においては長期間栽培後も発現を示した。この点についても予想外の効果であった。
【００４７】
【配列表】

【図面の簡単な説明】
【図１】 pIGcab1、pIGtub13のT-領域の構造を示す。
B:BamHI, E:EcoRI, H:HindIII, S:SalI, Sc:SacI, pnos:ノパリン合成酵素遺伝子プロモーター、tnos:ノパリン合成酵素遺伝子ターミネーター、BR：右境界配列、BL：左境界配列、NPTII：ネオマイシン・フォスフォトランスフェラーゼII、cab：クロロフィルa/b結合タンパク質遺伝子プロモーター、tub：tublin遺伝子プロモーター、GUS：β-グルクロニダーゼ遺伝子、35S：カリフラワーモザイクウイルス35Sプロモーター、HPT：ハイグロマイシン・フォスフォトランスフェラーゼ[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a DNA sequence having transcription activity in a plant, that is, a polynucleotide that functions as a promoter and use thereof.
[0002]
In this specification, the following terms are defined as follows.
“Polynucleotide” also includes single-stranded DNA, single-stranded DNA that is a complementary strand of the single-stranded DNA, double-stranded DNA in which both are hydrogen-bonded, and RNA that is a transcription product of these DNAs.
“A DNA sequence in which one or more bases are deleted, substituted or added” means a DNA sequence in which one base is deleted, substituted or added in the original DNA sequence, and a plurality of bases, preferably Refers to a DNA sequence with several bases deleted, substituted or added but having substantially equivalent functions. That is, it includes those in which there is no substantial change in the function of the promoter due to deletion, substitution or addition of these one or more bases, and those in which the function of the promoter is reduced. For example, when a deletion mutation is taken from the 5'-upstream, it means that the transcriptional activity is not changed or that the transcriptional activity is reduced. In addition, it is a technique well-known to those skilled in the art to make a deletion mutation from 5'-upstream. Deletion, substitution, and addition of a spacer region that does not function as a cis element often do not substantially change the promoter activity, and DNA sequences in which such spacer region is deleted, substituted, or added are also included in the above terms . Also included are those in which a functional cis element is deleted to reduce promoter activity or tissue specificity. As long as these conditions are satisfied, “a plurality of bases” includes from 2 bases to several hundred bases. Deletions, substitutions, and additions that increase promoter activity or substantially change function such as changing tissue specificity are not included.
[0003]
“Stringent conditions” as used herein refers to conditions under which DNA having 95-100% homology hybridizes. For example, conditions such as 2XSSC, 65 ° C., 16 to 20 hours, or 0.5M charlinic acid buffer, 1 mM EDTA, 7% SDS, 65 ° C., 16 to 20 hours, and the like are used, but not limited thereto.
“Promoter” refers to DNA having an activity to transcribe RNA from a gene. In the present invention, it means a promoter having transcription activity mainly in plants, but is not limited to this, and includes cases where it is used in animals, bacteria, yeasts, molds and the like as long as it functions.
“Expression vector” refers to a plasmid vector in which a restriction enzyme site for cloning is inserted downstream of a promoter. A vector derived from Ti plasmid is also included. In many cases, a poly A addition signal is linked downstream of a restriction enzyme site.
“Plant cell” means a plant cell in which the promoter according to the present invention exerts transcriptional activity, but it is not always necessary to exert transcriptional activity, and it exhibits transcriptional activity only when differentiated into any tissue. In some cases plant cells are also included.
“Chrysanthemum” means chrysanthemum plant cells and chrysanthemum plants in which the promoter according to the present invention exerts its transcriptional activity, but does not mean that it exhibits transcriptional activity in all tissues, but is transcribed in some tissues. Chrysanthemum that exhibits activity is also included.
By “polynucleotide not transformed” is meant a genomic polynucleotide originally possessed by the organism. When a chimeric gene linked to the promoter of the present invention is introduced into an organism that originally has the promoter of the present invention, the introduced promoter is not a “polynucleotide that is not transformed”.
[0004]
[Prior art]
With the development of plant molecular biology in recent years, gene sense RNA, antisense RNA, double-stranded RNA or ribozyme RNA is expressed in plant cells, pest resistance, herbicide resistance, stress resistance, useful substance production, It has become possible to molecularly breed new plant varieties having useful traits such as new flower colors and new forms. In other words, the target gene fragment is linked to the 3′-side of a promoter that can be expressed in plants so that it can form a double-stranded RNA in the sense direction or antisense direction, or so that a ribozyme RNA can be transcribed. Chimeric genes are prepared, and these genes are introduced into a plant cell chromosome using a vector or directly, thereby expressing or suppressing the gene of the target trait. By applying this technique, for example,Bacillus thuringensisInsect-resistant plants that express sense RNA of the insecticidal BT toxin gene derived from the plant (DAFischhoff et al., Bio / Technology, vol.232: 738, 1987) and antisense of polygalacturonase gene for ripening of tomato fruit Tomatoes (CJSmith et al., Nature, vol. 334: 724, 1988), etc. that have good shelf-life expressing RNA have been produced.
[0005]
In many cases, the cauliflower mosaic virus (CaMV) 35S promoter (hereinafter simply referred to as 35S promoter) is used as a promoter for genes introduced into such transformed plants. The 35S promoter has the function of strongly transcribing RNA from genes in many dicotyledonous plants, and is most widely used in transformed plants because it is strongly expressed in many tissues. However, the 35S promoter has the following problems. 1) The expression is not so strong in monocotyledonous plants. 2) When a progeny is taken in many plants, whether monocotyledonous or dicotyledonous, an individual that no longer appears appears. 3) The 35S promoter contains sequences that cause recombination at a high frequency (A. Kohli et al. Plant J 1999 Mar; 17 (6): 591-601), and there is a problem with the stability of the promoter sequence itself on the chromosome. There is. Therefore, a promoter that can solve these problems has been desired.
