JP4043581B2 - Process for producing N-vanillyl fatty acid amide - Google Patents

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、Ｎ-バニリル脂肪酸アミドの製造法に関するものであり、特に、Ｎ-バニリル脂肪酸アミドの中でも有用性の高い無辛味カプサイシン類縁体を製造する方法とそれを応用した無辛味カプサイシン類縁体含有油脂類の製造法に関するものである。
【０００２】
なお、この明細書ではＮ-バニリル脂肪酸アミドのうちトウガラシの辛味成分であるカプサイシンと同様に生理学的有用作用を有するものをカプサイシン類縁体といい、カプサイシン類縁体の中でも実質的に辛味がないものを無辛味カプサイシン類縁体という。
【０００３】
【従来の技術】
香辛料として広く利用されているトウガラシの主要辛味成分は、カプサイシン（8-メチル-N-バニリル-6-ノネンアミド）およびジヒドロカプサイシン（8-メチル-N-バニリル-ノナンアミド）である（以下、ジヒドロカプサイシンを含む意味でカプサイシンということがある）。カプサイシンは、強い辛味を有するだけでなく、食欲増進作用、血管拡張・収縮作用、唾液分泌亢進作用、胃酸分泌亢進作用、腸管蠕動運動亢進作用、循環器系コレステロール値低下作用、エネルギー代謝亢進作用、生理活性ペプチドの放出亢進作用等、生体に有用な様々な作用を有することで知られている。
【０００４】
中でもエネルギー代謝亢進作用については近年分子レベルでの解明が進み、次のような事実が明らかになった。すなわち、カプサイシンは副腎からのカテコラミンの分泌を促進することにより白色脂肪組織での脂肪分解を促すと共に褐色脂肪組織での熱産生を亢進させ、その結果、蓄積した体脂肪を減少させ且つ血清トリグリセリド値を低下させる。
【０００５】
したがって、肥満の防止と解消のためにカプサイシンを積極的に摂取することが考えられるが、効果が期待できる量のカプサイシンを継続的に摂取するにはカプサイシンの強い辛味が妨げとなる。
【０００６】
そこで、化学構造がカプサイシンと類似するＮ-バニリル脂肪酸アミドの中から上記カプサイシンが有する生理学的作用と同様の有用作用を有し辛味はカプサイシンほど強くないものを探索する研究がなされ、その結果、Ｎ-バニリル脂肪酸アミド類においては直鎖脂肪酸残基の炭素数が９のもの（たとえばカプサイシン）をピークにして炭素数が多くなるほど辛味は少なくなること（炭素数１１以上であれば辛味は微弱になり、炭素数１２以上であればほとんど辛味を感じない）、カテコラミン分泌促進作用は脂肪酸残基の炭素数が９〜２０の範囲ではほとんど変わりがないこと、などが確認された（Life Sciences,Vol.54,pp.369-374)。
【０００７】
カプサイシン類縁体の中に辛味の微弱なものが発見されたことは、辛味によって妨害されることなしにカプサイシン類縁体の上記さまざまな有用作用を経口的に利用できる可能性を示唆した。
【０００８】
辛くないカプサイシン類縁体すなわち無辛味カプサイシン類縁体を豊富に含有する植物体はまだ発見されていないので、これを食品分野で利用しようとするならば合成品を使用することになる。上述のカプサイシン類縁体についての研究において使われたＮ-バニリル脂肪酸アミド類はバニリルアミン塩酸塩と脂肪酸塩化物から合成されたものであるが、収率は多少悪くても、高価で取り扱いも厄介な酸塩化物を原料としない製造法によるものが望まれる。
【０００９】
酸塩化物を使用せずに脂肪酸アミドを合成する方法の一つは、リパーゼを用いて脂肪酸とアミンを反応させる方法である。しかしながら、油脂加水分解酵素として知られるリパーゼを用いてアミド合成に成功した例はきわめて少なく、メチル酪酸とブチルアミンをヘキサン中で反応させた例やペプチド合成に利用した例（日本農芸化学会誌 Vol.62,No.4,pp783-786,1988）のほか、直鎖脂肪酸とn-オクチルアミンとをヘキサン中で反応させた例（Tetrahedron Letters,Vol.32,No.24,pp2763-2764,1991）などが報告されているにすぎない。このことからも明らかなように、リパーゼを用いる合成法は一般的なアミド合成法として確立されているものではなく、リパーゼがアミドを生じさせることができる基質はきわめて限定されている可能性がある。
【００１０】
リパーゼを用いてカプサイシン類縁体を合成しようとする場合、用いるアミンはバニリルアミンであるが、このアミンは、メチルアミンのメチル基の水素原子の一つが 3-メトキシ-4-ヒドロキシフェニル基で置換された形の、フェノール性化合物でもある特種なアミンであるだけに、これがリパーゼの基質となってアミドを生じるかどうかは全く不明であった。
【００１１】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、酸塩化物を原料とすることなく無辛味カプサイシン類縁体およびその他のＮ-バニリル脂肪酸アミドを製造する方法を提供することにある。
【００１２】
本発明の他の目的は、酵素反応による無辛味カプサイシン類縁体およびその他のＮ-バニリル脂肪酸アミドの製造を可能にすることにある。
【００１３】
本発明の他の目的は、カプサイシンを原料にして無辛味カプサイシン類縁体を製造する方法を提供することにある。
【００１４】
本発明の他の目的は、無辛味カプサイシン類縁体を含有する食用油脂類を提供することにある。
【００１５】
【課題を解決するための手段】
本発明は、脂肪酸、脂肪酸エステル、または天然油脂類をリパーゼの存在下に水溶液状態のバニリルアミンと反応させることを特徴とするＮ-バニリル脂肪酸アミド（化１）の製造法の発明、および、この発明に基づく下記各発明を提供するものである。
【００１６】
【化１】

