JP4039664B2

JP4039664B2 - Stable reagent containing ketoamine oxidase

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Publication number: JP4039664B2
Application number: JP2002295624A
Authority: JP
Inventors: 卓司高妻
Original assignee: Asahi Kasei Pharma Corp
Current assignee: Asahi Kasei Pharma Corp
Priority date: 2002-10-09
Filing date: 2002-10-09
Publication date: 2008-01-30
Anticipated expiration: 2022-10-09
Also published as: JP2004129531A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、糖化タンパク質を酵素を用いて測定する試薬に於いて、ケトアミンオキシダーゼを安定化する試薬及び安定化方法に関するものである。より詳細には、糖化ヘモグロビン、糖化アルブミンのごとき糖化タンパク質の定量に有効な、ケトアミンオキシダーゼの安定化試薬及び安定化方法に関するものである。本発明は臨床検査の分野において有用である。
【０００２】
【従来の技術】
近年、糖尿病患者は爆発的に増加しており、ヘモグロビンＡ１ｃ（ＨｂＡ１ｃ）、グリコアルブミン、フルクトサミン、1.5アンヒドログルシトールなどの血糖コントロールマーカーの測定の需要が増加している。なかでもタンパク質中の糖化タンパク質割合で示されるＨｂＡ１ｃ、グリコアルブミンは、個人差が少なく、タンパク質濃度の影響を受けないことから、多用されている。ＨｂＡ１ｃ、グリコアルブミンはこれまで高速液体クロマトグラフ法（ＨＰＬＣ法）や免疫法で測定されてきたが、最近、大量検体を迅速に処理することか可能であり、かつ正確な酵素法が開発されてきた（特許文献１、特許文献２、特許文献３、特許文献４等）。また、本発明者らも正確に糖化タンパク質を測定する目的で、プロテアーゼのグロブリン成分への作用を選択的に阻害する方法（特許文献５）、糖化タンパク質割合の測定方法（特許文献６）を開発してきた。
【０００３】
一般に臨床検査の分野に広く使用されるために、また正確な測定値を保証する為には、試薬の製造初期性能はもちろんのこと、保存時の試薬の安定性が重要である。本発明者らはこれらの問題点を解決する目的で、ケトアミンオキシダーゼの安定化方法の検討を重ね、糖アルコール、水溶性マグネシウム塩、水溶性カルシウム塩、硫安、アミノ酸、ザルコシンによるケトアミンオキシダーゼの安定化方法を開発してきた（特許文献７）。但し最近の検討では、アスコルビン酸オキシダーゼ等の特殊な物質が共存する場合に、これらの安定化剤を添加してもケトアミンオキシダーゼの安定性が確保できないことが判明した。
アスコルビン酸オキシダーゼ等の特殊な物質が共存する場合のケトアミンオキシダーゼの安定化方法に関する安定化剤および安定化方法はこれまで知られていない。
【０００４】
【特許文献１】
特開平６−４６８４６号公報
【特許文献２】
特開平５−１９２１９３号公報
【特許文献３】
ＷＯ９８／４８０４３号公報
【特許文献４】
ＷＯ９７／１３８７２号公報
【特許文献５】
特開２００１−５４３９８号公報
【特許文献６】
特開２００１−２０４４９５号公報
【特許文献７】
ＷＯ０２／０６１１１９号公報
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
以上のとおり、本発明の課題は、安定なケトアミンオキシダーゼ含有試薬を提供すること及びケトアミンオキシダーゼを安定化する方法を提供することにある。さらに具体的には臨床生化学検査における安定なケトアミンオキシダーゼ試薬及び試薬中のケトアミンオキシダーゼの安定化方法を提供することにある。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
上記の目的を達成するために、本発明者は、如何にすれば効果的にケトアミンオキシダーゼ含有試薬を安定化できるか検討を行った。
本発明者らは鋭意検討した結果、ケトアミンオキシダーゼが不安定になる要素として、金属イオン、特に銅、亜鉛、マンガン、コバルト、ニッケル、カドミウム、水銀等のイオンの共存が強く関与していることを突き止めた。これらの悪影響は例えば銅イオンを分子内に保持するアスコルビン酸オキシダーゼ等を添加した場合に強く観察された。通常では酵素が保持している金属が、共存するその他の酵素に影響を与えるとは考えにくく、極めて意外な発見であった。
【０００７】
そこで本発明者は、キレート剤を共存させ、金属イオンの悪影響を回避することを試みた。本発明のケトアミンオキシダーゼ、アスコルビン酸オキシダーゼ及びキレート剤よりなる処方においては、この処方のケトアミンオキシダーゼ含有試薬が、液状−冷蔵保存にて、１年以上安定であること、さらに意外なことに、キレート剤の添加により銅イオンを分子内に保持するアスコルビン酸オキシダーゼの酵素活性の消失や不安定化がおこらないことを見出し本発明の完成に至った。
【０００８】
すなわち、本発明は、ケトアミンオキシダーゼ含有試薬にキレート剤を共存させることにより、効率的にケトアミンオキシダーゼを安定化する試薬及びケトアミンオキシダーゼの安定化方法に関する。さらに詳しくは、臨床生化学検査における糖化蛋白質の測定に有用な試薬、及び安定化方法に関する。
【０００９】
すなわち、本発明は、次の安定なケトアミンオキシダーゼ含有試薬及びケトアミンオキシダーゼを安定化する方法に関する。
(1) ケトアミンオキシダーゼ及びキレート剤を含有する、ケトアミンオキシダーゼ含有試薬。
(2) ケトアミンオキシダーゼ、金属イオンを含有する物質及びキレート剤を含有する、ケトアミンオキシダーゼ含有試薬。
(3) 金属イオンを含有する物質が、酵素である上記(2)記載の試薬。
(4) 試薬が、糖化タンパク質の定量に用いるものである、上記(1)〜(3)のいずれかに記載の試薬。
(5) 糖化タンパク質が、糖化ヘモグロビン又は糖化アルブミンである、上記(4)に記載の試薬。
(6) キレート剤をケトアミンオキシダーゼと共存させることよりなるケトアミンオキシダーゼの安定化方法。
(7) キレート剤をケトアミンオキシダーゼ及び金属イオンを含有する物質と共存させることよりなるケトアミンオキシダーゼの安定化方法。
(8) 金属イオンを含有する物質が、酵素である上記(6)又は(7)に記載の方法。
(9) 試薬が、糖化タンパク質の定量に用いるものである上記(6)〜(8)のいずれかに記載の方法。
(10) 糖化タンパク質が、糖化ヘモグロビン又は糖化アルブミンである上記(9)に記載の方法。
【００１０】
以下この発明の構成及び好ましい形態について更に詳しく説明する。
本発明に使用しうるケトアミンオキシダーゼとしては糖化アミノ酸及び／又は糖化ペプチドに良好に作用し、過酸化水素を生成するケトアミンオキシダーゼであればいかなる酵素を用いても良いが、糖化アルブミンを測定対象とする場合には、εアミノ基が糖化されたε糖化アミノ酸若しくはペプチドに作用する酵素が好ましく、糖化ヘモグロビンを測定対象とする場合には、αアミノ基が糖化されたα糖化アミノ酸若しくはペプチドに作用する酵素が好ましい。
【００１１】
εアミノ基が糖化された糖化アミノ酸に作用する酵素の例としては、ギベレラ（Gibberella）属、アスペルギルス（Aspergillus ）属、カンジダ（Candida ）属、ペニシリウム（Penicillium ）属、フサリウム（Fusarium）属、アクレモニウム（Acremonium）属又はデバリオマイゼス（Debaryomyces）属由来のケトアミンオキシダーゼ等が挙げられる。
【００１２】
αアミノ基が糖化された糖化アミノ酸若しくはペプチドに作用する酵素の例としては、上記αアミノ基が糖化された糖化アミノ酸に作用する酵素及びコリネバクテリウム（Corynebacterium ）由来の酵素が挙げられる。