[0006]
For chrysanthemum, foreign gene expression has been attempted using the 35S promoter for the same reason as described above. However, in chrysanthemum, when the 35S promoter is used, it is difficult to obtain individuals that express foreign genes, and even if individuals that show expression are obtained, the expression level is low, and the expression becomes weaker as they grow. Finally, it is known that expression is not observed (Y. Takatsu et al. Plant Biotechnology, 2000, 17 (3), 241-245). That is, the 35S promoter has a problem in stability when a foreign gene is expressed in chrysanthemum, and a promoter capable of efficiently and stably expressing chrysanthemum has been desired. In addition, since the 35S promoter shows only very weak expression even when expression is observed in chrysanthemum, a promoter capable of high expression has also been desired.
[0007]
Although the cause of the phenomenon that the expression of foreign genes becomes unstable in chrysanthemum has not yet been elucidated, it is speculated that one of the causes may be that the 35S promoter is inactivated by methylation. In other words, chrysanthemum often has high ploidy such as hexaploid, so that most of the chromosomal DNA is methylated, and the 35S promoter may be inactivated by methylation. . In fact, the addition of azacitidine, a demethylating agent, to chrysanthemum transformants in which gene expression by the 35S promoter has been suppressed (silenced) may restore expression, so methylation may be involved Is expensive. Silencing includes suppression of transcription and suppression after transcription, and here, it means suppression of transcription. Silencing by methylation is a problem not only in chrysanthemum but also in other plants. Therefore, a promoter that can be stably expressed in plants without being silenced by methylation or the like has been desired.
[0008]
[Problems to be solved by the invention]
An object of the present invention is to provide a promoter capable of stably expressing a gene, particularly a promoter capable of stably expressing a gene in any tissue in a plant body, more preferably chrysanthemum, and a method for using the same. And
[0009]
[Means for Solving the Problems]
Since chrysanthemum endogenous genes are normally expressed without silencing as described above, expression of foreign genes in chrysanthemum using the promoters of chrysanthemum endogenous genes is due to methylation, etc. There is a possibility that silencing can be avoided and stable high expression can be achieved.
[0010]
Therefore, a strong promoter derived from chrysanthemum was searched and cloned as follows. Total RNA was extracted from the leaves of Ryunogi using the CTAB-Li method (supervised by Isao Shimamoto and Takuji Sasaki, 60th-62th PCR experiment protocol for new plants, Shujunsha 1997) to construct a cDNA library. About 100 clones of plasmid were prepared for this cDNA library, EST (expressed sequence tag) analysis was performed, and EST sequences of genes with high frequency of appearance (chlorophyll a / b binding protein gene, hereinafter referred to as cab) and many tissues The EST of the gene (tublin) that is considered to be expressed was found. Primers were synthesized based on these EST sequences, and the upstream promoter was cloned by TAIL-PCR. In order to estimate the translation initiation codon from comparison with the known sequence and clone the sequence from one base upstream of this translation initiation codon to the upstream region including the promoter, 5′-upstream of the 5′-upstream primer Add a restriction enzyme Hind III cleavage site, 5'-upstream of the 3'-downstream primer (3'-downstream as seen from the promoter) and Bam HI cleavage site and start codon antisense (CAT) Using the designed primers, the promoter and 5′-untranslated region were amplified by PCR. The obtained PCR fragment containing the promoter and 5'-untranslated region was cleaved with a restriction enzyme, linked to a β-glucuronidase (GUS) gene containing an intron, and 8-10 months after transformation into chrysanthemum. GUS activity was measured. As a result, it was found that the cab promoter isolated from Ryunogi can be stably highly expressed for a long time (at least 8 months) in the leaves of transformed chrysanthemum plants.
[0011]
Similarly, the promoter of the tublin gene was linked to the reporter gene GUS gene and transformed into chrysanthemum to examine the stability and the strength of the promoter. As a result, stable expression in the leaves was not observed for the tublin promoter, but expression was frequently observed in the petals.
On the other hand, stable expression in leaves was not observed for the 35S promoter, and it was proved that the chrysanthemum-derived promoters, cab promoter and tublin promoter, were stably expressed specifically in the leaves and petals, respectively. It was. For the tublin promoter, primers were designed based on leaf-derived ESTs and cloned by the TAIL-PCR method. However, contrary to expectation, stable expression was not observed in leaves but stable expression was observed only in petals.
[0012]
This means that even if a promoter of a gene expressed in a tissue of a certain plant is cloned and transformed into the same plant species, it is not always stably expressed in the expected tissue. That is, the strategy of using the plant's own promoter is easily conceivable by those skilled in the art, but the effect is not always as expected, and may have an advantageous effect that cannot be predicted. In fact, this strategy was expected to yield a promoter that can be stably expressed in leaves, but not only a cab promoter having such characteristics but also a promoter that could not be stably expressed in leaves (tublin promoter) was obtained. Moreover, those skilled in the art cannot always predict which promoter can be stably expressed in which tissue. This is because the tublin gene is also used as a control for Northern analysis and is thought to be expressed universally in many tissues. Such expression in many tissues is considered to have a mechanism that allows stable expression without receiving tissue-specific silencing. However, when this tublin promoter was used, stable expression in chrysanthemum leaves was difficult. The cab promoter is known as a highly expressed promoter, but it is considered that such a highly expressed promoter is susceptible to silencing (silencing after transcription) when the expression level exceeds a certain threshold. Stable expression is usually considered difficult to expect. However, contrary to expectation, such a high expression promoter showed stable expression. These were unexpected by the inventors. Therefore, even when the host plant's own promoter is used, there are cases where stable expression may or may not be possible depending on the tissue, and the judgment is considered to be beyond the range that can be predicted by those skilled in the art. As described above, the cab promoter and tublin promoter according to the present invention have advantageous effects that cannot be anticipated by those skilled in the art.
