JP4074365B2

JP4074365B2 - Lactate dehydrogenase gene and gene-disrupted strain

Info

Publication number: JP4074365B2
Application number: JP03059498A
Authority: JP
Inventors: 和久畠山; 幸恵角出; 幹小林; 真人寺沢; 英明湯川
Original assignee: Mitsubishi Chemical Corp
Current assignee: Mitsubishi Chemical Corp
Priority date: 1998-01-28
Filing date: 1998-01-28
Publication date: 2008-04-09
Anticipated expiration: 2018-01-28
Also published as: JPH11206385A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ラクテートデヒドロゲナーゼをコードするＤＮＡ断片及びそれを用いたラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子破壊株の作成方法に関する。更に詳しくは、ブレビバクテリウム・フラバム等のコリネ型細菌由来のラクテートデヒドロゲナーゼをコードするＤＮＡ断片及びそれを用いた染色体ＤＮＡとの相同性組換えの原理による、ラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子破壊株の作成方法に関する。
【０００２】
乳酸は、アミノ酸、有機酸等の各種ファインケミカルズを製造する場合の副生物である。
【０００３】
【従来の技術】
ラクテートデヒドロゲナーゼは、ニコチンアミド・アデニン・ジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）を補酵素として、ピルビン酸を還元して乳酸を生成する酵素であるが、大腸菌あるいはコリネ型細菌等の微生物を用いて、リジン、トレオニン、イソロイシン、グルタミン酸等のアミノ酸、および、コハク酸、フマル酸、クエン酸等の有機酸等の各種ファインケミカルズを製造しようという場合は、副生物として乳酸等を生成する原因となる。そこで、従来は、例えばリジン製造において副生物の乳酸生成を抑える方法として、培養中の酸素供給濃度を十分に保つことにより乳酸の生成を抑える方法などが知られていた（K.Akashi et al., Agric. Biol. Chem., 43, 2087, 1979）。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、上記方法は、ファインケミカルズの製造に用いる微生物の培養中の、酸素濃度をコントロールするという煩雑な操作等が必要となり、ファインケミカルズを製造しようとする場合において作業効率が低減する結果となる。そこで、このように乳酸生成を抑えるために酸素濃度をコントロールする必要のない、ラクテートデヒドロゲナーゼ活性の低減あるいは欠如した菌株を取得することが望まれていた。
【０００５】
ラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子の破壊された微生物菌株としては、大腸菌(Escherichia coli)(J.Bacteriol., Vol.153, p.588-596)等で知られているが、これらの菌株を得る方法は、ランダム変異導入法により変異導入した菌株の中からスクリーニングするという煩雑な実験操作を要する方法であり、これまでに、アミノ酸、あるいは、有機酸等のファインケミカルズ製造において産業上重要なコリネ型細菌において取得された例はなく、ラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子の破壊されたコリネ型細菌の簡便な取得方法が望まれていた。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、遺伝子組換えの手法を駆使することにより、コリネ型細菌からラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子ＤＮＡを単離することに成功し、該ＤＮＡ断片を用いることにより効率的にラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子破壊株を作製することが可能であることを見い出し、本発明を完成するに至った。
【０００７】
すなわち、本発明の要旨は、下記（Ａ）又は（Ｂ）に示すタンパク質をコードするＤＮＡにある。
（Ａ）配列番号２に示すアミノ酸配列を有するタンパク質。
（Ｂ）配列番号２に示すアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、ラクテートデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質。
【０００８】
上記ＤＮＡとして具体的には、下記（ａ）又は（ｂ）に示すＤＮＡが挙げられる。
（ａ）配列番号１に示す塩基配列を含むＤＮＡ。
（ｂ）配列番号１に示す塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、ラクテートデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【０００９】
また本発明は、前記ＤＮＡがベクターに連結されてなる組換えベクターＤＮＡ、及び、配列番号１記載のＤＮＡもしくはこのＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ、又はその一部がベクターに連結されてなる組換えベクターＤＮＡを提供する。
【００１０】
本発明はさらに、前記ＤＮＡ又は組換えベクターＤＮＡと、微生物細胞の染色体ＤＮＡ上のラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子との相同組換えによりラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子が破壊された、微生物のラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子破壊株を提供する。
【００１１】
本発明はまた、前記ラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子破壊株を培地で培養し、その培養物からアミノ酸または有機酸（有機酸を除く）を採取することを特徴とする、アミノ酸または有機酸の製造方法を提供する。
【００１２】
上記ラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子破壊株の親株としては、コリネ型細菌、より具体的には、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３株が挙げられる。
本発明の「ラクテートデヒドロゲナーゼ（L-lactate dehydrogenase：EC 1.1.1.27）」とは、ニコチンアミド・アデニン・ジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）を補酵素として、ピルビン酸を還元して乳酸を生成する酵素を意味する。また、本明細書では、ラクテートデヒドロゲナーゼをコードするＤＮＡを、便宜上「ラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子」ということがある。
以下、本発明について詳細に説明する。
【００１３】
【発明の実施の形態】
本発明のＤＮＡは、ラクテートデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子であり、前記（Ａ）又は（Ｂ）に示すタンパク質をコードするＤＮＡである。
【００１４】
本発明のラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子は、本発明によりその塩基配列が決定されたので、この配列に基づいて合成することも可能であるが、本発明においてはコリネ型細菌からクローニングすることにより、初めて得られたものである。ラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子の供給源としては、ラクテートデヒドロゲナーゼ活性を有するコリネ型細菌であれば特に制限はない。
【００１５】
上記のようなコリネ型細菌としては、コリネバクテリウム・グルタミカム、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム、ブレビバクテリウム・アンモニアゲネス、ブレビバクテリウム・フラバム等が挙げられる。さらに具体的には、例えばブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３株が挙げられる。本菌株は、昭和５０年４月２８日に通商産業省工業技術院微生物工業技術研究所（現生命工学工業技術研究所）に微工研菌寄第３０６８号として寄託され、昭和５６年５月１日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、微工研条寄第１４９７号（ＦＥＲＭＢＰ−１４９７）の受託番号で寄託されている。
【００１６】
以下に、上記微生物からラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子ＤＮＡ断片を取得する方法、該遺伝子ＤＮＡ断片を用いたラクテートデヒドロゲナーゼ破壊株の作製方法の一例を説明する。
【００１７】
本発明のラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子ＤＮＡ断片は、コリネ型細菌の染色体ＤＮＡ、具体的には、ブレビバクテリウム・フラバム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍｆｌａｖｕｍ）ＭＪ−２３３（ＦＥＲＭＢＰ−１４９７）株等の染色体ＤＮＡから以下に述べる方法で単離、塩基配列決定することができる。
【００１８】
まず、上記コリネ型細菌、例えばブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３を常法［例えば、特開昭５１−１３０５９２参照］に従い培養し、培養物から菌体を集め、該菌体から染色体ＤＮＡを抽出する。染色体ＤＮＡは、例えば、特開平５−１５３７８の実施例１（Ａ）に記載の方法等により菌体から容易に抽出することができる。
【００１９】
上記菌株より染色体ＤＮＡを抽出する際には、適当な培地で培養した該菌株の菌体を使用することができるが、培養した菌体を集菌後に凍結保存した保存試料を使用することも可能である。
【００２０】
枯草菌（バチルス・サチリス）等のラクテートデヒドロゲナーゼの一次構造（アミノ酸配列）の相同性の高い部分から逆翻訳したオリゴデオキシリボヌクレオチドをプライマーとしてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行い、ラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子の部分断片を得る。このようなプライマーとしては、配列番号３および４に示すアミノ酸配列に相当する配列番号５および６に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドが挙げられる。配列番号３および４に示すアミノ酸配列は、後記実施例で詳述するように、枯草菌（バチルス・サチリス(Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ)）、ラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓｌａｃｔｉｓ）、マイコプラズマ・ハイオニューモニア（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、ストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｍｕｔａｎｓ）、ラクトバチルス・カゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｃａｓｅｉ）間で、それらが持つラクテートデヒドロゲナーゼのアミノ酸配列において保存されている領域から選択したものである。
【００２１】
ＰＣＲで得られたＤＮＡ断片を適当なクローニングベクター、例えばｐＧＥＭ−Ｔ（プロメガ社製）へサブクローニングし、エシェリヒア・コリＪＭ１０９株（宝酒造製）を形質転換する。この形質転換株を適当な抗生物質選択下で培養し、培養物から菌体を回収し、菌体から常法、例えばアルカリ−ＳＤＳ法によりプラスミドを抽出する。このプラスミドに挿入されたＤＮＡの塩基配列を決定することにより、本発明のラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子を含むＤＮＡ断片を取得することができる。
【００２２】
得られたＤＮＡ断片の塩基配列は、例えば、ジデオキシヌクレオチド酵素法［Dideoxy chain termination 法；Sanger, F. et al., Proc. Natl. Acad. sci. U.S.A., Vol.74, p.5463, (1977)］により決定することができる。
【００２３】
上記のようにして、後記実施例で得られたラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子の部分断片の塩基配列を決定し、アミノ酸配列に翻訳して解析した結果、ラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子の部分断片は、配列番号２記載のアミノ酸配列の８６番目から１７９番目までで示されるアミノ酸配列にあたる部分からなり、またそれをコードする遺伝子は、例えば、配列番号１記載の塩基配列中の２５６番目から５３７番目までの塩基配列で示される部分にあたるものであった。
【００２４】
ラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子全体を含むＤＮＡ断片を得るには、遺伝子の単離に関する公知のいずれの方法もが使用できるが、例えば、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３等のコリネ型細菌の染色体ＤＮＡライブラリーを作製し、上記ラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子部分断片をプローブとするハイブリダイゼーションにより、ラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子全体を含む染色体ＤＮＡを単離する方法が挙げられる。以下にその一例を説明する。
【００２５】
（Ａ）染色体ＤＮＡライブラリーの作製：
上記菌株より抽出した染色体ＤＮＡを適当な制限酵素、例えばＳａｕ３ＡＩを用いて部分分解し、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）等の宿主−ベクター系を用いて染色体ＤＮＡのライブラリーを作製する。具体的に使用し得るベクターとしては、例えばλＦＩＸＩＩ（東洋紡績（株）製）等のラムダファージベクター、ｐＵＣ１１８（宝酒造製）、ｐＢＲ３２２（宝酒造製）、コスミドｐＷＥ−１５（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）等のプラスミドベクターが挙げられる。
【００２６】
上記部分分解により得られる様々なＤＮＡ断片の上記ベクターへの挿入、例えばファージベクターλＦＩＸＩＩ（東洋紡績（株）製）への挿入は、適当な制限酵素、例えばＳａｕ３ＡＩで開裂したベクターと部分分解ＤＮＡ断片とをＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結することにより行うことができる。かくして染色体ＤＮＡライブラリーが得られる。
【００２７】
（Ｂ）ラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子を含むベクターの選別：
上記（Ａ）項で調製した染色体ＤＮＡライブラリーからラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子を含むベクターを選別するには、この染色体ＤＮＡライブラリーを用いて宿主微生物、例えばエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）の形質導入あるいは形質転換を行い、得られる形質導入体あるいは形質転換体から、適当な手段によりラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子を保持するクローンを選別すればよい。
【００２８】
具体的には、上記ファージベクターをエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）、例えばＰ２３９２株［Ａｕｓｕｂｅｌｅｔａｌ．，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．，Ｖｏｌ．７，ｐ．１５１３（１９７９）］に感染させ、これを寒天培地上に重層することによりプラークを形成させる。次いでこのプラーク中のファージＤＮＡをニトロセルロース膜に移し取り、このファージＤＮＡを該ニトロセルロース膜に固定し、前記のラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子の部分断片をプローブとして用いたプラークハイブリダイゼーション［ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ（１９８９）］を行う。こうして、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３株の染色体ＤＮＡ由来のラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子を有するファージベクターを含む形質導入体を検出し、選別することが可能である。
【００２９】
あるいは上記プラスミドベクターを用いて染色体ＤＮＡライブラリーを調製した場合には、このライブラリーＤＮＡでエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）ＪＭ１０９（宝酒造製）を形質転換し、得られた形質転換体から前記のラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子の部分断片をプローブとして用いたコロニーハイブリダイゼーション法［Ｒ．ＢｒｕｃｅＷａｌｌａｃｅ，ｅｔａｌ．，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．，Ｖｏｌ．９，ｐ．８７９（１９８１）］を行うことによっても選別可能である。
【００３０】
更に、上記のようにして選別された形質導入体あるいは形質転換体よりファージＤＮＡ、あるいはプラスミドＤＮＡを抽出し、挿入断片を適当な制限酵素でベクターから切り出すことで本発明のＤＮＡを取得することができる。
【００３１】
上記操作によって切り出されたＤＮＡ断片につき、前記のラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子の部分断片をプローブとして用いてサザンハイブリダイゼーション［Ｅ．Ｍ．Ｓｏｕｔｈｅｒｎ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，Ｖｏｌ．９８，ｐ．５０３（１９７５）］を行うことにより、ラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子が挿入ＤＮＡ断片内に存在することを再確認できる。
【００３２】
このようにして得られるＤＮＡ断片の１つとして、上記ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３株染色体ＤＮＡを制限酵素ＨｉｎｄIIIで切断して得られる、大きさが約４．８ｋｂのＤＮＡ断片を挙げることができる。さらに、上記ＤＮＡ断片の塩基配列を決定したところ、両断片中にはオープンリーディングフレームの存在が確認され、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３株のラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子のコード領域は、後記配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列中のアミノ酸番号１〜３１４の３１４個のアミノ酸配列をコードする９４５塩基対から構成されることがわかった。また、得られた塩基配列（配列番号１）には、前記のＰＣＲに用いたプライマーに相当する配列（配列番号５及び６）を含むことが確認された。
【００３３】
本発明におけるラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子は、天然の細菌、例えばコリネ型細菌の染色体ＤＮＡから分離されたもののみならず、通常用いられるＤＮＡ合成装置、例えばベックマン社製／オリゴ１０００ＭＤＮＡ合成装置（Oligo 1000M DNA Synthesizer）を用いて合成されたものであってもよい。
【００３４】
また、ラクテートデヒドロゲナーゼ活性を損なわない範囲で、配列番号２に示すアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列をコードするＤＮＡも、本発明に含まれる。ここで「数個」とは、好ましくは４０個以下、より好ましくは２０個以下である。
【００３５】
上記のようなＤＮＡの一態様として、例えば、配列表の配列番号１に記載の塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであって、かつ、ラクテートデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡが挙げられる。ここでいう「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。この条件を明確に数値化することは困難であるが、一例を示せば、相同性が高い核酸同士、例えば、６０％以上、好ましくは８０％以上の相同性を有するＤＮＡ同士がハイブリダイズし、それより相同性が低い核酸同士がハイブリダイズしない条件が挙げられる。
【００３６】
尚、後述するように、本発明のＤＮＡをコリネ型細菌のラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子破壊株の作製に用いる場合には、該ＤＮＡはラクテートデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードする必要はなく、生理的条件下、すなわち微生物細胞内で、染色体上のラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子と相同組換えを起こすことができ、それによってラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子を破壊することができる程度の相同性を有していればよい。このような相同性としては、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上の相同性が挙げられる。また、ラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子破壊株の作製に用いるＤＮＡは、染色体上のラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子と相同組換えを起こすことができ、それによってラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子を破壊することができる程度の大きさであれば、本発明のＤＮＡの一部であってもよい。ここで一部とは、好ましくは５０塩基以上、より好ましくは１００塩基以上の長さを有するものが挙げられる。
【００３７】
本発明のラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子は、例えば、ラクテートデヒドロゲナーゼやリンゴ酸の製造に用いることができる。すなわち、本発明のＤＮＡが導入された微生物、例えば本発明のＤＮＡがベクターに連結されてなる組換えベクターＤＮＡで形質転換された微生物は、ラクテートデヒドロゲナーゼを高生産することが予想される。
【００３８】
また、本発明のＤＮＡは、コリネ型細菌のラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子破壊株の作製に用いることができる。本発明のＤＮＡ又はその一部を用いたコリネ型細菌のラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子破壊法としては、該ＤＮＡをカナマイシン耐性遺伝子あるいはクロラムフェニコール耐性遺伝子等のマーカーと結合した後、電気パルス法(Electroporation)等により菌体内に導入した後、マーカーで選択することにより、相同組換えによって該ラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子部分断片を宿主微生物染色体上へ組み込むことが可能となる（Biosci. Biotech. Biochem., Vol.57, p.2036-2038, 1993）。
【００３９】
かくして得られる微生物から、ラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子破壊株を効率的に取得することができる。
上記のようにして得られるラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子破壊株は、実質的に活性のあるラクテートデヒドロゲナーゼを産生しないので、アミノ酸、有機酸等の各種ファインケミカルズの製造の際の乳酸の副生を低減することができる。
【００４０】
本発明の方法により製造されるアミノ酸としては、特に限定されないが、具体的にはリジン、トレオニン、イソロイシン、グルタミン酸等が挙げられる。また、本発明の方法により製造される有機酸としては乳酸以外のものであれば特に限定されないが、具体的にはコハク酸、フマル酸、クエン酸等が挙げられる。
【００４１】
【実施例】
以上に本発明を説明してきたが、下記の実施例によりさらに具体的に説明する。しかしながら、実施例は本発明の具体的な認識を得る一助とみなすべきのものであり、本発明の範囲を何等限定するものではない。
【００４２】
〔実施例１〕ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３由来のラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子断片の一部（Ａ断片）のクローン化およびその塩基配列の決定
【００４３】
（Ａ）ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３の全ＤＮＡの抽出
半合成培地Ａ培地［組成：尿素２ｇ、（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄ ７ｇ、Ｋ₂ＨＰＯ₄０．５ｇ、ＫＨ₂ＰＯ₄ ０．５ｇ、ＭｇＳＯ₄ ０．５ｇ、ＦｅＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ６ｍｇ、ＭｎＳＯ₄・４〜６Ｈ₂Ｏ６ｍｇ、酵母エキス２．５ｇ、カザミノ酸５ｇ、ビオチン２００μｇ、塩酸チアミン２００μｇ、グルコース２０ｇ、蒸留水１Ｌ］１Ｌに、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３（ＦＥＲＭＢＰ−１４９７）を対数増殖期後期まで培養し、菌体を集めた。得られた菌体を１０ｍｇ／ｍｌの濃度にリゾチームを含む１０ｍＭＮａＣｌ−２０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ８．０）−１ｍＭＥＤＴＡ・２Ｎａ溶液１５ｍｌに懸濁した。
【００４４】
