JP4026923B2

JP4026923B2 - Polypeptide

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Publication number: JP4026923B2
Application number: JP07854998A
Authority: JP
Inventors: 角二鳥越; 隆則大倉; 雅司栗本
Original assignee: Hayashibara Seibutsu Kagaku Kenkyujo KK
Current assignee: Hayashibara Seibutsu Kagaku Kenkyujo KK
Priority date: 1997-03-12
Filing date: 1998-03-12
Publication date: 2007-12-26
Anticipated expiration: 2018-03-12
Also published as: JPH11240898A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
この発明はサイトカインを認識する新規な受容体蛋白質、とりわけ、インターロイキン−１８（以下、「ＩＬ−１８」と略記する。）を認識する新規なポリペプチドに関する。
【０００２】
【従来の技術】
ＩＬ−１８は、免疫系における情報伝達物質であるサイトカインの一種である。ＩＬ−１８は、特開平８−２７１８９号公報、特開平８−１９３０９８号公報及びハルキ・オカムラら『ネイチャー』、第３７８巻、第６，５５２号、８８乃至９１頁（１９９５年）に見られるように、発見当初、インターフェロン−γ誘導因子として記載されていたが、その後、シンペイ・ウシオら『ザ・ジャーナル・オブ・イムノロジー』、第１５６巻、４，２７４乃至４，２７９頁（１９９６年）における提案にしたがって、「ＩＬ−１８」と呼称されるようになった。成熟型のＩＬ−１８は１５７個のアミノ酸からなり、免疫担当細胞において生理活性物質として有用なインターフェロン−γ（以下、「ＩＦＮ−γ」と略記する。）の産生を誘導する性質と、キラー細胞の細胞障害性を増強したり、キラー細胞の生成を誘導する性質を兼備している。これらの性質故に、ＩＬ−１８は抗ウイルス剤、抗菌剤、抗腫瘍剤、抗免疫疾患剤などの医薬品として広範な用途が期待され、鋭意研究が進められている。
【０００３】
前述のとおり、ＩＬ−１８にかぎらず、サイトカインは、本来、免疫系における情報伝達を担う物質として産生され、分泌される。したがって、サイトカインが哺乳類の体内で過剰に産生されたり、外部から投与されたりすると、免疫系のバランスに片寄りを生じる可能性がある。哺乳類の細胞の表面には、通常、受容体と呼ばれるサイトカインを認識する部位があり、分泌されたサイトカインは、この受容体に結合することによって、初めて所期の情報を細胞に伝達することができる。正常な免疫系においては、サイトカインとサイトカインを認識する受容体がある一定のバランスを保っていると考えられる。したがって、斯界においては、ＩＬ−１８を医薬品として実用化するためにも、ＩＬ−１８そのものの生理作用の解明に加えて、ＩＬ−１８受容体（以下、「ＩＬ−１８Ｒ」と略記する。）の性質・性状が一刻も早く解明され、量産されることが期待されている。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
斯かる状況に鑑み、この発明の第一の課題は、量産容易なＩＬ−１８Ｒとしてのポリペプチドを提供することにある。
【０００５】
さらに、この発明の第二の課題は、斯かるポリペプチドの医薬としての用途を提供することにある。
【０００６】
加えて、この発明の第三の課題は、斯かるポリペプチドをコードするＤＮＡを提供することにある。
【０００７】
さらに加えて、この発明の第四の課題は、斯かるポリペプチドの製造方法を提供することにある。
【０００８】
さらに加えて、この発明の第五の課題は、斯かるポリペプチドを用いるＩＬ−１８の中和剤を提供することにある。
【０００９】
さらに加えて、この発明の第六の課題は、斯かるポリペプチドによるＩＬ−１８の中和方法を提供することにある。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
本発明者らがこれらの課題を解決すべく鋭意研究したところ、ホジキン病患者に由来するリンパ芽球様細胞の一種であるＬ４２８細胞中にＩＬ−１８を認識する物質が存在していることを突き止めた。本発明者がこの物質を分離し、性質・性状を調べたところ、その本質は蛋白質であり、分離された状態においてもＩＬ−１８をよく認識し、結合することが判明した。斯くして存在が確認されたＩＬ−１８Ｒは、ヒトを含む哺乳類において、免疫系を活性化するＩＬ−１８を認識し、その生理活性を中和するので、自己免疫疾患を初めとする過剰な免疫反応に起因する種々の疾患の治療・予防に効果を発揮することが判明した。さらに、本発明者がこのＩＬ−１８Ｒの部分アミノ酸配列を手掛りにＬ４２８細胞を鋭意検索したところ、ＩＬ−１８ＲをコードするＤＮＡを取得するに到った。そして、このＤＮＡを人為的に発現させて得られるポリペプチドがＩＬ−１８をよく認識し、Ｌ４２８細胞から分離されたＩＬ−１８Ｒと同様の生理活性を有することを確認するとともに、そのポリペプチドが斯かるＤＮＡを用いる組換えＤＮＡ技術により、所望量を製造し得るものであることを確認してこの発明を完成した。
【００１１】
すなわち、この発明は前記第一の課題を、遺伝子の発現によって得ることができる、ＩＬ−１８Ｒとしてのポリペプチドにより解決するものである。
【００１２】
この発明は前記第二の課題を、有効成分として、斯かるポリペプチドを含んでなるＩＬ−１８Ｒ感受性疾患剤により解決するものである。
【００１３】
この発明は前記第三の課題を、斯かるポリペプチドをコードするＤＮＡにより解決するものである。
【００１４】
この発明は前記第四の課題を、斯かるポリペプチドをコードするＤＮＡを発現させる工程と、生成したポリペプチドを採取する工程を含んでなるポリペプチドの製造方法により解決するものである。
【００１５】
この発明は前記第五の課題を、斯かるポリペプチドを有効成分とするＩＬ−１８の中和剤により解決するものである。
【００１６】
この発明は前記第六の課題を、ＩＬ−１８に斯かるポリペプチドを作用させることを特徴とするＩＬ−１８の中和方法により解決するものである。なお、この発明で用いるＬ４２８細胞は、平成８年１２月２４日以降、茨城県つくば市東１丁目１番３号にある通商産業省、工業技術院、生命工学工業技術研究所に受託番号『ＦＥＲＭＢＰ−５７７７』で寄託されている。
【００１７】
【発明の実施の形態】
この発明は、遺伝子の発現によって得ることができる、ＩＬ−１８Ｒとしてのポリペプチドに関するものである。この発明によるヒト由来のポリペプチドは、通常、部分アミノ酸配列として、配列表における配列番号１２乃至１９に示すアミノ酸配列の１又は複数を含有し、全体としては、例えば、配列表における配列番号２０に示すアミノ酸配列の一部又は全部を含有する。また、この発明によるマウス由来のポリペプチドは、通常、配列表における配列番号２１に示すアミノ酸配列の一部又は全部を含有する。したがって、この発明でいうポリペプチドとは、配列表における配列番号２０又は２１に示すアミノ酸配列をそっくりそのまま含有するポリペプチドに加えて、例えば、それらのアミノ酸配列に１又は複数のアミノ酸が付加したポリペプチド、とりわけ、Ｃ末端及び／又はＮ末端に１又は複数のアミノ酸が付加したアミノ酸配列を含有するポリペプチド、配列番号２０及び２１に示すアミノ酸配列におけるアミノ酸の１又は複数が欠失したアミノ酸配列を含有するポリペプチド、とりわけ、配列番号２２乃至２５に示すアミノ酸配列を含有する可溶性ポリペプチド、さらには、上述のごときポリペプチドに糖鎖が結合したポリペプチドであっても、それらが遺伝子の発現によって得ることができ且つＩＬ−１８Ｒとしての機能を有するかぎり、すべて包含するものとする。ちなみに、ＩＬ−１８は、すでに、ヒト及びマウスに由来するものが知られており、これらはいずれも１５７個のアミノ酸を含んでなり、それぞれ、配列表における配列番号２６に示すアミノ酸配列（ただし、符合「Ｘａａ」を付して示したアミノ酸は、イソロイシン又はトレオニンを表すものとする。）、及び、配列表における配列番号２７に示すアミノ酸配列（ただし、符合「Ｘａａ」を付して示したアミノ酸は、メチオニン又はトレオニンを表すものとする。）を有する。
