JP4043925B2

JP4043925B2 - Biological material microarray reader and method

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Publication number: JP4043925B2
Application number: JP2002341244A
Authority: JP
Inventors: 竹昭甘川; 輝太石丸; 千穂伊藤; 千秋長浜
Original assignee: Mitsubishi Chemical Corp; Mitsubishi Rayon Co Ltd
Current assignee: Mitsubishi Chemical Corp; Mitsubishi Rayon Co Ltd
Priority date: 2001-12-05
Filing date: 2002-11-25
Publication date: 2008-02-06
Anticipated expiration: 2022-11-25
Also published as: JP2003262588A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、プローブを固定化して配列した生体関連物質マイクロアレイに、蛍光物質を付与した検体を反応させ、励起光を照射して、励起した蛍光の量を読み取る生体関連物質マイクロアレイ読取装置及び方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年、各種生物におけるゲノムプロジェクトが進められており、ヒト遺伝子をはじめとして、多数の遺伝子とその塩基配列が急速に明らかにされつつある。配列の明らかにされた遺伝子の機能については、各種の方法で調べることができる。その有力な方法の一つとして、明らかにされた塩基配列情報を利用した遺伝子発現解析が知られている。この解析方法においては、例えば、基板の表面、凹部、凸部またはキャピラリーの内壁部あるいはキャピラリー中空部に保持された高分子ゲル状物の区画の何れかに、例えば、異なる遺伝子ペプチド、タンパク質、抗体等の生体関連物質をプローブとして数十から数万個固定化したマイクロアレイを使用する。このプローブに対して、各種特異的反応を利用することにより、プローブとして使用された物質とその生体機能発現との関係を調べることができる。このような方法は、今日のゲノムプロジェクトを通して明らかにされつつあるような、一個体レベルという極めて多数の遺伝子の総合的・系統的解析を行うために、多数遺伝子の一括発現解析を可能とするＤＮＡマイクロアレイ法（ＤＮＡチップ法）と呼ばれる新しい分析法、ないし方法論として開発されてきた。
【０００３】
プローブと検体の反応物を検出する方法においては、まず、蛍光標識した検体と、マイクロアレイにプローブとして固定化された生体関連物質とを反応させる。次いで、蛍光レーザースキャナーや蛍光顕微鏡等の蛍光測定装置により蛍光量を検出することにより、蛍光標識された検体が、どのプローブと反応物を形成したかを検出することができる。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、検体の蛍光強度が低い場合や、マイクロアレイの配列の位置精度が低い場合には、検出された蛍光と、マイクロアレイにプローブとして固定化された生体関連物質との間の対応を正確認識することが困難であり、検体が、どのプローブとハイブリッドを形成したかを容易に正確に検出するのが困難であるという問題がある。
【０００５】
このような問題を解決するために、特許文献１にはマイクロアレイの読取方法が記載されている。この方法は、マイクロアレイにプローブとして固定化する生体関連物質の中に、検体を標識するための蛍光物質とは別の蛍光物質を予め混合しておき、プローブに混合された蛍光物質を励起して得られる蛍光を検出することによってスポットの位置を検出するものである。
【０００６】
しかしながら、この方法においては、マイクロアレイに固定化してプローブを形成する生体関連物質の中に、検体に付与する蛍光物質とは異なる蛍光物質を付与する必要がある。この生体関連物質に付与された、プローブの位置を予め検出するための蛍光物質は、本来検出すべき、検体に付与された蛍光物質の検出を行う際のノイズ源になるという問題がある。また、新たに生体関連物質に混合した蛍光物質を検出するためのフィルタ等、新たな光学系を構成する必要があるという問題もある。
【０００７】
本発明は、蛍光強度の低い検体や配列精度の低いアレイにおいても、プローブとして使用する生体関連物質に新たな物質を混合することなく、生体関連物質を固定化した検出すべき区画の位置及び／又は大きさの情報を正確に取得することができるマイクロアレイの読取装置及び方法を提供することを目的としている。
【０００８】
【特許文献１】
特開２００１−２７６０７号
【０００９】
【課題を解決するための手段】
上述した課題を解決するために、本発明は、蛍光物質が付与された検体を反応させた複数の区画を含む生体関連物質マイクロアレイから、蛍光物質が発する蛍光を読み取る読取装置であって、マイクロアレイに光を透過させる透過用光源と、区画に存在する蛍光物質を励起する励起用光源と、透過用光源から照射され、マイクロアレイを透過した光を撮像すると共に、励起用光源によって励起された蛍光物質から発せられる蛍光を撮像する撮像手段と、この撮像手段によって撮像された、マイクロアレイを透過した光の画像に基づいて、マイクロアレイ上に配置された区画の位置及び／又は大きさを検出する検出手段と、を有することを特徴としている。
【００１０】
また、マイクロアレイの区画以外の部分が不透明に構成されていることが好ましい。
【００１１】
さらには、マイクロアレイ上に配置された区画の位置から、区画を、撮像手段の視野内に移動させる手段を有していることを特徴としている。
【００１２】
次に、このマイクロアレイの区画に、蛍光物質が付与された検体を反応させ、マイクロアレイのプローブと検体の反応物を形成させる。次いで、このマイクロアレイに透過用光源から光が照射され、マイクロアレイを透過した透過光が撮像手段によって撮像される。
【００１３】
検出手段は、撮像された透過光の画像から、マイクロアレイ上の区画の位置及び／又は大きさを検出する。好ましくは、撮像された透過光の画像から、マイクロアレイ上の区画全体の位置を検出する。次いで、この検出したマイクロアレイ上の区画全体の中心位置が、撮像手段の視野中心位置と一致するように、マイクロアレイを移動する。次いで、再度マイクロアレイに透過用光源から光が照射され、マイクロアレイの区画を透過した透過光が撮像手段によって撮像され、撮像された透過光の画像から、マイクロアレイ上の区画の位置及び／又は大きさを検出する。
【００１４】
さらに、励起用光源からマイクロアレイに励起光が照射され、マイクロアレイ上に存在する蛍光物質を蛍光させる。この蛍光は、撮像手段によって撮像され、撮像された画像は、先に検出された区画の位置及び／又は大きさに基づいて解析される。
【００１５】
この構成により、マイクロアレイ上に形成された区画の位置及び／又は大きさを容易に認識することが可能になるので、区画を配置する位置精度が悪いマイクロアレイを使用した場合や、マイクロアレイから発せられる蛍光が微弱な場合においても、蛍光を正確に検出することができる。
【００１６】
検出手段が、撮像手段によって撮像された区画を透過した光の画像の一部分を選択し、この選択された部分の蛍光を検出するように構成するのが良い。
【００１７】
このように構成された本発明においては、透過光を撮像することによって検出された区画の画像であるスポットの一部分の画像情報を取り出し、その画像情報を基に解析を行う。この構成によれば、マイクロアレイ上の検出すべき蛍光物質以外から発せられる蛍光、例えば、マイクロアレイの区画以外の部分の材料から発せられる自家蛍光の影響を排除することができる。
【００１８】
好ましくは、検出手段は、マイクロアレイを透過した光を撮像する際の光学系と、蛍光物質から発せられた蛍光を撮像する際の光学系との差を補正する補正手段を更に有する。
【００１９】
このように構成された本発明においては、マイクロアレイを透過した光を撮像する際の光学系と、蛍光物質から発せられた蛍光を撮像する際の光学系が異なり、この光学系の相違により、画像にずれを生じるような場合においても、誤差なく区画の蛍光を検出することができる。
【００２０】
また、撮像手段はＣＣＤカメラで構成することができる。
【００２１】
さらに、透過用光源と励起用光源を、兼用としても良い。
【００２２】
また、透過用光源又は励起用光源は、発光手段と、この発光手段によって発光された光を導く光ファイババンドルと、によって構成することもできる。
【００２３】
このように構成された本発明においては、透過用光源又は励起用光源を任意の位置に配置することができ、また、光ファイバによって、光源が発する熱線がマイクロアレイに照射されるのを防止することができる。
【００２４】
さらに、透過用光源又は励起用光源を、ＬＥＤ光源によって構成することもできる。
【００２５】
このように構成された本発明においては、透過用光源又は励起用光源の寿命を長くすることができる。
【００２６】
また、本発明の生体関連物質マイクロアレイの読取方法は、蛍光物質が付与された検体を反応させた複数の区画を含む生体関連物質マイクロアレイを準備するステップと、マイクロアレイに光を照射し、マイクロアレイを透過した透過光を撮像するステップと、区画の位置及び／又は大きさを検出するステップと、マイクロアレイに励起光を照射してマクロアレイの区画に存在する蛍光物質を励起し、この蛍光物質から発せられる蛍光を撮像するステップと、このステップにおいて撮像された蛍光を、透過光に基づいて検出された区画の位置及び／又は大きさに基づいて読み取るステップと、を有することを特徴としている。