また、αアミノ基が糖化された糖化アミノ酸若しくはペプチドに特異的に作用し、実質的にεアミノ基が糖化された糖化アミノ酸には作用しない酵素としてはコリネバクテリウム（Corynebacterium ）由来の酵素が知られている。一方εアミノ基が糖化された糖化アミノ酸若しくはペプチドに特異的に作用し、実質的にαアミノ基が糖化された糖化アミノ酸には作用しない酵素としては遺伝子操作フルクトサミンオキシダーゼ（FODVII；旭化成社製；PCT/JP02/0072）が知られている。
【００１３】
さらに、αアミノ基及びεアミノ基が糖化された糖化アミノ酸若しくはペプチドに作用し、プロテアーゼと共存させた状態でも充分な活性を有する酵素の例としては、遺伝子組み替え型フルクトサミンオキシダーゼ（FODII；旭化成社製）が挙げられる。
【００１４】
糖化アミノ酸に作用する酵素の活性は特開2001-20449号公報（糖化タンパク質割合測定方法）記載の方法にて測定し、37℃-1 分間に1μmolの過酸化水素を生成する酵素量を1Uと定義した。
【００１５】
本発明に使用しうるキレート剤としては、ケトアミンオキシダーゼの安定性を損なう金属イオンをキレートし、ケトアミンオキシダーゼの安定性を向上させるものであれば如何なる物質を用いても良い。好ましいキレート剤の例としてはエチレンジアミン４酢酸(EDTA)およびその塩、trans-1,2-diaminocyclohexane
-N,N,N’,N’-tetraacetic acid, monohydrate (CyDTA),N,N-bis (2-hydroxyethyl)glycine (DHEG), 1,3-diamino-2-hydroxypropane
-N,N,N’,N’-tetraaceticacid (DPTA-OH), Diethylenetriamine
-N,N,N’,N’’,N’’-pentaacetic acid (DTPA), Ethylenediamine-N,N’-dipropionic acid, dihydrochloride (EDDP), Ethylenediamine-N,N’-bis (methylenephoephonic acid), hemihydrate (EDDPO),N-(2-Hydroxyethyl) ethylenediamine-N,N’,N’-triacetic acid (EDTA-OH), Ethylenediamine
-N,N,N’,N’-tetrakis (methylenephosphonic acid (EDTPO), O,O’-Bis(2-aminoethyl)ethleneglycol-N,N,N’,N’-tetraacetic acid (GEDTA),
N’,N’-Bis(2-hydroxybenzyl)ethylenediamine-N,N-diacetic acid (HBED),
1,6-Hexamethylenediamine-N,N,N’,N’-tetraacetic acid (HDTA), N-(2-Hydroxyethyl)iminodiacetic acid (HIDA),Iminodiacetic acid (IDA), 1,2-Diaminopropane-N,N,N’,N’-tetraacetic acid (Methyl-EDTA),
Nitrilotriacetic acid (NTA), Nitrilotripropionic acid (NTP),Nitrilotris(methylenephoshonic acid),trisodium salt (NTPO), Triethylenetetramine
-N,N,N’,N’’,N’’’,N’’’-hexaacetic acid (TTHA)
等が挙げられる。
【００１６】
EDTAの塩としては、２ナトリウム塩、３ナトリウム塩、４ナトリウム塩、２カリウム塩、３カリウム塩、２リチウム塩、２アンモニウム塩、等が挙げられる。
【００１７】
本発明に使用しうる金属イオンを含有する物質としてはケトアミンオキシダーゼの安定性を損なう金属イオンを含有していれば何れの物質も該当する。金属イオンとしては、例えば特に銅、亜鉛、マンガン、コバルト、ニッケル、カドミウム、水銀等の金属イオンが悪影響を及ぼすことが知られている。
【００１８】
一方、特にケトアミンオキシダーゼを用いた試薬において特筆すべきことは、アスコルビン酸が少量混入するだけで、測定値に影響を受けることから、アスコルビン酸オキシダーゼを処方するケースが増えている。アスコルビン酸オキシダーゼは酵素１分子中に８個の銅を含み特にケトアミンオキシダーゼの不安定化を引き起こしやすい。同様な理由でアルコールデヒドロゲナーゼ（酵素１分子に亜鉛原子を２個含む）、ヘキソースオキシダーゼ（酵素１分子に銅原子を１２個含む）、グリセロール３リン酸デヒドロゲナーゼ（酵素１分子に鉄原子を１個含む）、キサンチンデヒドロゲナーゼ（酵素１分子にモリブデン原子を２個含む）、アルデヒドオキシダーゼ（酵素１分子に鉄原子を８個、モリブデン原子を２個含む）、キサンチンオキシダーゼ（酵素１分子に鉄原子を８個、モリブデン原子を２個含む）、スクシネートデヒドロゲナーゼ（酵素に鉄原子を含む）、アミンオキシダーゼ（酵素１分子に銅原子を２個含む）、ザルコシンオキシダーゼ（酵素に鉄原子を含む）、ジメチルグリシンオキシダーゼ（酵素に鉄原子を含む）、ザルコシンデヒドロゲナーゼ（酵素に鉄原子を含む）、ジメチルグリシンデヒドロゲナーゼ（酵素に鉄原子を含む）、ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ（酵素に鉄原子を含む）、ウリカーゼ（（酵素に鉄若しくは銅原子を含む）、ナイトレートレダクターゼ（酵素１分子に銅原子を４個含む）、グルタチオンパーオキシダーゼ（酵素１分子にセレン原子を４個含む）、アミノペプチダーゼ（酵素１分子に亜鉛原子を２個含む）、ジペプチダーゼ（酵素１分子に亜鉛原子を１個含む）、ジペプチジルカルボキシペプチダーゼ酵素１分子に亜鉛原子を１個含む）、微生物由来メタロプロテアーゼ（酵素１分子に亜鉛原子を含むことが多い。サーモリシン、プロナーゼ、など）、スーパーオキサイドジスムターゼ（酵素１分子に銅及び亜鉛原子を各１個含む）、クレアチニンアミドハイドロラーゼ（酵素１分子に亜鉛原子を１個含む）、等も金属を含む酵素として挙げることが出来る。
【００１９】
本発明に使用しうるアスコルビン酸オキシダーゼとしては、被検液に含まれるアスコルビン酸に有効に作用するものであればいかなるものを用いても良いが、例えば植物又は微生物由来のアスコルビン酸オキシダーゼ等が挙げられる。具体的な例を以下に示すがこれらは１例に過ぎず、なんら限定されるものではない。
【００２０】
植物由来のアスコルビン酸オキシダーゼの例としては、キュウリ由来（アマノ社製、東洋紡社製）およびカボチャ由来（ロシュ社製、東洋紡社製）が挙げられる。
微生物由来のアスコルビン酸オキシダーゼの例としてはアクレモニウム（Acremonium）由来（旭化成社製）、微生物由来（アマノ社製）が挙げられる。
【００２１】
アスコルビン酸オキシダーゼの活性は下記の方法にて測定される。
＜＜アスコルビン酸オキシダーゼの活性測定法＞＞
＜保存基質溶液＞
Lアスコルビン酸（和光純薬社製）176mgとＥＤＴＡ（第一化学薬品社製）37mgを1mM塩酸100mlで溶解する。
＜反応試薬混合液＞
上記の保存基質溶液を0.45mMのEDTAを含む90mM 燐酸2カリウム−5mM燐酸1ナトリウム緩衝液で20倍に希釈する。
【００２２】
＜操作＞
上記の反応試薬混合液1mlを小試験管に入れ、30℃-5分間予備加温した後、適当に希釈した酵素液0.10mlを添加して攪拌し、反応を開始する。正確に5分間反応の後に0.2N塩酸水溶液3.0mlを添加して反応を停止し、波長245nmの吸光度を測定する(As)。またブランクとして上記の反応液1mlを小試験管に入れ、30℃-5分間予備加温した後、0.2N塩酸水溶液3.0mlを添加して反応を停止する。適当に希釈した酵素液0.10mlを添加して攪拌し、波長245nmの吸光度を測定する(Ab)。この酵素作用の吸光度(As)と盲検の吸光度(Ab)の吸光度差(Ab-As)より酵素活性を求める。30℃-1 分間に1μM のアスコルビン酸をデヒドロアスコルビン酸に酸化する酵素量を1Uと定義する。計算式を下記に示す。
【００２３】
【数１】