[0013]
That is, the above-mentioned problem of the present invention is solved by the cab promoter and the tublin promoter, specifically, a polynucleotide having the DNA sequences shown in SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2.
[0014]
As the promoter of the present invention, any polynucleotide having the DNA sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 2 can be used without limitation. Further, a DNA fragment that hybridizes with this DNA fragment under stringent conditions (for example, 2XSSC, 65 ° C., 16 hours to 20 hours) having promoter activity can also be used in the present invention. When Blast search was performed in the GenBank Database for the cab promoter and tublin promoter obtained in the present invention, similar sequences were not found. Similarities were observed for cab EST, and at the amino acid level, it showed 74% homology locally with the Lactuca Sativa cab protein. Therefore, this EST was identified as a cab EST. The amino acid portion of tublin EST was identified as tublin because the amino acid sequence of chicory tublin and the N-terminal 50 amino acids completely matched.
[0015]
The polynucleotide that hybridizes with such cab promoter or tublin promoter may be of any origin. Although DNA isolated from other plants, for example, other plants of the family Asteraceae using a conventional method (CTAB method or the like) can be used, the present invention is not limited thereto, and DNA of any species may be used. Alternatively, chemically synthesized DNA can be used.
[0016]
That is, the present invention
(1) a polynucleotide comprising the DNA sequence represented by SEQ ID NO: 1,
(2) a polynucleotide comprising a DNA sequence in which one or more bases are deleted, substituted or added in the DNA sequence represented by SEQ ID NO: 1 and having promoter activity;
(3) a polynucleotide that hybridizes with a polynucleotide comprising the DNA sequence represented by SEQ ID NO: 1 under stringent conditions and has promoter activity;
(4) a polynucleotide that hybridizes with a polynucleotide comprising the DNA sequence of SEQ ID NO: 1 under stringent conditions and has a promoter activity that can be stably expressed in one or more tissues of chrysanthemum,
About.
[0017]
(5) An expression vector having any one of the polynucleotides according to (1) to (4),
(6) A chimeric gene comprising any of the polynucleotides according to (1) to (4) and a structural gene,
(7) Among the polynucleotides according to (1) to (4), any of the polynucleotides, or a plant cell having the chimeric gene of (6) above, but a plant cell having a polynucleotide not transformed Except
(8) Among the polynucleotides described in (1) to (4) above, any one of the polynucleotides or a plant individual having the chimeric gene described in (6), provided that the polynucleotide is not transformed. Excluding plant individuals,
(9) A chrysanthemum plant cell or chrysanthemum plant having any one of the polynucleotides described in (1) to (4) above, or the chimeric gene described in (6) above; Excluding chrysanthemum plant cells or chrysanthemum plants with non-relevant polynucleotides,
About.
[0018]
(10) a polynucleotide comprising the DNA sequence represented by SEQ ID NO: 2,
(11) a polynucleotide comprising a DNA sequence represented by SEQ ID NO: 2 from which one or more bases have been deleted, substituted or added, and having promoter activity;
(12) a polynucleotide that hybridizes with a polynucleotide comprising the DNA sequence represented by SEQ ID NO: 2 under stringent conditions and has promoter activity;
(13) a polynucleotide that hybridizes with a polynucleotide comprising the DNA sequence of SEQ ID NO: 2 under stringent conditions and has a promoter activity that can be stably expressed in one or more tissues of chrysanthemum,
About.
[0019]
The present invention also provides:
(14) An expression vector having any one of the polynucleotides according to (10) to (13),
(15) A chimeric gene comprising any one of the polynucleotides according to (10) to (13) and a structural gene,
(16) Among the polynucleotides described in (10) to (13), any polynucleotide, or a plant cell having the chimeric gene described in (15) above, provided that the polynucleotide is not transformed. Excluding plant cells that have
(17) Among the polynucleotides described in (10) to (13) above, any polynucleotide, or a plant individual having the chimeric gene described in (15), provided that the polynucleotide is not transformed. Excluding plant individuals,
(18) A chrysanthemum plant cell or chrysanthemum plant having the polynucleotide of any one of the polynucleotides described in (10) to (13) or the chimeric gene described in (15) above; Excluding chrysanthemum plant cells or chrysanthemum plants with non-relevant polynucleotides,
About.
[0020]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
The gene to be controlled by the promoter of the present invention is linked to the 3′-downstream region of the promoter. Therefore, an expression vector is constructed in which an appropriate restriction enzyme cleavage site is inserted 3′-downstream of the promoter. Desirably, a transcription termination region containing a poly A addition signal is ligated downstream of the restriction enzyme cleavage site. If desired, an appropriate selectable marker gene is linked. For example, in pIGcab1 and pIGtub13 shown in Example 1 and FIG. 1, an intron-attached GUS gene can be excised with BamHI and SacI, and an arbitrary gene can be inserted instead. Although it does not specifically limit as a selection marker in a plant, Kanamycin, hygromycin, etc. can be utilized. If necessary, promoter activity can be increased by linking an appropriate enhancer to the upstream region of the promoter or inserting it into an intron. Insulators and Matrix Attatchment Region can be used to stabilize the expression. It is also possible to increase translation efficiency by inserting a translation enhancer between the promoter and the translation initiation codon. Furthermore, the expression efficiency can be further improved by linking a part of the structural gene including the first intron downstream of this codon and the structural gene to be controlled downstream of the ATG translation initiation codon. is there.
