JP4040004B2 - Ａ−３３関連抗原およびそれらの薬理学的使用 - Google Patents

Ａ−３３関連抗原およびそれらの薬理学的使用 Download PDF

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Description

本発明は、概して、存在が炎症性疾患（炎症関連抗原）および／または癌と関連している、新規なＤＮＡと新規なポリペプチドの同定、単離、および組換え生産に関連し、そのような抗原によって特徴づけられる状態の診断と治療のための組成物と方法に関する。
炎症反応は、複雑であり、局所的に肥満細胞、神経末梢、血小板、白血球、補体の活性化により生産される種々のシグナル分子によって仲介されている。これらのシグナル分子うちのあるものは、内皮細胞内層（lining）をより多孔性とし、および／または白血球を特異的炭水化物認識を通して認識および攻撃する細胞表面分子として作用するセレクチンを発現させることもある。より強い白血球結合は、インテグリンにより仲介され、それは内皮を通る白血球の移動を仲介する。さらなるシグナル分子は、化学誘引物質として作用し、結合した白血球を誘引物質に向かってゆっくりと動かす。炎症反応の途中で生産される他のシグナル分子は、血中に逃げて、骨髄がより多くの白血球が生産しそれらを血流中に放出するのを促進する。
炎症は、典型的には、抗原により開始され、抗原は、事実上、免疫反応を開始することができるいかなる分子ともし得る。正常の生理状態で、それらは外来分子であるが、それ自身の臓器で生成した分子も、種々の疾患状態で起こることが知られているような触媒としての役割を果たし得る。
混合リンパ球培養または混合リンパ球反応（ＭＬＲ）でのＴ細胞増殖は、化合物の免疫系を刺激する能力の確立された適応である。免疫応答において、応答する白血球は、好中性、好酸性、単核、リンパ球とすることができる。疾患組織の組織学的試験は、免疫刺激または阻害の反応の証拠を提供する。Current Protocols in Immunology, ed.John E. Coligan, 1994, John Wiley およびSons, Inc.を参照。
炎症性腸疾患（ＩＢＤ）は、潰瘍性大腸炎（ＵＣ）とクローン病の両方を含む腸の障害を集合的に記載するために用いられる用語であり、これらの両方は、別個の障害に分類されるが、同じ特徴を有し病理を共有しているようである。診断の基準の共通性は、患者が２つの障害のうちのいずれかを有しているかを正確に決定することを困難にしている。しかしながら、それぞれの病巣の型と位置は、典型的には異なっている。ＵＣ病巣は特徴的には粘膜の表面上の潰瘍で、直腸の近位の腸に見られる。ＣＤ病巣は、特徴的には広範囲の直線裂溝であり、腸のあらゆる場所でみられ、しばしば胃、食道、十二指腸も含まれる。
ＩＢＤのための従来の治療は、通常抗炎症または免疫抑制剤、例えばスルファサラジン、コルチコステロイド、６−メルカプトプリン／アザトプリン（azathoprine）、またはシクロスポリンの投与を含むが、これらのすべては、苦しんでいる患者に部分的な軽減しかもたらさない。しかしながら、抗炎症／免疫抑制治療が失敗したとき、結腸切除が防御の最後である。診断後の一年の間に、手術は約３０％のＣＤ患者に必要であり、手術法の可能性はその後年々約５％増加する。不幸なことに、ＣＤは患者の約５％が、最初の年の後に次の手術を必要とするという高い再発度をも有している。ＵＣ患者はさらに腸癌に発展するという実質的により高いリスクを有している。おそらくこのことは、内皮損傷、その後の再成長の再発サイクルのためであり、継続的に新形成性形質転換のリスクを増加させる。
接合部接着分子（Junctional Adhesion Molecule）（JAM）として知られている、最近発見された免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーは、異なる臓器の内皮と上皮細胞の細胞間接合部で選択的に濃縮されて同定された。Martin-Padura,I.ら、J.Cell Biol.142(1):117-27(1998)。ＪＡＭは、２つの細胞外、Ｖ型の鎖内ジスルフィドループを有するＩ型の内在性膜タンパク質である。ＪＡＭは、Ａ３３抗原に実質的な相同性を有する（図１または図２２）。ＪＡＭに対するモノクローナル抗体は、in vitroで、自然発生の、およびケモキネシス誘導の単核の、内皮細胞単層を通る移行を阻害することが見出された。Martin-Padura、上掲。
最近、ＪＡＭ発現は、腸炎を有するＣＲＦ２−４ −／−マウスの腸で増加することが発見された。ＣＲＦ２−４ −／−（ＩＬ−１０Ｒサブユニットノックアウトマウス）は、リンパ球、単核および好中球によって仲介される、自然発生腸炎を進行させる。いくつかの動物は腸の腺癌も進行させた。その結果、介入の化合物が高められたレベルで、あるいは炎症性腸疾患、他の腸の炎症性疾病、結腸直腸癌などのヒト疾患に関連して発現されることが予測できる。
本発明の化合物はまた、既知の結腸直腸関連指標であるＡ３３抗原に対して、高い相同性をも有している。Ａ３３抗原は、正常腸上皮と同様に、９９％以上の初期または転移腸癌で発現される。腸粘膜から発生する癌において、Ａ３３抗原は均一的にすべての細胞の９５％以上で発現される。Ａ３３抗原は、しかしながら広い範囲の他の正常組織では検出されなかった。すなわちその発現は臓器特異的であると思われる。したがってＡ３３抗原は、結腸直腸癌の誘導において重要な役割を果たしているようである。
腸癌が広範な病気であることから、初期の診断と治療が重要な医学的課題である。腸癌の診断と治療は、それに蛍光、核磁気、放射性タグを有する特異的モノクローナル抗体（ｍＡｂｓ）を用いて行うことができる。放射性遺伝子、毒素、および／または薬剤タグ化ｍＡｂｓは、最小限の患者記述（description）でin situの治療に用いることができる。ｍＡｂｓは腸癌の診断と治療の間の診断でも用いることができる。例えば、Ａ３３抗原の血清レベルが患者で高まるとき、手術後のレベルの低下が腫瘍の切除が成功したことを示すであろう。他方で、血清Ａ３３抗原レベルの手術後の上昇は、もとの腫瘍の転移が形成されたかあるいは新しい初期腫瘍が現れたことを示すであろう。
そのようなモノクローナル抗体は、手術および／または他の化学療法の代わりに、あるいはそれと共に用いることができる。例えば、結腸直腸癌に罹った患者での、Ａ３３に対するｍＡｂを用いた、前臨床分析および位置決めの研究は、Weltら,J.Clin.Oncl.8:1894-1906(1990)および Weltら,J.Clin.Oncl.12:1561-1571(1994) に記載されており、U.S.P.4,579,827とU.S.S.N.424,991(E.P.199,141)は、モノクローナル抗体の治療の投与に関するものであり、後者は抗Ａ３３ｍＡｂの適用に関する。
発明の要約
本発明は、さらに、ヒトを含む哺乳類における炎症性疾患診断と治療のための組成物と方法に関する。本発明は、哺乳類における免疫反応を促進あるいは阻害するタンパク質（アゴニストおよびアンタゴニスト抗体を含む）の同定に基づく。炎症性疾患は、炎症反応を抑制することにより治療することができる。炎症反応を増進する分子は、抗原に対する免疫反応を促進あるいは助長する。炎症反応を促進する分子は、炎症反応の抑制が有利である場合に阻害することができる。炎症反応を促進する分子は、炎症反応の増進が有利である場合に治療に用いることができる。そのような促進分子は、炎症反応の抑制が価値のある場合にも阻害することができる。中和抗体は、免疫促進活性を有する分子を阻害する分子の例であり、炎症性疾患の治療に有利であろう。炎症性反応を阻害する分子は、炎症反応を阻害し、炎症性疾患を改善するためにも用いることができる。
したがって、本発明のタンパク質は、免疫関連病の診断および／または治療（防止を含む）に有用である。促進タンパク質に結合する抗体は、炎症反応を抑制するために有用である。阻害タンパク質に結合する抗体は、炎症反応と免疫系を促進するために有用である。本発明のタンパク質と抗体は、炎症性および免疫関連病の治療のための医薬と薬剤を調製するためにも有用である。
１つの実施態様において、本発明は、ＰＲＯ３０１、ＰＲＯ３６２、またはＰＲＯ２４５ポリペプチドの、１つ以上の機能または活性を阻害する、ＰＲＯ３０１、ＰＲＯ３６２、またはＰＲＯ２４５ポリペプチドのアンタゴニストおよびアゴニストに関する。
別の実施態様において、本発明は、ポリペプチドを含んでいると思われる細胞を、抗ＰＲＯ３０１、抗ＰＲＯ３６２、または抗ＰＲＯ２４５抗体に接触させ、細胞への抗体の結合を確認することを含む、ＰＲＯ３０１、ＰＲＯ３６２、またはＰＲＯ２４５ポリペプチドの存在を確認する方法に関する。
さらに別の実施態様において、本発明は、（ａ）哺乳類から得られた組織細胞の試験試料中の、および（ｂ）同じ細胞型の既知の正常組織細胞の対照試料中の、ＰＲＯ３０１、ＰＲＯ３６２、またはＰＲＯ２４５をコードする遺伝子の発現レベルを検出し、試験試料中のより高い発現が哺乳類の炎症性疾患の存在を示すことを含む、哺乳類における炎症性関連疾患の診断方法に関する。
別の実施態様において、（ａ）抗ＰＲＯ３０１、抗ＰＲＯ３６２、または抗ＰＲＯ２４５抗体を、哺乳類から得られた組織培養細胞の試験試料に接触させること、および（ｂ）抗体とＰＲＯ３０１、ＰＲＯ３６２、またはＰＲＯ２４５ポリペプチドとの間の複合体の形成を検出することを含む、哺乳類における炎症性疾患の診断方法に関する。検出は、定性的でも定量的でもよく、同じ細胞型の既知の正常組織細胞の対照試料の複合体形成のモニターでの比較において行なうことができる。試験試料中のより多くの複合体の形成が、試験試料の取得源の哺乳類における腫瘍の存在を示す。抗体は、好ましくは検出可能なレベルを有している。複合体の形成は、例えば、光学顕微鏡、フローサイトメトリー、蛍光計、または他の周知の技術でモニターすることができる。試験試料は、通常、免疫反応に関して欠損あるいは異常を有していると思われる個体から得る。
別の実施態様において、本発明は、適当な包装の中に抗ＰＲＯ３０１、抗ＰＲＯ３６２、または抗ＰＲＯ２４５抗体と担体（例えばバッファー）含む診断キットに関する。キットは、好ましくは、ＰＲＯ３０１、ＰＲＯ３６２ポリペプチドを検出するために抗体を用いるための指示を含む。
さらなる実施態様において、本発明は、以下のものを含む製造物に関する：
容器；
容器上のラベル；および
容器内に含まれる活性剤を含む組成物、
ここで組成物は、哺乳類における炎症反応の促進または阻害に有効であり、容器上のラベルは組成物が炎症疾患の治療に用いることができることを示し、組成物中の活性剤はＰＲＯ３０１、ＰＲＯ３６２、またはＰＲＯ２４５ポリペプチドの発現および／または活性を促進または阻害する薬剤である。好ましい態様において、活性剤はＰＲＯ３０１、ＰＲＯ３６２、またはＰＲＯ２４５ポリペプチドまたは抗ＰＲＯ３０１、抗ＰＲＯ３６２、または抗ＰＲＯ２４５抗体である。
さらなる実施態様は、それらの２つの化合物に相互作用させるために十分な条件下と時間で、候補の化合物をＰＲＯ３０１、ＰＲＯ３６２、またはＰＲＯ２４５ポリペプチドと接触させることによって、ＰＲＯ３０１、ＰＲＯ３６２、またはＰＲＯ２４５の発現および／または活性を阻害することができる化合物を同定する方法である。特定の態様で、候補の化合物またはＰＲＯ３０１、ＰＲＯ３６２、またはＰＲＯ２４５ポリペプチドのいずれかが、固体支持体上に固定される。別の態様で、非固定化成分は、検出可能なレベルを有する。
さらなる態様で、本発明は、炎症性腸疾患；全身性エリテマトーデス、慢性関節リウマチ；若年性慢性関節炎；脊椎関節症；全身性硬化症（硬皮症）；特発性炎症性筋障害（皮膚筋炎、多発性筋炎）；シェ−グレン症候群；全身性脈管炎；サルコイドーシス；自己免疫性溶血性貧血、（免疫性汎血球減少症、発作性夜間血色素尿症）；自己免疫性血小板減少症、（特発性血小板減少性紫斑、免疫介在性血小板減少症）；甲状腺炎、（グレーブス病、橋本甲状腺炎、若年性リンパ球甲状腺炎、萎縮性甲状腺炎）；糖尿病、免疫介在性腎臓病（糸球体腎炎、管状間隙性腎炎）；中枢および末梢神経系の脱髄の疾病、例えば多発性硬化症、特発性多発神経障害；肝臓胆管の疾病、例えば感染性肝炎（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ，Ｅ型、および他の非肝臓親和性ウィルスの肝炎）；自己免疫性慢性活動性肝炎；初期性胆汁性肝硬変症；肉芽腫性肝炎；および硬化性胆管炎；炎症性および線維症の肺疾患（例えば嚢胞性線維症、好酸性肺炎、特発性肺線維症、および超感受性肺炎）；グルテン過敏性腸症；ホウィップル病；水疱性皮膚病、紅斑多形、および接触皮膚炎を含む自己免疫性または免疫介在性皮膚病；乾癬；肺のアレルギー病、例えば好酸性肺炎、特発性肺線維症、および超過敏性肺実質炎、移植片拒絶および対宿主性移植片病を含む移植関連病からなる群より選ばれる炎症性疾患の治療のために、必要な患者に対して、治療に有効な量のＰＲＯ３０１、ＰＲＯ３６２、またはＰＲＯ２４５アンタゴニスト、またはその断片を投与することによる、炎症性疾患の治療方法に関する。
さらなる実施態様において、本発明は、（ａ）哺乳類から得られた組織細胞の試験試料中の、および（ｂ）同じ細胞型の既知の正常組織細胞の対照試料中の、ＰＲＯ３０１、ＰＲＯ３６２、またはＰＲＯ２４５をコードする遺伝子の発現レベルを検出し、試験試料中のより高い発現が哺乳類の腫瘍の存在を示すことを含む、哺乳類における腫瘍の診断方法を提供する。
別の実施態様において、本発明は、（ａ）抗ＰＲＯ３０１、抗ＰＲＯ３６２、または抗ＰＲＯ２４５抗体を、哺乳類から得られた組織培養細胞の試験試料に接触させること、および（ｂ）抗体とＰＲＯ３０１、ＰＲＯ３６２、またはＰＲＯ２４５ポリペプチドとの間の複合体の形成を検出することを含む、哺乳類における腫瘍の診断方法を提供する。検出は、定性的でも定量的でもよく、同じ細胞型の既知の正常組織細胞の対照試料の複合体形成のモニターでの比較において行なうことができる。試験試料中のより多くの複合体の形成が、試験試料の取得源の哺乳類における腫瘍の存在を示す。抗体は、好ましくは検出可能なレベルを有している。複合体の形成は、例えば、光学顕微鏡、フローサイトメトリー、蛍光計、または他の周知の技術でモニターすることができる。試験試料は、通常、新形成性細胞成長または増殖（すなわち癌性細胞）を有していると思われる個体から得る。
別の実施態様において、本発明は、適当な包装の中に抗ＰＲＯ３０１、抗ＰＲＯ３６２、または抗ＰＲＯ２４５抗体と担体（例えばバッファー）含む癌診断キットに関する。キットは、好ましくは、ＰＲＯ３０１、ＰＲＯ３６２ポリペプチドを検出するために抗体を用いるための指示を含む。
さらなる実施態様において、本発明は、ＰＲＯ３０１、ＰＲＯ３６２、またはＰＲＯ２４５ポリペプチドを過剰発現している細胞を、ＰＲＯ３０１、ＰＲＯ３６２、またはＰＲＯ２４５ポリペプチドの発現および／または活性を阻害する薬剤の有効量にさらすことを含む、腫瘍細胞の成長を阻害する方法を提供する。薬剤は好ましくは、抗ＰＲＯ３０１、抗ＰＲＯ３６２、または抗ＰＲＯ２４５ポリペプチド、小さい有機または無機ペプチド、リン酸化ペプチド、アンチセンスまたはリボザイム分子、または３重らせん分子である。特定の態様で、薬剤、例えば抗ＰＲＯ３０１、抗ＰＲＯ３６２、または抗ＰＲＯ２４５抗体は、細胞死を誘導する。さらなる態様において、腫瘍細胞はさらに放射線治療および／または細胞毒性または化学療法剤にさらされる。
さらなる実施態様において、本発明は、以下のものを含む製造物に関する：
容器；
容器上のラベル；および
容器内に含まれる活性剤を含む組成物、
ここで組成物は、腫瘍細胞の成長の阻害に有効であり、容器上のラベルは組成物が抗ＰＲＯ３０１、抗ＰＲＯ３６２、または抗ＰＲＯ２４５ポリペプチドの過剰発現により特徴付けられる状態の治療に用いることができることを示し、組成物中の活性剤はＰＲＯ３０１、ＰＲＯ３６２、またはＰＲＯ２４５ポリペプチドの発現および／または活性を阻害する薬剤である。好ましい態様において、活性剤はＰＲＯ３０１、ＰＲＯ３６２、またはＰＲＯ２４５ポリペプチドまたは抗ＰＲＯ３０１、抗ＰＲＯ３６２、または抗ＰＲＯ２４５抗体である。
さらなる実施態様において、本発明は、（ａ）図２（配列番号：１）のアミノ酸残基２８ないし２５８の配列を有するＰＲＯ３０１ポリペプチドをコードするＤＮＡ分子または（ｂ）（ａ）のＤＮＡ分子の相補体と少なくとも約８０％の配列同一性を有するＤＮＡを含む、単離された核酸分子を提供する。好ましくは、配列同一性は、約８５％、より好ましくは約９０％、さらにより好ましくは約９５％である。一つの態様において、単離された核酸は、図２（配列番号：１）のアミノ酸残基２８ないし２５８の配列を有するポリペプチドに対して、少なくとも約８０％、好ましくは少なくとも約８５％、より好ましくは少なくとも約９０％、さらにより好ましくは少なくとも約９５％の配列同一性を有する。好ましくは、最高の配列同一性は、細胞外ドメイン（図２、配列番号：１のアミノ酸残基２８ないし２３５）で起こる。さらなる実施態様において、単離された核酸分子は、図２（配列番号：１）のアミノ酸残基２８ないし２９９を有するＰＲＯ３０１ポリペプチドをコードするＤＮＡを含むか、そのようなコード核酸配列に相補しており、中等度の、および任意に高いストリンジェント条件下で、それに安定に結合したまま保持されている。他の態様で、本発明は、受託番号ＡＴＣＣ２０９４３２でＡＴＣＣに寄託されたクローンＤＮＡ４０６２８の全長タンパク質の核酸、あるいは受託番号ＡＴＣＣ２０９４３２で寄託されたＤＮＡ４０６２８のコード配列の核酸を提供する。
別の実施態様で、本発明は、ＰＲＯ３６２ポリペプチドをコードするＤＮＡを含む単離された核酸分子を提供する。１つの態様で、単離された核酸は、図３（配列番号：２）のアミノ酸残基１ないし３２１を有するＰＲＯ３６２ポリペプチドをコードするＤＮＡを含むか、そのようなコード核酸配列に相補しており、中等度の、および任意に高いストリンジェント条件下で、それに安定に結合したまま保持されている。
別の態様で、単離された核酸は、図３（配列番号：２）のアミノ酸残基１からＸの配列を有するＰＲＯ３６２ポリペプチドをコードするＤＮＡで、Ｘは図３（配列番号：２）のアミノ酸残基２７１から２８０のいずれか１つであるものを含むか、そのようなコード核酸配列に相補しており、中等度の、および任意に高いストリンジェント条件下で、それに安定に結合したまま保持されている。単離された核酸配列は、ＰＲＯ３６２をコードするヌクレオチド配列を含むＡＴＣＣ２０９６２０として１９９８年２月５日に寄託されたＤＮＡ４５４１６−１２５１ベクターのｃＤＮＡ挿入物を含んでいてもよい。
さらに別の態様において、本発明は、ＰＲＯ３０１、ＰＲＯ３６２、またはＰＲＯ２４５ポリペプチドをコードする核酸分子の相補体にハイブリダイズする単離された核酸分子を提供する。核酸は好ましくはＤＮＡであり、ハイブリダイゼーションはストリンジェントな条件で起こる。そのような核酸分子は、ここで同定された炎症関連抗原のアンチセンス分子として作用することができ、順に、炎症関連抗原または調節における、あるいは増幅反応のアンチセンスプライマーとしての用途を見出すことができる。さらにそのような配列は、リボザイムおよび／または３重らせん配列の一部として用いられることができ、順に、炎症関連抗原の制御に用いられることができる。
さらなる実施態様において、本発明はＰＲＯ３０１またはＰＲＯ３６２ポリペプチドＤＮＡを含むベクターを提供する。そのようなベクターを含む宿主細胞も提供される。例として、宿主細胞はＣＨＯ細胞、大腸菌、または酵母であってよい。ＰＲＯ３０１、ＰＲＯ３６２、またはＰＲＯ２４５ポリペプチドを生産する方法もさらに提供され、ＰＲＯ３０１またはＰＲＯ２６２の発現に適した条件下で宿主細胞を培養し、細胞培養物からそれを回収することを含む。
さらに別の態様において、本発明は単離されたＰＲＯ３０１ポリペプチドを提供する。特に、本発明は、単離された天然配列ＰＲＯ３０１ポリペプチドを提供し、１つの実施態様において、図２（配列番号：１）の細胞外ドメイン残基２８ないし２３５を含むアミノ酸配列を含む。天然ＰＲＯ３０１ポリペプチドは、Ｎ末端シグナル配列（図２（配列番号：１）のアミノ酸１ないし２７）を有するかまたは有さず、開始メチオニンを有するかまたは有さないものが特に含まれる。さらに、本発明の配列は、トランスメンブレンドメイン（図２中、残基２３６から約２５８）（配列番号：１）および／または細胞内ドメイン（図２中、残基２５９から約２９９）（配列番号：１）を含むこともできる。あるいは、本発明は受託番号ＡＴＣＣ２０９４３２で寄託された核酸によりコードされているＰＲＯ３０１ポリペプチドを提供する。
さらに別の実施態様で、本発明は単離されたＰＲＯ３６２ポリペプチドを提供する。特に、本発明は、単離された天然配列ＰＲＯ３６２ポリペプチドを提供し、１つの実施態様において、図３（配列番号：２）の残基１ないし３２１を含むアミノ酸配列を含む。本発明のさらなる実施態様は、図２（配列番号：２）のアミノ酸１からＸを含むＰＲＯ３６２ポリペプチドの単離された細胞外ドメインで、Ｘはアミノ酸残基２７１から２８０のいずれかであるものに関する。任意にＰＲＯ３６１ポリペプチドは、受託番号ＡＴＣＣ２０９６２０として１９９８年２月５日寄託されたＤＮＡ４５４１６−１２５１ベクターのｃＤＮＡ挿入物によりコードされたポリペプチドを発現させることにより得たものあるいは得ることが可能なものである。
さらなる実施態様で、本発明は、ヘテロなポリペプチドまたはアミノ酸配列と融合したＰＲＯ３０１またはＰＲＯ３６２ポリペプチドを含むキメラ分子を提供する。そのようなキメラ分子の例としては、エピトープタグ配列または免疫グロブリンのＦｃ領域と融合したＰＲＯ３０１またはＰＲＯ３６２ポリペプチドが含まれる。
さらなる実施態様において、本発明は、図４Ａ中でＤＮＡ３５９３６（配列番号：３）、図４Ｂ中でconsen01（配列番号：４）およびconsen02（ＤＮＡ４２２５７）（配列番号：５）として同定されるヌクレオチド配列を含む発現配列タグ（ＥＳＴ）を提供する。
さらなる実施態様において、本発明は、ＰＲＯ３０１またはＰＲＯ３６２ポリペプチドに結合する単離された抗体を提供する。１つの態様において、抗体は、ＰＲＯ３０１またはＰＲＯ３６２ポリペプチドの活性を模倣し（アゴニスト抗体）または反対に抗体はＰＲＯ３０１またはＰＲＯ３６２ポリペプチドの活性を阻害または中和する（アンタゴニスト抗体）。別の態様で、抗体はモノクローナル抗体であり、好ましくは非ヒト相補性決定領域（ＣＤＲ）残基とヒトフレームワーク領域（ＦＲ）残基を含む。抗体は、標識されていても、固体支持体に固定化されていてもよい。さらなる態様で、抗体はアフィニティー成熟、抗体断片、一本鎖抗体、または抗イディオタイプ抗体である。
別の実施態様で、本発明は、担体または賦形剤と混合した、ＰＲＯ３０１またはＰＲＯ３６２ポリペプチドまたはアゴニストまたはアンタゴニスト抗体を含む組成物を提供する。１つの態様で、組成物は治療に有効な量のペプチドまたは抗体を含む。別の態様で、組成物が炎症促進分子を含むとき、組成物は、（ａ）それが必要な哺乳類において、炎症細胞の組織への湿潤を増加させるために、（ｂ）それが必要な哺乳類において免疫反応を促進または増進させるために、または（ｃ）抗原に対する応答において、それが必要な哺乳類で、Ｔリンパ球の増殖を増加させるために、有用である。さらなる態様で、組成物が炎症阻害分子を含むとき、組成物は、（ａ）それが必要な哺乳類において、炎症細胞の組織への湿潤を減少させるために、（ｂ）それが必要な哺乳類において免疫反応を阻害または低減させるために、または（ｃ）抗原に対する応答において、それが必要な哺乳類で、Ｔリンパ球の増殖を減少させるために、有用である。別の態様で、組成物はさらに活性成分を含み、それは例えばさらなる抗体または細胞毒性または化学療法薬剤でもよい。好ましくは組成物は無菌とされる。
さらなる実施態様において、本発明は、抗ＰＲＯ３０１および抗ＰＲＯ３６２抗体をコードする核酸と、そのような核酸を含むベクターと組換え宿主に関する。さらなる実施態様において、本発明は抗体が発現する条件下で抗体をコードする核酸で形質転換した宿主細胞を培養し、細胞培養物から抗体を回収することを含むそのような抗体を生産する方法に関する。
好ましい実施態様の詳細な説明
Ｉ．定義
ここで用いた用語「ＰＲＯ３０１」、「ＰＲＯ３６２」、「ＰＲＯ２４５」、「ＰＲＯ３０１ポリペプチド」、「ＰＲＯ３６２ポリペプチド」、「ＰＲＯ２４５ポリペプチド」、および「癌関連抗原」は、各々、天然配列ＰＲＯ３０１、ＰＲＯ３６２、またはＰＲＯ２４５とその変異体（この中でさらに定義される）を包含する。該ＰＲＯ３０１、ＰＲＯ３６２、またはＰＲＯ２４５は、ヒト組織タイプから又は別の供給源からのような各種の供給源から単離され、又は組換え又は合成法によって単離し得る。
「炎症性疾患」という用語は、哺乳類の免疫系の成分が、哺乳類における病的状態に寄与する炎症反応を起こす、仲介する、あるいは寄与する疾患を意味する。炎症反応の刺激または介入が、疾患の進行に改善効果を有する疾患も含まれる。用語の中には免疫介在性炎症性疾患も含まれる。
「Ｔ細胞媒介」疾患という用語は、Ｔ細胞が直接的または間接的に、哺乳類における病的状態に仲介または寄与する疾患を意味する。Ｔ細胞介在性疾患は細胞仲介効果、リンフォカイン仲介効果など、さらにＢ細胞が例えばＴ細胞によって分泌されたリンフォカインによって刺激されたとき、Ｂ細胞に関連する効果に関連している。
免疫関連および炎症性疾患の例は、それらのうちのいくつかはＴ細胞仲介であり、本発明によって治療可能なものであるが、炎症性腸疾患；全身性エリテマトーデス、慢性関節リウマチ；若年性慢性関節炎；脊椎関節症；全身性硬化症（硬皮症）；特発性炎症性筋障害（皮膚筋炎、多発性筋炎）；シェ−グレン症候群；全身性脈管炎；サルコイドーシス；自己免疫性溶血性貧血（免疫性汎血球減少症、発作性夜間血色素尿症）；自己免疫性血小板減少症（特発性血小板減少性紫斑、免疫介在性血小板減少症）；甲状腺炎（グレーブス病、橋本甲状腺炎、若年性リンパ球甲状腺炎、萎縮性甲状腺炎）；糖尿病、免疫介在性腎臓病（糸球体腎炎、管状間隙性腎炎）；中枢および末梢神経系の脱髄の疾病、例えば多発性硬化症、特発性多発神経障害；肝臓胆管の疾病、例えば感染性肝炎（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ，Ｅ型、および他の非肝臓親和性ウィルスの肝炎）；自己免疫性慢性活動性肝炎；初期性胆汁性胆硬変症；肉芽腫性肝炎；および硬化性胆管炎；炎症性および線維症の肺疾患（例えば嚢胞性線維症）；グルテン過敏性腸症；ホウィップル病；水疱性皮膚病、紅斑多形、および接触皮膚炎を含む自己免疫性または免疫介在性皮膚病；乾癬；肺のアレルギー病、例えば好酸性肺炎、特発性肺線維症、および超過敏性肺実質炎、移植関連病、移植片拒絶および対宿主性移植片病を含む。
ここで用いられるような「腫瘍」は、悪性でも良性でもすべての新形成の細胞成長および増殖と、すべての前癌状態の細胞および組織を意味する。
用語「癌」、「癌性の」、及び「悪性」は、無調節細胞増殖によって典型的に特徴付けされる哺乳類における生理学的状態に関し又は表される。癌の実例は制限されることなしに、腺癌、リンパ腫、芽細胞腫、メラノーマ、肉腫、及び白血病を含む癌を含む。そのような癌のより特有な実例は、胸癌、前立腺癌、腸癌、扁平上皮細胞癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、胃腸の癌、膵臓癌、グリア芽細胞腫、頸部癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、ヘパトーム、結腸直腸の癌、子宮内膜の癌、唾液腺癌、腎臓癌、肝臓癌、外陰部の癌、肝臓癌及び頭部と首部の各種のタイプの癌を含む。
「治療」は、疾病の病理の発展防止または変化を意図して行なう介入である。したがって、「治療」は、治療的処置と予防的な及び予防的意味の両方に関する。治療の必要なものは、既に疾患に罹ったものと、その疾患が防止されるそれらを含む。免疫関連病の治療では、治療薬が、免疫応答の成分の応答の程度を直接減少または増加させることができ、他の治療薬、例えば、抗体、抗菌剤、抗炎症剤、化学療法剤などによって、疾病がより治療されやすくすることができる。
免疫関連疾患の「病理」は、患者のより健康状態を危険にさらすすべての現象を含む。これには、制限的でなく、異常または制御不可能な細胞成長（好中球、好酸球、単核、リンパ球細胞）、抗体産生、抗−抗体産生、補体産生、隣接細胞の正常機能への干渉、異常なレベルのサイトカインまたは他の分泌産物の放出、炎症または免疫応答の抑制または悪化、炎症細胞の細胞空間への湿潤（好中球、好酸球、単核、リンパ球）などが含まれる。
ここで用いられる「哺乳類」なる用語は、ヒト、家畜及び農業用動物、及び動物園の、スポーツの又は愛玩用動物を含み、例えばウマ、ブタ、ウシ、イヌ、ネコ、およびフェレットシなどの、哺乳類として分類される何れかの動物に関する。好ましくは、ここでの哺乳類はヒトである。
１つ以上の治療薬を「組み合わせて」投与するとは、同時（共同で）およびあらゆる順序での連続した投与を含む。
ここで用いたような用語「細胞毒性剤」は、細胞の機能を抑制又は防止する及び／又は細胞の破壊を生じる物質に関する。その用語は、放射性同位体（例えば、１３１Ｉ，１２５Ｉ，９０Ｙ，及び１８６Ｒｅ）、化学療法剤、及び細菌、真菌、植物、又は動物起源の酵素的に活性な毒素、又はそのフラグメントのような毒素を含むことを意図する。
「化学療法剤」は、癌の治療に有用な化合物である。化学療法剤の実例は、アドリアマイシン、ドキソルビシン、５-フルオロウラシル、シトシンアラビノシド（"Ara-C"）、シクロフォスファミド、チオテパ、ブスルファン、シトキシン、タキソール、トクソテル、メトトレキサート、シスプラチン、メルファラン、ビンブラスチン、ブレオマイシン、エトポシド、イフォスファミド、マイトマイシンＣ、ミトキサントロン、ビンクレイスチン、ビノレルビン、カルボプラチン、テニポシド、ダウノマイシン、カルミノマイシン、アミノプテリン、ダクチノマイシン、マイトマイシン、エスペラマイシン（米国特許第４６７５１８７号参照）、メルファラン、及び他の関連するニトロジェンマスタードを含む。またこの定義には、タモキシフェンとオナプリストンのような腫瘍においてホルモン作用を調整する又は抑制するように作用するホルモン剤も含まれる。
ここで用いる場合、「増殖抑制剤」は、インビトロ又はインビボでのいずれか一方で、ここに同定した遺伝子の何れかを発現する又は過剰発現する細胞、特に癌細胞の増殖を抑制する化合物又は組成物に関する。かくして、増殖抑制剤は、Ｓ相中の悪性細胞のパーセンテージを有意に減じるそれである。増殖抑制剤の実例は、Ｇ１阻止とＭ-相阻止を誘導する剤のような、細胞循環進行を（Ｓ相以外の所で）阻止する剤を含む。従来のＭ-相ブロッカーは、ビンカス（ビンクリスチンとビンブラスチン）、タキソール、及びドキソルビシン、ダウノルビシン、エトポシド、及びブレオマイシンのようなtopoIIインヒビターを含む。ＧＩがＳ-相阻止にも流出するのを阻止するそれらの剤は、例えば、タモキシフェン、プレドニソン、ダカルバジン、メクロレタミン、シスプラチン、メトトレキサート、５-フルオロウラシル、及びａｒａ-ＣのようなＤＮＡアルキル化剤である。更なる情報が、ムラカミらによって"Cell cycle regulation, oncogenes, and antineoplastic drugs"と題されたThe Molecular Basis of Cancer, Mendelsohn and Israel, eds., Chapter 1,(WB Saunders: Philadelphia,1995)、特に13頁中に見出すことができる。
「サイトカイン」なる用語は、細胞間媒体として他の細胞に作用するある細胞母集団から放出される蛋白質についての一般的用語である。このようなサイトカインの例は、リンホカイン類、モノカイン類、及び伝統的ポリペプチドホルモン類である。サイトカインの内に含まれるものは、ＯＢ蛋白質；ヒト成長ホルモン、Ｎ−メチオニルヒト成長ホルモン、及びウシ成長ホルモン等の成長ホルモン類；副甲状腺ホルモン；チロキシン；インスリン；プロインスリン；リラキシン；プロリラキシン；卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、黄体形成ホルモン（ＬＨ）等の糖蛋白ホルモン類；肝細胞成長因子；線維芽細胞成長因子；プロラクチン；胎盤性ラクトゲン；腫瘍壊死因子−α及び−β；ミュラー阻害物質；マウスゴナドトロピン−会合ペプチド；インヒビン；アクチビン；血管内皮成長因子；インテグリン；トロンボポイエチン（ＴＰＯ）；ＮＧＦ−β等の神経成長因子；血小板成長因子；ＴＧＦ−α及びＴＧＦ−β等のトランスフォーミング成長因子（ＴＧＦ）；インスリン様成長因子−I及び−II；エリスロポイエチン（ＥＰＯ）；骨誘導因子；インターフェロンーα、−β及び−γ等のインターフェロン；マクロファージ−ＣＳＦ（Ｍ−ＣＳＦ）、顆粒球−マクロファージ−ＣＳＦ（ＧＭ−ＣＳＦ）及び顆粒球−ＣＳＦ（Ｇ−ＣＳＦ）等のコロニー刺激因子（ＣＳＦ）；ＩＬ−１、ＩＬ−１α、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２等のインターロイキン（ＩＬ）；並びに白血病阻害因子（ＬＩＦ）及びキットリガンド（ＫＬ）等を含む他のポリペプチド因子等である。ここにおいて使用されるように、サイトカインなる用語は天然供給源由来または、組換え細胞培養物由来の蛋白質、及び天然配列サイトカインの生物学的活性同等物を含む。
「治療に有効な量」は、そのケースにより、炎症性反応の測定可能な阻害または促進を達成するために必要とされる、活性のあるＰＲＯ３０１、ＰＲＯ３６２、またはＰＲＯ２４５アンタゴニストまたはアゴニストの量である。
