JP4035191B2 - Chemokine adsorbent, adsorption removal method and adsorber - Google Patents

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、体液中のケモカインを吸着除去するための吸着材、前記吸着材を用いた体液中のケモカインの吸着除去方法、および体液中よりケモカインを吸着除去するためのケモカインの吸着器に関する。
【０００２】
【従来の技術】
免疫担当細胞は免疫応答を引きおこす際に種々の活性物質を産生する。その一部はサイトカインと呼ばれる蛋白性物質であり、種々の抗原特異的、非特異的免疫炎症反応に深く関わる生体防御因子として非常に重要な役割を果たしている。本来サイトカインは生体の恒常性の維持に必要不可欠なものであるが、炎症などの病態では過剰に産生され、炎症の病態形成、遷延に関わっている。
【０００３】
サイトカインのなかでも、とくに走化性（Chemotaxis）を有するものはケモカイン（Chemokine）と総称されている。走化性とは、化学走性ともいい、化学物質の濃度差が刺激となる走性のことを指す。ケモカインと呼ばれる物質はその構造上の特徴から、１つのファミリーを形成しているものとして知られている。
【０００４】
ケモカインの特徴としては、約６，０００から１０，０００の分子量を有する蛋白質として主に存在することがあげられるが、ケモカインの種類により、溶液中では２量体や４量体を形成、またはＯ−グリコシル化により分子量が前記の範囲よりも大きい状態で存在するものもある。またケモカインは、その構造上の特徴から以下の２つのサブファミリーに分類されている。すなわち、エム・バッギオリニ（M. Baggiolini）らがその総説「シー・シー・ケモカインズ・イン・アレルギック・インフラメーション（CC CHEMOKINES IN ALLERGIC INFLAMMATION）」、イムノロジー・トゥディ（Immunology Today）、第１５巻、１２７頁、１９９４年に示しているように、ケモカインは分子内の非常に保存された位置に４つのシステイン残基（以下、Ｃという）を有しているが、４つのＣをＮ末端から順にＣ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４とすると、Ｃ１とＣ２のあいだに任意のアミノ酸（以下、Ｘという）が１つ存在するＣＸＣサブファミリーと、Ｃ１とＣ２のあいだにアミノ酸が存在しないＣＣサブファミリーに分類されている。さらに各サブファミリー内のケモカインは、Ｃ以外のアミノ酸の配列においても相同性（homology）を有していることが示されている（たとえば茆原の報告、臨床免疫、第２７巻［Ｓｕｐｐｌ．１６］、１６２〜１７１頁、１９９５年参照）。
【０００５】
ＣＸＣサブファミリーは、白血球のなかでも概ね好中球に作用し、ＣＣサブファミリーは、概ね単球、好酸球、好塩基球およびリンパ球に作用するとされていたが、近年ではその効果は多岐にわたることが示唆されている。たとえば、インターロイキン−８はインターロイキン類のなかでも走化性を有するインターロイキンであり、ＣＸＣサブファミリーに分類されるケモカインであるが、その機能は好中球のみならず、リンパ球、好塩基球、好酸球、皮膚角化細胞、メラノーマ細胞、繊維芽細胞、血管内皮細胞にもその生物活性を示すことが知られている（松島、臨床免疫、第２７巻［Ｓｕｐｐｌ．１６］、１４７〜１５４頁、１９９５年参照）。
【０００６】
また、たとえばヒト単球上には、ＣＣサブファミリーに分類されるケモカインの１つであるmonocyte chemoattractant protein-1（以下、ＭＣＰ−１という）およびマクロファージ炎症性蛋白質−１（macrophage inflammatory protein-1（以下、ＭＩＰ−１という））に対するそれぞれ特異的な受容体が存在するだけでなく、ＭＣＰ−１、ＭＩＰ−１、ＲＡＮＴＥＳというＣＣサブファミリーに分類される３種類のケモカインに対する共通の受容体が存在していることが示唆されており、サブファミリー内で同一の受容体を介して同一の生理活性を示すものが存在していることが知られている（松島、臨床免疫、第２７巻［Ｓｕｐｐｌ．１６］、１４７〜１５４頁、１９９５年参照）。
【０００７】
生体が外部より侵襲を受けると、生体防御反応としての炎症が引きおこされ、炎症局所への白血球浸潤が生じる。このような炎症局所への白血球浸潤は、炎症部位で産生された白血球走化性因子によって引きおこされる。この白血球浸潤を引きおこす因子としてケモカインがその役割を果たしていることが知られている。実際、ウサギ急性炎症モデルにおいて、ケモカインの１つであるインターロイキン−８に対する抗体（抗インターロイキン−８抗体）の投与により好中球浸潤をブロックし、急性炎症に伴う臓器障害を阻止することが証明されている（セキド（Sekido）ら、ネイチャー（Nature）、第３６５巻、６５４〜６５７頁、１９９３年参照）。
【０００８】
さらに近年、全身性炎症反応症候群（systemic inflammatory response syndrome（ＳＩＲＳ））という概念で包括される病態においては、種々のサイトカインが過剰に産生されることによりサイトカインネットワークが活性化され、それに伴いケモカインが過剰に産生されることにより好中球の誘導、活性化が引きおこされることが報告されており（遠藤ら、集中治療、第４巻、１３５７〜１３６５頁、１９９２年参照）、それに伴い全身性の炎症反応が進行し、ショック、組織障害および多臓器不全が引きおこされ、ひいては死にいたることが示唆されている。
【０００９】
また、アレルギー性炎症の病変局所においてもＲＡＮＴＥＳ、血小板第４因子（platelet factor-4（以下、ＰＦ−４という））およびマクロファージ炎症性蛋白質−１α(macrophage inflammatory protein-1α（以下、ＭＩＰ−１αという））などのケモカインを中心とした作用によりリンパ球、好酸球をはじめとした種々の炎症細胞が浸潤することが示唆されている。
【００１０】
また、たとえば透析療法など血液体外循環を行なう際の人工材料との接触、透析液中の菌体内毒素に代表される刺激物質、血中または組織中に存在する種々の刺激因子などによる免疫担当細胞への刺激によりケモカインが過剰に産生される可能性が指摘されており、たとえば長期透析療法に伴う合併症である透析アミロイド症や手根管症候群において、ＭＣＰ−１やＭＩＰ−１αが過剰に産生され、病態形成にかかわっている可能性が示唆されている（イノウエ（Inoue）ら、ネフロロジー・ダイアリシス・トランスプランテーション（Nephrology Dialysis Transplantation）、第１０巻、２０７７〜２０８２頁、１９９５年参照）。
【００１１】
さらに痛風性関節炎、乾癬、接触性皮膚炎、突発性肺線維症、成人呼吸窮迫症候群、炎症性腸疾患、免疫性血管炎、***症、心筋梗塞、喘息、気道感染症、周産期感染、移植臓器拒絶症などの疾患においては、ケモカインの１つであるインターロイキン−８が炎症局所または全身血中から正常人に比して異常に高濃度で検出されている（免疫薬理、第１２巻、１号、１５〜２１頁、１９９４年参照）。
【００１２】
また、慢性関節リウマチにおいてはインターロイキン−８、ＲＡＮＴＥＳ、ＭＣＰ−１、ＭＩＰ−１αおよびマクロファージ炎症性蛋白質−１β(macrophage inflammatory protein-1β（以下、ＭＩＰ−１βという））が、半月体形成性腎炎においてはＭＣＰ−１、ＭＩＰ−１αおよびＭＩＰ−１βが、慢性糸球体腎炎においてはインターロイキン−８およびＭＣＰ−１が、ループス腎炎ではＭＣＰ−１が異常に発現し、その病態形成に関与していることが示唆されている。
【００１３】
このような多様な機能を有する体液中のケモカインを除去する方法としては、これまでのところほとんど報告が見当たらないが、しいてあげれば、特開平６−３１２０１７号公報に、表面に陽性官能基を有する多孔質担体からなるエンドトキシンおよび／または該エンドトキシンに起因するサイトカインの吸着材により血液を浄化する方法が開示されている。しかしながら、その実施例においてサイトカインの測定またはサイトカインの吸着に関してはいっさい開示されていない。
【００１４】
また、ケモカインに対する抗体や、ケモカインがレセプターに結合することを阻害する物質を投与することにより、ケモカインの作用を抑制する、いわゆる抗サイトカイン療法の適用も考えられる。しかしながら、前記の慢性関節リウマチのような慢性的な炎症を伴う病態では多種類のケモカインが異常に発現していることが示唆されており、抗体などの投与によりこれらの作用を抑制するためにはそれぞれに対する抗体を作製し投与する必要がある。また、投与する抗体などは人体に悪影響を与えるものであってはならず、その開発には長い時間と多大な費用を要すると考えられ、適切な治療法とはいい難い。
【００１５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、体液中に種々存在するケモカインを効率よく吸着除去することが可能な吸着材、前記吸着材を用いたケモカインの吸着除去方法、および前記吸着材を用いたケモカインの吸着器を開発することを目的とするものである。
【００１６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、体液中に存在するケモカインを効率よく吸着除去できる吸着材について鋭意検討した。その結果、水不溶性担体にｌｏｇＰ（Ｐはオクタノール−水系での分配係数）値が２．５０以上の化合物を固定化した物質が体液中に存在するケモカインを効率よく吸着除去できることを発見し、本発明を完成した。
【００１７】
なお、本出願人は、水不溶性担体にｌｏｇＰ（Ｐはオクタノール−水系での分配係数）値が２．５０以上の化合物を固定してなるインターロイキン類の吸着材について、先に出願している（特願平７−６６５６５号）が、本発明においては、インターロイキン類のうち走化性を有するインターロイキン−８（ＣＸＣサブファミリーに属するケモカイン）は排除している。
【００１８】
すなわち本発明は、（１）水不溶性担体にｌｏｇＰ（Ｐはオクタノール−水系での分配係数）値が２．５０以上の化合物を固定してなることを特徴とする体液中のケモカイン（ただし、インターロイキン−８を除く）の吸着材に関する。
【００１９】
さらに本発明は、（２）水不溶性担体が親水性担体である前記（１）項記載の体液中のケモカイン（ただし、インターロイキン−８を除く）の吸着材に関する。
【００２０】
さらに本発明は、（３）水不溶性担体が多孔構造を有する前記（１）または（２）項記載の体液中のケモカイン（ただし、インターロイキン−８を除く）の吸着材に関する。
【００２１】
さらに本発明は、（４）水不溶性担体の、球状蛋白質の排除限界分子量が１万以上６０万以下である前記（１）、（２）または（３）項記載の体液中のケモカイン（ただし、インターロイキン−８を除く）の吸着材に関する。
【００２２】
さらに本発明は、（５）体液中のケモカイン（ただし、インターロイキン−８を除く）を吸着除去するための吸着器の製造のための前記（１）項記載のケモカイン（ただし、インターロイキン−８を除く）の吸着材の使用に関する。
【００２３】
さらに本発明は、（６）液の入口および出口を有し、かつ吸着材の容器外への流出防止手段を備えた容器内に、前記（１）項記載のケモカイン（ただし、インターロイキン−８を除く）の吸着材を充填してなることを特徴とする体液中のケモカイン（ただし、インターロイキン−８を除く）の吸着器に関する。
【００２４】
【発明の実施の形態】
本発明における体液とは、血液、血漿、血清、腹水、リンパ液、関節内液など生体由来の液性成分をいう。
【００２５】
また、本発明におけるケモカインとは、走化性を有する物質で、かつその物質をコードする遺伝子が、ＣＸＣサブファミリーに属するケモカインはヒト第４染色体（ｑ１２〜２１）に、またＣＣサブファミリーに属するケモカインはヒト第１７染色体（ｑ１１〜１２）に存在していることを特徴とする物質を指す。ただし、インターロイキン−８は除く。松島の報告（臨床免疫、第２７巻［Ｓｕｐｐｌ．１６］、１４７〜１５４頁、１９９５年参照）および茆原の報告（臨床免疫、第２７巻［Ｓｕｐｐｌ．１６］、１６２〜１７１頁、１９９５年参照）などを参考に、現在までに知られているヒトケモカインを列挙すると、ＣＸＣサブファミリーに分類されるものとして、ＧＲＯα、ＧＲＯβ、ＧＲＯγ、好中球活性化蛋白質−２（neutrophil activating protein-2（ＮＡＰ−２））、好中球活性化蛋白質−４（ＮＡＰ−４）、epithelial-cell derived neutrophil-activating protein-78（ＥＮＡ−７８）、ＰＦ−４、interferon-inducible protein-10（ＩＰ−１０）、granulocyte chemotactic protein-2（ＧＣＰ−２）、β−トロンボグロブリン（β-thromboglobulin（βＴＧ））および前Ｂ細胞増殖刺激因子（pre-B cell growth stimulating factor（ＰＢＳＦ））があげられる。また、ＣＣサブファミリーに分類されるものとして、ＭＣＰ−１、ＨＣ１４、monocyte chemoattractant protein-3（ＭＣＰ−３）、Ｉ−３０９、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、ＲＡＮＴＥＳがあげられる。しかしながら、ケモカインはその名称が統一されていないばあいがあり、同一物質であっても異なる名称で呼ばれるばあいがある。たとえばＧＲＯβ、ＧＲＯγはそれぞれマクロファージ炎症性蛋白質−２α（macrophage inflammatory protein-2α（ＭＩＰ−２α））、マクロファージ炎症性蛋白質−２β（macrophage inflammatory protein-2β（ＭＩＰ−２β））とも呼ばれ、また、ＭＣＰ−１は単球走化活性化因子（monocyte chemotactic and activating factor（ＭＣＡＦ））とも呼ばれ、ＨＣ１４はmonocyte chemoattractant protein-2（ＭＣＰ−２）とも呼ばれていることが、京都府立医科大学微生物教室により編集された成書（「サイトカインデータマニュアル」、南江堂、１９９５年）に記されている。このため、前記のケモカインがほかの名称で呼ばれるばあいもケモカインとして含まれることは当然のことである。さらには、今後新たに発見され、ケモカインの定義の範疇に入ることが認められた物質も含まれることはいうまでもない。