【００２７】
また、本発明の生体関連物質マイクロアレイの読取方法は、蛍光物質が付与された検体を反応させた複数の区画を含む生体関連物質マイクロアレイを準備するステップと、上記マイクロアレイに光を照射し、マイクロアレイを透過した透過光を撮像するステップと、このステップにおいて撮像された透過光に基づいて、区画の位置を撮像する視野内の適切な位置に移動させるステップと、再びマイクロアレイに光を照射し、マイクロアレイを透過した透過光を撮像するステップと、上記区画の位置及び／又は大きさを検出するステップと、マイクロアレイに励起光を照射してマクロアレイの区画に存在する蛍光物質を励起し、この蛍光物質から発せられる蛍光を撮像するステップと、このステップにおいて撮像された蛍光を、透過光に基づいて検出された上記区画の位置及び／又は大きさに基づいて読み取るステップと、を有することを特徴としている。
【００２８】
さらには、本発明のマイクロアレイ読取方法は、透過光に基づいて検出された区画の位置及び／又は大きさに基づいて、蛍光物質から発せられる蛍光を撮像した画像にマスクを施すことを特徴としている。
【００２９】
【発明の実施形態】
次に、添付図面を参照して、本発明の実施形態を説明する。図１は、本発明の第１又は第２の実施形態によるマイクロアレイの読取装置の概略構成図である。
【００３０】
また、図２は、本実施形態によるマイクロアレイの読取装置に使用されるマイクロアレイＡの平面図である。図１に示すように、本発明の第１実施形態によるマイクロアレイ読取装置１は、マイクロアレイＡを透過させる透過光を照射する透過用光源２と、蛍光物質を励起させるための光をマイクロアレイＡに照射する励起用光源６と、を有する。更に、マイクロアレイの読取装置１は、マイクロアレイＡを透過した透過光及びマイクロアレイＡ上の検体に付与された蛍光物質から発せられる蛍光を撮像する撮像手段であるＣＣＤカメラ４と、このＣＣＤカメラ４によって撮像された画像に基づいて、検体を解析する検出手段５と、を有する。
【００３１】
また、マイクロアレイの読取装置１は、所定の光を透過し又は反射させるダイクロックミラー８、吸収フィルタ１０、励起用フィルタ１２、及び、マイクロアレイＡに対する対物レンズ１４から構成される光学系を備えた顕微鏡１６を有する。さらに、マイクロアレイの読取装置１は、マイクロアレイＡを水平面内で所望の位置に移動させるＸＹステージ１８と、透過光光源２、ＣＣＤカメラ４、励起用光源６、ＣＣＤカメラ４に写されるマイクロアレイＡの像のピントを調節するため、ＸＹステージ１８又は対物レンズ１４を上下動させるフォーカスステージ（図示せず）、及び、ＸＹステージ１８等を制御する制御装置２０とを有する。
【００３２】
透過用光源２は、この光源が射出する光の光軸と、顕微鏡１６の光軸とが整合するように、ＸＹステージ１８の下方に配置されている。透過用光源２として、例えば、ハロゲンランプ、又はＬＥＤを複数個配列したＬＥＤアレイ光源を使用することができる。本実施形態では、透過用光源２として、ＬＥＤアレイ光源、ハロゲンランプが使用されている。
【００３３】
また、透過用光源２は、必ずしもＸＹステージ１８の下方に配置される必要はなく、ＸＹステージ１８の下方の位置以外の位置から適宜レンズ、ミラー等を介して顕微鏡１６の光軸と整合する方向に光を照射するように構成しても良い。あるいは、光源から光ファイババンドルを用いて、所定の位置まで光を導光しても良い。このように、光ファイババンドルを用いて導光した場合には、光ファイバによって光線の熱線を除去することができる。
【００３４】
また、各光ファイバの出射端をマイクロアレイＡの区画Ｃが配置された位置に合わせることにより、各区画Ｃに効率良く光を照射することができる。更に、光源にＬＥＤを使用した場合には、安定した光量、光源の長寿命化を実現することができる。
【００３５】
また、励起用光源６は、顕微鏡１６の鏡筒の側面から鏡筒内に光を射出するように配置されている。好ましくは、励起用光源６として、マイクロアレイＡ上の蛍光物質を励起することができる波長成分の光を多く含む光源を選択する。本実施形態に置いては、励起用光源６として、高圧水銀ランプが使用されている。
【００３６】
励起用フィルタ１２は、励起用光源６から射出された光の中の、マイクロアレイＡ上の蛍光物質を励起させることができる波長成分だけを透過し、それ以外の波長成分を遮断するように構成されている。また、吸収用フィルタ１０は、マイクロアレイＡから発せられる蛍光の波長の光を透過させ、蛍光物質を励起させる波長成分の光を透過させないように構成されている。ダイクロックミラー８は、励起用フィルタ１２を透過した、蛍光物質を励起させることができる波長成分の光を反射してマイクロアレイＡの方に差し向けるように構成され、配置されている。
【００３７】
また、このダイクロックミラー８は、マイクロアレイＡ上の蛍光物質から発せられた蛍光の波長の光を透過させるように構成されている。
【００３８】
本実施形態においては、蛍光物質としてＣｙ３を使用し、吸収フィルタ１０として、中心波長６１０ｎｍ、半値幅７５ｎｍのバンドパスフィルタが、励起用フィルタ１２として、中心波長５４５ｎｍ、半値幅３０ｎｍのバンドパスフィルタが、ダイクロックミラー８として、約５７０ｎｍ以下の波長の光を反射し、それ以上の波長の光を透過させるミラーが使用されている。なお、ダイクロックミラー８、吸収用フィルタ１０、及び、励起用フィルタ１２は、使用する蛍光物質の励起波長及び蛍光物質が発する蛍光の波長に合わせて選択、構成し、複数の蛍光物質を使用する場合には、顕微鏡１６において、容易に切替え可能に構成するのが良い。
【００３９】
ＣＣＤカメラ４は、その光軸が顕微鏡１６の光軸と整合するように、顕微鏡１６の鏡筒の、対物レンズ１４の反対側端部に取り付けられている。好ましくは、ＣＣＤカメラ４として、マイクロアレイＡから発せられる微弱な蛍光を、少ないノイズで撮像することができるように、カメラの冷却機能を備えた冷却ＣＣＤカメラを使用する。本実施形態においては、１３９２×１０４０有効画素を有し、−３０℃に冷却して使用するＣＣＤカメラが用いられている。また、本実施形態においては、顕微鏡１６は落射蛍光顕微鏡であり、倍率２倍の対物レンズを使用し、ＣＣＤカメラの手前に０.５倍のレンズを挿入して、等倍の光学系を使用している。
【００４０】
検出手段５は、ＣＣＤカメラ４によって撮像された画像データを基に、種々の画像処理を行ってマイクロアレイＡから発せられる蛍光を検出するように構成されている。検出手段５は、例えば、ＣＣＤカメラ４からの画像データを入力するためのインターフェース、パーソナルコンピュータ、及び、それを作動させるためのコンピュータプログラム等によって構成することができる。
【００４１】
ＸＹステージ１８は、ＣＣＤカメラ４によってマイクロアレイＡの各部を撮像するため、マイクロアレイＡを水平面内で移動させることができるように構成されている。フォーカスステージ（図示せず）は、ＣＣＤカメラ４に写されるマイクロアレイＡの像のピントを調節するため、ＸＹステージ１８又は対物レンズ１４を上下動させるように構成されている。また、制御装置２０は、ＣＣＤカメラ４による撮像、ＸＹステージ１８の移動、透過用光源２及び励起用光源６のＯＮ／ＯＦＦ、フォーカスステージの移動等を制御する。或いは、透過用光源２又は励起用光源６として、頻繁にＯＮ／ＯＦＦを繰り返すような使用に適さない種類の光源を使用する場合には、透過用光源２又は励起用光源６の前に光を遮断するためのシャッター（図示せず）を設け、このシャッターの開閉を制御装置２０によって制御する。制御装置２０は、例えば、各装置を作動させるアクチュエータと、このアクチュエータに信号を送るパーソナルコンピュータ等によって構成し、パーソナルコンピュータは検出手段５で使用するパーソナルコンピュータと兼用することができる。
【００４２】
次に、図２を参照して、本発明の第１又は第２の実施形態によるマイクロアレイの読取装置に使用するマイクロアレイＡを説明する。図２に示すマイクロアレイＡは、区画Ｃが貫通穴により形成されており、且つ区画Ｃが複数個、整然と配列されたマイクロアレイである。そのようなマイクロアレイは、例えば、WO 00/53736号、特開2000-60554号、特開2000-78998号公報記載の方法により作成される。
【００４３】
各区画には、区画の内壁部に直接、又はゲルを介してプローブとなりうる生体関連物質が固定されている。
【００４４】
区画以外の基材部分Ｂは、区画Ｃと光透過率が異なれば、その構成に特に限定はない。また基材部分Ｂと区画Ｃは、光透過率に差があれば良く、どちらが透明であるかは問題ではない。
【００４５】
好ましくは、基材部分Ｂが不透明材料で構成されている。ここで「不透明」とは、マイクロアレイＡのプローブが固定された区画よりも光を透過しにくい性質を意味し、必ずしも、光の透過率が０％であることを意味するものではない。
【００４６】
図２では、区画Ｃとして中空円形状物を例示しているが、区画の外形は円形に限定されるものではない。区画Ｃの構造内径は１７０μｍ、外径は２２０μｍである。
【００４７】
また、図２では区画Ｃの肉厚部分及びそれを包含する樹脂製の基材部分Ｂにおいて、光透過率が１％以下になる材料で構成されているマイクロアレイを例示している。区画Ｃの肉厚部分は、カーボンブラックを２％混合したＰＭＭＡ又はポリカーボネート樹脂により成形されている。この区画Ｃは、並行に縦横５列ずつ４２０μｍピッチで等間隔に配置しており、その周囲は、カーボンブラックを２.５％混合したウレタン樹脂で包含されている。
【００４８】
次に、本発明の第１実施形態によるマイクロアレイの読取装置１の作用を説明する。ここでは、実際に検体から発する蛍光の検出を説明する前に、本実施形態によるマイクロアレイの読取装置１の検出精度を検証するための検証実験について説明する。検証実験では、マイクロアレイＡの各区画Ｃに充填されたゲル状物に、予め設定した濃度で蛍光物質を直接固定化し、その蛍光物質から発せられる蛍光を検出する。