「天然配列ＰＲＯ３０１、ＰＲＯ３６２、またはＰＲＯ２４５ポリペプチド」は、各々、天然から得られたＰＲＯ３０１、ＰＲＯ３６２、またはＰＲＯ２４５と同じアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。そのような天然配列ＰＲＯ３０１、ＰＲＯ３６２、またはＰＲＯ２４５は、天然から単離され、若しくは組換えまたは合成法によって生産できる。
用語、「天然配列ＰＲＯ３０１」、「天然配列ＰＲＯ３６２」、または「天然配列ＰＲＯ２４５」は、各々、ＰＲＯ３０１、ＰＲＯ３６２、またはＰＲＯ２４５の天然で生じる端切り形態または分泌形態（例えば細胞外ドメイン配列）、天然で生じる変異体形態（例えば選択的スプライシング形態）及びＰＲＯ３０１、ＰＲＯ３６２、またはＰＲＯ２４５の天然で生じる対立遺伝子変異体を、特に包含する。
本発明の一つの実施態様において、天然配列ＰＲＯ３０１は、図２（配列番号１）の１から２９９アミノ酸を含む成熟したまたは全長天然配列ＰＲＯ３０１ポリペプチドであり、Ｎ末端シグナル配列を有するかまたは有さず、位置１の開始メチオニンを有するかまたは有さず、位置２３６から約２５８の可能性の有るトランスメンブレンドメインを有するかまたは有さず、及び約位置２５９から２９９までの細胞内ドメインを有するかまたは有していない。
他の実施態様において、天然配列ＰＲＯ３６２ポリペプチドは、図３（配列番号：２）に示されるアミノ酸配列のアミノ酸１からＸ、Ｘはアミノ酸残基２７１−２８０のいずれかである、を含む全長ＰＲＯ３６２タンパク質の細胞外ドメインである。任意にＰＲＯ３６２ポリペプチドは、１９９８年２月５日にＡＴＣＣ寄託番号：２０９６２０として寄託されたベクターＤＮＡ４５４１６−１２５１のｃＤＮＡ挿入物によってコードされるポリペプチドを発現させることにより得られたものあるいは得ることが可能なものである。
さらに他の実施態様で、天然配列ＰＲＯ２４５ポリペプチドは、図１５（配列番号：９）のアミノ酸１から３１２を含む成熟または全長天然配列ＰＲＯ２４５ポリペプチドである。
「ＰＲＯ３０１またはＰＲＯ３６２細胞外ドメイン」または「ＰＲＯ３０１またはＰＲＯ３６２ＥＣＤ」は、各々ＰＲＯ３０１またはＰＲＯ３６２ポリペプチドの型をさし、それは実質的に、各全長分子のトランスメンブレンおよびサイトプラスミックドメインを含まない。通常、ＰＲＯ３０１ＥＣＤまたはＰＲＯ３６２ＥＣＤは、１％未満のそのようなトランスメンブレンおよび／またはサイトプラスミックドメインを有しているであろう。好ましくは０．５％未満のそのようなドメインを有しているであろう。任意に、ＰＲＯ３０１ポリペプチドＥＣＤは図２（配列番号：１）の約２８から約２３５のアミノ酸残基を含み、ＰＲＯ３６２ポリペプチドＥＣＤは図３（配列番号：２）の１からＸ、Ｘは２７１−２８０からのアミノ酸のいずれかである、のアミノ酸残基を含んでいるであろう。本発明のＰＲＯ３０１またはＰＲＯ３６２ポリペプチドで同定されるいかなるトランスメンブレンドメインは、疎水性ドメインの型を同定するためにその分野で日常用いられている基準に従って同定されることが理解されるであろう。トランスメンブレンドメインの正確な境界は変化し得るが、最初に同定されたドメインの両端で約５アミノ酸以下までであると考えられる。したがって、ＰＲＯ３０１またはＰＲＯ３６２ポリペプチドＥＣＤは、任意に図３（配列番号：２）の１からＸ、Ｘは図３（配列番号：２）の２７１−２８０からのアミノ酸のいずれか１つである、のアミノ酸残基を含んでもよい。
「ＰＲＯ３０１変異体」または「ＰＲＯ２４５変異体」は、下記の通り、（ａ）ＰＲＯ３０１ポリペプチド、これはその天然シグナル配列を有するかまたは有さず、開始メチオニンを有するかまたは有さず、可能性の有るトランスメンブレンドメインを有するかまたは有さず、及び細胞内ドメインを有するかまたは有していない、（ｂ）（ａ）のＤＮＡ分子の相補体、と少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有する活性ＰＲＯ３０１を意味する。特定の実施態様において、ＰＲＯ３０１変異体は、全長天然配列ＰＲＯ３０１から推定される図１（配列番号：１）に示されるアミノ酸配列を有するＰＲＯ３０１に少なくとも約８０％のアミノ酸配列相同性を有する。そのようなＰＲＯ３０１変異体は、例えば図２（配列番号：１）の配列のＮまたはＣ末端で、一つ以上のアミノ酸残基が付加または欠失されたＰＲＯ３０１ポリペプチドを含む。好ましくは、核酸またはアミノ酸配列同一性は、少なくとも約８５％、より好ましくは少なくとも約９０％、さらにより好ましくは少なくとも約９５％である。
「ＰＲＯ３６２変異体」は、下記の通り、全長天然配列ＰＲＯ３６２から推定される図３（配列番号：２）に示されるアミノ酸配列を有するＰＲＯ３６２ポリペプチドに少なくとも約８０％のアミノ酸配列相同性を有する活性ＰＲＯ３６２ポリペプチドを意味する。そのようなＰＲＯ３６２変異体は、例えば図３（配列番号：２）の配列のＮまたはＣ末端で、一つ以上のアミノ酸残基が付加または欠失されたＰＲＯ３０１ポリペプチドを含む。好ましくは、核酸またはアミノ酸配列同一性は、図３（配列番号：２）のアミノ酸配列と、少なくとも約８５％、より好ましくは少なくとも約９０％、さらにより好ましくは少なくとも約９５％である。
ここで同定されたＰＲＯ３０１、ＰＲＯ３６２、またはＰＲＯ２４５配列についての「パーセント（％）アミノ酸配列同一性」は、該配列の同一性の一部としていずれかの保存的置換を考慮せずに、最大のパーセント配列同一性を得るために、もし必要であれば配列を並べギャップを導入した後に、ＰＲＯ３０１、ＰＲＯ３６２、またはＰＲＯ２４５配列におけるアミノ酸残基と同一である候補の配列中のアミノ酸残基のパーセントとして定義される。パーセントアミノ酸配列同一性を測定する目的のための整列は、例えばBLAST,ALIGNまたはMegalign(DNASTAR)ソフトウェアーのような公衆に利用可能であるコンピューターソフトウェアーを使用して、当業者に周知の各種の方法で達成される。好ましいソフトウェアー整列プログラムは、BLASTである。当業者は、比較される配列の全長に亘る最大の整列を得るために必要とされるいずれかのアルゴリズムを含む整列の測定のための適切なパラメーターを決定できる。
ここで同定されたＰＲＯ３０１、ＰＲＯ３６２、またはＰＲＯ２４５コード核酸配列（例えば、ＤＮＡ４０６２８、ＤＮＡ４５４１６、ＤＮＡ３５６３８）に関する「パーセント（％）核酸配列同一性」は、最大のパーセント配列同一性を得るために、もし必要ならば、配列を並べギャップを導入した後に、興味あるＰＲＯ３０１、ＰＲＯ３６２、またはＰＲＯ２４５コード配列中のヌクレオチドと同一である候補の配列中のヌクレオチドのパーセントとして定義される。パーセント核酸配列同一性を測定する目的のための整列は、例えばBLAST,ALIGNまたはMegalign(DNASTAR)ソフトウェアーのような公衆に利用可能であるコンピューターソフトウェアーを使用して、当業者に周知の各種の方法で達成される。当業者は、比較される配列の全長に亘る最大の整列を得るために必要とされるいずれかのアルゴリズムを含む整列の測定のための適切なパラメーターを決定できる。
ここで開示される各種のポリペプチドを記載するために使用される場合、「単離された」は、天然環境の構成成分から同定及び分離及び／または回収されたポリペプチドを意味する。天然環境の混在構成要素は、該ポリペプチドの診断または治療上の使用を典型的に妨げる物質であり、酵素、ホルモン、及び他のタンパク質性または非タンパク質性溶質を含む。好ましい実施態様として、該ポリペプチドは、（１）スピニングカップ配列決定器の使用によってＮ末端または内部アミノ酸配列の少なくとも１５残基を得るのに十分な程度に、または（２）クマシーブルーまたは好ましくは銀染色を使用して非還元または還元条件の下でＳＤＳ−ＰＡＧＥによる均質性に精製されるであろう。少なくとも１つのＰＲＯ３０１天然環境は存在しないであろうために、単離されたポリペプチドは、in situで組換え細胞内にポリペプチドを含む。しかしながら通常、単離されたポリペプチドは少なくとも１つの精製工程によって調製されるであろう。
「単離された」ＤＮＡ４０６２８核酸分子は、ＤＮＡ４０６２８核酸の天然の供給源で一般的に会合している少なくとも一つの混在核酸分子から同定され分離された核酸分子である。単離されたＤＮＡ４０６２８核酸分子は、それが天然で見出される形態または状態以外のものである。単離されたＤＮＡ４０６２８核酸分子はそれ故、天然細胞で存在するＤＮＡ４０６２８核酸分子とは区別される。しかしながら、ＤＮＡ４０６２８核酸分子は、例えば該核酸分子が、天然細胞のものとは異なる染色***置に存在する場合、通常ＤＮＡ４０６２８を発現する細胞において含まれたＤＮＡ４０６２８核酸分子を含む。
「単離された」ＰＲＯ３０１、ＰＲＯ３６２、またはＰＲＯ２４５ポリペプチドをコードする核酸分子は、ＰＲＯ３０１、ＰＲＯ３６２、またはＰＲＯ２４５ポリペプチドをコードする核酸の天然の供給源で一般的に会合している少なくとも一つの混在核酸分子から同定され分離された核酸分子である。単離されたＰＲＯ３０１、ＰＲＯ３６２、またはＰＲＯ２４５ポリペプチドをコードする核酸分子は、それが天然で見出される形態または状態以外のものである。単離されたＰＲＯ３０１、ＰＲＯ３６２、またはＰＲＯ２４５ポリペプチドをコードする核酸分子はそれ故、天然細胞で存在するＤＮＡ４０６２８核酸分子とは区別される。しかしながら、単離されたＰＲＯ３０１、ＰＲＯ３６２、またはＰＲＯ２４５ポリペプチドをコードする核酸分子は、例えば該核酸分子が、天然細胞のものとは異なる染色***置に存在する場合、通常ＰＲＯ３０１、ＰＲＯ３６２、またはＰＲＯ２４５ポリペプチドコードを発現する細胞において含まれたＰＲＯ３０１、ＰＲＯ３６２、またはＰＲＯ２４５ポリペプチドをコードする核酸分子を含む。
用語、「制御配列」は、特定の宿主中で機能的に連結されたコード配列を発現するために必要なＤＮＡ配列を指す。原核生物に好適な制御配列は、例えばプロモータ、場合によりオペレータ配列、リボソーム結合部位、および可能性としては他のまだほとんど理解されていない配列を含む。真核細胞は、プロモータ、ポリアデニル化シグナル、及びエンハンサーを使用することが周知である。
核酸は、他の核酸配列と機能的に関連して配置される場合に、「作動可能に連結している」。例えば、プレ配列または分泌リーダーに対するＤＮＡは、それがポリペプチドの分泌に関与するプレタンパク質として発現される場合にポリペプチドのＤＮＡに作動可能に連結し；またプロモーター若しくはエンハンサーは、それが配列の転写に影響する場合にコード配列に対して作動可能に連結し；またリボソーム結合部位は、それが翻訳を促進するように位置する場合にコード配列に作動可能に連結している。一般的に、「作動可能に連結」とは、ＤＮＡ配列が連続し、分泌リーダーの場合には連続かつ読み取りの枠内に連結されることを意味する。しかしながら、エンハンサーは連続する必要はない。連結は、慣用の制限部位においての連結により達成される。そのような部位が存在しない場合には、合成オリゴヌクレオチドアダプターまたはリンカーが慣用の方法により使用される。
用語、「抗体」は、最広義で使用され、単一の抗ＰＲＯ３０１、抗ＰＲＯ３６２、または抗ＰＲＯ２４５ポリペプチドモノクローナル抗体（アゴニスト、アンタゴニスト及び中和抗体を含む）及びポリエピトープ特異性を有する抗ＰＲＯ３０１、抗ＰＲＯ３６２、または抗ＰＲＯ２４５抗体組成物を特異的に包含する。ここで使用される用語、「モノクローナル抗体」は、実質的に均質な抗体の集団から得られた抗体を指し、即ち集団に含まれる個々の抗体は、少量存在する天然で生じる可能性を有する突然変異体を除いて同一である。
ここでの目的として「活性な」または「活性」は、特異的に天然のまたは天然で生じるＰＲＯ３０１の生物学的及び／または免疫学的活性を維持するＰＲＯ３０１、ＰＲＯ３６２、またはＰＲＯ２４５の形態を指す。好ましい活性は、結合活性および抗体結合活性を変化、例えば阻害あるいは調節することである。活性は好ましくは、制御、癌の活性およびまたはウィルス関連抗原の活性を含む。
ハイブリダイゼーション反応の「ストリンジェンシー」とは当業者により容易に決定でき、通常、プローブの長さ、洗浄温度および塩濃度に依存する経験的な算定である。一般に、長いプローブは適当なアニーリングのために高温を必要とし、逆に短いプローブは低温を必要とする。相補鎖がそれらの融解温度以下の環境にある場合、ハイブリダイゼーションは通常、変性ＤＮＡが再アニールする能力に依存する。プローブと、ハイブリダイゼーションが可能な配列との所望の相同性の程度が高ければ高いほど使用できる相対的温度が高くなる。その結果、さらに高い相対的温度は反応条件をさらにストリンジェントにする傾向があり、他方で低温は厳格性を低くする傾向があるということになる。さらなる詳細とハイブリダイゼーション反応のストリンジェンシーの説明については、Ausubelら,Current Protocols in Molecular Biology、Wiley Interscience Publishers(1995)を参照されたい。
「ストリンジェントな条件」は、（１）例えば５０℃で０．０１５塩化ナトリウム／０．００１５Ｍクエン酸ナトリウム／０．１％ドデシル硫酸ナトリウムといった、低イオン強度および高温での洗浄を使用し、または（２）例えば４２℃で０．１％ウシ血清アルブミン／０．１％Ｆｉｃｏｌ／０．１％ポリビニルピロリドン／７５０ｍＭ塩化ナトリウム、７５ｍＭクエン酸ナトリウムを含む５０ｎＭリン酸ナトリウム、ｐＨ６．５を含む５０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）ホルムアミドといった、ホルムアミドのような変性試薬をハイブリダイゼーションの間に使用する。もう一つの例としては、４２℃で５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（０．７５Ｍ ＮａＣｌ、０．０７５Ｍクエン酸ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ６／８）、０．１％ピロリン酸ナトリウム、５×デンハルト溶液、音波処理したサケ***ＤＮＡ（５０μｇ／ｍｌ）、０．１％ＳＤＳ、および１０％硫酸デキストランを使用し、４２℃で０．２×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳ中で洗浄する。またもう一つの例は、５５℃で１０％硫酸デキストラン、２×ＳＳＣ（塩酸ナトリウム／クエン酸ナトリウム）および５０％ホルムアミドを使用してハイブリダイゼーションし、引き続き５５℃でＥＤＴＡを含む０．１×ＳＳＣより成る強ストリンジェント洗浄を実施する。
「中等度の(moderate)ストリンジェントな条件」は、Sambrook等, 上記参照に記載されており、上述のものよりストリンジェントではない洗浄溶液及びハイブリダイゼーション条件（例えば温度、イオン強度、及び％SDS）の使用を含む。中等度のストリンジェントな条件の例は、２０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１５ｍＭクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハルト溶液、１０％デキストラン硫酸、及び２０ｍｇ／ｍＬ変性剪断サケ***ＤＮＡを含む溶液中で、３７℃での一晩のインキュベーション、引き続き３７−５０℃で１×ＳＳＣでのフィルターの洗浄のような条件である。当業者は、プローブの長さ等の因子を考慮する必要のような、温度、イオン強度等を調節する方法を認識するであろう。
ここで用いられる場合の「エピトープタグ」との用語は、本発明のポリペプチドを「タグポリペプチド」に融合させてなるキメラポリペプチドを意味する。タグポリペプチドは、抗体が作られうるエピトープを提供するのに十分な残基を有するが、それが融合するポリペプチドの活性に干渉しないように短い残基を有する。タグポリペプチドは、好ましくは、抗体が他のエピトープと実質的に交差反応しないようにかなり独自なものでなければならない。適するタグポリペプチドは、一般的に、少なくとも６アミノ酸残基、通常は約８〜５０アミノ酸残基（好ましくは、約１０〜２０アミノ酸残基）を有する。
本発明のポリペプチドの変異体の情況において「活性のある」または「活性」とは、天然または天然に存在する本発明のポリペプチドの生物学的および／または免疫学的活性を保持する本発明のタンパク質の形態を意味する。
抗体またはここで開示されたスクリーニングアッセイで同定されることができる他の分子（例えば、有機または無機小分子、ペプチドなど）の情況での「生物学的活性」は、そのような分子の、組織への炎症細胞の湿潤を誘導または阻害する、Ｔ細胞増殖を刺激または阻害する、細胞によるリンフォカインの放出を刺激または阻害する、能力をさすために用いられる。他の好ましい活性は、増加した血管透過性またはその阻害である。
「アンタゴニスト」との用語は最も広い意味で用いられ、ここに開示される天然のトールレセプタの生物学的活性を部分的または完全にブロック、阻止、抑制または中和する分子を包含する。同様に、「アゴニスト」との用語は最も広い意味で用いられ、ここに開示される天然のトールレセプタの生物学的活性に類似するか、増強する分子を包含する。適当なアゴニストまたはアンタゴニスト分子は具体的にはアゴニストまたはアンタゴニスト抗体または抗体断片、断片または天然のトールレセプタポリペプチドのアミノ酸配列の変異体、ペプチド、小有機分子等を包含する。
「小分子」とはここでは、約６００ダルトン未満の分子量を有すると定義される。
「抗体（Ａｂｓ）」および「免疫グロブリン」（Ｉｇｓ）は、同じ構造特性を有する糖タンパク質である。抗体は、特定の抗原に対して結合特異性を示すが、免疫グロブリンは、抗体と、抗原特異性を有していない他の抗体様分子の両方を含む。後者の種類のポリペプチドは、例えば、リンパ系によって低レベルで、骨髄腫細胞によって増加したレベルで、生産される。「抗体」という用語は、最広義で用いられ、特に、制限的でなく、完全な（intact）モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、少なくとも２つの完全抗体から形成された多重特異性（multispecific）抗体（例えば二重特異性（bispecific）抗体）、および所望の生理活性を示す抗体断片を包含する。
「天然（native）抗体」および「天然免疫グロブリン」は通常、約１５０，０００ダルトンのヘテロテトラマー（heterotetrameric）糖タンパク質であり、２つの同一の軽（Ｌ）鎖と２つの同一な重（Ｈ）鎖からなる。各軽鎖は、重鎖に１つの共有ジスルフィド結合によって結合しており、ジスルフィド架橋の数は、異なる免疫グロブリンのアイソタイプの重鎖の間で変化する。各重および軽鎖は規則的な間隔の鎖間ジスルフィド橋も有している。各重鎖は一方の端に可変ドメイン（ＶＨ）、その後に多くの不変ドメインを有している。各軽鎖は一方の端に可変ドメイン（ＶＬ）、他方の端に不変ドメインを有しており、軽鎖の不変ドメインは重鎖の最初の不変ドメインと並んでおり、軽鎖の可変ドメインは重鎖の可変ドメインと並んでいる。特定のアミノ酸残基が、軽と重鎖の可変ドメインの間の界面を形成すると考えられている。
「可変」なる用語は、可変ドメインのある部分が、抗体の間の配列中で広く変化し、特定の抗原に対する各特定の抗体の結合および特異性において用いられる事実をさす。しかしながら、可変度は、抗体の可変ドメイン全体に均一に分布されていない。軽鎖および重鎖可変ドメインの両方において、相補性決定領域（ＣＤＲｓ）と呼ばれる３つのセグメントまたは超可変領域に集中している。可変ドメインの中でより高く保存されている部分は、フレームワーク（ＦＲ）と呼ばれる。天然重および軽鎖の可変ドメインは各々４つのＦＲ領域を含み、それはβシート配置に多く適応しており、βシート構造を連結、ある場合はその一部を形成している、ループを形成する３つのＣＤＲｓによって連結されている。各鎖のＣＤＲｓは、ＦＲ領域によって、一緒に非常に近位に、そして他の鎖からのＣＤＲｓによって、支えられており、抗体の抗原結合部位の形成に寄与している（Kaatら、NIH Publ. No.91-3242,I巻、647-669頁(1991)参照）。不変ドメインは、抗原に対する抗体との結合には直接関与していないが、抗体依存性細胞毒性における抗体の関与などの、種々のエフェクター機能を示す。
「抗体断片」は、完全抗体の一部、好ましくは完全抗体の抗原結合または可変領域を含む。抗体断片の例は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、およびＦｖ断片；ダイアボディ（diabodies）；直鎖抗体（Zapata,Protein Eng.8(10):1057）;一本鎖抗体分子；および抗体断片から形成された多重特異性抗体を含む。
抗体のパパイン消化は、各々が単一の抗原結合部位を有している”Ｆａｂ”断片と呼ばれる２つの同一の抗原結合断片と、残りの”Ｆｃ”断片を生成する。”Ｆｃ”という表示は、容易に結晶化される性質を反映している。ペプシン処理では、２つの抗原結合部位を有し、抗原と架橋することができるＦ（ａｂ’）２断片を得る。
「Ｆｖ」は、完全な抗原認識および結合部位を含む最小抗体断片である。この領域は、強固な非共有結合で結合した、１つの重鎖および１つの軽鎖可変ドメインの二量体からなる。この配置で、各可変ドメインの３つのＣＤＲｓが、相互作用して、ＶＨ−ＶＬ二量体の表面上の抗原結合部位を定める。集合的に、６つのＣＤＲｓが、抗原結合特異性を抗体に与える。しかしながら、単一の可変ドメイン（あるいは抗原に特異的なＣＤＲｓを３つだけ含むＦｖの半分）でも、全体の結合部位よりも親和性は低いながらも、抗原を認識し結合する能力を有している。
Ｆａｂ断片も、軽鎖の不変ドメインと重鎖の第１の不変ドメイン（ＣＨ１）を含む。Ｆａｂ’断片は、抗体ヒンジ領域からの１つ以上のシステインを含む重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシ末端にいくつかの残基が付加されていることにより、Ｆａｂ断片と異なっている。Ｆａｂ’−ＳＨはここでは、不変ドメインのシステイン残基がフリーのチオール基を有しているＦａｂ’のための表示である。Ｆ（ａｂ’）２抗体断片は、元来、ヒンジシステインをその間に有するＦａｂ’断片のペアとして生産された。抗体断片の他の化学的カップリングも知られている。
いかなる脊椎動物種からの抗体（免疫グロブリン）の「軽鎖」も、それらの不変ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ（κ）とラムダ（λ）と呼ばれる２つの明らかに異なる型のうちの１つに特定することができる。
それらの重鎖の不変ドメインのアミノ酸配列に依存して、免疫グロブリンを異なるクラスに特定することができる。５つの免疫グロブリンの主クラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ，およびＩｇＭがあり、これらのうちのいくつかは、さらにサブクラス（アイソタイプ）、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、およびＩｇＡ２に分けられる。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖不変ドメインは、各々α、δ、ε、γ、およびμと呼ばれる。免疫グロブリンの異なるクラスのサブユニット構造と３次元配置はよく知られている。
ここにおいて使用される「モノクローナル抗体」なる用語は、実質的に均質な抗体、すなわち母集団を含むそれぞれの抗体がわずかに存在してもよい天然に生じ得る変異を除いて同等であるような母集団から得られる抗体を指す。モノクローナル抗体は高度に特異的であり、単一の抗原性部位を指向する。更に、典型的には異なる決定基（エピトープ）に向けられた異なる抗体を含む慣用の（ポリクローナル）抗体調製物とは対照的に、各モノクローナル抗体は抗原上の単一の決定基に向けられている。それらの特異性に加えて、モノクローナル抗体は他の免疫グロブリンで夾雑していないハイブリドーマ培養物により合成される点においても有利である。「モノクローナル」なる修飾語は、実質的に均質な抗体の母集団から得られ、いずれかの特定方法による産生を要求するものとも解されない抗体の特徴を示す。例えば、本発明に従って使用されるべきモノクローナル抗体は、Kohler et al., Nature 256:495(1975)により最初に記述されたハイブリドーマ法により調製されてよく、あるいは組換えＤＮＡ法により調製されてもよい。「モノクローナル抗体」は、例えばClackson et al., Nature 352:624-628 (1991)及びMarks et al., J. Mol. Biol. 222:581-597 (1991)に記述される技術を使用してファージ抗体ライブラリーからも単離し得るファージミドおよびファージベクターを用いた抗体の調製が記載されている米国特許No.5,750,373、No.5,571,698、No.5,403,484、No.5,223,409も参照。
ここにおけるモノクローナル抗体は、特定的には「キメラ」抗体（免疫グロブリン）を含み、その重及び／または軽鎖の一部は特定の種から誘導された抗体の対応する配列に同等、若しくは相同的であるか、または特定の抗体種若しくは亜種に属するものであり、その一方で鎖の残る部分は他の種から誘導された抗体の対応する配列に同等、若しくは相同的であるか、または他の抗体種若しくは亜種に属するものであり、加えて、それらが所望の生物学的活性を示す限りこのような抗体の断片も含む（Cabilly et al., 前出文献；Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984)）。
非ヒト（例えばネズミ）抗体の「ヒト化」形態は、非ヒト免疫グロブリンから誘導された最小の配列を含むキメラ性免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖、またはその断片（Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’Ｆ(ａｂ')２若しくは抗体の他の抗原結合配列等）である。ほとんどの部分についてヒト化抗体はヒト免疫グロブリン（受容抗体）であり、そのレセプターの相補性決定領域（ＣＤＲ）の残基は、所望の特異性、親和性、及び容量を持ったマウス、ラットまたはウサギ等の非ヒト種（提供側抗体）のＣＤＲの残基により置換されている。ある例においては、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク領域（ＦＲ）は、対応する非ヒト残基により置換されている。更に、ヒト化抗体は、受容抗体にも、あるいは導入されるＣＤＲまたはフレームワーク配列にも見出されない残基を含んでもよい。これらの修飾は、抗体の性能を更に洗練させるかまたは最適化させるために行われる。一般的に、ヒト化抗体は実質的に全て、または少なくとも１つ、典型的には２つの可変領域を有し、全てまたは実質的に全てのＣＤＲ領域が非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、また全てまたは実質的に全てのＦＲ領域がヒト免疫グロブリンのものである。ヒト化抗体は、最適には免疫グロブリンの定常領域（Ｆｃ）、典型的にはヒト免疫グロブリンのものの少なくとも一部をも含んでよい。更に詳細には、Jones et al., Nature 321:522-525 (1986); Reichmann et al., Nature 332:323-329 (1988);及びPresta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992)参照。ヒト化抗体は、抗体の抗原結合部位が、マカクザルを対象の抗原にて免疫して生成された抗体から誘導された、”primatized”抗体を含む。オールドワールド（Old World）モンキーからの残基を含む抗体も、本発明の範囲であり得る。例えば米国特許No.5,658,570、No.5,693,780、No.5,681,722、No.5,750,105、No.5,756,096参照。
「一本鎖Ｆｖ」または「ｓＦｖ」抗体断片は、抗体のＶＨおよびＶＬドメインを含み、これらのドメインは単一ポリペプチド鎖に存在している。好ましくは、Ｆｖポリペプチドはさらに、ＶＨおよびＶＬドメインの間に、ｓＦｖに、抗原結合のために所望の構造を形成することを可能にさせるポリペプチドリンカーを含む。ｓＦｖの参照のためには、Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, 113巻、RosenburgおよびMoore編、Springer-Verlag, New York、269-315頁(1994)参照。
「ダイアボディ（diabodies）」という用語は、２つの抗原結合部位を有する小さな抗体断片で、断片が、同じポリペプチド鎖（ＶＨ−ＶＬ）中で、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に結合した重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含むもの、をさす。同じ鎖上の２つのドメインを対にさせるには短すぎるリンカーを用いることにより、ドメインは他の鎖の相補性ドメインによって対になり、２つの抗原決定部位を形成する。ダイアボディはより詳しくは、例えばEP404,097、WO93/11161；およびHollongerら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:6444-6448(1993)に記載されている。
「単離された」抗体は、天然環境の構成成分から同定及び分離及び／または回収されたものである。天然環境の混在構成要素は、該ポリペプチドの診断または治療上の使用を典型的に妨げる物質であり、酵素、ホルモン、及び他のタンパク質性または非タンパク質性溶質を含む。好ましい実施態様において、本発明の化合物は、（１）ローリー法で測定された化合物の９５重量％、より好ましくは９９重量％を超えるまでに、（２）スピニングカップ配列決定器の使用によってＮ末端または内部アミノ酸配列の少なくとも１５残基を得るのに十分な程度に、または（３）クマシーブルーまたは好ましくは銀染色を使用して非還元または還元条件の下でＳＤＳ−ＰＡＧＥによる均質性に精製されるであろう。少なくとも１つの化合物の天然環境は存在しないであろうために、単離された化合物は、in situで組換え細胞内に該化合物を含む。しかしながら通常、単離された化合物は少なくとも１つの精製工程によって調製されるであろう。
ここで用いられるとき「標識」なる語は、「標識された」化合物を生成させるように、化合物、例えば抗体またはポリペプチドに直接あるいは間接に共役される（conjugated）検出可能な化合物または組成物をさす。標識は、それ自身検出可能であってよく（例えば放射性標識または蛍光標識）、または酵素標識の場合、検出可能な基質化合物または組成物の化学変化を触媒してもよい。
「固相」とは、興味ある試薬（例えばＷＳＸレセプターまたはそれに対する抗体）が付着しうる非−水性担体を意味する。固相の例は、ガラス（調節された多孔質ガラス）、ポリサッカライド（例えば、アガロース）、ポリアクリルアミド、ポリスチレン、ポリビニルアルコール及びシリコーンにより部分的または全体が形成されるものを含む。ある実施態様において、内容に依存するが、固相はアッセイプレートのウエルを含むことが出来、他の態様ではそれは精製カラム（例えば、アフィニティクロマトグラフィーカラム）である。この用語は、米国特許第4,275,149号に記述されるような、分散的粒子の非連続的固相も含む。
「リポソーム」は、哺乳類への薬剤（例えば、ここで開示されている抗ＥｒｂＢ２抗体、および任意に化学療法剤）のデリバリーに有用である、種々のタイプの脂質、リン脂質、および／または界面活性剤からなる小さな小胞（vesicle）である。リポソームの成分は、一般的に、生理的膜の脂質配列に類似した、二層形成で配置される。
ここで用いられる「免疫付着因子(immunoadhesin)」との用語は、異種タンパク質（「付着因子」）の結合特異性を免疫グロブリンの定常ドメインのエフェクター機能に組み合わせている抗体様分子を示す。構造的には、免疫付着因子は、抗体（すなわち「異種」のもの）の抗原認識結合部位ではない所望の結合特異性を有するアミノ酸配列と免系グロブリンの定常部ドメイン配列との融合からなる。免疫付着因子分子の付着因子部分は、典型的には、レセプタまたはリガンドの少なくとも結合部位からなる隣接アミノ酸配列である。免疫付着因子における免疫グロブリン定常ドメイン配列は、ＩｇＧ−１、ＩｇＧ−２、ＩｇＧ−３またはＩｇＧ−４サブタイプ、ＩｇＡ（ＩｇＡ−１およびＩｇＡ−２等）、ＩｇＥ、ＩｇＤまたはＩｇＭ等の免疫グロブリンから得てよい。
ＩＩ．本発明の組成物及び方法
Ａ．ＰＲＯ３０１、ＰＲＯ３６２、またはＰＲＯ２４５の調製
１．全長ＰＲＯ３０１、ＰＲＯ３６２、またはＰＲＯ２４５ポリペプチド
本発明は、ＰＲＯ３０１、ＰＲＯ３６２、またはＰＲＯ２４５として本出願において称されるポリペプチドをコードする新たに同定され単離されたヌクレオチド配列を提供する。特に、出願人は、以下の実施例でさらに詳細に開示される、ＰＲＯ３０１、ＰＲＯ３６２、またはＰＲＯ２４５ポリペプチドをコードするｃＤＮＡを同定し単離した。BLAST(FastAフォーマット)配列アライメントコンピュータープログラムを使用して、出願人は、全長天然配列ＰＲＯ３０１（図２、配列番号：１）、ＰＲＯ３６２（図３、配列番号：３）、またはＰＲＯ２４５（図１５、配列番号：９）をコードするｃＤＮＡ配列が、Ａ３３抗原とＪＡＭの両方に高い相同性を有することを見出した（図１、１２−１８参照）。従って、本出願で開示されたＰＲＯ３０１は、Ａ３３抗原タンパク質ファミリーの新たに同定されたメンバーであり、炎症性腸疾患などの炎症性疾患や結腸直腸癌などのヒト新形成疾患に関与していると現在思われる。