[0021]
In the present invention, gene introduction into plant cells can be carried out by a conventional method using a vector prepared by linking a promoter and a gene whose transcription is to be controlled as described above. That is, when a vector derived from a Ti plasmid is used as a vector, it is introduced into plant cells through Agrobacterium tumefaciens (hereinafter abbreviated as A. tumefaciens), Agrobacterium lysogenesis, etc. that infects plants. Gene transfer can be performed. It is also possible to directly introduce genes into plant cells by physical / chemical methods such as microinjection, electroporation, polyethylene glycol, liposome fusion, gene gun, and calcium carbide whisker. (K. Lindsey: Transgenic Plant Research, Harwood academic publishers: p. 1-33 (1998)) is not limited to these methods.
[0022]
Furthermore, from plant cells into which a gene has been introduced by these methods or the like, the plant body can be redifferentiated by culturing under appropriate conditions according to the type of the plant. Also, by introducing it into the shoot apex, orInPlantaBy using the transformation method, a transformed plant can also be obtained without using a redifferentiation technique. The plant cells / plants thus obtained are plant cells into which genes whose transcription has been controlled by the promoter of the present invention have been introduced, and are plant bodies.
[0023]
The cab promoter and tublin promoter of the present invention express not only the β-glucuronidase gene used in the following examples, but also the expression of genes encoding various other proteins, antisense genes, double-stranded RNAs or ribozyme RNAs. Can be controlled. Therefore, in the present invention, the following genes can be considered as a gene to be linked downstream of the promoter depending on the purpose, but are not limited thereto. Examples of genes that give agriculturally superior traits include, for example, disease resistance, insect resistance, virus resistance, herbicide resistance, antibiotic resistance, bacterial resistance, mold resistance, stress resistance, flower color-related genes , Genes involved in morphogenesis, biosynthetic genes of physiologically active substances, useful substance production genes, and the like. Examples of genes involved in the production of substances useful in the pharmaceutical and agricultural chemical industries include vaccine genes, antibody genes, pharmaceutical raw material production genes, insecticidal biosynthesis genes such as insecticide ingredients. Examples of genes involved in the production of substances useful in the chemical industry and the like include fat and oil biosynthesis genes, industrial enzyme genes, and the like. As genes used for research purposes, genes (transcription factor genes and the like) required for the study of gene expression mechanisms, reporter genes and the like are considered. These may be genes cloned from natural organisms, chemically synthesized genes, combinations thereof, or modified genes thereof. Further, the number of genes to be introduced is not limited to one and may be plural.
[0024]
Moreover, the kind of plant which can use the promoter of this invention is not specifically limited. As the plant, chrysanthemum is preferable, but other than chrysanthemum, for example, tobacco, rice, corn, Arabidopsis, petunia, soybean, sweet potato and other herbaceous plants, or porcupine, poplar, acacia, cedar, pine, eucalyptus, The promoter of the present invention can also be used for woody plants such as rubber, but is not limited to these plants.
[0025]
【Example】
The present invention will be described in more detail by the following examples, but the present invention is not limited to these examples.
[Example 1] Construction of promoter activity measurement vector
PIG101HmB used for measurement of promoter activity was constructed as follows. First, pBI101Hm (Akama, K. et al. Plant Cell Rep., 12: 7-11. (1992)) was partially decomposed with BamHI, the ends were filled in with Klenow enzyme, ligated as they were, and transformed. The emerged colony was cultured, a plasmid was prepared, and the cleavage pattern of the restriction enzyme was examined to obtain a plasmid from which the BamHI site downstream of the hygromycin gene of pBI101Hm was deleted, and this was named pBI101HmB. Next, pBI101HmB was cleaved with SacI, extracted with phenol / chloroform, precipitated with ethanol, cleaved with BamHI, and fractionated by gel electrophoresis to recover a long DNA fragment on the vector side from the gel. PrepA Gene DNA Purification Kit (BioRad) was used for gel recovery. Next, pIG121Hm (Y. Hiei et al. Plant J. 6, 271-282 (1994)) was similarly cut with SacI and BamHI, and the BamHI-SacI fragment containing the intron-GUS gene was recovered from the agarose gel. . This long BamHI-SacI fragment of pBI101HmB and the BamHI-SacI fragment containing the intron-GUS gene were ligated to construct a plasmid in which the GUS gene part of pBI101HmB was replaced with the intron-GUS gene of pIG121Hm, and named pIG101HmB .
[0026]
[Example 2] Preparation of chrysanthemum RNA
Chrysanthemum total RNA was prepared in the following manner (supervised by Isao Shimamoto, Takuji Sasaki, PCR experiment protocol for new plant pages 60-62, Shujunsha 1997). One gram of the leaves of Ryunogi cultivated in the field was pulverized in liquid nitrogen using a mortar and pestle until it became fine, mixed with 10 ml of 2XCTAB solution (80 ° C), and incubated at 65 ° C for 10 minutes. An equal amount of chloroform / isoamyl alcohol (24: 1) was added, stirred for 5 minutes, centrifuged (3500 rpm, room temperature), and the aqueous layer (upper layer) was recovered. Chloroform / isoamyl alcohol extraction was repeated until the intermediate layer disappeared, the aqueous layer was collected, 1/4 volume of 10M lithium chloride solution was added, and the mixture was allowed to stand at -20 ° C for at least 2 hours. The mixture was centrifuged at 15,000 rpm for 10 minutes at 4 ° C, the supernatant was discarded, and the precipitate was collected. The precipitate was dissolved in 1 ml of TE buffer, centrifuged at 15,000 rpm for 10 minutes at 4 ° C., and the supernatant was collected. An equal amount of TE-saturated phenol (pH 9.0) was added to the supernatant and stirred, and centrifuged at 15,000 rpm for 10 minutes at 4 ° C., and the aqueous layer was recovered. An equal amount of phenol / chloroform / isoamyl alcohol (25: 24: 1) was added to the aqueous layer, and the mixture was stirred and centrifuged at 15,000 rpm for 10 minutes at 4 ° C. to recover the aqueous layer. This operation was repeated twice. An equal amount of chloroform / isoamyl alcohol (24: 1) was added to the aqueous layer, and the mixture was stirred and centrifuged at 15,000 rpm for 10 minutes at 4 ° C to collect the aqueous layer. A 1 / 4-fold amount of 10M lithium chloride solution was added to the aqueous layer and left at -20 ° C for at least 2 hours. Centrifugation was performed at 15,000 rpm for 10 minutes at 4 ° C., and the precipitate was collected. The precipitate was washed with 70% ethanol, dried, and then dissolved in 30 μl of RNase-free sterilized water.