【００２４】
10.0：ｐH1.0の条件でアスコルビン酸の245ｎｍに於けるミリモル分子吸光係数
5：反応時間（min）
4.01：反応液総量 (ml)
0.10：反応に供した酵素試料液量
Ｂ：酵素液の希釈倍率
【００２５】
また本発明はケトアミンオキシダーゼに限らずこれらの金属化合物により安定性を損なう全ての酵素に対して有効である。
【００２６】
本発明のケトアミンオキシダーゼ含有試薬を用いて測定する対象である糖化蛋白質としては、例えば糖化アルブミン又は糖化ヘモグロビンが挙げられるが、測定対象となる糖化蛋白質は何らこれらに限定されるものではなく、何れの糖化蛋白質を測定しても良い。
【００２７】
本発明のケトアミンオキシダーゼ含有試薬を用いて糖化タンパク質を測定するには糖化タンパク質をプロテアーゼ等により糖化アミノ酸若しくは糖化ペプチドレベルまで分解し、ケトアミンオキシダーゼ含有試薬を作用させ、糖化アミノ酸を酸化し、生成するグルコソン又は過酸化水素を測定すれば良く、また減少する酸素を公知の方法で測定すればよい。使用し得るプロテアーゼとしては、臨床検査に使用できるものであればいかなるプロテアーゼを用いても良い。特に糖化タンパク質を測定する場合には、被検液に含まれる糖化蛋白質に有効に作用し、かつ当該蛋白質由来の糖化アミノ酸及び／又は糖化ペプチドを有効に生成するものであればいかなるものを用いても良い
【００２８】
本発明のキレート剤を共存させたケトアミンオキシダーゼ含有試薬については、キレート剤及びケトアミンオキシダーゼを同一試薬に含有するように組成を決定すれば良い。
【００２９】
また妨害物質の消去系を組み込む場合、例えば糖化アミノ酸を消去した後に糖化タンパク質を測定する場合は、第一試薬にケトアミンオキシダーゼ含有試薬を用い、第二試薬にプロテアーゼ及びカップラーを処方すれば良い。アスコルビン酸、過酸化水素の消去系を組み込む場合には、第１試薬のケトアミンオキシダーゼ含有試薬に例えばアスコルビン酸オキシダーゼ、パーオキシダーゼ等を処方すれば良い。
【００３０】
本発明に使用し得るキレート剤の濃度としては1μM〜500ｍMの濃度で使用すれば良く、好ましくは10μM〜200ｍM、最も好ましくは50μM〜100ｍMであるがこれ以外の量を用いても良い。本発明に使用し得るケトアミンオキシダーゼの濃度としては0.1〜500U/mlの濃度で使用すれば良く、好ましくは0.5〜200 U/ml、最も好ましくは1.0〜100 U/mlであるがこれ以外の量を用いても良い。
【００３１】
金属イオンを含有する物質の濃度は、例えばアスコルビン酸オキシダーゼの場合には濃度としては0.1〜500U/mlの濃度で使用すれば良く、好ましくは0.5〜200 U/ml、最も好ましくは1.0〜100 U/mlであるがこれ以外の量を用いても良い。
【００３２】
本発明を用いて糖化タンパク質を測定する場合のプロテアーゼの濃度としては0.1U〜1MU/mlの濃度で使用すれば良く、好ましくは1U〜500KU/ml、最も好ましくは5U〜100KU/mlであるがこれ以外の量を用いても良い。
【００３３】
本発明のキレート剤を共存させたケトアミンオキシダーゼ含有試薬を用いて被検液中の糖化タンパク質を測定する場合には、一定量の被検液0.1〜1000μl程度に、金属イオンの影響を消失させるに十分な量のキレート剤を共存させたケトアミンオキシダーゼ含有試薬、例えば1.0〜5000μl程度を1〜60分程度作用させれば良く、これ以外の量や時間を選択しても良い。この場合被検液はプロテアーゼ等によりアミノ酸、ペプチドレベルまで分解された処理液でも良く、また上記反応後にプロテアーゼ試薬を作用させ、定量を行っても良い。後者の場合には被検液中のフリーの糖化アミノ酸を消去することが出来る。
【００３４】
以上のことから、本発明に於けるキレート剤を共存させたケトアミンオキシダーゼ含有試薬としては、キレート剤及びケトアミンオキシダーゼを含有するものとして調製すれば良く、例えば液状品及び液状品の凍結物あるいは凍結乾燥品として提供できる。
【００３５】
また本発明を、電極等を用いた、例えば過酸化水素の定量に応用することも可能である。
さらに本発明に基づくキレート剤を共存させたケトアミンオキシダーゼ含有試薬には、例えば界面活性剤、塩類、緩衝剤、ｐＨ調製剤や防腐剤などを適宜選択して添加しても良い。
【００３６】
【発明の実施の形態】
次に、本発明の実施例を詳しく述べるが、本発明は何らこれにより限定されるものではない。
実施例１
＜ケトアミンオキシダーゼの安定性に及ぼすキレート剤添加の効果＞
＜ケトアミンオキシダーゼ含有試薬＞
＜反応液組成Ａ＞
30mM トリス緩衝液（和光純薬社製）pH7.5
10U/ml ケトアミンオキシダーゼII（ＫＡＯＤII；旭化成社製）
±10U/ml アスコルビン酸オキシダーゼ（ロシュ社製）
±0.5mM ＥＤＴＡ（和光純薬社製）
【００３７】
＜反応液組成Ｂ＞
30mM トリス緩衝液（和光純薬社製）pH7.5
10U/ml ケトアミンオキシダーゼII（ＫＡＯＤII；旭化成社製）
±0.1mM 塩化銅（和光純薬社製）
±0.5mM ＥＤＴＡ（和光純薬社製）
アスコルビン酸オキシダーゼ、塩化銅又はＥＤＴＡの±は、これらの化合物を添加した場合と、添加しない場合とを示す。
【００３８】
＜方法＞
上記試薬を調製し、３７℃１週間保存した。保存後ケトアミンオキシダーゼの残存活性を測定した。結果を表１に示す。
【００３９】
【表１】