２．ＰＲＯ３０１、ＰＲＯ３６２、またはＰＲＯ２４５変異体
ここに記載された全長天然配列ＰＲＯ３０１、ＰＲＯ３６２、またはＰＲＯ２４５に加えて、ＰＲＯ３０１、ＰＲＯ３６２、またはＰＲＯ２４５変異体を調製し得ることが企図される。ＰＲＯ３０１、ＰＲＯ３６２、またはＰＲＯ２４５変異体は、各々、ＰＲＯ３０１、ＰＲＯ３６２、またはＰＲＯ２４５ＤＮＡ内に適切なヌクレオチド変化を導入することによって、または所望のＰＲＯ３０１、ＰＲＯ３６２、またはＰＲＯ２４５ポリペプチドの合成によって調製され得る。当業者は、アミノ酸変化が、グリコシル化部位の数または位置の変化、若しくは膜アンカー特性の改変のような、ＰＲＯ３０１、ＰＲＯ３６２、またはＰＲＯ２４５の翻訳後工程を改変することを予測するであろう。
天然全長配列ＰＲＯ３０１、ＰＲＯ３６２、またはＰＲＯ２４５またはここで記載されるＰＲＯ３０１、ＰＲＯ３６２、またはＰＲＯ２４５の各種のドメインの変化は、例えば、米国特許第5,364,934号に示されたような保存的または非保存的突然変異のための技術及びガイドラインのいずれかを使用して作製される。変化は、天然配列ＰＲＯ３０１、ＰＲＯ３６２、またはＰＲＯ２４５と比較して、ＰＲＯ３０１、ＰＲＯ３６２、またはＰＲＯ２４５のアミノ酸配列において変化を引き起こすＰＲＯ３０１、ＰＲＯ３６２、またはＰＲＯ２４５をコードする一つ以上のコドンの置換、欠失または挿入である。任意に該変化は、ＰＲＯ３０１、ＰＲＯ３６２、またはＰＲＯ２４５の一つ以上のドメインの少なくとも一つのアミノ酸を、いずれかの他のアミノ酸で置換することによる。アミノ酸残基が、所望の活性に逆に影響することなく挿入、置換または欠失されることを測定するためのガイドラインは、ＰＲＯ３０１、ＰＲＯ３６２、またはＰＲＯ２４５の配列を相同的な周知のタンパク質分子のそれと比較すること、及び高い相同性を有する領域になされたアミノ酸配列変化の数を最小化することによって見出される。アミノ酸置換は、一つのアミノ酸を、ロイシンのセリンでの置換、即ち保存的なアミノ酸置換のような、同じ構造的及び／または化学的特性を有する別のアミノ酸で置換する結果とし得る。挿入または欠失は任意に、１から５アミノ酸の範囲でなされる。許容される変化は、配列中のアミノ酸の挿入、欠失または置換を系統的になすことによって、及び以下の実施例に記載されたインビトロアッセイにおいて活性に対して生じた変異を試験することによって測定される。
該変化は、オリゴヌクレオチド介在性（部位特異的）突然変異誘発、アラニンスキャニング、及びＰＣＲ突然変異誘発のような本分野で周知の方法を使用してなされる。部位特異的突然変異誘発[Carter等, Nucl. Acids Res., 13: 4331 (1986); Zoller等, Nucl. Acids Res., 10: 6487 (1987)]、カセット突然変異誘発[Wells等, Gene, 34: 315 (1985)]、制限選択突然変異誘発[Wells等, Philos. Trans. R. Soc. London SerA, 317: 415 (1986)]または他の周知の方法が、ＰＲＯ３０１変異体ＤＮＡを生産するためにクローン化ＤＮＡで実施され得る。
スキャニングアミノ酸分析はまた、連続した配列に沿って一つ以上のアミノ酸を同定するために使用され得る。好ましいスキャニングアミノ酸の中では、比較的小さい中性アミノ酸がある。上記アミノ酸は、アラニン、グリシン、セリン、及びシステインを含む。アラニンは典型的に、ベータ炭素より小さい側鎖を消去し、該変異体の主鎖の構造を改変しないために、この群の中では好ましいスキャニングアミノ酸である。アラニンはまた、最も一般的なアミノ酸であるために、典型的に好ましい。さらに、隠れたまたは表面化した位置の両者でそれは頻繁に見出される[Creighton, The Proteins, (W.H. Freeman & Co.,N.Y.); Chothia J. Mol. Biol., 150: 1 (1976)]。もしアラニン置換が、変異体の十分量を生じなければ、中性のアミノ酸が使用され得る。
３．ＰＲＯ３０１、ＰＲＯ３６２、またはＰＲＯ２４５の修飾
ＰＲＯ３０１、ＰＲＯ３６２、またはＰＲＯ２４５の共有結合修飾は、本発明の範囲内に含まれる。共有結合修飾の一つの型は、ＰＲＯ３０１、ＰＲＯ３６２、またはＰＲＯ２４５の選択された側鎖若しくはＮまたはＣ末端残基と反応可能な有機誘導化試薬でＰＲＯ３０１、ＰＲＯ３６２、またはＰＲＯ２４５の標的アミノ酸残基を反応させることを含む。例えば抗ＰＲＯ３０１抗体を生成するための方法で使用する水不溶性支持体マトリックスまたは表面にＰＲＯ３０１を架橋すること、またはその逆のために、二官能性試薬で誘導化することが有用である。一般的に使用される架橋剤は、例えば1,1-ビス（ジアゾアセチル）-2-フェニルエタン、グルタルアルデヒドN-ヒドロキシスクシンイミドエステル、例えば4-アジドサリチル酸のエステル、3,3'-ジチオビス（スクシンイミジルプロピオナート）のようなジスクシンイミジルエステルを含むホモ二官能性イミドエステル、ビス-N-マレイミド-1,8-オクタンのような二官能性マレイミド、及びメチル-3-[(p-アジドフェニル)ジチオ]プロピオイミダートのような試薬を含む。
他の修飾は、グルタミニル及びアスパラギニル残基のそれぞれ相当するグルタミル及びアスパルチル残基への脱アミド化、プロリン及びリジンのヒドロキシル化、セリルまたはトレオニル残基のヒドロキシル基のリン酸化、リジン、アルギニン、及びヒスチジン側鎖のα−アミノ基のメチル化[T.E. Creighton, Proteins; Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco, pp. 79-86 (1983)]、Ｎ末端アミンのアセチル化、Ｃ末端カルボキシル基のアミド化を含む。
本発明の範囲内に含まれるＰＲＯ３０１、ＰＲＯ３６２、またはＰＲＯ２４５ポリペプチドの共有結合の別の型は、該ポリペプチドの天然のグリコシル化パターンの改変を含む。「天然のグリコシル化パターンの改変」は、天然配列ＰＲＯ３０１、ＰＲＯ３６２、またはＰＲＯ２４５で見出される一つ以上の炭化水素部分を欠失すること、及び／または天然配列ＰＲＯ３０１、ＰＲＯ３６２、またはＰＲＯ２４５に存在しない一つ以上のグリコシル化部位を加えることを意味するようにここで企図される。
ＰＰＲＯ３０１、ＰＲＯ３６２、またはＰＲＯ２４５ポリペプチドのグリコシル化部位の付加は、アミノ酸配列を改変することによって達成される。該改変は、例えば天然配列ＰＲＯ３０１、ＰＲＯ３６２、またはＰＲＯ２４５（Ｏ結合グリコシル化部位について）に対して一つ以上のセリンまたはトレオニン残基の付加またはそれによる置換によってなされる。ＰＲＯ３０１、ＰＲＯ３６２、またはＰＲＯ２４５アミノ酸配列は任意に、特に、所望のアミノ酸に翻訳されるであろうコドンを生産するように事前に選択された塩基で、ＰＲＯ３０１、ＰＲＯ３６２、またはＰＲＯ２４５ポリペプチドをコードするＤＮＡを突然変異することによって、ＤＮＡレベルでの変化を通じて改変される。
ＰＲＯ３０１、ＰＲＯ３６２、またはＰＲＯ２４５ポリペプチドの炭化水素部分の数を増大する別の方法は、該ポリペプチドへのグリコシドの化学的または酵素的結合による。上記方法は、例えば1987年9月11日に印刷されたWO 87/05330、及びAplinとWriston, CRC Crit. Rev. Biochem.,pp. 259-306 (1981)において本分野で記載されている。
ＰＲＯ３０１、ＰＲＯ３６２、またはＰＲＯ２４５ポリペプチドに存在する炭化水素部分の除去は、化学的または酵素的に達成され、またはグリコシル化の標的として機能するアミノ酸残基をコードするコドンの突然変異置換によって達成される。化学的脱グリコシル化法は、本分野で周知であり、例えばHakimuddin等, Arch. Biochem. Biophys., 259: 52 (1987)及びEdge等, Anal. Biochem., 118: 131 (1981)によって記載されている。ポリペプチドの炭化水素部分の酵素的切断は、Thutakura等, Meth. Enzymol., 138: 350 (1987)に記載された各種のエンド及びエキソグリコシダーゼの使用によって達成され得る。
本発明のＰＲＯ３０１、ＰＲＯ３６２、またはＰＲＯ２４５の共有結合修飾の別の型は、ＰＲＯ３０１、ＰＲＯ３６２、またはＰＲＯ２４５ポリペプチドを各種の非タンパク質性ポリマーの一つ、例えばポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、またはポリオキシアルキレンに、米国特許第4,640,835; 4,496,689; 4,301,144; 4,670,417; 4,791,192;または4,179,337に示された方法で結合することを含む。
本発明のＰＲＯ３０１、ＰＲＯ３６２、またはＰＲＯ２４５は、別の異種ポリペプチドまたはアミノ酸配列に融合されたＰＲＯ３０１、ＰＲＯ３６２、またはＰＲＯ２４５を含むキメラ分子を形成するように修飾され得る。一つの実施態様として、上記キメラ分子は、抗タグ化抗体が選択的に結合するエピトープを提供するタグ化ポリペプチドと、ＰＲＯ３０１、ＰＲＯ３６２、またはＰＲＯ２４５との融合物を含む。該エピトープタグは、ＰＲＯ３０１、ＰＲＯ３６２、またはＰＲＯ２４５のアミノまたはカルボキシ末端に一般的に配置される。ＰＲＯ３０１、ＰＲＯ３６２、またはＰＲＯ２４５の上記エピトープタグ化形態の存在は、タグ化ポリペプチドに対する抗体を使用して検出され得る。また、エピトープタグの提供は、ＰＲＯ３０１、ＰＲＯ３６２、またはＰＲＯ２４５がエピトープタグに結合する抗タグ化抗体または別の型の親和性マトリックスを使用してアフィニティー精製により容易に精製される。別の実施態様として、該キメラ分子は、免疫グロブリンまたは免疫グロブリンの特定の領域とのＰＲＯ３０１、ＰＲＯ３６２、またはＰＲＯ２４５の融合物を含む。キメラ分子の二価形態のために、上記融合物は、ＩｇＧ分子のＦｃ領域に結合される。
各種のタグ化ポリペプチド及びそのそれぞれの抗体が、本分野で周知である。例として、ポリヒスチジン（ポリｈｉｓ）またはポリヒスチジン−グリシン（ポリｈｉｓ−ｇｌｙ）タグ；ＨＡ標識ポリペプチド、及びその抗体１２ＣＡ５[Field等, Mol. Cell. Biol.,8: 2159-2165 (1988)]；ｃ−ｍｙｃタグ及び８Ｆ９，３Ｃ７，６Ｅ１０，Ｇ４，Ｂ７及び９Ｅ１０抗体[Evan等, Molecular and Cellular Biology, 5: 3610-3616 (1985)]；及び単純ヘルペスウイルス糖タンパク質Ｄ（ｇＤ）タグ及びその抗体[Paborsky等, Protein Engineering, 3(6): 547-553 (1990)]が含まれる。他のタグ化ポリペプチドは、Flagエピトープ[Hopp等, BioTechnology, 6: 1204-1210 (1988)]; KTエピトープペプチド[Martin等, Science, 255: 192-194 (1992)]; α−チューブリンエピトープペプチド[Skinner等, J. Biol. Chem., 266: 15163-15166 )1991)];及びＴ７遺伝子１０タンパク質ペプチドタグ[Lutz-Freyermuth等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87: 6393-6397 (1990)]を含む。
４．ＰＲＯポリペプチドの調製
以下の記載は主に、ＰＲＯ３０１、ＰＲＯ３６２、またはＰＲＯ２４５核酸を含むベクターで形質転換または形質導入された細胞を培養することによるＰＲＯ３０１、ＰＲＯ３６２、またはＰＲＯ２４５の生産に関する。本分野で周知の別の方法が、ＰＲＯ３０１、ＰＲＯ３６２、またはＰＲＯ２４５調製するために使用され得ることは、もちろん企図される。例えば、ＰＲＯ３０１、ＰＲＯ３６２、またはＰＲＯ２４５配列またはその一部は、固相法を使用した直接的ペプチド合成によって生産し得る[例えばStewart等, Solid-Phase Peptide Synthesis, W. H. Freeman Co., San Francisco, CA (1969); Merrifield, J. Am. Chem. Soc., 85: 2149-2154 (1963)参照]。インビトロタンパク質合成は、マニュアルの手順を使用してまたは自動的に実施される。自動化合成は、例えば製造者の説明書を使用して、Applied Biosystems Peptide Synthesizer 'Foster City, CA)で達成され得る。ＰＲＯ３０１、ＰＲＯ３６２、またはＰＲＯ２４５の各種の部分が、化学的に別々に合成され、及び全長ＰＲＯ３０１、ＰＲＯ３６２、またはＰＲＯ２４５を生産するための化学的または酵素的方法を使用して組み合わされる。
ａ．ＰＲＯ３０１、ＰＲＯ３６２、またはＰＲＯ２４５をコードするＤＮＡの単離
ＰＲＯ３０１、ＰＲＯ３６２、またはＰＲＯ２４５をコードするＤＮＡは、所望のＰＲＯ３０１、ＰＲＯ３６２、またはＰＲＯ２４５ｍＲＮＡを有し、且つそれを検出可能なレベルで発現すると思われる組織から調製されたｃＤＮＡライブラリーから得られる。従って、ヒトＰＲＯ３０１、ＰＲＯ３６２、またはＰＲＯ２４５ＤＮＡは、実施例に記載されているように、ヒト組織から調製されたｃＤＮＡライブラリーから簡便に得られる。ＰＲＯ３０１、ＰＲＯ３６２、またはＰＲＯ２４５コード遺伝子はまた、ゲノムライブラリーからまたはオリゴヌクレオチド合成によって得ることができる。
ライブラリーは、興味ある遺伝子またはそれによってコードされるタンパク質を同定するために設計されたプローブでスクリーニングし得る（ＰＲＯ３０１、ＰＲＯ３６２、またはＰＲＯ２４５に対する抗体、または少なくとも約２０−８０塩基のオリゴヌクレオチドのような）。選択されたプローブでのｃＤＮＡまたはゲノムライブラリーのスクリーニングは、Sambrook等, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (New York : Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)に記載されているような標準法を使用して実施される。ＰＲＯ３０１、ＰＲＯ３６２、またはＰＲＯ２４５をコードする遺伝子を単離するための別法は、ＰＣＲ法を使用することである[Sambrook等, 上記参照; Dieffenbach等, ＰＣＲ Primer: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1995)]。
以下の実施例は、ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするための方法を記載する。プローブとして選択されたオリゴヌクレオチド配列は、擬陽性を最小化するために、十分な長さ且つ十分な明白性を有するべきである。該オリゴヌクレオチドは好ましくは、スクリーニングされるライブラリー中のＤＮＡに対するハイブリダイゼーションの際に検出可能なように標識される。標識化の方法は本分野で周知であり、３２Ｐ標識化ＡＴＰのような放射性標識の使用、ビオチン化または酵素標識化を含む。中等度のストリンジェンシー及び高いストリンジェンシーを含むハイブリダイゼーション条件は、Sambrook等, 上記参照に提供される。
上記ライブラリースクリーニング方法で同定された配列は、GenBankのような公のデータベースまたは他の私的なデータベースに寄託され入手可能な他の周知の配列と、比較され及び整列され得る。該分子の所定の領域内、または全長配列に沿った配列同一性（アミノ酸またはヌクレオチドレベルのそれぞれで）は、相同性を測定するための各種のアリゴリズムを使用するBLAST, ALIGN, DNAスター、及びINHERITのようなコンピューターソフトウェアープログラムを使用して、配列のアライメントを通して測定され得る。
タンパク質コード配列を有する核酸は、ここで初めて開示された推定のアミノ酸配列を使用して、及び必要であれば、ｃＤＮＡに逆転写されていないｍＲＮＡの前駆体及びプロセッシング中間体を検出するために、Sambrook等, 上記参照に記載された簡便なプライマー伸長法を使用して、選択されたｃＤＮＡまたはゲノムライブラリーをスクリーニングすることによって得ることができる。
ｂ．宿主細胞の選択及び形質転換
宿主細胞は、ＰＲＯ３０１、ＰＲＯ３６２、またはＰＲＯ２４５生産のためにここで記載される発現またはクローニングベクターで形質転換または形質導入され、プロモーターの誘導、形質転換体の選択、または所望の配列をコードする遺伝子の増幅のために適切なように修飾された従来の栄養培地で培養される。培地、温度、ｐＨ等のような培養条件は、過度の実験なく当業者に選択され得る。一般的に、細胞培養の生産性を最大化するための培地、プロトコール、及び実施方法は、Mammalian Cell Biotechnology: a Practical Approach, M. Butler編(IRL Press, 1991)及びSambrool等, 上記参照中に見出され得る。
例えばＣａＰＯ４及び電気穿孔法といった形質転換の方法は、当業者に周知である。使用される宿主細胞に依存して、形質転換は、上記細胞に適した標準法を使用して実施される。Sambrook等, 上記参照に記載されている塩化カルシウムを使用したカルシウム処理、または電気穿孔法は一般的に、原核生物または実質的な細胞壁障壁を含む他の細胞のために使用される。Agrobacterium tumefaciensでの感染は、Shaw等, Gene, 23: 315 (1983)及び1989年6月29日に印刷されたWO 89/05859に記載されているように、特定の植物細胞の形質転換のために使用される。上記細胞壁を有さない哺乳類細胞のためには、Graham及びvan der Eb, Virology, 52: 456-457 (1978)のリン酸カルシウム沈降法が使用され得る。哺乳類細胞の宿主系の形質転換の一般的特徴は、米国特許第4,399,216号に記載されている。酵母に対する形質転換は典型的に、Van Solingen等, J. Bact., 130: 946 (1977)及びHsiao等, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 76: 3829 (1979)の方法に従って実施される。しかしながら、核マイクロインジェクション、電気穿孔法、完全な細胞との細菌プロトプラスト融合、または例えばポリブレン、ポリオルニチンといったポリカチオンによるような、細胞内にＤＮＡを導入するための他の方法も使用されうる。哺乳類細胞を形質転換するための各種の方法については、Keown等, Methods in Enzymology, 185: 527-537 (1990)及びMansour等, Nature, 336: 348-352 (1988)参照。
ここでのベクター中のＤＮＡをクローニングまたは発現するための適した宿主細胞は、原核生物、酵母、または高等真核生物細胞を含む。適切な原核生物は、大腸菌のような腸内細菌属といった、グラム陰性またはグラム陽性生物のような真正細菌を制限することなく含む。大腸菌K12株MM294(ATCC 31,446)；大腸菌X1776 (ATCC 31,537)；大腸菌株W3110 (ATCC 27,325)及びK5 772 (ATCC 53,635)のような、各種の大腸菌株が公に入手可能である。
原核生物に加えて、糸状真菌または酵母のような真核生物微生物が、ＰＲＯ３０１、ＰＲＯ３６２、またはＰＲＯ２４５コードベクターのための適切なクローニングまたは発現宿主である。Saccharomyces cerevisiaeは、一般的に使用される低級真核生物宿主微生物である。
グリコシル化ＰＲＯ３０１、ＰＲＯ３６２、またはＰＲＯ２４５の発現のために適した宿主細胞は、多細胞生物から得られる。無脊椎動物細胞の例は、Drosophila S2及びSpodoptera Sf9のような昆虫細胞、同様に植物細胞を含む。有用な哺乳類宿主細胞系の例は、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）及びCOS細胞を含む。より特異的な例は、SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651)で形質転換されたサル腎CV1系；ヒト胚腎系（２９３または懸濁培地での生育のためにサブクローン化された２９３細胞, Graham等, J. Gen Virol., 36: 59 (1977))；チャイニーズハムスター卵巣細胞／-DHFR (CHO, Urlaub及びChasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: 4216 )1980))；マウスセルトリ細胞(TM4, Mather, Biol. Reprod., 23: 243-251 (1980))；ヒト肺細胞(W138, ATCC CCL 75)；ヒト肝細胞(Hep G2, HB 8065)；及びマウス乳癌(MMT 060562, ATCC CCL51)を含む。適切な宿主細胞の選択は、当業者の範囲内にあると考えられる。
ｃ．複製ベクターの選択及び使用
ＰＲＯ３０１、ＰＲＯ３６２、またはＰＲＯ２４５をコードする核酸（例えばｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ）は、クローニング（ＤＮＡの増幅）または発現のため複製ベクター内に挿入される。各種のベクターが一般的に入手可能である。例えば該ベクターは、プラスミド、コスミド、ウイルス粒子、またはファージの形態で存在し得る。適切な核酸配列は、各種の方法によってベクター内に挿入される。一般的に、ＤＮＡは、本分野で周知の方法を使用して適切な制限エンドヌクレアーゼ部以内に挿入される。ベクター構成成分は一般的に、一つ以上のシグナル配列、複製のオリジン、一つ以上のマーカー遺伝子、エンハンサーエレメント、プロモーター、及び転写終結配列を制限することなく含む。一つ以上のこれらの構成成分を含む適切なベクターの構築は、当業者に周知の標準的な結紮法を使用する。
ＰＲＯ３０１、ＰＲＯ３６２、またはＰＲＯ２４５は、直接的にだけでなく、異種ポリペプチドとの融合ポリペプチドとして組換え的に生産され、該該異種ポリペプチドはは、成熟タンパク質またはポリペプチドのＮ末端での特異的な切断部位を有するシグナル配列または他のポリペプチドである。一般的にシグナル配列は、ベクターの構成成分であり、ベクターに挿入されるＰＲＯ３０１、ＰＲＯ３６２、またはＰＲＯ２４５ＤＮＡの一部である。該シグナル配列は、例えばアルカリホスファターゼ；ペニシリナーゼ；ｌｐｐ；または熱安定性エンテロトキシンＩＩリーダーの群から選択される原核生物シグナル配列である。酵母の分泌のためのシグナル配列は、例えば酵母インベルターゼリーダー、アルファ因子リーダー(Saccharomyces及びKluyveromyces α−因子リーダーを含み、後者は米国特許第5,010,182号に記載される）、または酸性ホスファターゼリーダー、C. albicansグルコアミラーゼリーダー(1990年4月4日発行されたEP 362,179）または1990年11月15日に発行されたWO 90/13646に記載されたシグナルを含む哺乳類細胞発現において、哺乳類シグナル配列は、同種または関連種の分泌ポリペプチドから得たシグナル配列、同様にウイルス分泌リーダーのような、タンパク質の分泌に向けられて使用される。
発現及びクローニングベクターの両者は、該ベクターが、一つ以上の選択された宿主細胞で複製可能である核酸配列を含む。上記配列は、各種の細菌、酵母及びウイルスについて周知である。プラスミドｐＢＲ３２２から得た複製のオリジンは、ほとんどのグラム陰性細菌に適しており、２μプラスミドオリジンは、酵母に適しており、各種のウイルスオリジン(SV40、ポリオーマ、アデノウイルス、VSVまたはBPV)は、哺乳類細胞におけるクローニングベクターに有用である。
発現及びクローニングベクターは、典型的に、選択マーカーと称される選択遺伝子を含む。典型的な選択遺伝子は、（ａ）例えばアンピシリン、ネオマイシン、メトトレキセート、またはテトラサイクリンといった抗生物質または他の毒素に対して耐性を与えるタンパク質、（ｂ）栄養素要求欠損を相補するタンパク質、または（ｃ）例えばBacilliについてのD-アラニンラセマーゼをコードする遺伝といった複合培地から入手可能ではない必須栄養素を供給するタンパク質をコードする。
哺乳類細胞についての適切な選択マーカーの例は、細胞構成要素の同定が、ＤＨＦＲまたはチミジンキナーゼのようなＰＲＯポリペプチド核酸を抽出可能なものである。野生型ＤＨＦＲが使用される場合、適切な宿主細胞は、ＤＨＦＲ活性を欠損したCHO細胞系であり、Urlaub等, Proc. Natl. Acad. Sci, USA, 77: 4216 (1980)に記載されたように調製され増殖される。酵母での使用のための適切な選択遺伝子は、酵母プラスミドＹＲｐ７[Stinchcomb等, Nature, 282: 39 (1979); KIngsman等, Gene, 7: 141 (1979); Tschemper等, Gene, 10: 157 (1980)]に存在するtrp1遺伝子である。該trp1遺伝子は、例えばATCC 44076またはPEP4-1 [Jones, Genetics, 85: 12 (1977)]といったトリプトファンにおいて生育する能力を欠いた酵母の突然変異株に対する選択マーカーを提供する。
発現及びクローニングベクターは通常、ｍＲＮＡ合成を実行するために、Proポリペプチド核酸配列と実施可能に結合したプロモーターを含む。各種の宿主細胞となりうる細胞によって認識されるプロモーターは周知である。原核生物宿主で使用するために適したプロモーターは、β−ラクタマーゼ及びラクトースプロモーター系[Chang等, Nature, 275: 615 (1978); Goeddel等, Nature, 281: 544 (1979)]、アルカリホスファターゼ、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系[Goeddel, Nucleic Acids Res., 8: 4057 (1980); EP 36,776]及びtacプロモーターのようなハイブリッドプロモーター[deBoer等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80: 21-25 (1983)]を含む。細菌系における使用のためのプロモーターは、ＰＲＯ３０１、ＰＲＯ３６２、またはＰＲＯ２４５をコードするＤＮＡに実施可能に結合したシャイン−ダルガルノ（SD）配列を含む。
酵母宿主での使用のための適切なプロモーターの例は、3-ホスホグリセラートキナーゼのためのプロモーター[Hitzeman等, J. Biol. Chem., 255: 2073 (1980)]またはエノラーゼ、グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース-6-リン酸イソメラーゼ、3-ホスホグリセラートムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ、及びグルコキナーゼのような他の解糖系酵素[Hess等, J. Adv. Enzyme Reg., 7: 149 (1968); Holland, Biotechemistry, 17: 4900 (1978)]を含む。
増殖条件によってコントロールされる転写のさらなる利点を有する誘導プロモーターである他の酵母プロモーターは、アルコールデヒドロゲナーゼ２、イソチトクロームＣ、酸性ホスファターゼ、窒素代謝と関連する分解酵素、メタロチオネイン、グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ、及びマルトース及びガラクトース利用に応答性の酵素に対するプロモーター領域である。酵母発現での使用のための適切なベクター及びプロモーターは、EP 73,657にさらに記載される。
哺乳類宿主細胞におけるベクターからのＰＲＯ３０１、ＰＲＯ３６２、またはＰＲＯ２４５転写は、ポリオーマウイルス、鶏痘ウイルス(1989年7月5日に印刷されたUK 2,211,504)、アデノウイルス（アデノウイルス２のような）、ウシパピローマウイルス、鳥類サルコーマウイルス、サイトメガロウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス及びシミアンウイルス４０（SV40）のようなウイルスのゲノムから、例えばアクチンプロモーターまたは免疫グロブリンプロモーターといった異種哺乳類プロモーターから、及び熱ショックプロモーターから得られたプロモーターによって、上記プロモーターが宿主細胞系に適合可能であるという条件で制御される。
高等真核生物による所望のＰＲＯ３０１、ＰＲＯ３６２、またはＰＲＯ２４５をコードするＤＮＡの転写は、ベクター内にエンハンサーエレメントを挿入することによって増大される。エンハンサーは、通常約１０から３００ｂｐのＤＮＡのシス機能エレメントであり、転写を増大するためにプロモーター上で機能する。哺乳類遺伝子（グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α−フェトタンパク質及びインスリン）から多くのエンハンサー配列が現在周知である。しかしながら典型的には、真核生物ウイルスから得たエンハンサーが使用されるであろう。例としては、複製起源の後方に位置する（１００−２７０ｂｐ）SV40エンハンサー、サイトメガロウイルス早期プロモーターエンハンサー、複製起源の後方に位置するポリオーマエンハンサー、及びアデノウイルスエンハンサーが含まれる。エンハンサーは、ＰＲＯ３０１、ＰＲＯ３６２、またはＰＲＯ２４５コード配列に対して5'または3'位置でベクター内にスプライシングされるが、好ましくはプロモーターから5'側に位置する。
真核生物宿主細胞（酵母、真菌、昆虫、植物、動物、ヒト、または他の多細胞生物から得た有核細胞）で使用される発現ベクターは、転写の終結のため及びｍＲＮＡの安定化のために必要とされる配列を含む。上記配列は、真核生物またはウイルスまたはｃＤＮＡの5'及び場合により3'非翻訳領域から一般的に入手可能である。これらの領域は、ＰＲＯ３０１、ＰＲＯ３６２、またはＰＲＯ２４５をコードするｍＲＮＡの非翻訳領域中のポリアデニル化断片として転写されるヌクレオチド部分を含む。
組換え脊椎動物細胞培養物中のＰＲＯ３０１、ＰＲＯ３６２、またはＰＲＯ２４５の合成に対する適用のための適したさらに他の方法、ベクター、及び宿主細胞は、Gething等, Nature, 293: 620-625 (1981); Mantei等, Nature, 281: 40-46 (1979); EP 117,060; 及びEP 117,058に記載されている。
ｄ．遺伝子増幅／発現の検出
遺伝子増幅及び／または発現は、ここで提供される配列に基づいて、適切な標識化プローブを使用して、例えば従来のサザンブロッティング、ｍＲＮＡの転写を定量するためのノーザンブロッティング[Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: 5201-5205 (1980)]、ドットブロッティング（ＤＮＡ分析）、またはin situハイブリダイゼーションによって、直接サンプルにおいて測定される。別法として、ＤＮＡ二本鎖、ＲＮＡ二本鎖、及びＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド二本鎖、またはＤＮＡ−タンパク質二本鎖を含む、特異的な二本鎖を認識可能な抗体を使用できる。続いて該抗体は標識され、表面での二本鎖の形成により、二本鎖が表面に結合した場合、アッセイが実施され、二本鎖に結合した抗体の存在が検出される。
別法として、遺伝子発現は、遺伝子生成物の発現を直接定量するために、細胞または組織切片の免疫組織化学的染色のような免疫学的方法及び細胞培養物または体液のアッセイによって測定できる。免疫組織化学的染色及び／またはサンプル液のアッセイに有用な抗体は、モノクローナルまたはポリクローナルの何れでもよく、いずれかの動物において調製される。簡便には、天然配列ＰＲＯ３０１、ＰＲＯ３６２、またはＰＲＯ２４５ポリペプチドに対して、またはここで提供されるＤＮＡ配列に基づく合成ペプチドに対して、またはＰＲＯ３０１、ＰＲＯ３６２、またはＰＲＯ２４５ＤＮＡに融合され、特異的な抗体エピトープをコードする外因性配列に対して、抗体が調製される。
ｅ．ポリペプチドの精製
ＰＲＯ３０１、ＰＲＯ３６２、またはＰＲＯ２４５の形態は、細胞培地または宿主細胞溶解物から回収される。もし膜結合型であれば、それは適切な界面活性剤溶液（例えばｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００）を使用して、または酵素的切断によって膜から放出され得る。ＰＲＯ３０１、ＰＲＯ３６２、またはＰＲＯ２４５の発現において使用される細胞は、凍結溶解サイクリング、ソニケーション、機械的破壊、または細胞溶解試薬のような、各種の物理的または化学的手段によって破壊され得る。
組換え細胞タンパク質またはポリペプチドからＰＲＯ３０１、ＰＲＯ３６２、またはＰＲＯ２４５を精製することが望ましい。以下の方法は、適切な精製法の例示である：イオン交換カラムでの分画；エタノール沈降；逆相クロマトグラフィー；シリカまたはＤＥＡＥのようなカチオン交換樹脂でのクロマトグラフィー；クロマトフォーカシング；ＳＤＳ−ＰＡＧＥ；硫酸アンモニウム沈降；例えばSephadex G-75を使用したゲル濾過；ＩｇＧのような混在物を除去するためのプロテインＡセファロースカラム；及びＰＲＯ３０１、ＰＲＯ３６２、またはＰＲＯ２４５のエピトープタグ化形態を結合するための金属キレートカラム。タンパク質精製の各種の方法が使用され、上記方法は本分野で周知であり、例えばDeutscher, Methods in Enzymology, 182 (1990); Scopes, Protein Purification: Prionciples and Practice, Springer-Verlag, New York (1982)に記載されている。選択された精製工程は、例えば精製法の性質、及び生産される特定のＰＲＯ３０１、ＰＲＯ３６２、またはＰＲＯ２４５に依存するであろう。