[0027]
Poly ARNA was prepared using FAST Track mRNA Isolation Kit (InVitrogen). The method was performed according to the manual attached to the kit. Using this mRNA, cDNA was synthesized using a SuperScript cDNA synthesis kit manufactured by Gibco BRL, and cloned into the EcoRV site of pBluescript II KS (-) (StrataGene). Each of the obtained colony 105 clones was cultured overnight in LB medium containing 50 μg / ml of ampicillin, and the plasmid was extracted using a plasmid extractor PI-100Σ manufactured by Kurabo Industries. These plasmids were reacted using BigDye cycle sequencing Kit (Applied BioSystems), and DNA sequences were determined using an ABI PRISM 310 sequencer.
[0028]
As a result, we selected two genes, cab and ß-tublin, which were used in the positive control of Northern analysis, and TAIL-PCR primers were synthesized based on these DNA sequences.
[0029]
Extraction of total DNA from chrysanthemum was performed by a standard method using CTAB method.
[0030]
The method of TAIL-PCR was performed according to Isao Shimamoto and Takuji Sasaki, PCR experiment protocol for new editions, published by Shujunsha, 1997, p83-p89. For optional primers, see p2 in Fig. 2, B: Optional primer, 1: 5'-NGTCGA (G / C) (A / T) GANA (A / T) GAA-3 ', 2: 5'-GTNCGA ( G / C) (A / T) CANA (A / T) GTT-3 ′, 3: 5 ′-(A / T) GTGNAG (A / T) ANCANAGA-3 ′ were used. As the gene-specific primer, for the cab gene, SEQ ID NO: 5'-CCGTACCATGGGCTTCCTGAT-3 ', SEQ ID NO: 5'-AACTCTTCCATTTCCGAGAAGCT-3', SEQ ID NO: 5: 5'-GAGCCATGGTTGAAGAAGCCARR-3 'was used. . As a result of TAIL-PCR, a clear band of about 3 kb was amplified in all sections of arbitrary primers 1, 2, and 3. Therefore, the TAIL-PCR product was cloned into the EcoRV site of pBluescript II KS (−), and the DNA sequence of the resulting recombinant plasmid was determined. As a result, clone No. 19 obtained using arbitrary primer 3 contains the sequence of SEQ ID NO: 5 which is a gene-specific primer, matches the DNA sequence of the upstream cab, and further, the upstream end side There was an arbitrary primer 3 sequence. Therefore, this clone No. 19 was identified as the upstream region containing the cab promoter.
[0031]
Next, based on this No. 19 sequence, a region including a promoter is amplified immediately upstream of the translation initiation codon (ATG), and a reporter gene (β-glucuronidase gene:GUSThe following primers were synthesized for ligation to the gene: SEQ ID NO: 6: 5′-AAAGCTTTATATCTTCATCTCTCATGGCTA-3 ′, SEQ ID NO: 7: 5′-AGGATCCATTTGTTGAAATTGGTTGGAAGA-3 ′ TAIL-PCR was performed using these primers under the following conditions. 94 ° C 2 minutes → (94 ° C 30 seconds → 50 ° C ± 10 ° C 1 minute → 72 ° C 2 minutes) X5 cycle → (94 ° C 30 seconds → 55 ° C ± 10 ° C 1 minute → 72 ° C 3 minutes) X30 cycle → 72 ℃ 7 minutes 30 seconds → 4 ℃. The approximately 1.8 kb fragment obtained by this PCR reaction was cloned using the TOPO TA cloning Kit of InVitrogen. After culturing the emerged colonies, a plasmid was prepared and the 1.9 kb fragment was inserted by EcoRI digestion. It was confirmed. When this plasmid was digested with HindIII and BamHI, two bands of 0.9 kb and 1.0 kb were observed. These two bands were collected from the gel and ligated between HindIII and BamHI of pIG101HmB. This plasmid was named pIGcab1 (FIG. 1).