【００４０】
表1から分かるように、ケトアミンオキシダーゼが金属を含有する物質と共存すると、ケトアミンオキシダーゼの安定性が顕著に悪くなり、さらにキレート剤を添加することにより安定性が回復することが明白であった。
【００４１】
実施例２
＜ケトアミンオキシダーゼ含有試薬の安定性に及ぼすキレート剤の濃度の影響＞
＜ケトアミンオキシダーゼ含有試薬＞
30mM トリス緩衝液（和光純薬社製）pH7.5
10U/ml ケトアミンオキシダーゼII（ＫＡＯＤII；旭化成社製）
10U/ml アスコルビン酸オキシダーゼ（ロシュ社製；カボチャ由来）
0〜2mM ＥＤＴＡ（和光純薬社製）
1.3ｍM TOOS(同人化学研究所社製)
【００４２】
＜発色試薬＞
150mM トリス緩衝液（和光純薬社製）pH7.5
4000U/ml バチルス属由来プロテアーゼ（プロテアーゼタイプXXVII；シグマ社製）
5mM 4-アミノアンチピリン(和光純薬社製)
20U/ml パーオキシダーゼ(シグマ社製)
【００４３】
＜反応手順＞
上記ケトアミンオキシダーゼ含有試薬180μlおよび試料（管理血清又はプール血清）9μlをセルに分注し37℃-5分間インキュベーションし555nmを測光(A0)した。続いて発色試薬180μlを添加し37℃-5分間インキュベーションし555nmを測光し(A1)、試料の吸光度変化（ΔA=A1-A0）を求めた。一方、試料の代わりに蒸留水を用いてブランクの吸光度変化（ブランクΔA=A1ブランク-A0ブランク）を測定し、ブランク引きの試料の感度（ΔA-ブランクΔA）を求めた。
試薬を37℃−1週間保存し、測定の感度を求めた。その結果を表２に示す。
【００４４】
【表２】

【００４５】
表２から分かるように、キレート剤を入れることにより試薬の安定性が向上していることが明白である。キレート剤の濃度は必要量入っていれば十分であることが判明した。
【００４６】
実施例３
＜キレート剤を含有するケトアミンオキシダーゼ含有試薬を用いた糖化アルブミンの測定試薬＞
【００４７】
＜R-1;ケトアミンオキシダーゼ含有試薬＞
30mM トリス緩衝液（和光純薬社製）pH7.5
10U/ml ケトアミンオキシダーゼII（ＫＡＯＤII；旭化成社製）
10U/ml アスコルビン酸オキシダーゼ（ロシュ社製；カボチャ由来）若しくは（旭化成社製；微生物；アクレモニウム由来）
0.5mM ＥＤＴＡ（和光純薬社製）
1.3ｍM TOOS(同人化学研究所社製)
【００４８】
＜R-2;発色試薬＞
150mM トリス緩衝液（和光純薬社製）pH7.5
4000U/ml バチルス属由来プロテアーゼ（プロテアーゼタイプXXVII；シグマ社製）
5mM 4-アミノアンチピリン(和光純薬社製)
20U/ml パーオキシダーゼ(シグマ社製)
【００４９】
<R-3 アルブミン測定試薬> アルブミン測定キット(アルブミンII-HAテストワコー; 和
光純薬社製)にて測定した。
【００５０】
＜ＨＰＬＣ法＞
グリコアルブミン計（ＧＡＡ−２０００；アークレイ社製）使用
【００５１】
＜試料＞健常者血清５検体、患者血清５検体
【００５２】
＜反応手順＞
上記試薬は３７℃１週間保存した後に使用した。上記ケトアミンオキシダーゼ含有試薬180μlおよび試料9μlをセルに分注し37℃-5分間インキュベーションし555nmを測光した(A0)。続いて発色試薬180μlを添加し37℃-5分間インキュベーションし555nmを測光し(A1)、
試料の吸光度変化（ΔA=A1-A0）を求めた。一方、試料の代わりに蒸留水を用いてブランクの吸光度変化（ブランクΔA=A1ブランク-A0ブランク）を測定し、ブランク引きの試料の感度（ΔA-ブランクΔA）を求めた。グリコアルブミン濃度は、濃度既知の管理血清と試料のブランク引き感度を比較することにより算出した。
【００５３】
一方アルブミンの測定はアルブミン測定キット(アルブミンII-HAテストワコー; 和光純薬社製)の用法用量に従って測定した。ＧＡ値はグリコアルブミン濃度をアルブミン濃度で除し、割合換算した。その結果を表３に示す。
【００５４】
【表３】

【００５５】
表３から分かるように、ケトアミンオキシダーゼおよびキレート剤を含有するケトアミンオキシダーゼ含有試薬は安定であり、３７℃１週間という過酷な条件で保存しても、ＨＰＬＣ法と値が一致し、正確にグリコアルブミンを測定していることが明白であった。さらに、カボチャ由来及び微生物；アクレモニウム由来アスコルビン酸オキシダーゼのどちらを用いても同様の結果が得られた。
【００５６】
実施例４
＜キレート剤を含有するケトアミンオキシダーゼ含有試薬を用いた糖化ヘモグロビンの測定＞
＜R1;ケトアミンオキシダーゼ含有試薬＞
30mM トリス緩衝液（和光純薬社製）pH7.5
10U/ml ケトアミンオキシダーゼII（ＫＡＯＤII；旭化成社製）
10U/ml アスコルビン酸オキシダーゼ（ロシュ社製；カボチャ由来）
0.5mM ＥＤＴＡ（和光純薬社製）
1.3ｍM TOOS(同人化学研究所社製)
【００５７】
＜R2;プロテアーゼ試薬＞
150mM トリス緩衝液（和光純薬社製）pH7.5
4000U/ml ストレプトマイセス属由来プロテアーゼ（プロテアーゼタイプXIV；シグマ社製）
【００５８】
＜R3;発色試薬＞
150mM トリス緩衝液（和光純薬社製）pH8.0
5mM 4-アミノアンチピリン(和光純薬社製)
0.12% TOOS(同人化学研究所社製)
24U/ml ケトアミンオキシダーゼII（旭化成社製）
20U/ml POD(シグマ社製)
【００５９】
＜試料＞市販ヘモグロビン（シグマ社製）５０ｍｇ／ｍｌ
ＨｂＡ１ｃ値はHbA1c測定装置（アークレイ社製）にて測定した。
【００６０】
＜反応手順＞
試薬は上記R1試薬を３７℃1週間保存後測定した。上記R1試薬0.9mlおよび試料90μlを混合し、37℃10分反応を行う。続いて、分子量１万カットの膜で濾過し、ろ液にR2試薬0.9mlを混合し、37℃-２時間反応させた。分子量１万カットの膜で濾過し、ろ液をプロテアーゼ反応溶液とした。プロテアーゼ反応溶液189μlをセルに分注し555nmを測光した(A0)。続いてR3試薬180μlを添加し37℃-5分間インキュベーションし555nmを測光した(A1)。ブランクの測定は、試料に蒸留水を用いてブランクの吸光度変化（ブランクΔA=A1ブランク-A0ブランク）を測定した。また試料に検体及び糖化ヘモグロビン値既知の試料を用いて感度（感度ΔA=（A1-A0）-ブランクΔA ）を求め、糖化ヘモグロビン濃度を算出した。さらに糖化ヘモグロビン濃度をヘモグロビン濃度で除し、糖化ヘモグロビン値を算出した。その結果を表４に示す。
【００６１】
【表４】