【００２６】
本発明のケモカイン（ただし、インターロイキン−８を除く、以下同様）の吸着材は、ｌｏｇＰ値が２．５０以上の化合物を水不溶性担体に固定化してなることを特徴とするものである。
【００２７】
ｌｏｇＰ値は化合物の疎水性のパラメーターとなり、代表的なオクタノール−水系での分配係数Ｐの求め方はつぎのとおりである。まず、化合物をオクタノール（もしくは水）に溶解し、これに等量の水（もしくはオクタノール）を加え、グリッフィン・フラスク・シェイカー（Griffin flask shaker）（グリッフィン・アンド・ジョージ・リミテッド（Griffin & George Ltd.）製）で３０分間振とうする。そののち２，０００ｒｐｍで１〜２時間遠心分離し、オクタノール層および水層中の化合物濃度の測定を分光学的またはＧＬＣなどの種々の方法により測定することにより次式で求められる。
【００２８】
Ｐ＝Ｃｏｃt／Ｃｗ
Ｃｏｃｔ：オクタノール層中の化合物濃度
Ｃｗ ：水層中の化合物濃度
これまでに多くの研究者らにより種々の化合物のｌｏｇＰ値が実測されているが、それらの実測値はシー・ハンシュ（C. Hansch）らによって整理されている（「パーティション・コエフィシエンツ・アンド・ゼア・ユージズ（PARTITION COEFFICIENTS AND THEIR USES）」、ケミカル・レビューズ（Chemical Reviews）、第７１巻、５２５頁、１９７１年参照）。
【００２９】
また、実測値の知られていない化合物についてはアール・エフ・レッカー（R. F. Rekker）がその著書（「ザ・ハイドロフォビック・フラグメンタル・コンスタント（THE HYDROPHOBIC FRAGMENTAL CONSTANT）」、エルセビア・サイエンティフィック・パブリッシング・カンパニー（Elsevier Sci. Pub.Com.）、アムステルダム（Amsterdam）、１９７７年）中に示している疎水性フラグメント定数ｆを用いて計算した値（Σｆ）が参考となる。疎水性フラグメント定数は数多くのｌｏｇＰ実測値をもとに、統計学的処理を行ない決定された種々のフラグメントの疎水性を示す値であり、化合物を構成するおのおののフラグメントのｆ値の和はｌｏｇＰ値とほぼ一致すると報告されている。本発明においてｌｏｇＰ値というとき、ｌｏｇＰ値が知られていない化合物についてはΣｆ値を意味する。
【００３０】
ケモカインの吸着に有効な化合物の探索にあたり、種々のｌｏｇＰ値を有する化合物を固定し検討した結果、ｌｏｇＰ値２．５０以上、好ましくは２．７０以上、さらに好ましくは２．９０以上の化合物がケモカインの吸着に有効であり、ｌｏｇＰ値２．５０未満の化合物は殆どケモカイン吸着能を示さないことがわかった。たとえばアルキルアミンを固定化したばあい、アルキルアミンをｎ−ヘキシルアミン（ｌｏｇＰ＝２．０６）からｎ−オクチルアミン（ｌｏｇＰ＝２．９０）に変えると、このあいだでケモカイン吸着能は飛躍的に上昇することがわかった。これらの結果より、本発明の吸着材へのケモカインの吸着は、ｌｏｇＰ値２．５０以上の化合物の固定により担体上に導入された原子団とケモカインとのあいだの疎水性相互作用によるものと考えられ、ｌｏｇＰ値２．５０未満の化合物では疎水性が小さすぎるためにケモカインの吸着能を示さないと考えられる。
【００３１】
また一方で、ｎ−オクチルアミンを、さらにアルキル鎖長が長く、より疎水性が高いと考えられるセチルアミン（Σｆ＝７．２２）に変えると、ケモカインの吸着能はさらに上昇することがわかった。これらの結果より、本発明のケモカイン吸着材へのケモカインの吸着は、ｌｏｇＰ値２．５０以上の化合物の固定により達成されるが、化合物のｌｏｇＰ値は大きいほど好ましいことがわかり、たとえば、セチルアミンよりもさらにアルキル鎖長が長く、より疎水性が高いと考えられるオクタデシルアミン（Σｆ＝８．２８）のような化合物の固定により、セチルアミンを固定したばあいと同等またはそれ以上のケモカインの吸着を示すものと考えられる。ｌｏｇＰ値の上限値はとくに制限されないが、実用上１５程度である。
【００３２】
本発明において、水不溶性担体に固定される化合物としては、ｌｏｇＰ値が２．５０以上の化合物であれば特別な制限なしに用いることができる。ただし、担体上に化合物を化学結合法によって結合するばあいには、化合物の一部が脱離することが多いが、この脱離基が化合物の疎水性に大きく寄与しているばあい、すなわち脱離により担体上に固定される原子団の疎水性がΣｆ＝２．５０より小さくなるようなばあいには本発明の主旨から考えて、本発明に用いる化合物としては不適当である。その代表例を一つあげると、安息香酸イソペンチルエステル（Σｆ＝４．１５）をエステル交換により水酸基を有する担体上に固定するばあいがあげられる。このばあい、実際に担体上に固定される原子団はＣ₆Ｈ₅ＣＯ−であり、この原子団のΣｆは１以下である。このような化合物が本発明で用いる化合物として適当かどうかは、脱離基の部分を水素に置き換えた化合物のｌｏｇＰ値が２．５０以上かどうかにより判断すればよい。
【００３３】
ｌｏｇＰ値が２．５０以上の化合物のなかでも、炭素数７〜２０個、なかんづく８〜１８個の炭化水素部位を有するものが好ましく、さらに不飽和炭化水素、アルコール、アミン、チオール、カルボン酸およびその誘導体、ハロゲン化物、アルデヒド、イソシアナート、グリシジルエーテルなどのオキシラン環含有化合物、ハロゲン化シランなどのように担体への結合に利用できる官能基を有する化合物が好ましい。
【００３４】
前記不飽和炭化水素としては、１−ヘプテン、１−オクテン、１−デセン、１−ドデセン、１−テトラデセン、１−ヘキサデセン、１−オクタデセン、１−エイコセンなどがあげられる。
【００３５】
前記アルコールとしては、ｎ−オクチルアルコール、ドデシルアルコール、ヘキサデシルアルコール、１−オクテン−３−オール、ナフトール、ジフェニルメタノール、４−フェニル−ブタノールなどがあげられる。
【００３６】
前記アミンとしては、ｎ−オクチルアミン、デシルアミン、ドデシルアミン、ヘキサデシルアミン、オクタデシルアミン、ナフチルアミン、２−アミノオクテン、ジフェニルメチルアミンなどがあげられる。
【００３７】
前記チオールとしては、オクタンチオール、デカンチオール、ドデカンチオール、テトラデカンチオール、ヘキサデカンチオール、オクタデカンチオールなどがあげられる。
【００３８】
前記カルボン酸およびその誘導体としては、ｎ−オクタン酸、ノナン酸、２−ノネン酸、デカン酸、ドデカン酸、ステアリン酸、アラキドン酸、オレイン酸、ジフェニル酢酸などがあげられ、その誘導体としては前記カルボン酸の酸ハロゲン化物、エステル、アミド、ヒドラジドなどがあげられる。
【００３９】
前記ハロゲン化物としては、塩化オクチル、臭化オクチル、塩化デシル、塩化ドデシルなどがあげられる。
【００４０】
前記アルデヒドとしては、オクチルアルデヒド、ｎ−カプリンアルデヒド、ドデシルアルデヒドなどがあげられる。
【００４１】
前記イソシアナートとしては、ドデシルイソシアナート、ヘキサデシルイソシアナート、オクタデシルイソシアナートなどがあげられる。
【００４２】
前記グリシジルエーテルとしては、ドデシルグリシジルエーテル、ヘキサデシルグリシジルエーテル、オクタデシルグリシジルエーテルなどがあげられる。
【００４３】
前記ハロゲン化シランとしては、ｎ−オクチルトリクロロシラン、オクタデシルトリクロロシランなどがあげられる。
【００４４】
これらのほかにも、前記の例示化合物の炭化水素部分の水素原子がハロゲン、チッ素、酸素、イオウなどのヘテロ原子を含有する置換基、ほかのアルキル基などで置換された化合物のうち、ｌｏｇＰ値が２．５０以上の化合物、前述のシー・ハンシュ（C.Hansch）らの総説「パーティション・コエフィシエンツ・アンド・ゼア・ユージズ（PARTITION COEFFICIENTS AND THEIR USES）」、ケミカル・レビューズ（Chemical Reviews）、第７１巻、５２５頁、１９７１年の中の５５５頁から６１３頁の表に示されているｌｏｇＰ値が２．５０以上の化合物などを用いることができるが、本発明においてはこれらのみに限定されるものではない。
【００４５】
なお、これらの化合物はそれぞれ単独で用いてもよいし、任意の２種類以上を組み合わせてもよく、さらにはｌｏｇＰ値が２．５０未満の化合物との組み合わせで用いてもよい。
【００４６】
本発明の吸着材における水不溶性担体とは、常温常圧で固体であり水不溶性であることを意味する。また、本発明における水不溶性担体の形状としては、粒状、板状、繊維状、中空糸状などがあげられるが、その形状は問わず、その大きさもとくに限定されない。
【００４７】
本発明の吸着材における水不溶性担体としては、ガラスビーズ、シリカゲルなどの無機担体、架橋ポリビニルアルコール、架橋ポリアクリレート、架橋ポリアクリルアミド、架橋ポリスチレンなどの合成高分子やセルロース類、架橋アガロース、架橋デキストリンなどの多糖類からなる有機担体、さらには、これらの組み合わせによってえられる有機−有機、有機−無機などの複合担体などが代表例としてあげられる。
【００４８】
なかでも、親水性担体が非特異的吸着が比較的少なくケモカインの吸着選択性が良好であるため好ましい。ここでいう親水性担体とは、担体を構成する物質を平板状にしたときの水との接触角が６０度以下の担体を指す。水の接触角の測定方法は種々知られているが、たとえば池田が、その著書（「実験化学選書・コロイド化学、第４章、界面の熱力学」、裳華房、７５〜１０４頁、１９８６年）に示しているごとく、被測定物質の平板上に水滴を置き測定する方法が最も一般的である。前記の方法で測定した水の接触角が６０度以下である担体としては、セルロース、ポリビニルアルコール、エチレン−酢酸ビニル共重合体けん化物、ポリアクリルアミド、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、ポリメタクリル酸メチル、ポリアクリル酸グラフト化ポリエチレン、ポリアクリルアミドグラフト化ポリエチレン、ガラスなどからなる担体が代表例としてあげられる。
【００４９】
なお、前記セルロースにおいては、水の接触角は約１８度であることが成書に示されている（筏義人、「医用高分子材料」、共立出版、６５頁、１９８９年参照）。
【００５０】
これらの水不溶性担体は、適当な大きさの細孔を多数有する、すなわち多孔構造を有する担体であることがより好ましい。多孔構造を有する担体とは、基礎高分子母体が微小球の凝集により１個の球状粒子を形成する際に微小球の集塊によって形成される空間（マクロポアー）を有する担体のばあいは当然であるが、基礎高分子母体を構成する１個の微小球内の核と核との集塊のあいだに形成される細孔を有する担体のばあい、または三次元構造（高分子網目）を有する共重合体が混和性のある有機溶媒で膨潤された状態のときに存在する細孔（ミクロポアー）を有する担体のばあいも含まれる。
【００５１】
また、吸着材の単位体積あたりの吸着能から考えて、多孔構造を有する水不溶性担体としては、表面多孔性よりも全多孔性のものが好ましく、また空孔容積および比表面積は、吸着性が損なわれない程度に大きいことが好ましい。
【００５２】
これらの好ましい要件を満たす担体としてセルロース類からなる多孔質のゲルがあげられる。セルロース類からなる多孔質のゲルは、（１）機械的強度が比較的高く、強靭であるため撹拌などの操作により破壊されたり微粉を生じたりすることが少なく、カラムに充填したばあい、体液を高速で流しても圧密化しないので高流速で流すことが可能となり、また細孔構造が高圧蒸気滅菌などによって変化を受けにくい、（２）ゲルがセルロース類で構成されているため親水性であり、リガンドの結合に利用しうる水酸基が多数存在し、非特異的吸着も少ない、（３）空孔容積を大きくしても比較的強度が高いため軟質ゲルにおとらない吸着容量がえられる、（４）安全性が合成高分子ゲルなどに比べて高いなどのすぐれた点を有しており、本発明に用いる最も適した担体の１つである。
【００５３】
本発明でいうセルロース類とは、天然セルロース、再生セルロースおよびセルロース誘導体の少なくとも１種のことであり、例えば天然セルロースとしては木綿繊維を脱脂したもの、麻類の繊維、木材からリグニンやヘミセルロースなどを除去してえられるパルプ、該パルプをさらに精製してえられる精製セルロースなどがある。また、再生セルロースとは天然セルロースをいったんセルロース誘導体にしたのち加水分解などにより再生させたセルロースのことである。セルロース誘導体としては、例えば天然または再生セルロースの水酸基の一部または全部がエステル化および／またはエーテル化されたものなどが挙げられる。前記セルロースの水酸基の一部または全部がエステル化されたものの具体例としては、例えば酢酸セルロース、プロピオン酸セルロース、酪酸セルロース、ニトロセルロース、硫酸セルロース、リン酸セルロース、酢酸酪酸セルロース、硝酸セルロース、セルロースのジカルボン酸エステルなどが挙げられるが、これに限定されるものではない。また前記セルロースの水酸基の一部または全部がエーテル化されたものの具体例としては、例えばメチルセルロース、エチルセルロース、ベンジルセルロース、シアノエチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、アミノエチルセルロース、オキシエチルセルロースなどが挙げられるが、これに限定されるものではない。
【００５４】
本発明においては前述の担体はそれぞれ単独で用いてもよいし、任意の２種類以上を混合して用いてもよい。
【００５５】