【００１７】
式中、Ｒは飽和または不飽和のアルキル基であって、水酸基で置換されていてもよい。
【００１８】
無辛味カプサイシン類縁体の製造法：バニリルアミンの水溶液をリパーゼの存在下に炭素数１２〜２２の脂肪酸またはそのエステルと接触させることによりバニリルアミンと上記脂肪酸またはエステルとを反応させて、化１におけるＲが炭素数１１〜２１のものであるＮ-バニリル脂肪酸アミドを生成させることを特徴とする。
【００１９】
無辛味カプサイシン類縁体を含有する油脂の製造法：食用油脂をリパーゼの存在下にバニリルアミンの水溶液と接触させることによりバニリルアミンと反応させて該食用油脂の一部よりＮ-バニリル脂肪酸アミドを生成させたのち油相を採取することを特徴とする。
【００２０】
【発明の実施の形態】
リパーゼを触媒として使用する本発明の製造法で基質とする脂肪酸は、無辛味カプサイシン類縁体を製造する場合においては炭素数が１２〜２２、好ましくは炭素数１４〜２０のものになるが、無辛味カプサイシン類縁体に限定されないＮ-バニリル脂肪酸アミドを製造する場合は、炭素数に制限はない。脂肪酸は飽和脂肪酸、不飽和脂肪酸、直鎖脂肪酸、および分枝を有する脂肪酸のいずれであっても差し支えなく、さらに、オキシ脂肪酸やポリカルボン酸であってもよい。具体的には、たとえば次のようなものを使用することができる。
【００２１】
飽和直鎖脂肪酸：ラウリン酸，ミリスチン酸，パルミチン酸，ステアリン酸，アラキン酸，ベヘン酸，リグノセリン酸，ペンタデシリック酸，マーガリック酸，ノナデシリック酸，ヘンエイコサン酸，トリコサン酸
【００２２】
飽和分枝脂肪酸：イソミリスチン酸，イソパルミチン酸，イソステアリン酸，イソアラキン酸，19-メチル-エイコサン酸，α-エチル-ヘキサン酸
【００２３】
不飽和脂肪酸：デンチセチン酸，ラウロレイン酸，ツヅ酸，フィトセトレイン酸，ミリストレイン酸，パルミトレイン酸，ペトロセリン酸，オレイン酸，エライジン酸，バクセン酸，カドレイン酸，セトレイン酸，エルカ酸，セラコレイン酸，リノール酸，α−リノレン酸，γ−リノレン酸，α-エレオステアリン酸，β-エレオステアリン酸，プニカ酸，6,9,12,15-オクタデカテトラエン酸，パルナリン酸，アラキドン酸，5,8,11,14,17-エイコサペンタエン酸，7,10,13,16,19-ドコサペンタエン酸，4,7,10,13,16,19-ドコサヘキサエン酸
【００２４】
オキシ脂肪酸：α-ヒドロキシミリスチン酸，α-ヒドロキシパルミチン酸，α-ヒドロキシステアリン酸，α-ヒドロキシアラキン酸，9-ヒドロキシ-12-オクタデセン酸，リシノール酸，α-ヒドロキシベヘニン酸，カモレン酸，イプロリン酸，9,10-ジヒドロキシステアリン酸，12-ヒドロキシステアリン酸
【００２５】
上記脂肪酸類のエステルは、いずれも本発明の製造法において基質として使用することができる。エステルのアルコール成分の炭素数および水酸基数に制限はなく、また、直鎖アルコールである必要もない。しかしながら、その中でも炭素数が１４までのもの、特に炭素数が１〜６の脂肪族アルコールは好ましいものであり、その具体例としては、メチルアルコール、エチルアルコール、n-プロピルアルコール、イソプロピルアルコール、n-ブチルアルコール、イソブチルアルコール、n-ヘキシルアルコール等の１価アルコールのほか、グリセリンのような多価アルコールがある。
【００２６】
アルコール成分がグリセリンである脂肪酸エステルすなわちグリセリドは、モノエステル、ジエステルおよびトリエステルのいずれであってもよく、これらの混合物であってもよい。したがって、グリセリンエステルは動植物由来の天然油脂であってもよく、むしろ、製品を食品分野で利用する場合の安全性を考慮すると、天然の食用油脂は本発明の製造法の原料として最も好ましいものである。
【００２７】
食用に利用される油脂のトリグリセリドを構成している脂肪酸類のほとんどは炭素数が１２以上のものであるから、油脂をバニリルアミンと反応させた場合に生じるＮ-バニリル脂肪酸アミド群は事実上無辛味カプサイシン類縁体のみからなるものとなる。
【００２８】
利用可能な油脂の具体例としては、アマニ油、オリーブ油、カカオ油、ツバキ油、菜種油、トウモロコシ油、ゴマ油、ベニバナ油、シソの実油、小麦胚芽油、パーム油、パーム核油、ヒマシ油、ヤシ油、落花生油、ヒマワリ油、綿実油、米ぬか油、大豆油、木ロウ油、イワシ油、カツオ油、ニシン油、サメ油等がある。
【００２９】
上述の脂肪酸および脂肪酸エステルは、２種以上を混合して反応原料とすることもできる。
【００３０】
脂肪酸またはそのエステルと反応させるバニリルアミンとしては、市販されている合成品を使用してもよいが、安全性を考慮しなるべく天然の原料を使用するという観点からは、トウガラシから抽出されたカプサイシンその他のＮ-バニリル脂肪酸アミドを酸、アルカリ、または加水分解酵素を用いて加水分解することにより調製されたものが好ましい。
【００３１】
カプサイシン等のＮ-バニリル脂肪酸アミドをトウガラシから抽出するには、たとえばメタノール、エタノール等の低級アルコール類、1,3-ブチレングリコール、グリセリン等の多価アルコール類、ヘキサン等の炭化水素類等を抽出溶媒として抽出すればよい。これをバニリルアミンと構成脂肪酸に加水分解するには、鉱酸または苛性アルカリを加えて加熱する。反応終了後、中和して減圧下に濃縮し、ヘキサン等の親油性有機溶媒を用いて脂肪酸および未反応のＮ-バニリル脂肪酸アミドを抽出し、水層にバニリルアミンを得る。これを任意の方法で精製し、反応原料とする。Ｎ-バニリル脂肪酸アミドを酵素的に加水分解するには、これを基質とし得る加水分解酵素を作用させるか、該加水分解酵素を産生する微生物（たとえばアスペルギルス・オリゼ）の培養物中に基質を加えて加水分解反応を生じさせる（発酵工学：第63巻，第3号，221頁）。
【００３２】
バニリルアミンは、塩酸塩の形で反応系に加えてもよい。
【００３３】
アミド形成反応の触媒として使用するリパーゼに特殊なものは必要なく、グリセリドの加水分解用酵素として市販されているリパーゼまたはリパーゼを主成分とする複合酵素製剤をいずれも使用することができる。リパーゼは、通常、リパーゼ産生能を有する微生物の培養液から製造されたものが市販されているが、アミド形成反応を触媒する作用は製造に使われた微生物の種類とは無関係である。
【００３４】