【００６２】
表４から分かるように、ケトアミンオキシダーゼおよびキレート剤を含有することを特徴とするケトアミンオキシダーゼ含有試薬は安定であり、３７℃１週間という過酷な条件で保存しても、ＨＰＬＣ法と酵素法の値が一致し、正確にグリコヘモグロビンを測定していることが明白であった。
【００６３】
実施例５
＜ケトアミンオキシダーゼの安定性に及ぼすキレート剤種類の効果＞
＜ケトアミンオキシダーゼ試薬＞
30mM トリス緩衝液（和光純薬社製）pH7.5
10U/ml ケトアミンオキシダーゼ（旭化成社製）
10U/ml アスコルビン酸オキシダーゼ（ロシュ社製）
±0.5mM キレート剤（和光純薬社製）（表５参照）
上記試薬を４５℃３日間保存し残存活性を測定した。結果を表５に示す。
【００６４】
【表５】

【００６５】
表５から分かるように、ケトアミンオキシダーゼが金属を含有する物質と共存した場合の
安定性を確保する方法として、ＥＤＴＡ以外のキレート剤を用いても同様の効果が得られる
ことが判明した。
【００６６】
【発明の効果】
本発明によるとケトアミンオキシダーゼ含有試薬において、保存中ケトアミンオキシダーゼの活性の低下を防ぎ、糖化タンパク質を正確かつ簡便に測定することができる。特に臨床検査の分野で有用である。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a reagent and method for stabilizing ketoamine oxidase in a reagent for measuring a glycated protein using an enzyme. More specifically, the present invention relates to a ketoamine oxidase stabilizing reagent and a stabilizing method effective for quantifying glycated proteins such as glycated hemoglobin and glycated albumin. The present invention is useful in the field of clinical testing.
[0002]
[Prior art]
In recent years, the number of diabetic patients has increased explosively, and the demand for measurement of blood glucose control markers such as hemoglobin A1c (HbA1c), glycoalbumin, fructosamine, 1.5 anhydroglucitol has increased. Among them, HbA1c and glycoalbumin, which are indicated by the ratio of glycated protein in the protein, are widely used because there are few individual differences and they are not affected by the protein concentration. HbA1c and glycoalbumin have been measured by high performance liquid chromatography (HPLC method) and immunization until now. Recently, it is possible to process a large amount of sample rapidly, and an accurate enzyme method has been developed. (Patent Literature 1, Patent Literature 2, Patent Literature 3, Patent Literature 4, etc.). In addition, the present inventors also developed a method for selectively inhibiting the action of protease on the globulin component (Patent Document 5) and a method for measuring the ratio of glycated protein (Patent Document 6) for the purpose of accurately measuring glycated protein. I have done it.
[0003]
In general, in order to be widely used in the field of clinical examination and to guarantee accurate measurement values, not only the initial production performance of the reagent but also the stability of the reagent during storage is important. In order to solve these problems, the present inventors have repeatedly studied a method for stabilizing ketoamine oxidase, and the ketoamine oxidase by sugar alcohol, water-soluble magnesium salt, water-soluble calcium salt, ammonium sulfate, amino acid, and sarcosine. A stabilization method has been developed (Patent Document 7). However, recent studies have revealed that when special substances such as ascorbate oxidase coexist, the stability of ketoamine oxidase cannot be ensured even if these stabilizers are added.
A stabilizer and a stabilization method regarding a method for stabilizing ketoamine oxidase in the case where a special substance such as ascorbate oxidase coexists has not been known so far.
[0004]
[Patent Document 1]
JP-A-6-46846 [Patent Document 2]
JP-A-5-192193 [Patent Document 3]
WO98 / 48043 [Patent Document 4]
WO97 / 13872 Publication [Patent Document 5]
JP 2001-54398 A [Patent Document 6]
JP 2001-204495 A [Patent Document 7]
WO02 / 061119 Publication [0005]
[Problems to be solved by the invention]
As described above, an object of the present invention is to provide a stable ketoamine oxidase-containing reagent and to provide a method for stabilizing ketoamine oxidase. More specifically, it is to provide a stable ketoamine oxidase reagent and a method for stabilizing ketoamine oxidase in the reagent in clinical biochemical examination.
[0006]
[Means for Solving the Problems]
In order to achieve the above-mentioned object, the present inventor has examined how the ketoamine oxidase-containing reagent can be effectively stabilized.
As a result of intensive studies, the present inventors have found that the coexistence of metal ions, particularly ions such as copper, zinc, manganese, cobalt, nickel, cadmium, and mercury, is strongly involved as an element that makes ketoamine oxidase unstable. I found out. These adverse effects were strongly observed when, for example, ascorbate oxidase that retains copper ions in the molecule was added. Usually, the metal held by the enzyme is unlikely to affect other coexisting enzymes, and this was a surprising discovery.
[0007]
Therefore, the present inventor tried to avoid the adverse effects of metal ions by coexisting a chelating agent. In the formulation comprising the ketoamine oxidase, ascorbate oxidase and chelating agent of the present invention, the ketoamine oxidase-containing reagent of this formulation is stable for more than 1 year in liquid-refrigerated storage, and more surprisingly, It was found that the addition of a chelating agent did not cause loss or destabilization of the enzyme activity of ascorbate oxidase that retains copper ions in the molecule, resulting in the completion of the present invention.
[0008]
That is, the present invention relates to a reagent for efficiently stabilizing ketoamine oxidase and a method for stabilizing ketoamine oxidase by allowing a chelating agent to coexist in a reagent containing ketoamine oxidase. More specifically, the present invention relates to a reagent useful for measurement of glycated protein in clinical biochemical tests, and a stabilization method.
[0009]
That is, the present invention relates to the following stable ketoamine oxidase-containing reagent and a method for stabilizing ketoamine oxidase.
(1) A ketoamine oxidase-containing reagent containing a ketoamine oxidase and a chelating agent.
(2) A ketoamine oxidase-containing reagent containing a ketoamine oxidase, a substance containing a metal ion, and a chelating agent.
(3) The reagent according to (2) above, wherein the substance containing a metal ion is an enzyme.
(4) The reagent according to any one of (1) to (3) above, wherein the reagent is used for quantification of glycated protein.
(5) The reagent according to (4) above, wherein the glycated protein is glycated hemoglobin or glycated albumin.
(6) A method for stabilizing ketoamine oxidase, which comprises coexisting a chelating agent with ketoamine oxidase.
(7) A method for stabilizing ketoamine oxidase, comprising coexisting a chelating agent with a substance containing ketoamine oxidase and metal ions.
(8) The method according to (6) or (7) above, wherein the substance containing metal ions is an enzyme.
(9) The method according to any one of (6) to (8) above, wherein the reagent is used for quantification of glycated protein.
(10) The method according to (9) above, wherein the glycated protein is glycated hemoglobin or glycated albumin.
[0010]
Hereinafter, the configuration and preferred embodiments of the present invention will be described in more detail.
As the ketoamine oxidase that can be used in the present invention, any enzyme may be used as long as it is a ketoamine oxidase that works well on glycated amino acids and / or glycated peptides and generates hydrogen peroxide. In this case, an enzyme that acts on an ε-glycosylated amino acid or peptide in which the ε-amino group is glycated is preferable. When glycated hemoglobin is a measurement target, it acts on an α-glycated amino acid or peptide in which the α-amino group is glycated. An enzyme is preferred.
[0011]