また、前述のような多孔構造を有する水不溶性担体は、吸着対象の物質はある程度大きな確率で細孔内に侵入できるが、ほかの蛋白質の侵入はできる限りおこらない特徴を有することがより好ましい。すなわち、本発明の吸着材の吸着対象であるケモカインは分子量約６，０００〜１０，０００の蛋白質として存在することが多く、この蛋白質を効率よく吸着するためには、ケモカインはある程度大きな確率で細孔内に侵入できるが、ほかの蛋白質の侵入はできる限りおこらないことが好ましい。細孔内に侵入可能な物質の分子量の目安として排除限界分子量が一般に用いられている。排除限界分子量とは、成書（たとえば、波多野博行、花井俊彦著、「実験高速液体クロマトグラフ」、化学同人）などに述べられているごとく、ゲル浸透クロマトグラフィーにおいて細孔内に侵入できない（排除される）分子の内、最も小さい分子量をもつものの分子量をいう。排除限界分子量は一般に球状蛋白質、デキストラン、ポリエチレングリコールなどについてよく調べられているが、本発明に用いる担体のばあい、球状蛋白質を用いてえられた値を用いるのが適当である。
【００５６】
種々の排除限界分子量の担体を用いて検討した結果、ケモカインの吸着に適当な球状蛋白質の排除限界分子量の範囲は、１万以上６０万以下であることが明らかとなった。すなわち、球状蛋白質の排除限界分子量が１万未満である担体を用いたばあいには、ケモカインの吸着量は小さくその実用性が低下し、また６０万をこえるものでは、ケモカイン以外の蛋白質（主としてアルブミン）の吸着が大きくなり、選択性の点でその実用性が低下する。したがって、本発明に用いる担体の球状蛋白質の排除限界分子量の好ましい範囲は１万以上６０万以下、さらに好ましくは２万以上５０万以下、とくに好ましくは３万以上４０万以下である。
【００５７】
さらに、担体にはリガンドの固定化反応に用いうる官能基を有していることが好ましい。これらの官能基の代表例としては水酸基、アミノ基、アルデヒド基、カルボキシル基、チオール基、シラノール基、アミド基、エポキシ基、ハロゲン基、スクシンイミド基、酸無水物基、トレシル基などがあげられるが、これらに限定されるわけではない。
【００５８】
本発明に用いる担体としては硬質担体、軟質担体のいずれも用いることができるが、体外循環用の吸着材として使用するばあいには、カラムに充填し、通液する際などに目詰まりを生じないことが重要であり、そのためには充分な機械的強度が要求される。したがって本発明に用いる担体は硬質担体であることがより好ましい。ここでいう硬質担体とは、たとえば粒状ゲルのばあい、後記参考例に示すごとく、ゲルを円筒状カラムに均一に充填し、水性流体を流した際の圧力損失ΔＰと流速の関係が０．３ｋｇ／ｃｍ²までの直線関係にあるものをいう。
【００５９】
本発明の吸着材は、ｌｏｇＰ値が２．５０以上の化合物を水不溶性担体に固定してえられるが、その固定化方法としては公知の種々の方法を特別な制限なしに用いることができる。しかしながら、本発明の吸着材を体外循環治療に供するばあいには、滅菌時または治療時においてのリガンドの脱離溶出を極力抑えることが安全上重要であり、そのためには共有結合法により固定化することが好ましい。
【００６０】
また、本発明における吸着材は、ｌｏｇＰ値が２．５０以上の化合物を適量固定化したものであることが好ましい。固定量が少なすぎるとケモカインの吸着が見られず、多すぎると体液として血液を用いたばあいに血小板などの粘付着がおこりうる。よって、ｌｏｇＰ値が２．５０以上の化合物の固定量は、好ましくは水不溶性担体の乾燥重量（１ｇ）当たり１０〜１０００μｍｏｌであり、さらに好ましくは５０〜５００μｍｏｌであり、最も好ましくは１００〜３００μｍｏｌである。
【００６１】
本発明の吸着材としては、ｌｏｇＰ値が２．５０以上の化合物を固定したセルロース類（以下、Ｃ−セルロース類という）と水とからなるコロイド質固相を持つヒドロゲルであることが好ましく、さらにＣ−セルロース類と水の重量比が１：９から３：７の範囲にあることが好ましい。以下、この吸着材について説明する。
【００６２】
セルロース類に対してｌｏｇＰ値が２．５０以上の化合物を固定する方法には、公知の種々の方法、例えば物理的に結合させる方法、イオン結合を介して結合させる方法、共有結合を介して結合させる方法などを用いることができるが、結合した化合物が脱離しにくいことが重要であることから、共有結合を介して固定することが最も好ましい。具体的な手段としては、セルロース類の水酸基を利用して直接的に該化合物をエステル結合、アミド結合、エーテル結合、チオエーテル結合、ウレタン結合等を介して結合させる方法や、セルロース類にアミノ基、アルデヒド基、エポキシ基、カルボキシル基などの官能基を導入することにより反応性の高い状態とした（活性化）後、該化合物を結合させる方法が挙げられる。また、セルロース類に官能基を導入して活性化する具体的な方法としては、臭化シアン法、エポキシ法、トレシルクロリド性、過ヨウ素酸酸化法などが具体例として挙げられるが、これらのみに限定されるものではない。
【００６３】
本発明でいうヒドロゲルとは、前述の通り水または水溶液を必須成分とするコロイド質固相のことをいい、ヒドロゲルを乾燥して水分を除去した後に残されるゲル骨格、すなわちキセロゲルは本発明でいうヒドロゲルの概念から外れるものである。
【００６４】
Ｃ−セルロース類と水の重量比は、ヒドロゲルの付着水やヒドロゲル粒子間の間隙水を吸引濾過法や遠心法などにより除去したときの重量（湿潤重量Ｗｗ）と、続いて乾燥させて重量が変化しなくなったときの重量（乾燥重量Ｗｄ）とから求められる。すなわち、Ｗｄ：（Ｗｗ−Ｗｄ）が本発明でいうＣ−セルロース類と水の重量比となる。具体的な湿潤重量を求める方法としては、例えばヒドロゲルをグラスフィルターにとり、アスピレーターを用いて吸引し、吸引時間と重量の関係を示す重量減少曲線を作成した際に曲線の傾きが緩やかになる吸引時間経過後に重量を測定する方法が挙げられる。また、乾燥方法としては、恒量化が達成できる方法であれば特に制限はないが、１０５℃程度の温度での常圧乾燥が特別な装置が不要で簡便に採用できる。本発明のヒドロゲルを構成するＣ−セルロースと水の重量比は１：９〜３：７の範囲にあるが、この重量比は、ケモカイン吸着器に体液を通液した際の圧力損失によるヒドロゲルの変形、およびこれに伴う圧密化を防ぐという観点から、Ｃ−セルロース類の割合が１／９以上あることが望ましく、さらに浄化速度の低下を防ぐという観点からＣ−セルロース類の割合が３／７以下にあることが望ましいことに基づく。
【００６５】
本発明のケモカイン吸着器に収納される球状ヒドロゲル粒子、とくに血液浄化器として使用するケモカイン吸着器に収納されるヒドロゲル粒子の形状は球状であるのが好ましく、ここで球状とは真球状のものはもちろんのこと、広く回転楕円体を含む。この種のヒドロゲルの平均粒子径に関しては、一般に血漿の如き細胞成分をほとんど含まない体液を処理する場合には、３００μｍ以下のものが浄化速度が高いという観点から採用され、また、直接血液灌流方式で用いる場合には、血球成分の充分な通過流路を確保するために２５０〜１０００μｍのものが好ましく用いられている。本発明の球状ヒドロゲル粒子、とくに血液浄化器として使用されるケモカイン吸着器に収納される球状ヒドロゲル粒子については、血球成分の通過性および浄化速度の両立の観点から３００〜６００μｍのものがより好ましい。ここでいう平均粒子径とは、数平均粒子径のことを指し、たとえば実体顕微鏡にて１０倍から５０倍程度の倍率で２０〜５０個のヒドロゲル粒子の粒子径を観察・測定し、えられた測定値を平均することにより求められる。ヒドロゲル粒子が回転楕円体の場合は、その長径を粒子径とし、前述と同様の方法により平均粒子径を求める。粒子径が上述の範囲にあれば粒径分布に関しては特別な制限なく用いることが可能であるが、例えば特開昭６３−１１７０３９号公報などに記載された振動法を用いて均一液滴を形成し、適切な条件で凝固させて作製される粒径分布の狭い粒子は特に直接血液灌流方式で用いる場合好ましい。
【００６６】
本発明のＣ−セルロース類からなるヒドロゲル粒子を作製する方法としては、セルロース類をＣ−セルロース類としたのち成形してヒドロゲル粒子とする方法、セルロース類のヒドロゲル粒子を作製してこれにｌｏｇＰ値が２．５０以上の化合物を固定する方法のいずれの方法も可能である。
【００６７】
具体的にセルロース類をＣ−セルロース類としたのち成形してヒドロゲル粒子とする方法を挙げると、セルロース類にｌｏｇＰ値が２．５０以上の化合物を固定してＣ−セルロース類としたのち、該Ｃ−セルロース類を溶剤に溶かして溶液化した後、液滴化し凝固させてヒドロゲル粒子とする方法、また該Ｃ−セルロース類を溶液化するのに適当な溶剤がない場合は、Ｃ−セルロース類に対しさらにエステル化やエーテル化を行い溶剤に溶けやすいものとしたのち、ヒドロゲル粒子とする方法などが挙げられるが、これに限定されるものではない。
【００６８】
セルロース類のヒドロゲル粒子を作製してこれにｌｏｇＰ値が２．５０以上の化合物を固定する方法において、セルロース類のヒドロゲル粒子を作製する方法としては、セルロース類を溶剤に溶解した後、液滴化し凝固させてヒドロゲル粒子を作製する方法が挙げられるが、セルロース類としてセルロース誘導体を用いる方法が溶剤の種類が多様化するために製造条件の選択範囲も広くなり、好ましく用いられる。セルロース誘導体としては、前述のセルロースの水酸基の一部または全部がエステル化および／またはエーテル化されたものが挙げられるが、なかでも酢酸セルロース、プロピオン酸セルロースなどのセルロースエステルが多種の溶剤に溶解するためより好ましく用いられる。これらのセルロース誘導体をヒドロゲル粒子化したのち、そのままあるいは必要に応じ加水分解反応を行った後、ｌｏｇＰ値が２．５以上の化合物を固定することによりＣ−セルロース類のヒドロゲル粒子が作製される。
【００６９】
本発明の吸着材を用いて体液中よりケモカインを吸着除去する方法には種々の方法がある。最も簡便な方法としては体液を取り出してバッグなどに貯留し、これに吸着材を混合してケモカインを吸着除去したのち、吸着材を濾別してケモカインが除去された体液をうる方法がある。ほかには体液の入口と出口を有し、出口には体液は通過するが吸着材は通過しないフィルターを装着した容器に吸着材を充填し、これに体液を流す方法がある。いずれの方法も用いることができるが、後者の方法は操作も簡便であり、また体外循環回路に組み込むことにより患者の体液、とくに血液から効率よくオンラインでケモカインを除去することが可能であり、本発明の吸着材はこの方法に適している。
【００７０】
ここでいう体外循環回路では本発明の吸着材を単独で用いることもできるが、ほかの体外循環治療システムとの併用も可能である。併用の例としては、人工透析回路などがあげられ、透析療法との組み合わせに用いることもできる。
【００７１】
つぎに、前記ケモカイン吸着材を用いた本発明のケモカイン吸着器を、一実施例の概略断面図である図１にもとづき説明する。
【００７２】
図１中、１は体液の流入口、２は体液の流出口、３は本発明のケモカインの吸着材、４および５は体液および体液に含まれる成分は通過できるが前記ケモカイン吸着材は通過できないフィルター、６はカラム、７はケモカインの吸着器である。しかしながら、ケモカイン吸着器はこのような具体例に限定されるものではなく、液の入口および出口を有し、かつケモカイン吸着材の容器外への流出防止具を備えた容器内に、前記吸着材を充填したものであれば、どのようなものでもよい。
【００７３】
前記流出防止具には、メッシュ、不織布、綿栓などのフィルターがあげられる。また、容器の形状、材質、大きさにはとくに限定はないが、好ましい具体例としては、たとえば容量１５０〜５００ｍｌ程度、直径４〜１０ｃｍ程度の透明または半透明の筒状容器などがあげられる。材料としては、とくに好ましくは耐滅菌性を有する素材であるが、具体的にはシリコンコートされたガラス、ポリプロピレン、ポリ塩化ビニル、ポリカーボネート、ポリサルフォン、ポリメチルペンテンなどがあげられる。
【００７４】
【実施例】
以下、実施例において、本発明についてさらに詳細に述べるが、本発明は以下の実施例のみに限定されるものではない。また以下の実施例では、吸着対象のケモカインとして、ＣＣサブファミリーの１つであるＭＩＰ−１αを例にとりあげたが、そのほかのケモカインについても同様に実施が可能であることはいうまでもない。
【００７５】
参考例
両端に孔径１５μｍのフィルターを装着したガラス製円筒カラム（内径９ｍｍ、カラム長１５０ｍｍ）にアガロースゲル（バイオラッド（Ｂｉｏ−ｒａｄ）社製のバイオゲル（Ｂｉｏｇｅｌ）Ａ−５ｍ、粒径５０〜１００メッシュ）、ビニル系ポリマーゲル（東ソー（株）製のトヨパールＨＷ−６５、粒径５０〜１００μｍ）およびセルロースゲル（チッソ（株）製のセルロファインＧＣ−７００ｍ、粒径４５〜１０５μｍ）をそれぞれ均一に充填し、ペリスタティックポンプにより水を流し、流速と圧力損失ΔＰとの関係を求めた。その結果を図２に示す。
【００７６】
図２に示すごとく、トヨパールＨＷ−６５およびセルロファインＧＣ−７００ｍが圧力の増加にほぼ比例して流速が増加するのに対し、バイオゲル（Ｂｉｏｇｅｌ）Ａ−５ｍは圧密化を引きおこし、圧力を増加させても流速が増加しないことがわかる。本発明においては前者のごとく、圧力損失ΔＰと流速の関係が０.３ｋｇ／ｃｍ²までの直線関係にあるものを硬質ゲルという。
【００７７】
実施例１
セルロース系多孔質担体であるセルロファインＧＣ−７００ｍ（チッソ（株）製、球状蛋白質の排除限界分子量４００，０００）１７０ｍｌに水を加え全量を３４０ｍｌとしたのち、２Ｍ水酸化ナトリウム水溶液９０ｍｌを加え４０℃とした。これにエピクロルヒドリン３１ｍｌを加え、４０℃で撹拌下２時間反応させた。反応終了後、充分に水洗し、エポキシ化担体をえた。
【００７８】
このエポキシ化担体１０ｍｌにｎ−オクチルアミン（ｌｏｇＰ＝２．９０）２００ｍｇを加え、５０（ｖ／ｖ）％エタノール水溶液中、４５℃で静置下、６日間反応させた。反応終了後、５０（ｖ／ｖ）％エタノール水溶液、エタノール、５０（ｖ／ｖ）％エタノール水溶液、水の順に充分に洗浄し、ｎ−オクチルアミン固定化担体をえた。ｎ−オクチルアミンの固定量は、担体の乾燥重量（１ｇ）当たり１８４μｍｏｌであった。
【００７９】
この固定化担体およびセルロファインＧＣ−７００ｍそれぞれ０．５ｍｌに対し、健常人血清（大日本製薬（株）製）にヒト遺伝子組み替えＭＩＰ−１α（アール・アンド・ディー・システムズ（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）社製）を加えて調製したＭＩＰ−１α加健常人血清（ＭＩＰ−１α濃度１．１ｎｇ／ｍｌ）３ｍｌを加え、３７℃で２時間振盪下で吸着させた。吸着前後の上澄み溶液のＭＩＰ−１αの濃度をアール・アンド・ディー・システムズ社製ヒトＭＩＰ−１α測定キットを用いて測定し、次式により吸着率を算出した。
【００８０】
【数１】