２．組織分布
本発明のポリペプチドを発現する組織の位置は、ヒトの種々の組織内で発現しているｍＲＮＡを測定して確認することができる。このような遺伝子の位置により、本発明のポリペプチドの活性を刺激・阻害すると、どの組織が最も影響を受けるのかについての情報が提供される。特定組織において遺伝子が位置することにより、上で議論した活性ブロッキングアッセイ用の組織検体が提供される。
種々の組織での遺伝子発現は、通常のサザンブロット、ノーザンブロットによりｍＲＮＡの転写量を定量することにより（Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci., USA. 77:5201-5205 (1980)）、ドットブロッティング（ＤＮＡ分析）により、又は本願で提供される配列に基づき適切な標識プローブを使用して、in situハイブリダイゼーションにより確認することができる。或いは、抗体を利用して特定の二重鎖（ＤＮＡ二重鎖、ＲＮＡ二重鎖、及びＤＮＡ-ＲＮＡハイブリッド二重鎖、又はＤＮＡ-蛋白質二重鎖を含む）を認識することも可能である。
或いは、種々の組織における遺伝子発現を、例えば組織切片の免疫組織染色や、細胞培養又は体液のアッセイ等の免疫学的方法により測定し、遺伝子生成物の発現を直接的に提供することができる。免疫組織化学的染色、及び／又は液体試料のアッセイに有益な抗体は、モノクローナル又はポリクローナルの何れかとすることができるが、これらは何れかの哺乳類で調製することができる。抗体は都合よくは、本発明のポリペプチドの天然の配列、又は本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡ配列に基づく合成ペプチド、又は本発明のポリペプチドコードするＤＮＡに融合された外来性配列であって特定の抗体エピトープをコードするものに対して調製することができる。抗体を産生するための一般的技術、並びにノーザンブロッティング及びin situハイブリダイゼーション用の特別のプロトコールを、以下に示す。
３．抗体結合試験
本発明のポリペプチドの活性は更に、抗体結合試験により確認することができるが、この試験では抗−ＰＲＯ３０１、抗−ＰＲＯ３６２、抗−ＰＲＯ２４５抗体が、組織細胞上のＰＲＯ３０１ポリペプチド、ＰＲＯ３６２ポリペプチド、又はＰＲＯ２４５ポリペプチドの効果を阻害する能力が試験される。例示の抗体にはポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、二重特異性抗体、及びヘテロ共役抗体が含まれ、これらの調製を以下に示す。
抗体結合試験は、既知の何れかの方法により実施することができるが、例えば競合結合アッセイ、直接的及び間接的サンドイッチアッセイ、免疫沈降アッセイ等がある（Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, pp. 147-158 (CRC Press, Inc., 1987)）。
競合結合アッセイは、標識済の標準物質が、限定された量の抗体と結合する試験分析物と競合する能力に依存している。試験試料標的蛋白質の量は、抗体に結合する標準物質の量と反比例する。結合する標準物質の量の測定を容易にするため、抗体は好ましくは競合前又は競合後に不溶化されて、抗体に結合した標準物質と分析物とが未結合のままの標準物質及び分析物から容易に分離できるようにする。
サンドイッチアッセイは二つの抗体を使用するが、それぞれは検出する蛋白質の異なる免疫原部分又はエピトープに結合することができる。サンドイッチアッセイにおいては、試験分析物は、固体支持体上に固定化された第一抗体により結合され、その後、第二抗体が当該分析物に結合して不溶性の三部複合体を形成する。例えば米国特許第４，３７６，１１０号を参照されたい。第二抗体自身は、検出可能な部分で標識することもでき（直接的サンイッチアッセイ）、又は検出可能な部分で標識された抗−免疫グロブリン抗体を使用して測定することもできる（間接的サンドイッチアッセイ）。例えば、サンドイッチアッセイの一つのタイプは、ＥＬＩＳＡアッセイであるが、この場合には、検出可能な部分は酵素である。
免疫組織化学法の場合、組織試料は新鮮なもの、または凍結されたもの、或いはパラフィン中に包埋されて、ホルマリン等の保存料で固定化されているものとすることができる。
４．細胞ベースアッセイ
免疫関連疾患用の動物モデル及び細胞ベースアッセイを使用して更に、本願で同定された遺伝子とポリペプチドとの関係、そして免疫関連疾患の発生と病因を理解することができる。
別の方法においては、特定の免疫関連疾患に関与することが既知の細胞タイプの細胞を、本願に記載するｃＤＮＡで形質移入し、そのｃＤＮＡが免疫機能を刺激、又は阻害する能力を分析している。適切な細胞を所望の遺伝子で形質移入して、免疫機能の活性をモニターすることができる。このような形質移入された細胞株を使用して更に、ポリ−若しくはモノクローナル抗体、又は抗体組成物が免疫機能を阻害又は刺激する能力を試験することが可能であり、例えばＴ細胞の増殖や炎症性の細胞浸潤を調節することができる。本願で同定された遺伝子のコード配列で形質移入された細胞を更に使用して、免疫関連疾患の治療用の薬剤候補を同定することが可能である。
更に、トランスジェニック動物（以下に記載）由来の初代培養を本願の細胞ベースアッセイに使用することも可能であるが、もっとも安定な細胞株が好ましい。トランスジェニック動物から持続性の細胞株を誘導する技術は、当該技術分野において周知である（例えば、Small et al., Mol. Cell. Biol., 5, 642-648 (1985)）。
適切な細胞ベースアッセイの一つは、混合リンパ球反応（ＭＬＲ）である（Current Protocols in Immunology, unit 3.12;編：J E Coligan, A M Kruisbeek, D H Marglies, E M Shevach, W Strober, National Institute of Health, Published by John Wiley & Sons, Inc.）。このアッセイにおいては、試験化合物が活性化Ｔ細胞の増殖を刺激する能力がアッセイされる。キラーＴ細胞（responder T cell）の懸濁物をアロジェニック刺激細胞とともに培養し、Ｔ細胞の増殖をトリチウム化したチミジンの摂取により測定する。多くのＴ細胞は、活性化されるとＩＬ-２に応答し、ＩＬ-２を産生するので、このアッセイにおける応答性の差異は一部には、応答性細胞のＩＬ-２産生の差異を反映している。ＭＬＲの結果は、標準的なリンホカイン（ＩＬ-２）検出アッセイにより確認することができる（Curent Protocols in Immunology; 上記 3.15, 6.3）。
増殖性のＴ細胞のＭＬＲアッセイにおける応答は、有糸***促進性応答によるものか、又は当該Ｔ細胞による刺激応答によるものであるかもしれない。本発明のポリペプチドのＴ細胞刺激活性を更なる確認は、共刺激アッセイにより得ることができる。Ｔ細胞活性化には、抗原特異的シグナルであって主要組織適合複合体により介在されるものと、第二のリガンドの結合性相互作用、例えばＢ７（ＣＤ８０、ＣＤ８６）／ＣＤ２８結合性相互作用により介在される共刺激性シグナルとが必要である。ＣＤ２８の架橋により、活性化Ｔ細胞により分泌されるリンホカインが増大する。Ｔ細胞活性化には、陰性又は陽性の効果を有するリガンドの結合による陰性及び陽性の対照の双方がある。ＣＤ２８及びＣＴＬＡ−４は、Ｂ７に結合するＩｇスーパーファミリーの関連糖蛋白質である。ＣＤ２８のＢ７への結合は、Ｔ細胞活性化の陽性の共刺激効果があるが、逆に、Ｂ７へのＣＴＬＡ-４結合には陰性のＴ細胞不活化効果がある（Chambers, C.A. and Allison, J.P., Curr. Opin. Immunol. (1997)9:396; Schwartz, R. H., Cell (1992) 71:1065; Linsey, P.S. and Ledbetter, J.A., Annu. Rev. Immunol. (1993) 11:191; June, C.H. et al., Immunol. today, (1994) 15:321; Jenkins, M. K., Immunity (1994) 1:405）。共刺激アッセイにおいては、本発明のポリペプチドをＴ細胞共刺激又は阻害活性についてアッセイする。
本発明のポリペプチドは、本発明の他の化合物と同様にＭＬＲ及び共刺激アッセイ等により決定されるようにＴ細胞増殖の刺激剤（共刺激剤）であるが、これらは免疫機能が乏しいか、最適以下であるか、又は不適切である免疫関連疾患を治療するのに有益である。これらの疾患は、Ｔ細胞（及びＴ細胞介在性免疫）の増殖及び活性化を刺激し、哺乳類において例えば本発明のポリペプチド等の刺激性化合物を投与して免疫応答を促進することにより治療される。刺激性ポリペプチドは、ＰＲＯ３０１、ＰＲＯ３６２や、ＰＲＯ２４５のポリペプチド、又はこれらのアゴニスト抗体とすることができる。以下に詳細に記載される、腫瘍の治療のための免疫アジュバント治療は、本発明の刺激性化合物の使用の一例である。阻害性ポリペプチドに結合する抗体は、阻害性ポリペプチドの阻害効果を除去することにより免疫応答を促進するように機能する。この効果は、おそらくはＣＴＬＡ-４結合により引き起こされる阻害シグナルを除去することによりＴ細胞増殖を促進する、抗−ＣＴＬＡ-４抗体を使用した実験において見られる（Walunas, T. L. et al., Immunity (1994)1:405）。この使用は、４-１ＢＢ糖タンパク質（初回抗原刺激済のＴ細胞上に発現しているリガンド（４-１ＢＢＬ）に結合し、Ｔ細胞活性化及び増殖のシグナルを送る、４-１ＢＢ糖タンパク質腫瘍壊死因子受容体ファミリーのメンバー）での実験においても確認されている（Alderson, M.E. et al., J. Immunol. (1994) 24:2219）。抗−４-１抗体での処置による４-１ＢＢ結合の阻止により、移植片対宿主疾患の厳密度が増加し、腫瘍を根絶するのに使用することができる（Hellstrom, I., and Hellstrm, K. E. Crit. Rev. Immunol. (1998) 18:1）。
他方では、本発明のポリペプチドは本発明の他の化合物と同様に、Ｔ細胞増殖／活性化、及び／又はリンホカイン分泌の阻害剤であるが、これらを直接的に抑制して免疫応答を抑制することができる。これらの化合物は、免疫応答の度合いを低減し、過敏反応性、最適以上の、又は自己免疫性の応答性により特徴付けられる免疫関連疾患を治療するのに有益である。或いは、本発明の刺激性ポリペプチドに結合し、これらの分子の刺激効果を阻害する抗体を使用して、Ｔ細胞増殖／活性化、及び／又はリンホカイン分泌を阻害することにより、Ｔ細胞介在性の免疫応答を抑制することができる。当該ポリペプチドの刺激効果を阻止すると、哺乳類の免疫応答が抑制される。
５．動物モデル
細胞ベースの試験管内アッセイの結果は更に、Ｔ細胞機能用の生体内動物モデル及びアッセイを使用して確認することができる。種々の周知の動物モデルを使用して更に、本願で同定された遺伝子の、免疫関連疾患の発生及び病因における役割を理解することができ、また、抗体や天然のポリペプチドのアンタゴニストを含む、治療剤の候補の効能を試験することもできる。このようなモデルの生体内の性質により、ヒトの患者における応答の予想となる。免疫関連疾患の動物モデルには、非組換及び組換（トランスジェニック）の動物の双方が含まれる。非組換動物モデルには例えば、マウスのモデルが含まれる。このようなモデルは、標準的な技術、例えば皮下接種、尾部静脈接種、脾臓移植、腹腔内移植、腎臓被膜（renal capsule）下の移植等により同系のマウスに細胞を導入することにより作製することができる。
接触過敏症は、細胞介在免疫機能の単純な生体内アッセイである。この方法においては、表皮細胞を外来性のハプテンであって、定量測定される遅延型の過敏反応を生じるものに露出する。接触過敏症は、初期的な感作期と、その後の惹起期が関与する。惹起期は、以前に接触した抗原に表皮細胞が出くわすと起こる。腫脹と炎症とが起こるが、これはヒトのアレルギー性接触皮膚炎の良好なモデルとなる。適切な方法の詳細は、Current Protocols in Immunology, Eds. J.E.Cologan, A.M.Kruinbeek, D.H.Margulies, E.M. Shevach and W. Strober, John Wiley & Sons, Inc. 1994, unit 4.2に記載されている（Grabbe, S. and Schwarz T. Immunol. Today, 19(1):37-44 (1998)も参照されたし）。
移植片対宿主疾患は、免疫的確細胞が免疫的に抑制された又は寛容な患者に移植された時に起こる。ドナー細胞は宿主抗原を認識して反応する。この反応は、生命に危険を与えるほどの重度の炎症から、下痢や体重減少の中程度の場合まで変化する。移植片対宿主疾患のモデルは、ＭＨＣ抗原及びマイナー移植抗原に対するＴ細胞反応性を調べる手段を提供する。適切な方法が、Current Protocols in Immunology、上記、unit 4.3に詳細に記載されている。
皮膚の同種異系移植の拒絶の動物モデルは、抗−ウイルス及び抗−腫瘍免疫の指標及びこれらにおける役割の尺度である、Ｔ細胞の生体体内組織破壊能力を調べる手段である。最も普通の許容されているモデルでは、マウスの尾部の皮膚移植片を使用する。反復した実験によれば、皮膚の同種異系移植の拒絶は、抗体ではなくて、Ｔ細胞、ヘルパーＴ細胞、及びキラーエフェクター細胞により介在されることが示されている（Auchincloss,H. Jr. and Sachs, D.H., Fundamental Immunology, 2md Ed., W.E. Paul Ed., Raven Press NY, 1989, 889-992）。適切な方法が上記のCurrent Protocols in Immunology unit 4.4に詳細に記載されている。他の移植片拒絶モデルであって本発明の化合物を試験するのに使用することが可能なものには、同種異系心臓移植片モデルがある（Tanabe et al., Transplantation (1994)58:23; Tinubu S.A. et al., J. Immunol. (1994) 4330-4338）。
遅延型の過敏症の動物モデルにより、細胞介在性免疫機能のアッセイもが提供される。遅延型過敏症反応は、Ｔ細胞介在性の生体内免疫反応であって、抗原での免疫性試験の後に一定期間が経過して初めてピークに達する炎症により特徴付けられるものである。この反応はまた、組織特異的な自己免疫疾患、例えば多発性硬化症（MS）や、実験的自己免疫脳脊髄炎（EAE、MSのモデルである）において起こる。適切な方法が、上記のCurrent Protocols in Immunology unit 4.5に詳細に記載されている。
EAEは、Ｔ細胞介在性の自己免疫疾患であって、Ｔ細胞及び単核球の炎症、その後の中枢神経系の軸策の脱髄により特徴付けられるものである。EAEは一般にはヒトのMSに相当する動物モデルであると考えられている（Bolton, C., Multiple Sclerosis (1995)1:143）。急性及び回帰性-弛張性の両方のモデルが開発されている。本発明の化合物は、上記のCurrent Protocols in Immunology, unit 15.1, 15.2に記載されるプロトコールを使用して、免疫介在性脱髄疾患に対するＴ細胞の刺激性又は阻害性活性について試験することができる。Duncan, I.D. et al., Molec. Med. Today (1887) 554-561に記載されるように、稀突起神経膠細胞又はシュヴァン細胞が中枢神経系に移植されるミエリン病のモデルも参照されたし。
関節炎の動物モデルは、コラーゲン誘導性関節炎である。このモデルは、ヒトの自己免疫性リウマチ性関節炎についての、臨床的、組織学的、及び免疫学的特徴を有し、ヒトの自己免疫性関節炎についての許容されたモデルである。マウス及びラットのモデルは、滑膜炎、軟骨及び肋軟骨下の骨の侵食により特徴付けられる。本発明の化合物は、上記のCurrent Protocols in Immunology, unit 15.5に記載のプロトコールを使用して、自己免疫性関節炎に対する活性について試験することができる。Issekutz, A.C. et al., Immunology (1996)88:569に記載されるようにCD１８及びVLA-４に対するモノクローナル抗体を使用したモデルについても参照されたし。
喘息のモデルが記載されているが、このモデルにおいては、動物を卵白アルブミンで感作し、次にエアゾルでデリバリーした同じ蛋白質によりチャレンジすることによって、抗原誘導性の、気道過剰反応、肺好酸球増加症、及び炎症が誘導される。いくつかの動物モデル（モルモット、ラット、ヒト以外の霊長類）では、エアロゾルの抗原でチャレンジすると、ヒトのアトピー性喘息に似た症状が起こる。マウスのモデルには、ヒトの喘息の特徴の多くがある。本発明の化合物を、喘息の治療における活性と有効性について試験する適切な方法が、Wolyniec, W.W. et al., Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. (1998)18:777、及びその中の引用文献に記載されている。
更に、本発明の化合物は、乾癬様疾患の動物モデルで試験することができる。Ｔ細胞が乾癬の病因であることを示唆する証拠がある。本発明の化合物は、Schon,M.P. et al., Nat. Med. (1997)3:183に記載されるscid/scidマウスモデルで試験することができるが、このモデルではマウスが乾癬に似た、組織病理学的皮膚病変を示す。Nickoloff, B.J. et al., Am. J. Path. (1995)146:580に記載されるようにして調製した、ヒトの皮膚/scidマウスキメラは、別の適切なモデルである。
組換え（トランスジェニック）動物モデルは、本願で同定された遺伝子のコード部分を興味ある動物のゲノムへ、トランスジェニック動物作製の標準的な技術により導入することによって、作り出すことができる。トランスジェニック操作の標的となる動物には、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ヒト以外の霊長類（ヒヒ、チンパンジー、サル等）が含まれるが、これらには限定されない。導入遺伝子をこのような動物に導入する当該技術分野で既知の技術には、前核マイクロインジェクション（pronucleic injection）(Hoppe and Wanger, U.S. Pantent No. 4,873,191)；生殖細胞系へのレトロウイルス介在性遺伝子トランスファー（Van der Putten et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 6148-615(1985)等）；胚性肝細胞での遺伝子ターゲティング（Thompson et al., Cell 56, 313-321 (1989）；胚のエレクトロポレーション（Lo, Mol. Cel. Biol. 3,1803-1814 (1983)）；***介在性遺伝子トランスファー（Lavitrano et al., Cell 57, 717-73 (1983)）が含まれる。再考のために、例えば米国特許第4,736,866号を参照。
本発明の目的の場合、トランスジェニック動物にはその細胞の一部のみにおいて導入遺伝子を有するもの（モザイク動物）が含まれる。導入遺伝子は、単一の導入遺伝子として、又はコンカテマー（ヘッド-ヘッド、又はヘッド-テール配列など）として組み込むことができる。特定の細胞種に対する導入遺伝子の選択的導入は、例えば、Lasko et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 623-636 (1992)の技術により可能である。
トランスジェニック動物における導入遺伝子の発現は、標準的な技術によりモニターすることができる。例えば、サザンブロット分析又はＰＣＲ増幅を使用して、導入遺伝子の組み込みを確認することができる。ｍＲＮＡ発現のレベルは、in situハイブリダイゼーション、ノーザンブロット分析、ＰＣＲ、免疫細胞学などの技術を使用して分析することができる。
動物は更に、免疫疾患病理の兆候について調べることができるが、例えば組織学的検査により免疫細胞が特定の組織に浸潤しているかを確認することができる。阻害実験も行うことができるが、その実験ではトランスジェニック動物を本発明の化合物で処置して、当該化合物によるＴ細胞増殖の刺激又は阻害の度合いを確認する。このような実験においては、本発明のポリペプチドに結合する阻害抗体であって、上記のように調製したものを、当該動物へ投与して、免疫機能への効果を調べる。
あるいは、当該ポリペプチドがコードされる内在性遺伝子と、動物の胚細胞へ導入された、同じポリペプチドをコードする改変済ゲノムＤＮＡとの間の相同組換により、本願で同定された遺伝子を欠失するか改変された「ノックアウト」動物を構築する。例えば、特定のポリペプチドをコードするｃＤＮＡを使用して、確立された技術により当該ポリペプチドをコードするゲノムＤＮＡをクローン化する。特定のポリペプチドをコードするゲノムＤＮＡの一部を欠失するか他の遺伝子、例えば組み込みをモニターするのに使用することが可能な選択マーカーをコードする遺伝子で置換することができる。典型的には、数キロベースの変化させていないフランキングＤＮＡ（５’末端及び３’末端の両方）をベクター中に含める（Thomas and Capecchi, Cell, 51:503 (1987)(相同組換ベクターの記載)）。ベクターを（エレクトロポレーション等により）胚幹細胞株に導入し、導入したＤＮＡが内在性DNAと相同性組換している細胞を選択する（Li et al., Cell, 69:915(1992)）。選択した細胞を次に、動物（マウスやラット）の胚盤胞に注入して、凝集キメラ（aggregation chimeras）を作成する（Bradley, Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach, E. J. Robertson, ed. (IRL, Oxford, 1987), pp.113-152）。次いでキメラの胚を適切な擬似妊娠したメスの代理動物（foster animal）に移植し、当該胚を「ノックアウト」動物が作り出される時期まで育てる。生殖細胞内において相同組換したＤＮＡを有する子孫を、標準的な技術により同定して、全ての細胞が相同組換したＤＮＡを有している動物を飼育することができる。ノックアウト動物は例えば、ある種の病因的状態に対する防御能力により、及び当該ポリペプチドの欠失により病因的状態になることで特徴付けることができる。
６．免疫アジュバント治療
一の態様においては、本発明の化合物で免疫刺激効果を有するものを、腫瘍（癌）の治療のために免疫アジュバント治療に使用することができる。Ｔ細胞が、ヒトの腫瘍特異性抗原を認識するということは、現在十分に確立されている。腫瘍抗原のうちの一つのグループで、MAGE.BAGE及びGAGEの遺伝子ファミリーによりコードされるものは、全ての成人の清浄な組織中においてサイレントであるが、メラノーマ、肺腫瘍、頭部及び首の腫瘍や、膀胱癌などの腫瘍内においてはかなりの量で発現している（DeSmet.C et al., (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93:7149）。Ｔ細胞を共刺激すると、腫瘍の後退及び抗-腫瘍性反応が、試験管内及び生体内の両方により誘導されることが示されている（Melero, I. et al., Nature Medicine (1997) 3:682;Kwon, E.D. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1997)94:8099; Lynch, D.H. et al., Nature Medicine(1997)3:625;Finn, O.J. and Lotze, M.T., J. Immunol. (1998)21:114）。本発明の刺激性化合物は、アジュバントとして単独で、又は成長制御剤、細胞毒性剤、又は化学治療剤とともに投与して、Ｔ細胞増殖/活性化、及び腫瘍抗原に対する抗-腫瘍反応を刺激することができる。成長制御剤、細胞毒性剤、又は化学治療剤は、既知の投与養生法を使用して通常の量で投与することができる。本発明の化合物の免疫刺激活性により、成長制御剤、細胞毒性剤、又は化学療法剤の労を減らし、それによって患者への毒性を低減することが潜在的に可能である。
癌は、正常組織に由来する、正常な、又は新生物形成性の細胞であって、増殖して腫瘍塊を形成するものの数の増大、これらの新生物形成性腫瘍細胞による周辺組織の侵食、及び最終的には血液系又はリンパ系により局部的なリンパ節または（転移の場合には）隔離した部位へと伝播される悪性細胞の生成により特徴付けられる。癌の状態においては、細胞は正常細胞が増殖しないような条件下で増殖する。癌は、種々の形態で現れるが、侵食及び凝集の異なる度合いにより特徴付けられる。
遺伝子発現の変化は、癌に共通の性質である、制御されない細胞増殖及び脱分化（de-differentiation）に密接に関連している。良く研究されたある種の腫瘍のゲノムでは、劣性遺伝子の発現が減少していることが示されているが、これを通常は腫瘍抑制遺伝子と呼ぶが、これは正常ならば悪性細胞の増殖、及び/又はある種の優性遺伝子、例えば癌遺伝子で悪性の増殖を促進するものの過剰発現を防止するものである。これらの遺伝的変化のそれぞれは、集合すると完全な新生物形成性の表現型を表すものとなる特徴のいくつかを導入する原因となるものであることが分かっている（Hunter, Cell 64:1129(1991); Bishop, Cell 64:235-248(1991)）。
癌における、（癌遺伝子などの）遺伝子の過剰発現の周知のメカニズムは、遺伝子増幅である。これは先祖の細胞の染色体において、特定遺伝子の多重コピーが産生されるプロセスである。このプロセスには、当該遺伝子を備えた染色体部位が不定期に複製されて、その複製された部分が組換により染色体へ戻ることが関与する（Alitalo et al.,Adv. Cancer Res. 47,235-281(1986)）。遺伝子過剰発現は、遺伝子増幅と並行すると考えられているが、即ちこれは作成されるコピー数に比例する。
前癌遺伝子で増殖因子及び増殖因子受容体をコードするものが、ヒトの種々の悪性腫瘍（乳癌）の病原性において重要な役割を演じることが判明している。例えば、ヒトのErbB2遺伝子（erbB2、her２、又はc-erbB-2としても知られる）は、１８５-ｋｂの経膜糖タンパク質受容体（ｐ１８５HER2、HER2）をコードするが、これは表皮増殖因子受容体（EGFR）に関連していて、ヒトの乳癌の約２５％乃至３０％で過剰発現していることが判明している（Slamon et al., Science 235:177-182(1987); Slamon et al., Science 244:707-712 (1989)）。
原癌遺伝子の遺伝子増幅は、典型的には癌についてのより悪性の形態において関与する出来事であり、臨床上の結果の予想となり得るものであると報告されている（Schwab et al., Genes Chromosomes Cancer 1, 181-193(1990); Alitalo et al.,上記）。従って、erbB2の過剰発現は通常は、劣っている予後を予測するものであり、初期の疾患が腋窩リンパ節に関わるものである患者においては特にそうであり（Slamon et al., (1987)(1989)、上記；Ravdin and Chamness, Gene 159:19-27 (1995); Hynes and Stern, Biochim Biophys Acta 1198:165-184(1994)）、またホルモン治療及び化学療法的養生法（CMF(シクロホスファミド、メトトレキセート、及びフルオロウラシル)、及びアントラサイクリンを含む）に対する感受性及び/又は抵抗性に関連している（Baselga et al., Oncology 11(3 Suppl 1):43-48 (1997)）。しかしながら、erbB2の過剰発現が劣った予後と関連するにも関わらず、タクサンでの治療に対して臨床的に応答するHER-2陽性患者の異常性は、HER-2陰性患者（同）のものよりも三倍大きかった。ヒト化した組換体の抗-ErbB2（抗-HER2）モノクローナル抗体（マウスの抗-ErbB2抗体４D5をヒト化したもの、rhuMab又はHerceptin７と呼ぶ）は、ErbB2過剰発現性の転移乳癌の患者であって、以前に抗癌治療を徹底的に受けていたものにおいて、臨床的に活性であった（Baselga et al., J. Clin. Oncol. 14:737-744 (1996)）。
７．薬剤候補用のスクリーニングアッセイ
薬剤候補用のスクリーニングアッセイは、本願で同定された遺伝子によりコードされているポリペプチド又は生物学的に活性なその断片と結合又は複合体形成するか、或いは当該コードされるポリペプチドと他の細胞性蛋白質との相互作用を阻害する化合物を同定するようにして設計した。このようなスクリーニングアッセイには、化学的ライブラリーの高スループットスクリーニングにかけることができるアッセイが含まれるであろうが、これは小分子薬剤候補の同定に特に適する。考慮する小分子には、合成の、有機又は無機の化合物が含まれ、これにはペプチド、特に可溶性ペプチド、（ポリ）ペプチド−免疫グロブリン融合物、特には抗体（ポリ−又はモノクローナル抗体及び抗体断片、単一鎖抗体、抗-イディオタイプ抗体、及びこのような抗体若しくは断片のキメラ又はヒト化抗体が含まれるがこれらには限定されない）、並びにヒト抗体及び抗体断片が含まれる。アッセイは、種々の形式で行うことができるが、これには蛋白質−蛋白質結合アッセイ、生化学的スクリーニングアッセイ、免疫アッセイ、及び細胞ベースアッセイが含まれ、これらは当該技術分野でその特徴がよく知られているものである。
全てのアッセイは、薬剤候補を本願で同定した核酸によりコードされるポリペプチドに、当該二つの成分が相互作用するのに十分な条件及び時間、接触させることを要求するという点において共通する。
結合アッセイにおいては、相互作用は結合であり、形成される複合体は、単離され又は反応混合物中で検出することができる。特定態様においては、本願で同定された遺伝子によりコードされるポリペプチド、又は薬剤候補を固相、例えばマイクロタイタープレートに、共有結合又は非共有結合で固定化する。非共有結合は一般に、固体表面を、当該ポリペプチドの溶液でコートして乾燥することにより達成される。或いは、固定化するポリペプチドに特異的な固定化抗体、例えばモノクローナル抗体を使用して固体表面にそれを固定化することができる。このアッセイは、非固定化成分であって、検出可能な標識で標識しうるものを、固定化成分、例えば固定化された成分を含むコート済表面に添加することにより行う。反応が完了したら、反応しなかった成分を例えば洗浄により除去し、固体表面に固定された複合体を検出する。元々固定化されなかった成分が検出可能な標識を有する場合、表面に固定化された標識が検出されることは複合体形成がおこったことを意味する。元々固定化されなかった成分が標識を有さない場合は、複合体形成は、例えば標識済抗体で固定化された複合体に特異的に結合するものを使用して検出することができる。
候補の化合物が本願で同定された遺伝子によりコードされる特定の蛋白質と相互作用するが結合しない場合、当該蛋白質との相互作用は、蛋白質−蛋白質相互作用を検出するのによく知られた方法によりアッセイすることができる。このようなアッセイには、伝統的な方法、例えば架橋、共免疫沈降、及び勾配又はクロマトグラフィーカラムでの共精製が含まれる。更に蛋白質−蛋白質相互作用は、 Fieldsらの酵母ベースの遺伝系（Fields and Song, Nature (London) 340, 245-246 (1989)；Chien et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 9578-9582 (1991)）を、Chevray and Nathanes（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 5789-5793 (1991)）が開示したようにして使用することによりモニターすることができる。多くの転写活性因子、たとえは酵母のＧＡＬ４は、２つの物理的に別個の調節領域からなるが、その一はＤＮＡ結合領域として作用し、もう一方は転写活性領域として作用する。上記の刊行物に記載される酵母発現系（一般には「２−ハイブリッド系」と呼ばれる）は、この性質を有効利用していて、二つのハイブリッド蛋白質を使用しているが、一方はその中で標的蛋白質がＧＡＬ４のＤＮＡ結合領域に融合していて、もう一方は、その中で候補の活性蛋白質が活性領域に融合している。ＧＡＬ１−ｌａｃＺレポーター遺伝子のＧＡＬ４活性化プロモーターの制御下での発現は、蛋白質−蛋白質相互作用によるＧＡＬ４活性の再構築に依存する。相互作用するポリペプチドを含むコロニーは、β−ガラクトシドの色素産生性基質で検出される。２−ハイブリッド技術を使用して二つの特定の蛋白質間での蛋白質−蛋白質相互作用を同定するための完全なキット（MATCHMAKER（商標））は、Clonetechより商業的に入手可能である。この系はまた、特定の蛋白質相互作用に関与する蛋白質領域をマッピングするため、並びにその相互作用に重要なアミノ酸残基を正確に同定するためにも利用することができる。