次に、上記懸濁液にプロテナーゼＫを、最終濃度が１００μｇ／ｍｌになるように添加し、３７℃で１時間保温した。さらにドデシル硫酸ナトリウムを最終濃度が０．５％になるように添加し、５０℃で６時間保温して溶菌した。この溶菌液に、等量のフェノール／クロロホルム溶液を添加し、室温で１０分間ゆるやかに振盪した後、全量を遠心分離（５，０００×ｇ、２０分間、１０〜１２℃）し、上清画分を分取し、酢酸ナトリウムを０．３Ｍとなるように添加した後、２倍量のエタノールをゆっくりと加えた。水層とエタノール層の間に存在するＤＮＡをガラス棒でまきとり、７０％エタノールで洗浄した後、風乾した。得られたＤＮＡに１０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．５）−１ｍＭＥＤＴＡ・２Ｎａ溶液５ｍｌを加え、４℃で一晩静置し、鋳型ＤＮＡとして、ＰＣＲに使用した。
【００４５】
（Ｂ）プライマーの選択
ラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子は、原核生物では、バチルス・サチリス（Microbiology, 142, 3047-3056, 1996）、ラクトコッカス・ラクティス（J. Bacteriol., 174, 6956-6964, 1992）、マイコプラズマ・ハイオニューモニア（J. Gen. Microbiol., 139, 317-323, 1993）、ストレプトコッカス・ミュータンス（GenBank Database Accession No. M72545）、ラクトバチルス・カゼイ（Appl. Environ. Microbiol., 57, 2413-2417, 1991）等のものが知られている。これら５種の微生物のラクテートデヒドロゲナーゼにおいて保存されている領域を検討し、配列番号３および４のアミノ酸配列を基に、配列番号５および６に示す塩基配列を有する２つのプライマーを選択し、アプライド・バイオシステムズ（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）社製３９４ＤＮＡ／ＲＮＡシンセサイザー（ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ）を用いて合成した。
【００４６】
（配列番号５）CARAARCCNG GNGARAC
（配列番号６）TCNCCRTGYT CNCCNAT
（配列中、ＲはＡ又はＧ、ＹはＣ又はＴ、ＮはＡ、Ｇ、Ｃ又はＴを示し、ここでＡはアデニン、Ｇはグアニン、Ｃはシトシン、Ｔはチミンを示す。）
【００４７】
これら２つのプライマーを用いて上記（１）で調製した染色体を鋳型としてＰＣＲを行うと、ラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子が存在する限り、（ａ）と（ｂ）の組み合わせで約３００ｂｐの反応産物が得られると期待される。
【００４８】
（Ｃ）ＰＣＲ反応
ＰＣＲ反応はパーキンエルマーシータス社製のＤＮＡサーマルサイクラーを用いて下記の条件で行った。
【００４９】
反応液：
５０ｍＭＫＣｌ
１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．４）
１．５ｍＭＭｇＣｌ₂
鋳型ＤＮＡ５μｌ
上記（Ｂ）で作製したプライマー各々０．２５μＭ
ｄＮＴＰｓ各々２００μＭ
ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造）２．５ｕｎｉｔｓ
以上を混合し、１００μｌとした。
【００５０】
ＰＣＲサイクル：
デナチュレーション過程：９４℃ ６０秒
アニーリング過程：５５℃ １２０秒
エクステンション過程：７２℃ １８０秒
以上を１サイクルとし、３０サイクル行った。
【００５１】
（Ｄ）反応物の検出
上記（Ｃ）で生成した反応液１０μｌを２％アガロースゲルにより電気泳動を行って約３００ｂｐの断片の検出を行った。
【００５２】
（Ｅ）増幅断片のクローン化
上記（Ｃ）項で得た反応液３μｌと、ＰＣＲ産物クローニングベクターｐＧＥＭ−Ｔ（ＰＲＯＭＥＧＡより市販）１μｌを混合し、５０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．６）、１０ｍＭジチオスレイトール、１ｍＭＡＴＰ、１０ｍＭＭｇＣｌ2及びＴ4 ＤＮＡリガーゼ１ｕｎｉｔの各成分を添加し（各成分の濃度は最終濃度である）、４℃で１５時間反応させ、結合させた。
【００５３】
得られたプラスミド混液を用い、塩化カルシウム法（ＪｏｕｒｎａｌｏｆＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，５３，１５９，１９７０）によりエシェリヒア・コリＪＭ１０９（宝酒造製）を形質転換し、アンピシリン５０ｍｇを含む培地［トリプトン１０ｇ、イーストエキストラクト５ｇ、ＮａＣｌ５ｇ及び寒天１６ｇを蒸留水１Ｌに溶解］に塗抹した。
【００５４】
この培地上の生育株を常法により液体培養し、培養液よりプラスミドＤＮＡを抽出し、該プラスミドを制限酵素により切断し、挿入断片を確認した。この結果、プラスミドｐＧＥＭ−Ｔの長さ３．０ｋｂのＤＮＡ断片に加え、長さ約３００ｂｐの挿入断片が認められた。
【００５５】
（Ｆ）増幅断片の塩基配列の決定
（Ｅ）項で得られた長さが約３００ｂｐの増幅断片について、その塩基配列をジデオキシヌクレオチド酵素法（ｄｉｄｅｏｘｙｃｈａｉｎｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ法）（Ｓａｎｇｅｒ，Ｆ．ｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ, ７４，５４６３，１９７７）により決定した。その結果得られたＤＮＡ塩基配列およびその翻訳アミノ酸配列を配列表配列番号１および２に示す。本アミノ酸配列は、枯草菌、あるいは、ラクトバシルスのラクテートデヒドロゲナーゼのアミノ酸配列の一部分と高い相同性を示し、本ＤＮＡ断片がブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３株由来のラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子の部分断片であることが明らかになった。
【００５６】
［実施例２］ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３由来のラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子全体のクローン化およびその塩基配列の決定
（Ｇ）ゲノミック・サザンハイブリダイゼーション
上記（Ａ）項で得たブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３株の染色体ＤＮＡ溶液の９０μｌに制限酵素ＨｉｎｄIII、５０Ｕ（ｕｎｉｔｓ）を加え、３７℃で１時間反応させ完全分解し、アガロースゲル電気泳動に供した後、アガロースゲルよりＤＮＡをナイロン膜上に移し取った。前記（Ｅ）項で取得したラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子部分断片を、宝酒造製 Random Primer DNA Labeling Kit Ver.2 を用いて、Exo-free Klenow Fragment 及び［α−³²Ｐ］ｄＣＴＰによりラジオアイソトープラベル［Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１５８，３０７−３１５（１９８６）］した。アイソトープラベルされたプローブを用い、常法［ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ（１９８９）］に従ってサザンハイブリダイゼーションを行った。
【００５７】
その結果、ＨｉｎｄIII処理したものは上記ナイロン膜上の約４．８ｋｂの位置に、上記プローブが強くハイブリダイズするＤＮＡ断片の存在を確認した。
【００５８】
（Ｈ）ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３株の染色体ＤＮＡライブラリーの作製
上記（Ａ）項で得たブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３株の染色体ＤＮＡ溶液の９０μｌに制限酵素Ｓａｕ３ＡＩ５ｕｎｉｔｓを加え、３７℃で１０分間反応させて部分分解した。この様々な長さの部分分解ＤＮＡと、制限酵素ＸｈｏＩで切断後、ＤＮＡポリメラーゼクレノーフラグメント（Ｋｌｅｎｏｗｆｒａｇｍｅｎｔ）を用いてｄＴＴＰ（２’−デオキシチミジン５’−トリフォスフェート）、ｄＣＴＰ（２’−デオキシシチジン５’−トリフォスフェート）で切断末端を埋めたファージベクターλＦＩＸＩＩ（λＦＩＸＩＩ／ＸｈｏＩ−ｐａｒｔｉａｌｆｉｌｌ−ｉｎｔｒｅａｔｅｄＤＮＡ：東洋紡績（株）社製）とを混合し、５０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．６）、１０ｍＭジチオスレイトール、１ｍＭＡＴＰ、１０ｍＭＭｇＣｌ2、および、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ１ｕｎｉｔの各成分を添加し（各成分の濃度は最終濃度である）、１６℃で１０時間反応させて部分分解ＤＮＡとベクターとを連結させ、染色体ＤＮＡのλＤＮＡライブラリーを得た。
【００５９】
（Ｉ）目的組換え体ＤＮＡの選別
上記（Ｈ）項で作製したλＤＮＡライブラリーファージ溶液（２〜５×１０⁴ｐｆｕ；ＳＭ緩衝液希釈）と、エシェリヒア・コリＰ２３９２の培養液を当量混合し、３７℃で１５分間保温した。これに５０℃にて保温しておいた３〜４ｍｌのλ培地（１％トリプトン、０．５％酵母エキス、０．５％ＮａＣｌ、０．２％ＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ、０．５％寒天）を加え、λプレート（１％トリプトン、０．５％ＮａＣｌ、０．２％ＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ、１％寒天）に均一に塗布し、３７℃で１２〜１６時間培養した。
【００６０】
この培地上にニトロセルロースフィルターを載せ、培地上に形成されたプラークをフィルターに吸着させ、順次５分間ずつ以下イ）〜ハ）の試薬に浸した濾紙上にフィルターをのせて処理した。
【００６１】
イ）０．５ＭＮａＯＨ、１．５ＭＮａＣｌ
ロ）０．５ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１．５ＭＮａＣｌ、１ｍＭＥＤＴＡ
ハ）２×ＳＳＣ（２０×ＳＳＣ；ＮａＣｌ１７５．３ｇ，クエン酸三ナトリウム二水和物８８．２ｇを蒸留水１Ｌに溶解）
上記フィルターを風乾後、８０℃にて２時間乾熱処理をしてＤＮＡを固定した。
【００６２】
前記ラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子部分断片をプローブとして用い、上記で作製したフィルターにつきプラークハイブリダイゼーションを常法［ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ（１９８９）］に従って行った。
【００６３】
この結果、上記ラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子部分断片をプローブとしてハイブリダイゼーション陽性のプラークＬＤＨ２３３を選択した。ＬＤＨ２３３からファージＤＮＡを抽出し、制限酵素ＨｉｎｄIIIにより切断したところ、ゲノミック・サザンハイブリダイゼーションの結果と一致する、長さ約４．８ｋｂのＨｉｎｄIII挿入断片をアガロースゲル電気泳動により確認することができた。
【００６４】
（Ｊ）ラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子のサブクローニング：
上記（Ｉ）項で得られた長さが約４．８ｋｂのＨｉｎｄIII−ＤＮＡ断片上に存在するラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子の位置をさらに特定するために、該ＤＮＡ断片を下記のようにプラスミドｐＵＣ１１８（宝酒造（株）社製）へサブクローニングした。
【００６５】
上記ＬＤＨ２３３から抽出したファージＤＮＡからＨｉｎｄIIIで切り出されるＤＮＡ断片と、クローニングベクターｐＵＣ１１８（宝酒造（株）製）を、各々制限酵素ＨｉｎｄIIIで切断した後、脱リン酸化処理したものを混合し、５０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．６）、１０ｍＭジチオスレイトール、１ｍＭＡＴＰ、１０ｍＭＭｇＣｌ₂およびＴ４ＤＮＡリガーゼ１ｕｎｉｔの各成分を添加し（各成分の濃度は最終濃度である）、１６℃で１０時間反応させ、上記ＨｉｎｄIII断片とベクターを連結させた。
【００６６】
得られた連結反応液を用い、塩化カルシウム法［ＪｏｕｒｎａｌｏｆＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．５３，ｐ．１５９（１９７０）］によりエシェリヒア・コリＪＭ１０９（宝酒造（株）社製）を形質転換し、アンピシリン５０μｇ／ｍｌを含む培地［トリプトン１０ｇ、酵母エキス５ｇ、ＮａＣｌ５ｇおよび寒天１６ｇを蒸留水１Ｌに溶解］に塗抹した。
【００６７】
この培地上の生育株を常法により液体培養し、培養液よりプラスミドＤＮＡを抽出し、該プラスミドを各々制限酵素ＨｉｎｄIIIにより切断し、ハイブリダイゼーション法を用いて挿入断片を調べたところ、プラスミドｐＵＣ１１８の長さ３．４ｋｂのＤＮＡ断片に加え、長さ約４．８ｋｂのＨｉｎｄIII−ＤＮＡ断片が確認された。
【００６８】
上記で得られたプラスミドを各々ｐＵＣ１１８−ＬＤＨ２３３と命名し、該プラスミドで形質転換されたエシェリヒア・コリＪＭ１０９株（宝酒造（株）製）を各々、ＥＣＬＤＨ２３３と命名した。
【００６９】
（Ｋ）塩基配列の決定
上記（Ｊ）項で得られたラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子を含む長さが約４．８ｋｂのＤＮＡ（ＨｉｎｄIII−ＨｉｎｄIII）断片について、その塩基配列をｐＵＣ１１８（宝酒造（株）社製）を用いるジデオキシヌクレオチド酵素法（ｄｉｄｅｏｘｙｃｈａｉｎｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ法）［Ｓａｎｇｅｒ，Ｆ．ｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，Ｖｏｌ．７４，ｐ．５４６３，（１９７７）］により決定した。