いうまでもなく、リパーゼは固定化酵素の形で使用してもよく、また、リパーゼを菌体外に産生する能力を有する微生物菌体、その培養液、または該培養液より得られる粗酵素液も、本発明のために使用することができる。
【００３５】
本発明のためのリパーゼの起源微生物となり得るものを例示すると、次のようなものがある。
ムコル属微生物：ムコル・ミーヘイ，ムコル・ジャバニクス
アスペルギルス属微生物：アスペルギルス・ニガー
リゾプス属微生物：リゾプス・デレマー，リゾプス・ニベウス
ジオトリカム属微生物：ジオトリカム・カンジダム
ベニシリウム属微生物：ペニシリウム・シクロピウム，ペニシリウム・ロクエフォルテ
フィコミセス属微生物：フィコミセス・ニテンス
フミコラ属微生物：フミコラ・ラヌギノーザ
クロモバクテリウム属微生物：クロモバクテリウム・ビスコーサム
アースロバクター属微生物：アースロバクター・ウレアファシエンス
シュードモナス属微生物：シュードモナス・メフィチカ，シュードモナス・セパシア，シュードモナス・フルオレッセンス
キャンディダ属酵母：キャンディダ・シリンドラシェ，キャンディダ・ルゴーサ，キャンディダ・リポリティカ，キャンディダ・アンタルクティカ
【００３６】
リパーゼを用いて脂肪酸またはそのエステルとバニリルアミンを反応させる場合、バニリルアミンおよびリパーゼは水溶液にする。この水溶液には、リパーゼ活性化のための助剤（たとえばカルシウム塩）その他を必要に応じて添加することができる。
【００３７】
脂肪酸およびそのエステルは、そのまま反応させるか、リパーゼを失活させない疎水性有機溶媒（たとえばヘキサン）に溶かして反応させる。無辛味カプサイシン類縁体の製造に使用するような炭素数の多い脂肪酸およびそのエステルは水に溶けないので、有機溶媒を使用する場合も使用しない場合も、反応系は通常水相と油相の２相からなるものとなる（固定化酵素または不溶化酵素の形で使われたリパーゼは固相として存在することになる。また、用いる脂肪酸またはそのエステルが炭素数の少ない水溶性のものの場合、それはバニリルアミン水溶液に溶け込むので、反応系は水相だけになる。）。
【００３８】
反応系が水相と油相の２相になる反応の場合は、原料混合物を激しく撹拌または振盪して水中油滴型の分散状態を生じさせることにより２相の接触面積を大きくし、界面で生じる反応の機会を増やす。このとき水相と油相の体積比が著しくアンバランスであると好ましい分散状態にならないので、水相１００容量部に対して油相が約５０〜２００容量部になるようにして反応させることが望ましい。水相には、両基質と酵素の接触性を高めるために、酵素阻害作用のない界面活性剤たとえばツイーン８０、トリトンＸ１００等を微量添加してもよい。
【００３９】
高価なバニリルアミンの反応率を高くするためには、理論値よりも大過剰の脂肪酸またはそのエステルを反応系に存在させることが望ましい。通常、バニリルアミンに対して当量比で約３倍以上、好ましくは約３０〜１０００倍の脂肪酸またはそのエステルを存在させるとよい。
【００４０】
基質または（および）酵素は、生産性を高めるため反応系に連続的に（または間欠的に）添加してもよい。
【００４１】
反応温度、水相のpＨ等の反応条件は、用いるリパーゼにとって最適な条件に選定すればよいが、一般的な反応温度は５〜８０℃、pＨは４〜１１である。
【００４２】
反応を続けると徐々にＮ-バニリル脂肪酸アミドが生成し、生成した該アミドは主として油相に溶け込むが、一部は水相にも分布する。反応混合物から目的物を採取するには、反応混合物全体をｎ−ヘキサン等の有機溶媒で抽出することにより目的物を未反応の油性原料と共に抽出し、その後、抽出液から目的物を分離する処理を行う方法と、反応混合物を静置または遠心分離して油相と水相を分取し、それらに対して個々に、あるいは油相部分だけに、目的物を採取する処理を施す方法とがある。目的物と油性原料とを分離するには、カラムクロマトグラフィー等任意の手段を採用することができる。
【００４３】
食用油脂を原料に用いて無辛味カプサイシン類縁体を含有する油脂を製造する場合は、反応混合物を静置または遠心分離して油相を分取し、必要に応じて洗浄、脱水、脱臭、脱色、転溶、乾燥等の処理を施してから利用に供する。
【００４４】
本発明の製造法により得られた無辛味カプサイシン類縁体またはそれを含有する油脂は、抗肥満作用を有する機能性食品、健康食品等の製造原料として利用することができる。
【００４５】
【実施例】
以下、実施例を示して本発明をさらに詳しく説明する。なお、各例において使用したリパーゼの詳細は次のとおりである。
【００４６】
リパーゼＦ：天野製薬社製，リゾプス・ニベウス由来
リパーゼＡ：天野製薬社製，アスペルギルス・ニガー由来
リパーゼＭ：天野製薬社製，ムコル・ジャバニクス由来
リパーゼＡＹ：天野製薬社製，キャンディダ・ルゴーサ由来
リパーゼＰＳ−Ｃ：天野製薬社製，シュードモナス・セパシア由来固定化酵素
リパーゼＡＫ：天野製薬社製，シュードモナス・フルオレッセンス由来
リパーゼＤ：天野製薬社製，リゾプス・デレマー由来
リパーゼＲ：天野製薬社製，ペニシリウム・ロックエフォルテ由来
リパーゼＬ：天野製薬社製，キャンディダ・リポリティカ由来
ニューラーゼＦ：天野製薬社製，リゾプス・ニベウス由来
リポザイム：ノボルディスク社製，ムコル・ミーヘイ由来固定化酵素
ノボザイム４３５：ノボルデイスク社製，キャンディダ・アンタルクティカ由来固定化酵素
リパーゼ：シグマ社製，キャンディダ・シリンドラシェ由来
【００４７】
また、酵素反応で生成したＮ-バニリル脂肪酸アミドの生成量は下記条件の高速液体クロマトグラフィーにより定量した。
カラム：Wakosil 5C18 AR, 4.6×150mm
キャリヤ−：メタノール
流速：０.５ml／min
検出波長：蛍光検出，Ｅx 280nm, Ｅm 320nm
【００４８】
実施例１
バニリルアミン塩酸塩３７.８mg（０.２mmol）を１０mMホウ酸緩衝液（pＨ９.０）１０mlに溶解し、そこにノボザイム４３５を１０００mg、ミリスチン酸メチルエステルを５.８０ｇ（２４mmol）加えて、撹拌しながら７０℃で所定の時間反応させる。その後、反応混合物を高速液体クロマトグラフィーで分析し、生成したＮ−バニリルミリスチン酸アミドを定量する。
【００４９】
反応時間を種々変更して上記の反応を行い、用いたバニリルアミンの量を基準とする反応収率を求めた結果は表１のとおりであった。
【００５０】
【表１】