本願で同定された遺伝子と他の細胞内若しくは細胞外成分との相互作用の阻害を試験することができる化合物を発見するため、反応混合物は通常、遺伝子産物及び細胞内若しくは細胞外成分を、当該二つの産物の相互作用及び結合をするのに十分な条件及び時間で含むようにして調製される。試験化合物の結合阻害能を試験するため、反応は試験化合物の存在下又は非存在下で行う。更に偽薬を第三の反応物へ添加して陽性対照としてもよい。試験化合物と、混合物中に存在する細胞内若しくは細胞外成分との結合（複合体形成）は、上記したようにしてモニターする。試験化合物を含む反応混合物中ではなく、対照反応中での複合体の形成は、試験化合物は試験化合物とその反応パートナーとの相互作用を阻害することを意味する。
８．免疫関連疾患の治療用の組成物及び方法
免疫関連疾患の治療に有益な組成物には、抗体、有機又は無機の小分子、ペプチド、リンペプチド（phosphopeputide）、アンチセンス分子及びリボザイム分子、三重らせん分子等の、免疫機能（Ｔ細胞の増殖／活性化、リホカインの放出、又は免疫細胞浸潤等）を阻害若しくは刺激するものが含まれるがこれらには限定されない。
例えばアンチセンスＲＮＡ及びＲＮＡ分子は、標的ｍＲＮＡにハイブリダイズして蛋白質の翻訳を阻害することにより、ｍＲＮＡの翻訳を直接ブロックするようにして作用する。アンチセンスＤＮＡを使用する場合、翻訳開始部位、例えば標的遺伝子ヌクレオチド配列の約−１０位と約＋１０位との間から由来するオリゴデオキシリボヌクレオチドが好ましい。
リボザイムは、ＲＮＡの特定の開裂を触媒することが可能な酵素性ＲＮＡ分子である。リボザイムは、相補的な標的ＲＮＡへの配列特異的なハイブリダイゼーションの後、エンドヌクレアーゼ的開裂を行う。潜在的なＲＮＡ標的内の特定のリボザイム開裂部位は、既知の技術により同定することができる。詳細は、Rossi. Current Biology 4, 469-471 (1994)、及びPCT公報WO 97/33551（１９９７年９月１８日発行）を参照されたし。
転写を阻害するのに使用する三重らせんの形態をとる核酸分子は、単一鎖であり、またデオキシヌクレオチドからなるものとすべきである。これらのオリゴヌクレオチドの塩基組成は、Hoogsteenの塩基対規則により三重らせんの形成が促進されるようにして設計されるが、これには一般に二本鎖の一方の鎖上にかなりの大きさのプリン又はピリミジンのストレッチが必要である。詳細は、上記のＰＣＴ公報ＷＯ97/33551を参照されたし。
これらの分子は、上記で議論した何れかのスクリーニングアッセイ又はこれらの何れかの組み合わせ、及び／又は当該技術分野で周知の他のスクリーニング技術により同定することができる。
９．抗体
本発明による薬剤候補のなかで最も有望なものは、Ｔ細胞増殖やリンパ球浸潤を阻害する（アンタゴニスト）か、又は刺激する（アゴニスト）、抗体又は抗体断片である。具体的な抗体には、ポリクローナル、モノクローナル、ヒト化、二重特異性、及びヘテロ共役性の抗体が含まれる。
ａ．ポリクローナル抗体
ポリクローナル抗体を調製する方法は、当業者には既知である。ポリクローナル抗体は、哺乳類で作製することができるが、例えば免疫剤を一回以上接種し、必要ならばアジュバントを使用する。典型的には、免疫剤及び／又はアジュバントは、皮下接種又は腹腔内接種を複数回行って哺乳類に接種する。免疫剤には、本発明のＰＲＯ３０１、ＰＲＯ３６２、又はＰＲＯ２４５ポリペプチド又はその融合蛋白質を含ませることができる。免疫剤を、免疫される哺乳類中で免疫原性であることが既知の蛋白質に共役させることは有益であろう。このような免疫原性蛋白質の例には、キーホールリンペットヘモシアニン、血清アルブミン、ウシチログロブリン、ダイズトリプシン阻害因子が含まれるがこれらには限定されない。使用することができるアジュバントの例には、フロイトの完全アジュバント、及びＭＰＬ−ＴＤＭアジュバント（モノホスホリル脂質Ａ、合成トレハロースジコリノミコレート（trehalose dicorynomycolate））が含まれる。免疫接種のプロトコールは、当業者が過度な実験を行うことなく選択することができる。
b．モノクローナル抗体
本発明のポリペプチドを認識して結合するか、又はそれに対してアンタゴニストとして作用する抗体は、モノクローナル抗体とすることができる。モノクローナル抗体はハイブリドーマ法、例えばKohler and Milstein, Nature 256:495 (1975) に記載される方法等により調製することができる。ハイブリドーマ法では、典型的にはマウス、ハムスター、又は他の適当な宿主動物を、免疫剤で免疫接種して、免疫剤に対して特異的に結合する抗体を産生するか、又は産生することが可能なリンパ球を惹起する。或いは、リンパ球は試験管内で免疫接種することもできる。
免疫剤は典型的には、本発明のＰＲＯ３０１、ＰＲＯ３６２、またはＰＲＯ２４５ポリペプチド、その抗原性断片又は融合蛋白質が含まれる。一般に、ヒト起源の細胞が望まれる場合には末梢血リンパ球（「ＰＢＬ」）が、ヒト以外の哺乳類起源のものが望まれる場合には脾臓細胞又はリンパ節細胞が使用される。次いでリンパ球を不朽化した細胞株に、例えばポリエチレングリコール等の適切な融合剤を使用して融合させて、ハイブリドーマ細胞を作製する（Goding, Monoclonal Antibodies:Principle and Practice, Academic Press, (1986) pp. 59-103）。不朽化した細胞株は通常、形質転換された哺乳類細胞であり、特には齧歯類、ウシ若しくはヒト起源のミエローマ細胞である。通常は、ラット又はマウスのミエローマ細胞株が使用される。ハイブリドーマ細胞は好ましくは、融合しなかった不朽化細胞の増殖又は生存を阻害する一以上の物質を含んだ適切な培地中で培養することができる。例えば、親の細胞は酵素ヒポキサンチン・グアニン・ホスホリボシル・トランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴ又はＨＰＲＴ）を欠失する場合、ハイブリドーマ用の培地は典型的にはヒポキサンチン、アミノプテリン、及びチミジンを含むが（「ＨＡＴ培地」）、これらの物質はＨＧＰＲＴ欠失細胞の増殖を妨げる。
好ましい不朽化細胞株は、効率良く誘導し、選択された抗体産生細胞による安定な高レベルの抗体発現を支持し、ＨＡＴ培地等の培地に感受性があるものである。より好ましい不朽化細胞株はマウスのミエローマ株であるが、これは例えばCalifornia州San DiegoのSalk Institute Cell Distribution Centerや、Maryland州RockvilleのAmerical Type Culture Collectionから入手することができる。ヒトのミエローマ及びマウス−ヒトヘテロミエローマ細胞株もまた、ヒトのモノクローナル抗体の産生用に記載されている（Kozbor, J. Immunol., 133:3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Application, Marcel Dekker, Inc., New York, (1987) pp. 51-63）。
次に、ハイブリドーマ細胞を培養する培地をアッセイして、本発明のポリペプチド又は本発明のポリペプチドと同等の活性を有するものに対するモノクローナル抗体の存在を調べた。好ましくは、ハイブリドーマ細胞により産生されたモノクローナル抗体の結合特異性は、免疫沈降法又は試験管内結合アッセイ、例えばラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）や、酵素結合免疫吸着検査法（ＥＬＩＳＡ）により調べる。このような技術及びアッセイは、当該技術分野において既知である。モノクローナル抗体の結合親和性は例えばスキャッチャード分析（Munson and Polland, Anal. Biochem., 107:220 (1980)）により調べることができる。
所望のハイブリドーマ細胞が同定された後は、当該クローンを限界希釈法によりサブクローニングし、標準的な方法で増殖させる（Goding,上記）。このための適切な培地には、例えばダルベッコ修正イーグル培地やＲＰＭＩ−１６４０培地が含まれる。或いは、ハイブリドーマ細胞は哺乳類中で腹水として生体内増殖させてもよい。
当該サブクローンにより分泌されるモノクローナル抗体は、例えばプロテイン−Ａセファロース、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、又はアフィニティークロマトグラフィー等の通常の免疫グロブリン精製法により、培地又は腹水から単離又は精製することができる。
モノクローナル抗体はまた、米国特許第４，８１６，５６７号に記載されるもの等の組換ＤＮＡ法によっても作製することができる。本発明のモノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、通常の方法（例えばマウスの抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に対して特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブ）により容易に単離されて配列決定することができる。本発明のハイブリドーマ細胞は、このようなＤＮＡの好ましい供給源となる。一旦単離されると、このＤＮＡは発現ベクターへ挿入することができるが、次いでこれをサルのＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞や、さもなくば免疫グロブリン蛋白質を産生しないミエローマ細胞等の宿主細胞へ形質転換し、組換宿主細胞内でモノクローナル抗体の合成を行う。このＤＮＡはまた、例えばヒトの重鎖及び軽鎖の定常領域のコード配列により、対応したマウスの配列を置き換えるか（米国特許第４，８１６，５６７号；Morrison et al., 上記）、免疫グロブリンのコード配列に対して免役グロブリンでないポリペプチドのコード配列の全部若しくは一部を共有結合させることにより修飾することもできる。このような免疫グロブリン以外のポリペプチドで、本発明の抗体の定常領域を置換するか、または本発明の抗体の一の抗原結合部位の可変領域を置換して、キメラの二価の抗体を作り出すことができる。
抗体は好ましくは一価の抗体である。一価の抗体を調製する方法は、当該技術分野で既知である。たとえば、一の方法においては免疫グロブリンの軽鎖と修飾した重鎖とを組換発現している。重鎖は通常、Ｆｃ領域の何れかの部位で切詰められていて、重鎖の架橋を防いでいる。或いは関連したシステイン残基を別のアミノ酸残基で置換するか、欠失させて架橋を防ぐ。
インビトロ法もまた、一価の抗体を調製するのに適している。抗体を消化してその断片、特にＦａｂ断片を産生することは、当該技術分野で慣用の技術を使用して達成することができる。
c．ヒトの及びヒト化した抗体
本発明の抗体は更に、ヒト化抗体又はヒトの抗体を具備することができる。ヒト以外（例えばマウス）の抗体のヒト化したものは、キメラの免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖又はその断片（例えばＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２や、その他抗体の抗原結合性配列）であってヒト以外の免疫グロブリン由来の配列が最小で含まれるものである。ヒト化抗体には、ヒトの免疫グロブリン（受容抗体）であって、その受容体の相補性決定領域（ＣＤＲ）由来の残基が、ヒト以外の種（供与抗体）のＣＤＲ由来の残基で置換されているものが含まれる。場合により、ヒトの免疫グロブリンのＦｖ骨格残基は、ヒト以外の対応する残基で置換されている。ヒト化抗体はまた、受容抗体中、導入されたＣＤＲ又は骨格配列中の何れでも見出されない残基を具備することができる。一般に、ヒト化抗体は、可変領域の実質的に全部、又は少なくとも一つ、典型的には二つを具備するであろうが、ＣＤＲ領域の全部又は実質的に全部は、ヒト以外の免疫グロブリンのものに対応し、又、ＦＲ領域の全部又は実質的に全部は、ヒト免疫グロブリン共通配列のものである。ヒト化抗体はまた、適宜、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）、典型的にはヒトの免疫グロブリンのものの少なくとも一部を具備するであろう（Jones et al., Nature, 321:522 (1986); Riechmann et al., Nature, 332:323-329 (1988); Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2:593-596 (1992)）。
ヒト以外の抗体をヒト化する方法は、当該技術分野で周知である。一般的にはヒト化抗体はヒト以外の供給源から導入された一以上のアミノ酸残基を有している。これらのヒト以外のアミノ酸残基はしばしば、「導入（import）」残基とよばれるが、これは典型的には「導入」可変領域からのものである。ヒト化は、Winter らの方法（Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 322:323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239:1543-1536 (1986)）に従い、齧歯類のＣＤＲ又はＣＤＲ配列に対応するヒトの抗体の配列で置換することにより、本質的に行うことができる。従って、このような「ヒト化」抗体はキメラの抗体であり（米国特許第４，８１６，５６７号）、ここでは無傷のヒトの可変領域よりも実質的に少ないものが、ヒト以外の種に由来する対応配列で置換されている。実際に、ヒト化抗体は典型的にはＣＤＲ残基のいくつか、そしておそらくはいくつかのＦＲ残基が、齧歯類の抗体の類似の部位の残基により置換されている。
ヒトの抗体はまた、当該技術分野で既知の種々の方法により産生することができ、これにはファージディスプレーライブラリー（Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227:381 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581 (1991)）が含まれる。Coleら及びBoernerらの技術もまた、ヒトのモノクローナル抗体の調製に利用することができる（Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985); Boerner et al., J. Immunol., 147(1):86-95 (1991)）。同様に、ヒトの抗体は、ヒトの免疫グロブリンの遺伝子座をトランスジェニック動物、例えば内在性の免疫グロブリン遺伝子が、一部又は完全に不活化されたマウスに導入することにより調製することもできる。攻撃（感染）すると、ヒトの抗体産生が観察されるが、これは全ての点（遺伝子転移（gene rearrangement）、アセンブリー、抗体レパートリーを含む）においてヒトで見られるものと非常に似ている。この方法は例えば、米国特許第５，５４５，８０７号、第５，５４５，８０６号、第５，５６９，８２５号、第５，６２５，１２６号、第５，６３３，４２５号、第５，６６１，０１６号、及び以下の科学的刊行物に記載されている：Marks et al., Bio/Technology 10, 779-783 (1992); Lonberg et al., Nature, 368 856-859 (1994); Morrison, Nature 368, 812-13 (1994); Fishwild et al., Nature Biotechnology 14, 845-51 (1996); Neuberg, Nature Biotechnology 14, 826 (1996); Lonberg and Huszar, Intern. Rev. Immunol., 13 65-93 (1995)。
ｄ．二重特異性抗体
二重特異性抗体は、モノクローナル、好ましくはヒトの又はヒト化した抗体であって、少なくとも二の異なる抗原に対して結合特異性を有するものである。本願の場合、結合特異性のうちの一方は本発明のポリペプチド用であり、もう一方は、他の抗原用、好ましくは細胞表面蛋白質若しくは受容体若しくは受容体サブユニットとすることができる。
二重特異性抗体を調製する方法は、当該技術分野で既知である。慣習上、二重特異性抗体の組換産生は、免疫グロブリンの二組の重鎖／軽鎖の共発現に基づくものであり、ここで二つの重鎖は異なる特異性を有している（Milstein and Cuello, Nature 305:537-539(1983)）。免疫グロブリンの重鎖及び軽鎖のランダムな組み合わせのため、これらのハイブリドーマ（クワドローマ（quadromas））は１０の異なる抗体分子の混合物を作り出す可能性があり、その内のたった一つが正しい二重特異性構造を有している。正しい分子の精製は通常、アフィニティークロマトグラフィー工程により達成される。同様な方法が、１９９３年５月１３日発行のＷＯ93/08829及びTraunecker et al.,（EMBO J. 10:3655-3659 (1991)）に開示されている。
抗体の可変領域で所望の結合特異性を有するもの（抗体-抗原結合部位）は、免疫グロブリンの定常領域の配列に融合することができる。融合は好ましくは免疫グロブリンの重鎖定常領域で少なくともヒンジ領域、ＣＨ２領域、及びＣＨ３領域を具備するものと行われる。軽鎖結合に必要な部位を含む第一の重鎖定常領域（ＣＨ１）が、少なくとも一の融合部において存在することが好ましい。免疫グロブリン重鎖融合物、及び必要ならば免疫グロブリン軽鎖をコードするＤＮＡを別個の発現ベクター中に導入し、適切な宿主生物中に共形質移入する。二重特異性抗体の産生についての更なる詳細は、例えばSuresh et al., Methods in Exzymology, 121:210 (1986)を参照されたし。
ｅ．ヘテロ共役抗体
ヘテロ共役抗体は、二つの結合した抗体からなる。このような抗体は、例えば免疫系の細胞が、望ましくない細胞を標的とするため（米国特許第４，６７６，９８０号）、またＨＩＶ感染の治療用（ＷＯ91/00360；ＷＯ92/200373；ＥＰ03089）に提案されている。抗体は、合成蛋白質化学における既知の方法により試験管内で調製することも考えられるが、これには架橋剤を利用するものが含まれる。例えば免疫毒素は、ジスルフィド交換反応又はチオエーテル結合の形成により構築することができる。このための適切な試薬には、イミノチオレート（iminothiolate）及びメチル-４-メルカプトブチルイミデート、並びに例えば米国特許第４，６７６，９８０号に開示されているものが含まれる。
ｆ．エフェクター機能工学
本発明の抗体をエフェクター効果に関して改変し、免疫関連疾患の治療における抗体の有効性を促進することが望ましいと考えられる。例えば、システイン残基をＦｃ領域に導入し、これによって鎖間ジスルフィド結合の形成をこの領域で起こさせることができる。このように産生されるホモ二量体抗体は、改善された内部移行能及び／又は増大した、補体介在細胞殺傷と抗体依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ）を有する。Caron et al., J. Exp. Med., 176: 1191-1195 (1992); Shopes, B., J. Immumol., 148:2918-2922 (1992)を参照されたし。ホモ二量体抗体で抗−腫瘍活性が促進されたものは、ヘテロ二重機能性の架橋剤（Wolff et al., Cancer Research 53:2560-2565 (1993)）を使用して調製することができる。或いは、抗体を改変して二重のＦｃ領域を有するようにし、従って補体溶解能及びＡＤＣＣ能が促進されたものとすることができる。Stevenson et al., Anti-Cancer Drug Design, 3:219-230 (1989)を参照されたし。
ｇ．免疫共役物（immunoconjugates）
本発明はまた、免疫共役物であって化学療法剤等の細胞毒性剤、毒素（例えば酵素的に活性である、細菌、酵母、植物又は動物起源の毒素、又はその断片）、又は放射性同位元素（即ち放射性共役物）に共役した抗体を具備するものに関する。
このような免疫共役物の調製に有益な化学療法剤が、上に記載されている。酵素的に活性な毒素及びその断片で使用することができるものには、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合性の活性断片、エキソトキシンＡ鎖（緑膿菌（Psedomonas aeruginosa））、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデシン（modeccin）Ａ鎖、アルファ−サルシン（sarcin）、アロイライテス・フォルディイ（Aleurites fordii）蛋白質、ジアンチン（dianthin）蛋白質、フィトラカ・アメリカーナ（Phytolaca americana）蛋白質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ、及びＰＡＰ−S）、モモルジカ・チャランチア（momordica charantia）阻害因子、クルシン、クロチン、サパオナリア・オフィシナリス（sapaonaria officinalis）阻害因子、ゲロニン（gelonin）、マイトゲリン（mitogellin）、レストリクトチン（restrictocin）、フェノマイシン（phenomycin）、エノマイシン（enomycin）、及びトリコテセン（tricothesenes）が含まれる。種々の放射性核種が、放射性共役抗体の産生に利用することができる。例えば、212Ｂｉ、131Ｉ、131Ｉｎ、96Ｙ、及び186Ｒｅがある。
抗体と細胞毒性剤との共役物は、種々の二重機能性蛋白質カップリング剤、例えばＮ-スクシニミジル-３-（２-ピリジルジチオール）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、イミノチオレート（ＩＴ）、イミドエステルの二重機能性誘導体（ジメチルアジピミデートＨＣＬ等）、活性エステル（ジスクシニミジルスベラート）、アルデヒド（グルタルデヒド等）、ビス-アジド化合物（ビス-（ｐ-アジドベンゾイル）ヘキサンジアミン等）、ビス-ジアゾニウム誘導体（ビス-（ｐ-ジアゾニウムベンゾイル）-エチレンジアミン等）、ジイソシアネート（トリレン ２，６-ジイソシアネート等）、及びビス-活性フッ化化合物（１，５-ジフルオロー２，４-時にトロベンゼン等）等を使用して調製する。例えば、リシン免疫毒素は、Vitetta et al., Science, 238:1098 (1987) に記載されるようにして調製することができる。カーボン１４で標識された１-イソチオシアネートベンジル-３-メチルジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＭＸ-ＤＴＰＡ）は、放射性ヌクレオチドを抗体へ共役させるためのキレート剤の例である。ＷＯ94/11026を参照。
別の態様においては、抗体は「受容体」（ストレプトアビジン等）に共役して、組織前標的（tisue pretargeting）を行うことができるが、ここで抗体−受容体共薬物を患者に投与し、非結合共役物をキレート剤により血流より除去し、次いで細胞毒性剤（放射性ヌクレオチド等）に共役した「リガンド」（アビジン等）を投与する。
ｈ．免疫リポソーム
本願で開示する蛋白質、抗体等はまた、免疫リポソームとして調製することもできる。抗体を含有するリポソームは、例えばEpstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:3688 (1985); Hwang et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 77:4030 (1980) ;並びに米国特許第４，４８５，０４５号及び第４，５４４，５４５号に開示されるもの等の、当該技術分野で既知の方法により調製する。循環時間が促進されたリポソームが、米国特許第５，０１３，５５６号に開示されている。
特に有益なリポソームは、ホスファチジルコリン、コレステロール、及びＰＥＧ−誘導体化ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ-ＰＥ）を具備する脂質組成物を使用した逆相蒸発法により作製することができる。リポソームは、予め設定した孔径のフィルターを通して押出し、所望の直径のリポソームを産生する。本発明の抗体のＦａｂ’断片は、Martin et al., J. Biol. Chem., 257:286-288 (1982)に記載されるようにして、ジスルフィド交換反応を介してリポソームに共役することができる。化学療法剤（ドキソルビシン等）を適宜、リポソーム内に含ませることができる。Gabizon et al., J. National Cnacer Inst., 81 (19) 1484 (1984)を参照されたし。
１０．薬学的組成物
本発明の活性分子であるポリペプチド及び抗体、並びに本願で開示するスクリーニングアッセイにより同定される他の分子は、薬学的組成物の形態で炎症性疾患の治療用に投与することができる。
活性分子、好ましくは本発明のポリペプチド又は抗体であるＰＲＯ３０１、ＰＲＯ３６２、又はＰＲＯ２４５の治療用製剤は、所望の純度を有する活性分子を適宜薬学的に受容される担体、賦形剤、又は安定化剤と混合することにより、水溶液の凍結乾燥形態での保存用に調製することができる（Remington’s Pharmaceutical Sciences 16 th edition, Osol, A., Ed. (1980)）。受容される担体、賦形剤、又は安定化剤は、使用した投薬量及び濃度において受容者に毒性がないものであり、これにはリン酸塩、クエン酸塩、及び他の酸等の緩衝液；アスコルビン酸やメチオニンを含む抗−酸化剤；保存料（塩化オクタデシルジメチルベンジルアンモニウム等）；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム；塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチルアルコール又はベンジルアルコール；メチルパラベンやプロピルパラベン等のアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール：３-ペンタノール：及びｍ-クレゾール）；低分子量（約１０残基未満）のポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリン等の蛋白質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニンや、リジン等のアミノ酸；二糖類、及び他の炭水化物（グルコース、マンノースや、デキストリンを含む）；ＥＤＴＡ等のキレート剤；スクロース、マンニトール、トレハロースや、ソルビトール等の糖類；ナトリウム等の塩形成対イオン；金属錯体（Ｚｎ−蛋白質錯体等）；及び／又はＴｗｅｅｎＴＭ、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳＴＭや、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の非イオン性界面活性剤が含まれる。
本発明のスクリーニングアッセイで同定された化合物は、当該技術分野で既知の標準的な技術を利用した、同様の方法により製剤化することができる。
リポフェクションやリポソームを使用して、ポリペプチド、抗体、抗体断片を細胞内へデリバリーすることができる。抗体断片を使用する場合には標的蛋白質の結合領域に特異的に結合する最小の阻害断片が好ましい。例えば、抗体の可変領域の配列に基づき、標的蛋白質配列に結合する能力を保持してペプチドを消化することができる。このようなペプチドは、化学的に合成することができ、及び／又は組換ＤＮＡ技術により生産することもできる（Marasco et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 7889-7893 (1993)等を参照されたし）。
本願での製剤にはまた、治療する特定の適応症に必要な複数の活性化合物、好ましくは互いに逆の効果を与えない相補的活性を有するものを含むことができる。或いは、又は更に、当該組成物は細胞毒性剤、サイトカイン、又は増殖阻害剤を具備することができる。このような分子は適切には、目的に対して効果的な量で組み合わされて存在する。
活性分子はまた、コアセルべーション技術又は界面重合により調製されるマイクロカプセル、例えばそれぞれコロイドドラッグデリバリーシステム（例えばリポソーム、アルブミン小球、マイクロエマルジョン、ナノ粒子及びナノカプセル等）、又はマクロエマルジョンにおける、ヒドロキシメチルセルロース、又はゼラチン−マイクロカプセル及びポリ-（メチルメタクリル酸）マイクロカプセル中に包含させることができる。このような技術は、Remington’s Pharmaceutical Sciences 16 th edition, Osol, A. Ed. (1980)に開示されている。
生体内投与に使用されるこの製剤は、無菌である必要がある。これは無菌の濾過膜を通すことにより容易に行うことができる。
持続性放出調剤を調製することもできる。持続性放出調剤の適切な例には、抗体を含んだ固体疎水性ポリマーの半透過性マトリックスが含まれるが、このマトリックスは、成型品、例えばフィルムやマイクロカプセルの形態である。持続性放出マトリックスの例には、ポリエステル、ヒドロゲル（ポリ（２-ヒドロキシエチル-メタクリル酸）や、ポリ（ビニルアルコール）、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，９１９号）、Ｌ-グルタミン酸とγエチル-L-グルタミン酸とのコポリマー、非分解性エチレン-酢酸ビニル、分解性乳酸-グリコール酸コポリマー（ＬＵＰＲＯＮ ＤＥＰＯＴＴＭ（乳酸-グリコール酸コポリマーと酢酸ロイプロリド（leuprolide）からなる注射可能な小球体）等）、及びポリ-D-（-）-３-ヒドロキシ酪酸が含まれる。エチレン-酢酸ビニルや乳酸-グリコール酸等のポリマーは１００日間以上の分子放出を可能にするが、一方ある種のヒドロゲル放出蛋白質はより短期間でしか放出しない。カプセル化された抗体が体内で長期間残存すると、３７°Ｃの水分への露出により、変性又は凝集して、生物学的活性の喪失が起こり、そして免疫原性の変化をきたすかもしれない。関与する機構に応じて、安定化のために合理的な方法を考案することができる。例えば、凝集機構がチオジスルフィド交換による分子間Ｓ−Ｓ結合の形成であることが判明したら、スルフィドリル残基を修飾し、酸性溶液から凍結乾燥し、水分量を制御し、適切な添加剤を使用し、そして特別なポリマーマトリックス組成物を開発することにより、安定化を達成することができる。
１１．治療方法
本発明のポリペプチド、抗体、そしてその他の活性分子を使用して、種々の炎症性疾患や状態、例えばＴ細胞介在疾患（リンパ球細胞の組織への浸潤、Ｔ細胞増殖、血管透過性の増大又は減少、又はその阻害、により特徴付けらられるものを含む）等の治療を行うことができる。
本発明の化合物（ＰＲＯ３０１、ＰＲＯ３６２、ＰＲＯ２４５等）は、Ａ３３抗原に対する相同性により特徴付けられる蛋白質ファミリーの新規のメンバーをコードする。本発明の化合物の前炎症性（proinflammatory nature）は、以下の試験管内アッセイにおいて示される。
本発明の化合物である、ＤＮＡ４０６２８、ＤＮＡ４５４１６、及びＤＮＡ３５６３８によりコードされる蛋白質（それぞれ、配列番号１、配列番号２、配列番号９）は、接合付着分子（junctional adhesion molecule）（ＪＡＭ）（Martin-Padura et al., J. Cell Biol. 1998 142(1):117-27）の同一性に対しての相同性を共有している。実質的に最大の同一性は、ＤＮＡ４０６２８（配列番号１）によりコードされるＰＲＯ蛋白質によるものである（６７％）。ＪＡＭは、生体内でＭＣＰ-１、ＭＣＰ-３、及びＬＰＳに応答した、単球の動員に関与する。ＪＡＭに対する抗体は、生体内での単球の移動を阻止する。ＪＡＭは、単球移動の接合付着分子としてマウスの上皮及内皮に局在している。他の白血球もＪＡＭを使用しているかもしれないが、このことを支持する情報は一切ない。ＪＡＭは、結腸炎になったマウスの結腸において上昇しており、その結腸の病変部への単球又は白血球の動員に関与すると思われる。