【００１８】
この発明のポリペプチドは、通常、組換えＤＮＡ技術を応用して製造される。すなわち、当該ポリペプチドをコードするＤＮＡを人為的に発現させ、生成したポリペプチドを採取する。この発明は、当該ポリペプチドをコードするＤＮＡに加えて、組換えＤＮＡ技術を用いる当該ポリペプチドの製造方法を提供するものでもあり、この発明の製造方法によるときには、所望量の当該ポリペプチドが容易に得られる。
【００１９】
この発明の製造方法で用いるＤＮＡとしては、それが当該ポリペプチドをコードするかぎり、天然の給源から得られたＤＮＡであっても、これを人為的に改変したり、化学合成したものであってもよい。すなわち、斯界においては、一般に、あるポリペプチドをコードするＤＮＡを人為的に発現させるに際し、そのＤＮＡの発現効率を改善したり、あるいは、ポリペプチドそのものの生理活性や物性を改善する目的で、ＤＮＡにおける塩基の１又は複数を他の塩基で置換したり、ＤＮＡに適宜の塩基配列を連結することがある。この発明のＤＮＡにおいても斯かる変更は当然可能であり、具体的には、最終的に得られるポリペプチドが所期の生理活性を失わない範囲で、前述のごときこの発明のポリペプチドをコードするＤＮＡにおける５´末端及び／又は３´末端に適宜の制限酵素による認識部位、開始コドン、終止コドン、プロモーター、エンハンサーなどの塩基配列を連結し得ることは言うまでもない。したがって、この発明でいうＤＮＡとは、前述のごときポリペプチドをコードするＤＮＡ、そのＤＮＡの塩基配列に相補的な塩基配列を有するＤＮＡ、さらには、それらのＤＮＡがコードするアミノ酸配列を変更することなく、塩基の１又は複数を他の塩基で置換したＤＮＡのすべてを包含することとなる。
【００２０】
斯かるＤＮＡを天然の給源から得るには、例えば、配列表における配列番号１２乃至２５に示すアミノ酸配列に基づき調製したオリゴヌクレオチドをプローブにして、上皮細胞、内皮細胞、間質細胞、軟骨細胞、単球、顆粒球、リンパ球、神経細胞及びそれらを培養株化して得られるヒト及びマウスを含む哺乳類由来の細胞を検索すればよい。細胞の検索に当たり、検索対象の細胞を培養する培養培地に、斯かる細胞においてＩＬ−１８Ｒ遺伝子の発現を誘発し得る物質、とりわけ、ＩＬ−１２やＩＬ−１８を細胞１×１０⁶ 当たり約０．０１ｐｇ乃至１μｇ、望ましくは、約１ｐｇ乃至１００ｎｇ含有せしめると、目的とするＤＮＡの取得を容易にすることができる。望ましい細胞の具体例としては、リンパ球を始めとする造血系細胞などを培養株化して得られる、例えば、ジュン・ミノワダ『キャンサー・レビュー』、第１０巻、１乃至１８頁（１９８８年）に記載されているＪＭ細胞、ＨＤＬＭ−２細胞、ＭＯＬＴ−１６細胞及びＰＥＥＲ細胞、さらには、Ｌ４２８細胞（ＦＥＲＭＢＰ−５７７７）、ＫＧ−１細胞（ＡＴＣＣＣＣＬ−２４６）、Ｕ−９３７細胞（ＡＴＣＣＣＲＬ−１５９３．２）などのリンパ芽球様細胞が挙げられる。斯くして得られるＤＮＡのうち、ヒト及びマウス由来のＤＮＡは、通常、それぞれ配列表における配列番号１及び２に示す塩基配列の一部又は全部を含有する。例えば、ホジキン病患者由来のリンパ芽球様細胞の一種であるＬ４２８細胞（ＦＥＲＭＢＰ−５７７７）から得られるＤＮＡは、配列表における配列番号７に示したとおり、配列番号２０に示すアミノ酸配列をコードする配列番号１に示す塩基配列と、配列番号１に示す塩基配列の５´末端に連結されたシグナルペプチドをコードする塩基配列からなる。また、配列表における配列番号２２乃至２５に示すアミノ酸配列の可溶性ポリペプチドは、それぞれ、配列番号３乃至６に示す塩基配列によってコードされ、配列番号８乃至１１の塩基配列に示したように、通常、その５´末端にシグナルペプチドをコードする塩基配列を連結した形態で用いられる。斯かるＤＮＡは通常の化学合成によっても得られ、いずれにしても、一旦ＤＮＡが入手されれば、これにＰＣＲ法を適用することによって所望のレベルに容易に増幅することができる。なお、配列表における配列番号２０及び２１に示すアミノ酸配列は、いずれも、シグナルペプチドのアミノ酸配列とともに、ピー・パーネットら、『ザ・ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー』、第２７１巻、３，９６７乃至３，９７０頁（１９９６年）に報告されている。しかしながら、同論文においては、配列番号２０及び２１に示すアミノ酸配列を有するポリペプチドがＩＬ−１８Ｒとして機能する事実について、示唆も教示もなされていない。
【００２１】
斯かるＤＮＡは、微生物及び動植物由来の適宜の宿主に導入すると、当該ポリペプチドを発現する。この発明のＤＮＡは、通常、組換えＤＮＡの形態で宿主に導入される。組換えＤＮＡはこの発明のＤＮＡと自律複製可能なベクターを含んでなり、ＤＮＡさえ入手できれば、通常一般の組換えＤＮＡ技術により比較的容易に調製することができる。この発明のＤＮＡを挿入し得るベクターとしては、例えば、ｐＫＫ２２３−３、ｐｃＤＮＡＩ／Ａｍｐ、ＢＣＭＧＳＮｅｏ、ｐｃＤＬ−ＳＲα、ｐＫＹ４、ｐＣＤＭ８、ｐＣＥＶ４、ｐＭＥ１８Ｓ、ｐＥＦ−ＢＯＳなどのプラスミドベクターが挙げられる。自律複製可能なベクターは、通常、プロモーター、エンハンサー、複製起点、転写終結部位、スプライシング配列及び／又は選択配列などの、この発明のＤＮＡが個々の宿主において発現するための適宜塩基配列を含んでなる。なお、プロモーターとして、例えば、熱ショック蛋白質プロモーターや、あるいは、同じ特許出願人による特開平７−１６３３６８号公報に開示されたインターフェロン−αプロモーターを用いるときには、形質転換体における当該ＤＮＡの発現を外部刺激により人為的に制御できることになる。
【００２２】
斯かるベクターにこの発明のＤＮＡを挿入するには、斯界において慣用の方法が用いられる。具体的には、まず、この発明のＤＮＡを含む遺伝子と自律複製可能なベクターとを制限酵素及び／又は超音波により切断し、次に、生成したＤＮＡ断片とベクター断片を連結する。遺伝子及びベクターの切断にヌクレオチドに特異的に作用する制限酵素、とりわけ、ＡｃｃＩ、ＢａｍＨＩ、ＢｓｔＸＩ、ＥｃｏＲＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＮｏｔＩ、ＰｓｔＩ、ＳａｃＩ、ＳａｌＩ、ＳｍａＩ、ＳｐｅＩ、ＸｂａＩ、ＸｈｏＩなどを用いれば、ＤＮＡ断片とベクター断片を連結するのが容易となる。ＤＮＡ断片とベクター断片を連結するには、必要に応じて、両者をアニーリングした後、生体内又は生体外でＤＮＡリガーゼを作用させればよい。斯くして得られる組換えＤＮＡは、微生物や動物由来の宿主において無限に複製可能である。
【００２３】
斯かる組換えＤＮＡは、適宜宿主に導入して当該ポリペプチドの製造に用いられる。宿主としては、斯界において慣用される微生物及び動植物由来のものを用いることができるが、ポリペプチドの最終用途が医薬品である場合には、酵母や哺乳類由来の宿主が望ましい。哺乳類由来の宿主細胞の具体例としては、例えば、３Ｔ３細胞（ＡＴＣＣＣＣＬ−９２）、Ｃ１２７Ｉ細胞（ＡＴＣＣＣＲＬ−１６１６）、ＣＨＯ−Ｋ１細胞（ＡＴＣＣＣＣＬ−６１）、ＣＶ−１細胞（ＡＴＣＣＣＣＬ−７０）、ＣＯＳ−１細胞（ＡＴＣＣＣＲＬ−１６５０）、ＨｅＬａ細胞（ＡＴＣＣＣＣＬ−２）、ＭＯＰ−８細胞（ＡＴＣＣＣＲＬ−１７０９）及びそれらの変異株を始めとする、ヒト、サル、マウス及びハムスター由来の上皮系細胞、間質系細胞及び造血系細胞が挙げられる。斯かる宿主にこの発明のＤＮＡを導入するには、例えば、公知のＤＥＡＥ−デキストラン法、燐酸カルシウム法、エレクトロポレーション法、リポフェクション法、マイクロインジェクション法、さらには、レトロウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルスなどによるウイルス感染法などを用いればよい。形質転換体から当該ポリペプチドを産生するクローンを選択するには、形質転換体を培養培地で培養し、当該ポリペプチドの産生が観察されたクローンを選択すればよい。なお、哺乳類由来の宿主細胞を用いる組換えＤＮＡ技術については、例えば、黒木登志夫、谷口克、押村光雄編集、『実験医学別冊細胞工学ハンドブック』、１９９２年、羊土社発行や横田崇、新井賢一編集、『実験医学別冊バイオマニュアルシリーズ３遺伝子クローニング実験法』、１９９３年、羊土社発行などにも詳述されている。