【００５１】
実施例２
リパーゼを他のものに変更し反応時間を７２時間に固定したほかは実施例１と同様にして、バニリルアミンとミリスチン酸メチルエステルを反応させた。その結果を表２に示す。
【００５２】
【表２】

【００５３】
実施例３
ミリスチン酸メチルエステルを同じモル数の他の脂肪酸エステルまたは脂肪酸に変えたほかは実施例１と同様の実験を行なった。その結果を表３に示す。
【００５４】
【表３】

【００５５】
実施例４
バニリルアミン塩酸塩３７.８mg（０.２mmol）を１０mMホウ酸緩衝液（pＨ９.０）１０mlに溶解し、そこにリパーゼＦを２００mg、トリオレインを８.８４ｇ（１０mmol）加えて、窒素雰囲気で撹拌しながら３７℃で所定の時間反応させる。その後、反応混合物を高速液体クロマトグラフィーで分析し、生成したＮ−バニリルミリスチン酸アミドを定量する。
【００５６】
反応時間を種々変更して上記の反応を行い、用いたバニリルアミンの量を基準とするＮ−バニリルオレイン酸アミドの収率を求めた結果は表４のとおりであった。
【００５７】
【表４】

【００５８】
実施例５
リパーゼを他のものに変更し反応時間を１４４時間に固定したほかは実施例４と同様にして、バニリルアミンとトリオレインを反応させた。その結果を表５に示す。
【００５９】
【表５】

【００６０】
実施例６
トリオレインを同じ重量の天然油脂に変えたほかは実施例５と同様の実験を行なった。その結果を表６に示す。なお、収率は用いたバニリルアミンの量を基準とする全Ｎ-バニリル脂肪酸アミドの収率である。
【００６１】
【表６】