【００８１】
ただし、このばあいの吸着前血清中の濃度とは、あらかじめ担体に含まれる水分を補正した値である。
【００８２】
また吸着前後のアルブミン濃度をＢＣＧ法により測定した。
【００８３】

【００８４】
実施例２
ｎ−オクチルアミンをセチルアミン（Σｆ＝７．２２）に、固定化反応の溶媒をエタノールに変えたほかは実施例１と同様にしてセチルアミン固定化担体をえた。セチルアミンの固定量は、担体の乾燥重量（１ｇ）当たり１８９μｍｏｌであった。この固定化担体を用いて実施例１と同様にして吸着実験を行ない、ＭＩＰ−１αの濃度を測定することにより吸着率を算出し、またアルブミン濃度の変化を測定した。
【００８５】

【００８６】
実施例３
セルロファインＧＣ−７００ｍをセルロファインＧＣ−２００ｍ（チッソ（株）製、球状蛋白質の排除限界分子量１４０，０００）に変えたほかは実施例１と同様にしてｎ−オクチルアミン固定化担体をえた。ｎ−オクチルアミンの固定量は、担体の乾燥重量（１ｇ）当たり１８９μｍｏｌであった。この固定化担体を用いて実施例１と同様にして吸着実験を行ない、ＭＩＰ−１αの濃度を測定することにより吸着率を算出し、またアルブミン濃度の変化を測定した。
【００８７】

【００８８】
実施例４
セルロファインＧＣ−７００ｍをセルロファインＧＣ−２００ｍに、ｎ−オクチルアミンをセチルアミンに、固定化反応の溶媒をエタノールに変えたほかは実施例１と同様にしてセチルアミン固定化担体をえた。セチルアミンの固定量は、担体の乾燥重量（１ｇ）当たり１８９μｍｏｌであった。この固定化担体を用いて実施例１と同様にして吸着実験を行ない、ＭＩＰ−１αの濃度を測定することにより吸着率を算出し、またアルブミン濃度の変化を測定した。
【００８９】