【００４９】
まず、マイクロアレイＡの各区画Ｃに充填されたゲル状物に、各々異なる濃度で蛍光物質を固定化する。この検証実験では、蛍光物質としてＣＹ３を使用した。表１は、各区画Ｃに固定化された蛍光物質の濃度を示す。
【００５０】
【表１】

表１に示すように、各区画Ｃには、１から２５の番号が付されており、第１行は、左端から順に１番乃至５番の番号が付され、第２行左端が６番、以下同様に、第５行右端の２５番まで番号が付されている。各区画Ｃの中心座標及び固定化された蛍光物質濃度は、表１に示す通りである。また、各区画Ｃの中心座標及び内径の数値は、マイクロアレイＡの設計値である。
【００５１】
表２は、このように構成されたマイクロアレイＡに投影機によって光を照射し、マイクロアレイＡの各区画を透過した光のスポットの位置及びスポット径を測定した結果を示す。なお、表２の値は、５回の測定値の平均値である。
【００５２】
【表２】

次に、このマイクロアレイＡを、本発明の第１実施形態によるマイクロアレイ読取装置１のＸＹステージ１８にセットし、透過用光源２の光を透過させ、透過した光をＣＣＤカメラ４によって撮像する。図３は、このようにして撮像された透過光のスポットの画像の一例を示す。このスポットの画像を構成する各画素は所定の閾値によって２値に分類され、所定の閾値よりも明るい部分がスポットの部分、所定の閾値よりも暗い部分がスポット以外の部分と認識される。次いで、図３に示したスポットの画像のスポット径を、検出手段５によって収縮させる。ここでは、各スポットの直径を約７０μｍずつ収縮させている。この画像処理には、MEDIA CYBERNETICS社製のイメージングソフトウェアであるImage-Pro PLUS（登録商標）を使用した。即ち、このソフトウェアのProcessメニューの中のFilter機能であるMorphologicalのErodeにおいて、１１×１１Circleオプションを用いて各スポットの径を７０μｍずつ収縮させた。
【００５３】
図４は、検出手段５によって画像処理し、各スポットの径を収縮させた結果の一例を示す。しかしながら、画像処理に用いるソフトウェア、画像処理方法は、任意適当なものを使用することができる。例えば、ここでは、各スポットの径を一定量ずつ縮径させているが、各スポットの径を一定割合で縮径させても良いし、スポットの中心位置から一定半径の円領域とすることも出来る。
【００５４】
表３は、図４に示す各スポットの位置及び大きさを測定した結果の一例を示す。
【００５５】
【表３】

表２と表３を比較すると、各スポットの中心座標は良く一致しており、スポット径は、表３では、表２よりも約７０μｍ小さくなっていることがわかる。従って、表３のように求められた各スポットの位置及び大きさに従って、各スポットの蛍光を測定することにより、マイクロアレイＡ上の各区画Ｃの周辺部を除外し、区画Ｃの中心付近の領域について測定を行うことが可能になる。
【００５６】
次に、マイクロアレイ読取装置１のＸＹステージ１８上にセットされているマイクロアレイＡに、励起用光源６から励起光を照射し、マイクロアレイＡに配置されている各区画Ｃに充填されているゲル状物に固定化された蛍光物質からの蛍光を、ＣＣＤカメラ４によって撮像する。図５は、ＣＣＤカメラ４によって撮像された画像の一例を示す。また、図６は、図５の画像に、図４から測定された各スポットの輪郭線を重ね合わせた結果を示す。
【００５７】
図６の輪郭線の中の各画素の明るさを表すＣＣＤ読取値を平均した平均ＣＣＤ読取値Ｄ_AVが、検出手段５によって計算される。図７は、このようにして求められた各スポットの平均ＣＣＤ読取値Ｄ_AVと、対応するスポットに固定化されている蛍光物質濃度との関係をグラフに示したものである。ただし、縦軸の各平均ＣＣＤ読取値Ｄ_AVは、各スポットのＣＣＤ読取値の平均値から、蛍光物質濃度０［ｎｍｏｌ／ｍｌ］、即ち、蛍光物質を固定化していない全てのスポットのＣＣＤ読取値を平均した値を夫々減じた値である。なお、縦軸の平均ＣＣＤ読取値Ｄ_AV、横軸の蛍光物質濃度とも、対数目盛によって示されている。
【００５８】
図７に示すように、蛍光物質濃度と、平均ＣＣＤ読取値Ｄ_AVとの関係は両対数グラフ上でほぼ直線関係になる。従って、平均ＣＣＤ読取値Ｄ_AVから各区画Ｃのゲル状物に固定化された蛍光物質の濃度を求めることができる。
【００５９】
次に、本発明の第２実施形態によるマイクロアレイの読取装置１の作用を説明する。まず、各区画Ｃにプローブを含むマイクロアレイＡを用意する。一方、解析すべき検体には蛍光物質を付与し、この検体を、マイクロアレイＡに作用させる。或る検体が、所定の構造のプローブに作用すると、プローブと検体が反応し、反応物が形成されるので、検体に付与された蛍光物質が、マイクロアレイＡの区画Ｃの中に固定される。従って、解析すべき検体とハイブリッドを形成することができる構造のプローブが固定されている区画Ｃの中にのみ蛍光物質が存在することになる。
【００６０】
マイクロアレイＡの読み取りを開始する前に、マイクロアレイの読取装置１のＸＹステージ１８の上に、均一な光の拡散板（図示せず）をセットする。次に、励起用光源６から拡散板に光を照射し、拡散板による反射光をＣＣＤカメラ４によって撮像する。撮像された拡散画像の情報は、励起用光源６の光量斑を補正するために、検出手段５に記憶させておく。ここで撮像する画像は、サンプル面における励起光の照射斑を後の工程で補正するために、励起光の照射斑を撮像する物であり、一般的に拡散板に対してピントを外した状態で撮像する。また、拡散板を用いずに、ＸＹステージ１８の上に何も置かない、つまり、サンプル面に何も存在しない状態で励起用光源６から光を照射し、その状態でＣＣＤカメラ４によって撮像する場合もある。
【００６１】
次に、マイクロアレイＡをＸＹステージ１８にセットする。ＸＹステージ１８にマイクロアレイＡをセットする時のＸＹステージ１８の位置と、マイクロアレイＡの測定を行う時のＸＹステージ１８の位置が異なる場合、ＸＹステージ１８を測定位置に移動する。
【００６２】
次いで、透過用光源２からマイクロアレイＡに光を照射する。透過用光源２から照射され、マイクロアレイＡを透過した光は、対物レンズ１４を通ってＣＣＤカメラ４によって撮像される。このとき撮像される画像は、マイクロアレイＡの寸法精度、マイクロアレイＡの区画Ｃの配列精度、マイクロアレイＡをＸＹステージ１８にセットする際の位置精度、ＸＹステージ１８の移動精度、等の要因により、例えば図９に示すように、ＣＣＤカメラ４の視野にマイクロアレイＡの区画Ｃが収まらない場合がある。ここで、図９におけるＣＣＤカメラ４の視野は、ＣＣＤカメラ４の動作速度をできるだけ速くするために、使用したマイクロアレイＡの区画Ｃの配置に合わせて画像を取り込む範囲を調整している。
【００６３】
次に、ＣＣＤカメラ４によって撮像した画像における、区画Ｃの位置、数量等の情報を基に、検出手段５において、マイクロアレイＡの区画Ｃ全体の位置を算出し、マイクロアレイＡの区画Ｃ全体がＣＣＤカメラ４によって撮像可能となるように、制御装置２０によってＸＹステージ１８を移動する。次いで、再度透過用光源２からマイクロアレイＡに光を照射する。透過用光源２から照射され、マイクロアレイＡを透過した光は、対物レンズ１４を通ってＣＣＤカメラ４によって撮像される。マイクロアレイＡの区画Ｃ全体が、ＣＣＤカメラ４の全視野内に収まらない場合には、予め設定しておいた区画Ｃの数毎に纏まった領域がＣＣＤカメラ４の視野内に収まるようにし、ＸＹステージ１８を使用して、マイクロアレイＡを順次移動させて全ての区画Ｃを撮像する。このとき、ＸＹステージ１８の移動精度等を考慮して、マイクロアレイＡを順次移動させて、全ての区画Ｃの撮像を行ってから後の蛍光の撮像を行うのではなく、区画Ｃの撮像後、ＸＹステージ１８を移動させる前に、蛍光の測定も合わせて実施することが望ましい。
【００６４】
ＣＣＤカメラ４によって撮像された透過光のスポットは、検出手段５によって画像解析され、各スポットの位置及び大きさが測定される。更に、測定されたスポットの大きさは、検出手段５によって所定量収縮処理され、この収縮されたスポットの輪郭は、検出手段５に記憶される。なお、適用によっては、透過光を撮像する際には、ダイクロックミラー８、吸収用フィルタ１０、及び励起用フィルタ１２を、顕微鏡１６の光軸から外れるように移動させておいて良い。
【００６５】
スポットを収縮させる割合は、区画Ｃ周辺の基材部分Ｂや、区画Ｃの壁面の影響によるノイズの大きさに応じて適宜選択することができる。例えば、スポット周辺部の形状斑が大きく、プローブの固定化率がスポットの中心部と周辺部で異なる場合、或いは、基材部分Ｂ又は区画Ｃの壁面の自家蛍光が強い場合等は、収縮させる割合を大きく、即ち、区画Ｃの中心付近の画像のみを採用するようにする。一般的には、元のスポットの概略直径を３０乃至１００％程度の大きさに縮小させるのが良い。この検出手段５によって、スポット径を収縮させる手順は、上述した検証実験と同様であるので、説明を省略する。
【００６６】
また、プローブが各区画の内壁に直接固定化されているタイプのマイクロアレイ、又は、各区画の内壁部にのみゲル状物が付与されているタイプのマイクロアレイにおいては、プローブは各区画の内壁付近にのみ存在し、中心付近は空洞になる。従って、このようなマイクロアレイにおいては、区画の中心付近の透過光強度が、区画の内壁付近の透過光強度よりも更に強くなる。このタイプのマイクロアレイを読み取る場合には、スポットの内部の各画素を、第２の閾値で更に分類し、スポットの中心付近の空洞部分の画像を取り除いて後の解析を行うようにしても良い。
【００６７】
透過光のスポットを撮像した後、透過用光源２の光を遮断し、次いで、励起用光源６を点灯させ、あるいは、励起用光源６のシャッターを開放することにより、励起用光源６の励起光をマイクロアレイＡに照射する。励起用光源６から射出された光は、励起用フィルタ１２に入射し、蛍光物質の励起に必要な波長の光だけが透過される。励起用フィルタ１２を透過した励起光はダイクロックミラー８によって反射され、顕微鏡１６の対物レンズ１４の方に差し向けられる。ダイクロックミラー８によって反射された励起光は、対物レンズ１４によって集光され、マイクロアレイＡに照射される。