【００６２】
実施例７
トウガラシ果実（マラウィ産）１０００ｇをn-ヘキサン：n-プロパノール＝８：２の混合溶媒１０リットルで還流下に加熱し、得られた抽出液を減圧下に濃縮して、オレオレジン６２ｇを得た。このオレオレジン全量に７０％エタノール１００mlを加え、室温で１時間撹拌したのち静置して、生じた沈殿物を濾過した。得られた濾液を減圧下に濃縮し、カプサイシンを含有するトウガラシ抽出物７ｇを得た。
【００６３】
このトウガラシ抽出物をカビ培養用培地・ツアペックドックスブロース（日水製薬社製）１０００mlに混合し、そこにアスペルギルス・オリゼの胞子を接種して３７℃で７日間振盪培養した。培養終了後、培養液をヘキサン１０００mlで抽出し、水層を減圧下に濃縮して、１.８ｇのペースト状バニリルアミンを得た。
【００６４】
このバニリルアミン１.０ｇを水１００mlに溶解し、pＨを９.０に調整後、リパーゼＡＹ１.０ｇおよびオリーブ油１０.０ｇを加え、撹拌しながら３７℃で反応させた。高速液体クロマトグラフィーによる反応混合物の分析を続けたところ徐々にＮ-バニリルオレイン酸アミドが生成し、その生成量は１４４時間後に１１０mgになった。
【００６５】
実施例８
実施例７と同様にしてトウガラシ果実からバニリルアミンを得、その１.０ｇを１００mlの水に溶解し、pＨを９.０に調整後、リパーゼＰＳ１.０ｇおよびシソの実油１０ｇを加え、３７℃で１４４時間撹拌を続けることにより、シソの実油の一部からＮ-バニリル脂肪酸アミドを生成させた。
【００６６】
その後、静置して分離した油層を分取し、無辛味カプサイシン類縁体を含有するシソの実油を得た。
【００６７】
【発明の効果】
上述のように、本発明によれば酸塩化物を原料としない無辛味カプサイシン類縁体およびその他のＮ-バニリル脂肪酸アミドの製造が可能になり、食品分野における無辛味カプサイシン類縁体の利用が容易になる。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
TECHNICAL FIELD The present invention relates to a method for producing N-vanillyl fatty acid amide, and in particular, a method for producing a non-pasteur capsaicin analog that is highly useful among N-vanillyl fatty acid amides, and a spicy capsaicin analog containing the same. The present invention relates to a method for producing fats and oils.
[0002]
In this specification, among N-vanillyl fatty acid amides, those having a physiologically useful action similar to capsaicin, which is a pungent component of pepper, are referred to as capsaicin analogs, and among capsaicin analogs, those having substantially no pungency. It is called a spicy capsaicin analog.
[0003]
[Prior art]
Capsicin (8-methyl-N-vanillyl-6-nonenamide) and dihydrocapsaicin (8-methyl-N-vanillyl-nonanamide) (hereinafter referred to as dihydrocapsaicin) are widely used as spices. It may be called capsaicin in the meaning to include). Capsaicin not only has a strong pungent taste, but also increases appetite, vasodilation / contraction, salivary secretion, gastric acid secretion, gastrointestinal peristalsis, circulatory cholesterol lowering, energy metabolism, It is known to have various effects useful for living bodies, such as a release enhancing action of bioactive peptides.
[0004]
In particular, the energy metabolism enhancing action has been elucidated at the molecular level in recent years, and the following facts have been clarified. That is, capsaicin promotes lipolysis in white adipose tissue by promoting secretion of catecholamine from the adrenal gland and enhances heat production in brown adipose tissue, resulting in decreased accumulated body fat and serum triglyceride levels Reduce.
[0005]
Therefore, it is conceivable to actively take capsaicin to prevent and eliminate obesity, but the strong pungency of capsaicin hinders continuous consumption of capsaicin in an amount that can be expected to be effective.
[0006]
Therefore, research has been conducted to search for N-vanillyl fatty acid amides having a chemical structure similar to capsaicin, which have the same useful effects as those of capsaicin and have a less pungent taste than capsaicin. -In vanillyl fatty acid amides, the peak of the straight-chain fatty acid residue having 9 carbon atoms (for example, capsaicin), and the higher the carbon number, the less the pungent taste (if the carbon number is 11 or more, the pungent taste becomes weaker). It was confirmed that the catecholamine secretion-promoting action is almost unchanged in the range of 9 to 20 carbon atoms in the fatty acid residue (Life Sciences, Vol. 12). 54, pp.369-374).
[0007]
The discovery of a weak pungent taste among capsaicin analogs suggested the possibility that the various useful effects of capsaicin analogs could be used orally without being hindered by the pungent taste.
[0008]
A non-spicy capsaicin analog, that is, a plant body containing abundant spicy capsaicin analogs has not yet been discovered, and if it is to be used in the food field, a synthetic product will be used. The N-vanillyl fatty acid amides used in the research on the capsaicin analogs described above were synthesized from vanillylamine hydrochloride and fatty acid chloride, but the yield was somewhat poor but expensive and cumbersome to handle. A production method using no chloride as a raw material is desired.
[0009]
One method for synthesizing a fatty acid amide without using an acid chloride is a method of reacting a fatty acid with an amine using lipase. However, there have been very few examples of successful amide synthesis using a lipase known as an oil and fat hydrolase, examples of reaction of methylbutyric acid and butylamine in hexane, and examples of peptide synthesis (Japanese Journal of Agricultural Chemistry Vol.62 , No.4, pp783-786, 1988), as well as examples of reaction of linear fatty acids and n-octylamine in hexane (Tetrahedron Letters, Vol.32, No.24, pp2763-2764, 1991), etc. Is only reported. As is clear from this, the synthesis method using lipase has not been established as a general amide synthesis method, and the substrates on which lipase can generate amides may be extremely limited. .
[0010]
When using lipase to synthesize capsaicin analogs, the amine used is vanillylamine, but this amine has one of the methylamine hydrogen atoms substituted with a 3-methoxy-4-hydroxyphenyl group. Since it is a special amine in the form, which is also a phenolic compound, it was completely unclear whether it would be a substrate for lipases to produce amides.
[0011]
[Problems to be solved by the invention]
An object of the present invention is to provide a method for producing a spicy capsaicin analog and other N-vanillyl fatty acid amides without using an acid chloride as a raw material.
[0012]
Another object of the present invention is to enable the production of spicy capsaicin analogs and other N-vanillyl fatty acid amides by enzymatic reactions.
[0013]
Another object of the present invention is to provide a method for producing a non-savory capsaicin analog using capsaicin as a raw material.
[0014]
Another object of the present invention is to provide edible fats and oils containing a non-savory capsaicin analog.
[0015]
[Means for Solving the Problems]
The present invention relates to an invention of a method for producing N-vanillyl fatty acid amide (Chemical Formula 1), characterized by reacting a fatty acid, fatty acid ester, or natural fats and oils with vanillylamine in an aqueous solution in the presence of lipase, and this invention The following inventions based on the above are provided.
[0016]
[Chemical 1]