[0032]
Similarly, the following primers were synthesized for the Tublin promoter and cloned by TAIL-PCR. That is, 1st PCR primer SEQ ID NO: 8: 5'-CTCCACTCGCTTCGTTGTAGTAGACATTGA-3 ', 2nd PCR primer SEQ ID NO: 9: 5'-GATGCGTTCTAGCTGGAGTTCTGAGTCT-3', 3rd PCR primer SEQ ID NO: 10: 5'-GGAAGTGAAGGATTTCTCTCATTTTTGGTT-3 'in this order -PCR was performed. The TAIL-PCR method is similar to the above except that many bands appeared if the above method was used, but for the 3rd PCR, 1 μl of 10-fold diluted 2nd PCR product was used. In a volume of 100 μl (94 ° C. 2 minutes → 44 ° C. 1 minute → 72 ° C. 3 minutes), normal PCR was performed in a cycle of X20 cycle → 72 ° C. 5 minutes → 4 ° C. The obtained PCR product was extracted with phenol / chloroform, ligated with an EcoRV digest of plasmid pBluescript KS (-), and transformed into E. coli. For the obtained clone, after confirming the DNA sequence for both strands, a primer with a HindIII site upstream and a BamHI site immediately before the translation start codon as described above SEQ ID NO: 11: 5′-AAAGCTTCGAGAGAGAAGAACAAACAAA-3 ′ SEQ ID NO: 12: 5′-AGGATCCATTTTTGGTTTTGGTTAGTGTGT-3 ′ was synthesized, PCR was performed again, and TA cloning was performed. The clone plasmid obtained by screening with restriction enzymes was cleaved with HindIII and BamHI, and a fragment containing the promoter was recovered from the gel and inserted between HindIII and BamHI of pIG121HmB to prepare pIGtub13. The DNA sequence of the promoter region was determined by the BigDye Cycle Sequence method using the TA cloning clone, ABI3100 sequencer for both strands, and ligated by DNASIS. The DNA sequence was similarly determined for the Cab promoter. For the cab promoter, the AT content of 300 bases upstream from the translation initiation codon was very high, about 80%. Therefore, silencing due to methylation of CpG sequence may be avoided. For the tublin promoter, the AT content of 300 bases upstream from the translation initiation codon was about 60%.
[0033]
Subsequently, pIGcab1 and pIGtub13 were introduced into chrysanthemum (Dendranthema grandiflorum (Ramat.) Kitamura, variety Seymarin) by the Agrobacterium method. That is, pIGcab1 and pIGtub13 were prepared by A.P. After introduction into Tumefaciens EHA105 (in 2500%, 25 μF was applied as an electric pulse in 10% glycerol. GENE PULSERII manufactured by Bio-Rad was used). The tumefaciens was selected by culturing at 28 ° C. for 2 days on an LB agar medium (tryptone 1%, salt 0.5%, yeast extract 0.5%) containing kanamycin 50 mg / l, and this containing kanamycin 50 mg / l A liquid culture of LB medium overnight was infected with aseptically cultured chrysanthemum leaves.
[0034]
Chrysanthemum transformation was performed by the following procedure. Aseptic plant leaves of chrysanthemum cultivar 'Seimarin' were cut into 5mm squares to make explants. After this explant (leaf section) was applied to an Agrobacterium suspension for about 30 minutes, excess bacterial solution was removed with filter paper, and a co-culture medium (Murashige-Skoog basic medium (hereinafter abbreviated as MS)), 3% sucrose, 0.8% agar, 2 mg / l naphthalene acetic acid, 1 mg / l benzyladenine, 1 g / l casamino acid, 100 μM / l acetosyringone) For 2 days. At the end of coculture, the explants were sterilized by shaking in 10 mM magnesium sulfate solution containing 300 mg / l carbenicillin and 1% Tween 20 at 25 ° C. for 1 hour. The explants are then transferred to Selection Medium A (MS, 3% sucrose, 0.8% agar, 2 mg / l naphthalene acetic acid, 1 mg / l benzyladenine, 300 mg / l carbenicillin, 25 mg / l paromomycin), 20 ℃, low illumination (7μmol / s / m²). Two weeks later, the cells were transferred to a new selection medium A. Two more weeks later, selection medium B (MS, 3% sucrose, 0.8% agar, 0.02 mg / l naphthalene acetic acid, 1 mg / l benzyladenine, 10.0 mg / l gibberellin) Acid, 300 mg / l carbenicillin, 25 mg / l paromomycin). Subsequently, the cells were transferred to a new selection medium B every two weeks, and when the shoots became 2-3 mm long, the shoots were scraped and transferred to an extension medium (MS with an inorganic salt concentration of 1/2, 300 mg / l carbenicillin). Further, the leaves of the shoots elongated on the elongation medium were cut into 5 mm squares and cultured in the selection medium A to confirm antibiotic resistance.
[0035]
About the obtained chrysanthemum plant introduced with pIGcab1 or pIGtub13, that is, chrysanthemum having chrysanthemum cab promoter-GUS fusion gene or chrysanthemum tublin promoter-GUS fusion gene, the method of Jefferson et al. (EMBO J. 1987, 6, 3901-3907) Based on this, the GUS gene expression test was performed. For quantitative analysis, we used 4-methylumbelliferyl-β-D-glucuronide (MUG) as a material, using a leaf piece of about 7 mm in diameter punched from the expanded leaf of a transformant that has been grown in an incubator for about 8 months. ) Was used as a substrate. The extract obtained by grinding the leaf pieces was mixed with 50 mM sodium phosphate (pH 7.0), 10 mM mercaptoethanol, 10 mM EDTA, 0.1% N-lauroyl sarcosinate, 0.1% Triton X-100, 20% methanol, 1 Treated in a reaction solution of mM MUG at 37 ° C. for 30 minutes. After the treatment, the amount of 4-methylumbelliferone (4-MU) present in the reaction solution was quantitatively measured with a spectrofluorometer. GUS activity was expressed as the amount of 4-MU produced per 1 mg of protein in the leaf extract (pmol 4-MU / min / mg protein). The protein concentration was quantified using a Protein assay kit (Bio-Rad Laboratories, California, USA). For petals, GUS activity was measured in the same manner as described above using the petals of tongue-like flowers of greenhouse plants 12 to 18 months after redifferentiation. For histochemical analysis, the whole transformant that had been grown in an incubator for about 8 months was used as a material, and 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-glucuronic acid was used. (X-GLUC) was used as a substrate. Immerse the plant material in a reaction solution of 100 mM sodium phosphate (pH 7.0), 0.5 mM potassium ferrocyanide, 0.5 mM potassium ferricyanide, 10 mM EDTA, 0.1% Triton X-100, 20% methanol, 1 mM X-GLUC. For 16 hours at 37 ° C. After the reaction treatment, the chlorophyll was decolored by soaking in a 70% ethanol solution, and the distribution of the dark blue portion showing GUS activity was investigated. As a result of quantitative analysis, in the leaves of chrysanthemum transformants, the chrysanthemum cab promoter has more GUS-expressing individuals than the 35S promoter and chrysanthemum tublin promoter, and the proportion of individuals having GUS activity in the transformants is also high. (Table 1). That is, it was shown that the function is exhibited even when it is used as a promoter of a GUS structural gene that is completely different from the structural gene that originally functions as a promoter.