【００９０】
実施例５
市販の酢酸セルロースをジメチルスルホキシドとプロピレングリコールの混合溶剤に溶解し、この溶液を特開昭６３−１１７０３９号公報に記載された方法（振動法）により液滴化し、凝固させて、酢酸セルロースの球状ヒドロゲル粒子をえた。この粒子を水酸化ナトリウム水溶液と混和することにより加水分解反応を行ない、セルロースヒドロゲル粒子（球状蛋白質の排除限界分子量は３０，０００であった。以下、Ｃ−ｌという）をえた。
【００９１】
セルロファインＧＣ−７００ｍをＣ−ｌに、ｎ−オクチルアミンをセチルアミンに、固定化反応の溶媒をエタノールに変えたほかは実施例１と同様にしてセチルアミン固定化担体をえた。セチルアミンの固定量は、担体の乾燥重量（１ｇ）当たり１６０μｍｏｌであった。この固定化担体を用いて実施例１と同様にして吸着実験を行ない、ＭＩＰ−１αの濃度を測定することにより吸着率を算出し、またアルブミン濃度の変化を測定した。
【００９２】

【００９３】
比較例１
ｎ−オクチルアミンをｎ−ブチルアミン（ｌｏｇＰ＝０．９７）に変えたほかは実施例１と同様にしてｎ−ブチルアミン固定化担体をえた。この固定化担体を用いて実施例１と同様にして吸着実験を行ない、ＭＩＰ−１αの濃度を測定することにより吸着率を算出し、またアルブミン濃度の変化を測定した。
【００９４】

【００９５】
比較例２
ｎ−オクチルアミンをｎ−ヘキシルアミン（ｌｏｇＰ＝２．０６）に変えたほかは、実施例１と同様にしてｎ−ヘキシルアミン固定化担体をえた。この固定化担体を用いて実施例１と同様にして吸着実験を行ない、ＭＩＰ−１αの濃度を測定することにより吸着率を算出し、またアルブミン濃度の変化を測定した。
【００９６】