【００６８】
励起光をマイクロアレイＡに照射すると、マイクロアレイＡ上に存在する蛍光物質は、励起光によって励起され、励起光とは異なる波長の蛍光を発する。マイクロアレイＡから発せられた蛍光は、対物レンズ１４、ダイクロックミラー８を透過して吸収用フィルタ１０に入射する。また、マイクロアレイＡによって反射され、ダイクロックミラー８へ戻った励起光の波長成分は、ダイクロックミラー８によって反射されるので、吸収用フィルタ１０には殆ど入射しない。吸収用フィルタ１０は、入射した光のうちマイクロアレイＡ上の蛍光物質から発せられた蛍光の波長成分を透過させ、励起光の波長成分の光を遮断する。吸収用フィルタ１０を透過した蛍光は、ＣＣＤカメラ４によって撮像される。
【００６９】
ＣＣＤカメラ４によって撮像された、マイクロアレイＡ上の蛍光物質から発せられた蛍光のスポット画像は、先に撮像され、検出手段５に記憶させておいた拡散画像に基づいてシェーディング補正される。即ち、マイクロアレイＡに照射された励起光の光量斑が、検出手段５によって数値的に補正される。
【００７０】
また、透過光の撮像時にダイクロックミラー８、吸収用フィルタ１０、及び、励起用フィルタ１２を顕微鏡１６の光軸から外した事による光学系有無、あるいはこれらを外さない場合でも、使用する光学系の収差によって画像の位置ずれを引き起こす場合があり、このずれを予め検出手段５に記憶させておき、それに基づいて画像取込のピント位置、蛍光画像とスポット画像の位置等を補正するのが良い。次に、先に撮像され、検出手段５に記憶させておいた透過光のスポットの輪郭の画像が、シェーディング補正された蛍光のスポット画像と重ね合わせられる。各蛍光のスポットの輪郭線内部の各画素のＣＣＤ読取値が、検出手段５によって平均され、そのスポットの平均ＣＣＤ読取値が求められる。この求められた平均ＣＣＤ読取値から、解析すべき検体が、各プローブとハイブリットを形成した量を求めることができる。
【００７１】
また、シェーディング補正された蛍光のスポット画像に対して、検出手段５に記憶させておいた透過光のスポットの輪郭によって、画像の不必要な部分をマスクすることができる。このようにしてマスクした画像は、圧縮処理によってその保存容量を少なく抑えることが可能となる。
【００７２】
本発明の第１又は第２の実施形態によるマイクロアレイの読取装置によれば、マイクロアレイ上のどの位置に区画が配置されているかを予め認識することができるので、蛍光強度の低い検体や配列精度の低いマイクロアレイにおいても、検出された蛍光が、どのプローブと反応物を形成した検体から発せられたものであるかを正確に識別することができる。さらに、ＣＣＤカメラによって撮像された透過光のスポットを収縮させて、スポットの一部分の画像を採用して蛍光の解析を行うので、区画自体の自家蛍光等、蛍光物質が発する蛍光以外のノイズの影響を効果的に除去することができる。
【００７３】
上述した第１又は第２の実施形態においては、１つのマイクロアレイに対して１種類の蛍光物質が付与されていたが、１つのマイクロアレイに対して蛍光の波長が異なる複数の蛍光物質を同時に付与することもできる。この場合には、検出する蛍光の波長に合わせて、ダイクロックミラー８、吸収用フィルタ１０、及び、励起用フィルタ１２の組が、制御装置２０によって適宜交換されるように構成するのが良い。ダイクロックミラー８、吸収用フィルタ１０、及び、励起用フィルタ１２の組を交換することによって、スポットの結像位置に微妙なずれが生じる場合には、このずれを予め測定しておき、使用したフィルタ等の組に応じてずれを補正するように構成することができる。
【００７４】
次に、図８を参照して、本発明の第３又は第４の実施形態を説明する。本発明の第３又は第４の実施形態によるマイクロアレイの読取装置３０は、透過用光源と励起用光源が兼用にされている点が、上述した実施形態とは異なる。従って、ここでは、第３又は第４の実施形態が上述した実施形態と異なる点のみを説明し、同様の構成、作用、効果については説明を省略する。
【００７５】
図８は、本発明の第３又は第４の実施形態によるマイクロアレイの読取装置３０の概略構成図である。図８に示すように、本発明の第２実施形態によるマイクロアレイの読取装置３０は、マイクロアレイＡを透過させる透過光及び蛍光物質を励起させる励起光を照射する透過・励起用光源３２と、この透過・励起用光源３２の射出光にフィルタをかける励起用フィルタ３４と、を有する。更に、マイクロアレイの読取装置３０は、透過光及び蛍光を撮像するＣＣＤカメラ４と、検体を解析する検出手段５と、を有する。
【００７６】
また、マイクロアレイの読取装置３０は、ダイクロックミラー８、吸収用フィルタ１０、及び、対物レンズ１４から構成される光学系を備えた顕微鏡１６を有する。更に、マイクロアレイの読取装置３０は、マイクロアレイＡを水平面内で所望の位置に移動させるＸＹステージ１８と、透過・励起用光源３２、ＣＣＤカメラ４、ＣＣＤカメラ４に写されるマイクロアレイＡの像のピントを調節するため、ＸＹステージ１８又は対物レンズ１４を上下動させるフォーカスステージ（図示せず）、及び、ＸＹステージ１８を制御する制御装置２０とを有する。
【００７７】
本実施形態においては、透過・励起用光源３２及び励起用フィルタ３４がＸＹステージ１８の下方に配置されている。励起用フィルタ３４は、マイクロアレイＡ上に存在する蛍光物質を励起させる波長の光のみを透過するように構成されている。
【００７８】
本発明の第３の実施形態の他の構成要素は、上述した実施形態と同様であるので説明を省略する。
【００７９】
次に、本発明の第４の実施形態によるマイクロアレイの読取装置３０の作用を説明する。まず、マイクロアレイＡに透過光を照射する際には、励起用フィルタ３４を光軸から外し、透過・励起用光源３２からマイクロアレイＡに直接、透過用の光が照射される。透過・励起用光源３２から照射された光は、マイクロアレイＡを透過し、ＣＣＤカメラ４によって撮像される。次に、透過・励起用光源３２からマイクロアレイＡ上の蛍光物質を励起させる際には、励起用フィルタ３４が光軸上に配置され、蛍光物質を励起させることができる波長の励起光が、下方からマイクロアレイＡに照射される。また、マイクロアレイＡを透過した励起光は、ダイクロックミラー８によって反射され、ＣＣＤカメラ４に入射する光軸の外へ偏向される。励起光の照射によって励起された蛍光物質から発せられた蛍光は、ダイクロックミラー８、及び、吸収用フィルタ１０を透過してＣＣＤカメラ４に入射する。以上の点以外の作用は、上述した実施形態と同様であるので、説明を省略する。
【００８０】
本実施形態によれば、透過用光源と励起用光源とを兼用にすることができる。
【００８１】
また、励起光がマイクロアレイＡの下方から照射されるので、顕微鏡１６に入射するのは、全てマイクロアレイＡの区画Ｃの部分を透過した光である。従って、第１又は第２の実施形態のように、マイクロアレイＡに照射された励起光が、マイクロアレイＡの基材部分Ｂによって反射され、その反射光が顕微鏡１６に入射することがない。これにより、検出すべき蛍光のＳ／Ｎ比を改善することができる。
【００８２】
【発明の効果】
本発明のマイクロアレイの読取装置によれば、蛍光強度の低い検体や配列精度の低いマイクロアレイにおいても、プローブに新たな物質を混合することなく、プローブを固定化した検出すべき区画の位置及び／又は大きさの情報を正確に取得することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の第１実施形態によるマイクロアレイの読取装置の概略構成図である。
【図２】本発明の第１実施形態によるマイクロアレイの読取装置に使用されるマイクロアレイの平面図である。
【図３】ＣＣＤカメラによって撮像されたマイクロアレイを透過する光のスポットの一例を示す図である。
【図４】図３に示した透過光のスポットを縮径させた結果の一例を示す。
【図５】ＣＣＤカメラによって撮像されたマイクロアレイから発せられる蛍光のスポットの一例を示す図である。
【図６】図５に示した蛍光のスポットに、図４に示した縮径させた透過光のスポットの輪郭を重ね合わせた結果を示す図である。
【図７】各蛍光のスポットのＣＣＤ読取値と、対応するスポットに固定化されている蛍光物質濃度との関係を示したグラフである。
【図８】本発明の第２実施形態によるマイクロアレイの読取装置の概略構成図である。
【図９】ＣＣＤカメラによって撮像されたマイクロアレイを透過する光のスポットが、ＣＣＤカメラ視野に対してずれた場合の一例を示す図である。
【符号の説明】
Ａマイクロアレイ
Ｂ基材部分
Ｃ区画
１本発明の第１実施形態によるマイクロアレイの読取装置
２透過用光源
４ＣＣＤカメラ
５検出手段
６励起用光源
８ダイクロックミラー
１０吸収用フィルタ
１２励起用フィルタ
１４対物レンズ１４
１６顕微鏡
１８ＸＹステージ
２０制御装置
３０本発明の第２実施形態によるマイクロアレイの読取装置
３２透過・励起用光源
３４励起用フィルタ[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a bio-related substance microarray reader and method for reading a quantity of excited fluorescence by reacting a specimen to which a fluorescent substance is provided with a bio-related substance microarray in which probes are immobilized and arranged, irradiating excitation light. .