【００７０】
塩基配列決定の結果、約４．８ｋｂのＤＮＡ（ＨｉｎｄIII−ＨｉｎｄIII）断片は、その塩基配列中のオープンリーデイングフレームの存在から、ラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子は、後記配列表の配列番号１に示す塩基配列を有し、３１４個のアミノ酸をコードする９４５塩基対より構成されることが判明した。この遺伝子がコードするアミノ酸配列を、配列番号２に示す。尚、この塩基配列の中には、実施例２の（Ｆ）項で決定した塩基配列に相当する配列が含まれていることが確認された。
【００７１】
〔実施例３〕ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３由来のラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子（ｌｄｈ遺伝子）の発現
（Ｌ）ＭＪ−２３３由来ラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子発現ベクターの構築実施例３で確認された９４５塩基対より構成される、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３由来ラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子のオープンリーディングフレームについて、エシェリヒア・コリ菌体内での発現を確認するため、該ＤＮＡ断片を下記のようにプラスミドｐＫＫ２２３−３（ファルマシア社製）へサブクローニングした。
【００７２】
まず、上記オープンリーディングフレームの両端に制限酵素ＳｍａＩの切断部位を連結したＤＮＡ断片を、下記に示すプライマーを用いてＰＣＲにより、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３株の染色体ＤＮＡを鋳型として増幅した。該ＰＣＲ断片とクローニングベクターｐＫＫ２２３−３（ファルマシア社製）を、各々制限酵素ＳｍａＩで切断した後、脱リン酸化処理したものを混合し、５０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．６）、１０ｍＭジチオスレイトール、１ｍＭＡＴＰ、１０ｍＭＭｇＣｌ₂およびＴ４ＤＮＡリガーゼ１ｕｎｉｔの各成分を添加し（各成分の濃度は最終濃度である）、１６℃で１０時間反応させ、上記ＳｍａＩ断片とベクターを連結させた。
【００７３】
（配列番号７）TCCCCCGGGA TGAAAGAAAC CGTCGGC
（配列番号８）TCCCCCGGGT CAGAAGAACT GCTTCTG
【００７４】
得られた連結反応液を用い、塩化カルシウム法［ＪｏｕｒｎａｌｏｆＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．５３，ｐ．１５９（１９７０）］によりエシェリヒア・コリＪＭ１０９（宝酒造（株）社製）を形質転換し、アンピシリン５０μｇ／ｍｌを含む培地［トリプトン１０ｇ，イーストエキストラクト５ｇ，ＮａＣｌ５ｇおよび寒天１６ｇを蒸留水１Ｌに溶解］に塗抹した。
【００７５】
この培地上の生育株を常法により液体培養し、培養液よりプラスミドＤＮＡを抽出し、該プラスミドを制限酵素ＳｍａＩにより切断し、アガロース電気泳動法を用いて挿入断片を調べたところ、プラスミドｐＫＫ２２３−３の長さ４．６ｋｂのＤＮＡ断片に加え、長さ約１ｋｂのＤＮＡ断片が確認された。
【００７６】
これらのプラスミドについて、１ｋｂの挿入断片の方向性の確認を行った。その結果、プラスミドｐＫＫ２２３−３上に存在するｔａｃプロモーターに対して、ｌｄｈ遺伝子のオープンリーディングフレームが順方向に挿入断片が挿入されたプラスミドを選択し、ｐＫＫ２２３−ＬＤＨ２３３と命名した。プラスミドｐＫＫ２２３−ＬＤＨ２３３でエシェリヒア・コリＪＭ１０９株を形質転換して得られた形質転換株をエシェリヒア・コリＥＣｔａｃＬＤＨ２３３と命名した。
【００７７】
（Ｍ）ラクテートデヒドロゲナーゼ酵素の製造および活性の確認
上記（Ｌ）で作製したエシェリヒア・コリＥＣｔａｃＬＤＨ２３３株をアンピシリン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ培地［トリプトン１０ｇ，酵母エキス５ｇ，ＮａＣｌ５ｇ）に植菌し、３７℃で１５時間好気的に振とう培養した。得られた培養物を遠心分離（３，０００×ｇ、４℃、２０分間）して菌体を回収後、ナトリウム−リン酸緩衝液［組成：50mM リン酸ナトリウム緩衝液(pH7.3)］で洗浄した。
【００７８】
次いで、洗浄菌体０．５ｇ（湿重量）を上記ナトリウム−リン酸緩衝液２ｍｌに懸濁し、氷冷下で超音波破砕器（ブランソン社製）にかけ菌体破砕物を得た。該破砕物を遠心分離（１０，０００×ｇ，４℃，３０分間）し、上清を粗酵素液として得た。対照として、エシェリヒア・コリＪＭ１０９株の粗酵素液を同様に調製し、以下の活性測定に供した。
【００７９】
ラクテートデヒドロゲナーゼ酵素活性の確認は、両粗酵素液について、ピルビン酸を基質とした乳酸の生成に伴い、補酵素ＮＡＤＨがＮＡＤ⁺に酸化されるのを、３４０ｎｍの吸光度変化として測定した［L.Kanarek and R.Ｌ.Hill, J. Biol. Chem.239, 4202 (1964)］。反応は、５０ｍＭカリウム−リン酸緩衝液(pH7.2)、１０ｍＭピルビン酸、０．４ｍＭＮＡＤＨ存在下、３７℃にて行った。その結果、エシェリヒア・コリＪＭ１０９株から調製された粗酵素液に対し、エシェリヒア・コリＥＣｔａｃＬＤＨ２３３から調製された粗酵素液は、約５０倍ラクテートデヒドロゲナーゼ活性を有していた。
【００８０】
〔実施例４〕ラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子部分断片を用いたブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３由来染色体ラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子の破壊
（Ｎ）遺伝子破壊に用いるプラスミドベクターの構築
上記（Ｅ）項で得たプラスミドを２０μｌについて、５０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．５）、１ｍＭジチオスレイトール、１０ｍＭＭｇＣｌ2_、１００ｍＭＮａＣｌ、制限酵素ＳｐｈＩおよびＳａｌＩ１ｕｎｉｔの各成分を添加し（各成分の濃度は最終濃度である）、３７℃で１時間反応させ、ラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子部分断片約３００ｂｐとｐＧＥＭ−Ｔベクター領域約３ｋｂの２つの断片を得た。得られたＤＮＡ溶液からＧｅｎｅＣｌｅａｎＩＩ（フナコシ社製）を用いて３００ｂｐ断片の回収を行い、該ＤＮＡ溶液１０μｌと、クロラムフェニコール耐性のクローニングベクターｐＨＳＧ３９６（宝酒造社製）１μｌのＳｐｈＩ、ＳａｌＩ分解物と混合し、５０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．６）、１０ｍＭジチオスレイトール、１ｍＭＡＴＰ、１０ｍＭＭｇＣｌ₂及びＴ4 ＤＮＡリガーゼ１ｕｎｉｔの各成分を添加し（各成分の濃度は最終濃度である）、４℃で１５時間反応させ、結合させた。
【００８１】
得られたプラスミド混液を用い、塩化カルシウム法（ＪｏｕｒｎａｌｏｆＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，５３，１５９，１９７０）によりエシェリヒア・コリＪＭ１０９（宝酒造製）を形質転換し、アンピシリン５０ｍｇを含む培地［トリプトン１０ｇ、イーストエキストラクト５ｇ、ＮａＣｌ５ｇ及び寒天１６ｇを蒸留水１Ｌに溶解］に塗抹した。
【００８２】
この培地上の生育株を常法により液体培養し、培養液よりプラスミドＤＮＡを抽出し、該プラスミドを制限酵素により切断し、挿入断片を確認した。この結果、プラスミドｐＨＳＧ３９６の長さ２．２ｋｂのＤＮＡ断片に加え、長さ約３００ｂｐの挿入断片が認められた。
【００８３】
（Ｏ）ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３株ラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子破壊株の作成
上記（Ｎ）項で得られたプラスミドはＭＪ−２３３菌体内で複製不可能なプラスミドである。該プラスミドを、電気パルス法（Ｒｅｓ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、Vol.144, p.181-185, 1993）によりブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３に導入し、クロラムフェニコール５μｇ／ｍｌを含む培地［尿素２ｇ、（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄ ７ｇ、ＫＨ₂ＰＯ₄ ０．５ｇ、Ｋ₂ＨＰＯ₄ ０．５ｇ、ＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ０．５ｇ、ＦｅＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ６ｍｇ、ＭｎＳＯ₄・４−５Ｈ₂Ｏ６ｍｇ、ビオチン２００μｇ、チアミン１００μｇ、イーストエキストラクト１ｇ、カザミノ酸１ｇ、グルコース２０ｇ、及び、寒天１６ｇを蒸留水１Ｌに溶解］に塗抹した。
【００８４】
この培地上の生育株を常法により液体培養し、培養液より染色体ＤＮＡを抽出し、以下に述べるゲノミックサザンハイブリダイゼーションにより染色体上のラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子の破壊を確認した。染色体ＤＮＡを適当な制限酵素で分解した後、ナイロンフィルター（ＨｙｂｏｎｄＮアマシャム社製）にブロッティングし、上記で得た３００ｂｐのラクテートデヒドロゲナーゼ部分断片をプローブとしてランダムプライマーラベリングキット（³²Ｐ［ｄＣＴＰ］使用）（宝酒造社製）によりラベル化し、ゲノミックサザンハイブリダイゼーションを行った。野生株より抽出した染色体ＤＮＡを用いたゲノミックサザンハイブリダイゼーションのパターンと比較して、遺伝子破壊株のパターンは（Ｎ）項で導入したプラスミド２．５ｋｂ分長いバンドが検出され、染色体上のラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子の破壊が確認できた。このようにして得られたラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子の破壊株をブレビバクテリウム・フラバムＥＳΔｌｄｈ：ｃａｔ１と命名した。
【００８５】
（Ｐ）ラクテートデヒドロゲナーゼ酵素の製造および活性の確認
上記（Ｏ）で作製したブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３−Δｌｄｈ：ｃａｔ１株をクロラムフェニコール５μｇ／ｍｌを含む培地［尿素２ｇ、（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄ ７ｇ、ＫＨ₂ＰＯ₄ ０．５ｇ、Ｋ₂ＨＰＯ₄ ０．５ｇ、ＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ０．５ｇ、ＦｅＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ６ｍｇ、ＭｎＳＯ₄・４−５Ｈ₂Ｏ６ｍｇ、ビオチン２００μｇ、チアミン１００μｇ、イーストエキストラクト１ｇ、カザミノ酸１ｇ、グルコース２０ｇ、及び、寒天１６ｇを蒸留水１Ｌに溶解］に植菌し、３０℃で１５時間好気的に振とう培養した。得られた培養物を遠心分離（３，０００×ｇ、４℃、２０分間）して菌体を回収後、ナトリウム−リン酸緩衝液［組成：50mM リン酸ナトリウム緩衝液(pH7.3)］で洗浄した。
【００８６】
次いで、洗浄菌体０．５ｇ（湿重量）を上記ナトリウム−リン酸緩衝液２ｍｌに懸濁し、氷冷下で超音波破砕器（ブランソン社製）にかけ菌体破砕物を得た。該破砕物を遠心分離（１０，０００×ｇ，４℃，３０分間）し、上清を粗酵素液として得た。対照として、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３−ＥＳ株の粗酵素液を同様に調製し、以下の活性測定に供した。
【００８７】
ラクテートデヒドロゲナーゼ酵素活性の確認は、両粗酵素液について、ピルビン酸を基質とした乳酸の生成に伴い、補酵素ＮＡＤＨがＮＡＤ⁺に酸化されるのを、３４０ｎｍの吸光度変化として測定した［L.Kanarek and R.Ｌ.Hill, J. Biol. Chem.239, 4202 (1964)］。反応は、５０ｍＭカリウム−リン酸緩衝液(pH7.2)、１０ｍＭピルビン酸、０．４ｍＭＮＡＤＨ存在下、３７℃にて行った。その結果、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３−ＥＳ株から調製された粗酵素液におけるラクテートデヒドロゲナーゼ活性に対し、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３−Δｌｄｈ：ｃａｔ１株から調製された粗酵素液におけるラクテートデヒドロゲナーゼ活性は、１０分の１以下であった。
【００８８】
【発明の効果】
本発明のＤＮＡおよびそれを含む組換えベクターは、微生物のラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子破壊株の作製に用いることができる。ラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子破壊株を用いると、培養中の酸素濃度の調節等の操作を行わなくても、アミノ酸、有機酸等の各種ファインケミカルズの製造の際の乳酸の副生を低減することができる。
【００８９】
また、本発明のＤＮＡは、ラクテートデヒドロゲナーゼの製造に利用することができる。
【００９０】
【配列表】