【００２４】
斯くして得られる形質転換体は、培養培地で培養すると、宿主内外に当該ポリペプチドを産生する。培養培地としては、形質転換体を培養するための慣用の培養培地を用いればよく、斯かる培養培地は、通常、緩衝水を基材とし、これにナトリウムイオン、カリウムイオン、カルシウムイオン、燐イオン、塩素イオンなどの無機イオンと、宿主の代謝能力に応じた微量元素、炭素源、窒素源、アミノ酸、ビタミンなどを加え、必要に応じて、さらに血清、ホルモン、細胞成長因子、細胞接着因子などを含有せしめて構成される。個々の培養培地としては、例えば、１９９培地、ＤＭＥＭ培地、Ｈａｍ´ｓＦ１２培地、ＩＭＤＭ培地、ＭＣＤＢ１０４培地、ＭＣＤＢ１５３培地、ＭＥＭ培地、ＲＤ培地、ＲＩＴＣ８０−７培地、ＲＰＭＩ−１６３０培地、ＲＰＭＩ−１６４０培地、ＷＡＪＣ４０４培地などが挙げられる。斯かる培養培地に形質転換体を約１×１０⁴乃至１×１０⁷個／ｍｌ、望ましくは、約１×１０⁵乃至１×１０⁶個／ｍｌ接種し、必要に応じて新鮮な培養培地と取替えながら、温度３７℃前後で１日乃至１週間、望ましくは、２乃至４日間浮遊培養又は単層培養すると、当該ポリペプチドを含む培養物が得られる。形質転換体の種類や培養条件にもよるが、斯くして得られる培養物は、通常、１ｌ当り当該ポリペプチドを約１μｇ乃至１ｍｇ含む。
【００２５】
このようにして得られた培養物は、必要に応じて、超音波、細胞溶解酵素及び／又は界面活性剤により菌体又は細胞を破砕した後、濾過、遠心分離などにより当該ポリペプチドを菌体若しくは細胞又はそれらの破砕物から分離し、精製する。精製には菌体若しくは細胞又はそれらの破砕物を除去した培養物に、例えば、塩析、透析、濾過、濃縮、分別沈澱、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー、等電点クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ゲル電気泳動、等電点電気泳動などの生理活性蛋白質を精製するための斯界における慣用の方法が適用され、必要に応じて、これらは適宜組合せて適用される。そして、最終使用形態に応じて、精製ポリペプチドを濃縮・凍結乾燥して液状又は固状にすればよい。なお、同じ特許出願人による特開平８−１９３０９８号公報に開示されたＩＬ−１８及び特願平８−３５６４２６号明細書に開示されたモノクローナル抗体は当該ポリペプチドの精製に極めて有用であり、これらを用いるイムノアフィニティークロマトグラフィーによるときには、高純度の当該ポリペプチドが最少の時間と労力で得られる。
【００２６】
この発明のポリペプチドは、ヒトを含む哺乳類において、免疫系を活性化するＩＬ−１８を認識・結合して免疫反応を抑制したり調節する性質を有するので、過剰な免疫反応に起因する種々の疾患の治療・予防に著効を発揮する。免疫系は、本来、有害な異物から生体を防御するためのものであるが、ときとして、その働き故に、却って、生体に有害な結果をもたらすことがある。哺乳類に、例えば、皮膚、腎臓、肝臓、心臓、骨髄などの臓器を移植すると、同種異系抗原に対する拒絶反応や免疫反応により、Ｔ細胞が活性化され、リンパ球が増殖したり、炎症が生じることがある。症状の程度こそ違え、同様の現象は、例えば、アレルゲンのように、宿主が固有のものと見做さない異種異系抗原が侵入した場合にも観察される。自己免疫疾患においては、本来、固有のものと見做されるべき成分がアレルギー反応を惹起する。この発明のポリペプチドは、ヒトを含む哺乳類に投与すると、斯かる免疫反応を抑制又は調節し、それらに起因する各種疾患の治療・予防に著効を発揮する。したがって、この発明でいう感受性疾患とは免疫反応の亢進に起因する疾患であって、ＩＬ−１８Ｒが直接又は間接に作用して治療又は予防し得るすべての疾患ということになり、個々の感受性疾患としては、例えば、上記のごとき臓器移植に伴う拒絶反応や、悪性貧血、萎縮性胃炎、インスリン抵抗性糖尿病、ウェジナー肉芽腫症、円板状エリテマトーデス、潰瘍性大腸炎、寒冷凝集素症、グッドパスチャー症候群、クローン病、原発性胆汁性肝硬変症、交感性眼炎、甲状腺機能亢進症、若年性糖尿病、シェーグレン症候群、自己免疫性肝炎、自己免疫性溶血性貧血、重症筋無力症、進行性全身性硬化症、全身性エリテマトーデス、多発性寒冷血色素尿症、多発性筋炎、多発性結節性動脈炎、多発性硬化症、特発性アジソン病、特発性血小板減少性紫班病、バセドウ病、白血球減少症、ベーチェット病、早発性更年期、慢性関節リウマチ、リウマチ熱、慢性甲状腺炎、ホジキン病、ＨＩＶ感染症、喘息、アトピー性皮膚炎、アレルギー性鼻炎、花粉症及びハチ毒アレルギーを含む自己免疫疾患及びアレルギー性疾患が挙げられる。なお、この発明のポリペプチドは、ＩＦＮ−γの過剰産生や過剰投与などに起因する敗血症ショックの治療や予防にも有効である。
【００２７】
斯くして、有効成分としてこの発明のポリペプチドを含んでなる感受性疾患剤は、上記のごとき感受性疾患を治療・予防するための抗自己免疫疾患剤、抗アレルギー剤、抗炎症剤、免疫抑制剤、増血剤、白血球増多剤、血小板増多剤、鎮痛剤、解熱剤などとして多種多様な用途を有することとなる。剤型並びに感受性疾患の種類及び症状にもよるが、この発明の感受性疾患剤は、通常、液状、懸濁状、ペースト状又は固形状に調製され、この発明のポリペプチドを０．００００１乃至１００％（ｗ／ｗ）、望ましくは、０．０００１乃至２０％（ｗ／ｗ）含んでなる。
【００２８】
この発明の感受性疾患剤は、当該ポリペプチド単独の形態はもとより、それ以外の生理的に許容される、例えば、担体、賦形剤、希釈剤、アジュバント、安定剤、さらには、必要に応じて、他の生理活性物質の１若しくは複数種類との組成物としての形態をも包含する。安定剤としては、例えば、血清アルブミンやゼラチンなどの蛋白質、グルコース、シュークロース、ラクトース、マルトース、トレハロース、ソルビトール、マルチトール、マンニトール、ラクチトールなどの糖質及びクエン酸塩若しくは燐酸塩を主体とする緩衝剤が、また、併用し得る他の生理活性物質としては、例えば、ＦＫ５０６、グルココルチコイド、シクロフォスファミド、ナイトロゲンマスタード、トリエチレンチオフォスファミド、ブズルファン、フェニラミンマスタード、クロランブシル、アザチオプリン、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、６−アザグアニン、８−アザグアニン、フルオロウラシル、シタラビン、メトトレキセート、アミノプテリン、マイトマイシンＣ、塩酸ダウノルビシン、アクチノマイシンＤ、クロモマイシンＡ３、塩酸ブレオマイシン、塩酸ドキソルビシン、サイクロスポリンＡ、Ｌ−アスパラギナーゼ、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ヒドロキシウレア、塩酸プロカルバジン、副腎皮質ホルモン、金製剤などの他に、ＩＬ−１８以外のサイトカインの受容体アンタゴニスト、例えば、インターロイキン−１受容体蛋白質、インターロイキン−２受容体蛋白質、インターロイキン−５受容体蛋白質、インターロイキン−６受容体蛋白質、インターロイキン−８受容体蛋白質及びインターロイキン−１２受容体蛋白質に対するそれぞれの抗体、さらには、ＴＮＦ−α受容体、ＴＮＦ−β受容体、インターロイキン−１受容体、インターロイキン−５受容体及びインターロイキン−８受容体に対するそれぞれのアンタゴニストなどが挙げられる。
【００２９】
さらに、この発明の感受性疾患剤は投薬単位形態の薬剤をも包含し、その投薬単位形態の薬剤とは、当該ポリペプチドを、例えば、１回当りの用量又はその整数倍（４倍まで）若しくはその約数（１／４０まで）に相当する量を含んでなり、投薬に適する物理的に一体の剤型にある薬剤を意味する。このような投薬単位形態の薬剤としては、注射剤、液剤、散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、舌下剤、点眼剤、点鼻剤、坐剤などが挙げられる。この発明の感受性疾患剤は経口的に投与しても非経口的に投与してもよく、いずれの場合にも感受性疾患の治療・予防に効果を発揮する。感受性疾患の種類や症状にもよるが、具体的には、患者の症状や投与後の経過を観察しながら、成人当り約１μｇ乃至１ｇ／回、通常、約１０μｇ乃至１００ｍｇ／回の当該ポリペプチドを１乃至４回／日又は１乃至５回／週の用量で１日乃至１年間に亙って経口投与するか、皮内、皮下、筋肉内又は静脈内に非経口投与すればよい。