[0017]
In the formula, R is a saturated or unsaturated alkyl group, which may be substituted with a hydroxyl group.
[0018]
Process for producing spicy capsaicin analog: An aqueous solution of vanillylamine is brought into contact with a fatty acid having 12 to 22 carbon atoms or an ester thereof in the presence of lipase to react the vanillylamine with the fatty acid or ester so that R in Chemical Formula 1 is N-vanillyl fatty acid amide having 11 to 21 carbon atoms is produced.
[0019]
Method for producing fat and oil containing spicy capsaicin analogue: N-vanillyl fatty acid amide was formed from a portion of the edible fat by reacting edible fat with vanillylamine in the presence of lipase to react with vanillylamine The oil phase is collected afterwards.
[0020]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
The fatty acid used as a substrate in the production method of the present invention using lipase as a catalyst has 12 to 22 carbon atoms, preferably 14 to 20 carbon atoms, in the production of a spicy capsaicin analog. When producing N-vanillyl fatty acid amides that are not limited to pungent capsaicin analogs, there is no limitation on the number of carbon atoms. The fatty acid may be any of a saturated fatty acid, an unsaturated fatty acid, a linear fatty acid, and a branched fatty acid, and may be an oxy fatty acid or a polycarboxylic acid. Specifically, for example, the following can be used.
[0021]
Saturated linear fatty acids: lauric acid, myristic acid, palmitic acid, stearic acid, arachidic acid, behenic acid, lignoceric acid, pentadecylic acid, margaric acid, nonadecilic acid, heneicosanoic acid, tricosanoic acid
Saturated branched fatty acids: isomyristic acid, isopalmitic acid, isostearic acid, isoarachidic acid, 19-methyl-eicosanoic acid, α-ethyl-hexanoic acid
Unsaturated fatty acids: dentetic acid, lauroleic acid, oxalic acid, phytocetoleic acid, myristoleic acid, palmitoleic acid, petrothelic acid, oleic acid, elaidic acid, vaccenic acid, cadreic acid, cetreic acid, erucic acid, ceracoleic acid, linoleic acid Acid, α-linolenic acid, γ-linolenic acid, α-eleostearic acid, β-eleostearic acid, punicic acid, 6,9,12,15-octadecatetraenoic acid, parnaric acid, arachidonic acid, 5 , 8,11,14,17-eicosapentaenoic acid, 7,10,13,16,19-docosapentaenoic acid, 4,7,10,13,16,19-docosahexaenoic acid
Oxy fatty acids: α-hydroxymyristic acid, α-hydroxypalmitic acid, α-hydroxystearic acid, α-hydroxyarachidic acid, 9-hydroxy-12-octadecenoic acid, ricinoleic acid, α-hydroxybehenic acid, camolenic acid, Iprolic acid, 9,10-dihydroxystearic acid, 12-hydroxystearic acid
Any of the above esters of fatty acids can be used as a substrate in the production method of the present invention. There is no restriction | limiting in carbon number and hydroxyl number of the alcohol component of ester, and it is not necessary to be a linear alcohol. However, among them, those having up to 14 carbon atoms, particularly aliphatic alcohols having 1 to 6 carbon atoms are preferred, and specific examples thereof include methyl alcohol, ethyl alcohol, n-propyl alcohol, isopropyl alcohol, n In addition to monohydric alcohols such as -butyl alcohol, isobutyl alcohol and n-hexyl alcohol, there are polyhydric alcohols such as glycerin.
[0026]
The fatty acid ester in which the alcohol component is glycerin, that is, glyceride may be any of monoester, diester and triester, or a mixture thereof. Therefore, the glycerin ester may be a natural fat derived from animals and plants. Rather, considering the safety when using the product in the food field, natural edible fats and oils are the most preferable raw materials for the production method of the present invention. is there.
[0027]
Since most of the fatty acids constituting the triglycerides of fats and oils used for food are those having 12 or more carbon atoms, the N-vanillyl fatty acid amide group produced when fats and oils are reacted with vanillylamine is virtually spicy. It consists only of capsaicin analogs.
[0028]
Specific examples of oils that can be used include flaxseed oil, olive oil, cacao oil, camellia oil, rapeseed oil, corn oil, sesame oil, safflower oil, perilla seed oil, wheat germ oil, palm oil, palm kernel oil, castor oil, There are coconut oil, peanut oil, sunflower oil, cottonseed oil, rice bran oil, soybean oil, tree wax oil, sardine oil, bonito oil, herring oil, shark oil and the like.
[0029]
The above-mentioned fatty acids and fatty acid esters can be used as a reaction raw material by mixing two or more kinds.
[0030]
As the vanillylamine to be reacted with the fatty acid or its ester, a commercially available synthetic product may be used, but from the viewpoint of using a natural raw material as much as possible in consideration of safety, capsaicin extracted from chili pepper and other Those prepared by hydrolyzing N-vanillyl fatty acid amide using acid, alkali, or hydrolase are preferred.
[0031]
To extract N-vanillyl fatty acid amides such as capsaicin from red pepper, lower alcohols such as methanol and ethanol, polyhydric alcohols such as 1,3-butylene glycol and glycerin, and hydrocarbons such as hexane are extracted. What is necessary is just to extract as a solvent. To hydrolyze this into vanillylamine and constituent fatty acids, a mineral acid or caustic is added and heated. After completion of the reaction, the reaction mixture is neutralized and concentrated under reduced pressure, and fatty acid and unreacted N-vanillyl fatty acid amide are extracted using a lipophilic organic solvent such as hexane to obtain vanillylamine in the aqueous layer. This is refine | purified by arbitrary methods and it is set as the reaction raw material. To hydrolyze N-vanillyl fatty acid amide enzymatically, a hydrolase that can be used as a substrate is allowed to act, or a substrate is added to the culture of a microorganism that produces the hydrolase (for example, Aspergillus oryzae). To cause hydrolysis reaction (Fermentation Engineering: Vol.63, No.3, p.221).
[0032]
Vanillylamine may be added to the reaction system in the form of hydrochloride.
[0033]
No special lipase is required as a catalyst for the amide formation reaction, and any commercially available lipase or lipase-based complex enzyme preparation can be used as an enzyme for hydrolyzing glycerides. The lipase is usually commercially available from a culture solution of a microorganism capable of producing lipase, but the action of catalyzing the amide formation reaction is independent of the type of microorganism used for the production.
[0034]