[0002]
[Prior art]
In recent years, genome projects in various organisms have been promoted, and many genes and their base sequences, including human genes, are being rapidly revealed. The function of a gene whose sequence has been clarified can be examined by various methods. As one of the promising methods, gene expression analysis using known nucleotide sequence information is known. In this analysis method, for example, a different gene peptide, protein, antibody, for example, on the surface of a substrate, a concave portion, a convex portion, or an inner wall portion of a capillary or a section of a polymer gel-like material held in a capillary hollow portion. A microarray in which several tens to several tens of thousands of biologically related substances such as these are immobilized as probes is used. By utilizing various specific reactions for this probe, the relationship between the substance used as the probe and the expression of its biological function can be examined. Such a method is a DNA that enables collective expression analysis of a large number of genes in order to perform a comprehensive and systematic analysis of a large number of genes at a single individual level, which is being revealed through today's genome project. It has been developed as a new analytical method or methodology called microarray method (DNA chip method).
[0003]
In a method for detecting a reaction product between a probe and a specimen, first, a fluorescently labeled specimen is reacted with a biological substance immobilized as a probe on a microarray. Next, by detecting the amount of fluorescence with a fluorescence measuring device such as a fluorescence laser scanner or a fluorescence microscope, it is possible to detect which probe and reaction product are formed by the fluorescently labeled specimen.
[0004]
[Problems to be solved by the invention]
However, when the fluorescence intensity of the specimen is low or the positional accuracy of the microarray array is low, the correspondence between the detected fluorescence and the biological substance immobilized as a probe on the microarray can be accurately recognized. There is a problem that it is difficult to easily and accurately detect which probe has formed a hybrid with the specimen.
[0005]
In order to solve such a problem, Patent Document 1 describes a microarray reading method. In this method, a fluorescent substance different from a fluorescent substance for labeling a specimen is mixed in advance with a biological substance immobilized as a probe on a microarray, and the fluorescent substance mixed in the probe is excited. The spot position is detected by detecting the obtained fluorescence.
[0006]
However, in this method, it is necessary to apply a fluorescent material different from the fluorescent material to be applied to the specimen to the biological material that is immobilized on the microarray to form the probe. There is a problem in that the fluorescent material for detecting the position of the probe previously applied to the biological substance becomes a noise source when detecting the fluorescent material applied to the specimen, which should be detected. There is also a problem that a new optical system such as a filter for detecting a fluorescent substance newly mixed with a biological substance needs to be configured.
[0007]
In the present invention, the position of the compartment to be detected and / or the immobilization of the biological substance is not mixed with the biological substance to be used as a probe, even in a sample with low fluorescence intensity or an array with low arrangement accuracy. Alternatively, an object of the present invention is to provide a microarray reading apparatus and method capable of accurately acquiring size information.
[0008]
[Patent Document 1]
JP 2001-27607 A
[0009]
[Means for Solving the Problems]
In order to solve the above-described problems, the present invention provides a reading device that reads fluorescence emitted from a fluorescent substance from a bio-related substance microarray including a plurality of compartments reacted with a specimen to which the fluorescent substance has been applied. From a light source for transmission that transmits light, an excitation light source that excites a fluorescent material present in a section, and a fluorescent material that is irradiated from the light source for transmission and that is transmitted through the microarray and excited by the light source for excitation. Imaging means for imaging the emitted fluorescence, and detection means for detecting the position and / or size of the sections arranged on the microarray based on the image of the light imaged by the imaging means and transmitted through the microarray; It is characterized by having.
[0010]
Moreover, it is preferable that parts other than the section of a microarray are comprised opaquely.
[0011]
Furthermore, it has a means for moving the section from the position of the section arranged on the microarray into the field of view of the imaging means.
[0012]
Next, a specimen to which a fluorescent material is applied is reacted with the compartment of the microarray to form a reaction product of the probe of the microarray and the specimen. Next, the microarray is irradiated with light from the light source for transmission, and the transmitted light that has passed through the microarray is imaged by the imaging means.
[0013]
The detection means detects the position and / or size of the section on the microarray from the captured image of transmitted light. Preferably, the position of the entire section on the microarray is detected from the captured image of transmitted light. Next, the microarray is moved so that the center position of the entire section on the detected microarray matches the visual field center position of the imaging means. Next, the microarray is again irradiated with light from the light source for transmission, and the transmitted light that has passed through the sections of the microarray is picked up by the imaging means, and the position and / or size of the sections on the microarray are determined from the image of the picked-up transmitted light. To detect.
[0014]
Further, excitation light is irradiated from the excitation light source to the microarray to cause the fluorescent material present on the microarray to fluoresce. This fluorescence is imaged by the imaging means, and the captured image is analyzed based on the position and / or size of the section detected previously.
[0015]
With this configuration, it becomes possible to easily recognize the position and / or size of the section formed on the microarray, so that the fluorescence emitted from the microarray when using a microarray with poor position accuracy for placing the section is used. Even in the case where is weak, fluorescence can be detected accurately.
[0016]
The detection means may be configured to select a part of the image of the light transmitted through the section imaged by the imaging means and detect the fluorescence of the selected part.
[0017]
In the present invention configured as described above, image information of a part of a spot which is an image of a section detected by imaging transmitted light is extracted, and analysis is performed based on the image information. According to this configuration, it is possible to eliminate the influence of fluorescence emitted from other than the fluorescent substance to be detected on the microarray, for example, autofluorescence emitted from a material other than the microarray section.
[0018]
Preferably, the detection unit further includes a correction unit that corrects a difference between an optical system for imaging light transmitted through the microarray and an optical system for imaging fluorescence emitted from the fluorescent material.
[0019]
In the present invention configured as described above, the optical system for imaging light transmitted through the microarray is different from the optical system for imaging fluorescence emitted from the fluorescent material. Even in the case where there is a deviation, the fluorescence of the compartment can be detected without error.
[0020]
Further, the imaging means can be constituted by a CCD camera.
[0021]
Further, the light source for transmission and the light source for excitation may be combined.
[0022]
Moreover, the light source for transmission or the light source for excitation can also be comprised by a light emission means and the optical fiber bundle which guide | induces the light light-emitted by this light emission means.
[0023]
In the present invention configured as described above, the light source for transmission or the light source for excitation can be arranged at an arbitrary position, and the optical fiber prevents the heat rays emitted from the light source from being applied to the microarray. Can do.
[0024]
Furthermore, the light source for transmission or the light source for excitation can be constituted by an LED light source.
[0025]
In the present invention thus configured, the lifetime of the light source for transmission or the light source for excitation can be extended.
[0026]
In addition, the method for reading a biomaterial microarray according to the present invention includes a step of preparing a biomaterial microarray including a plurality of sections in which a specimen to which a fluorescent material has been applied is reacted, irradiating the microarray with light, and transmitting the microarray Imaging the transmitted light, detecting the position and / or size of the compartment, and irradiating the microarray with excitation light to excite the fluorescent material present in the compartment of the macroarray and emitting from the fluorescent material The method includes imaging fluorescence, and reading the fluorescence imaged in this step based on the position and / or size of the section detected based on the transmitted light.
[0027]
The method for reading a biomaterial microarray according to the present invention includes a step of preparing a biomaterial microarray including a plurality of compartments in which a specimen to which a fluorescent material has been applied is reacted, and irradiating the microarray with light. The step of imaging the transmitted light that has been transmitted, the step of moving the position of the section to an appropriate position within the field of view to be imaged based on the transmitted light imaged in this step, and irradiating the microarray with light again, Imaging the transmitted transmitted light, detecting the position and / or size of the section, irradiating the microarray with excitation light to excite the fluorescent material present in the section of the macroarray, Imaging the emitted fluorescence and the fluorescence imaged in this step based on the transmitted light Is characterized by having a step of reading based on the position and / or size of the detected said compartment.
[0028]
Furthermore, the microarray reading method of the present invention is characterized in that a mask is applied to an image obtained by imaging fluorescence emitted from a fluorescent material based on the position and / or size of a section detected based on transmitted light. .
[0029]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
Next, embodiments of the present invention will be described with reference to the accompanying drawings. FIG. 1 is a schematic configuration diagram of a microarray reader according to the first or second embodiment of the present invention.
[0030]
FIG. 2 is a plan view of the microarray A used in the microarray reader according to the present embodiment. As shown in FIG. 1, the microarray reader 1 according to the first embodiment of the present invention irradiates the microarray A with a light source 2 for irradiating transmitted light that transmits the microarray A and light for exciting the fluorescent material. An excitation light source 6. Further, the microarray reading device 1 includes a CCD camera 4 that is an imaging means for imaging the transmitted light transmitted through the microarray A and the fluorescence emitted from the fluorescent material applied to the specimen on the microarray A, and the CCD camera 4 captures an image. And detecting means 5 for analyzing the sample based on the obtained image.
[0031]
The microarray reader 1 also includes a microscope including an optical system including a dichroic mirror 8 that transmits or reflects predetermined light, an absorption filter 10, an excitation filter 12, and an objective lens 14 for the microarray A. 16 Further, the microarray reading device 1 includes an XY stage 18 that moves the microarray A to a desired position in the horizontal plane, a transmitted light source 2, a CCD camera 4, an excitation light source 6, and a microarray A imaged on the CCD camera 4. In order to adjust the focus of the image, a focus stage (not shown) that moves the XY stage 18 or the objective lens 14 up and down, and a control device 20 that controls the XY stage 18 and the like are included.