【００３０】
ところで、この発明のポリペプチドをコードするＤＮＡは、いわゆる、「遺伝子療法」にも有用である。すなわち、通常の遺伝子療法においては、この発明のＤＮＡを、例えば、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルスなどのウイルス由来のベクターに挿入するか、カチオニックポリマーや膜融合型リポソームなどのリポソームに包埋し、この状態でＩＬ−１８Ｒに感受性を有する疾患に罹患した患者に直接注入するか、あるいは、患者からリンパ球を採取し、生体外で導入した後、患者に自家移植するのである。また、養子免疫遺伝子療法においては、効果細胞にこの発明のＤＮＡを通常の遺伝子療法の場合と同様にして導入すると、例えば、腫瘍細胞やウイルス感染細胞などの標的細胞に対する効果細胞の細胞障害性が高まり、養子免疫療法を強化することができる。さらに、腫瘍ワクチン遺伝子療法においては、患者から摘出した腫瘍細胞にこの発明のＤＮＡを通常の遺伝子療法の場合と同様にして導入し、生体外で一定数に達するまで増殖させた後、患者に自家移植するのである。移植された腫瘍細胞は患者体内においてワクチンとして作用し、強力且つ抗原特異的な抗腫瘍免疫を発揮する。斯くして、この発明のＤＮＡは、例えば、悪性腫瘍、ウイルス性疾患、感染症及び自己免疫疾患を始めとする各種疾患の遺伝子療法、さらには、臓器移植やアレルギー性疾患に伴う拒絶反応や過剰な免疫反応の抑制に著効を発揮することとなる。なお、これらの遺伝子療法を実施するための一般的手順は、例えば、島田隆、斉藤泉、小澤敏也編集、『実験医学別冊バイオマニュアルＵＰシリーズ遺伝子治療の基礎技術』、１９９６年、羊土社発行にも詳述されている。さらに、この発明のポリペプチドをコードするＤＮＡは、その一部又は全てをプローブ又はプライマーとして用いるハイブリダイゼーション法やＰＣＲ法を諸種の哺乳類に由来するＤＮＡやＲＮＡに適用することにより、この発明のポリペプチドと構造的に関連する物質をコードするＤＮＡ、例えば、この発明に開示された個々のＤＮＡとは相違する起源のＩＬ−１８ＲとしてのポリペプチドをコードするＤＮＡ、さらには、ＩＬ−１８Ｒに対する作動薬や拮抗薬などをコードするＤＮＡの検索にも有用である。
【００３１】
また、この発明のポリペチプチドはＩＬ−１８を認識し、結合する性質があるので、当然のことながら、ＩＬ−１８を精製したり検出するためのアフィニティークロマトグラフィーや標識アッセイにおいても有用である。また、これに加え、この発明のポリペプチド、とりわけ、この発明の可溶性ポリペプチドは、ＩＬ−１８Ｒに対する作動薬や拮抗薬の、生体内又は生体外での検索にも有用である。さらに、この発明のポリペプチドには、ＩＬ−１８を認識し、結合して、その生理作用を中和する性質があるので、当該ポリペプチドを有効成分とするこの発明の中和剤及び、ＩＬ−１８に当該ポリペプチドを作用させるこの発明の中和方法は、ＩＬ−１８の過剰産生やＩＬ−１８の過剰投与に起因する種々の疾患の治療に有用である。
【００３２】
以下、この発明の実施の形態につき、実施例を挙げて説明する。なお、以下の実施例１乃至９において用いられる手法は斯界において慣用のものであり、例えば、黒木登志夫、谷口克、押村光雄編集、『実験医学別冊細胞工学ハンドブック』、１９９２年、羊土社発行や横田崇、新井賢一編集、『実験医学別冊バイオマニュアルシリーズ３遺伝子クローニング実験法』、１９９３年、羊土社発行などにも詳述されている。
【００３３】
【実施例１】
〈ＩＬ−１８Ｒの調製と特徴付け〉
【００３４】
【実施例１−１】
〈ＩＬ−１８Ｒの調製〉
常法により、生後間もないハムスター新生児の腹腔内にウサギ由来の抗リンパ球抗体を注射して免疫反応を減弱させた後、背部皮下にホジキン病患者に由来するリンパ芽球様細胞株の一種であるＬ４２８細胞（ＦＥＲＭＢＰ−５７７７）を約５×１０⁵個／匹注射移植し、通常の方法で３週間飼育した。皮下に生じた腫瘍塊（約１０ｇ／匹）を摘出し、常法により血清無含有のＲＰＭＩ−１６４０培地（ｐＨ７．４）により分散させ、洗浄して増殖細胞を得た。
【００３５】
この増殖細胞に対して０．８３％（ｗ／ｖ）塩化アンモニウムと１７０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．７）との混液（容量比９：１）を細胞湿重量の１０倍量加え、撹拌した後、２，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離して細胞を回収した。次に、細胞を適量の燐酸緩衝食塩水（以下、「ＰＢＳ」と言う。）に浮遊させ、撹拌し、２，０００ｒｐｍで遠心分離して再度回収し、１ｍＭ塩化マグネシウムを含む１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．２）に細胞密度約１×１０⁸個／ｍｌになるように浮遊させ、キネマティカ製細胞破砕機『ポリトロン』により破砕し、１ｍＭ塩化マグネシウム及び１Ｍシュークロースをそれぞれ含む１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．２）をシュークロースの最終濃度が０．２Ｍになるように加えた後、１，０００ｒｐｍで遠心分離して上清を採取し、これを２５，０００ｒｐｍでさらに６０分間遠心分離し、沈澱部を採取した。この沈澱に１２ｍＭ３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−１−プロパンスルフォネート（以下、「ＣＨＡＰＳ」と言う。）、１０ｍＭＥＤＴＡ及び１ｍＭフェニルメチルスルフォニルフルオライドをそれぞれ適量加え、４℃で１６時間撹拌した後、２５，０００ｒｐｍで６０分間遠心分離し、上清を採取した。
【００３６】
この上清を１２ｍＭＣＨＡＰＳを含むＰＢＳにより平衡化しておいたファルマシア製アフィニティークロマトグラフィー用ゲル『ウィート・ジャーム・レクチン・セファロース６Ｂ』のカラムに負荷し、カラムを１２ｍＭＣＨＡＰＳを含むＰＢＳにより洗浄した後、溶出液の蛋白質含量を波長２８０ｎｍの紫外線に対する吸光度でモニターしながら、０．５ＭＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン及び１２ｍＭＣＨＡＰＳをそれぞれ含むＰＢＳを通液した。そして、吸光度が０．１６乃至０．２０の画分を採取し、合一したところ、蛋白質含量約１ｍｇ／ｍｌの水溶液が原料細胞１０¹²個当り約２５ｌ得られた。
【００３７】
この水溶液の一部を小分し、常法にしたがって ¹²⁵Ｉで標識したヒトＩＬ−１８を４ｎｇずつ加え、４℃で１時間インキュベートし、担体としてγ−グロブリンと平均分子量６，０００ダルトンのメルク製ポリエチレングリコール『ポリエチレングリコール６０００』をそれぞれ適量加え、氷冷下で３０分間静置して結合反応させた後、反応物を６，０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、生じた沈澱を採取し、放射能強度を測定した。同時に、 ¹²⁵Ｉ標識ヒトＩＬ−１８に加えて未標識のヒトＩＬ−１８を３μｇ用いる系を設け、これを上記と同様に処置して対照とした。対照と比較したところ、被検水溶液から生じた沈澱の放射能強度は有意に高かった。このことは、上記で得た水溶液が正にＩＬ−１８Ｒを含有するものであり、ＩＬ−１８に作用させると、このＩＬ−１８ＲがＩＬ−１８を認識し、結合したことを示している。
【００３８】
【実施例１−２】
〈モノクローナル抗体に対する結合性〉
Ｌ４２８細胞（ＦＥＲＭＢＰ−５７７７）を０．１％（ｗ／ｖ）アジ化ナトリウムを含み、０．１％（ｖ／ｖ）ウシ血清アルブミンを補足したＲＰＭＩ−１６４０培地（ｐＨ７．４）に細胞密度４×１０⁷個／ｍｌになるように浮遊させる一方、同じ特許出願人による特願平８−３５６４２６号明細書に記載された方法により得た、ヒトＩＬ−１８Ｒに特異的なモノクローナル抗体ＭＡｂ＃１１７−１０Ｃを濃度０．０１９μｇ／ｍｌ、０．２０９μｇ／ｍｌ、２．３μｇ／ｍｌ、２５．３μｇ／ｍｌ又は１３９．５μｇ／ｍｌになるように０．１％（ｖ／ｖ）ウシ血清アルブミンを補足した別のＲＰＭＩ−１６４０培地（ｐＨ７．４）に溶解した。
【００３９】