Needless to say, the lipase may be used in the form of an immobilized enzyme, the microbial cell having the ability to produce lipase outside the cell, its culture solution, or a crude enzyme solution obtained from the culture solution Can also be used for the present invention.
[0035]
Examples of the lipase origin microorganism for the present invention include the following.
Microorganisms of the genus Mucor: Mucor Mihei, Mucor Javanicus・ Microbes belonging to the genus Roqueforte Phycomyces: Microorganisms belonging to the genus Phycomyces nitens Fumicola: Humicola lanuginosa chromobacteria: Chromobacterium biscorsum earth lobacter: Earth lobacter Ureafaciens pseudomonas: Pseudomonas Mephitica, Pseudomonas cepacia, Pseudomonas fluorescens Candida yeast: Candida cylindrache, Candida lugo , Candida lipolytica, Candida Ann talc Atlantica [0036]
When lipase is used to react fatty acid or its ester with vanillylamine, vanillylamine and lipase are made into an aqueous solution. If necessary, an auxiliary agent (for example, calcium salt) for lipase activation can be added to this aqueous solution.
[0037]
The fatty acid and its ester are reacted as they are or dissolved in a hydrophobic organic solvent (for example, hexane) that does not deactivate the lipase. Fatty acids having a high carbon number and their esters used in the production of spicy capsaicin analogs are not soluble in water, so the reaction system is usually composed of an aqueous phase and an oil phase, whether or not an organic solvent is used. (The lipase used in the form of immobilized enzyme or insolubilized enzyme will exist as a solid phase. Also, if the fatty acid or ester used is water-soluble, it contains vanillylamine. Because it dissolves in an aqueous solution, the reaction system is only an aqueous phase.)
[0038]
In the case of a reaction in which the reaction system has two phases, an aqueous phase and an oil phase, the contact area of the two phases is increased by vigorously stirring or shaking the raw material mixture to produce an oil-in-water dispersion state at the interface. Increase the chances of a reaction occurring. At this time, if the volume ratio of the water phase and the oil phase is extremely unbalanced, a preferable dispersion state cannot be obtained. Therefore, the reaction can be performed so that the oil phase is about 50 to 200 parts by volume with respect to 100 parts by volume of the water phase. desirable. In order to increase the contact between the two substrates and the enzyme, a small amount of a surfactant having no enzyme inhibitory action, such as Tween 80 or Triton X100, may be added to the aqueous phase.
[0039]
In order to increase the reaction rate of expensive vanillylamine, it is desirable that a larger excess of fatty acid or ester thereof than the theoretical value is present in the reaction system. Usually, the fatty acid or its ester is present in an equivalent ratio of about 3 times or more, preferably about 30 to 1000 times that of vanillylamine.
[0040]
The substrate or (and) the enzyme may be added continuously (or intermittently) to the reaction system to increase productivity.
[0041]
Reaction conditions such as reaction temperature and pH of the aqueous phase may be selected as optimum conditions for the lipase used, but a general reaction temperature is 5 to 80 ° C. and pH is 4 to 11.
[0042]
When the reaction is continued, N-vanillyl fatty acid amide is gradually formed, and the produced amide is mainly dissolved in the oil phase, but a part is also distributed in the aqueous phase. In order to collect the target product from the reaction mixture, the entire reaction mixture is extracted with an organic solvent such as n-hexane to extract the target product together with an unreacted oily raw material, and then the target product is separated from the extract. And a method in which the reaction mixture is allowed to stand or centrifuged to separate the oil phase and the aqueous phase, and the target is collected individually or in only the oil phase portion. is there. Arbitrary means such as column chromatography can be employed to separate the target product from the oily raw material.
[0043]
When producing edible fats and oils containing raw spicy capsaicin analogs, leave the reaction mixture or centrifuge to separate the oil phase, and wash, dehydrate, deodorize, and decolorize as necessary. It is used after being subjected to treatments such as melting and drying.
[0044]
The spicy capsaicin analog obtained by the production method of the present invention or fats and oils containing it can be used as a production raw material for functional foods, health foods and the like having an anti-obesity effect.
[0045]
【Example】
Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to examples. The details of the lipase used in each example are as follows.
[0046]
Lipase F: Amano Pharmaceutical Co., Ltd., Rhizopus nibeus-derived lipase A: Amano Pharmaceutical Co., Ltd., Aspergillus niger-derived lipase M: Amano Pharmaceutical Co., Ltd., Mucor Javanics lipase AY: Amano Pharmaceutical Co., Ltd., Candida Lugosa-derived lipase PS-C: Amano Pharmaceutical Co., Pseudomonas cepacia derived immobilized enzyme lipase AK: Amano Pharmaceutical Co., Pseudomonas fluorescens lipase D: Amano Pharmaceutical Co., Ltd., Rhizopus deremer lipase R: Amano Pharmaceutical Co., Penicillium・ Rock Eforte-derived lipase L: Amano Pharmaceutical Co., Ltd., Candida lipolytica-derived Newase F: Amano Pharmaceutical Co., Ltd., Rhizopus nibeus-derived lipozyme: Novoldisk, Immobilized enzyme Novozyme 435: Novoledisk Candida Anne talc Atlantica derived from immobilized enzyme lipase: Sigma, derived from Candida-Shirindorashe [0047]
The amount of N-vanillyl fatty acid amide produced by the enzymatic reaction was quantified by high performance liquid chromatography under the following conditions.
Column: Wakosil 5C18 AR, 4.6 × 150mm
Carrier: Methanol flow rate: 0.5 ml / min
Detection wavelength: Fluorescence detection, Ex 280nm, Em 320nm
[0048]
Example 1
37.8 mg (0.2 mmol) of vanillylamine hydrochloride was dissolved in 10 ml of 10 mM borate buffer (pH 9.0), and 1000 mg of Novozyme 435 and 5.80 g (24 mmol) of myristic acid methyl ester were added thereto and stirred. The reaction is carried out at 70 ° C. for a predetermined time. Thereafter, the reaction mixture is analyzed by high performance liquid chromatography, and the produced N-vanillyl myristate amide is quantified.
[0049]
Table 1 shows the results obtained by carrying out the above reaction while varying the reaction time and determining the reaction yield based on the amount of vanillylamine used.
[0050]
[Table 1]