Examples of enzymes that act on glycated amino acids whose ε-amino group has been glycated include the genus Gibberella, Aspergillus, Candida, Penicillium, Fusarium, and Acremonium And ketoamine oxidase derived from the genus (Acremonium) or the genus Debaryomyces.
[0012]
Examples of the enzyme that acts on a glycated amino acid or peptide in which the α-amino group is glycated include the enzyme that acts on the glycated amino acid in which the α-amino group is glycated and an enzyme derived from Corynebacterium.
In addition, an enzyme derived from Corynebacterium is known as an enzyme that specifically acts on a glycated amino acid or peptide in which an α-amino group is glycated but does not substantially act on a glycated amino acid in which an ε-amino group is glycated. It has been. On the other hand, as an enzyme that specifically acts on a glycated amino acid or peptide in which ε-amino group is glycated but does not substantially act on glycated amino acid in which α-amino group is glycated, genetically engineered fructosamine oxidase (FODVII; manufactured by Asahi Kasei Corporation; PCT / JP02 / 0072) is known.
[0013]
Furthermore, as an example of an enzyme that acts on a glycated amino acid or peptide in which α-amino group and ε-amino group are saccharified and has sufficient activity even in the coexistence with protease, genetically modified fructosamine oxidase (FODII; manufactured by Asahi Kasei Co., Ltd.) ).
[0014]
The activity of the enzyme acting on the glycated amino acid was measured by the method described in JP-A-2001-20449 (Method for measuring the proportion of glycated protein). Defined.
[0015]
As the chelating agent that can be used in the present invention, any substance that chelates metal ions that impair the stability of ketoamine oxidase and improves the stability of ketoamine oxidase may be used. Examples of preferred chelating agents include ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) and its salts, trans-1,2-diaminocyclohexane
-N, N, N ', N'-tetraacetic acid, monohydrate (CyDTA), N, N-bis (2-hydroxyethyl) glycine (DHEG), 1,3-diamino-2-hydroxypropane
-N, N, N ', N'-tetraaceticacid (DPTA-OH), Diethylenetriamine
-N, N, N ', N``, N''-pentaacetic acid (DTPA), Ethylenediamine-N, N'-dipropionic acid, dihydrochloride (EDDP), Ethylenediamine-N, N'-bis (methylenephoephonic acid), hemihydrate (EDDPO), N- (2-Hydroxyethyl) ethylenediamine-N, N ', N'-triacetic acid (EDTA-OH), Ethylenediamine
-N, N, N ', N'-tetrakis (methylenephosphonic acid (EDTPO), O, O'-Bis (2-aminoethyl) ethleneglycol-N, N, N', N'-tetraacetic acid (GEDTA),
N ', N'-Bis (2-hydroxybenzyl) ethylenediamine-N, N-diacetic acid (HBED),
1,6-Hexamethylenediamine-N, N, N ', N'-tetraacetic acid (HDTA), N- (2-Hydroxyethyl) iminodiacetic acid (HIDA), Iminodiacetic acid (IDA), 1,2-Diaminopropane-N, N , N ', N'-tetraacetic acid (Methyl-EDTA),
Nitrilotriacetic acid (NTA), Nitrilotripropionic acid (NTP), Nitrilotris (methylenephoshonic acid), trisodium salt (NTPO), Triethylenetetramine
-N, N, N ', N'',N''', N '''-hexaacetic acid (TTHA)
Etc.
[0016]
Examples of EDTA salts include disodium salt, trisodium salt, tetrasodium salt, potassium salt, potassium salt, lithium salt, ammonium salt, and the like.
[0017]
Any substance containing a metal ion that can be used in the present invention is applicable as long as it contains a metal ion that impairs the stability of ketoamine oxidase. As metal ions, for example, metal ions such as copper, zinc, manganese, cobalt, nickel, cadmium, mercury and the like are known to have adverse effects.
[0018]
On the other hand, especially in the reagent using ketoamine oxidase, what is remarkable is that only a small amount of ascorbic acid is mixed and it is influenced by the measured value. Ascorbate oxidase contains 8 coppers in one molecule of enzyme, and particularly tends to cause destabilization of ketoamine oxidase. For the same reason, alcohol dehydrogenase (contains two zinc atoms in one enzyme molecule), hexose oxidase (contains twelve copper atoms in one enzyme molecule), glycerol triphosphate dehydrogenase (contains one iron atom in one enzyme molecule) ), Xanthine dehydrogenase (contains two molybdenum atoms in one enzyme molecule), aldehyde oxidase (contains eight iron atoms and two molybdenum atoms in one enzyme molecule), xanthine oxidase (eight iron atoms in one enzyme molecule) , Succinate dehydrogenase (enzyme contains iron atoms), amine oxidase (enzyme contains 2 copper atoms), sarcosine oxidase (enzyme contains iron atoms), dimethyl Glycine oxidase (enzyme contains iron atom), sarcosine dehydrogenase (enzyme ), Dimethylglycine dehydrogenase (containing iron atom in enzyme), NADH dehydrogenase (containing iron atom in enzyme), uricase (containing iron or copper atom in enzyme), nitrate reductase (copper atom in one molecule of enzyme) 4), glutathione peroxidase (containing 4 selenium atoms in one enzyme molecule), aminopeptidase (containing 2 zinc atoms in 1 enzyme molecule), dipeptidase (containing 1 zinc atom in 1 enzyme molecule) ), Dipeptidyl carboxypeptidase enzyme molecule contains one zinc atom), microorganism-derived metalloprotease (enzyme molecule often contains zinc atom, thermolysin, pronase, etc.), superoxide dismutase (enzyme molecule) Containing one copper and one zinc atom), creatinine amide hydrolase Enzyme 1 comprising one zinc atoms to the molecule), etc. can also be mentioned as an enzyme containing metal.
[0019]
As the ascorbic acid oxidase that can be used in the present invention, any ascorbic acid oxidase may be used as long as it effectively acts on ascorbic acid contained in the test solution. Examples include ascorbic acid oxidase derived from plants or microorganisms. It is done. Although a specific example is shown below, these are only examples and are not limited at all.
[0020]
Examples of plant-derived ascorbate oxidase include cucumber (Amano, Toyobo) and pumpkin (Roche, Toyobo).
Examples of microorganism-derived ascorbate oxidase include those derived from Acremonium (Asahi Kasei) and microorganisms (Amano).
[0021]
The activity of ascorbate oxidase is measured by the following method.
<< Ascorbate oxidase activity measurement method >>
<Storage substrate solution>
176 mg of L ascorbic acid (manufactured by Wako Pure Chemical Industries) and 37 mg of EDTA (manufactured by Daiichi Chemicals) are dissolved in 100 ml of 1 mM hydrochloric acid.
<Reaction reagent mixture>
The stock substrate solution is diluted 20-fold with 90 mM dipotassium phosphate-5 mM monosodium phosphate buffer containing 0.45 mM EDTA.
[0022]
<Operation>
Put 1 ml of the above reaction reagent mixture in a small test tube, preheat it at 30 ° C. for 5 minutes, add 0.10 ml of an appropriately diluted enzyme solution and stir to start the reaction. After the reaction for exactly 5 minutes, 3.0 ml of 0.2N hydrochloric acid aqueous solution is added to stop the reaction, and the absorbance at a wavelength of 245 nm is measured (As). Also, 1 ml of the above reaction solution as a blank is put into a small test tube, preheated at 30 ° C. for 5 minutes, and then the reaction is stopped by adding 3.0 ml of 0.2N hydrochloric acid aqueous solution. 0.10 ml of an appropriately diluted enzyme solution is added and stirred, and the absorbance at a wavelength of 245 nm is measured (Ab). The enzyme activity is determined from the absorbance difference (Ab-As) between the absorbance (As) of this enzyme action and the absorbance (Ab) of the blind. The amount of enzyme that oxidizes 1 μM ascorbic acid to dehydroascorbic acid for 1 minute at 30 ° C. is defined as 1 U. The calculation formula is shown below.
[0023]
[Expression 1]