[0032]
The transmission light source 2 is disposed below the XY stage 18 so that the optical axis of light emitted from the light source and the optical axis of the microscope 16 are aligned. As the transmissive light source 2, for example, a halogen lamp or an LED array light source in which a plurality of LEDs are arranged can be used. In this embodiment, an LED array light source and a halogen lamp are used as the transmissive light source 2.
[0033]
Further, the transmission light source 2 is not necessarily arranged below the XY stage 18, and is aligned with the optical axis of the microscope 16 from a position other than the position below the XY stage 18 through a lens, a mirror, or the like as appropriate. You may comprise so that light may be irradiated to. Alternatively, light may be guided from a light source to a predetermined position using an optical fiber bundle. As described above, when the light is guided using the optical fiber bundle, the heat rays of the light beam can be removed by the optical fiber.
[0034]
Further, by aligning the emission end of each optical fiber with the position where the section C of the microarray A is arranged, it is possible to efficiently irradiate the light to each section C. Further, when an LED is used as the light source, it is possible to realize a stable light amount and a long life of the light source.
[0035]
The excitation light source 6 is arranged so as to emit light into the lens barrel from the side surface of the lens barrel of the microscope 16. Preferably, as the excitation light source 6, a light source containing a large amount of light having a wavelength component that can excite the fluorescent substances on the microarray A is selected. In this embodiment, a high-pressure mercury lamp is used as the excitation light source 6.
[0036]
The excitation filter 12 is configured to transmit only the wavelength component that can excite the fluorescent substance on the microarray A in the light emitted from the excitation light source 6 and block other wavelength components. ing. Further, the absorption filter 10 is configured to transmit light having a fluorescence wavelength emitted from the microarray A and not to transmit light having a wavelength component that excites the fluorescent substance. The dichroic mirror 8 is configured and arranged so as to reflect the light having a wavelength component that has passed through the excitation filter 12 and can excite the fluorescent material and direct it toward the microarray A.
[0037]
The dichroic mirror 8 is configured to transmit light having a fluorescent wavelength emitted from the fluorescent material on the microarray A.
[0038]
In the present embodiment, Cy3 is used as a fluorescent material, a bandpass filter having a center wavelength of 610 nm and a half-value width of 75 nm is used as the absorption filter 10, and a bandpass filter having a center wavelength of 545 nm and a half-value width of 30 nm is used as the excitation filter 12. As the dichroic mirror 8, a mirror that reflects light having a wavelength of about 570 nm or less and transmits light having a wavelength longer than that is used. The dichroic mirror 8, the absorption filter 10, and the excitation filter 12 are selected and configured according to the excitation wavelength of the fluorescent material to be used and the wavelength of the fluorescence emitted from the fluorescent material, and use a plurality of fluorescent materials. In such a case, the microscope 16 may be configured to be easily switchable.
[0039]
The CCD camera 4 is attached to the opposite end of the objective lens 14 of the lens barrel of the microscope 16 so that its optical axis is aligned with the optical axis of the microscope 16. Preferably, as the CCD camera 4, a cooled CCD camera having a camera cooling function is used so that weak fluorescence emitted from the microarray A can be imaged with less noise. In the present embodiment, a CCD camera having 1392 × 1040 effective pixels and cooled to −30 ° C. is used. In this embodiment, the microscope 16 is an epifluorescence microscope, uses an objective lens having a magnification of 2 ×, inserts a lens of 0.5 × in front of the CCD camera, and uses an equal magnification optical system. is doing.
[0040]
The detection means 5 is configured to detect fluorescence emitted from the microarray A by performing various image processing based on the image data captured by the CCD camera 4. The detection means 5 can be configured by, for example, an interface for inputting image data from the CCD camera 4, a personal computer, a computer program for operating the computer, and the like.
[0041]
The XY stage 18 is configured so that the microarray A can be moved in a horizontal plane in order to image each part of the microarray A by the CCD camera 4. The focus stage (not shown) is configured to move the XY stage 18 or the objective lens 14 up and down in order to adjust the focus of the image of the microarray A imaged on the CCD camera 4. Further, the control device 20 controls imaging by the CCD camera 4, movement of the XY stage 18, ON / OFF of the transmission light source 2 and excitation light source 6, movement of the focus stage, and the like. Alternatively, when a light source that is not suitable for use is used as the transmission light source 2 or the excitation light source 6 and is frequently turned ON / OFF, light is transmitted before the transmission light source 2 or the excitation light source 6. A shutter (not shown) for blocking is provided, and opening and closing of the shutter is controlled by the control device 20. The control device 20 is constituted by, for example, an actuator that operates each device and a personal computer that sends a signal to the actuator, and the personal computer can also be used as a personal computer used in the detection means 5.
[0042]
Next, with reference to FIG. 2, the microarray A used for the microarray reader according to the first or second embodiment of the present invention will be described. The microarray A shown in FIG. 2 is a microarray in which the sections C are formed by through holes and a plurality of the sections C are arranged in an orderly manner. Such a microarray is prepared, for example, by the method described in WO 00/53736, JP 2000-60554, JP 2000-78998.
[0043]
In each compartment, a biological substance that can serve as a probe is fixed directly to the inner wall of the compartment or via a gel.
[0044]
The base part B other than the section is not particularly limited in its configuration as long as the light transmittance is different from that of the section C. Moreover, the base material part B and the division C should just have a difference in light transmittance, and it is not a problem which is transparent.
[0045]
Preferably, the base material portion B is made of an opaque material. Here, “opaque” means a property of transmitting light less easily than the section where the probe of the microarray A is fixed, and does not necessarily mean that the light transmittance is 0%.
[0046]
In FIG. 2, a hollow circular object is illustrated as the section C, but the outer shape of the section is not limited to a circle. The structural inner diameter of the section C is 170 μm, and the outer diameter is 220 μm.
[0047]
FIG. 2 illustrates a microarray composed of a material having a light transmittance of 1% or less in the thick part of the section C and the resin base part B including the thick part. The thick part of the section C is formed by PMMA mixed with 2% of carbon black or polycarbonate resin. This section C is arranged in parallel at equal intervals of 420 μm in 5 rows and 5 rows in parallel, and the periphery thereof is covered with urethane resin mixed with 2.5% of carbon black.
[0048]
Next, the operation of the microarray reader 1 according to the first embodiment of the present invention will be described. Here, a verification experiment for verifying the detection accuracy of the microarray reader 1 according to the present embodiment will be described before the detection of the fluorescence actually emitted from the specimen is described. In the verification experiment, a fluorescent substance is directly fixed to a gel-like material filled in each section C of the microarray A at a preset concentration, and fluorescence emitted from the fluorescent substance is detected.
[0049]
First, fluorescent substances are immobilized at different concentrations on gel-like materials filled in the respective sections C of the microarray A. In this verification experiment, CY3 was used as the fluorescent material. Table 1 shows the concentration of the fluorescent substance immobilized in each section C.
[0050]
[Table 1]

As shown in Table 1, each section C is numbered from 1 to 25, the first row is numbered 1 to 5 in order from the left end, and the second row left end is number 6. In the same manner, numbers up to 25 at the right end of the fifth row are numbered. Table 1 shows the central coordinates of each section C and the concentration of the immobilized fluorescent substance. The numerical values of the center coordinates and the inner diameter of each section C are design values of the microarray A.
[0051]
Table 2 shows the result of measuring the position and the spot diameter of the light spot transmitted through each section of the microarray A by irradiating the microarray A configured in this manner with a projector. In addition, the value of Table 2 is an average value of five measurements.
[0052]
[Table 2]

Next, this microarray A is set on the XY stage 18 of the microarray reader 1 according to the first embodiment of the present invention, the light of the light source 2 for transmission is transmitted, and the transmitted light is imaged by the CCD camera 4. FIG. 3 shows an example of a spot image of transmitted light imaged in this way. Each pixel constituting the image of the spot is classified into binary values by a predetermined threshold, and a portion brighter than the predetermined threshold is recognized as a spot portion, and a portion darker than the predetermined threshold is recognized as a portion other than the spot. Next, the spot diameter of the spot image shown in FIG. Here, the diameter of each spot is contracted by about 70 μm. For this image processing, Image-Pro PLUS (registered trademark), which is imaging software manufactured by MEDIA CYBERNETICS, was used. That is, in the Morphological Erode, which is a Filter function in the Process menu of this software, the diameter of each spot was shrunk by 70 μm using the 11 × 11 Circle option.
[0053]
FIG. 4 shows an example of the result of image processing by the detecting means 5 and contracting the diameter of each spot. However, any appropriate software and image processing method used for image processing can be used. For example, the diameter of each spot is reduced by a certain amount here, but the diameter of each spot may be reduced at a constant rate, or a circular area having a constant radius from the center position of the spot may be used. I can do it.
[0054]
Table 3 shows an example of the result of measuring the position and size of each spot shown in FIG.
[0055]
[Table 3]

Comparing Table 2 and Table 3, it can be seen that the center coordinates of the spots are in good agreement, and the spot diameter is about 70 μm smaller in Table 3 than in Table 2. Therefore, by measuring the fluorescence of each spot according to the position and size of each spot determined as shown in Table 3, the peripheral portion of each section C on the microarray A is excluded, and the area near the center of the section C Can be measured.
[0056]
Next, the microarray A set on the XY stage 18 of the microarray reader 1 is irradiated with excitation light from the excitation light source 6, and the gel-like material filled in each section C arranged in the microarray A The fluorescence from the fluorescent material immobilized on the CCD is imaged by the CCD camera 4. FIG. 5 shows an example of an image captured by the CCD camera 4. FIG. 6 shows the result of superimposing the contour lines of the spots measured from FIG. 4 on the image of FIG.