[0036]
As a result of histochemical analysis of the whole plant by GUS staining, 35S promoter / GUS (≥100 individuals in Table 1) was stained lightly only in leaf veins and tublin promoter / GUS (≥100 individuals in Table 1) ), Only the veins of the leaves were stained deeply, and the cab promoter / GUS (individuals of ≧ 1000 in Table 1) was stained strongly throughout the leaves. This suggests that the cab promoter is strongly expressed in the entire leaf, but the tublin promoter is strongly expressed only in the leaf vein, the 35S promoter is weakly expressed in the leaf vein, and is hardly expressed in other tissues.
[0037]
[Table 1]

In addition, the GUS activity level in a table | surface was shown by pmol 4MU / min / mg protein.
[0038]
[Table 2]

In addition, the GUS activity level in a table | surface was shown by pmol 4MU / min / mg protein.
[0039]
From the above results, the polynucleotide having the DNA sequence shown in SEQ ID NO: 1 isolated as the promoter of the present invention, ie, chrysanthemum cab promoter, is a structural gene that originally acts as a promoter in the leaves of chrysanthemum transformants. It was revealed that expression can be promoted even for completely different structural genes. In addition, the activity of tublin promoter was hardly detected in leaves of chrysanthemum transformants (Table 1), but moderate activity was observed in petals (Table 2). This means that both the tublin promoter and the gene other than the original structural gene have activity.
[0040]
【The invention's effect】
The cab promoter of the present invention, that is, the polynucleotide having the DNA sequence shown in SEQ ID NO: 1, is stable and strong in leaves in the chrysanthemum transformant for the structural gene placed under its control for at least 8 months or more. Ability to express. That is, by using this promoter, it becomes possible to avoid silencing in chrysanthemum and to stably and highly express a foreign gene for a long period of time. Moreover, this promoter does not matter the type of structural gene that can be used.
[0041]
Therefore, if an appropriate DNA sequence is selected according to the purpose, a vector is prepared under the control of the promoter of the present invention, and chrysanthemum is transformed using this vector, the chrysanthemum is derived from the DNA sequence. RNA can be stably and strongly expressed, so that the desired trait can be imparted.
[0042]
The cab promoter obtained in the present invention shows about 10 times stronger expression in chrysanthemum plants than the 35S promoter. In tobacco and petunia, the 35S promoter showed an activity about 3 to 10 times higher than that of the cab promoter. In chrysanthemum, the chrysanthemum cab promoter showed an activity about 10 times higher than the 35S promoter. This is an advantageous effect that the inventors have never expected.
[0043]
In addition, in chrysanthemum, the expression of 35S promoter may be observed in young plants, but the expression becomes weaker as it grows, and finally expression is not observed. In contrast, the cab promoter maintained stable and strong expression for about 8 months after the chrysanthemum transformants grew. The tublin promoter was also frequently expressed in petals after long-term cultivation.
[0044]
It is considered that the chrysanthemum-derived promoter is stably expressed in chrysanthemum. However, the chrysanthemum-derived tublin promoter cloned at the same time as the present invention did not show stable expression in the leaves. Since the tublin promoter is a universally expressed promoter in many tissues, it is used as a control in Northern analysis. Such a promoter that is stably expressed in many tissues does not have a sequence that suppresses expression in the vicinity thereof, and is expected to be stably expressed in most tissues. However, the tublin promoter did not show stable expression in the leaves and was observed only in the petals.
[0045]
On the other hand, since the cab promoter is a light-inducible tissue-specific high expression promoter, it cannot always be expected to be stably expressed. This is because high expression promoters are prone to silencing. However, stable expression was observed in the leaves for the cab promoter. This is beyond the range that can be predicted by those skilled in the art, and can be said to be an unexpected effect.
[0046]
Furthermore, although the cab promoter had an adenine / thymine content (AT content) of about 80%, this is a very high AT content, and it is expected by those skilled in the art that such a high AT content promoter exists. Considered outside. A high AT content means that there is little cytosine and guanine undergoing methylation, which may be less susceptible to methylation. Therefore, there is a possibility that such a sequence having a high AT content contributes to stable and high expression. If so, this point is also considered to be an unexpected effect of those skilled in the art. Although such a high AT content was not observed for the tublin promoter, nonetheless, the petals were expressed even after long-term cultivation. This was also an unexpected effect.
[0047]
[Sequence Listing]

[Brief description of the drawings]
FIG. 1 shows the structure of the T-region of pIGcab1 and pIGtub13.