[0024]
10.0: millimolar extinction coefficient of ascorbic acid at 245 nm under the condition of pH 1.0
5: Reaction time (min)
4.01: Total reaction volume (ml)
0.10: Amount of enzyme sample solution subjected to reaction B: Dilution ratio of enzyme solution
The present invention is effective not only for ketoamine oxidase but also for all enzymes whose stability is impaired by these metal compounds.
[0026]
Examples of the glycated protein to be measured using the ketoamine oxidase-containing reagent of the present invention include glycated albumin or glycated hemoglobin, but the glycated protein to be measured is not limited to these, and any The glycated protein may be measured.
[0027]
In order to measure glycated protein using the ketoamine oxidase-containing reagent of the present invention, the glycated protein is decomposed to the level of glycated amino acid or glycated peptide by a protease, etc. The glucosone or hydrogen peroxide to be measured may be measured, and the decreasing oxygen may be measured by a known method. Any protease can be used as long as it can be used for clinical examination. In particular, when measuring glycated protein, any substance can be used as long as it effectively acts on the glycated protein contained in the test solution and can effectively produce the glycated amino acid and / or glycated peptide derived from the protein. Good [0028]
Regarding the ketoamine oxidase-containing reagent in which the chelating agent of the present invention coexists, the composition may be determined so that the chelating agent and ketoamine oxidase are contained in the same reagent.
[0029]
When incorporating an interfering substance elimination system, for example, when glycated protein is measured after elimination of a glycated amino acid, a ketoamine oxidase-containing reagent is used as the first reagent and a protease and a coupler are prescribed as the second reagent. In the case of incorporating an ascorbic acid or hydrogen peroxide elimination system, for example, ascorbic acid oxidase, peroxidase or the like may be formulated in the first reagent ketoamine oxidase-containing reagent.
[0030]
The concentration of the chelating agent that can be used in the present invention may be 1 μM to 500 mM, preferably 10 μM to 200 mM, and most preferably 50 μM to 100 mM, but other amounts may be used. The concentration of ketoamine oxidase that can be used in the present invention may be 0.1 to 500 U / ml, preferably 0.5 to 200 U / ml, and most preferably 1.0 to 100 U / ml. An amount may be used.
[0031]
For example, in the case of ascorbate oxidase, the concentration of the metal ion-containing substance may be 0.1 to 500 U / ml, preferably 0.5 to 200 U / ml, and most preferably 1.0 to 100 U. Although / ml, other amounts may be used.
[0032]
When measuring glycated protein using the present invention, the protease concentration may be 0.1 U to 1 MU / ml, preferably 1 U to 500 KU / ml, and most preferably 5 U to 100 KU / ml. Other amounts may be used.
[0033]
When measuring a glycated protein in a test solution using a ketoamine oxidase-containing reagent coexisting with the chelating agent of the present invention, the influence of metal ions is eliminated in a fixed amount of the test solution of about 0.1 to 1000 μl. A ketoamine oxidase-containing reagent coexisting with a sufficient amount of a chelating agent, for example, about 1.0 to 5000 μl may be allowed to act for about 1 to 60 minutes, and other amounts and time may be selected. In this case, the test solution may be a treatment solution decomposed to the amino acid or peptide level by protease or the like, or may be quantified by allowing a protease reagent to act after the above reaction. In the latter case, free glycated amino acids in the test solution can be eliminated.
[0034]
From the above, the ketoamine oxidase-containing reagent coexisting with the chelating agent in the present invention may be prepared as containing a chelating agent and ketoamine oxidase. For example, liquid products and frozen products of liquid products or It can be provided as a lyophilized product.
[0035]
The present invention can also be applied to, for example, determination of hydrogen peroxide using an electrode or the like.
Further, for example, surfactants, salts, buffers, pH adjusters, preservatives and the like may be appropriately selected and added to the ketoamine oxidase-containing reagent in which the chelating agent based on the present invention coexists.
[0036]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
Next, although the Example of this invention is described in detail, this invention is not limited at all by this.
Example 1
<Effect of addition of chelating agent on stability of ketoamine oxidase>
<Reagent containing ketoamine oxidase>
<Reaction solution composition A>
30mM Tris buffer (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) pH7.5
10 U / ml ketoamine oxidase II (KAODII; manufactured by Asahi Kasei Corporation)
± 10U / ml ascorbate oxidase (Roche)
± 0.5mM EDTA (Wako Pure Chemical Industries)
[0037]
<Reaction solution composition B>
30mM Tris buffer (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) pH7.5
10 U / ml ketoamine oxidase II (KAODII; manufactured by Asahi Kasei Corporation)
± 0.1mM copper chloride (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)
± 0.5mM EDTA (Wako Pure Chemical Industries)
± of ascorbate oxidase, copper chloride or EDTA indicates the case where these compounds are added and the case where they are not added.
[0038]
<Method>
The reagent was prepared and stored at 37 ° C. for 1 week. After storage, the residual activity of ketoamine oxidase was measured. The results are shown in Table 1.
[0039]
[Table 1]

[0040]
As can be seen from Table 1, when ketoamine oxidase coexists with a metal-containing substance, it is obvious that the stability of ketoamine oxidase is significantly deteriorated, and that the stability is restored by adding a chelating agent. It was.
[0041]
Example 2
<Effect of chelating agent concentration on the stability of ketoamine oxidase-containing reagents>
<Reagent containing ketoamine oxidase>
30mM Tris buffer (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) pH7.5
10 U / ml ketoamine oxidase II (KAODII; manufactured by Asahi Kasei Corporation)
10U / ml ascorbate oxidase (Roche; pumpkin derived)
0-2mM EDTA (Wako Pure Chemical Industries)
1.3 mM TOOS (manufactured by Doujin Chemical Laboratory)
[0042]
<Coloring reagent>
150 mM Tris buffer (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) pH 7.5
4000 U / ml protease derived from Bacillus (protease type XXVII; manufactured by Sigma)
5 mM 4-aminoantipyrine (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)
20 U / ml peroxidase (Sigma)
[0043]
<Reaction procedure>
180 μl of the above-mentioned reagent containing ketoamine oxidase and 9 μl of sample (control serum or pooled serum) were dispensed into cells, incubated at 37 ° C. for 5 minutes, and 555 nm was measured (A0). Subsequently, 180 μl of a coloring reagent was added, incubated at 37 ° C. for 5 minutes, 555 nm was measured (A1), and the change in absorbance of the sample (ΔA = A1-A0) was determined. On the other hand, the absorbance change of the blank (blank ΔA = A1 blank-A0 blank) was measured using distilled water instead of the sample, and the sensitivity of the blank-drawn sample (ΔA-blank ΔA) was determined.
The reagent was stored at 37 ° C. for 1 week to determine the sensitivity of the measurement. The results are shown in Table 2.
[0044]
[Table 2]