次に、上記で調製した細胞浮遊液を５０μｌずつとり、これに濃度の相違する上記モノクローナル抗体溶液のいずれかを５０μｌずつ加え、４℃で２時間振盪した後、常法にしたがって ¹²⁵Ｉにより標識したヒトＩＬ−１８を４ｎｇ含み、０．１％（ｖ／ｖ）ウシ血清アルブミンを補足したＲＰＭＩ−１６４０培地（ｐＨ７．５）を５０μｌずつ加え、同じ温度でさらに３０分間振盪した。その後、各細胞浮遊液にジブチルフタレート／ジオクチルフタレート混液（容量比１：１）を２００μｌずつ加え、２０℃、１０，０００ｒｐｍで５分間遠心分離した後、細胞を含む沈澱部を採取し、アロカ製ガンマカウンター『ＡＲＣ−３００型』を用いて放射能強度を測定した。
【００４０】
同時に、モノクローナル抗体を省略する一方、 ¹²⁵Ｉ標識ヒトＩＬ−１８を４ｎｇとともに未標識ヒトＩＬ−１８を４μｇ加える系（非特異的結合区）と未標識ヒトＩＬ−１８を加えない系（総結合区）をそれぞれ設け、これらを試験区と同様に処置した。そして、「総結合区」及び「非特異的結合区」において観察された放射能強度と、試験区において観察された放射能強度をそれぞれ数１に示す式に代入し、阻害率（％）を計算した。結果を図１に示す。
【００４１】
【数１】

【００４２】
さらに、実施例１−１の方法により得たＩＬ−１８Ｒを含む水溶液を５０μｌずつとり、これを上記と同様の濃度に調製したモノクローナル抗体ＭＡｂ＃１１７−１０Ｃを５０μｌ加え、４℃で２時間振盪した後、 ¹²⁵Ｉ標識ヒトＩＬ−１８を４ｎｇずつ加え、同じ温度でさらに３０分間振盪した。その後、４ｍｇ／ｍｌ γ−グロブリンを５０μｌ加え、氷冷下で３０分間静置した後、２０％（ｗ／ｖ）ポリエチレングリコールを含むＰＢＳを２５０μｌ加え、氷冷下でさらに３０分間静置し、４℃、６，０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、沈澱部を採取し、その放射能強度を上記と同様にして測定した。
【００４３】
同時に、モノクローナル抗体を省略する一方、 ¹²⁵Ｉ標識ヒトＩＬ−１８を４ｎｇとともに未標識ヒトＩＬ−１８を４μｇ加える系（非特異的結合区）と未標識ヒトＩＬ−１８を加えない系（総結合区）をそれぞれ設け、これらを試験区と同様に処置した。そして、「総結合区」及び「非特異的結合区」において観察された放射能強度と、試験区において観察された放射能強度をそれぞれ数１に示す式に代入し、阻害率（％）を計算した。結果を図１に併記する。
【００４４】
図１に見られるように、Ｌ４２８細胞を用いる場合も、溶液状のＩＬ−１８Ｒを用いる場合も、モノクローナル抗体ＭＡｂ＃１１７−１０Ｃの濃度が上昇するにしたがって、ＩＬ−１８のＬ４２８細胞及びＩＬ−１８Ｒへの結合がより強く阻害された。このことは、モノクローナル抗体ＭＡｂ＃１１７−１０Ｃが溶液中のＩＬ−１８Ｒ及びＬ４２８細胞の表面に存在すると考えられるＩＬ−１８ＲにＩＬ−１８と競合して結合したことを示すと同時に、実施例１−１の方法により得た水溶液がＩＬ−１８を認識する性質ある蛋白質、すなわちＩＬ−１８Ｒを含有し、そして、モノクローナル抗体ＭＡｂ＃１１７−１０ＣがそのＩＬ−１８Ｒに特異的に反応するモノクローナル抗体であることを示している。
【００４５】
【実施例１−３】
〈ウェスタン・ブロッティング分析〉
実施例１−１の方法により得たＩＬ−１８Ｒ水溶液の一部をとり、これに２．５％（ｗ／ｖ）ドデシル硫酸ナトリウム及び５０％（ｖ／ｖ）グリセリンからなる混液を２／３容量加え、３７℃で１時間インキュベートした後、常法にしたがって、還元剤非存在下においてゲル濃度１０乃至２０％のグラジエントＳＤＳ−ＰＡＧＥを適用して蛋白質成分を分離した。常法によりゲルをニトロセルロース膜上に移取り、適量の大日本製薬製固定化剤『ブロックエース』に１時間浸漬し、さらに、同じ特許出願人による特願平８−３５６４２６号明細書に開示された方法により得たモノクローナル抗体ＭＡｂ＃１１７−１０Ｃ、ブロックエース及びツイーン２０をそれぞれ１０μｇ／ｍｌ、１０％（ｖ／ｖ）及び０．０５％（ｖ／ｖ）の濃度で含む５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）に１時間浸漬した後、０．０５％（ｖ／ｖ）ツイーン２０を含む５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）で洗浄して過剰の抗体を除いた。ニトロセルロース膜を西洋ワサビパーオキシダーゼで標識したウサギ由来の抗マウスイムノグロブリン抗体の適量と１０％（ｖ／ｖ）ブロックエース及び０．０５％（ｖ／ｖ）ツイーン２０をそれぞれ含むトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）に１時間浸漬して反応させ、０．０５％（ｖ／ｖ）ツイーン２０を含む５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）により洗浄した後、アマシャム製染色キット『ＥＣＬｋｉｔ』を用いて発色させた。
【００４６】
同時に、モノクローナル抗体ＭＡｂ＃１１７−１０Ｃを省略した系を設け、上記と同様に処置して対照とした。なお、分子量マーカーには、ウシ血清アルブミン（６７，０００ダルトン）、オボアルブミン（４５，０００ダルトン）、カルボニックアンヒドロラーゼ（３０，０００ダルトン）、トリプシンインヒビター（２０，１００ダルトン）及びα−ラクトアルブミン（１４，４００ダルトン）を用いた。結果を図２に示す。
【００４７】
図２のゲル電気泳動像において、モノクローナル抗体無添加のレーン３には見られないバンドが、モノクローナル抗体添加のレーン２には観察されるが、このバンドはＩＬ−１８Ｒに相当するバンドである。
【００４８】
【実施例１−４】
〈ＩＬ−１８に対する活性阻害〉
ヒト急性骨髄性白血病患者に由来する株化細胞の一種であるＫＧ−１細胞（ＡＴＣＣＣＣＬ−２４６）を１００μｇ／ｍｌカナマイシンと１８．８ｍＭ燐酸水素二ナトリウムをそれぞれ含み、１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清を補足したＲＰＭＩ−１６４０培地（ｐＨ７．２）に細胞密度１×１０⁷個／ｍｌになるように浮遊させ、同じ特許出願人による特願平８−３５６４２６号明細書に開示された方法により得たモノクローナル抗体ＭＡｂ＃１１７−１０Ｃを濃度１０μｇ／ｍｌになるように加えた後、３７℃で３０分間インキュベートした。
【００４９】
次に、９６ウェルマイクロプレートに上記ＫＧ−１細胞浮遊液を５０μｌ／ウェルずつ分注し、それに、ヒトＩＬ−１８を上記と同一の新鮮な培地に濃度０ｎｇ／ｍｌ、１．５６ｎｇ／ｍｌ、３．１２ｎｇ／ｍｌ、６．２５ｎｇ／ｍｌ、１２．５ｎｇ／ｍｌ、２５ｎｇ／ｍｌ又は５０ｎｇ／ｍｌになるように溶解したものを５０μｌ／ウェルずつ加え、さらに、上記と同一の新鮮な培地に濃度５μｇ／ｍｌになるように溶解したリポ多糖を５０μｌ／ウェルずつ加え、３７℃で２４時間インキュベートした後、培養上清を採取し、そのＩＦＮ−γ含量を通常の酵素免疫アッセイにより調べた。並行して、各々のヒトＩＬ−１８濃度につき、モノクローナル抗体ＭＡｂ＃１１７−１０Ｃを省略した系をそれぞれ設け、これらを上記と同様に処置して対照とした。結果を図３に示す。なお、図３に示すＩＦＮ−γ含量は、米国国立衛生研究所（ＮＩＨ）から入手したＩＦＮ−γ標準品（Ｇｇ２３−９０１−５３０）に基づき国際単位（ＩＵ）に換算して表示している。
【００５０】
図３に示す結果は、モノクローナル抗体ＭＡｂ＃１１７−１０Ｃが共存すると、免疫担当細胞としてのＫＧ−１細胞におけるＩＬ−１８によるＩＦＮ−γ産生の誘導が阻害されることを示している。このことは、モノクローナル抗体ＭＡｂ＃１１７−１０ＣがＩＬ−１８と競合してＫＧ−１細胞の表面に存在するＩＬ−１８Ｒを封鎖し、結果として、ＩＬ−１８によるＫＧ−１細胞への情報伝達を妨げたことを示している。
【００５１】
【実施例１−５】
〈ＩＬ−１８Ｒの精製〉
同じ特許出願人による特願平８−３５６４２６号明細書に記載された方法により得たモノクローナル抗体ＭＡｂ＃１１７−１０Ｃ７８ｍｇを適量の蒸留水に溶解し、溶液を０．５Ｍ塩化ナトリウムを含む硼酸緩衝液（ｐＨ８．５）に対して４℃で１６時間透析した。その後、常法にしたがって、透析内液にファルマシア製臭化シアン活性化ゲル『ＣＮＢｒ−アクティベーテッド・セファロース４Ｂ』を適量加え、穏やかに撹拌しながら４℃で１８時間反応させてゲルにモノクローナル抗体ＭＡｂ＃１１７−１０Ｃを固定化した。
【００５２】