【００９７】
【発明の効果】
本発明の方法による水不溶性担体にｌｏｇＰ値２．５０以上の化合物を固定化してなることを特徴とする吸着材を用いることで体液中のケモカインを効率よく吸着除去することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明のケモカイン吸着器の一実施例の概略断面図である。
【図２】３種類のゲルを用いて流速と圧力損失との関係を調べた結果を示すグラフである。
【符号の説明】
１ 体液の流入口
２ 体液の流出口
３ ケモカインの吸着材
４、５ フィルター
６ カラム
７ ケモカインの吸着器[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to an adsorbent for adsorbing and removing chemokines in body fluids, a method for adsorbing and removing chemokines in body fluids using the adsorbent, and a chemokine adsorber for adsorbing and removing chemokines from body fluids.
[0002]
[Prior art]
Immunocompetent cells produce various active substances when eliciting an immune response. Some of them are protein substances called cytokines and play a very important role as biological defense factors that are deeply involved in various antigen-specific and non-specific immune inflammatory reactions. Cytokines are essential for maintaining the homeostasis of living organisms, but are excessively produced in pathologies such as inflammation, and are involved in the pathogenesis and prolongation of inflammation.
[0003]
Among cytokines, those having chemotaxis in particular are collectively called chemokines. Chemotaxis is also referred to as chemotaxis, and refers to chemotaxis that is stimulated by the concentration difference of chemical substances. Substances called chemokines are known to form one family because of their structural characteristics.
[0004]
The chemokine is mainly characterized as a protein having a molecular weight of about 6,000 to 10,000. Depending on the type of chemokine, a dimer or tetramer is formed in the solution, or O -Some exist with a molecular weight greater than the above range due to glycosylation. Chemokines are classified into the following two subfamilies because of their structural characteristics. That is, M. Baggiolini et al. Reviewed its review “CC CHEMOKINES IN ALLERGIC INFLAMMATION”, Immunology Today, Vol. 15, 127. As shown in page 1994, chemokines have four cysteine residues (hereinafter referred to as C) at highly conserved positions in the molecule. , C2, C3, and C4, it is classified into CXC subfamily where one arbitrary amino acid (hereinafter referred to as X) exists between C1 and C2, and CC subfamily where no amino acid exists between C1 and C2. ing. Furthermore, chemokines within each subfamily have been shown to have homology in amino acid sequences other than C (eg, Sugawara report, Clinical Immunization, Vol. 27 [Suppl. 16]). 162-171, 1995).
[0005]
The CXC subfamily generally acts on neutrophils among leukocytes, and the CC subfamily is generally thought to act on monocytes, eosinophils, basophils and lymphocytes. Has been suggested. For example, interleukin-8 is an interleukin having chemotaxis among interleukins and is a chemokine classified into the CXC subfamily, but its function is not limited to neutrophils, but also lymphocytes, basophils Spheres, eosinophils, skin keratinocytes, melanoma cells, fibroblasts, and vascular endothelial cells are also known to exhibit their biological activity (Matsushima, Clinical Immunization, Vol. 27 [Suppl. 16], 147). ˜154, 1995).
[0006]
For example, on human monocytes, monocyte chemoattractant protein-1 (hereinafter referred to as MCP-1), which is one of the chemokines classified into the CC subfamily, and macrophage inflammatory protein-1 ( Hereinafter, there are not only specific receptors for MIP-1)), but also common receptors for three chemokines classified into the CC subfamily of MCP-1, MIP-1, and RANTES. It is known that there are those that exhibit the same physiological activity through the same receptor in the subfamily (Matsushima, Clinical Immunization, Vol. 27 [Suppl 16] pp. 147-154, 1995).
[0007]
When a living body is invaded from the outside, inflammation as a biological defense reaction is caused, and leukocyte infiltration into the inflamed area occurs. Such leukocyte infiltration into the inflamed area is caused by leukocyte chemotactic factors produced at the site of inflammation. It is known that chemokine plays a role as a factor causing this leukocyte infiltration. In fact, in a rabbit acute inflammation model, administration of an antibody against antileukin-8 (anti-interleukin-8 antibody), which is one of chemokines, can block neutrophil infiltration and prevent organ damage associated with acute inflammation. (See Sekido et al., Nature, 365, 654-657, 1993).
[0008]
Furthermore, in recent years, in the pathological condition encompassed by the concept of systemic inflammatory response syndrome (SIRS), the cytokine network is activated by excessive production of various cytokines, and chemokines are excessive accordingly. Has been reported to induce neutrophil induction and activation (see Endo et al., Vol. 4, pages 1357 to 1365, 1992). It has been suggested that the inflammatory response has progressed, causing shock, tissue damage and multiple organ failure, and thus death.
[0009]
In addition, RANTES, platelet factor-4 (hereinafter referred to as PF-4) and macrophage inflammatory protein-1α (hereinafter referred to as MIP-1α) are also used in the local lesions of allergic inflammation. It is suggested that various inflammatory cells including lymphocytes and eosinophils are infiltrated by the action of chemokines such as)).
[0010]
In addition, for example, contact with artificial materials when performing extracorporeal blood circulation such as dialysis therapy, stimulating substances typified by endotoxin in the dialysate, various immune stimulating cells present in blood or tissues, etc. It has been pointed out that chemokines may be produced in excess due to stimulation of the body. For example, in dialysis amyloidosis and carpal tunnel syndrome, which are complications associated with long-term dialysis therapy, MCP-1 and MIP-1α are produced excessively. It has been suggested that it may be involved in pathogenesis (see Inoue et al., Nephrology Dialysis Transplantation, Vol. 10, 2077-2082, 1995).
[0011]
In addition, gouty arthritis, psoriasis, contact dermatitis, idiopathic pulmonary fibrosis, adult respiratory distress syndrome, inflammatory bowel disease, immune vasculitis, urinary tract infection, myocardial infarction, asthma, respiratory tract infection, perinatal period In diseases such as infection and transplanted organ rejection, interleukin-8, which is one of chemokines, has been detected at abnormally high concentrations compared to normal individuals from the inflamed or systemic blood (immunopharmacology, no. Vol. 12, No. 1, 15-21, 1994).
[0012]
Further, in rheumatoid arthritis, interleukin-8, RANTES, MCP-1, MIP-1α and macrophage inflammatory protein-1β (hereinafter referred to as MIP-1β) are caused by crescent-forming nephritis. Is associated with MCP-1, MIP-1α and MIP-1β, interleukin-8 and MCP-1 are abnormally expressed in chronic glomerulonephritis, and MCP-1 is abnormally expressed in lupus nephritis. It is suggested that
[0013]
As a method for removing chemokines in body fluids having such various functions, there have been few reports so far. However, JP-A-6-312017 discloses a positive functional group on the surface. A method for purifying blood with an endotoxin comprising a porous carrier and / or an adsorbent for cytokines resulting from the endotoxin is disclosed. However, there is no disclosure regarding cytokine measurement or cytokine adsorption in the examples.
[0014]
In addition, application of so-called anti-cytokine therapy that suppresses the action of chemokines by administering antibodies against chemokines or substances that inhibit the binding of chemokines to receptors is also conceivable. However, it has been suggested that many types of chemokines are abnormally expressed in the pathological conditions with chronic inflammation such as the above-mentioned rheumatoid arthritis, and in order to suppress these effects by administration of antibodies and the like. It is necessary to produce and administer antibodies against each. In addition, the antibody to be administered should not adversely affect the human body, and its development is considered to require a long time and a large amount of money, and it is difficult to say that it is an appropriate treatment method.
[0015]
[Problems to be solved by the invention]
The present invention develops an adsorbent capable of efficiently adsorbing and removing various chemokines in body fluids, a method for adsorbing and removing chemokines using the adsorbent, and a chemokine adsorber using the adsorbent. It is for the purpose.
[0016]
[Means for Solving the Problems]
The present inventors diligently studied an adsorbent that can efficiently adsorb and remove chemokines present in body fluids. As a result, it was discovered that a substance in which a compound having a log P (P is an octanol-water partition coefficient) value of 2.50 or more is immobilized on a water-insoluble carrier can efficiently adsorb and remove chemokines present in body fluids. Completed the invention.
[0017]
The present applicant has previously filed an adsorbent for interleukins in which a compound having a log P (P is a partition coefficient in an octanol-water system) value of 2.50 or more is fixed to a water-insoluble carrier. (Japanese Patent Application No. 7-66565) excludes interleukin-8 (chemokine belonging to the CXC subfamily) having chemotaxis among interleukins in the present invention.
[0018]
That is, the present invention relates to (1) a chemokine in a body fluid characterized by immobilizing a compound having a log P (P is a partition coefficient in an octanol-water system) value of 2.50 or more on a water-insoluble carrier. (Excluding leukin-8).
[0019]
Furthermore, the present invention relates to (2) an adsorbent for chemokines (excluding interleukin-8) in body fluids as described in (1) above, wherein the water-insoluble carrier is a hydrophilic carrier.
[0020]
Furthermore, the present invention relates to (3) an adsorbent for chemokines (excluding interleukin-8) in body fluids according to (1) or (2) above, wherein the water-insoluble carrier has a porous structure.
[0021]
Furthermore, the present invention relates to (4) a chemokine in a body fluid according to the above (1), (2) or (3) wherein the exclusion protein molecular weight of the globular protein of the water-insoluble carrier is 10,000 or more and 600,000 or less (however, (Excluding interleukin-8).
[0022]
Furthermore, the present invention provides (5) For the production of an adsorber for adsorbing and removing chemokines in body fluids (except for interleukin-8) Adsorbent for chemokine (excluding interleukin-8) described in (1) above Use of About.
[0023]
Furthermore, the present invention provides (6) a chemokine (provided that interleukin-8) described in the above item (1) in a container having an inlet and an outlet for the liquid and provided with means for preventing the adsorbent from flowing out of the container And an adsorber for chemokines (excluding interleukin-8) in body fluids.
[0024]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
The body fluid in the present invention refers to a liquid component derived from a living body such as blood, plasma, serum, ascites, lymph, intra-articular fluid.
[0025]
Further, the chemokine in the present invention is a substance having chemotaxis, and a chemokine whose gene encoding the substance belongs to the CXC subfamily belongs to human chromosome 4 (q12 to 21) and belongs to the CC subfamily. A chemokine refers to a substance characterized by being present on human chromosome 17 (q11-12). However, interleukin-8 is excluded. Matsushima's report (clinical immunity, Vol. 27 [Suppl. 16], pp. 147-154, 1995) and Sugawara's report (clinical immunity, Vol. 27 [Suppl. 16], pp. 162-171, 1995) ) And the like, and enumeration of known human chemokines to date is classified into the CXC subfamily as GROα, GROβ, GROγ, neutrophil activating protein-2 (neutrophil activating protein-2 ( NAP-2)), neutrophil activating protein-4 (NAP-4), epithelial-cell derived neutrophil-activating protein-78 (ENA-78), PF-4, interferon-inducible protein-10 (IP-10) ), Granulocyte chemotactic protein-2 (GCP-2), β-thromboglobulin (βTG) and pre-B cell growth stimulating factor (PBSF) And the like. Examples of those classified into the CC subfamily include MCP-1, HC14, monocyte chemoattractant protein-3 (MCP-3), I-309, MIP-1α, MIP-1β, and RANTES. However, chemokines sometimes have different names, and even the same substance may be called with different names. For example, GROβ and GROγ are also called macrophage inflammatory protein-2α and macrophage inflammatory protein-2β (MIP-2β), respectively, and MCP -1 is also called monocyte chemotactic and activating factor (MCAF), and HC14 is also called monocyte chemoattractant protein-2 (MCP-2). Is written in a book ("Cytokine Data Manual", Nanedo, 1995) edited by. For this reason, when the said chemokine is called by another name, it is natural that it is included as a chemokine. Furthermore, it goes without saying that substances newly discovered in the future and approved to fall within the definition of chemokine are included.
[0026]
The adsorbent for the chemokine of the present invention (however, excluding interleukin-8, the same shall apply hereinafter) is characterized in that a compound having a log P value of 2.50 or more is immobilized on a water-insoluble carrier.
[0027]
The log P value is a hydrophobic parameter of the compound, and the method for obtaining the partition coefficient P in a typical octanol-water system is as follows. First, the compound is dissolved in octanol (or water), to which an equal amount of water (or octanol) is added, and Griffin flask shaker (Griffin & George Ltd. )) For 30 minutes. Thereafter, the mixture is centrifuged at 2,000 rpm for 1 to 2 hours, and the concentration of the compound in the octanol layer and the aqueous layer is measured by various methods such as spectroscopic or GLC.
[0028]
P = Coct / Cw
Coct: Compound concentration in the octanol layer
Cw: Compound concentration in the water layer
To date, many researchers have measured the log P values of various compounds, and these measured values have been arranged by C. Hansch et al. (“Partition Co-Efficients and There • See PARTITION COEFFICIENTS AND THEIR USES, Chemical Reviews, Vol. 71, page 525, 1971).
[0029]
For compounds for which measured values are not known, RF Rekker has written the book ("THE HYDROPHOBIC FRAGMENTAL CONSTANT"), Elsevier Scientific. The value (Σf) calculated using the hydrophobic fragment constant f shown in the Publishing Company (Elsevier Sci. Pub.Com., Amsterdam, 1977) is helpful. The hydrophobic fragment constant is a value indicating the hydrophobicity of various fragments determined by statistical processing based on a large number of measured logP values. The sum of the f values of the respective fragments constituting the compound is logP. It is reported that the values are almost the same. In the present invention, the logP value means a Σf value for a compound whose logP value is not known.
[0030]
In searching for a compound effective for adsorption of chemokines, compounds having various log P values were fixed and examined. As a result, compounds having a log P value of 2.50 or more, preferably 2.70 or more, more preferably 2.90 or more are chemokines. It was found that a compound having a log P value of less than 2.50 exhibits almost no chemokine adsorption ability. For example, when immobilizing an alkylamine, changing the alkylamine from n-hexylamine (log P = 2.06) to n-octylamine (log P = 2.90) dramatically increases the chemokine adsorption capacity. I found out that From these results, it is considered that the adsorption of the chemokine to the adsorbent of the present invention is due to the hydrophobic interaction between the chemokine and the atomic group introduced onto the support by fixing the compound having a log P value of 2.50 or more. It is considered that a compound having a log P value of less than 2.50 does not exhibit chemokine adsorption ability because its hydrophobicity is too small.
[0031]
On the other hand, it was found that when n-octylamine is changed to cetylamine (Σf = 7.22), which is considered to have a longer alkyl chain length and higher hydrophobicity, the chemokine adsorption ability further increases. From these results, it can be seen that adsorption of chemokine to the chemokine adsorbent of the present invention is achieved by immobilizing a compound having a log P value of 2.50 or more, but the larger the log P value of the compound, the more preferable. Furthermore, the chemokine adsorbed at or higher than the case of fixing cetylamine by immobilizing a compound such as octadecylamine (Σf = 8.28), which has a longer alkyl chain length and is considered to be more hydrophobic. It is considered a thing. The upper limit of the logP value is not particularly limited, but is practically about 15.
[0032]
In the present invention, as a compound immobilized on a water-insoluble carrier, any compound having a log P value of 2.50 or more can be used without any particular limitation. However, when a compound is bound on a carrier by a chemical bonding method, a part of the compound is often eliminated, but when this leaving group contributes greatly to the hydrophobicity of the compound, that is, In view of the gist of the present invention, when the hydrophobicity of the atomic group immobilized on the carrier by detachment is smaller than Σf = 2.50, it is not suitable as the compound used in the present invention. One typical example is when isopentyl benzoate (Σf = 4.15) is fixed on a carrier having a hydroxyl group by transesterification. In this case, the atomic group actually fixed on the carrier is C ₆ H _Five CO-, and Σf of this atomic group is 1 or less. Whether such a compound is suitable as a compound to be used in the present invention may be determined based on whether the logP value of the compound in which the leaving group is replaced with hydrogen is 2.50 or more.
[0033]
Among compounds having a log P value of 2.50 or more, those having a hydrocarbon moiety of 7 to 20 carbon atoms, especially 8 to 18 carbon atoms are preferable, and further unsaturated hydrocarbons, alcohols, amines, thiols, carboxylic acids and Preference is given to compounds having functional groups that can be used for binding to the carrier, such as derivatives thereof, halides, oxirane ring-containing compounds such as aldehydes, isocyanates and glycidyl ethers, and halogenated silanes.
[0034]
Examples of the unsaturated hydrocarbon include 1-heptene, 1-octene, 1-decene, 1-dodecene, 1-tetradecene, 1-hexadecene, 1-octadecene, 1-eicocene and the like.
[0035]
Examples of the alcohol include n-octyl alcohol, dodecyl alcohol, hexadecyl alcohol, 1-octen-3-ol, naphthol, diphenylmethanol, 4-phenyl-butanol and the like.
[0036]
Examples of the amine include n-octylamine, decylamine, dodecylamine, hexadecylamine, octadecylamine, naphthylamine, 2-aminooctene, diphenylmethylamine and the like.
[0037]
Examples of the thiol include octanethiol, decanethiol, dodecanethiol, tetradecanethiol, hexadecanethiol, and octadecanethiol.
[0038]
Examples of the carboxylic acid and derivatives thereof include n-octanoic acid, nonanoic acid, 2-nonenoic acid, decanoic acid, dodecanoic acid, stearic acid, arachidonic acid, oleic acid, diphenylacetic acid, and the like. Examples include acid halides of acids, esters, amides, hydrazides and the like.
[0039]
Examples of the halide include octyl chloride, octyl bromide, decyl chloride, dodecyl chloride and the like.
[0040]
Examples of the aldehyde include octyl aldehyde, n-caprin aldehyde, dodecyl aldehyde and the like.
[0041]
Examples of the isocyanate include dodecyl isocyanate, hexadecyl isocyanate, octadecyl isocyanate and the like.
[0042]
Examples of the glycidyl ether include dodecyl glycidyl ether, hexadecyl glycidyl ether, and octadecyl glycidyl ether.
[0043]
Examples of the halogenated silane include n-octyltrichlorosilane and octadecyltrichlorosilane.
[0044]
In addition to these, among the compounds in which the hydrogen atom of the hydrocarbon portion of the above exemplary compounds is substituted with a substituent containing a hetero atom such as halogen, nitrogen, oxygen, sulfur, or other alkyl group, logP Compounds with values greater than 2.50, the aforementioned review by C. Hansch et al. “PARTITION COEFFICIENTS AND THEIR USES”, Chemical Reviews, Vol. 71, 525, 1971. The compounds having log P values of 2.50 or more shown in the table on pages 555 to 613 in 1971 can be used. However, the present invention is not limited to these. It is not something.
[0045]
Each of these compounds may be used alone, or any two or more of them may be combined, and further, may be used in combination with a compound having a log P value of less than 2.50.
[0046]
The water-insoluble carrier in the adsorbent of the present invention means a solid at room temperature and normal pressure and water-insoluble. In addition, examples of the shape of the water-insoluble carrier in the present invention include granular, plate-like, fiber-like, and hollow fiber-like shapes, but the shape is not limited and the size is not particularly limited.
[0047]
Examples of the water-insoluble carrier in the adsorbent of the present invention include inorganic carriers such as glass beads and silica gel, synthetic polymers such as crosslinked polyvinyl alcohol, crosslinked polyacrylate, crosslinked polyacrylamide, and crosslinked polystyrene, celluloses, crosslinked agarose, and crosslinked dextrin. Representative examples include organic carriers composed of these polysaccharides, and organic-organic, organic-inorganic and other composite carriers obtained by combinations thereof.
[0048]