【００９１】

【００９２】

【００９３】

【００９４】

【００９５】

【００９６】

【００９７】

[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a DNA fragment encoding lactate dehydrogenase and a method for producing a lactate dehydrogenase gene-disrupted strain using the same. More specifically, the present invention relates to a method for producing a lactate dehydrogenase gene-disrupted strain based on the principle of homologous recombination with a DNA fragment encoding lactate dehydrogenase derived from coryneform bacteria such as Brevibacterium flavum and chromosomal DNA using the same.
[0002]
Lactic acid is a by-product in the production of various fine chemicals such as amino acids and organic acids.
[0003]
[Prior art]
Lactate dehydrogenase is an enzyme that produces lactic acid by reducing pyruvic acid using nicotinamide, adenine, dinucleotide (NADH) as a coenzyme, but using microorganisms such as Escherichia coli or coryneform bacteria, lysine, threonine, If various fine chemicals such as amino acids such as isoleucine and glutamic acid and organic acids such as succinic acid, fumaric acid and citric acid are to be produced, it will cause lactic acid and the like as by-products. Thus, conventionally, for example, as a method for suppressing the production of lactic acid as a by-product in lysine production, a method for suppressing the production of lactic acid by sufficiently maintaining the oxygen supply concentration during culture has been known (K. Akashi et al. , Agric. Biol. Chem., 43, 2087, 1979).
[0004]
[Problems to be solved by the invention]
However, the above method requires a cumbersome operation of controlling the oxygen concentration during the cultivation of the microorganism used for the production of fine chemicals, resulting in a reduction in work efficiency when trying to produce fine chemicals. Thus, it has been desired to obtain a strain that has reduced or lacked lactate dehydrogenase activity and does not need to control the oxygen concentration in order to suppress lactic acid production.
[0005]
As a microorganism strain having a disrupted lactate dehydrogenase gene, Escherichia coli (J. Bacteriol., Vol.153, p.588-596) is known. It is a method that requires complicated experimental operations to screen from strains that have been mutated by the mutagenesis method, and has been obtained for coryneform bacteria that are industrially important in the production of fine chemicals such as amino acids or organic acids. There is no example, and a simple method for obtaining a coryneform bacterium having a disrupted lactate dehydrogenase gene has been desired.
[0006]
[Means for Solving the Problems]
As a result of intensive studies to solve the above problems, the present inventors succeeded in isolating lactate dehydrogenase gene DNA from coryneform bacteria by making full use of genetic recombination techniques, and the DNA fragment It was found that a lactate dehydrogenase gene-disrupted strain can be efficiently produced by using, and the present invention has been completed.
[0007]
That is, the gist of the present invention resides in DNA encoding the protein shown in (A) or (B) below.
(A) A protein having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2.
(B) A protein having an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 and having lactate dehydrogenase activity.
[0008]
Specific examples of the DNA include DNA shown in the following (a) or (b).
(A) DNA containing the base sequence shown in SEQ ID NO: 1.
(B) A DNA that hybridizes with a DNA having the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 under a stringent condition and encodes a protein having lactate dehydrogenase activity.
[0009]
The present invention also provides a recombinant vector DNA obtained by ligating the DNA to a vector, the DNA of SEQ ID NO: 1, or a DNA that hybridizes with this DNA under stringent conditions, or a part thereof. The recombinant vector DNA thus prepared is provided.
[0010]
The present invention further provides a microbial lactate dehydrogenase gene-disrupted strain in which the lactate dehydrogenase gene is disrupted by homologous recombination between the DNA or the recombinant vector DNA and the lactate dehydrogenase gene on the chromosomal DNA of the microbial cell.
[0011]
The present invention also provides a method for producing an amino acid or an organic acid, comprising culturing the lactate dehydrogenase gene-disrupted strain in a medium and collecting an amino acid or an organic acid (excluding the organic acid) from the culture. .
[0012]
Examples of the parent strain of the lactate dehydrogenase gene disruption strain include coryneform bacteria, more specifically, Brevibacterium flavum MJ-233 strain.
The term “lactate dehydrogenase (EC 1.1.1.27)” in the present invention means an enzyme that produces lactic acid by reducing pyruvic acid using nicotinamide adenine dinucleotide (NADH) as a coenzyme. . In the present specification, DNA encoding lactate dehydrogenase may be referred to as “lactate dehydrogenase gene” for convenience.
Hereinafter, the present invention will be described in detail.
[0013]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
The DNA of the present invention is a gene encoding lactate dehydrogenase, and is a DNA encoding the protein shown in the above (A) or (B).
[0014]
Since the base sequence of the lactate dehydrogenase gene of the present invention has been determined by the present invention, it can be synthesized based on this sequence, but in the present invention, it is obtained for the first time by cloning from a coryneform bacterium. It is a thing. The source of the lactate dehydrogenase gene is not particularly limited as long as it is a coryneform bacterium having lactate dehydrogenase activity.
[0015]
Examples of such coryneform bacteria include Corynebacterium glutamicum, Brevibacterium lactofermentum, Brevibacterium ammoniagenes, Brevibacterium flavum, and the like. More specifically, for example, Brevibacterium flavum MJ-233 strain can be mentioned. This strain was deposited on April 28, 1975, by the Ministry of International Trade and Industry, Institute of Industrial Science, Microbial Industrial Technology Research Institute (currently Biotechnology Industrial Technology Research Institute) as Microtechnical Bacteria No. 3068. It was transferred to an international deposit based on the Budapest Treaty on the 1st, and deposited with the accession number of the Fine Art Institute Article 1497 (FERM BP-1497).
[0016]
Hereinafter, an example of a method for obtaining a lactate dehydrogenase gene DNA fragment from the microorganism and an example of a method for producing a lactate dehydrogenase-disrupted strain using the gene DNA fragment will be described.
[0017]
The lactate dehydrogenase gene DNA fragment of the present invention is a method described below from chromosomal DNA of a coryneform bacterium, specifically, chromosomal DNA such as Brevibacterium flavum MJ-233 (FERM BP-1497). Can be isolated and sequenced.
[0018]
First, the coryneform bacterium such as Brevibacterium flavum MJ-233 is cultured according to a conventional method [see, for example, JP-A-51-130592], the cells are collected from the culture, and the chromosomal DNA is extracted from the cells. To do. Chromosomal DNA can be easily extracted from the cells by, for example, the method described in Example 1 (A) of JP-A-5-15378.
[0019]
When extracting chromosomal DNA from the above strain, cells of the strain cultured in an appropriate medium can be used, but it is also possible to use a stored sample that has been cultured and cryopreserved after collection. It is.
[0020]
Polymerase chain reaction (PCR) was performed using oligodeoxyribonucleotides back-translated from a highly homologous portion of the primary structure (amino acid sequence) of lactate dehydrogenase such as Bacillus subtilis, and a partial fragment of lactate dehydrogenase gene was obtained. obtain. Examples of such a primer include oligonucleotides having the base sequences shown in SEQ ID NOs: 5 and 6 corresponding to the amino acid sequences shown in SEQ ID NOs: 3 and 4. The amino acid sequences shown in SEQ ID NOs: 3 and 4, as described in detail in Examples below, are Bacillus subtilis, Lactococcus lactis, Mycoplasma hyopneumonia (Mycoplasma hyopneumonia). ), Streptococcus mutans, and Lactobacillus casei, which are selected from regions conserved in the amino acid sequence of lactate dehydrogenase that they have.
[0021]
The DNA fragment obtained by PCR is subcloned into an appropriate cloning vector such as pGEM-T (Promega), and Escherichia coli JM109 strain (Takara Shuzo) is transformed. This transformed strain is cultured under the selection of an appropriate antibiotic, the cells are collected from the culture, and the plasmid is extracted from the cells by a conventional method, for example, alkali-SDS method. By determining the base sequence of the DNA inserted into this plasmid, a DNA fragment containing the lactate dehydrogenase gene of the present invention can be obtained.
[0022]
The base sequence of the obtained DNA fragment is, for example, the dideoxynucleotide enzyme method [Dideoxy chain termination method; Sanger, F. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol.74, p.5463, (1977 )].
[0023]
As described above, the base sequence of the partial fragment of the lactate dehydrogenase gene obtained in the examples described later was determined, translated into an amino acid sequence, and analyzed. As a result, the partial fragment of the lactate dehydrogenase gene was converted into the amino acid described in SEQ ID NO: 2. It consists of a portion corresponding to the amino acid sequence shown by the 86th to 179th positions of the sequence, and the gene encoding it is, for example, a portion shown by the 256th to 537th base sequences in the base sequence described in SEQ ID NO: 1 It was a hit.
[0024]
To obtain a DNA fragment containing the entire lactate dehydrogenase gene, any known method for gene isolation can be used. For example, a chromosomal DNA library of a coryneform bacterium such as Brevibacterium flavum MJ233 is prepared. And a method of isolating chromosomal DNA containing the entire lactate dehydrogenase gene by hybridization using the above-mentioned lactate dehydrogenase gene partial fragment as a probe. One example will be described below.
[0025]
(A) Preparation of chromosomal DNA library:
Chromosomal DNA extracted from the above strain is partially decomposed using an appropriate restriction enzyme such as Sau3AI, and a chromosomal DNA library is prepared using a host-vector system such as Escherichia coli. Specific examples of vectors that can be used include lambda phage vectors such as λFIXII (Toyobo Co., Ltd.), plasmids such as pUC118 (Takara Shuzo), pBR322 (Takara Shuzo), and cosmid pWE-15 (Stratagene). Vector.
[0026]
Various DNA fragments obtained by the above partial degradation can be inserted into the above vector, for example, into the phage vector λFIXII (manufactured by Toyobo Co., Ltd.) by using a vector cleaved with an appropriate restriction enzyme such as Sau3AI and a partially degraded DNA fragment. Can be performed using T4 DNA ligase. A chromosomal DNA library is thus obtained.
[0027]
(B) Selection of vector containing lactate dehydrogenase gene:
In order to select a vector containing a lactate dehydrogenase gene from the chromosomal DNA library prepared in the above section (A), the chromosomal DNA library is used to transduce or transform a host microorganism such as Escherichia coli. And a clone carrying the lactate dehydrogenase gene may be selected from the resulting transductant or transformant by an appropriate means.
[0028]
Specifically, the phage vector is Escherichia coli, for example, the P2392 strain [Ausubel et al. Nucleic Acids Res. , Vol. 7, p. 1513 (1979)], and plaques are formed by overlaying this on an agar medium. Subsequently, the phage DNA in the plaque was transferred to a nitrocellulose membrane, the phage DNA was immobilized on the nitrocellulose membrane, and plaque hybridization using the partial fragment of the lactate dehydrogenase gene as a probe [Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory] Press (1989)]. In this way, it is possible to detect and select a transductant containing a phage vector having a lactate dehydrogenase gene derived from the chromosomal DNA of Brevibacterium flavum MJ233 strain.
[0029]
Alternatively, when a chromosomal DNA library is prepared using the plasmid vector, Escherichia coli JM109 (manufactured by Takara Shuzo) is transformed with the library DNA, and the lactate is obtained from the obtained transformant. Colony hybridization method using a partial fragment of dehydrogenase gene as a probe [R. Bruce Wallace, et al. Nucleic Acids Res. , Vol. 9, p. 879 (1981)].
[0030]
Furthermore, the DNA of the present invention can be obtained by extracting phage DNA or plasmid DNA from the transductant or transformant selected as described above, and cutting out the inserted fragment from the vector with an appropriate restriction enzyme. it can.
[0031]
Southern DNA hybridization using the partial fragment of the lactate dehydrogenase gene as a probe [E. M.M. Southern, J.M. Mol. Biol. , Vol. 98, p. 503 (1975)], it can be reconfirmed that the lactate dehydrogenase gene is present in the inserted DNA fragment.
[0032]
As one of the DNA fragments thus obtained, there can be mentioned a DNA fragment having a size of about 4.8 kb obtained by cleaving the chromosomal DNA of Brevibacterium flavum MJ233 strain with restriction enzyme HindIII. Furthermore, when the nucleotide sequence of the above DNA fragment was determined, the presence of an open reading frame was confirmed in both fragments, and the coding region of the lactate dehydrogenase gene of Brevibacterium flavum MJ233 strain was SEQ ID NO: 1 in the sequence listing below. It was found to be composed of 945 base pairs encoding 314 amino acid sequences of amino acid numbers 1 to 314 in the amino acid sequence shown in FIG. In addition, it was confirmed that the obtained base sequence (SEQ ID NO: 1) includes sequences (SEQ ID NOs: 5 and 6) corresponding to the primers used in the PCR.