本発明のポリペプチド、抗体、及びその他の化合物で治療される状態又は疾患には以下のものが含まれるが、これらには限定されない：炎症性腸疾患（即ち潰瘍性大腸炎、クローン病）、全身性エリテマトーデス、リウマチ性関節炎、若年性慢性関節炎、脊髄関節症（spondyloarthropathies）、全身性硬化症（硬皮症）、特発性炎症性筋障害（皮膚筋炎、多発性筋炎）、シェーグレン症候群、全身性脈管炎、サルコイドーシス、自己免疫性溶血性貧血（免疫性汎血球減少症、発作性夜間血色素尿症）、自己免疫性血小板減少症（特発性血小板減少性紫斑病、免疫介在性血小板減少症）、甲状腺炎（グレーブズ病、橋本甲状腺炎、若年性リンパ球性甲状腺炎、萎縮性甲状腺炎）、糖尿病、免疫介在性腎臓疾患（腎炎、細管間質性腎炎（tubulointerstitial nephritis））、中枢神経系及び末梢神経系の脱髄疾患（多発性硬化症、特発性脱髄多発性神経炎やギラン−バレー症候群、及び慢性炎症性脱髄性多発性神経炎等）、肝胆道系疾患（感染性肝炎（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ型肝炎ウイルス及びその他の非肝臓親和性ウイルス））、自己免疫性慢性活動性肝炎、初期の胆汁性肝硬変症、肉芽種性肝炎、硬化性胆管炎、炎症性及び繊維形成性肺疾患（嚢胞性線維症、グルテン過敏性腸疾患、及びホウィップル病）、自己免疫性又は免疫介在性皮膚病（水疱性皮膚病、多形性紅斑、及び接触皮膚炎を含む）、乾癬、アレルギー疾患（喘息、アレルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎、食品過敏症、及びじん麻疹等）、肺の免疫疾患（ＰＩＥ症候群、特発性肺線維症及び超過敏性肺実質炎等）、移植関連疾患（移植片拒絶及び対宿主性移植片病）を含む。
全身性エリテマトーデスにおいては、疾患の中心的媒介物は、自己の蛋白質／組織に対する自己反応性抗体の産生と、それに引き続く免疫介在性炎症の発生である。抗体は、直接的又は間接的に組織の傷害を媒介する。Ｔリンパ球が組織傷害に関与することは示されていないが、Ｔリンパ球は自己反応性抗体の発生には必要である。従って疾患の発症は、Ｔリンパ球依存性である。複数の臓器とシステムが臨床的な影響を受けるが、これには腎臓、肺、筋骨格系、粘膜皮膚、眼、中枢神経系、心血管系、消化管、骨髄、及び血液が含まれる。
リウマチ性関節炎（ＲＡ）は、慢性の全身性自己免疫性の炎症疾患であり、関節軟骨に傷害を生じる、複数の関節の滑膜が主として関るものである。病因はＴリンパ球に依存し、リウマチ因子、自己のＩｇＧに対する自己抗体の産生に関連し、結果として滑液及び血液中に高レベルの免疫複合体を形成する。これらの関節における複合体は、リンパ球及び単球の滑膜への顕著な浸潤及びその子の顕著な滑膜変化を誘起する。即ち関節窩／同様の細胞が多数の好中球の添加とともに浸潤した場合には滑液が生じる。影響される組織は主として関節であり、しばしば対称的なパターンとなる。しかしながら、関節外の疾患もまた二つの形態で発生する。一の形態は、進行性の関節疾患の進行、並びに肺線維症、脈管炎、及び皮膚の潰瘍の典型的な病変とともに関節外病変が発生するものである。関節外疾患の第二の形態は、ＲＡの後期、時として関節疾患が鎮静期となった後に発症し、また好中球減少症、血小板減少症、及び脾腫の存在が関与する、いわゆるフェルティー症候群である。これは、梗塞、皮膚潰瘍、壊疽の形成とともに、複数の器官において脈管炎を伴うことがある。患者は影響される関節の上の皮下組織においてリウマチ性結節を発症することがよくあり、この結節は後期において、炎症性細胞浸潤物の混合物で包囲された壊死中心を有する。ＲＡにおいて起こる他の症状発現には、心膜炎、胸膜炎、冠状動脈炎、肺線維症を伴った腸管肺実質炎（intestitial pneumonitis）、乾性角結膜炎、及びリウマチ性結節が含まれる。
若年性の慢性関節炎は、慢性の特発性炎症疾患であって、１６歳未満でしばしば始る疾患である。その表現型はＲＡとの類似性を有しているが、リウマチ因子陽性の患者の中には、若年性のリウマチ関節炎と分類されるものがいる。この疾患は、３つのサブクラス、即ち少関節性（pauciarticular）、ポリ関節性（polyarticular）、全身性の範疇に分類される。関節炎は重度であることがあるが、典型的には破壊性であり、関節強直症となって及び成長が遅延する。他の症状発現には、慢性の前部ブドウ膜炎及び全身性アミロイドシスが含まれる。
脊髄関節症は、いくらかの共通の臨床的特徴を有し、また、ＨＬＡ-Ｂ２７遺伝子産物の発現にともに関連した、一群の疾患のことである。この疾患には、強直性関節炎、ライター症候群（反応性関節炎）、炎症性腸疾患を伴う関節炎、乾癬に関連した脊髄炎、脊髄性関節症及び未分化脊髄関節炎の若年性発症が含まれる。
他と区別する特徴には、脊髄炎を伴った／伴わない仙腸関節炎；炎症性の非対称性関節炎；ＨＬＡ-Ｂ２７（クラスＩＭＨＣのＨＬＡ−Ｂ遺伝子座の、血清学的に定義された対立遺伝子）との関連；眼球炎症、及び他のリウマチ性疾患に関連した自己抗体の不存在が含まれる。疾患の導入にとって鍵となるものとして最も有力な細胞は、ＣＤ８＋のＴリンパ球であるが、これはクラスＩＭＨＣ分子により提示された抗原を標的とする細胞である。ＣＤ８＋のＴ細胞は、ＭＨＣクラスＩ分子により発現された外来ペプチドであるかのようにして、クラスＩＭＨＣ対立遺伝子ＨＬＡ-Ｂ２７と反応するであろう。ＨＬＡ-Ｂ２７のエピトープは、細菌又は他の微生物の抗原性エピトープの模倣をして、その結果ＣＤ８＋のＴ細胞応答を誘導するという仮説が立てられている。
全身性の硬化症（強皮症）は、その病因が不明である。この疾患の証明は、皮膚のしこりであるが、これは進行性の炎症プロセスにより誘導されると思われる。強皮症は、局所的又は全身性となることがあるが、血管に病変が生じるのが普通であり、また、微小血管中の内皮細胞の損傷は、全身性強皮症の発症において早期に起こる重要な出来事である。血管の損傷には、免疫系が介在することもある。皮下の病変部に浸潤した単核細胞の存在、及び多くの患者における抗−核抗体の存在により、免疫学的基礎が示唆される。ＩＣＡＭ−１は、皮膚の病変部における線維芽細胞の細胞表面上で、しばしば上流制御されるが、これはＴ細胞がこれらの細胞と相互作用することにより当該疾患の病原性において役割を演じていることを示唆するものである。関与する他の器官には、消化器管：異常な蠕動運動／自動運動を引き起こす平滑筋萎縮症及び線維症；腎臓：小さい弓状動脈及び小葉間動脈に影響して、腎皮質の血流が減少する同心性内皮下内膜増殖は、蛋白尿症、高窒素血症、及び高血圧を引き起こす；骨格筋：萎縮症、間質性線維症；炎症；肺：間質性肺炎及び間質性線維症；及び心臓：収縮体壊死、瘢痕化／線維症が含まれる。
特発性炎症性筋障害には皮膚筋炎、多発性筋炎等が含まれるが、これらは病因が不明の慢性の筋肉炎であり筋肉の衰弱を引き起こす。筋肉の損傷／炎症は、対称的且つ進行性であることが多い。自己抗体が多くの形態と関連している。これらの筋炎特異的自己抗体は、蛋白質合成に関与する蛋白質及びＲＮＡに対して向けられていて、成分の機能を阻害する。
シェーグレン症候群は、免疫介在性の炎症と、引き続いて起こる涙腺と唾液腺の機能破壊によるものである。この疾患は、炎症性の結合組織病と関連するか、又はこれを伴っている。この疾患は、Ｒｏ及びＬａ抗原に対する自己抗体の産生に関っているが、これらの両者は小型のＲＮＡ-蛋白質複合体である。病変により乾性角結膜炎、口腔乾燥症が、他の症状発現又は関連（association）（胆汁性肝硬変（bilary cirrhosis）、末梢又は知覚の神経障害、及び触知可能な紫斑を含む）を伴って起こる。
全身性動脈炎は、一次病変部が炎症とその後の血管損傷である疾患であるが、これは影響を受けた血管により供給を受ける組織の虚血／壊死／退行変性を生じ、ある場合には末梢器官の機能不全を起こす。動脈炎はまた、二次病変、又はリウマチ性関節炎、全身性硬化症等の他の疾患、特に免役複合体の形成にも関連した疾患において、免疫−炎症介在性疾患の後遺症として発症する。一次的な全身性動脈炎のグループの疾患には、全身性壊死化動脈炎：結節性多発性動脈炎、アレルギー性脈管炎、肉芽腫症、多発性血管症；ウェグナー肉芽種症；リンパ腫様肉芽種症；及び巨細胞動脈炎が含まれる。他の動脈炎には、粘膜皮膚リンパ節症候群（ＭＬＮＳ、又は川崎病）、分離性（isolated）ＣＮＳ動脈炎、ベーチェット病、閉塞性血栓性血管炎（バージャー病）、及び皮膚壊死性細静脈炎（cutaneous necrotizing venulitis）が含まれる。上記の動脈炎の多くのタイプの病原性機構は、主として免疫グロブリン複合体の血管壁への沈着、そしてその後のＡＤＣＣ、補体活性化又はその両方による炎症反応の誘起によるものと考えられている。
サルコイドーシスは、病因が不明の状態であって、体中のほぼどの組織においても類上皮細胞肉芽腫が存在することにより特徴付けられ、肺が関ることが最も一般的である。病因には、活性化されたマクロファージ及びリンパ球系細胞が、疾患部位に残留して、これらの細胞種により放出される局所的又は全身的な活性物質の放出による慢性の後遺症が関係する。
自己免疫性溶血性貧血には自己免疫性溶血性貧血、免疫性全白血球減少症、及び発作性夜間血色素尿症が含まれるが、これは赤血球（そしてある場合には血小板が含まれるその他の血液細胞）の表面に発現された抗原と反応する抗体の産生の結果であり、補体介在性溶菌及び／又はＡＤＣＣ／Ｆｃ受容体介在性機構によりこれらの抗体でコートされた細胞を除去することによるものである。
自己免疫性血小板減少症には血小板減少性紫斑病、他の臨床的環境下での免疫介在性血小板減少症が含まれるが、これらにおいては血小板の破壊／除去が、血小板に付着した抗体又は補体に何れかにより、補体溶菌、ＡＤＣＣ若しくはＦＣ受容体介在機構による除去の結果として起こる。
甲状腺炎には、グレーブス病、橋本甲状腺炎、若年性リンパ球性甲状腺炎、及び萎縮性甲状腺炎が含まれるが、これらは甲状腺抗原に対する自己免疫反応が、甲状腺内に存在し、甲状腺に特異的な蛋白質と反応する抗体の産生を伴って起こる。実験モデルが存在するが、これには自発的なモデル：ラット（ＢＵＦ及びＢＢラット）及びニワトリ（肥満ニワトリ）；誘導性モデル：チログロブリン、甲状腺ミクロソーム抗原（甲状腺ペルオキシダーゼ）の何れかで免役した動物が含まれる。
Ｉ型の糖尿病又はインスリン依存性糖尿病は、膵臓の島β細胞の自己免疫破壊であるが、この破壊は自己抗体及び自己反応性Ｔ細胞により仲介される。インスリンに対する抗体又はインスリン受容体もまた、インスリン非応答性の表現型で産生することが可能である。
免疫介在性の腎臓病には、腎炎及び細管間質性腎炎が含まれるが、これらは腎抗原に対する自己反応性抗体又はＴ細胞の産生の結果としての直接的な、又は他の非腎臓抗原に対して反応性のある抗体及び／又は免疫複合体の沈着の結果としての間接的な、抗体又はＴリンパ球が介在する腎組織への傷害の結果である。従って、他の免疫介在性疾患で免疫複合体の形成が起こるものは、間接的な後遺症として免疫介在性の腎疾患を誘導する。直接的及び間接的な免疫機構の双方により、腎組織に器官機能障害を伴って、またある場合には腎不全へと進行して、腎組織中に病変部の発生を生じる／誘導する炎症が起こる。液性及び細胞性免疫機構の両方が病変部の病原性に関与することがある。
中枢及び末梢の神経系の脱髄疾患には多発性硬化症；多発性脱髄性神経障害又はギラン−バレー症候群；及び慢性の炎症性脱髄性神経障害が含まれるが、これらは自己免疫性をよりどころとし、乏突起神経膠芽細胞腫（oligodendrocyte）又はミエリンへの直接的な傷害の結果として神経の脱髄が起こる。ＭＳにおいては、疾患の誘起及び進行がＴリンパ球に依存することを示唆する証拠がある。多発性硬化症は、Ｔリンパ球依存性であり、また回帰性−弛張性（relapsing-remitting）の経過、若しくは慢性の進行性の経過をとる脱髄性疾患である。病因は不明であるが、ウイルス感染、遺伝的素因、環境、及び自己免疫の全てが関与する。病変部には主としてＴリンパ球介在性の小膠細胞性浸潤物、及び浸潤性マクロファージが含まれるが、ＣＤ４＋Ｔリンパ球が病変部における主要な細胞種である。乏突起神経膠芽細胞腫の細胞死の機構とそれに続く脱髄の機構は不明であるが、Ｔリンパ球駆動性であると思われる。
炎症性及び繊維性の肺疾患にはＰＩＥ症候群、多発性肺線維症、及び過敏性肺炎が含まれるが、これらは無制御の免疫−炎症反応が関与するかもしれない。この反応の阻止は治療的に有益であろう。
自己免疫又は免疫介在性の皮膚疾患には水疱性皮膚疾患、多形性紅斑、及び接触皮膚炎が含まれるが、これらはその産生がＴリンパ球依存性である自己抗体により引き起こされる。
乾癬は、Ｔリンパ球介在性の炎症性疾患である。病原部にはＴリンパ球、マクロファージ及び抗原処理細胞、並びにいくらかの好中球の浸潤物が含まれる。
アレルギー疾患には喘息；アレルギー性鼻炎；アトピー性皮膚炎；食品過敏症；及びじん麻疹が含まれるが、これらはＴリンパ球依存性である。これらの疾患は主としてＴリンパ球誘導性炎症、ＩｇＥ介在性炎症、又はこの両方により介在される。
移植関連疾患には移植片拒絶、及び移植片対宿主疾患（ＧＶＨＤ）が含まれるが、これらはＴリンパ球依存性であり、Ｔリンパ球機能の阻害により改善する。
免疫及び／又は炎症性反応の介在が有益である他の疾患には、以下の感染症が含まれるがこれには限定されない：ウイルス感染（ＡＩＤＳ、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ型肝炎が含まれるがこれらには限定されない）、細菌感染、真菌感染、原虫感染及び寄生虫感染（ＭＬＲを刺激する分子（または誘導体／アゴニスト）を治療に使用して感染性因子に対する免疫反応を促進することができる）、免疫不全疾患（ＭＬＲを刺激する（分子／誘導体／アゴニスト）を治療に使用して、先天的な、後天的な、（ＨＩＶ感染等のように）感染により誘導された、（化学療法等による）医原性の、免疫不全の状態の免疫反応を促進することができる）、及び腫瘍形成。
ヒトの癌患者になかには、腫瘍形成細胞上の抗原に対する抗体及び／又はＴリンパ球の反応を示すものがあることが証明されている。腫瘍形成の動物モデルにおいては、免疫反応の促進によりその特定の腫瘍形成が排除又は退行することも示されている。ＭＬＲにおいてＴリンパ球を促進する分子は、腫瘍形成に対する免疫反応を生体内において促進する有用性がある。ＭＬＲにおいてＴリンパ球の増殖を促進する分子（又は小分子アゴニスト若しくは抗体であって、アゴニスト的な様式で同じ受容体に影響を与えるもの）は、癌の治療に使用することが可能である。ＭＬＲにおけるリンパ球の反応を阻害する分子はまた、腫瘍形成中に生体内で腫瘍形成に対する免疫反応を抑制する機能を有するが、このような分子は腫瘍形成細胞自身によるか、又は他の細胞中の腫瘍形成により誘導することも可能である。このような阻害性分子（抗体、小分子アンタゴニスト、又は他の手段）の拮抗作用により、免疫介在性の腫瘍排除が促進される。
更に、前炎症性（proinflammatory）特性を有する分子を阻害することは、再還流（reperfusin）傷害；発作；心筋梗塞；アテローム性動脈硬化症；急性肺傷害；出血性ショック；火傷；敗血症／敗血症性ショック；急性尿細管壊死；子宮内膜症；変形性関節疾患及び膵炎（pancreatis）において治療における有用性があるかもしれない。
本発明の化合物であるＰＲＯ３０１、３６２、及びＰＲＯ２４５、例えばポリペプチド又は抗体を哺乳類、好ましくはヒトに対し、例えばボーラス静脈投与するか、又はある期間連続して輸液するか、筋肉内、腹腔内、脳脊髄内（intracerobrospinal）、皮下、関節内、滑液包内、くも膜下、経口的、局所的、（鼻腔内、肺内）吸入経路などの既知の方法により投与する。ポリペプチド及び抗体は、静脈内投与又は吸入投与することが好ましい。
免疫アジュバント治療においては、例えば抗癌剤の投与などの他の治療的養生法を、本発明の蛋白質、抗体、又は化合物と組み合わせることができる。例えば、本発明の免疫アジュバントで治療する患者に抗癌剤（化学療法剤）を与えてもよく、または放射線治療を与えてもよい。このような化学療法剤の調製と投薬スケジュールは、製造者の指示にしたがって使用するか、又は熟達した技術者が経験的に決定したようにして使用することができる。このような化学療法の調製及び投薬スケジュールはまた、Chemotherapy Service Ed., M.C.Perry, Williams & Wilkins, Baltimore, MD (1992)に記載されている。化学療法剤は、免疫アジュバントの前又は後に投与することができ、或いは、それと同時に投与することもできる。更に、タモキシフェン等の抗−エストロゲン化合物、オナプリストン（onapristone）（EP 616812参照）等の抗−プロゲステロンを、それらの分子既知の投薬量で投与することもできる。
他の免疫疾患関連性又は腫瘍関連性の抗原に対する抗体、例えばＣＤ２０、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１８、ＥｒｂＢ２、ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ３、ＥｒｂＢ４や、血管内皮因子（ＶＥＧＦ）に結合する抗体を投与することが望ましいかもしれない。或いは、又は更に、本願で開示する同じ抗原又は二以上の異なる抗原に結合する二以上の抗体を患者に一緒に投与することもできる。場合により、一以上のサイトカインを患者に投与することも有益であろう。一の態様においては、本発明のポリペプチドを増殖阻害剤と一緒にして投与する。例えば、増殖阻害剤をまず投与し、その後に本発明のポリペプチドを投与する。しかしながら、同時投与や、最初に投与することも考えられる。増殖阻害剤の適切な投薬量は、本願で使用されているものであるが、増殖阻害剤と本発明のポリペプチドの組み合わせ作用（相乗効果）により低減することも可能である。
免疫関連疾患の治療又は緩和の場合、本発明の化合物の適切な投薬量は、上に定義したように治療する疾患のタイプ、重度、及び疾患の経過、薬剤が予防又は治療のために投与されるのか、以前の治療、患者の臨床的歴史、化合物への応答性、及び関与する医者の裁量に依存するであろう。化合物は適切には、一回、又は一連の治療にわたって投与される。好ましくは、用量反応曲線を決定し、ヒトでの治験に先立ち、本発明の薬学的組成物をまず試験管内で、そして次に有益な動物モデルで決定する。
例えば、疾患の種類と重度により、例えば一回以上の分離した投与であるか、又は連続した輸液であるかはとわず、約１μｇ／ｋｇから１５ｍｇ／ｋｇ（例えば０．１−２０ｍｇ／ｋｇ）のポリペプチド又は抗体を初期の候補として患者に投与する。典型的な一日の投薬量は、約１ｕｇ／ｋｇ乃至１００ｍｇ／ｋｇの範囲、又はそれ以上であるが、これは上記した要素に依存する。数日間以上繰り返して投与する場合、状況により、疾患の兆候の所望の抑制が起こるまで治療を持続する。しかしながら、他の投薬養生法を行うこともできる。この治療の進行は、通常の技術及びアッセイにより容易にモニターすることができる。
１２．製造物品
本発明の別の態様においては、上記した疾患の診断又は治療に有益な材料を含む製造物品が提供される。この製造物品は、容器及びラベルを具備する。適切な容器には例えば、ボトル、バイアル、シリンジ、及び試験管が含まれる。容器は種々の物質、例えばガラスやプラスチックより形成することができる。容器は状態を診断又は治療するために有益な組成物を保持するものであり、無菌のアクセスポート（例えば容器は、皮下注射用の針で貫通可能なストッパーを有するバイアル又は静脈溶液バッグとすることができる）を有することができる。組成物中の活性剤は通常、本発明のポリペプチド又は抗体である。容器の上、又は容器に付いたラベルは、その組成物が選択した状態の診断又は治療用に使用されるものであることが記載されている。この製造物品は更に、薬学的に許容される緩衝液、例えばリン酸塩緩衝生理食塩水、リンガー溶液、及びデキストロース溶液を具備した第二の容器を具備することができる。これには更に、他の物質であって商業的又は使用者の観点から望ましいものを含めることができ、これには他の緩衝液、希釈液、フィルター、針、シリンジ、使用時の指示のためのパケージ挿入物が含まれる。
１３．免疫関連疾患の診断及び予後
細胞表面蛋白質、例えばある種の免疫関連疾患において過剰発現している蛋白質は、薬剤候補又は疾患治療の優れた標的である。免疫関連性病的状態において増幅している遺伝子がコードする分泌性蛋白質と同じ蛋白質は、当該疾患の治療及び予後に更に使用することができる。例えば、多発性硬化症、リウマチ性関節炎や、他の免疫関連疾患において増幅している遺伝子の蛋白質産物に対する抗体は、診断又は予後に使用することができる。
例えば、抗体（抗体断片を含む）は増幅した、又は過剰発現した遺伝子（「マーカー遺伝子産物」）によりコードされる蛋白質の発現を定性的又は定量的に確認するために使用することができる。抗体は好ましくは検出可能な、例えば蛍光標識を備え、また結合は光学顕微鏡、フローサイトメトリー、蛍光定量法、又は当該技術分野における他の技術によりモニターすることができる。これらの技術は、過剰発現した遺伝子が細胞表面蛋白質をコードする場合には特に適している。このような結合アッセイは、本質的には上記のようにして行うことができる。
マーカー遺伝子産物への抗体結合のin situ検出は、例えば免疫蛍光顕微鏡法又は免疫電子顕微鏡法により行うことができる。このためには、組織学的検体を患者より取出し、好ましくは生物学的試料を当該抗体で被うことによりそれに標識済抗体を適用する。当業者らには、種々の組織学的方法をin situ検出に容易に用いられることが明らかである。
以下の実施例は例示のためのみに提供するものであり、如何なる場合にも本発明の範囲を限定するものではない。
本明細書中で引用する全ての特許及び参考文献は、その全体を参照することにより本願に組み込む。
別記した以外は、実施例で参照される市販の試薬は、製造者の指示に従って用いた。以下の実施例中、および明細書を通しての、ＡＴＣＣ受託番号により示される起源は、アメリカンタイプカルチャーコレクション、Rockville、Marylandである。
実施例１
ヒトＰＲＯ３０１をコードするｃＤＮＡの単離
Swiss-Protのパブリックデータベースからの約９５０の既知の分泌タンパク質からの細胞外ドメイン（ECD）配列をESTデータベースの検索に用いた。ESTデータベースは公のデータべース（例えば、Dayhoff、GenBank）、および私有のデータベース（例えばLIFESEQ（商標）、Incyte Pharmaceuticals、Palo Alto、CA）を含んでいた。検索は、コンピュータープログラムBLASTまたはBLAST2（Altschul、およびGish、Methods in Enzymology 266:460-80(1996);http://blast.wustl/edu/blast/README.html）を用いて、EST配列の６フレーム翻訳に対するECDタンパク質配列の比較として行なわれた。既知のタンパク質をコードしていない７０（あるいは、あるケースでは９０）以上のBlastスコアとのそれらの比較を、プログラム”pharap”を用いて、共通ＤＮＡ配列に集めて組み立てた。（Phil Green、ワシントン大学、シアトル、WA；http://bozeman.mbt.washington.edu/pharp.docs/pharp.html）。
phrapを用いて、ＤＮＡ３５９３６をコードする共通ＤＮＡ配列を組み立てた。場合により、共通ＤＮＡ配列は、上記EST配列の３つの源を用いて共通配列をできるだけ延長するために、blastとpharpの反復サイクルを用いて延長した。
上記で得られた共通配列に基づき、ついで、１）ＰＣＲにより対象の配列を含むｃＤＮＡライブラリーを同定し、２）全長コード配列のクローンを単離するためのプローブとして使用するために、オリゴヌクレオチドを合成した。前進および逆進ＰＣＲプライマー（各々*.fおよび*.rと記す）は、通常２０から３０ヌクレオチド（典型的には約２４）の範囲であり、しばしば約１００−１０００bpのＰＣＲ産物を得るためにデザインされる。プローブ配列（*.pと記す）は典型的には４０−５５bp（典型的には約５０）の長さである。場合により、付加的なオリゴヌクレオチドは、共通配列が約１−１．５kbpより大きいときに合成される。全長クローンのためのいくつかのライブラリーをスクリーニングするために、ライブライリーからのＤＮＡを、ＰＣＲプライマー対を用いて、Ausubelら、Current Protocols in Molecular Biologyにより、ＰＣＲ増幅によりスクリーニングした。ついで陽性ライブラリーを、プローブオリゴヌクレオチドとＰＣＲプライマーの一方を用いて対象の遺伝子をコードするクローンの単離のために用いた。
全長クローン源としていくつかのライブラリーをスクリーニングするために、ライブライリーからのＤＮＡを、上記ＰＣＲプライマーペアを用いて、ＰＣＲ増幅によりスクリーニングした。ついで陽性ライブラリーを、プローブオリゴヌクレオチドとＰＣＲプライマーの一方を用いて、ＰＲＯ３０１遺伝子をコードするクローンの単離のために用いた。
ｃＤＮＡライブラリーの構築のためのＲＮＡは、ヒト胎児腎臓より単離した。ｃＤＮＡクローンを単離するために用いられたｃＤＮＡライブラリーは、市販の試薬（例えば、Invitrogen、サンディエゴ、CA；Clontechなど）を用いた標準的な方法により構築した。ｃＤＮＡは、NotI部位を含むオリゴｄTにより開始し、ブラントでSalIヘミキナーゼ化アダプターに連結し、NotIで切断し、ゲル電気泳動でおおよそサイズを合わせ、定められた方向で適当なクローニングベクター（例えばpRKBまたはpRKD；ｐRK5Bは、SfiI部位を含まないpRK5Dの前駆体である；Holmesら、Science,253:1278-1280(1991)参照）内にユニークなXhoIとNotI部位にクローン化した。
ｃＤＮＡはその全てを配列決定した。
天然配列ＤＮＡ４０６２８の全長ヌクレオチド配列を、図６（配列番号：１１）に示す。クローンＤＮＡ４０６２８は、ヌクレオチド位置５２−５４に明らかな翻訳開始部位を有する単一オペロンリーディングフレームを含む（図６；配列番号：１１）。予想されるポリペプチド前駆体は、２９９アミノ酸の長さであり（図７および図８）、推定分子量３２５８３ダルトン、８．２９のｐＩを有している。クローンＤＮＡ４０６２８は、ＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ寄託番号Ｎｏ．２０９４３２が付与されている。
全長配列のBLASTおよびFastA配列アライメント分析（ALIGNコンピュータープログラムを用いて）によれば、ＤＮＡ４０６２８にコードされたＰＲＯ３０１は、Ａ３３抗原前駆体（３３％）とコクサッキーとアデノウィルスレセプタータンパク質（２９％）に対して、アミノ酸配列の同一性を示している。
上記の方法で用いたオリゴヌクレオチド配列は以下の通りであった：
OLI2162(35936.f1) TCGCGGAGCTGTGTTCTGTTTCCC（配列番号：１２）
OLI2163(35936.p1)
TGATCGCGATGGGGACAAAGGCGCAAGCTCGAGAGGAAACTGTTGTGCCT（配列番号：１３）
OLI2164(35936.f2) ACACCTGGTTCAAAGATGGG（配列番号：１４）
OLI2165(35936.r1) TAGGAAGAGTTGCTGAAGGCACGG（配列番号：１５）
OLI2166(35936.f3) TTGCCTTACTCAGGTGCTAC（配列番号：１６）
OLI2167(35936.r2) ACTCAGCAGTGGTAGGAAAG（配列番号：１７）
実施例２
ヒトＰＲＯ３６２をコードするｃＤＮＡの単離
Swiss-Protの公共データベースからの約９５０の既知の分泌タンパク質からの細胞外ドメイン（ECD）配列をESTデータベースの検索に用いた。ESTデータベースは公のデータべース（例えば、Dayhoff、GenBank）、および私有のデータベース（例えばLIFESEQ（商標）、Incyte Pharmaceuticals、Palo Alto、CA）を含んでいた。検索は、コンピュータープログラムBLASTまたはBLAST2（Altschul、およびGish、Methods in Enzymology 266:460-80(1996);http://blast.wustl/edu/blast/README.html）を用いて、EST配列の６フレーム翻訳に対するECDタンパク質配列の比較として行なわれた。既知のタンパク質をコードしていない７０（あるいは、あるケースでは９０）以上のBlastスコアとのそれらの比較を、プログラム”pharap”を用いて、共通ＤＮＡ配列に集めて組み立てた。（Phil Green、ワシントン大学、シアトル、WA；http://bozeman.mbt.washington.edu/pharp.docs/pharp.html）。
phrapを用いて、他のＥＳＴ配列に対して共通ＤＮＡ配列を組み立てた。この共通配列はここではＤＮＡ４２２５７（配列番号：５）と称する（図５参照）。図５に示すＤＮＡ４２２５７（配列番号：５）共通配列に基づき、１）ＰＣＲにより対象の配列を含むｃＤＮＡライブラリーを同定し、２）ＰＲＯ３６２の全長コード配列のクローンを単離するためのプローブとして使用するために、オリゴヌクレオチドを合成した。前進および逆進ＰＣＲプライマーは、通常２０から３０ヌクレオチドの範囲であり、しばしば約１００−１０００bpのＰＣＲ生成物を得るために設計される。プローブ配列は典型的には４０−５５bpの長さである。場合により、付加的なオリゴヌクレオチドは、共通配列が約１−１．５kbpより大きいときに合成される。全長クローンのためのいくつかのライブラリーをスクリーニングするために、ライブライリーからのＤＮＡを、ＰＣＲプライマー対を用いて、Ausubelら、Current Protocols in Molecular Biologyにより、ＰＣＲ増幅によりスクリーニングした。ついで陽性ライブラリーを、プローブオリゴヌクレオチドとＰＣＲプライマーの一方を用いて対象の遺伝子をコードするクローンの単離のために用いた。
ＰＣＲプライマー（前進および逆進）を合成した：
前進ＰＣＲプライマー１（42257.f1）
5'-TATCCCTCCAATTGAGCACCCTGG-3'（配列番号：１８）
前進ＰＣＲプライマー２（42257.f2）
5'-GTCGGAAGACATCCCAACAAG-3'（配列番号：１９）
逆進ＰＣＲプライマー１（42257.r1）
5'-CTTCACAATGTCGCTGTGCTGCTC-3'（配列番号：２０）
逆進ＰＣＲプライマー２（42257.r2）
5'-AGCCAAATCCAGCAGCTGGCTTAC-3'（配列番号：２１）
さらに、以下のヌクレオチド配列を有する、合成オリゴヌクレオチドハイブリダーゼーションプローブを、共通ＤＮＡ４２２５７配列から構築した。
ハイブリダイゼーションプローブ（42257.p1）
5'-TGGATGACCGGAGCCACTACACGTGTGAAGTCACCTGGCAGACTCCTGAT-3'
（配列番号：２２）
全長クローン源としていくつかのライブラリーをスクリーニングするために、ライブライリーからのＤＮＡを、上記ＰＣＲプライマーペアを用いて、ＰＣＲ増幅によりスクリーニングした。ついで陽性ライブラリーを、プローブオリゴヌクレオチドとＰＣＲプライマーの一方を用いて、ＰＲＯ３０１遺伝子をコードするクローンの単離のために用いた。
ｃＤＮＡライブラリーの構築のためのＲＮＡは、ヒト胎児脳組織（ＬＩＢ１５３）より単離した。ｃＤＮＡクローンを単離するために用いられたｃＤＮＡライブラリーは、市販の試薬、例えば、Invitrogen、サンディエゴ、CAからの試薬を用いた標準的な方法により構築した。ｃＤＮＡは、NotI部位を含むオリゴｄTにより開始し、ブラントでSalIヘミキナーゼ化アダプターに連結し、NotIで切断し、ゲル電気泳動でおおよそサイズを合わせ、定められた方向で適当なクローニングベクター（例えばpRKBまたはpRKD；ｐRK5Bは、SfiI部位を含まないpRK5Dの前駆体である；Holmesら、Science,253:1278-1280(1991)参照）内にユニークなXhoIとNotI部位にクローン化した。
上述のように単離したクローンのＤＮＡ配列決定により、単離されたＰＲＯ３６２の全長ＤＮＡ配列を得た[ここではＵＮＱ３１７（ＤＮＡ４５４１６−１２５１）（配列番号：７）と称する]。
天然配列ＵＮＱ３１７（ＤＮＡ４５４１６−１２５１）の全長ヌクレオチド配列を、図７および図８（配列番号：７）に示す。クローンＵＮＱ３１７（ＤＮＡ４５４１６−１２５１）は、ヌクレオチド位置１０８２−１０８４に明らかな翻訳開始部位を有するシングルオペロンリーディングフレームを含む（図７および図８；配列番号：７）。予想されるポリペプチド前駆体は、３２１アミノ酸の長さである（図３、配列番号：２）。図３に示される全長ＰＲＯ３６２タンパク質は、推定分子量３５，５４４ダルトン、８．５１のｐＩを有している。図３（配列番号：２）に示すように、全長ＰＲＯ３６２ポリペプチドの分析は、約アミノ酸１４９から約アミノ酸１５２にグルコサミノグリカン付着部位、約アミノ酸２７６から約アミノ酸３０６にトランスメンブレンドメインの存在を示している。クローンＵＮＱ３１７（ＤＮＡ４５４１６−１２５１）は、ＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ寄託番号Ｎｏ．２０９６２０が付与されている。
実施例３
ヒトＰＲＯ２４５をコードするｃＤＮＡの単離
Swiss-Protの公共データベースからの約９５０の既知の分泌タンパク質からの細胞外ドメイン（ECD）配列をESTデータベースの検索に用いた。ESTデータベースは公のデータべース（例えば、Dayhoff、GenBank）、および私有のデータベース（例えばLIFESEQ（商標）、Incyte Pharmaceuticals、Palo Alto、CA）を含んでいた。検索は、コンピュータープログラムBLASTまたはBLAST2（Altschul、およびGish、Methods in Enzymology 266:460-80(1996);http://blast.wustl/edu/blast/README.html）を用いて、EST配列の６フレーム翻訳に対するECDタンパク質配列の比較として行なわれた。既知のタンパク質をコードしていない７０（あるいは、あるケースでは９０）以上のBlastスコアとのそれらの比較を、プログラム”pharap”を用いて、共通ＤＮＡ配列に集めて組み立てた。（Phil Green、ワシントン大学、シアトル、WA；http://bozeman.mbt.washington.edu/pharp.docs/pharp.html）。