[0045]
As can be seen from Table 2, it is clear that the stability of the reagent is improved by adding a chelating agent. It has been found that the concentration of the chelating agent is sufficient if it is contained in the required amount.
[0046]
Example 3
<Measurement reagent of glycated albumin using ketoamine oxidase-containing reagent containing chelating agent>
[0047]
<R-1; Reagent containing ketoamine oxidase>
30mM Tris buffer (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) pH7.5
10 U / ml ketoamine oxidase II (KAODII; manufactured by Asahi Kasei Corporation)
10 U / ml ascorbate oxidase (Roche; pumpkin-derived) or (Asahi Kasei; microorganism; Acremonium-derived)
0.5mM EDTA (Wako Pure Chemical Industries)
1.3 mM TOOS (manufactured by Doujin Chemical Laboratory)
[0048]
<R-2; Coloring reagent>
150 mM Tris buffer (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) pH 7.5
4000 U / ml protease derived from Bacillus (protease type XXVII; manufactured by Sigma)
5 mM 4-aminoantipyrine (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)
20 U / ml peroxidase (Sigma)
[0049]
<R-3 Albumin Measurement Reagent> Measurement was performed with an albumin measurement kit (Albumin II-HA Test Wako; manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.).
[0050]
<HPLC method>
Glycoalbumin meter (GAA-2000; manufactured by ARKRAY) is used.
<Sample> 5 healthy serum samples, 5 patient serum samples [0052]
<Reaction procedure>
The reagent was used after storage at 37 ° C. for 1 week. 180 μl of the ketoamine oxidase-containing reagent and 9 μl of the sample were dispensed into a cell, incubated at 37 ° C. for 5 minutes, and 555 nm was measured (A0). Subsequently, 180 μl of coloring reagent was added and incubated at 37 ° C. for 5 minutes to measure 555 nm (A1),
The change in absorbance of the sample (ΔA = A1-A0) was determined. On the other hand, the absorbance change of the blank (blank ΔA = A1 blank-A0 blank) was measured using distilled water instead of the sample, and the sensitivity of the blank-drawn sample (ΔA-blank ΔA) was determined. The glycoalbumin concentration was calculated by comparing the blanking sensitivity of the sample with the control serum with a known concentration.
[0053]
On the other hand, albumin was measured according to the dosage of an albumin measurement kit (Albumin II-HA Test Wako; manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.). The GA value was converted to a ratio by dividing the glycoalbumin concentration by the albumin concentration. The results are shown in Table 3.
[0054]
[Table 3]

[0055]
As can be seen from Table 3, the ketoamine oxidase-containing reagent containing ketoamine oxidase and chelating agent is stable, and even when stored under the harsh conditions of 37 ° C. for 1 week, the values are consistent with the HPLC method and are accurate. It was clear that glycoalbumin was being measured. Furthermore, similar results were obtained using either pumpkin-derived and microorganisms; Acremonium-derived ascorbate oxidase.
[0056]
Example 4
<Measurement of glycated hemoglobin using a ketoamine oxidase-containing reagent containing a chelating agent>
<R1; ketoamine oxidase-containing reagent>
30mM Tris buffer (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) pH7.5
10 U / ml ketoamine oxidase II (KAODII; manufactured by Asahi Kasei Corporation)
10U / ml ascorbate oxidase (Roche; pumpkin derived)
0.5mM EDTA (Wako Pure Chemical Industries)
1.3 mM TOOS (manufactured by Doujin Chemical Laboratory)
[0057]
<R2; Protease reagent>
150 mM Tris buffer (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) pH 7.5
4000 U / ml Protease from Streptomyces (protease type XIV; manufactured by Sigma)
[0058]
<R3; coloring reagent>
150 mM Tris buffer (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) pH 8.0
5 mM 4-aminoantipyrine (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)
0.12% TOOS (Doujin Chemical Laboratory Co., Ltd.)
24U / ml ketoamine oxidase II (Asahi Kasei Corporation)
20U / ml POD (Sigma)
[0059]
<Sample> Commercial hemoglobin (manufactured by Sigma) 50 mg / ml
The HbA1c value was measured with an HbA1c measuring device (manufactured by ARKRAY).
[0060]
<Reaction procedure>
The reagent was measured after the above R1 reagent was stored at 37 ° C. for 1 week. Mix 0.9 ml of the above R1 reagent and 90 μl of the sample, and perform the reaction at 37 ° C. for 10 minutes. Subsequently, the mixture was filtered through a membrane having a molecular weight of 10,000 cut, and 0.9 ml of R2 reagent was mixed with the filtrate and reacted at 37 ° C. for 2 hours. The solution was filtered through a membrane having a molecular weight of 10,000, and the filtrate was used as a protease reaction solution. 189 μl of protease reaction solution was dispensed into a cell, and 555 nm was measured (A0). Subsequently, 180 μl of R3 reagent was added and incubated at 37 ° C. for 5 minutes to measure 555 nm (A1). The blank was measured by measuring the absorbance change of the blank (blank ΔA = A1 blank−A0 blank) using distilled water as a sample. Further, the sensitivity (sensitivity ΔA = (A1-A0) −blank ΔA) was obtained using a specimen and a sample with a known glycated hemoglobin value as a sample, and the glycated hemoglobin concentration was calculated. Furthermore, the glycated hemoglobin concentration was divided by the hemoglobin concentration to calculate a glycated hemoglobin value. The results are shown in Table 4.
[0061]
[Table 4]

[0062]
As can be seen from Table 4, a ketoamine oxidase-containing reagent characterized by containing a ketoamine oxidase and a chelating agent is stable, even if stored under the harsh conditions of 37 ° C. for 1 week, the HPLC method and the enzymatic method It was clear that the values of glycated hemoglobin were accurately measured.
[0063]
Example 5
<Effects of chelating agents on the stability of ketoamine oxidase>
<Ketoamine oxidase reagent>
30mM Tris buffer (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) pH7.5
10U / ml ketoamine oxidase (Asahi Kasei Corporation)
10U / ml ascorbate oxidase (Roche)
± 0.5mM chelating agent (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) (see Table 5)
The reagent was stored at 45 ° C. for 3 days and the residual activity was measured. The results are shown in Table 5.
[0064]
[Table 5]

[0065]
As can be seen from Table 5, it was found that the same effect can be obtained even when a chelating agent other than EDTA is used as a method for ensuring the stability when ketoamine oxidase coexists with a metal-containing substance.
[0066]
【The invention's effect】
According to the present invention, in a ketoamine oxidase-containing reagent, it is possible to prevent a decrease in the activity of ketoamine oxidase during storage and measure glycated protein accurately and simply. It is particularly useful in the field of clinical testing.

Claims

ケトアミンオキシダーゼ、アスコルビン酸オキシダーゼおよび二価の金属に対するキレート剤を一の試薬として含有することを特徴とするケトアミンオキシダーゼ含有試薬。A ketoamine oxidase-containing reagent comprising a ketoamine oxidase, an ascorbate oxidase and a chelating agent for a divalent metal as one reagent.

試薬が糖化タンパク質の定量に用いるものであることを特徴とする請求項１に記載の試薬。 The reagent according to claim 1, wherein the reagent is used for quantification of glycated protein.

糖化タンパク質が糖化ヘモグロビン又は糖化アルブミンである請求項２に記載の試薬。 The reagent according to claim 2, wherein the glycated protein is glycated hemoglobin or glycated albumin.

二価の金属に対するキレート剤を共存させることを特徴とするケトアミンオキシダーゼおよびアスコルビン酸オキシダーゼを一の試薬として含有する試薬の保存時の安定化方法。 A method for stabilizing a reagent containing ketoamine oxidase and ascorbic acid oxidase as one reagent, wherein a chelating agent for a divalent metal is allowed to coexist.

試薬が糖化タンパク質の定量に用いるものであることを特徴とする請求項４に記載の方法。 The method according to claim 4, wherein the reagent is used for quantification of glycated protein.

糖化タンパク質が糖化ヘモグロビン又は糖化アルブミンである請求項５に記載の方法。 The method according to claim 5, wherein the glycated protein is glycated hemoglobin or glycated albumin.