[0033]
The lactate dehydrogenase gene in the present invention is not limited to those isolated from the chromosomal DNA of natural bacteria, such as coryneform bacteria, but is also a commonly used DNA synthesizer such as Beckman / Oligo 1000M DNA Synthesizer. ) May be synthesized.
[0034]
In addition, a DNA encoding an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted, or added in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 within a range not impairing lactate dehydrogenase activity is also included in the present invention. Here, “several” is preferably 40 or less, more preferably 20 or less.
[0035]
As one embodiment of the DNA as described above, for example, a DNA that hybridizes under stringent conditions with a DNA having the base sequence set forth in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing and having a lactate dehydrogenase activity Examples include DNA encoding. The “stringent conditions” referred to herein are conditions under which so-called specific hybrids are formed and non-specific hybrids are not formed. Although it is difficult to quantify this condition clearly, for example, nucleic acids with high homology, for example, DNAs having homology of 60% or more, preferably 80% or more hybridize, Examples include conditions under which nucleic acids having lower homology do not hybridize.
[0036]
As will be described later, when the DNA of the present invention is used to produce a lactate dehydrogenase gene disrupted strain of coryneform bacteria, the DNA does not need to encode a protein having lactate dehydrogenase activity, and under physiological conditions, That is, it is sufficient that homologous recombination with the lactate dehydrogenase gene on the chromosome can occur in the microbial cell, and the lactate dehydrogenase gene can be destroyed thereby. Such homology is preferably 90% or more, more preferably 95% or more. In addition, the DNA used for the preparation of the lactate dehydrogenase gene disruption strain can be homologous recombination with the lactate dehydrogenase gene on the chromosome, so long as the lactate dehydrogenase gene can be destroyed. It may be part of the DNA of the invention. Here, the term “part” includes those having a length of preferably 50 bases or more, more preferably 100 bases or more.
[0037]
The lactate dehydrogenase gene of the present invention can be used, for example, for the production of lactate dehydrogenase or malic acid. That is, a microorganism into which the DNA of the present invention has been introduced, for example, a microorganism transformed with a recombinant vector DNA in which the DNA of the present invention is linked to a vector, is expected to produce lactate dehydrogenase at a high yield.
[0038]
Further, the DNA of the present invention can be used for production of a lactate dehydrogenase gene disrupted strain of coryneform bacteria. As a method for disrupting a lactate dehydrogenase gene of coryneform bacteria using the DNA of the present invention or a part thereof, the DNA is combined with a marker such as a kanamycin resistance gene or a chloramphenicol resistance gene, and then an electric pulse method (Electroporation) After being introduced into the microbial cells by the like, the lactate dehydrogenase gene partial fragment can be incorporated into the host microorganism chromosome by homologous recombination by selecting with a marker (Biosci. Biotech. Biochem., Vol. 57, p.2036-2038, 1993).
[0039]
A lactate dehydrogenase gene-disrupted strain can be efficiently obtained from the microorganism thus obtained.
Since the lactate dehydrogenase gene-disrupted strain obtained as described above does not produce a substantially active lactate dehydrogenase, it can reduce the by-product of lactic acid during the production of various fine chemicals such as amino acids and organic acids. .
[0040]
The amino acid produced by the method of the present invention is not particularly limited, and specific examples include lysine, threonine, isoleucine, glutamic acid and the like. The organic acid produced by the method of the present invention is not particularly limited as long as it is other than lactic acid, and specific examples include succinic acid, fumaric acid, citric acid and the like.
[0041]
【Example】
Although the present invention has been described above, it will be described more specifically with the following examples. However, the examples should be regarded as an aid for obtaining specific recognition of the present invention, and are not intended to limit the scope of the present invention in any way.
[0042]
[Example 1] Cloning of part of a lactate dehydrogenase gene fragment (A fragment) derived from Brevibacterium flavum MJ-233 and determination of its base sequence
[0043]
(A) Extraction of total DNA of Brevibacterium flavum MJ-233
Semi-synthetic medium A medium [composition: urea 2 g, (NH_Four)₂SO_Four 7g, K₂HPO_Four0.5g, KH₂PO_Four 0.5g, MgSO_Four 0.5g, FeSO_Four・ 7H₂O 6mg, MnSO_Four・ 4-6H₂O 6 mg, yeast extract 2.5 g, casamino acid 5 g, biotin 200 μg, thiamine hydrochloride 200 μg, glucose 20 g, distilled water 1 L] to 1 L Brevibacterium flavum MJ-233 (FERM BP-1497) until the late logarithmic growth phase The cells were cultured and the cells were collected. The obtained cells were suspended in 15 ml of 10 mM NaCl-20 mM Tris buffer (pH 8.0) -1 mM EDTA · 2Na solution containing lysozyme at a concentration of 10 mg / ml.
[0044]
Next, proteinase K was added to the suspension so that the final concentration was 100 μg / ml, and the mixture was incubated at 37 ° C. for 1 hour. Further, sodium dodecyl sulfate was added to a final concentration of 0.5%, and the mixture was incubated at 50 ° C. for 6 hours for lysis. After adding an equal amount of phenol / chloroform solution to this lysate and shaking gently at room temperature for 10 minutes, the whole amount was centrifuged (5,000 × g, 20 minutes, 10 to 12 ° C.) to obtain a supernatant fraction. The fraction was collected and sodium acetate was added to a concentration of 0.3 M, and then twice the amount of ethanol was slowly added. DNA existing between the aqueous layer and the ethanol layer was scraped off with a glass rod, washed with 70% ethanol, and then air-dried. To the obtained DNA, 5 ml of 10 mM Tris buffer (pH 7.5) -1 mM EDTA · 2Na solution was added and left overnight at 4 ° C., and used as template DNA for PCR.
[0045]
(B) Selection of primer
In prokaryotes, the lactate dehydrogenase gene is expressed in Bacillus subtilis (Microbiology, 142, 3047-3056, 1996), Lactococcus lactis (J. Bacteriol., 174, 6956-6964, 1992), Mycoplasma hyopneumonia (J Gen. Microbiol., 139, 317-323, 1993), Streptococcus mutans (GenBank Database Accession No. M72545), Lactobacillus casei (Appl. Environ. Microbiol., 57, 2413-2417, 1991), etc. Things are known. A region conserved in lactate dehydrogenase of these five microorganisms was examined, and based on the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 3 and 4, two primers having the nucleotide sequences shown in SEQ ID NOs: 5 and 6 were selected, Synthesis was performed using a 394 DNA / RNA synthesizer manufactured by Applied Biosystems.
[0046]
(SEQ ID NO: 5) CARAARCCNG GNGARAC
(SEQ ID NO: 6) TCNCCRTGYT CNCCNAT
(In the sequence, R represents A or G, Y represents C or T, N represents A, G, C or T, where A represents adenine, G represents guanine, C represents cytosine, and T represents thymine.)
[0047]
When PCR is performed using the chromosome prepared in (1) above as a template using these two primers, a reaction product of about 300 bp can be obtained by combining (a) and (b) as long as the lactate dehydrogenase gene is present. Be expected.
[0048]
(C) PCR reaction
The PCR reaction was performed under the following conditions using a DNA thermal cycler manufactured by Perkin Elmer Citas.
[0049]
Reaction solution:
50 mM KCl
10 mM Tris-HCl (pH 8.4)
1.5 mM MgCl₂
Template DNA 5μl
Each primer prepared in (B) above, 0.25 μM
dNTPs 200μM each
Taq DNA polymerase (Takara Shuzo) 2.5 units
The above was mixed to make 100 μl.
[0050]
PCR cycle:
Denaturation process: 94 ° C 60 seconds
Annealing process: 55 ° C 120 seconds
Extension process: 72 ° C 180 seconds
The above was regarded as one cycle, and 30 cycles were performed.
[0051]
(D) Detection of reactant
10 μl of the reaction solution generated in (C) was electrophoresed on a 2% agarose gel to detect a fragment of about 300 bp.
[0052]
(E) Cloning of amplified fragments
3 μl of the reaction solution obtained in the above (C) and 1 μl of PCR product cloning vector pGEM-T (commercially available from PROMEGA) are mixed, 50 mM Tris buffer (pH 7.6), 10 mM dithiothreitol, 1 mM ATP, 10 mM MgCl 2 And each component of T4 DNA ligase 1 unit was added (the concentration of each component is the final concentration) and reacted at 4 ° C. for 15 hours for binding.
[0053]
Using the obtained plasmid mixture, Escherichia coli JM109 (Takara Shuzo) was transformed by the calcium chloride method (Journal of Molecular Biology, 53, 159, 1970), and a medium containing 50 mg of ampicillin [tryptone 10 g, yeast extract 5 g Then, 5 g of NaCl and 16 g of agar were dissolved in 1 L of distilled water].
[0054]
The growing strain on this medium was subjected to liquid culture by a conventional method, plasmid DNA was extracted from the culture, and the plasmid was cleaved with a restriction enzyme to confirm the inserted fragment. As a result, in addition to the 3.0 kb DNA fragment of plasmid pGEM-T, an insertion fragment of about 300 bp in length was observed.
[0055]
(F) Determination of base sequence of amplified fragment
About the amplified fragment obtained in the item (E) and having a length of about 300 bp, its base sequence is converted into the dideoxy chain termination method (Sanger, F. et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 74, 5463, 1977). The resulting DNA base sequence and its translated amino acid sequence are shown in SEQ ID NOs: 1 and 2 in Sequence Listing. This amino acid sequence shows high homology with a part of the amino acid sequence of lactate dehydrogenase of Bacillus subtilis or Lactobacillus, and this DNA fragment is a partial fragment of the lactate dehydrogenase gene derived from Brevibacterium flavum MJ-233 strain Became clear.
[0056]
[Example 2] Cloning of the entire lactate dehydrogenase gene derived from Brevibacterium flavum MJ-233 and determination of its nucleotide sequence
(G) Genomic Southern hybridization
Restriction enzymes HindIII and 50U (units) were added to 90 μl of the chromosomal DNA solution of Brevibacterium flavum MJ-233 obtained in the above section (A), and reacted at 37 ° C. for 1 hour for complete decomposition, and agarose gel electrophoresis Then, DNA was transferred onto a nylon membrane from an agarose gel. Using the Random Primer DNA Labeling Kit Ver. 2 manufactured by Takara Shuzo, the lactate dehydrogenase gene partial fragment obtained in the above (E) section was used to prepare the Exo-free Klenow Fragment and [α-³²Radioisotope label [Anal. Biochem. 158, 307-315 (1986)]. Southern hybridization was performed using isotope-labeled probes according to a conventional method [Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)].
[0057]
As a result, it was confirmed that the HindIII-treated DNA fragment was strongly hybridized with the probe at a position of about 4.8 kb on the nylon membrane.
[0058]
(H) Preparation of chromosomal DNA library of Brevibacterium flavum MJ-233 strain
Restriction enzyme Sau3AI 5 units was added to 90 μl of the chromosomal DNA solution of Brevibacterium flavum MJ-233 strain obtained in the above section (A) and reacted at 37 ° C. for 10 minutes for partial degradation. This partially degraded DNA of various lengths, cleaved with the restriction enzyme XhoI, and then dTTP (2′-deoxythymidine 5′-triphosphate), dCTP (2′−) using a DNA polymerase Klenow fragment (Klenow fragment). A phage vector λFIXII (λFIXII / XhoI-partial-filled DNA: manufactured by Toyobo Co., Ltd.) in which the cleavage end was filled with deoxycytidine 5′-triphosphate was mixed, and 50 mM Tris buffer (pH 7. 6) Add 10 mM dithiothreitol, 1 mM ATP, 10 mM MgCl 2, and 1 unit of T4 DNA ligase (the concentration of each component is the final concentration), and react at 10 ° C. for 10 hours to cause partially degraded DNA and the vector. And connect It was obtained λDNA library of body DNA.
[0059]
(I) Selection of target recombinant DNA
The λDNA library phage solution prepared in the above item (H) (2-5 × 10^Fourpfu; SM buffer diluted) and an Escherichia coli P2392 culture solution were mixed in an equivalent amount and incubated at 37 ° C. for 15 minutes. 3-4 ml of λ medium (1% tryptone, 0.5% yeast extract, 0.5% NaCl, 0.2% MgSO) kept at 50 ° C._Four・ 7H₂O, 0.5% agar) and λ plate (1% tryptone, 0.5% NaCl, 0.2% MgSO)_Four・ 7H₂O, 1% agar) and cultured at 37 ° C. for 12-16 hours.
[0060]
A nitrocellulose filter was placed on this medium, and plaques formed on the medium were adsorbed on the filter, and the filter was placed on a filter paper soaked in the reagents (i) to (c) below for 5 minutes in sequence.
[0061]
A) 0.5M NaOH, 1.5M NaCl
B) 0.5 M Tris-HCl (pH 7.5), 1.5 M NaCl, 1 mM EDTA
C) 2 × SSC (20 × SSC; NaCl 175.3 g, trisodium citrate dihydrate 88.2 g dissolved in 1 L of distilled water)
The filter was air-dried and then heat-treated at 80 ° C. for 2 hours to immobilize DNA.
[0062]
Using the lactate dehydrogenase gene partial fragment as a probe, plaque hybridization was performed according to a conventional method [Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Press (1989)].