次に、プラスチック製円筒管に上記のゲルをカラム状に充填し、２ｍＭＣＨＡＰＳを含むＰＢＳにより平衡化した後、実施例１−１の方法により得たＩＬ−１８Ｒを含む水溶液を負荷し、１２ｍＭＣＨＡＰＳを含むＰＢＳを通液して非吸着成分を除いた。その後、カラムに２ｍＭＣＨＡＰＳ含む３５ｍＭエチルアミン（ｐＨ１０．８）を通液しつつ、溶出液を８ｍｌずつ採取し、それぞれの画分におけるＩＬ−１８Ｒの有無を実施例１−１の ¹²⁵Ｉ標識ヒトＩＬ−１８を用いる方法により判定した。このとき得られたクロマトグラムを図４に示す。
【００５３】
図４に見られるように、実施例１−１のＩＬ−１８Ｒを含む水溶液のようなＩＬ−１８Ｒと夾雑物質を含む混合物にモノクローナル抗体ＭＡｂ＃１１７−１０Ｃを用いるイムノアフィニティークロマトグラフィーを適用すると、ＩＬ−１８Ｒがシャープな単一ピークとなって溶出した。この単一ピークに相当する画分を採取し、合一し、凍結乾燥したところ、精製ＩＬ−１８Ｒの固状物が得られた。
【００５４】
その後、このようにして精製したＩＬ−１８Ｒの一部をとり、ＰＢＳ中、１００℃で５分間インキュベートした後、実施例１−２の方法により残存活性を測定したところ、ＩＬ−１８に対する結合性が全く観察されず、加熱により失活したことが判明した。このことは、この受容体の本質が蛋白質であることを裏付けている。
【００５５】
さらに、上記のようにして得た精製ＩＬ−１８Ｒを適量のＰＢＳに溶解し、室温下、ＰＢＳに対して一晩透析し、実施例１−１の方法により ¹²⁵Ｉ標識ヒトＩＬ−１８の適量とピアース製架橋試薬『ＢＳ³』を１ｍＭそれぞれ加えた後、０℃で２時間静置してＩＬ−１８Ｒと ¹²⁵Ｉ標識ヒトＩＬ−１８との複合体を形成させた。反応物にトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）を濃度５０ｍＭになるように加え、０℃でさらに１時間静置して反応を停止させ、常法にしたがって、反応物に分子量マーカーとともに還元剤としてジチオトレイトールを用いるＳＤＳ−ＰＡＧＥを適用して蛋白質成分を分離した後、オートラジオグラム分析した。
【００５６】
得られたオートラジオグラムにおける分子量マーカーの易動度に基づき計算したところ、このＩＬ−１８Ｒと ¹²⁵Ｉ標識ヒトＩＬ−１８との複合体の分子量は、見掛け上、約５０，０００乃至２００，０００ダルトンであることが判明した。ヒトＩＬ−１８の分子量は約２０，０００ダルトンであるから、ＩＬ−１８ＲにヒトＩＬ−１８が１分子結合したと仮定すると、ＩＬ−１８Ｒの分子量は約３０，０００乃至１８０，０００ダルトンということになる。
【００５７】
【実施例１−６】
〈ＩＬ−１８Ｒのペプチド・マッピング〉
実施例１−５の方法により得た精製ＩＬ−１８Ｒを、還元剤としての２％（ｗ／ｖ）ジチオトレイトールを含むゲル濃度７．５％（ｗ／ｖ）のＳＤＳ−ＰＡＧＥによりゲル電気泳動し、ゲルを０．１％（ｗ／ｖ）クーマシーブリリアントブルーを含む４０％（ｖ／ｖ）水性メタノールと１％（ｖ／ｖ）酢酸水溶液の混液に５分間浸漬して染色し、４０％（ｖ／ｖ）水性メタノールと１％（ｖ／ｖ）酢酸水溶液の混液にさらに２時間浸漬して脱色した後、ゲルにおける分子量約８０，０００乃至１１０，０００ダルトンに相当する染色部分を切出し、０．２Ｍ炭酸アンモニウムを含む５０％（ｖ／ｖ）水性アセトニトリルを加え、室温下で繰返し振盪した。次いで、ゲルを真空乾燥し、０．２Ｍ炭酸アンモニウム（ｐＨ８．０）を加え、５分間静置してゲルを膨潤させ、プロメガ製トリプシン製剤『シーケンシング・グレード・モディファイッド・トリプシン』を０．１μｇ／μｌ含む１ｍＭ塩酸と０．２Ｍ炭酸アンモニウム（ｐＨ８．９）をそれぞれ適量加え、３７℃で一晩反応させた。１０％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸水溶液により反応を停止させた後、反応物に０．１％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸水溶液と６０％（ｖ／ｖ）水性アセトニトリルの混液を加え、室温下で振盪した後、上清を採取し、真空乾燥し、遠心濾過してペプチド断片を含む濃縮物を得た。
【００５８】
この濃縮物を予め０．０６５％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸水溶液により平衡化しておいたファルマシア製高速液体クロマトグラフィー用カラム『μＲＰＣＣ２／Ｃ１８ＳＣ２．１／１０』に負荷し、通液開始から１６０分間でアセトニトリル濃度が０％（ｖ／ｖ）から８０％（ｖ／ｖ）まで直線的に上昇するアセトニトリルの濃度勾配下、８０％（ｖ／ｖ）水性アセトニトリルを含む０．０５５％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸水溶液を１００μｌ／分の流速で通液した。波長２１４ｎｍにおける溶出液の吸光度をモニターしながら溶出液を分画し、溶出開始から約４５分後、約５０分後、約５５分後、約５８分後、約６２分後、約７２分後、約７５分後及び約７７分後に溶出したペプチド断片をそれぞれ別々に採取した。常法にしたがって、これらのペプチド断片（以下、溶出時間の早い順に「ペプチド断片１」、「ペプチド断片２」、「ペプチド断片３」、「ペプチド断片４」、「ペプチド断片５」、「ペプチド断片６」、「ペプチド断片７」及び「ペプチド断片８」と言う。）のアミノ酸配列をパーキン・エルマー製プロテイン・シーケンサー『４７３Ａ型』により調べたところ、ペプチド断片１乃至８は、それぞれ、配列表における配列番号１２乃至１９に示すアミノ酸配列を有することが判明した。このとき得られたペプチド・マップを図５に示す。
【００５９】
【実施例２】
〈ＤＮＡの調製〉
【００６０】
【実施例２−１】
〈全ＲＮＡの調製〉
常法にしたがって、Ｌ４２８細胞（ＦＥＲＭＢＰ−５７７７）を１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清を補足したＲＰＭＩ−１６４０培地（ｐＨ７．２）に浮遊させ、培養規模を拡大しながら、３７℃で増殖させた。所期の細胞密度に達した時点で増殖細胞を採取し、これを６Ｍグアニジンイソチオシアナート及び０．５％（ｗ／ｖ）ザルコシルをそれぞれ含む１０ｍＭクエン酸ナトリウム水溶液（ｐＨ７．０）に浮遊させ、ホモジナイザーで破砕した。
【００６１】
次に、３５ｍｌ容遠心管に５．７Ｍ塩化セシウムを含む０．１ＭＥＤＴＡ（ｐＨ７．５）を注入し、その上部に上記で得られた細胞破砕物を重層し、この状態のまま、２０℃、２５，０００ｒｐｍで２０時間超遠心分離し、ＲＮＡ画分を採取した。このＲＮＡ画分を１５ｍｌ容遠心管にとり、クロロホルム／１−ブタノール混液（容量比４：１）を等容量加え、５分間振盪し、４℃、１０，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した後、水層部を採取し、これにエタノールを２．５倍容加え、−２０℃で２時間静置して全ＲＮＡを沈澱させた。この沈澱を採取し、７５％（ｖ／ｖ）水性エタノールで洗浄した後、滅菌蒸留水０．５ｍｌに溶解してＬ４２８細胞由来の全ＲＮＡを含む水溶液を得た。
【００６２】
【実施例２−２】
〈ｍＲＮＡの調製〉
実施例２−１の方法により得た全ＲＮＡを含む水溶液に１ｍＭＥＤＴＡ及び０．１％（ｗ／ｖ）ザルコシルをそれぞれ含む１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）を０．５ｍｌ加え、全量を１ｍｌとした。この混液に日本ロシュ製オリゴ（ｄＴ）３０ラテックス『オリゴテックスｄＴ３０スーパー』を１ｍｌ加え、６５℃で５分間反応させた後、氷浴中で急冷した。次いで、反応物に５Ｍ塩化ナトリウムを０．２ｍｌ加え、３７℃で１０分間インキュベートした後、２５℃、１０，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、生成したペレット状の沈澱を採取し、これを滅菌蒸留水０．５ｍｌに懸濁し、６５℃で５分間インキュベートしてラテックスからｍＲＮＡを溶離させた。得られた水溶液に適量のエタノールを加え、生成した沈澱を採取し、凍結乾燥して、ｍＲＮＡの固状物を得た。
【００６３】
【実施例２−３】
〈ポリペプチドをコードするＤＮＡ断片の調製〉