phrapを用いて、他のＥＳＴ配列に対して共通ＤＮＡ配列を組み立てた。この共通配列はここではＤＮＡ３０９５４（配列番号：２７）と称する。ＤＮＡ３０９５４共通配列に基づき、ＰＣＲにより対象の配列を含むｃＤＮＡライブラリーを同定し、ＰＲＯ２４５の全長コード配列のクローンを単離するためのプローブとして使用するために、オリゴヌクレオチドを合成した。
ＰＣＲプライマーのペア（前進と逆進）を合成した：
前進ＰＣＲプライマー
5'-ATCGTTGTGAAGTTAGTGCCCC-3'（配列番号：２８）
逆進ＰＣＲプライマー
5'-ACCTGCGATATCCAACAGAATTG-3'（配列番号：２９）
前進および逆進ＰＣＲプライマーは、通常２０から３０ヌクレオチドの範囲であり、しばしば約１００−１０００bpのＰＣＲ産物を得るために設計される。プローブ配列は典型的には４０−５５bpの長さである。場合により、付加的なオリゴヌクレオチドは、共通配列が約１−１．５kbpより大きいときに合成される。全長クローンのためのいくつかのライブラリーをスクリーニングするために、ライブライリーからのDNAを、ＰＣＲプライマーペアを用いて、Ausubelら、Current Protocols in Molecular Biologyにより、ＰＣＲ増幅によりスクリーニングした。
さらに、以下のヌクレオチド配列を有する、合成オリゴヌクレオチドハイブリダーゼーションプローブを、共通ＤＮＡ３０９５４配列から構築した。
ハイブリダイゼーションプローブ：
5'-GGAAGAGGATACAGTCACTCTGGAAGTATTAGTGGCTCCAGCAGTTCC-3'（配列番号：３０）
全長クローン源としていくつかのライブラリーをスクリーニングするために、ライブライリーからのＤＮＡを、上記ＰＣＲプライマーペアを用いて、ＰＣＲ増幅によりスクリーニングした。ついで陽性ライブラリーを、プローブオリゴヌクレオチドとＰＣＲプライマーの一方を用いて、ＰＲＯ２４５遺伝子をコードするクローンの単離のために用いた。
ｃＤＮＡライブラリーの構築のためのＲＮＡは、ヒト胎児肝組織より単離した。ｃＤＮＡクローンを単離するために用いられたｃＤＮＡライブラリーは、市販の試薬、例えば、Invitrogen、サンディエゴ、CAからの試薬を用いた標準的な方法により構築した。ｃＤＮＡは、NotI部位を含むオリゴｄTにより開始し、ブラントでSalIヘミキナーゼ化アダプターに連結し、NotIで切断し、ゲル電気泳動でおおよそサイズを合わせ、定められた方向で適当なクローニングベクター（例えばpRKBまたはpRKD；ｐRK5Bは、SfiI部位を含まないpRK5Dの前駆体である；Holmesら、Science,253:1278-1280(1991)参照）内にユニークなXhoIとNotI部位にクローン化した。
上述のように単離したクローンのＤＮＡ配列決定により、天然配列ＰＲＯ２４５の全長ＤＮＡ配列を得た[ここではＵＮＱ２１９（ＤＮＡ３５６３８）（配列番号：８）と誘導タンパク質配列（配列番号：９）と称する]。
天然配列ＵＮＱ２１９（ＤＮＡ３５６３８）の全長ヌクレオチド配列を、図９（配列番号：８）に示す。クローンＵＮＱ２１９（ＤＮＡ３５６３８）は、ヌクレオチド位置８９−９１に明らかな翻訳開始部位[Kozakら、上掲]を有し、ヌクレオチド位置１０２５−１０２７の停止コドンで終わるシングルオペロンリーディングフレームを含む（図９；配列番号：８）。予想されるポリペプチド前駆体は、３１２アミノ酸の長さである（図１５）（配列番号：９）。クローンＵＮＱ２１９（ＤＮＡ３５６３８）は、１９９７年９月１７日にＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ寄託番号Ｎｏ．２０９２６５が付与されている。
実施例４
内皮細胞成長のＶＥＧＦ−促進化増殖を阻害する能力
ウシ副腎皮質毛細内皮細胞（ＡＣＥ）細胞（１次培養から、最大１２−１４継代）を９６ウェルマイクロタイタープレート（Amersham Life Science）に、３ｎｇ／ｍＬのＶＥＧＦが添加された、低グルコースＤＭＥＭ、１０％子ウシ血清、２ｍＭグルタミン、１×pen/strept、およびファンギゾン（fungizone）の１００μＬ当たり５００細胞／ウェルの密度で平板培養した。対照は、そのうちいくつかがＶＥＧＦを含まなかった以外は、同様に平板培養した。ＰＲＯ３０１およびＰＲＯ２４５ポリペプチドの試験サンプルを、１００μｌの容量で、最終容量２００μＬとなるように添加した。細胞は、５−７日間３７℃でインキュベートした。培地を吸引し、細胞を１×ＰＢＳで洗浄した。酸性ホスファターゼ反応混合物（１００μＬ、０．１Ｍ酢酸ナトリウム、ｐＨ５、５、０．１％ ＴＲＩＴＯＮ−１００（商標）、１０ｍＭ ｐ−ニトロフェニルホスフェート）を添加した。３７℃２時間のインキュベーションの後、反応を１０μＬ １Ｎ ＮａＯＨの添加により停止した。ＯＤを４０５ｎｍにおいてマイクロタイタープレートリーダーで測定した。対照は：細胞なし、細胞単独、細胞＋ＦＧＦ（５ｎｇ／ｍＬ）、細胞＋ＶＥＧＦ（３ｎｇ／ｍＬ）、細胞＋ＶＥＧＦ（３ｎｇ／ｍＬ）＋ＴＧＦ−β（１ｎｇ／ｍｌ）、細胞＋ＶＥＧＦ（３ｎｇ／ｍＬ）＋ＬＩＦ（５ｎｇ／ｍｌ）。（１ｎｇ／ｍｌ濃度のＴＧＦ−βは、ＶＥＧＦ促進化細胞増殖の７０−９０％を阻害することが知られている）。
その結果を、（１）促進されない細胞に対する、および（２）ＶＥＧＦ促進化活性の参照ＴＧＦ−β阻害に対する、酸性ホスファアーゼ活性のＯＤ４０５ｎｍでの測定により決めた、ＶＥＧＦ（３ｎｇ／ｍｌ）促進化細胞増殖の阻害率を計算することにより評価した。結果は、以下の表１３に示すように、ＰＲＯ３０１およびＰＲＯ２４５ポリペプチドの癌治療での、具体的には癌新脈管形成阻害における有用性を示している。
Figure 0004040004
実施例５
混合リンパ球反応（ＭＬＲ）アッセイにおける刺激活性
本実施例では、本発明のポリペプチドが、刺激されたＴ-リンパ球の増殖の刺激薬として活性であることを示す。リンパ球の増殖を刺激する化合物が、免疫反応を高めることが有益である場合に、治療的に有用である。リンパ球の増殖を抑制する化合物は、免疫反応の抑制が有益である場合に、治療的に有用である。治療薬が、本発明のポリペプチドのアンタゴニスト、例えば、該ポリペプチドに対する齧歯動物−ヒトキメラ、ヒト化もしくはヒト抗体の型であることができる。
このアッセイの基本となるプロトコールは、John Wiley & Sons.社により出版されたCurrent Protocol in Immunology, Unit 3.12, J.E. Coligan. A.M. Kruisbeek. DH Marglies. EM ShevachおよびW Strober. Eds. National Institute of Health.において、記載されている。
さらに詳しくは、アッセイの一態様において、末梢血液単核細胞（ＰＢＭＣ）が、哺乳類個体、例えば、ヒトのボランティアから、白血球搬出法（一方が刺激薬ＰＢＭＣを供給し、もう一方のドナーが応答薬ＰＢＭＣを供給する）により単離された。所望するならば、単離後、胎児牛血清およびDMSO中で、細胞を凍結させる。凍結細胞を、一晩、アッセイ用の培地中（３７℃、５％CO２）で解凍し、次いで、洗浄し、アッセイ用の培地（RPMI:１０％胎児牛血清、１％ペニシリン／ストレプトマイシン、１％グルタミン、１％HEPES、１％非必須アミノ酸、１％ピルビン酸）に３ｘ１０６cells/mlとなるように懸濁する。
刺激薬ＰＢＭＣは、細胞を照射（約３０００Rads）することによって調製する。該アッセイは、混合液：０．１％の１％に希釈された試料１００μｌ；照射された刺激薬細胞５０μｌおよび応答薬PBMC細胞５０μｌを、３連のウェルに播種して調製する。細胞培養培地１００μｌもしくはCD4-IgG１００ｍｌを、対照として用いる。次いで、該ウェルを、４日間、３７℃、５％CO2でインキュベートする。５日目に、各ウェルを、トリチウムチミジン（１．０ｍＣ／ウェル；Amersham）で、十分にパルス標識する。数時間後に、細胞を３回洗浄し、次いでラベルの取り込みを測定する。
このアッセイの別の態様においては、Balb/cマウスとC57B6マウスの脾臓から、ＰＢＭＣを単離する。アッセイ用の培地（RPMI:１０％胎児牛血清、１％ペニシリン／ストレプトマイシン、１％グルタミン、１％HEPES、１％非必須アミノ酸、１％ピルビン酸）中で、新鮮に回収された脾臓から細胞を掻き裂き、得られたこれらの細胞を、Lympholyte M（Organ Teknika）上に重層し、２０００ｒｐｍで２０分間遠心し、アッセイ用培地中に単核細胞層を回収、洗浄し、該細胞を１ｘ１０７cells/mlとなるようにアッセイ用培地に懸濁することによって、PBMCを単離する。次いで、アッセイを上記方法に従って行う。本発明の組成物のアッセイでの結果を、下記の表２に示す。対照を超える正の増加を陽性とみなし、１８０％以上の増加が好ましい。しかしながら、対照を超えた値は、タンパク質試料に対する刺激作用を示す。
［表２］
化合物 濃度 対照を超える
増加パーセント
DNA40628タンパク質（配列番号：１） 0.1% 181.7
DNA40628タンパク質（配列番号：１） 1.0% 187.3
DNA40628タンパク質（配列番号：１） 0.1% 193.4
DNA40628タンパク質（配列番号：１） 1.0% 204.1

DNA45416タンパク質（配列番号：２） 0.1% 87.4
DNA45416タンパク質（配列番号：２） 1.0% 180.2

DNA35638タンパク質（配列番号：９） 0.1% 189.7
DNA35638タンパク質（配列番号：９） 0.1% 193.7
DNA35638タンパク質（配列番号：９） 1.0% 212.5
DNA35638タンパク質（配列番号：９） 1.0% 300.5
実施例６
炎症性細胞のモルモット皮膚への浸潤
以下の実施例では、本発明のポリペプチドが、炎症性細胞（例えば、好中球、好酸球、単球もしくはリンパ球）のモルモット皮膚への浸潤を刺激する前炎症性（proinflammatory）であることを示す。ここに記載されたアッセイは、炎症性細胞のモルモット皮膚への浸潤を誘導する各タンパク質の性能を測定する。炎症性の浸潤を刺激する化合物は、炎症性の応答を高めることが有益である場合に、治療的に有用である。リンパ球の増殖を抑制する化合物は、炎症性の応答を抑制することが有益である場合に、治療的に有用である。本発明のポリペプチドのアンタゴニスト、例えば、該ポリペプチドに対する齧歯動物−ヒトキメラ、ヒト化もしくはヒト抗体を治療薬としてもよい。
体重が３５０グラム以上の無毛のモルモット（Charles River Labs）に、塩酸ケタミン（７５−８０ｍｇ／ｋｇ体重）とキシラジン（５ｍｇ／ｋｇ体重）を用いて、筋間麻酔する。タンパク質試料を、各動物の背中の皮内に、各注入部位当たり１００μｌの用量で注入する。動物一個体当たりの注入部位は、約１６−２４箇所とする。エヴァンスブルー染色液（Evans blue dye）（生理食塩水中１％）を心臓内に注射する。６時間後に動物を安楽死させる。各皮膚の注入部位を生検し、フォルマリンで固定する。該皮膚を組織病理学検査用に調製する。各部位における皮膚への炎症性細胞の浸潤を測定する。可視の炎症性細胞部位を陽性として記録する。炎症性細胞の浸潤を誘導している試料は、前炎症性物質として記録する。
［表３］
化合物 前炎症性活性
DNA40628タンパク質（配列番号：１） +
DNA45416タンパク質（配列番号：２） +
DNA35638タンパク質（配列番号：９） +
陰性コントロール -
実施例７
ヒト好中球との相互作用
以下の実施例では、本発明のポリペプチドと、炎症および炎症応答に伴う分子であるヒト好中球との結合能を示す。
Scan.J.Clin. Lab. Invest. Suppl. 97: 51-76 (1968)に記載されたように、ヒトドナーの血液から単離された好中球（ＰＭＮ）を、DNA40628（以下の実施例で述べたように調製）によってコードされるタンパク質のIg融合体、もしくは陰性コントロールであるヒト化抗体と共にインキュベートした。
該PMNを、マイクロ遠心チューブ中で、１サンプル当たり濃度２ｘ１０６cellとなるようにＰＢＳに懸濁した。該細胞を、冷ＰＢＳを用い、４００ｘｇで２回洗浄した。該PMN細胞を、ＰＢＳに溶かした０．５％BSA（ブロッキング剤）を用い、４℃で１時間ブロッキングした。インキュベート後、該細胞を、さらに２回、ブロッキング剤で洗浄した。最終の洗浄後、該ＰＭＮをペレットとし、DNA４０６２８とコントロール用抗体を各々０．１μｇ／ｍｌ含有するブロッキング緩衝液１ｍｌ中に再度懸濁した。インキュベートは、４℃で２時間行った。該PMN細胞は、１５分毎に、氷上で緩やかに懸濁させ、次いで、ブロッキング緩衝液を用い、４℃で５分間、４００ｘｇで５回、洗浄を繰り返した。次いで、PMN細胞に、ブロッキング緩衝液で１：１０００に希釈したウシ抗ヒトIgG Fc特異的アルカリフォスファターゼ結合抗体を添加した。該ＰＭＮ細胞を、１５分毎に氷上で緩やかに混合しながら、４℃で１時間インキュベートした。次いで、該PMN細胞を、ブロッキング緩衝液で５回洗浄し、アルカリフォスファターゼの適当な基質で再度懸濁し、マイクロプレートに、等しく１００μｌずつ４ウェルに分注した。色の変化をO.D.４０５で読ませた。結果を図２５に示す。
実施例８
ドットブロット組織ハイブリダイゼーション
ヒトRNAマスターブロット（Clontech）を、Expresshyb（商標）緩衝液（Clontech）中で、製造元の説明書に従い、ソラレン−ビオチン標識されたDNA４０６２８ｃＤＮＡプロ−ブ（配列番号：７）１００nMと、６５℃で一晩ハイブリダイズさせた。ストレプトアビジンーアルカリフォスファターゼを、ビオチン標識されたプローブを検出するために用いた。ブロットを、CDP-star基質（Ambion）で現像し、Biomaxフィルム（Kodak）に、様々に時間で露光した。ヒト組織のｃＤＮＡハイブリダイゼーション解析より、図２３に示すように、DNA４０６２８mRNAが、小脳と脊髄を除く多くの組織で発現している。DNA40628mRNAは、結腸、前立腺、胃、卵巣、唾液腺、腎臓、肺、気管および胎盤において、高発現している。
実施例９
遺伝子産物過剰発現
本実施例では、図２４に示された様々なタンパク質をコードする遺伝子が、CRF2-4-/-「ノックアウト」マウスの結腸において過剰発現していることを示す。示された遺伝子産物のアンタゴニスト、例えば、それらに対する齧歯動物−ヒトキメラ、ヒト化もしくはヒト抗体を治療薬とすることができる。
CRF2-4-/-マウス（Spencerら、J.Exp.Med.187,571-578（1998））は、IL-10受容体をコードする遺伝子のサブユニットが除去された動物である。該マウスは、マクロファージの活性化に対するIL-10の抑制制御機能に応答せず、マクロファージのTNF-α分泌を引き起こすリポ多糖体の応答を抑制できない。そして、慢性腺癌へと進行し得る慢性の結腸炎へと進展する。
図２４に示されたタンパク質に対するプローブは、示された遺伝子産物のmRNAテンプレートから作製され、５’−ヌクレアーゼアッセイ（例えば、TaqManTM）およびリアルタイム定量ＰＣＲ（例えば、ABI Priam 7700 Sequence Detection SystemTM (Perkin-Elmer, Applied Biosystems Division. Foster City, CA））で使用される。結果を、デルタＣＴ単位で示す。１単位は、１ＰＣＲサイクル、もしくは常態の約２倍の増幅に相当し、２単位は４倍、３単位は８倍に相当するなど。定量は、プライマーと図２４に示された炎症性関連遺伝子産物試料から得られたTaqManTM蛍光標識mRNAを用いて行った。特異的な核酸配列を含む可能性が高く、イントロンとして除去される可能性が低い、示された遺伝子産物の領域、例えば、３’−未翻訳領域は、プライマーを誘導するのに好ましい。
５’−ヌクレアーゼアッセイの反応は、増幅をリアルタイムで測定するため、Taq DNAポリメラーゼ酵素の５’−エキソヌクレアーゼ活性を用いた蛍光ＰＣＲに基づく技術で行う。２つのオリゴヌクレオチドプライマーを、ＰＣＲ反応で模式的に増幅させるために用いた。第３のオリゴヌクレオチド、もしくはプローブを、２つのＰＣＲプライマーの間に位置する核酸配列を検出するために設計する。該プローブは、Taq DNAポリメラーゼ酵素によって伸長せず、レポータ蛍光染料と消光蛍光染料で標識される。２つの染料がお互いにプローブ上で密接して位置しているならば、レーザにより誘導されるレポーター染料からの発光が消光染料によって消光される。増幅反応時に、プローブは、Taq DNAポリメラーゼ酵素によってテンプレート依存的に分割される。結果、プローブの断片が溶液中に遊離し、遊離したレポータ染料からのシグナルが、第２の蛍光体の消光作用から開放される。レポータ染料の１分子が、新しく合成された各分子から遊離され、消光されていないレポータ染料の検出に基づき、データを定量的に解析する。
５’−ヌクレアーゼの操作は、ABI Prism 7700TM Sequence Detectionなどのリアルタイム定量ＰＣＲ装置で行う。このシステムは、サーモサイクラー、レーザ、電荷結合素子カメラ（ＣＣＤ）およびコンピューターからなる。このシステムは、サーモサイクラー上の９６ウェル版型で試料を増幅する。増幅時に、レーザにより誘導された全９６ウェル分の蛍光シグナルが、光ファイバケーブルを介して、リアルタイムで回収され、CCDで検出される。該システムは、機器を動かし、データを解析するためのソフトウェアーを含む。
５’ヌクレアーゼアッセイのデータは、最初に、Ctもしくはサイクル閾値で表される。これを、バックグラウンドの蛍光強度を超えて、レポータのシグナルが蓄積する時のサイクル数として、限定する。該Ct値を、核酸試料中の特定の標的配列の最初のコピー数に対する相対値を、定量的に評価するために用いる。
mRNAの増幅の結果を図２４に示す。野生型動物における発現を、参照用スタンダードとしてβーアクチンを用いて、CRF2.4 KO動物と比較した。各群において、４匹の動物で評価した。４匹のKO動物全てが、結腸炎と診断され、これらのうちの３匹が、結腸腺癌を有していた。
図２２に示すように、結腸炎を有するCRF2-4-/-マウスの結腸において、JAM mRNAが３．３倍増強している。これらのマウスでは、リンパ球、単球、および好中球を介した一過性の結腸炎が進展しているIL-10受容体のノックアウトマウスである。IL-10は、ある炎症性サイトカインの発現を修飾することにより炎症性の応答を抑制する。
結果のように、PRO301、PRO362およびPRO245は、例えば、炎症性腸疾患など、ヒトの炎症性疾患においても、発現が増強しているようである。
実施例１０
内皮細胞のアポトーシスの誘導
本発明のポリペプチドの内皮細胞におけるアポトーシスの誘導能を、ヒト臍帯静脈内皮細胞（HUVEC、Cell Systems）において試験した。１日目に、９６ウェルマイクロプレート（Amersham Life Science, cytostar-T scintillating microplate. RPNQ160.滅菌、組織培養用に処置、個別包装）に、１０％血清（ＣＧＳ培地、Cell Systems）で、１ウェル当たり総容量１００μｌで２x１０４コの細胞濃度で、細胞を播種した。２日目に、DNA40628とDNA35638によってコードされたPRO301とPRO245ポリペプチドを、１％、０．３３％と０．１１％に希釈して、各々３連で加えた。３日目に、商業用に利用できるキットであるApoptosis Detection kit (R&D Systems, Minnesota）（カルシウムとリン脂質結合タンパクの一種であるアネキシンＶがアポトーシスを検出するために用いられる）を用いて、製造元によって推奨されているプロトコールに従って、PRO301とPRO245ポリペプチドのアポトーシス誘導能を測定した。フルオロセイン（Fluroescein）標識アネキシンＶとプロピディウム(propidium)ヨウ素を、細胞に加えた。解析を、４８８nmの励起光を放射する単一レーザを備えるサイトメータで行った。この試験において、生細胞はいずれのフルオロクロムによっても染色されず、ネクロティック（壊死）細胞が両フルオロクロムで染色され、アポトシスを起こしている細胞がFITC標識アネキシンＶにより唯一染色される。FITC標識アネキシンＶにより生じるシグナルは、FITCシグナル検出器により検出される。結果を下記の表４に示す。
［表４］
試験した化合物 濃度 バックグラウンドの蛍光
を超える％
DNA40628タンパク質（配列番号：１） 0.11% 115.8
DNA40628タンパク質（配列番号：１） 0.33% 199.3
DNA40628タンパク質（配列番号：１） 1.0% 335.6
DNA35638タンパク質（配列番号：９） 0.11% 77.6
DNA35638タンパク質（配列番号：９） 0.33% 143.7
DNA35638タンパク質（配列番号：９） 1.0% 146.0
DNA35638タンパク質（配列番号：９） 6.82nM 67.2
DNA35638タンパク質（配列番号：９） 20.46nM 102.6
DNA35638タンパク質（配列番号：９） 62.0nM 118.8
内皮細胞のアポトーシスを、特に、実施例４で示したような細胞のジャンクション形成の崩壊と組合わせて誘導する本発明のタンパク質化合物の性能は、該化合物が、細胞の接着や移行に役割を果たしていることを示唆している。齧歯動物のJAMと同様に、該化合物は、おそらく上皮および内皮における細胞連結分子であり、これらが広く組織に分散していることの説明がつく。内皮細胞のアポトーシスの誘導の崩壊は、細胞増殖とアポトーシスにおける役割を支持するものである。
実施例１１
インビトロ抗腫瘍アッセイ
本発明のPRO301とPRO362ポリペプチドの抗増殖活性を、本質的には、Skehanら、J. Natl. Cancer. Inst. 82: 1107-1112 (1990)によって記載されたように、スルホローダミンＢ（ＳＲＢ）染料バインディングアッセイを用いた、研究的に、疾患に適応した米国癌協会(NCI)のインビトロ抗癌剤のディスカバリーアッセイにおいて測定した。この研究において用いられた６０種類の腫瘍細胞株（「NCI panel」）が、これらのin vitroでの維持および培養条件と同様に、Monksら、J. Natl. Cancer. Inst. 83 : 757-766 (1991)によって記載されている。このスクリーニングの目的は、まず、異なる型の腫瘍に対する試験組成物の細胞毒性および／もしくは細胞増殖抑制活性を測定することである（Monksら、supra. Boyd. Cancer: Princ. Pract. Oncol. Update 3(10): 1-12 (1989)）。
約６０種のヒト腫瘍細胞株から細胞を、トリプシン／EDTA（Gibco）を用いて回収し、１回洗浄し、IMEMに再度懸濁し、それらの生存率を測定した。細胞懸濁液を、ピペット（１００μｌ容量）で、各々９６ウェルマイクロタイタープレートに分注した。６０日間インキュベート用の細胞濃度は、過剰増殖を抑制するために２０日間インキュベート用のものよりも少なくした。安定化のために３７℃で２４時間プレインキュベートしてから播種した。企図された試験濃度の２倍希釈溶液を、マイクロタイタープレトのウェルに、１００ｍｌ溶液で、タイム０で添加した（１：２希釈）。試験組成物を半対数希釈（１０００から１０００００倍）で評価した。５％CO2環境下、１００％湿度中で、２日間と６日間、インキュベーションを行った。
インキュベーション後、培地を除去し、細胞を０．１ｍｌの１０％トリクロロ酢酸中、４０℃で固定した。プレートを、脱イオン水で５回洗浄し、乾燥し、１％酢酸に溶解した０．４％のスルホローダミンＢ染料（Sigma）０．１ｍｌで３０分間染色し、結合していない染料を除去するために、１％酢酸で４回洗浄し、乾燥し、染色物を０．１ｍｌの１０mMトリス塩基[トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン]、pH10.5を用いて、５分間抽出した。４９２nmにおけるスルホローダミンＢの吸光度（OD）を、コンピューターを仲介させた９６ウェルマイクロタイタープレートリーダを用いて、測定した。
試料は、１以上の濃度で、少なくとも５０％の増殖阻害作用を示す場合に、陽性と見なす。結果を以下の表に示し、表中の略語は以下のとおりである：
NSCL＝非小肺癌
CNS＝中枢神経系
Leuk＝白血病
Figure 0004040004
実施例１２
ＰＲＯ３０１、ＰＲＯ３０２、またはＰＲＯ２４５の、ハイブリダイゼーションプローブとしての使用
以下の方法は、PROポリペプチドをコードする、ハイブリダイゼーションプローブとしての核酸の使用を記載している。
天然配列ＰＲＯ３０１、ＰＲＯ３０２、またはＰＲＯ２４５の各々のコード配列（図６−９、配列番号：１１，７および８）を含むDNAは、ヒト組織ｃＤＮＡライブラリー又はヒト組織ゲノムライブラリーにおける相同性DNA（例えば各ＰＲＯ３０１、ＰＲＯ３０２、またはＰＲＯ２４５の天然に起こる変異体をコードするもの）をスクリーニングするためのプローブとして使用することができる。
どちらかのライブラリーDNAを含むフィルターのハイブリダイゼーションと洗浄は、以下の高ストリンジェントな条件下で行われる。放射性標識したPROポリペプチドコーディング核酸由来のプローブの、フィルターへのハイブリダイゼーションは、50％ホルムアミド、5xSSC、0．1％SDS、0．1％ピロリン酸ナトリウム、50mMリン酸ナトリウム、pH 6．8、2xDenhardt溶液、及び10％硫酸デキストランの溶液内で、42°C、20時間行う。このフィルターの洗浄は、0．1xSSC及び0．1％SDSの水溶液内で42°Cで行う。
全長天然ＰＲＯ３０１、ＰＲＯ３０２、またはＰＲＯ２４５をコードするDNAについて所望の配列相同性を有するDNAは、次いで、当該技術分野で知られる標準的な技術により同定することができる。
実施例１３
大腸菌（E.coli）内でのＰＲＯ３０１、ＰＲＯ３０２、またはＰＲＯ２４５の発現
この実施例は、大腸菌内での組換発現による、ＰＲＯ３０１、ＰＲＯ３０２、またはＰＲＯ２４５の非グリコシル化形態での調製を例示するものである。
ＰＲＯ３０１、ＰＲＯ３０２、またはＰＲＯ２４５をコードするDNA配列をまず、選択したＰＣＲプリマーを使用して増幅させる。このプライマーは、選択した発現ベクター上の制限酵素部位に対応する制限酵素部位を含む必要がある。種々の発現ベクターを使用することができる。適切なベクターの例としては、pBR322（大腸菌由来；Gene, 2:95(1977)を参照）であって、アンピシリン及びテトラサイクリンの耐性遺伝子を含むものがある。ベクターは、制限酵素で消化して脱リン酸化する。ＰＣＲで増幅した配列を次いでベクターへ連結する。ベクターは好ましくは抗生物質耐性遺伝子、trpプロモーター、ポリhisリーダー（最初の6つのSTIIコドン、ポリhis配列、及びエンテロキナーゼ開裂部位を含む）、ＰＲＯ３０１、ＰＲＯ３０２、またはＰＲＯ２４５コード領域、ラムダ転写終了符号、及びargU遺伝子をコードする配列を含むであろう。
次いで連結混合物を使用して、選択した大腸菌株へ形質転換するが、これにはSambrookら（上記）に記載の方法を使用する。形質転換体は、LBプレート上での増殖能力により同定し、抗生物質抵抗性のコロニーを選択する。プラスミドDNAは、制限分析及びDNA配列決定により同定及び確認することができる。
選択したクローンを、抗生物質を補ったLBブロス等の液体培地中で一晩増殖させるてもよい。この一晩培養したものを次いで、より大スケールの培養用の接種用に使用することができる。細胞を次いで所望の光学密度まで増殖させるが、その間に、発現プロモーターをオンにする。
細胞を更に数時間培養した後、細胞を遠心により回収する。遠心して得られた細胞の沈殿物を、当該技術分野で知られる種々の薬剤を使用して可溶化し、可溶化したＰＲＯ３０１、ＰＲＯ３０２、またはＰＲＯ２４５を次いで、金属キレート性カラムをタンパク質との強固な結合を許容する条件下で使用して精製する。
ＰＲＯ３０１は、大腸菌内でポリ−Hisのタグがついた形態で発現することに成功したが、これには以下の方法を用いた。ＰＲＯ３０１をコードするDNAをまず、選択したＰＣＲプライマーで増幅した。このプライマーには選択した発現ベクター上の制限酵素部位に対応した制限酵素部位が含まれ、また効率が良く信頼性のある翻訳開始、金属キレートカラムでの迅速な精製、及びエンテロキナーゼによる蛋白質分解性除去を提供するのに有益な他の配列が含まれる。ＰＣＲで増幅した、ポリ−Hisのタグがついた配列を次に発現ベクターに連結したが、これを使用して52株（W3110 fuhA(tonA) lon galE rpoHts (htpRts) clpP (lacIq)）ベースの大腸菌宿主を形質転換した。形質転換体はまず、50mg／mlのカルベニシリンを含有するLB内で30°CでO．D．600が3乃至5になるまで増殖させた。培養物を次いで、CRAP培地（3.57gの（NH4）2SO4、0．71gのクエン酸ナトリウム・2H2O、1．07gのKCl、5．36gのDifco酵母抽出物、5．36gのSheffield hycase SF (500mLの水中)、更に110mMのMPOS pH7．3、0．55％（w／v）のグルコース、及び7mMのMgSO4を混合して調製）中に50乃至100倍に希釈し、約20乃至30時間、30°Cで震盪しながら増殖させた。試料を取り出してSDS−PAGE分析で発現を確認し、バルクの培養物を遠心して細胞を沈殿させた。細胞沈殿物を精製及び再生を行うまで凍結した。
0．5乃至1リットルの培養物からの大腸菌のペースト（6乃至10gのペレット）を10倍量（w／v）の7Mグアニジン、20mMトリス pH8の緩衝液に再懸濁した。固体の硫酸ナトリウム及びテトラチオン酸ナトリウムを添加して最終濃度をそれぞれ0．1M、及び0．02Mとして、溶液を4°Cで一晩攪拌した。この段階により、蛋白質は全てのシステイン残基がスルフィトライゼーション（sulfitolization）によりブロックされている変性蛋白質となる。この溶液を毎分40，000回転で、ベックマンの超遠心機で30分間遠心した。この上清を3乃至5倍量の金属キレートカラム緩衝液（6Mグアニジン、20mMトリス pH7．4）で希釈し、0．22ミクロンのフィルターに通して浄化した。浄化した抽出物に応じて、金属キレートカラム緩衝駅で平衡化した、5mlのキアゲンNi−NTA金属キレートカラムにかけた。カラムは、50mMイミダゾールを含む付加緩衝液（Calbiochem, Utrol grade）pH7．4で洗浄した。蛋白質は、250mMのイミダゾールを含有する緩衝液で溶出した。所望の蛋白質を含有する画分をプールして4°Cで保存した。蛋白質濃度は、アミノ酸配列に基づいて計算した吸光係数を使用した280nmでの吸光度により推定した。
蛋白質は、以下よりなる調製したての再折畳み緩衝液でゆっくりと希釈して再折畳みを行った：20mMトリス pH8．6、0．3M NaCl、2．5M 尿素、5mM システイン、20mM グリシン、及び1mM EDTA。再折畳みの容量は、蛋白質の最終濃度が50乃至100μg／mlとなるようにした。再折畳み溶液は、4°Cで12乃至36時間ゆっくりと攪拌した。再折畳み反応は、TFAを最終濃度が0．4％となるように添加して（pHが約3）停止した。蛋白質を更に精製する前に、当該溶液を0．22ミクロンフィルターにかけ、アセトニトリルを最終濃度が2乃至10％となるようにして添加した。再折畳みを行った蛋白質を、0．1％TFAの移動緩衝液、10〜80％のアセトニトリルの勾配による溶出を利用した、Poros R1/H逆相カラムでのクロマトグラフィーにかけた。A280吸光の画分の一部をSDS−ポリアクリルアミドゲルで分析し、均一な再折畳み済蛋白質を含む画分をプールした。一般に、多くの蛋白質のうちの適切に再折畳みされた種は、アセトニトリルが最も低い濃度時に溶出されるが、これはこのような種は、その疎水性の内部が逆相樹脂との相互作用から遮蔽されていて最もコンパクトになっているからである。凝集した種は、通常はより高濃度のアセトニトリルで溶出される。誤って折り畳まれた形態の蛋白質を、望ましい形態のものから分割するのみならず、逆相工程はまた、試料中のエンドトキシンを除去する。
所望の折畳み済みのＰＲＯ３０１タンパク質をそれぞれ含んだ画分をプールし、溶液に対して窒素気流を優しく当ててアセトをニトリル除去した。蛋白質は、透析して20mM Hepes pH6．8、0．14M 塩化ナトリウム、及び4％マンニトールに調整するか、又は調整緩衝液で平衡化したG25Superfine（Pharmacia）樹脂でゲル濾過し、濾過滅菌した。
実施例１４
哺乳類細胞におけるＰＲＯポリペプチドの発現
本実施例は、哺乳類細胞内で発現させることによる、ＰＲＯ３０１、ＰＲＯ３０２、またはＰＲＯ２４５のグリコシル化された形態での調製を例示するものである。
pRK5ベクター（1989年3月15日公開のEP 307,247を参照）を発現ベクターとして使用する。適宜、Sambrookら（上記）に記載されるものなどの連結法を利用して、選択した制限酵素を使用してＰＲＯ３０１、ＰＲＯ３０２、またはＰＲＯ２４５ＤＮＡを挿入して、ＰＲＯ３０１、ＰＲＯ３０２、またはＰＲＯ２４５ＤＮＡをpRK5に連結する。得られるベクターは、pRK5−ＰＲＯ３０１、pRK5−ＰＲＯ３０２、またはpRK5−ＰＲＯ２４５と呼ぶ。