[0057]
The average CCD read value D obtained by averaging the CCD read values representing the brightness of each pixel in the outline of FIG. _AV Is calculated by the detection means 5. FIG. 7 shows the average CCD read value D of each spot thus obtained. _AV And a graph showing the relationship between the concentration of the fluorescent substance immobilized on the corresponding spot. However, each average CCD reading D on the vertical axis _AV Is a value obtained by subtracting, from the average value of the CCD reading values of each spot, the fluorescent substance concentration 0 [nmol / ml], that is, the average value of the CCD reading values of all spots where the fluorescent substance is not immobilized. . The average CCD read value D on the vertical axis _AV The fluorescent substance concentration on the horizontal axis is indicated by a logarithmic scale.
[0058]
As shown in FIG. 7, the fluorescent substance concentration and the average CCD reading D _AV The relationship with is almost linear on the log-log graph. Therefore, the average CCD read value D _AV From this, the concentration of the fluorescent substance immobilized on the gel-like material in each compartment C can be determined.
[0059]
Next, the operation of the microarray reader 1 according to the second embodiment of the present invention will be described. First, a microarray A including probes in each section C is prepared. On the other hand, a fluorescent substance is applied to the specimen to be analyzed, and this specimen is allowed to act on the microarray A. When a certain sample acts on a probe having a predetermined structure, the probe and the sample react to form a reaction product, so that the fluorescent substance applied to the sample is fixed in the section C of the microarray A. Therefore, the fluorescent substance exists only in the section C where the probe having a structure capable of forming a hybrid with the specimen to be analyzed is fixed.
[0060]
Before starting to read the microarray A, a uniform light diffusion plate (not shown) is set on the XY stage 18 of the microarray reader 1. Next, light is emitted from the excitation light source 6 to the diffusion plate, and the reflected light from the diffusion plate is imaged by the CCD camera 4. The information of the captured diffusion image is stored in the detection means 5 in order to correct the unevenness of the light amount of the excitation light source 6. The image captured here is an image of the excitation light irradiation spot in order to correct the excitation light irradiation spot on the sample surface in a later step. Take an image with. Further, light is irradiated from the excitation light source 6 in a state where nothing is placed on the XY stage 18 without using a diffusion plate, that is, there is nothing on the sample surface, and imaging is performed by the CCD camera 4 in that state. In some cases.
[0061]
Next, the microarray A is set on the XY stage 18. When the position of the XY stage 18 when the microarray A is set on the XY stage 18 and the position of the XY stage 18 when measuring the microarray A are different, the XY stage 18 is moved to the measurement position.
[0062]
Next, light is emitted from the light source 2 for transmission to the microarray A. The light emitted from the transmission light source 2 and transmitted through the microarray A passes through the objective lens 14 and is imaged by the CCD camera 4. The image captured at this time depends on factors such as the dimensional accuracy of the microarray A, the alignment accuracy of the sections C of the microarray A, the positional accuracy when the microarray A is set on the XY stage 18, and the movement accuracy of the XY stage 18, for example. As shown in FIG. 9, the section C of the microarray A may not fit in the field of view of the CCD camera 4. Here, the field of view of the CCD camera 4 in FIG. 9 is adjusted in accordance with the arrangement of the sections C of the microarray A used in order to make the operation speed of the CCD camera 4 as fast as possible.
[0063]
Next, based on information such as the position and quantity of the section C in the image captured by the CCD camera 4, the detection means 5 calculates the position of the entire section C of the microarray A, and the entire section C of the microarray A is the CCD. The XY stage 18 is moved by the control device 20 so that the camera 4 can capture an image. Next, light is again applied to the microarray A from the transmission light source 2. The light emitted from the transmission light source 2 and transmitted through the microarray A passes through the objective lens 14 and is imaged by the CCD camera 4. If the entire section C of the microarray A does not fit within the entire field of view of the CCD camera 4, an area grouped for each preset number of sections C is placed within the field of view of the CCD camera 4, and XY Using the stage 18, the microarray A is sequentially moved to image all the sections C. At this time, in consideration of the movement accuracy of the XY stage 18 and the like, the microarray A is sequentially moved, and after all the sections C are imaged, the subsequent fluorescence imaging is not performed. Before moving the XY stage 18, it is desirable to perform fluorescence measurement together.
[0064]
The spot of the transmitted light imaged by the CCD camera 4 is image-analyzed by the detecting means 5 and the position and size of each spot are measured. Further, the measured spot size is contracted by a predetermined amount by the detecting means 5, and the contour of the contracted spot is stored in the detecting means 5. Depending on the application, when imaging the transmitted light, the dichroic mirror 8, the absorption filter 10, and the excitation filter 12 may be moved away from the optical axis of the microscope 16.
[0065]
The ratio of shrinking the spot can be appropriately selected according to the size of noise due to the influence of the base material portion B around the section C and the wall surface of the section C. For example, if the spot around the spot is large and the probe immobilization rate is different between the center part and the peripheral part of the spot, or if the autofluorescence of the wall surface of the base part B or section C is strong, etc. The ratio is increased, that is, only the image near the center of the section C is adopted. In general, it is preferable to reduce the approximate diameter of the original spot to a size of about 30 to 100%. The procedure for contracting the spot diameter by the detection means 5 is the same as that in the verification experiment described above, and a description thereof will be omitted.
[0066]
In addition, in the type of microarray in which the probe is directly fixed to the inner wall of each section, or in the type of microarray in which a gel-like material is applied only to the inner wall portion of each section, the probe is located near the inner wall of each section. Only exists, and the vicinity of the center is hollow. Therefore, in such a microarray, the transmitted light intensity in the vicinity of the center of the section is further stronger than the transmitted light intensity in the vicinity of the inner wall of the section. When reading this type of microarray, each pixel in the spot may be further classified by the second threshold value, and the image of the cavity near the center of the spot may be removed to perform later analysis.
[0067]
After imaging the spot of the transmitted light, the light from the transmission light source 2 is blocked, and then the excitation light source 6 is turned on or the shutter of the excitation light source 6 is opened, thereby exciting the excitation light from the excitation light source 6. To the microarray A. The light emitted from the excitation light source 6 enters the excitation filter 12, and only light having a wavelength necessary for excitation of the fluorescent material is transmitted. Excitation light that has passed through the excitation filter 12 is reflected by the dichroic mirror 8 and directed toward the objective lens 14 of the microscope 16. The excitation light reflected by the dichroic mirror 8 is collected by the objective lens 14 and applied to the microarray A.
[0068]
When the microarray A is irradiated with the excitation light, the fluorescent substance existing on the microarray A is excited by the excitation light and emits fluorescence having a wavelength different from that of the excitation light. The fluorescence emitted from the microarray A passes through the objective lens 14 and the dichroic mirror 8 and enters the absorption filter 10. Further, the wavelength component of the excitation light reflected by the microarray A and returned to the dichroic mirror 8 is reflected by the dichroic mirror 8 and therefore hardly enters the absorption filter 10. The absorption filter 10 transmits the wavelength component of the fluorescence emitted from the fluorescent material on the microarray A in the incident light, and blocks the light of the wavelength component of the excitation light. The fluorescence transmitted through the absorption filter 10 is imaged by the CCD camera 4.
[0069]
The spot image of the fluorescence emitted from the fluorescent material on the microarray A, which has been imaged by the CCD camera 4, is subjected to shading correction based on the diffusion image that has been previously captured and stored in the detection means 5. That is, the unevenness of the amount of excitation light irradiated to the microarray A is numerically corrected by the detection means 5.
[0070]
In addition, the optical system used even when the dichroic mirror 8, the absorption filter 10, and the excitation filter 12 are removed from the optical axis of the microscope 16 or when these are not removed during imaging of transmitted light. In some cases, image aberration may be caused by the aberration of the image, and this deviation is stored in the detection unit 5 in advance, and the focus position of the image capture, the position of the fluorescence image and the spot image, etc. are corrected based on the deviation. . Next, the contour image of the spot of the transmitted light previously captured and stored in the detection means 5 is superimposed on the fluorescent spot image subjected to the shading correction. The CCD reading value of each pixel inside the contour of each fluorescent spot is averaged by the detecting means 5 to obtain the average CCD reading value of the spot. From the obtained average CCD reading value, the amount of the specimen to be analyzed that forms a hybrid with each probe can be obtained.
[0071]
Further, an unnecessary portion of the image can be masked by the contour of the spot of the transmitted light stored in the detection means 5 with respect to the fluorescent spot image corrected for shading. The image masked in this way can be reduced in storage capacity by compression processing.
[0072]
According to the microarray reader according to the first or second embodiment of the present invention, it is possible to recognize in advance on which position the section is arranged on the microarray. Even in a low microarray, it is possible to accurately identify the detected fluorescence from the analyte that has formed a reaction with the probe. In addition, the transmitted light spot imaged by the CCD camera is shrunk, and the fluorescence is analyzed by adopting an image of a part of the spot, so the influence of noise other than the fluorescence emitted by the fluorescent material, such as the autofluorescence of the section itself Can be effectively removed.
[0073]
In the first or second embodiment described above, one type of fluorescent substance is applied to one microarray. However, a plurality of fluorescent substances having different fluorescence wavelengths are simultaneously applied to one microarray. You can also In this case, it is preferable that the set of the dichroic mirror 8, the absorption filter 10, and the excitation filter 12 is appropriately replaced by the control device 20 in accordance with the fluorescence wavelength to be detected. When a subtle shift occurs in the spot imaging position by exchanging the set of the dichroic mirror 8, the absorption filter 10, and the excitation filter 12, this shift is measured in advance and used. It can be configured to correct the deviation according to the set of filters and the like.