[0063]
As a result, a hybridization positive plaque LDH233 was selected using the lactate dehydrogenase gene partial fragment as a probe. When phage DNA was extracted from LDH233 and cleaved with restriction enzyme HindIII, a HindIII insert fragment of about 4.8 kb in length, which was consistent with the result of genomic Southern hybridization, could be confirmed by agarose gel electrophoresis.
[0064]
(J) Subcloning of lactate dehydrogenase gene:
In order to further specify the position of the lactate dehydrogenase gene present on the HindIII-DNA fragment having a length of about 4.8 kb obtained in the above item (I), the DNA fragment was converted into plasmid pUC118 (Takara Shuzo ( Subcloning into a product manufactured by Co., Ltd.
[0065]
A DNA fragment excised from HindIII from the phage DNA extracted from LDH233 and a cloning vector pUC118 (Takara Shuzo Co., Ltd.) were each digested with restriction enzyme HindIII and then dephosphorylated and mixed, and 50 mM Tris buffer was mixed. Solution (pH 7.6), 10 mM dithiothreitol, 1 mM ATP, 10 mM MgCl₂And each component of T4 DNA ligase 1 unit was added (the concentration of each component is the final concentration) and reacted at 16 ° C. for 10 hours to link the HindIII fragment and the vector.
[0066]
Using the obtained ligation reaction solution, the calcium chloride method [Journal of Molecular Biology, Vol. 53, p. 159 (1970)], Escherichia coli JM109 (manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd.) was transformed, and a medium containing 50 μg / ml of ampicillin [10 g tryptone, 5 g yeast extract, 5 g NaCl, and 16 g agar dissolved in 1 L distilled water] Smeared on.
[0067]
The growing strain on this medium was subjected to liquid culture by a conventional method, plasmid DNA was extracted from the culture, each plasmid was cleaved with the restriction enzyme HindIII, and the inserted fragment was examined using a hybridization method. As a result, plasmid pUC118 In addition to a DNA fragment of 3.4 kb in length, a HindIII-DNA fragment of about 4.8 kb in length was confirmed.
[0068]
Each of the plasmids obtained above was named pUC118-LDH233, and Escherichia coli JM109 strain (manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd.) transformed with the plasmid was named ECLDH233.
[0069]
(K) Determination of base sequence
The dideoxynucleotide enzymatic method using pUC118 (Takara Shuzo Co., Ltd.) for the base sequence of a DNA (HindIII-HindIII) fragment having a length of about 4.8 kb containing the lactate dehydrogenase gene obtained in (J) above. (Deoxychain termination method) [Sanger, F .; et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. , Vol. 74, p. 5463, (1977)].
[0070]
As a result of the base sequence determination, a DNA (HindIII-HindIII) fragment of about 4.8 kb has an open reading frame in the base sequence, so that the lactate dehydrogenase gene has the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing described later. It was found to be composed of 945 base pairs encoding 314 amino acids. The amino acid sequence encoded by this gene is shown in SEQ ID NO: 2. It was confirmed that this base sequence contained a sequence corresponding to the base sequence determined in Example (F) in Example 2.
[0071]
[Example 3] Expression of lactate dehydrogenase gene (ldh gene) derived from Brevibacterium flavum MJ-233
(L) Construction of MJ-233-derived lactate dehydrogenase gene expression vector Regarding the open reading frame of the Brevibacterium flavum MJ-233-derived lactate dehydrogenase gene composed of 945 base pairs confirmed in Example 3, Escherichia coli In order to confirm the expression in the microbial cells, the DNA fragment was subcloned into plasmid pKK223-3 (manufactured by Pharmacia) as follows.
[0072]
First, a DNA fragment in which the restriction enzyme SmaI cleavage sites were linked to both ends of the open reading frame was amplified by PCR using the primers shown below, using the chromosomal DNA of Brevibacterium flavum MJ-233 strain as a template. The PCR fragment and the cloning vector pKK223-3 (manufactured by Pharmacia) were each digested with the restriction enzyme SmaI and then dephosphorylated, and mixed, and 50 mM Tris buffer (pH 7.6), 10 mM dithiothreitol, 1 mM ATP, 10 mM MgCl₂And each component of T4 DNA ligase 1 unit was added (the concentration of each component is the final concentration), and the mixture was reacted at 16 ° C. for 10 hours to ligate the SmaI fragment and the vector.
[0073]
(SEQ ID NO: 7) TCCCCCGGGA TGAAAGAAAC CGTCGGC
(SEQ ID NO: 8) TCCCCCGGGT CAGAAGAACT GCTTCTG
[0074]
Using the obtained ligation reaction solution, the calcium chloride method [Journal of Molecular Biology, Vol. 53, p. 159 (1970)] is transformed into Escherichia coli JM109 (Takara Shuzo Co., Ltd.), and a medium containing 50 μg / ml of ampicillin [10 g tryptone, 5 g yeast extract, 5 g NaCl, and 16 g agar is dissolved in 1 L distilled water. ] Smeared.
[0075]
The growing strain on this medium was subjected to liquid culture by a conventional method, plasmid DNA was extracted from the culture, the plasmid was cleaved with restriction enzyme SmaI, and the inserted fragment was examined using agarose electrophoresis. Plasmid pKK223- In addition to a DNA fragment having a length of 4.6 kb, a DNA fragment having a length of about 1 kb was confirmed.
[0076]
For these plasmids, the orientation of the 1 kb insert was confirmed. As a result, a plasmid in which an insert fragment was inserted in the forward direction of the open reading frame of the ldh gene with respect to the tac promoter present on the plasmid pKK223-3 was selected and named pKK223-LDH233. A transformant obtained by transforming Escherichia coli JM109 strain with plasmid pKK223-LDH233 was designated Escherichia coli ECtacLDH233.
[0077]
(M) Production of lactate dehydrogenase enzyme and confirmation of activity
The Escherichia coli ECtacLDH233 strain prepared in the above (L) was inoculated into LB medium (10 g tryptone, 5 g yeast extract, 5 g NaCl) containing 50 μg / ml ampicillin, and cultured aerobically at 37 ° C. for 15 hours. . The obtained culture is centrifuged (3,000 × g, 4 ° C., 20 minutes) to recover the bacterial cells, and then sodium-phosphate buffer [composition: 50 mM sodium phosphate buffer (pH 7.3)]. Washed with.
[0078]
Next, 0.5 g (wet weight) of washed cells was suspended in 2 ml of the above sodium-phosphate buffer, and subjected to an ultrasonic crusher (manufactured by Branson) under ice cooling to obtain a crushed cell. The crushed material was centrifuged (10,000 × g, 4 ° C., 30 minutes), and the supernatant was obtained as a crude enzyme solution. As a control, a crude enzyme solution of Escherichia coli JM109 strain was similarly prepared and subjected to the following activity measurement.
[0079]
Confirmation of the lactate dehydrogenase enzyme activity was confirmed by confirming that the coenzyme NADH was converted to NAD for both crude enzyme solutions with the production of lactic acid using pyruvate as a substrate.⁺Oxidation was measured as an absorbance change at 340 nm [L. Kanarek and RL Hill, J. Biol. Chem. 239, 4202 (1964)]. The reaction was performed at 37 ° C. in the presence of 50 mM potassium-phosphate buffer (pH 7.2), 10 mM pyruvic acid, 0.4 mM NADH. As a result, the crude enzyme solution prepared from Escherichia coli ECtacLDH233 had an approximately 50-fold lactate dehydrogenase activity relative to the crude enzyme solution prepared from Escherichia coli JM109 strain.
[0080]
[Example 4] Disruption of a chromosomal lactate dehydrogenase gene derived from Brevibacterium flavum MJ-233 using a partial fragment of a lactate dehydrogenase gene
(N) Construction of plasmid vector used for gene disruption
About 20 μl of the plasmid obtained in the above (E), 50 mM Tris buffer (pH 7.5), 1 mM dithiothreitol, 10 mM MgCl 2_,Each component of 100 mM NaCl, restriction enzyme SphI and SalI 1 unit was added (the concentration of each component is the final concentration), reacted at 37 ° C. for 1 hour, about 300 bp of lactate dehydrogenase gene partial fragment and about 3 kb of pGEM-T vector region Obtained two fragments. A 300 bp fragment was recovered from the obtained DNA solution using Gene Clean II (manufactured by Funakoshi), and 10 μl of the DNA solution and 1 μl of a chloramphenicol resistant cloning vector pHSG396 (manufactured by Takara Shuzo) were decomposed into SphI and SalI. And mixed with 50 mM Tris buffer (pH 7.6), 10 mM dithiothreitol, 1 mM ATP, 10 mM MgCl₂And each component of T4 DNA ligase 1 unit was added (the concentration of each component is the final concentration) and reacted at 4 ° C. for 15 hours for binding.
[0081]
Using the resulting plasmid mixture, Escherichia coli JM109 (Takara Shuzo) was transformed by the calcium chloride method (Journal of Molecular Biology, 53, 159, 1970), and a medium containing 10 mg of ampicillin [tryptone 10 g, yeast extract 5 g Then, 5 g of NaCl and 16 g of agar were dissolved in 1 L of distilled water].
[0082]
The growing strain on this medium was subjected to liquid culture by a conventional method, plasmid DNA was extracted from the culture, and the plasmid was cleaved with a restriction enzyme to confirm the inserted fragment. As a result, in addition to the 2.2 kb DNA fragment of plasmid pHSG396, an inserted fragment of about 300 bp in length was observed.
[0083]
(O) Creation of Brevibacterium flavum MJ-233 strain lactate dehydrogenase gene disruption strain
The plasmid obtained in the above item (N) is a plasmid that cannot replicate in MJ-233 cells. The plasmid was introduced into Brevibacterium flavum MJ-233 by the electric pulse method (Res. Microbiol., Vol. 144, p.181-185, 1993), and a medium containing 5 μg / ml of chloramphenicol [urea 2g, (NH_Four)₂SO_Four 7g, KH₂PO_Four 0.5g, K₂HPO_Four 0.5g, MgSO_Four・ 7H₂O 0.5g, FeSO_Four・ 7H₂O 6mg, MnSO_Four・ 4-5H₂6 mg of O, 200 μg of biotin, 100 μg of thiamine, 1 g of yeast extract, 1 g of casamino acid, 20 g of glucose, and 16 g of agar were dissolved in 1 L of distilled water.
[0084]
Growing strains on this medium were subjected to liquid culture by a conventional method, chromosomal DNA was extracted from the culture solution, and disruption of the lactate dehydrogenase gene on the chromosome was confirmed by genomic Southern hybridization described below. Chromosomal DNA was digested with an appropriate restriction enzyme, then blotted onto a nylon filter (Hybond N Amersham), and a random primer labeling kit (using the 300 bp lactate dehydrogenase partial fragment obtained above as a probe)³²P [dCTP] used) (manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd.) for labeling and genomic Southern hybridization. Compared with the genomic Southern hybridization pattern using chromosomal DNA extracted from the wild strain, the pattern of the gene disrupted strain was detected as a 2.5 kb longer band of the plasmid introduced in (N), and lactate dehydrogenase on the chromosome was detected. The destruction of the gene was confirmed. The lactate dehydrogenase gene-disrupted strain thus obtained was designated Brevibacterium flavum ESΔldh: cat1.
[0085]
(P) Production of lactate dehydrogenase enzyme and confirmation of activity
Brevibacterium flavum MJ233-Δldh: cat1 strain prepared in (O) above was added to a medium containing 5 μg / ml of chloramphenicol [urea 2 g, (NH_Four)₂SO_Four 7g, KH₂PO_Four 0.5g, K₂HPO_Four 0.5g, MgSO_Four・ 7H₂O 0.5g, FeSO_Four・ 7H₂O 6mg, MnSO_Four・ 4-5H₂6 mg of O, 200 μg of biotin, 100 μg of thiamine, 1 g of yeast extract, 1 g of casamino acid, 20 g of glucose and 16 g of agar dissolved in 1 L of distilled water] and inoculated aerobically at 30 ° C. for 15 hours. . The obtained culture is centrifuged (3,000 × g, 4 ° C., 20 minutes) to recover the bacterial cells, and then sodium-phosphate buffer [composition: 50 mM sodium phosphate buffer (pH 7.3)]. Washed with.
[0086]
Next, 0.5 g (wet weight) of washed cells was suspended in 2 ml of the above sodium-phosphate buffer, and subjected to an ultrasonic crusher (manufactured by Branson) under ice cooling to obtain a crushed cell. The crushed material was centrifuged (10,000 × g, 4 ° C., 30 minutes), and the supernatant was obtained as a crude enzyme solution. As a control, a crude enzyme solution of Brevibacterium flavum MJ233-ES strain was similarly prepared and subjected to the following activity measurement.
[0087]
Confirmation of the lactate dehydrogenase enzyme activity was confirmed by confirming that the coenzyme NADH was converted to NAD for both crude enzyme solutions with the production of lactic acid using pyruvate as a substrate.⁺Oxidation was measured as an absorbance change at 340 nm [L. Kanarek and RL Hill, J. Biol. Chem. 239, 4202 (1964)]. The reaction was performed at 37 ° C. in the presence of 50 mM potassium-phosphate buffer (pH 7.2), 10 mM pyruvic acid, 0.4 mM NADH. As a result, in contrast to the lactate dehydrogenase activity in the crude enzyme solution prepared from Brevibacterium flavum MJ233-ES strain, the lactate dehydrogenase activity in the crude enzyme solution prepared from Brevibacterium flavum MJ233-Δldh: cat1 strain was It was 1/10 or less.
[0088]
【The invention's effect】
The DNA of the present invention and the recombinant vector containing the same can be used for the production of a lactate dehydrogenase gene disruption strain of a microorganism. By using a lactate dehydrogenase gene-disrupted strain, the by-product of lactic acid during the production of various fine chemicals such as amino acids and organic acids can be reduced without performing operations such as adjusting the oxygen concentration during the culture.
[0089]
Moreover, the DNA of the present invention can be used for the production of lactate dehydrogenase.
[0090]
[Sequence Listing]