[0051]
Example 2
Vanillylamine and myristic acid methyl ester were reacted in the same manner as in Example 1 except that the lipase was changed to another and the reaction time was fixed at 72 hours. The results are shown in Table 2.
[0052]
[Table 2]

[0053]
Example 3
The same experiment as in Example 1 was performed except that myristic acid methyl ester was changed to another fatty acid ester or fatty acid having the same mole number. The results are shown in Table 3.
[0054]
[Table 3]

[0055]
Example 4
37.8 mg (0.2 mmol) of vanillylamine hydrochloride was dissolved in 10 ml of 10 mM borate buffer (pH 9.0), 200 mg of lipase F and 8.84 g (10 mmol) of triolein were added thereto, and the mixture was stirred in a nitrogen atmosphere. The reaction is allowed to proceed for a predetermined time at 37 ° C. Thereafter, the reaction mixture is analyzed by high performance liquid chromatography, and the produced N-vanillyl myristate amide is quantified.
[0056]
Table 4 shows the results obtained by performing the above reaction while changing the reaction time in various ways and determining the yield of N-vanillyl oleic acid amide based on the amount of vanillylamine used.
[0057]
[Table 4]

[0058]
Example 5
Vanillylamine and triolein were reacted in the same manner as in Example 4 except that the lipase was changed to another and the reaction time was fixed to 144 hours. The results are shown in Table 5.
[0059]
[Table 5]

[0060]
Example 6
The same experiment as in Example 5 was performed except that triolein was changed to a natural fat / oil of the same weight. The results are shown in Table 6. The yield is the yield of all N-vanillyl fatty acid amide based on the amount of vanillylamine used.
[0061]
[Table 6]

[0062]
Example 7
1000 g of red pepper fruit (from Malawi) was heated under reflux with 10 liters of a mixed solvent of n-hexane: n-propanol = 8: 2, and the resulting extract was concentrated under reduced pressure to obtain 62 g of oleoresin. . To this total amount of oleoresin, 100 ml of 70% ethanol was added, stirred for 1 hour at room temperature, allowed to stand, and the resulting precipitate was filtered. The obtained filtrate was concentrated under reduced pressure to obtain 7 g of capsicum extract containing capsaicin.
[0063]
This capsicum extract was mixed with 1000 ml of mold culture medium, Tsuapekkudokkusu broth (manufactured by Nissui Pharmaceutical), inoculated with spores of Aspergillus oryzae and cultured at 37 ° C. for 7 days with shaking. After completion of the culture, the culture broth was extracted with 1000 ml of hexane, and the aqueous layer was concentrated under reduced pressure to obtain 1.8 g of pasty vanillylamine.
[0064]
After dissolving 1.0 g of this vanillylamine in 100 ml of water and adjusting the pH to 9.0, 1.0 g of lipase AY and 10.0 g of olive oil were added and reacted at 37 ° C. with stirring. When the analysis of the reaction mixture by high performance liquid chromatography was continued, N-vanillyl oleic acid amide was gradually formed, and the amount produced was 110 mg after 144 hours.
[0065]
Example 8
Vanillylamine is obtained from pepper fruit in the same manner as in Example 7. 1.0 g of this is dissolved in 100 ml of water, pH is adjusted to 9.0, 1.0 g of lipase PS and 10 g of perilla seed oil are added, and the temperature is 37 ° C. The N-vanillyl fatty acid amide was formed from a portion of perilla seed oil by continuing to stir for 144 hours.
[0066]
Then, the oil layer separated by allowing to stand was separated to obtain a perilla seed oil containing a spicy capsaicin analog.
[0067]
【The invention's effect】
As described above, according to the present invention, it is possible to produce a spicy capsaicin analog and other N-vanillyl fatty acid amides that do not use acid chloride as a raw material, and it is easy to use the spicy capsaicin analog in the food field. Become.

Claims (5)

バニリルアミンの水溶液をリパーゼの存在下に炭素数１２〜２２の脂肪酸またはそのエステルと接触させることによりバニリルアミンと上記脂肪酸またはエステルとを反応させてＮ-バニリル脂肪酸アミドを生成させることを特徴とするカプサイシン類縁体の製造法。Capsaicin analogs characterized in that an N-vanillyl fatty acid amide is produced by reacting vanillylamine with the above fatty acid or ester by contacting an aqueous solution of vanillylamine with a fatty acid having 12 to 22 carbon atoms or an ester thereof in the presence of lipase. Body manufacturing method. カプサイシンを加水分解してバニリルアミンを得、該バニリルアミンの水溶液をリパーゼの存在下に炭素数１２〜２２の脂肪酸またはそのエステルと接触させることによりバニリルアミンと上記脂肪酸またはエステルとを反応させてＮ-バニリル脂肪酸アミドを生成させることを特徴とするカプサイシン類縁体の製造法。Capsaicin is hydrolyzed to obtain vanillylamine, and an aqueous solution of vanillylamine is contacted with a fatty acid having 12 to 22 carbon atoms or an ester thereof in the presence of lipase to react vanillylamine with the above fatty acid or ester to produce N-vanillyl fatty acid. A method for producing a capsaicin analog characterized in that an amide is produced. 食用油脂をリパーゼの存在下にバニリルアミンの水溶液と接触させることによりバニリルアミンと反応させて該食用油脂の一部よりＮ-バニリル脂肪酸アミドを生成させたのち油相を採取することを特徴とするカプサイシン類縁体を含有する油脂の製造法。Capsaicin analogue characterized in that an edible oil / fat is brought into contact with an aqueous solution of vanillylamine in the presence of lipase to react with vanillylamine to form N-vanillyl fatty acid amide from a part of the edible fat / oil and then the oil phase is collected. The manufacturing method of fats and oils containing a body. 脂肪酸または脂肪酸エステルをリパーゼの存在下にバニリルアミンの水溶液と混合することによりバニリルアミンと反応させることを特徴とするＮ-バニリル脂肪酸アミドの製造法。A method for producing N-vanillyl fatty acid amide, characterized in that a fatty acid or a fatty acid ester is reacted with vanillylamine by mixing with an aqueous solution of vanillylamine in the presence of lipase. リパーゼを失活させない疎水性有機溶媒に溶解させた脂肪酸または脂肪酸エステルをバニリルアミンの水溶液と接触させることを特徴とする請求項４に記載のＮ-バニリル脂肪酸アミドの製造法。The method for producing N-vanillyl fatty acid amide according to claim 4, wherein a fatty acid or a fatty acid ester dissolved in a hydrophobic organic solvent that does not deactivate lipase is contacted with an aqueous solution of vanillylamine.