０．５ｍｌ容反応管に２５ｍＭ塩化マグネシウムを４μｌ、５００ｍＭ塩化カリウムを含む１００ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．３）を２μｌ、２５ｍＭｄＮＴＰミックスを１μｌ、４０単位／μｌのリボヌクレアーゼインヒビターを０．５μｌ、そして、２００単位／μｌの逆転写酵素を１μｌそれぞれ加えた後、５０μＭランダムヘキサヌクレオチドの適量と実施例２−２の方法により得たｍＲＮＡを１０ｎｇ加え、滅菌蒸留水で全量を２０μｌとした。得られた混合物を４２℃で２０分間インキュベートし、さらに９９℃で５分間インキュベートすることにより反応を終結させて第一ストランドｃＤＮＡを含む反応物を得た。
【００６４】
この反応物を２０μｌとり、これに２．５単位／μｌのストラタジーン製ＤＮＡポリメラーゼ『クローンドＰｆｕポリメラーゼ』１μｌ、ストラタジーン製専用緩衝液１０μｌ及び２５ｍＭｄＮＴＰミックス１μｌをそれぞれ加え、さらに、ピー・パーネットらが『ザ・ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー』、第２７１巻、３，９６７乃至３，９７０頁（１９９６年）に報告しているアミノ酸配列に基づいて調製した５´−ＴＣＡＧＴＣＧＡＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＡＡＴＴＧＴＡＧＡＧＡＡ−３´及び５´−ＧＡＡＧＣＧＧＣＣＧＣＡＴＣＡＴＴＡＡＧＡＣＴＣＧＧＡＡＡＧＡＡＣ−３´で表される塩基配列のオリゴヌクレオチド０．１μｇをそれぞれセンスプライマー及びアンチセンスプライマーとして加え、滅菌蒸留水で全量を１００μｌとした。この混合物を９５℃で１分間、４２℃で２分間、７２℃で３分間この順序でインキュベートするサイクルを３回繰返した後、さらに、９５℃で１分間、６０℃で２分間、７２℃で３分間この順序でインキュベートするサイクルを３５回繰返してＰＣＲ反応させた。
【００６５】
得られたＰＣＲ産物を５０ｎｇとり、これにストラタジーン製プラスミドベクター『ｐＣＲ−ＳｃｒｉｐｔＣａｍＳＫ（＋）』を１ｎｇ加え、さらに、宝酒造製ＤＮＡライゲーションキット『ＤＮＡライゲーション・キット・バージョン２』を用い、１６℃で２時間反応させてプラスミドベクター内にこのＰＣＲ産物であるＤＮＡ断片を挿入した。反応物の一部をとり、常法にしたがってストラタジーン製大腸菌株『ＸＬ１−ＢｌｕｅＭＲＦ´Ｋａｎ』を形質転換した。
【００６６】
【実施例３】
〈組換えＤＮＡの調製〉
実施例２−３の方法により得た形質転換体をクロラムフェニコールを３０μｇ／ｍｌ含むＬＢ培地（ｐＨ７．５）に接種し、３７℃で１８時間培養した後、培養物から菌体を採取し、これを常法にしたがって処理してプラスミドＤＮＡを得た。ジデオキシ法により、このプラスミドＤＮＡが配列表における配列番号７に示す塩基配列を含有していることを確認した後、制限酵素ＮｏｔＩ及びＳａｌＩをそれぞれ作用させ、得られたＤＮＡ断片１００ｎｇに、制限酵素ＮｏｔＩ及びＸｈｏＩにより予め同様に切断しておいたマルチクローニングサイト改変インビトロジェン製プラスミドベクター『ｐｃＤＮＡＩ／Ａｍｐ』を１０ｎｇ加え、宝酒造製ライゲーション・キット『ライゲーション・キット・バージョン２』を用い、１６℃で２時間反応させた。反応物の一部をとり、これを常法にしたがって『ＸＬ１−ＢｌｕｅＭＲＦ´Ｋａｎ』に導入してこの発明の組換えＤＮＡ『ｐｃＤＮＡ／ＨｕＩＬ−１８Ｒ』を含む形質転換体『ｃＤＮＡ／ＨｕＩＬ−１８Ｒ』を得た。常法にしたがって分析したところ、組換えＤＮＡ『ｐｃＤＮＡ／ＨｕＩＬ−１８Ｒ』においては、この発明のポリペプチドをコードする、配列表における配列番号１に示す塩基配列を含有するｃＤＮＡである『ＩＬ−１８ＲｃＤＮＡ』が、図６に示すように、サイトメガロウイルス・プロモーターＰｃｍｖの下流に連結されていた。
【００６７】
【実施例４】
〈形質転換体の調製〉
実施例３の方法により得た形質転換体『ｃＤＮＡ／ＨｕＩＬ−１８Ｒ』をアンピシリンを１００μｇ／ｍｌ含むＬＢ培地（ｐＨ７．５）に接種し、３７℃で１８時間培養した後、培養物から菌体を採取し、これを常法にしたがって処理してプラスミドＤＮＡを採取した。別途、アフリカミドリザルの腎臓に由来する線維芽細胞株の一種であるＣＯＳ−１細胞（ＡＴＣＣＣＲＬ−１６５０）を常法にしたがって増殖させ、これに上記で得られたプラスミドＤＮＡを２０μｇとり、これを通常一般のエレクトロポレーション法により１×１０⁷個のＣＯＳ−１細胞に導入して、この発明のＤＮＡを含む形質転換体を得た。
【００６８】
【実施例５】
〈ポリペプチドの製造〉
平底培養瓶に１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清を補足したＤＭＥＭ培地（ｐＨ７．２）をとり、これに実施例４の方法により得た形質転換体を１×１０⁵個／ｍｌの割合で接種し、５％ＣＯ₂インキュベーター中、３７℃で３日間培養した。培養物から培養液を除去した後、培養瓶内に５ｍＭＥＤＴＡ及び０．０２％（ｗ／ｖ）アジ化ナトリウムをそれぞれ含むＰＢＳを注入して増殖細胞を脱着させた。
【００６９】
この増殖細胞をＰＢＳで洗浄した後、２０ｍＭＨＥＰＥＳ、１０ｍＭ塩化カリウム、１．５ｍＭ塩化マグネシウム、０．１ｍＭＥＤＴＡを含む緩衝液（ｐＨ７．４）（以下、「ハイポトニックバッファー」と言う。）で再度洗浄し、細胞密度を２×１０⁷個／ｍｌとなるようにハイポトニックバッファーに懸濁した。この細胞懸濁液を氷上でダウンス型ホモジナイザーによりホモジナイズし、１５，０００ｒｐｍで５分間遠心分離して細胞核及び非破砕細胞を除去した後、２ｍＭＣＨＡＰＳを含むＰＢＳに対して一夜透析した。
【００７０】
この透析物を実施例１−５に示した方法で作製したモノクローナル抗体ＭＡｂ＃１１７−１０Ｃを固定化したカラムに負荷し、１２ｍＭＣＨＡＰＳを含むＰＢＳを通液して非吸着成分を除いた。その後、カラムに２ｍＭＣＨＡＰＳを含む３５ｍＭエチルアミン（ｐＨ１０．８）を通液し、溶出液を分画採取した。そして、それぞれの画分におけるヒト由来のポリペプチドの有無を実施例１−１に示した ¹²⁵Ｉ標識ヒトＩＬ−１８を用いる方法により判定し、選別し、合一したところ、配列表における配列番号２０に示すアミノ酸配列のポリペプチドを含む水溶液が原料細胞１０⁸個当り約２ｍｌ得られた。なお、この水溶液の蛋白質含量は約１０μｇ／ｍｌであった。
【００７１】
斯くして得られたこの発明のポリペプチドに実施例１で述べた方法を適用し、その理化学的性質を調べた。その結果、本実施例で得られたポリペプチドは、部分アミノ酸配列として、配列表における配列番号１２乃至１９に示すアミノ酸配列をそれぞれ有するとともに、Ｌ４２８細胞由来のＩＬ−１８Ｒと同様の生理活性を示した。
【００７２】
【実施例６】
〈ヒト由来の可溶性ポリペプチド〉
【００７３】
【実施例６−１】
〈組換えＤＮＡの調製〉
０．５ｍｌ容反応管に実施例３の方法により得た組換えＤＮＡ『ｐｃＤＮＡ／ＨｕＩＬ−１８Ｒ』１ｎｇ、１０×ＰＣＲ緩衝液１０μｌ及び２５ｍＭｄＮＴＰミックス１μｌをそれぞれとり、２．５単位／μｌＰｆｕＤＮＡポリメラーゼを１μｌ加えた後、センスプライマー及びアンチセンスプライマーとして５´−ＴＣＡＧＴＣＧＡＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＡＡＴＴＧＴＡＧＡＧＡＡＴＴＡ−３´及び５´−ＧＡＡＧＣＧＧＣＣＧＣＡＴＣＡＴＴＡＴＣＴＴＧＴＧＡＡＧＡＣＧＴＧ−３´で表される塩基配列のポリヌクレオチドをそれぞれ適量加え、滅菌蒸留水で１００μｌとした。次いで、混合物を、常法にしたがって、９４℃で１分間、４２℃で２分間、７２℃で３分間この順序でインキュベートするサイクルを３回繰返した後、さらに、９４℃で１分間、６０℃で２分間、７２℃で３分間この順序でインキュベートするサイクルを３５回繰返してＰＣＲ反応させた。
【００７４】
得られたＰＣＲ産物を５０ｎｇとり、これに宝酒造製プラスミドベクター『ｐＣＲ−ＳｃｒｉｐｔＳＫ（＋）』を１ｎｇ加え、さらに、宝酒造製ＤＮＡライゲーションキット『ＤＮＡライゲーション・キット・バージョン２』を用い、１６℃で２時間反応させてプラスミドベクター内にＰＣＲ産物であるＤＮＡ断片を挿入した。反応物の一部をとり、常法にしたがってストラタジーン製大腸菌『ＸＬ１−ＢｌｕｅＭＲＦ´Ｋａｎ』を形質転換した。
【００７５】