Among these, a hydrophilic carrier is preferable because nonspecific adsorption is relatively small and chemokine adsorption selectivity is good. The term “hydrophilic carrier” as used herein refers to a carrier having a contact angle with water of 60 ° or less when the material constituting the carrier is made flat. Various methods for measuring the contact angle of water are known. For example, Ikeda has published his book ("Experimental Chemistry Selection / Colloidal Chemistry, Chapter 4, Thermodynamics of Interfaces", Suikabo, pages 75-104, 1986. As shown in (Year), the most common method is to place water droplets on the flat plate of the substance to be measured. Examples of the carrier having a water contact angle of 60 degrees or less measured by the above method include cellulose, polyvinyl alcohol, saponified ethylene-vinyl acetate copolymer, polyacrylamide, polyacrylic acid, polymethacrylic acid, and polymethyl methacrylate. Typical examples include carriers made of polyacrylic acid grafted polyethylene, polyacrylamide grafted polyethylene, glass, and the like.
[0049]
In the cellulose, it is shown in the book that the contact angle of water is about 18 degrees (see Yoshito Tsuji, “Medical Polymer Material”, Kyoritsu Shuppan, page 65, 1989).
[0050]
These water-insoluble carriers are more preferably carriers having a large number of appropriately sized pores, that is, carriers having a porous structure. A carrier having a porous structure is naturally a carrier having a space (macropore) formed by agglomeration of microspheres when the base polymer matrix forms one spherical particle by agglomeration of microspheres. In the case of a carrier having pores formed between agglomerates of nuclei in one microsphere constituting the basic polymer matrix, or having a three-dimensional structure (polymer network) In the case of a carrier having pores (micropores) present when the copolymer is swollen with a miscible organic solvent.
[0051]
In view of the adsorptive capacity per unit volume of the adsorbent, the water-insoluble carrier having a porous structure is preferably completely porous rather than surface porous, and the pore volume and specific surface area are adsorbent. It is preferably large enough not to be damaged.
[0052]
Examples of the carrier that satisfies these preferable requirements include porous gels made of celluloses. Porous gels made of cellulose (1) have relatively high mechanical strength and are tough, so they are less likely to be broken or produce fine powder by operations such as stirring. It is possible to flow at a high flow rate because it does not become compact even if it is flowed at high speed, and the pore structure is less susceptible to changes due to high-pressure steam sterilization, etc. (2) It is hydrophilic because the gel is composed of celluloses. Yes, there are many hydroxyl groups that can be used for ligand binding, and there is little non-specific adsorption. (3) Even if the pore volume is increased, the strength is relatively high, so an adsorption capacity that does not fit into a soft gel can be obtained. (4) It has excellent points such as higher safety than synthetic polymer gels, and is one of the most suitable carriers used in the present invention.
[0053]
The cellulose referred to in the present invention is at least one of natural cellulose, regenerated cellulose, and cellulose derivatives. For example, natural cellulose is obtained by defatting cotton fiber, hemp fiber, lignin, hemicellulose, etc. from wood. There are pulp obtained by removing, purified cellulose obtained by further refining the pulp, and the like. The regenerated cellulose refers to a cellulose that has been made from natural cellulose once by a cellulose derivative and then regenerated by hydrolysis or the like. Examples of the cellulose derivative include those in which part or all of the hydroxyl groups of natural or regenerated cellulose are esterified and / or etherified. Specific examples of those in which some or all of the hydroxyl groups of cellulose are esterified include, for example, cellulose acetate, cellulose propionate, cellulose butyrate, nitrocellulose, cellulose sulfate, cellulose phosphate, cellulose acetate butyrate, cellulose nitrate, and cellulose. Examples thereof include, but are not limited to, dicarboxylic acid esters. Specific examples of those in which part or all of the hydroxyl groups of the cellulose are etherified include, but are not limited to, methyl cellulose, ethyl cellulose, benzyl cellulose, cyanoethyl cellulose, carboxymethyl cellulose, aminoethyl cellulose, oxyethyl cellulose, and the like. It is not something.
[0054]
In the present invention, the above carriers may be used alone or in combination of two or more.
[0055]
In addition, the water-insoluble carrier having a porous structure as described above preferably has a characteristic that the substance to be adsorbed can enter the pores with a certain degree of probability, but other proteins do not enter as much as possible. That is, the chemokine that is the adsorption target of the adsorbent of the present invention often exists as a protein having a molecular weight of about 6,000 to 10,000, and in order to adsorb this protein efficiently, the chemokine has a certain degree of probability. Although it can penetrate into the pores, it is preferable that other proteins do not penetrate as much as possible. The exclusion limit molecular weight is generally used as a measure of the molecular weight of a substance that can enter the pores. Exclusion limit molecular weight means that it cannot penetrate into pores in gel permeation chromatography as described in the books (for example, Hiroyuki Hatano, Toshihiko Hanai, “Experimental High Performance Liquid Chromatograph”, Chemical Dojin) (exclusion) The molecular weight of the molecule with the smallest molecular weight. The exclusion limit molecular weight is generally well investigated for globular proteins, dextran, polyethylene glycol, and the like, but in the case of the carrier used in the present invention, it is appropriate to use values obtained using globular proteins.
[0056]
As a result of studies using carriers of various exclusion limit molecular weights, it was revealed that the range of exclusion limit molecular weights of globular proteins suitable for chemokine adsorption is from 10,000 to 600,000. In other words, when a carrier having a globular protein with an exclusion limit molecular weight of less than 10,000 is used, the amount of chemokine adsorbed is small, and its practicality is reduced, and if it exceeds 600,000, proteins other than chemokines (mainly, Albumin) is increased in adsorption, and its practicality is reduced in terms of selectivity. Therefore, the preferred range of the exclusion limit molecular weight of the globular protein used in the present invention is 10,000 to 600,000, more preferably 20,000 to 500,000, and particularly preferably 30,000 to 400,000.
[0057]
Further, the carrier preferably has a functional group that can be used for the ligand immobilization reaction. Representative examples of these functional groups include hydroxyl group, amino group, aldehyde group, carboxyl group, thiol group, silanol group, amide group, epoxy group, halogen group, succinimide group, acid anhydride group, and tresyl group. However, it is not limited to these.
[0058]
As the carrier used in the present invention, either a hard carrier or a soft carrier can be used, but when used as an adsorbent for extracorporeal circulation, clogging occurs when the column is packed and passed through. It is important that no mechanical strength is required. Therefore, the carrier used in the present invention is more preferably a hard carrier. The hard carrier here is, for example, in the case of a granular gel, and as shown in a reference example described later, the relationship between the pressure loss ΔP and the flow rate when the gel is uniformly packed in a cylindrical column and an aqueous fluid is flowed is 0. 3kg / cm ² The one that has a linear relationship up to.
[0059]
The adsorbent of the present invention can be obtained by immobilizing a compound having a log P value of 2.50 or more on a water-insoluble carrier, and various immobilization methods can be used without particular limitation. However, when the adsorbent of the present invention is used for extracorporeal circulation treatment, it is important for safety to suppress the desorption and elution of the ligand as much as possible during sterilization or treatment. For this purpose, immobilization is performed by a covalent bond method. It is preferable to do.
[0060]
Further, the adsorbent in the present invention is preferably an adsorbent obtained by fixing an appropriate amount of a compound having a log P value of 2.50 or more. If the fixed amount is too small, chemokine adsorption is not observed, and if it is too large, sticking of platelets or the like may occur when blood is used as a body fluid. Therefore, the fixed amount of the compound having a log P value of 2.50 or more is preferably 10 to 1000 μmol, more preferably 50 to 500 μmol, most preferably 100 to 300 μmol per dry weight (1 g) of the water-insoluble carrier. is there.
[0061]
The adsorbent of the present invention is preferably a hydrogel having a colloidal solid phase composed of cellulose (hereinafter referred to as C-cellulose) to which a compound having a log P value of 2.50 or more is fixed, and water. The weight ratio of C-celluloses and water is preferably in the range of 1: 9 to 3: 7. Hereinafter, this adsorbent will be described.
[0062]
There are various known methods for fixing a compound having a log P value of 2.50 or more to celluloses, for example, a physical bonding method, a ionic bond bonding method, and a covalent bond bonding. However, since it is important that the bound compound is not easily detached, it is most preferable to fix it via a covalent bond. As specific means, a method of directly bonding the compound via an ester bond, an amide bond, an ether bond, a thioether bond, a urethane bond or the like using a hydroxyl group of celluloses, an amino group to celluloses, There is a method in which a compound having a high reactivity (activation) is introduced by introducing a functional group such as an aldehyde group, an epoxy group, or a carboxyl group, and then the compound is bonded. Specific examples of the method of activating cellulose by introducing a functional group include cyanogen bromide method, epoxy method, tresyl chloride property, periodate oxidation method, etc. It is not limited to.
[0063]
The hydrogel referred to in the present invention refers to a colloidal solid phase having water or an aqueous solution as an essential component as described above, and the gel skeleton, that is, the xerogel left after the water is removed by drying the hydrogel is referred to in the present invention. It deviates from the concept of hydrogel.
[0064]
The weight ratio of C-celluloses to water is the weight when the adhering water of the hydrogel and the interstitial water between the hydrogel particles are removed by a suction filtration method or a centrifugal method (wet weight Ww), followed by drying to obtain a weight. It is determined from the weight when the change stops (dry weight Wd). That is, Wd: (Ww−Wd) is the weight ratio of C-celluloses and water as referred to in the present invention. As a specific method for determining the wet weight, for example, when a hydrogel is placed on a glass filter and sucked using an aspirator, a weight reduction curve indicating the relationship between the suction time and the weight is created. The method of measuring a weight after progress is mentioned. Further, the drying method is not particularly limited as long as it can achieve constant weighting, but normal pressure drying at a temperature of about 105 ° C. is not necessary and can be easily adopted. The weight ratio of C-cellulose and water constituting the hydrogel of the present invention is in the range of 1: 9 to 3: 7. This weight ratio is determined by the pressure loss caused by pressure loss when the body fluid is passed through the chemokine adsorber. From the viewpoint of preventing deformation and accompanying consolidation, the ratio of C-cellulose is desirably 1/9 or more, and from the viewpoint of preventing reduction in the purification rate, the ratio of C-cellulose is 3/7. Based on what is desirable below.
[0065]
The shape of the spherical hydrogel particles housed in the chemokine adsorber of the present invention, particularly the hydrogel particles housed in the chemokine adsorber used as a blood purifier, is preferably spherical. Of course, it widely includes spheroids. With regard to the average particle size of this type of hydrogel, in general, when treating a bodily fluid such as plasma that contains almost no cellular components, one having a size of 300 μm or less is adopted from the viewpoint of high purification rate, and direct blood perfusion method In order to secure a sufficient flow path for blood cell components, those having a thickness of 250 to 1000 μm are preferably used. The spherical hydrogel particles of the present invention, particularly the spherical hydrogel particles housed in the chemokine adsorber used as a blood purifier, are more preferably those having a particle size of 300 to 600 μm from the viewpoint of compatibility of blood cell component permeability and purification rate. The average particle diameter here refers to the number average particle diameter. For example, the particle diameter of 20 to 50 hydrogel particles is observed and measured at a magnification of about 10 to 50 times with a stereomicroscope. It is obtained by averaging the measured values. When the hydrogel particles are spheroids, the major axis is taken as the particle diameter, and the average particle diameter is determined by the same method as described above. If the particle size is in the above range, the particle size distribution can be used without any particular limitation. For example, uniform droplets can be formed using a vibration method described in JP-A-63-117039. However, particles having a narrow particle size distribution prepared by coagulation under appropriate conditions are particularly preferred when used in the direct blood perfusion method.
[0066]
As a method for producing hydrogel particles comprising the C-celluloses of the present invention, a method in which celluloses are made into C-celluloses and then formed into hydrogel particles, and hydrogel particles of celluloses are produced to obtain a log P value. Any method of immobilizing a compound having an A of 2.50 or more is possible.
[0067]
Specifically, when the cellulose is made into C-cellulose and then formed into hydrogel particles, a compound having a log P value of 2.50 or more is fixed to the cellulose to obtain C-cellulose. A method in which C-celluloses are dissolved in a solvent and then formed into droplets and solidified to form hydrogel particles. If there is no solvent suitable for dissolving the C-celluloses, C-celluloses On the other hand, there is a method of making it easy to dissolve in a solvent by further esterification or etherification, but it is not limited to this.
[0068]
In the method of preparing cellulose hydrogel particles and fixing a compound having a log P value of 2.50 or more to the cellulose hydrogel particles, the cellulose hydrogel particles can be prepared by dissolving cellulose in a solvent and then forming droplets. A method of preparing hydrogel particles by coagulation can be mentioned, but the method of using a cellulose derivative as celluloses is preferably used because the range of production conditions is widened because the types of solvents are diversified. Examples of cellulose derivatives include those in which some or all of the hydroxyl groups of cellulose are esterified and / or etherified. Among them, cellulose esters such as cellulose acetate and cellulose propionate dissolve in various solvents. Therefore, it is used more preferably. After hydrolyzing these cellulose derivatives into hydrogel particles, the hydrogel particles of C-cellulose are prepared by fixing a compound having a log P value of 2.5 or more as it is or after performing a hydrolysis reaction as necessary.
[0069]
There are various methods for adsorbing and removing chemokines from body fluids using the adsorbent of the present invention. As the simplest method, there is a method in which body fluid is taken out and stored in a bag or the like, adsorbent is mixed with this to adsorb and remove chemokine, and then the adsorbent is filtered to obtain body fluid from which chemokine has been removed. In addition, there is a method of having a body fluid inlet and outlet, filling the container with a filter fitted with a filter through which the body fluid passes but the adsorbent does not pass, and flowing the body fluid therethrough. Either method can be used, but the latter method is easy to operate, and by incorporating it into an extracorporeal circuit, it is possible to efficiently remove chemokines from a patient's body fluid, particularly blood, online. The inventive adsorbent is suitable for this method.
[0070]
In this extracorporeal circuit, the adsorbent of the present invention can be used alone, but can also be used in combination with other extracorporeal circulation treatment systems. Examples of the combination include an artificial dialysis circuit and the like, and can also be used in combination with dialysis therapy.
[0071]
Next, the chemokine adsorber of the present invention using the chemokine adsorbent will be described with reference to FIG. 1 which is a schematic sectional view of one embodiment.
[0072]
In FIG. 1, 1 is a bodily fluid inlet, 2 is a bodily fluid outlet, 3 is a chemokine adsorbent of the present invention, and 4 and 5 can pass the bodily fluid and components contained in the bodily fluid, but cannot pass the chemokine adsorbent. A filter, 6 is a column, and 7 is a chemokine adsorber. However, the chemokine adsorber is not limited to such a specific example, and the adsorbent is provided in a container having a liquid inlet and an outlet and provided with a chemokine adsorbent outflow prevention tool. Any material may be used as long as it is filled.
[0073]
Examples of the anti-spill tool include filters such as mesh, non-woven fabric, and cotton plug. The shape, material, and size of the container are not particularly limited, but preferred specific examples include a transparent or translucent cylindrical container having a capacity of about 150 to 500 ml and a diameter of about 4 to 10 cm. The material is particularly preferably a material having sterilization resistance, and specific examples include silicon-coated glass, polypropylene, polyvinyl chloride, polycarbonate, polysulfone, and polymethylpentene.
[0074]
【Example】
EXAMPLES Hereinafter, although an Example demonstrates this invention further in detail, this invention is not limited only to a following example. In the following examples, as a chemokine to be adsorbed, MIP-1α, which is one of the CC subfamily, is taken as an example, but it goes without saying that other chemokines can be similarly applied.
[0075]
Reference example
Agarose gel (Biogel A-5m, particle size 50-100 mesh manufactured by Bio-rad) on a glass cylindrical column (inner diameter 9 mm, column length 150 mm) equipped with a 15 μm pore filter at both ends , Uniformly filled with vinyl polymer gel (Toyopearl HW-65 manufactured by Tosoh Corp., particle size 50-100 μm) and cellulose gel (Cellulofine GC-700 m manufactured by Chisso Corp., particle size 45-105 μm) Then, water was flowed by a peristatic pump, and the relationship between the flow velocity and the pressure loss ΔP was determined. The result is shown in FIG.
[0076]
As shown in FIG. 2, Toyopearl HW-65 and Cellulofine GC-700m increase in flow rate almost in proportion to the increase in pressure, whereas Biogel A-5m causes consolidation and increases the pressure. It can be seen that the flow rate does not increase even if it is applied. In the present invention, as in the former, the relationship between the pressure loss ΔP and the flow velocity is 0.3 kg / cm. ² Those having a linear relationship up to are called hard gels.
[0077]
Example 1
After adding water to 170 ml of cellulofine GC-700m (manufactured by Chisso Corporation, globular protein exclusion limit molecular weight of 400,000), which is a cellulose-based porous carrier, the total amount is 340 ml, and then adding 90 ml of 2M aqueous sodium hydroxide solution to 40 ml. C. To this, 31 ml of epichlorohydrin was added and reacted at 40 ° C. with stirring for 2 hours. After completion of the reaction, it was thoroughly washed with water to obtain an epoxidized carrier.
[0078]
To 10 ml of this epoxidized carrier, 200 mg of n-octylamine (log P = 2.90) was added and allowed to react for 6 days in a 50 (v / v)% ethanol aqueous solution at 45 ° C. while standing. After completion of the reaction, it was washed thoroughly in the order of 50 (v / v)% aqueous ethanol, ethanol, 50 (v / v)% aqueous ethanol, and water to obtain an n-octylamine-immobilized carrier. The fixed amount of n-octylamine was 184 μmol per dry weight (1 g) of the carrier.
[0079]
For 0.5 ml each of this immobilization carrier and Cellulofine GC-700m, human genetically engineered MIP-1α (R & D systems) manufactured by healthy human serum (Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd.) 3 ml of MIP-1α-treated normal human serum (MIP-1α concentration 1.1 ng / ml) prepared by adding 2) and adsorbed under shaking at 37 ° C. for 2 hours. The concentration of MIP-1α in the supernatant solution before and after adsorption was measured using a human MIP-1α measurement kit manufactured by R & D Systems, and the adsorption rate was calculated by the following formula.
[0080]
[Expression 1]