B: BamHI, E: EcoRI, H: HindIII, S: SalI, Sc: SacI, pnos: nopaline synthase gene promoter, tnos: nopaline synthase gene terminator, BR: right border sequence, BL: left border sequence, NPTII: Neomycin phosphotransferase II, cab: chlorophyll a / b binding protein gene promoter, tub: tublin gene promoter, GUS: β-glucuronidase gene, 35S: cauliflower mosaic virus 35S promoter, HPT: hygromycin phosphotransferase

Claims (18)

配列番号１で表されるDNA配列からなるポリヌクレオチド。  A polynucleotide comprising the DNA sequence represented by SEQ ID NO: 1. 配列番号１で表されるDNA配列において、１若しくは２の塩基が欠失、置換若しくは付加されたDNA配列からなり、かつプロモーター活性を有するポリヌクレオチド。A polynucleotide comprising a DNA sequence in which one or two bases are deleted, substituted or added in the DNA sequence represented by SEQ ID NO: 1 and having promoter activity. 配列番号１で表されるDNA配列と 95 〜 100 ％の相同性を有する DNA 配列からなり、かつプロモーター活性を有するポリヌクレオチド。 It consists DNA sequence having a DNA sequence 95-100% homology to SEQ ID NO: 1, and a polynucleotide having a promoter activity. 配列番号１のDNA配列と 95 〜 100 ％の相同性を有する DNA 配列からなり、かつキクの１以上の組織において安定発現可能なプロモーター活性を有するポリヌクレオチド。 A polynucleotide comprising a DNA sequence having a homology of 95 to 100 % with the DNA sequence of SEQ ID NO: 1 and having a promoter activity that can be stably expressed in one or more tissues of chrysanthemum. 請求項１ないし４に記載のポリヌクレオチドのうち、いずれかを有する発現ベクター。  An expression vector having any one of the polynucleotides according to claim 1. 請求項１ないし４に記載のポリヌクレオチドのうち、いずれかのポリヌクレオチドと構造遺伝子とからなるキメラ遺伝子。  A chimeric gene comprising any one of the polynucleotides according to claim 1 and a structural gene. 請求項１ないし４に記載のポリヌクレオチドのうち、いずれかのポリヌクレオチド、または請求項６のキメラ遺伝子を有する植物細胞。ただし、形質転換によらないポリヌクレオチドを有する植物細胞は除く。  A plant cell having any one of the polynucleotides according to claim 1 or 4, or the chimeric gene according to claim 6. However, plant cells having a polynucleotide not transformed are excluded. 請求項１ないし４に記載のポリヌクレオチドのうち、いずれかのポリヌクレオチド、または請求項６に記載のキメラ遺伝子を有する植物個体。ただし、形質転換によらないポリヌクレオチドを有する植物個体は除く。  A plant individual having any one of the polynucleotides according to claims 1 to 4 or the chimeric gene according to claim 6. However, plant individuals having a non-transformed polynucleotide are excluded. 請求項１ないし４に記載のポリヌクレオチドのうち、いずれかのポリヌクレオチド、または請求項６に記載のキメラ遺伝子を有するキク植物細胞またはキク植物体。ただし、形質転換によらないポリヌクレオチドを有するキク植物細胞またはキク植物体は除く。  A chrysanthemum plant cell or chrysanthemum plant having any one of the polynucleotides according to claim 1, or the chimeric gene according to claim 6. However, chrysanthemum plant cells or chrysanthemum plants having polynucleotides not resulting from transformation are excluded. 配列番号２で表されるDNA配列からなるポリヌクレオチド。  A polynucleotide comprising the DNA sequence represented by SEQ ID NO: 2. 配列番号２で表されるDNA配列において、１若しくは２の塩基が欠失、置換若しくは付加されたDNA配列からなり、かつプロモーター活性を有するポリヌクレオチド。A polynucleotide comprising a DNA sequence in which one or two bases are deleted, substituted or added in the DNA sequence represented by SEQ ID NO: 2 and having promoter activity. 配列番号２で表されるDNA配列と 95 〜 100 ％の相同性を有する DNA 配列からなり、かつプロモーター活性を有するポリヌクレオチド。A polynucleotide comprising a DNA sequence having 95 to 100 % homology with the DNA sequence represented by SEQ ID NO: 2 and having promoter activity. 配列番号２のDNA配列と 95 〜 100 ％の相同性を有する DNA 配列からなり、かつキクの１以上の組織において安定発現可能なプロモーター活性を有するポリヌクレオチド。 A polynucleotide comprising a DNA sequence having a homology of 95 to 100 % with the DNA sequence of SEQ ID NO: 2 and having a promoter activity that can be stably expressed in one or more tissues of chrysanthemum. 請求項１０ないし１３に記載のポリヌクレオチドのうち、いずれかのポリヌクレオチドを有する発現ベクター。  An expression vector comprising any one of the polynucleotides according to claims 10 to 13. 請求項１０ないし１３に記載のポリヌクレオチドのうち、いずれかのポリヌクレオチドと構造遺伝子からなるキメラ遺伝子。  A chimeric gene comprising any one of the polynucleotides according to claims 10 to 13 and a structural gene. 請求項1０ないし１３に記載のポリヌクレオチドのうち、いずれかのポリヌクレオチド、または請求項１５に記載のキメラ遺伝子を有する植物細胞。ただし、形質転換によらないポリヌクレオチドを有する植物細胞は除く。  A plant cell having any one of the polynucleotides according to claims 10 to 13, or the chimeric gene according to claim 15. However, plant cells having a polynucleotide not transformed are excluded. 請求項1０ないし１３に記載のポリヌクレオチドのうち、いずれかのポリヌクレオチド、または請求項１５に記載のキメラ遺伝子を有する植物個体。ただし、形質転換によらないポリヌクレオチドを有する植物個体は除く。  A plant individual having any one of the polynucleotides according to claims 10 to 13, or the chimeric gene according to claim 15. However, plant individuals having a non-transformed polynucleotide are excluded. 請求項1０ないし１３に記載のポリヌクレオチドのうち、いずれかのポリヌクレオチド、または請求項１５に記載のキメラ遺伝子を有するキク植物細胞またはキク植物体。ただし、形質転換によらないポリヌクレオチドを有するキク植物細胞またはキク植物体は除く。  A chrysanthemum plant cell or chrysanthemum plant having any one of the polynucleotides according to claim 10 or 13, or the chimeric gene according to claim 15. However, chrysanthemum plant cells or chrysanthemum plants having polynucleotides not resulting from transformation are excluded.

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