一の態様においては、293細胞を宿主細胞として選択することができる。ヒトの293細胞（ATCC CCL1573）は、ウシ胎児血清及び適宜栄養成分及び／又は抗生物質で補ったDMEM等の培養液で、組織培養プレート内で周密的になるまで増殖させた。約10μgのpRK5−ＰＲＯ３０１、pRK5−ＰＲＯ３０２、またはpRK5−ＰＲＯ２４５DNAを、VA RNA遺伝子（Thimmapaya et al., Cell, 31:543 (1982)）をコードする約1μgのDNAと混合し、500μlの1mMトリス−HCl、0．1mM EDTA、0．227M CaCl2に溶解した。この混合物に対して、500μlの50mM HEPES（pH7．35）、280mM NaCl、1．5mM NaPO4、を一滴づつ添加し、25°Cで10分間、沈殿を形成させる。この沈殿物を再懸濁し、293細胞へ添加し、約4時間、37°Cで沈殿させる。培養液を吸引除去し、2mlのPBS中20％グリセロールを30秒間添加する。この293細胞を次いで無血清培地で洗浄し、新鮮な培地を添加して細胞を約5日間インキュベーションする。
形質移入の約24時間後、培養液を除去して培養液（のみ）で置換するか、又は200μCi／mlの35S−システイン及び200μCi／mlの35Sメチオニンを含有する培養液で置換する。12時間のインキュベーション後、馴化培地を回収し、スピンフィルターで濃縮し、15％SDS−ゲルにかける。処理したゲルは、乾燥して設定した時間、フィルムを露出してＰＲＯ３０１、ＰＲＯ３０２、またはＰＲＯ２４５ポリペプチドの存在を明らかにすることができる。形質移入細胞を含む培養物はさらに、（無血清培地で）インキュベーションして、この培地を選択したバイオアッセイで試験することもできる。
代替技術によりＰＲＯ３０１、ＰＲＯ３０２、またはＰＲＯ２４５ＤＮＡは、Somparyracら（Proc. Natl. Acad. Sci., 12:7575 (1981)）の記載する硫酸デキストラン法を使用して、293細胞内に一過性に導入することができる。293細胞を、スピナーフラスコ内で最大濃度まで増殖させ、700μgのpRK5−ＰＲＯ３０１、pRK5−ＰＲＯ３０２、またはpRK5−ＰＲＯ２４５DNAを添加する。細胞をまず、遠心により濃縮して、PBSで洗浄する。DNA−デキストラン沈殿物を細胞のペレットとともに4時間インキュベーションする。細胞を20％のグリセロールで90秒間処理し、組織培養培地で洗浄し、細胞培地、5μg／mlウシインシュリン、及び0．1μg／mlのウシトランスフェリンを含有するスピナーフラスコに再導入する。約4日後、馴化培地を遠心して細胞及びその断片を除去する。発現ＰＲＯ３０１、ＰＲＯ３０２、またはＰＲＯ２４５ポリペプチドを含む試料を次いで、例えば透析及び／又はカラムクロマトグラフィー等の選択した方法により濃縮・精製する。
別の態様において、ＰＲＯ３０１、ＰＲＯ３０２、またはＰＲＯ２４５は、CHO細胞内で発現することもできる。pRK5−ＰＲＯ３０１、pRK5−ＰＲＯ３０２、またはpRK5−ＰＲＯ２４５を、例えばＣａＰＯ４やDEAEデキストラン等の既知の試薬を使用してＣＨＯ細胞へ形質移入することができる。上記したように、細胞培養物をインキュベーションして、培地を培養液（のみ）、又は３５Ｓ−メチオニン等で放射性標識した培地で置換する。ＰＲＯ３０１、ＰＲＯ３０２、またはＰＲＯ２４５ポリペプチドの存在を確認した後、培地を無血清培地で置換する。好ましくは、培養物は約６時間インキュベーションし、次いで馴化培地を回収する。発現したＰＲＯ３０１、ＰＲＯ３０２、またはＰＲＯ２４５を含む培地を次いで、何らかの方法を選択して濃縮・精製することができる。
エピトープのタグのついたＰＲＯ３０１、ＰＲＯ３０２、またはＰＲＯ２４５もまた、ＣＨＯの宿主細胞内で発現することができる。ＰＲＯ３０１、ＰＲＯ３０２、またはＰＲＯ２４５は、pRK5ベクターからサブクローニングすることもできる。このサブクローンインサートは、ＰＣＲにより選択したエピトープ、例えばポリ−hisのタグとフレームを合わせ、バキュロウイルス発現ベクターへ融合させることができる。このポリ−hisのタグのついたＰＲＯ３０１、ＰＲＯ３０２、またはＰＲＯ２４５は次いで、SV40駆動性ベクターであってDHFR等の、安定クローンの選択用の選択標識を含むものへサブクローニングすることができる。最後に、このCHO細胞をSV40駆動性のベクターで（上記したようにして）形質移入することができる。発現したポリ−Hisのタグの付いたＰＲＯ３０１、ＰＲＯ３０２、またはＰＲＯ２４５を含む培養物は次いで、例えばNi2+-キレート親和クロマトグラフィー等の何らかの選択した方法により濃縮・精製することができる。
一過性及び安定性の発現方法の何れにおいても、CHO細胞内で、ＰＲＯ３０１、ＰＲＯ３０２、またはＰＲＯ２４５を発現することに成功した。
ＣＨＯ細胞内での安定性発現には、以下の方法を利用した。蛋白質をＩｇＧ（免疫付着素）構築物として発現し（ここで、それぞれの蛋白質の可溶型（例えば細胞外領域）のコード配列は、ヒンジ、ＣＨ２及びCH2ＣＨ２領域を含むＩｇＧ１定常領域配列に融合している）、及び／又はポリ−Hisのタグの付いた形態で発現した。
ＰＣＲ増幅の後、それぞれのＤＮＡを、Ausubelらに記載されるようにして（Current Protocols of Molecular Biology, Unit3.16, John Wiley and Sons (1997)）CHO発現ベクターへサブクローニングした。ＣＨＯ発現ベクターは、挿入部のDNAの5’及び3’と適合する制限部位を有するように構築されていて、ｃＤＮＡの便利なシャトル化を行えるようになっている。ＣＨＯ細胞内での発現に使用されるベクターは、Lucasら（Nucl. Acids Res. 24:9 (1774-1779 (1996)）に記載されるものであり、ＳＶ４０の初期プロモーター／エンハンサーを使用していて、注目しているｃＤＮＡ及びジヒドロフォレート・リダクターゼ（DHFR）の発現を行うようになっている。DHFR発現により、形質移入後にプラスミドを安定に維持しているものを選択することが可能になる。
12μgの所望のプラスミドＤＮＡは、商業的に入手可能な形質移入試薬でああるSuperfect* (Qiagen)、Dosper*又はFugene*(Boehringe Mannheim)を使用して、約1，000万のＣＨＯ細胞へ導入した。細胞をLucasら（上記）が記載するようにして増殖させた。約3×107の細胞を、将来の増殖及び生産のために、以下のようにしてアンプル中に凍結する。
プラスミドＤＮＡを含むアンプルを水浴中で解凍し、渦動混合した。内容物をピペットで、10mLの選択培地を含んだ遠心管に移し、毎分1000回転で5分間遠心した。上清を吸引除去し、細胞を10mLの選択培地（0．2μmのフィルター済PS20、ダイアフィルター済（diafiltered）5％ウシ胎児血清含有）に再懸濁した。次いで細胞を90mLの選択培地を含有する100mLのスピナーにその一部を移した。1−2日後、細胞は、150mLの選択性増殖培地を含む250mLのスピナーに移し、37°Cでインキュベーションした。更に2−3日後、500mL及び2000mLのスピナーを3×105細胞／mLで接種した。細胞培地は、遠心して生産培地中に再懸濁することにより新鮮な培地と置換した。適切なCHO培地は如何なるものをも使用することができるが、1992年6月16日発行の米国特許第5，122，469号に記載される生産培地が実際には使用された。3Lの生産用スピナーを1．2×106細胞／mLで接種した。0日目に細胞数とpHを決定した。1日目に、スピナーのサンプリングを行い、濾過空気での噴霧（sparging）を開始した。2日目に、スピナーをサンプリングして温度を33°Cにシフトさせ、500g／Lのフルコースを30mL、及び10％泡止め剤を0．6mL（例えば35％のポリジメチルシロキサンエマルジョン、ダウコーニング365メディカルグレードエマルジョン）とした。生産中はたえず、pHを7．2付近に維持する必要があるので調節した。10日後、又は生存度が70％未満にまで低下したら、細胞培養物を遠心により回収して、0．22μmフィルターで濾過した。濾過物を4°Cで保存するか、又は精製用カラムにすぐにかけた。
ポリ−Hisのタグの付いた構築物の場合、Ni−NTAカラム（Qiagen）を使用して、蛋白質の精製を行った。精製前に、イミダゾールを馴化培地に5mMとなるように添加した。この馴化培地は、20mM Hepes pH7．4緩衝液（0．3M NaCl、及び5mMイミダゾール含有）で平衡化した6mlのNi−NTAカラムに、ポンプを使用して4°C、流速4−5ml／分で導入した。充填後、カラムを更に平衡化緩衝液で洗浄し、蛋白質を0．25Mのイミダゾール含有平衡化緩衝液で溶出した。この高度に精製された蛋白質は、25ml G25Superfine (Pharmacia)カラムで10mM Hepes、0．14M NaCl、及び4％マンニトールを含有する緩衝液（pH6．8）に脱塩し、−80°Cで保存した。
免疫付着因子（Fc含有）構築物は、馴化培地より以下のようにして精製した。馴化培地は、20mMリン酸ナトリウム緩衝液 pH6．8で平衡化した5mlのプロテインAカラム（Pharmacia）にポンプで導入した。充填後、カラムを平衡化緩衝液で十分に洗浄し、その後、100mMクエン酸 pH3．5で溶出した。溶出した蛋白質は、その1mlの画分を275μlの1Mトリス緩衝液 pH9を含有する試験管内に回収することによりすぐに中和させた。この高度に精製された蛋白質を次いで、上記のポリ−Hisのタグの付いた蛋白質用の保存緩衝液へと脱塩した。均一性は、SDS−ポリアクリルアミドゲル及びエドマン分解によるN末アミノ酸配列決定により調べた。
COS細胞内で、ＰＲＯ３０１、ＰＲＯ３０２、またはＰＲＯ２４５を一過性に発現することができた。
実施例１５
酵母中でのPROポリペプチドの発現
以下の方法は、酵母中での、ＰＲＯ３０１、ＰＲＯ３０２、またはＰＲＯ２４５の組換発現を記載したものである。
まず、酵母発現ベクターを、ADH2／GAPDHプロモーターより、ＰＲＯ３０１、ＰＲＯ３０２、またはＰＲＯ２４５の細胞内生産又は分泌用に構築する。ＰＲＯ３０１、ＰＲＯ３０２、またはＰＲＯ２４５をコードするDNA、選択したシグナルペプチド、及びプロモーターを選択したプラスミド中の適切な制限酵素部位に挿入して、ＰＲＯ３０１、ＰＲＯ３０２、またはＰＲＯ２４５の細胞内発現をさせる。分泌用には、ＰＲＯ３０１、ＰＲＯ３０２、またはＰＲＯ２４５をコードするDNAを選択したプラスミドへ、ADH2／GAPDHプロモーター、酵母アルファ因子分泌シグナル／リーダー配列、及び（必要ならば）ＰＲＯ３０１、ＰＲＯ３０２、またはＰＲＯ２４５の発現用のリンカー配列とともにクローニングすることができる。
例えば酵母株AB110等の酵母細胞は、上記したような発現プラスミドで形質移入することができる。形質転換した酵母の上清は、10％トリクロロ酢酸で沈殿してSDS−PAGE、それに引き続くゲルのクマシーブルー染料での染色により分析することができる。
組換体ＰＲＯ３０１、ＰＲＯ３０２、またはＰＲＯ２４５は引き続いて、酵母細胞を培養液より遠心で除去し、選択したカートリッジフィルターで濃縮することにより単離・精製することができる。ＰＲＯ３０１、ＰＲＯ３０２、またはＰＲＯ２４５を含有する濃縮物は。カラムクロマトグラフィーの樹脂を選択して更に精製することができる。
実施例１６
バキュロウイルス感染昆虫細胞内におけるＰＲＯ３０１、ＰＲＯ３０２、またはＰＲＯ２４５の発現
以下の方法は、バキュロウイルス感染昆虫細胞でのＰＲＯ３０１、ＰＲＯ３０２、またはＰＲＯ２４５組換発現を記載している。
ＰＲＯ３０１、ＰＲＯ３０２、またはＰＲＯ２４５をバキュロウイルス発現ベクターのエピトープタグの上流に融合させる。このようなエイトープタグには、ポリ−hisタグや（IgGのFc領域のような）免疫グロブリンタグがある。種々のプラスミドを使用することができるが、これには商業的に入手可能なプラスミド、例えばpVL1393（Novagen）などに由来するものがある。簡潔にいうと、ＰＲＯ３０１、ＰＲＯ３０２、またはＰＲＯ２４５又はＰＲＯ３０１、ＰＲＯ３０２、またはＰＲＯ２４５の所望の部分（例えば経膜蛋白質の細胞外領域をコードする配列等）を5’及び3’領域に相補的なプライマーでもってＰＣＲにより増幅させる。5’プライマーは、間に挟まれた（選択した）制限酵素部位を含むことができる。その産物を次いで、その選択した制限酵素で消化し、発現ベクター中へサブクローニングする。
組換バキュロウイルスは、上記のプラスミドとBaculoGold（商標）ウイルスDNA（Pharmingen）とをSpodoptera frugipedra(“Sf9”)細胞（ATCC CRL1711）へ、リポフェクチン（GIBCO−BRLより商業的に入手可能）を使用して共形質転換して作り出される。28°Cで4乃至5日間インキュベーションした後、放出されたウイルスを回収して更なる増殖に使用する。ウイルス感染及び蛋白質発現は、O'Reilleyら（Baculovirus expression vectors: A laboratory Manual, Oxford: Oxford University Press (1994)）に記載されるようにして行う。
発現したポリ−hisタグの付いたＰＲＯ３０１、ＰＲＯ３０２、またはＰＲＯ２４５は次いで、例えばNi2+−キレート親和性クロマトグラフィーで、以下のようにして精製することができる。抽出物は組換ウイルスに感染したSf9細胞より、Rupertら（Nature, 362:175-179 (1993)）が記載したようにして調製する。簡潔にいうと、Sf9細胞を洗浄し、超音波処理緩衝液（25mM Hepes pH7．9、12．5mM MgCl2、0．1mM EDTA、10％グリセロール、0．1％NP−40、0．4M Kcl）中に再懸濁し、氷上で20秒間、2回、超音波処理する。超音波処理物を遠心して、その上清を充填用緩衝液（50mMリン酸塩、300mM NaCl、10％グリセロール、pH7．8）で50倍に希釈し、0．45μmのフィルターに通す。Ni2+−NTAアガロースカラム（Qiagenより商業的に入手可能）を5mLのベッド容量で用意し、25mLの水で洗浄し、25mLの充填用緩衝液で平衡化する。濾過済の細胞抽出物を毎分0．5mLでカラムにのせる。カラムは、 A280がベースラインになるまで充填用緩衝液で洗浄し、その点から画分の回収を開始する。次に、カラムを二次洗浄緩衝液（50mMリン酸塩、300mM NaCl、10％グリセロール、pH6．0）で洗浄するが、これにより非特異的に結合した蛋白質が溶出する。再びA280のベースラインになった後、カラムを二次洗浄緩衝液中の0乃至500mMのイミダゾール勾配で展開する。1mLの画分を回収してSDS−PAGE及び銀染色又はアルカリホスファターゼに共役したNi2+−NTA（Qiagen）を利用したウェスターンブロッティングで分析する。溶出したHis10のタグ付ＰＲＯ３０１、ＰＲＯ３０２、またはＰＲＯ２４５をプールし、充填用緩衝液に対して透析する。
或いは、IgGタグ付（又はFcタグ付）ＰＲＯ３０１、ＰＲＯ３０２、またはＰＲＯ２４５の精製は、既知のクロマトグラフィー技術（例えばプロテインAやプロテインGカラムクロマトグラフィーを含む）を利用して行うこともできる。
ＰＲＯ３０１、ＰＲＯ３０２、またはＰＲＯ２４５は、バキュロウイルス感染Sf9又はhigh5昆虫細胞内で発現することに成功した。発現は0．5乃至2Lのスケールで行ったが、より大規模（8L）へとスケールアップすることは容易である。蛋白質は、IgG構築物（免疫付着因子）として発現されたが、ここで、この蛋白質の細胞外領域は、IgG1の定常領域配列であって、ヒンジ領域、CH2領域、及びCH3領域を含むものに融合し、及び／又はポリ−Hisタグ付の形態である。
ＰＣＲ増幅後、それぞれのコード配列をバキュロウイルス発現ベクター（IgGとの融合にはpb.PH.IgG、ポリ−Hisタグ付蛋白質にはpb.PH.His.c）へとサブクローニングし、ベクター及びBaculoGold（商標）バキュロウイルスDNA（Pharmingen）を105のSpodoptera frugiperda（“Sf9”）細胞（ATCC CRL1711）へ、リポフェクチン（Gibco BRL）を使用して共形質転換した。pb.PH.IgG及びpb.PH.Hisは、商業的に入手可能なバキュロウイルス発現ベクターであるpVL1393（Pharmingen）を修飾したものであるが、これはポリリンカー領域を修飾してHis又はFcタグ配列を含むようにしたものである。細胞は、10％FBS（Hyclone）で補足したHinkのTNM−FH培地で増殖させた。細胞を28°Cで5日間インキュベーションした。上清を回収し、次いで感染多重度（MOI）を約10にして、10％FBSで補足したHinkのTNM−FH培地内のSf9細胞に感染させて、第一回目のウイルス増幅に使用した。細胞を28°Cで3日間インキュベーションした。上清を回収し、バキュロウイルス発現ベクター中の構築物の発現は、1mlの上清を、ヒスチジンタグ付蛋白質の場合には25mlのNi−NTAビーズ（Qiagen）、又はIgGタグ付蛋白質の場合にはプロテインAセファロースCL−4B（Pharmacia）とバッチ式で結合させ、引き続いてSDS−PAGE、クマシーブルー染色を行い、既知の濃度の標準蛋白質との比較により決定した。
第一回目のウイルス増幅の上清を使用して、 MOIを約0．1にして、Sf9細胞をESF−921培地（Expression Systems LLC）で増殖させたスピナー培養物（500ml）を感染させた。細胞を28°Cで3日間インキュベーションさせた。上清を回収し、濾過した。バッチ式の結合及びSDS−PAGE分析を必要に応じて繰返し、スピナー培養物の発現を確認した。
感染済細胞の馴化培地（0．5乃至3L）を遠心により回収し、細胞を除去して0．22ミクロンのフィルターに通した。ポリ−Hisタグ付構築物の場合、蛋白質構築物は、Ni−NTAカラム（Qiagen）を使用して精製した。精製を行う前に、イミダゾールを馴化培地に添加して5mMにする。馴化培地を20mM Hepes pH7．4（0．3M NaCl及び5mM イミダゾール含有）で平衡化した6mlのNi−NTAカラムに、ポンプを使用して4°Cで毎分4乃至5mlの流速で充填する。充填後、カラムを平衡化用緩衝液で洗浄し、蛋白質は0．25Mのイミダゾールを含有する平衡化緩衝液で溶出する。高度に精製された蛋白質をついで、25mlのG25Superfineカラム（Pharmacia）を使用して10mM Hepes、0．14M NaCl、4％マンニトール、pH6．8の保存緩衝液へと脱塩し、−80°Cで保存する。
免疫付着因子（Fc含有）蛋白質構築物は、馴化培地より以下のようにして精製した。20mMのリン酸ナトリウム緩衝液 pH6．8で平衡化しておいた5mlのプロテインAカラム（Pharmacia）に、馴化培地をポンプで充填する。充填後、カラムを平衡化緩衝液で十分に洗浄し、その後100mMのクエン酸 pH3．5で溶出する。溶出した蛋白質は、275μ（m）Lの1Mトリス緩衝液 pH9を含んだ1mlのチューブ内に回収してすぐに中和した。高度に精製された蛋白質を次いで、上記のポリ−Hisタグ付蛋白質用の保存緩衝液に対して脱塩した。蛋白質の均一性は、SDSポリアクリルアミドゲル（PEG）電気泳動及びエドマン分解によりN末アミノ酸配列決定により確認した。
ＰＲＯ３０１、ＰＲＯ３６２、およびＰＲＯ２４５は、同様の方法を用いたバキュロウィルス感染Ｈｉｇｈ５細胞でも発現される。Ｈｉｇｈ５細胞は、２７℃、ＣＯ２なし、ペニシリン無添加、ストレプトマイシン無添加で集密度５０％まで増殖される。各１５０ｍｍプレートに、３０μｇのＰＲＯ３０１、ＰＲＯ３６２、またはＰＲＯ２４５を含むｐＩＥベースベクターを１ｍｌのＥｘ−セル培地（培地：Ｅｘ−セル４０１、１/１００Ｌ−Ｇｌｕ JRH Bioscience、＃14401-78P、ただし培地は光感受性）と混合し、別のチューブに、１００μｌのセルフェクチン（GibcoBRL＃10362-010）を１ｍｌのEc-セル培地と混合した。ｐＩＥ１-１およびｐＩＥ１-２ベクターを、安定形質転換昆虫細胞中でバキュロウィルスie１プロモーターからの組換えタンパク質の構成的な発現のためにデザインした（Cartier.J.L.ら、J.Viol.68,7728-7737(1994)）。プラスミドは、多重クローニング部位の方向のみが異なっており、hr5エンハンサー成分と同様に非感染昆虫細胞でのie1仲介遺伝子発現のために重要であると知られているすべてのプロモーター配列を含む。ｐＩＥ１−１およびｐＩＥ１−２はie1翻訳開始部位を含み、融合タンパク質を生産するために用いられることができる。
２つの溶液を合わせて、室温にて１５分間インキュベートした。８ｍｌのEx-セル培地を、２ｍｌのＤＮＡ／セルフェクチン（CellFectin）混合物に添加し、Ex―セル培地で予め洗浄したＨｉｇｈ５細胞上に積層した。プレートを暗所にて１時間室温でインキュベートした。ＤＮＡ／セルフェクチン混合物を吸引し、細胞をＥｘ−セルで一度洗浄して余分なセルフェクチンを除去した。新鮮なＥｘ−セル培地（３０ｍｌ）を添加して、細胞を３日間２８℃でインキュベートした。上清を集めて、Ｓｆ９細胞において記載された方法と同様にして、バッチ結合によって、ＰＲＯ３０１、ＰＲＯ３６２、またはＰＲＯ２４５の発現を測定した。
実施例１７
ＰＲＯ３０１、ＰＲＯ３０２、およびＰＲＯ２４５に結合する抗体の調製
この実施例は、ＰＲＯ３０１、ＰＲＯ３０２、およびＰＲＯ２４５に特異的に結合することができるモノクローナル抗体の調製を例証する。
モノクローナル抗体を産生する技術は、当該技術分野において周知であり、例えば、Goding（上掲）に記載されている。用いられる免疫原は、精製されたＰＲＯ３０１、ＰＲＯ３０２、およびＰＲＯ２４５、ＰＲＯ３０１、ＰＲＯ３０２、およびＰＲＯ２４５を含む融合タンパク、並びに細胞表面に組み換えＰＲＯ３０１、ＰＲＯ３０２、およびＰＲＯ２４５を提示する細胞を含む。免疫原の選択は、過度の実験を要することなく当業者によって実施される。
Balb/cのようなマウスが、完全フロイントアジュバント中に乳化されたＰＲＯ３０１、ＰＲＯ３０２、まおよびＰＲＯ２４５免疫原で免疫され、１−１００マイクログラムの量で皮下または腹膜内に注射される。あるいは、この免疫原はＭＰＩ-ＴＤＭアジュバント（Ribi Immunochemical Research, Hamilton, MT）に乳化され、動物の後ろ足に注入される。免疫されたマウスは、選択されたアジュバントに乳化されたさらなる免疫原を用いて１０ないし１２日後にブーストされる。その後、数週間、マウスは、さらなる免疫注射でブーストされてもよい。血清サンプルは、ＰＲＯ３０１、ＰＲＯ３０２、およびＰＲＯ２４５抗体を検出するためにＥＬＩＳＡアッセイで試験するための後眼窩採血(retro-orbital bleeding)によりマウスから定期的に得ることができる。
適切な抗体力価が検出された後、抗体に“陽性”の動物は、ＰＲＯポリペプチドの最終的な静脈注射により注射されてもよい。３−４日後、このマウスがと殺され、脾臓細胞が回収される。脾臓細胞は、ATCC、No.CRL1597から入手できるP3X63AgU.1のような選別されたマウスミエローマ細胞系に融合（３５％ポリエチレングリコールを用いて）される。融合体はハイブリドーマ細胞を生じ、非融合細胞、ミエローマハイブリッド、および脾臓細胞ハイブリッドの増殖を阻害するためにＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン、およびチミジン）培地を含む９６ウェル組織培養プレートにプレートされ得る。
ハイブリドーマ細胞は、ＰＲＯ３０１、ＰＲＯ３０２、およびＰＲＯ２４５に対する反応性についてＥＬＩＳＡで選別される。ＰＲＯ３０１、ＰＲＯ３０２、およびＰＲＯ２４５に対する所望のモノクローナル抗体を分泌する“陽性”ハイブリドーマ細胞の決定は、当業者の技術範囲である。
陽性ハイブリドーマ細胞は、抗ＰＲＯ３０１、抗ＰＲＯ３０２、または抗ＰＲＯ２４５モノクローナル抗体を含む腹水を産生するために同系のBalb/cマウスに腹膜内注入されてもよい。あるいは、このハイブリドーマ細胞は、組織培養フラスコまたはローラーボトルで生育することもできる。腹水中に産生されたモノクローナル抗体の精製は、硫安沈殿、ゲル排除クロマトグラフィーを用いて実施することができる。あるいは、プロテインＡまたはプロテインＧに対する抗体の結合に基づくアフィニティークロマトグラフィーを用いることができる。
材料の寄託
以下の材料は、American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD, USA (ATCC)に寄託されている：
表示 ATCC寄託番号 寄託日
pRK5ベースプラスミドDNA40628-1216 209432 1997年11月7日
DNA45416-1251 209620 1998年2月5日
DNA35638-1141 209265 1997年9月16日
これらの寄託物は、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約の規定およびそれに基づく規則の下で作製された。これは、寄託日から３０年間、寄託物の生存可能な培養物の維持を保証する。寄託物はブダペスト条約の下でＡＴＣＣにより入手可能であり、Genentech, Inc.とＡＴＣＣとの間の合意を得ることを条件として、直接関係する米国特許の発行、もしくは米国またはその他の国の特許出願の公開に基づいて、公衆に寄託物の培養物の子孫の永久的かつ無制限の利用可能性を保証し、そして、その子孫の入手を、３５ ＵＳＣ 第１２２条およびそれに準ずる長官規則（特に８８６ＯＧ６３８に関して３７ ＣＦＲ 第１．１４条を含む）に従って付与される米国特許商標庁長官によって定められた者に保証する。
本願の代理人は、寄託物の培養物が適切な条件下で培養された場合に死滅または損なわれた場合には、この材料を速やかに同一物で置き換えることに同意した。寄託材料の利用可能性は、その国の特許法に従って政府の権力の下に付与された権利に違反して本発明を実施するライセンスとして解釈されない。
上記明細書は、当業者が本発明を十分に実施できるものと解する。寄託された実施態様は、本発明の一部の態様の単なる例示に過ぎないこと、並びに、機能的に等価なあらゆる構成物が本発明の範囲に含まれることから、本発明は、寄託された構成物により、範囲が制限されるものではない。ここに言う材料の寄託は、上記記述が、その最良の形態を含めた本発明のあらゆる態様の実施を可能にするのに不適切であることの承認、あるいは、それが示す特定の例示に請求の範囲を限定すると解釈されるとの承認を構成するものではない。実際に、ここに記載または示されたものに加えて、本発明の種々の変更が、上記記載から当業者にとって明白になり、添付された請求の範囲内に含まれる。
図１は、Ａ３３抗原（配列番号：６）、ＤＮＡ４０６２８（配列番号：１）、ＤＮＡ４５４１６（配列番号：２）、ＤＮＡ３５６３８（配列番号：９）、およびＪＡＭ（配列番号：１０）によってコードされたポリペプチドの間の比較を示す。 図２は、天然配列ＰＲＯ３０１ポリペプチドの誘導アミノ酸配列（配列番号：１）を示す。このポリペプチドは２９９アミノ酸の長さであり、残基１から２７にシグナル配列、残基２８から約２３５に細胞外ドメイン、残基９４から２３５にＩｇスーパーファミリー相同性、残基２３６から約２５８に可能性のあるトランスメンブレンドメイン、約残基２５９から２９９に細胞内ドメインを有している。 図３は、図７および図８（ＤＮＡ４５４１６、配列番号：７）に示されるヌクレオチド配列のヌクレオチド１１９−１０８１に由来するアミノ酸配列（配列番号：２）を示す。図３で下線で示したものは、グリコソアミノグリカン（glycosoaminoglycan）部位とトランスメンブレンドメインの位置である。 ４Ａは、コンセンサスアセンブリＤＮＡ３５９３６（配列番号：３）を示し、４Ｂはconsen01（配列番号：４）を示す。これらの両方がＤＮＡ４０６２８（配列番号：１１）の単離のために用いられた。 図５は、consen02（ＤＮＡ４２２５７）（配列番号：５）を示し、これはＤＮＡ４５４１６（配列番号：７）の単離において用いられた。 図６は、天然配列ＤＮＡ４０６２８ｃＤＮＡ（配列番号：１１）のヌクレオチド配列を示し、これは、「ＵＮＱ２６４」および／または「ＤＮＡ４０６２８−１２１６」とも表示される天然配列ＰＲＯ３０１ｃＤＮＡである。 図７は、ヌクレオチド配列ＤＮＡ４５４１６（配列番号：７）を示し、これは、「ＵＮＱ３１７」および／または「ＤＮＡ４５４１６−１２５１」とも表示される天然配列ＰＲＯ３６２ｃＤＮＡである。全長ＰＲＯ３６２ポリペプチド（配列番号：２）のための開始メチオニンおよびタンパク質翻訳も示される。 図７の続きである。 図９は、天然配列ＰＲＯ２４５ｃＤＮＡのヌクレオチド配列を示し、これは、「ＵＮＱ２１９」および／または「ＤＮＡ３５６３８」とも表示されるヌクレオチド配列である。 図１０は、OLI2162(35936.f1) （配列番号１２）、OLI2163(35936.p1) （配列番号：１３）、OLI2164(35936.f2) （配列番号１４）、OLI2165(35936.r1) （配列番号１５）、OLI2166(35936.f3) （配列番号１６）、OLI2167(35936.r2) （配列番号１７）のオリゴヌクレオチド配列を示し、これらはＤＮＡ４０６２８の単離に用いられた。 図１１は、下線で示した、５つのオリゴヌクレオチドプライマーの位置と共に、ＤＮＡ４２２５７（consen02）（配列番号：５）の二重らせん表示を示す。これらはすべてDNA４５４１６（配列番号：７）の単離に用いられた。示されているオリゴヌクレオチドは、42257.f1（配列番号：１８）、42257.f2（配列番号：１９）、42257.r1（配列番号：２０）、42257.r2（配列番号：２１）、42257.p1（配列番号：２２）である。 図１１の続きである。 図１３と図１４は、Blastスコア、DNA４０６２８とA33 HUMAN、ヒトＡ３３抗原前駆体の２つの重なるフラグメントの間のマッチまたはパーセント相同性アラインメントを記載している。図１３は、ＤＮＡ４０６２８（配列番号：２３）のヌクレオチド位置１２１から８１６で開始するコードされた残基とＡ３３ ＨＵＭＡＮ（配列番号：２４）のヌクレオチド位置１７から２８４で開始するコードされた残基とを比較している。 図１４は、ヌクレオチド１１２から８１０で開始するコードされた残基と、ヌクレオチド１２から２８４で開始するコードされた残基とを、各々比較している。 図１５は、図９（ＤＮＡ３５６３８、配列番号：８）のヌクレオチド配列によってコードされている天然配列ＰＲＯ２４５ポリペプチド（配列番号：９）の誘導アミノ酸配列を示す。 図１６は、ＤＮＡ４０６２８（配列番号：１）とＡ３３抗原（配列番号：６）によってコードされているアミノ酸配列との間の２５．３％同一性を示している。 図１７は、ＤＮＡ４５４１６（配列番号：２）とＡ３３抗原（配列番号：６）によってコードされているアミノ酸配列との間の２０．８％同一性を示している。 図１８は、ＤＮＡ３５６３８（配列番号：９）とＡ３３抗原（配列番号：６）によってコードされているアミノ酸配列との間の２４．３％同一性を示している。 図１９は、ＤＮＡ４０６２８（配列番号：１）とＪＡＭ（配列番号：１０）によってコードされているアミノ酸配列との間の６７．６％同一性を示している。 図２０は、ＤＮＡ４５４１６（配列番号：２）とＪＡＭ（配列番号：１０）によってコードされているアミノ酸配列との間の２３．３％同一性を示している。 図２１は、ＤＮＡ３５６３８（配列番号：２９）とＪＡＭ（配列番号：１０）によってコードされているアミノ酸配列との間の３４．２％同一性を示している。 図２２は、Ａ３３抗原（配列番号：６）とＪＡＭ（配列番号：１０）によってコードされているアミノ酸配列との間の２６％同一性を示している。 図２３は、実施例８に記載されたドットブロットハイブリダイゼーション法の結果を示す。 図２０は、実施例９に記載されたTaqman ｍＲＮＡ発現アッセイの結果を示す。 図２５は、実施例７に記載されたＤＮＡ４０６２８によってコードされたタンパク質のヒト好中球との結合を示す。

Claims (4)

  1. （ａ）哺乳動物から得られる組織細胞の試験サンプルにおいて、及び（ｂ）同じ細胞タイプの既知の正常な組織細胞のコントロールサンプルにおいて、図１５（配列番号：９）の全長アミノ酸配列と少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチドをコードする遺伝子の発現のレベルを検出し、試験サンプルにおいて該コントロールサンプルにおけるよりも高い発現レベルが前記哺乳動物における炎症性疾患の存在を示すことを含む、哺乳動物における炎症性疾患の診断において支援するための方法。
  2. （ａ）哺乳動物から得られる組織細胞の試験サンプルにおいて、及び（ｂ）同じ細胞タイプの既知の正常な組織細胞のコントロールサンプルにおいて、図１５（配列番号：９）の全長アミノ酸配列と少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチドをコードする遺伝子の発現のレベルの検出において支援するための方法であって、試験サンプルにおいて該コントロールサンプルにおけるよりも高い発現レベルが前記哺乳動物における炎症性疾患の存在を示す、方法。
  3. 前記同一性のレベルが少なくとも９５％である請求項１または２に記載の方法。
  4. 前記ポリペプチドが図１５（配列番号：９）に示されたアミノ酸配列を有する請求項３に記載の方法。
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