[0074]
Next, a third or fourth embodiment of the present invention will be described with reference to FIG. The microarray reading device 30 according to the third or fourth embodiment of the present invention is different from the above-described embodiment in that the light source for transmission and the light source for excitation are combined. Accordingly, here, only the points where the third or fourth embodiment is different from the above-described embodiment will be described, and description of similar configurations, operations, and effects will be omitted.
[0075]
FIG. 8 is a schematic configuration diagram of a microarray reader 30 according to the third or fourth embodiment of the present invention. As shown in FIG. 8, the microarray reader 30 according to the second embodiment of the present invention includes a transmission / excitation light source 32 that irradiates transmission light that transmits through the microarray A and excitation light that excites a fluorescent substance, and this transmission light. An excitation filter 34 that filters the light emitted from the excitation light source 32; Furthermore, the microarray reader 30 includes a CCD camera 4 that captures transmitted light and fluorescence, and a detection means 5 that analyzes the specimen.
[0076]
The microarray reader 30 includes a microscope 16 having an optical system including a dichroic mirror 8, an absorption filter 10, and an objective lens 14. Further, the microarray reading device 30 includes an XY stage 18 that moves the microarray A to a desired position in the horizontal plane, a transmission / excitation light source 32, the CCD camera 4, and the focus of the image of the microarray A that is imaged on the CCD camera 4. In order to adjust the XY stage 18, a focus stage (not shown) that moves the XY stage 18 or the objective lens 14 up and down, and a control device 20 that controls the XY stage 18 are included.
[0077]
In the present embodiment, the transmission / excitation light source 32 and the excitation filter 34 are arranged below the XY stage 18. The excitation filter 34 is configured to transmit only light having a wavelength that excites a fluorescent substance existing on the microarray A.
[0078]
Since the other components of the third embodiment of the present invention are the same as those of the above-described embodiment, description thereof will be omitted.
[0079]
Next, the operation of the microarray reader 30 according to the fourth embodiment of the present invention will be described. First, when irradiating the microarray A with transmitted light, the excitation filter 34 is removed from the optical axis, and the transmission / excitation light source 32 directly irradiates the microarray A with transmission light. The light emitted from the transmission / excitation light source 32 passes through the microarray A and is imaged by the CCD camera 4. Next, when the fluorescent material on the microarray A is excited from the transmission / excitation light source 32, the excitation filter 34 is arranged on the optical axis, and the excitation light having a wavelength capable of exciting the fluorescent material is below. To the microarray A. The excitation light transmitted through the microarray A is reflected by the dichroic mirror 8 and is deflected out of the optical axis incident on the CCD camera 4. The fluorescence emitted from the fluorescent material excited by the irradiation of the excitation light passes through the dichroic mirror 8 and the absorption filter 10 and enters the CCD camera 4. Since operations other than the above are the same as those in the above-described embodiment, the description thereof is omitted.
[0080]
According to this embodiment, the light source for transmission and the light source for excitation can be combined.
[0081]
Further, since the excitation light is irradiated from below the microarray A, all of the light incident on the microscope 16 is transmitted through the section C of the microarray A. Therefore, unlike the first or second embodiment, the excitation light applied to the microarray A is reflected by the base portion B of the microarray A, and the reflected light does not enter the microscope 16. Thereby, the S / N ratio of the fluorescence to be detected can be improved.
[0082]
【The invention's effect】
According to the microarray reader of the present invention, the position of the section to be detected and / or the position where the probe is immobilized and / or the microarray having low fluorescence intensity and the microarray having low array accuracy are mixed without mixing a new substance in the probe. The size information can be obtained accurately.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a schematic configuration diagram of a microarray reader according to a first embodiment of the present invention.
FIG. 2 is a plan view of a microarray used in the microarray reader according to the first embodiment of the present invention.
FIG. 3 is a diagram illustrating an example of a spot of light transmitted through a microarray imaged by a CCD camera.
4 shows an example of the result of reducing the diameter of the spot of transmitted light shown in FIG. 3. FIG.
FIG. 5 is a diagram illustrating an example of fluorescent spots emitted from a microarray imaged by a CCD camera.
6 is a diagram showing a result of superimposing the outline of the spot of transmitted light having a reduced diameter shown in FIG. 4 on the spot of fluorescence shown in FIG. 5;
FIG. 7 is a graph showing the relationship between the CCD reading value of each fluorescent spot and the concentration of fluorescent substance immobilized on the corresponding spot.
FIG. 8 is a schematic configuration diagram of a microarray reader according to a second embodiment of the present invention.
FIG. 9 is a diagram illustrating an example of a case where a spot of light transmitted through a microarray imaged by a CCD camera is deviated from the CCD camera field of view.
[Explanation of symbols]
A Microarray
B Base material part
C section
1. Microarray reader according to the first embodiment of the present invention
2 Light source for transmission
4 CCD camera
5 Detection means
6 Light source for excitation
8 Dichroic Mirror
10 Absorption filter
12 Excitation filter
14 Objective lens 14
16 Microscope
18 XY stage
20 Control device
30 Microarray reader according to the second embodiment of the present invention
32 Light source for transmission and excitation
34 Excitation filter

Claims

蛍光物質が付与された検体を反応させた複数の区画を含み、区画と区画以外の部分との光透過率が異なる生体関連物質マイクロアレイから、蛍光物質が発する蛍光を読み取る読取装置であって、マイクロアレイに光を透過させる透過用光源と、区画に存在する蛍光物質を励起する励起用光源と、透過用光源から照射され、マイクロアレイを透過した透過光、及び励起用光源によって励起された蛍光物質から発せられる蛍光を撮像する撮像手段と、この撮像手段によって撮像された、マイクロアレイを透過した光の画像に基づいて、マイクロアレイ上に配置された区画の位置及び／又は大きさを検出する検出手段とを含む、生体関連物質マイクロアレイ読取装置。 A reader that reads a fluorescence emitted from a fluorescent substance from a bio-related substance microarray that includes a plurality of compartments that have reacted with a specimen to which a fluorescent substance has been applied and that has different light transmittances between the compartments and portions other than the compartment. Emitted from the transmission light source that transmits light to the light source, the excitation light source that excites the fluorescent material present in the compartment, and the transmitted light that is irradiated from the transmission light source and transmitted through the microarray, and the fluorescent material that is excited by the excitation light source Image pickup means for picking up the captured fluorescence, and detection means for detecting the position and / or size of the section arranged on the microarray based on the image of light picked up by the image pickup means and transmitted through the microarray A bio-related substance microarray reader.

マイクロアレイを透過した光を撮像する際の光学系と、蛍光物質から発せられた蛍光を撮像する際の光学系との差を補正する補正手段を更に含む、請求項１記載の読取装置。 The reading apparatus according to claim 1, further comprising correction means for correcting a difference between an optical system for imaging light transmitted through the microarray and an optical system for imaging fluorescence emitted from the fluorescent material.

複数の区画を含み、区画と区画以外の部分との光透過率が異なる生体関連物質マイクロアレイに、蛍光物質が付与された検体を反応させるステップと、該マイクロアレイに光を照射し、マイクロアレイを透過した透過光を撮像するステップと、前記ステップにおいて撮像された透過光に基づいて、区画の位置及び／又は大きさを検出するステップと、マイクロアレイに励起光を照射してマイクロアレイの区画に存在する蛍光物質を励起し、この蛍光物質から発せられる蛍光を撮像するステップと、前記ステップにおいて撮像された蛍光を、透過光に基づいて検出された区画の位置及び／又は大きさに基づいて読み取るステップとを含む、生体関連物質マイクロアレイの読取方法。 A step involving reacting a specimen to which a fluorescent substance has been applied to a bio-related substance microarray including a plurality of compartments and having different light transmittances between the compartments and portions other than the compartments, and irradiating the microarray with light and transmitting the microarray A step of imaging the transmitted light; a step of detecting the position and / or size of the section based on the transmitted light imaged in the step; and a fluorescent substance existing in the section of the microarray by irradiating the microarray with excitation light. And imaging the fluorescence emitted from the fluorescent material, and reading the fluorescence imaged in the step based on the position and / or size of the section detected based on the transmitted light A method for reading a bio-related substance microarray.

複数の区画を含み、区画と区画以外の部分との光透過率が異なる生体関連物質マイクロアレイに、蛍光物質が付与された検体を反応させるステップと、該マイクロアレイに光を照射し、マイクロアレイを透過した透過光を撮像するステップと、前記ステップにおいて撮像された透過光に基づいて、区画の位置を、撮像する視野内の適切な位置に移動させるステップと、再びマイクロアレイに光を照射し、マイクロアレイを透過した透過光を撮像するステップと、区画の位置及び／又は大きさを検出するステップと、マイクロアレイに励起光を照射してマイクロアレイの区画に存在する蛍光物質を励起し、この蛍光物質から発せられる蛍光を撮像するステップと、前記ステップにおいて撮像された蛍光を、透過光に基づいて検出された区画の位置及び／又は大きさに基づいて読み取るステップとを含む、生体関連物質マイクロアレイの読取方法。 A step involving reacting a specimen to which a fluorescent substance has been applied to a bio-related substance microarray including a plurality of compartments and having different light transmittances between the compartments and portions other than the compartments, and irradiating the microarray with light and transmitting the microarray The step of imaging the transmitted light, the step of moving the position of the section to an appropriate position in the field of view to be imaged based on the transmitted light imaged in the step, and irradiating the microarray again with light and transmitting through the microarray Imaging the transmitted light, detecting the position and / or size of the section, and irradiating the microarray with excitation light to excite the fluorescent substance present in the section of the microarray, and the fluorescence emitted from the fluorescent substance And the fluorescence imaged in the step is detected based on the transmitted light. And / or size and a step of reading on the basis of the of the reading of the biological substance microarray method.