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Claims

５０ｍＭカリウム−リン酸緩衝液(pH7.2)、１０ｍＭピルビン酸、０．４ｍＭＮＡＤＨ存在下、３７℃の条件下でのラクテートデヒドロゲナーゼ酵素活性が、親株のラクテートデヒドロゲナーゼ酵素活性と比較して１０分の１以下であるコリネ型細菌のラクテートデヒドロゲナーゼ活性低減株であって、コリネ型細菌の染色体ＤＮＡ上の下記のＤＮＡ：
配列番号１記載のＤＮＡ；又は
配列番号１記載のＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであって、かつ、ラクテートデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
の破壊により得られるコリネ型細菌のラクテートデヒドロゲナーゼ活性低減株。Lactate dehydrogenase enzyme activity in the presence of 50 mM potassium-phosphate buffer (pH 7.2), 10 mM pyruvate, 0.4 mM NADH at 37 ° C. is 1/10 compared to the lactate dehydrogenase enzyme activity of the parent strain. A lactate dehydrogenase activity-reducing strain of a coryneform bacterium, which is the following DNA on the chromosomal DNA of the coryneform bacterium:
DNA described in SEQ ID NO: 1 ; or DNA that hybridizes with the DNA described in SEQ ID NO: 1 under stringent conditions and that encodes a protein having lactate dehydrogenase activity
Lactate dehydrogenase activity-reducing strain of coryneform bacteria obtained by disruption of

コリネ型細菌の染色体ＤＮＡ上の下記のＤＮＡ：
配列番号１記載のＤＮＡ；又は
配列番号１記載のＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであって、かつ、ラクテートデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
の相同組換えにより得られる請求項１に記載のコリネ型細菌のラクテートデヒドロゲナーゼ活性低減株。 The following DNA on the chromosomal DNA of coryneform bacteria:
DNA according to SEQ ID NO: 1; or
DNA that hybridizes with the DNA of SEQ ID NO: 1 under stringent conditions and that encodes a protein having lactate dehydrogenase activity
The lactate dehydrogenase activity-reducing strain of coryneform bacterium according to claim 1, which is obtained by homologous recombination.

コリネ型細菌がブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３株であることを特徴とする請求項１または２に記載のラクテートデヒドロゲナーゼ活性低減株。3. The lactate dehydrogenase activity-reducing strain according to claim 1 or 2, wherein the coryneform bacterium is Brevibacterium flavum MJ-233 strain.

請求項１〜３のいずれか一項に記載のラクテートデヒドロゲナーゼ活性低減株を培地で培養し、その培養物からアミノ酸または乳酸以外の有機酸を採取することを特徴とする、アミノ酸または有機酸の製造方法。A lactate dehydrogenase activity-reducing strain according to any one of claims 1 to 3 is cultured in a medium, and an amino acid or an organic acid other than lactic acid is collected from the culture. Method.