[0081]
However, the concentration in the serum before adsorption in this case is a value obtained by correcting the moisture contained in the carrier in advance.
[0082]
The albumin concentration before and after adsorption was measured by the BCG method.
[0083]

[0084]
Example 2
A cetylamine-immobilized support was obtained in the same manner as in Example 1 except that n-octylamine was changed to cetylamine (Σf = 7.22) and the solvent for the fixation reaction was changed to ethanol. The fixed amount of cetylamine was 189 μmol per dry weight (1 g) of the carrier. Using this immobilization carrier, an adsorption experiment was conducted in the same manner as in Example 1, and the adsorption rate was calculated by measuring the concentration of MIP-1α, and the change in albumin concentration was also measured.
[0085]

[0086]
Example 3
An n-octylamine-immobilized carrier was obtained in the same manner as in Example 1 except that Cellulofine GC-700m was changed to Cellulofine GC-200m (manufactured by Chisso Corp., globular protein exclusion limit molecular weight 140,000). The fixed amount of n-octylamine was 189 μmol per dry weight (1 g) of the carrier. Using this immobilization carrier, an adsorption experiment was conducted in the same manner as in Example 1, and the adsorption rate was calculated by measuring the concentration of MIP-1α, and the change in albumin concentration was also measured.
[0087]

[0088]
Example 4
A cetylamine-immobilized carrier was obtained in the same manner as in Example 1 except that Cellulofine GC-700m was changed to Cellulofine GC-200m, n-octylamine was changed to cetylamine, and the solvent for the fixation reaction was changed to ethanol. The fixed amount of cetylamine was 189 μmol per dry weight (1 g) of the carrier. Using this immobilization carrier, an adsorption experiment was conducted in the same manner as in Example 1, and the adsorption rate was calculated by measuring the concentration of MIP-1α, and the change in albumin concentration was also measured.
[0089]

[0090]
Example 5
Commercially available cellulose acetate is dissolved in a mixed solvent of dimethyl sulfoxide and propylene glycol, and this solution is formed into droplets by the method described in JP-A-63-117039 (vibration method) and solidified to form spherical cellulose acetate. Hydrogel particles were obtained. The particles were mixed with an aqueous solution of sodium hydroxide to cause a hydrolysis reaction, thereby obtaining cellulose hydrogel particles (spherical protein having an exclusion limit molecular weight of 30,000, hereinafter referred to as C-I).
[0091]
A cetylamine-immobilized support was obtained in the same manner as in Example 1 except that Cellulofine GC-700m was changed to Cl, n-octylamine was changed to cetylamine, and the solvent for the fixation reaction was changed to ethanol. The fixed amount of cetylamine was 160 μmol per dry weight (1 g) of the carrier. Using this immobilization carrier, an adsorption experiment was conducted in the same manner as in Example 1, and the adsorption rate was calculated by measuring the concentration of MIP-1α, and the change in albumin concentration was also measured.
[0092]

[0093]
Comparative Example 1
An n-butylamine-immobilized support was obtained in the same manner as in Example 1 except that n-octylamine was changed to n-butylamine (log P = 0.97). Using this immobilization carrier, an adsorption experiment was conducted in the same manner as in Example 1, and the adsorption rate was calculated by measuring the concentration of MIP-1α, and the change in albumin concentration was also measured.
[0094]

[0095]
Comparative Example 2
An n-hexylamine-immobilized carrier was obtained in the same manner as in Example 1 except that n-octylamine was changed to n-hexylamine (log P = 2.06). Using this immobilization carrier, an adsorption experiment was conducted in the same manner as in Example 1, and the adsorption rate was calculated by measuring the concentration of MIP-1α, and the change in albumin concentration was also measured.
[0096]

[0097]
【The invention's effect】
By using an adsorbent characterized by immobilizing a compound having a log P value of 2.50 or more on a water-insoluble carrier according to the method of the present invention, chemokines in body fluids can be efficiently adsorbed and removed.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a schematic cross-sectional view of an embodiment of a chemokine adsorber according to the present invention.
FIG. 2 is a graph showing the results of examining the relationship between flow velocity and pressure loss using three types of gels.
[Explanation of symbols]
1 Body fluid inlet
2 Fluid outlet
3 Adsorbent of chemokine
4, 5 filter
6 columns
7 Chemokine adsorber

Claims (6)

水不溶性担体にｌｏｇＰ（Ｐはオクタノール−水系での分配係数）値が２．５０以上の化合物を固定してなることを特徴とする体液中のケモカイン（ただし、インターロイキン−８を除く）の吸着材。  Adsorption of chemokines (except for interleukin-8) in body fluids, characterized by immobilizing a compound with a log P (P is an octanol-water partition coefficient) value of 2.50 or more on a water-insoluble carrier Wood. 水不溶性担体が親水性担体である請求項１記載の体液中のケモカイン（ただし、インターロイキン−８を除く）の吸着材。  The adsorbent for chemokines (except for interleukin-8) in body fluids according to claim 1, wherein the water-insoluble carrier is a hydrophilic carrier. 水不溶性担体が多孔構造を有する請求項１または２記載の体液中のケモカイン（ただし、インターロイキン−８を除く）の吸着材。  The adsorbent for chemokines (excluding interleukin-8) in body fluids according to claim 1 or 2, wherein the water-insoluble carrier has a porous structure. 水不溶性担体の、球状蛋白質の排除限界分子量が１万以上６０万以下である請求項１、２または３記載の体液中のケモカイン（ただし、インターロイキン−８を除く）の吸着材。  The adsorbent for chemokines (except for interleukin-8) in body fluids according to claim 1, 2 or 3, wherein the water-insoluble carrier has a globular protein exclusion limit molecular weight of 10,000 to 600,000. 体液中のケモカイン（ただし、インターロイキン−８を除く）を吸着除去するための吸着器の製造のための請求項１記載のケモカイン（ただし、インターロイキン−８を除く）の吸着材の使用。 Chemokine in body fluids (excluding interleukin-8) chemokine according to claim 1 for the preparation of adsorbers for adsorbing and removing (excluding interleukin-8) used the adsorbent. 液の入口および出口を有し、かつ吸着材の容器外への流出防止手段を備えた容器内に、請求項１記載のケモカイン（ただし、インターロイキン−８を除く）の吸着材を充填してなることを特徴とする体液中のケモカイン（ただし、インターロイキン−８を除く）の吸着器。  A chemokine (except for interleukin-8) adsorbent according to claim 1 is filled in a container having an inlet and an outlet for liquid and provided with means for preventing the adsorbent from flowing out of the container. An adsorber for chemokines (except for interleukin-8) in body fluids.

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