上記で得られた形質転換体をアンピシリンを１００μｇ／ｍｌ含むＬＢ培地（ｐＨ７．５）に接種し、３７℃で１８時間培養した後、培養物から菌体を採し、これを常法にしたがって処理してプラスミドＤＮＡを得た。ジデオキシ法により、このプラスミドＤＮＡが配列表における配列番号１０に示す塩基配列を含有していることを確認した後、制限酵素ＮｏｔＩ及びＳａｌＩをそれぞれ作用させ、得られたＤＮＡ断片１００ｎｇに、予め制限酵素ＮｏｔＩ及びＸｈｏＩにより切断しておいた、エス・ミズシマら『ニュークレイック・アシッド・リサーチ』、第１８巻、第１７号、５，３３２頁（１９９０年）に記載された方法に準じて調製したプラスミドベクター『ｐＥＦ−ＢＯＳ』を１０ｎｇ加え、宝酒造製ライゲーションキット『ライゲーション・キット・バージョン２』を用い、１６℃で２時間反応させた。反応物の一部をとり、これを常法にしたがって『ＸＬ１−ＢｌｕｅＭＲＦ´Ｋａｎ』に導入して、この発明の組換えＤＮＡ『ｐＥＦＨＩＬ１８Ｒ−１４』を含む形質転換体『ＥＦＨＩＬ１８Ｒ−１４』を得た。常法にしたがって分析したところ、この組換えＤＮＡ『ｐＥＦＨＩＬ１８Ｒ−１４』においては、この発明のポリペプチドをコードする、配列表における配列番号６に示す塩基配列を含有するｃＤＮＡである『ＥＦＨＩＬ１８Ｒ−１４ｃＤＮＡ』が、図７に示すように、延長因子１プロモーター『ＥＦ１αＰ』の下流に連結されていた。
【００７６】
【実施例６−２】
〈形質転換体の調製〉
実施例６−１の方法により得た形質転換体『ＥＦＨＩＬ１８Ｒ−１４』をアンピシリンを１００μｇ／ｍｌ含むＬＢ培地（ｐＨ７．５）に接種し、３７℃で１８時間培養した後、培養物から菌体を採取し、これを常法にしたがって処理してプラスミドＤＮＡを採取した。別途、アフリカミドリザルの腎臓に由来する線維芽細胞株の一種であるＣＯＳ−１細胞（ＡＴＣＣＣＲＬ−１６５０）を常法にしたがって増殖させ、これに上記で得られたプラスミドＤＮＡを２０μｇとり、これを通常一般のエレクトロポレーション法により１×１０⁷個のＣＯＳ−１細胞に導入して、この発明のＤＮＡを含む形質転換体を得た。
【００７７】
【実施例６−３】
〈可溶性ポリペプチドの製造〉
平底培養瓶に味の素製無血清培地『ＡＳＦ１０４』をとり、これに実施例６−２の方法により得た形質転換体を１×１０ ^５個／ｍｌの割合で接種し、常法にしたがって５％ＣＯ_２インキュベーター中、３７℃で３日間培養した。培養物から培養上清を採取し、実施例１−５の方法により得たモノクローナル抗体ＭＡｂ＃１１７−１０Ｃを固定化したカラムに負荷し、１２ｍＭＣＨＡＰＳを含むＰＢＳを通液して非吸着画分を除いた。その後、カラムに２ｍＭＣＨＡＰＳを含む３５ｍＭエチルアミン（ｐＨ１０．８）を通液し、溶出液を分画採取した。そして、それぞれの画分におけるヒト由来の可溶性ポリペプチドの有無を実施例１−１に示した^１２５Ｉ標識ヒトＩＬ−１８を用いる方法により判定し、選別し、合一したところ、配列表における配列番号２２に示すアミノ酸配列のポリペプチドを含む水溶液が原料細胞１０^８個当り約２ｍｌ得られた。なお、この水溶液の蛋白質含量は約１０μｇ／ｍｌであった。
【００７８】
斯くして得られたこの発明の可溶性ポリペプチドに実施例１で述べた方法を適用し、その理化学的性質を調べた。その結果、本実施例で得られた可溶性ポリペプドは、部分アミノ酸配列として、配列表における配列番号１２乃至１７及び配列番号１９に示すアミノ酸配列をそれぞれ含有するとともに、Ｌ４２８細胞由来のＩＬ−１８Ｒと同様の生理活性を示した。
【００７９】
【実施例７】
〈ヒト由来の可溶性ポリペプチド〉
０．５ｍｌ容反応管に実施例６−１の方法により得た組換えＤＮＡ『ｐＥＦＨＩＬ１８Ｒ−１４』１ｎｇ、１０×ＰＣＲ緩衝液１０μｌ及び２５ｍＭｄＮＴＰミックス１μｌをそれぞれとり、２．５単位／μｌＰｆｕＤＮＡポリメラーゼを１μｌ加え、さらに、センスプライマー及びアンチセンスプライマーとして、それぞれ、５´−ＴＣＡＧＴＣＧＡＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＡＡＴＴＧＴＡＧＡＧ−３´及び５´−ＧＡＡＧＣＧＧＣＣＧＣＴＣＡＴＴＡＧＴＧＡＴＧＧＴＧＡＴＧＧＴＧＡＴＧＴＧＣＡＡＣＡＴＧＧＴＴＡＡＧＣＴＴ−３´で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドをそれぞれ適量加えた後、滅菌蒸留水で全量を１００μｌとした。この混合物を９４℃で１分間、４２℃で２分間、７２℃で３分間この順序でインキュベートするサイクルを３回繰返した後、さらに、９４℃で１分間、６０℃で１分間、７２℃で１分間この順序でインキュベートするサイクルを３５回繰返してＰＣＲ反応させて、配列表における配列番号５に示す塩基配列、その塩基配列の５´末端に連結された制限酵素ＳａｌＩによる切断部位とコザック配列、そして、３´末端に連結された制限酵素ＮｏｔＩにより切断部位と（Ｈｉｓ）₆タグをコードする塩基配列からなるＤＮＡ断片を得た。このＤＮＡ断片を実施例６−１におけると同様にしてストラタジーン製大腸菌株『ＸＬ１−ＢｌｕｅＭＲＦ´Ｋａｎ』に導入し、この発明の組換えＤＮＡ『ｐＥＦＨＩＬ１８ＲＤ１−２−Ｈ』を含む形質転換体を得た。常法にしたがって分析したところ、この組換えＤＮＡにおいては、この発明のポリペプチドをコードする、配列表における配列番号５に示す塩基配列を含有するｃＤＮＡである『ＨＩＬ１８ＲＤ１−２−Ｈ』が、図８に示すように、延長因子プロモーター『ＥＦ１αＰ』の下流に連結されていた。
【００８０】
斯くして得られた形質転換体を用い、実施例６−２におけると同様にして組換えＤＮＡ『ｐＥＦＨＩＬ１８ＲＤ１−２−Ｈ』をＣＯＳ−１細胞に導入した後、そのＣＯＳ−１細胞を実施例６−３におけると同様に培養した。培養物から培養上清を採取し、膜濾過により濃縮した後、キアジェン製アフィニティークロマトグラフィー用ゲル『Ｎｉ−ＮＴＡＳｐｉｎＫｉｔ』のカラムに負荷し、カラムに２０ｍＭイミダゾールを含むＰＢＳを通液して非吸着画分を除いた。その後、カラムに２５０ｍＭイミダゾールを含むＰＢＳを通液し、溶出液を分画採取する一方、それぞれの画分におけるヒト由来の可溶性ポリペプチドの有無を実施例１−１に示した ¹²⁵Ｉ標識ヒトＩＬ−１８を用いる方法により判定し、選別し、合一したところ、配列表における配列番号２３に示すアミノ酸配列のポリペプチドを含む水溶液が原料細胞１０⁸個当り約２ｍｌ得られた。なお、この水溶液の蛋白質含量は約１０μｇ／ｍｌであった。
【００８１】
斯くして得られたこの発明の可溶性ポリペプチドに実施例１で述べた方法を適用し、その理化学的性質を調べた。その結果、本実施例で得られた可溶性ポリペプチドは、部分アミノ酸配列として、配列表における配列番号１４乃至１６及び１９に示すアミノ酸配列のそれぞれの一部又は全てを含有するとともに、Ｌ４２８細胞由来のＩＬ−１８Ｒと同様の生理活性を示した。
【００８２】
【実施例８】
〈ヒト由来の可溶性ポリペプチド〉
センスプライマー及びアンチセンスプライマーとして、それぞれ、５´−ＴＣＡＧＴＣＧＡＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＡＡＴＴＧＴＡＧＡＧ−３´及び５´−ＧＡＡＧＣＧＧＣＣＧＣＴＣＡＴＴＡＧＴＧＡＴＧＧＴＧＡＴＧＧＴＧＡＴＧＴＣＴＴＴＣＡＧＴＧＡＡＡＣＡＧＣＴ−３´で表される塩基配列のオリゴヌクレチオドを用いた以外は実施例７と同様にして、この発明の組換えＤＮＡ『ｐＥＦＨＩＬ１８ＲＤ１−Ｈ』を含む形質転換体を得た。常法にしたがって分析したところ、この組換えＤＮＡにおいては、この発明のポリペプチドをコードする、配列表における配列番号３に示す塩基配列を含有するｃＤＮＡである『ＨＩＬ１８ＲＤ１−Ｈ』が、図９に示すように、延長因子プロモーター『ＥＦ１αＰ』の下流に連結されていた。その後、実施例７におけると同様にして、この組換えＤＮＡをＣＯＳ−１細胞に導入し、発現させたところ、配列表における配列番号２４に示すアミノ酸配列のポリペプチドを含む水溶液が原料細胞１０⁸個当り約２ｍｌ得られた。なお、この水溶液の蛋白質含量は約１０μｇ／ｍｌであった。
【００８３】
斯くして得られたこの発明の可溶性ポリペプチドに実施例１で述べた方法を適用し、その理化学的性質を調べた。その結果、本実施例で得られた可溶性ポリペプチドは、部分アミノ酸配列として、配列表における配列番号１４及び１５に示すアミノ酸配列をそれぞれ含有するとともに、Ｌ４２８細胞由来のＩＬ−１８Ｒと同様の生理活性を示した。
【００８４】
【実施例９】
〈マウス由来の可溶性ポリペプチド〉
【００８５】
【実施例９−１】
〈組換えＤＮＡの調製〉
Ｌ４２８細胞由来のｍＲＮＡに代えて、マウス肝細胞から常法にしたがって調製したｍＲＮＡを用いた以外は、実施例２−３と同様に反応させて第一ストランドｃＤＮＡを含む反応物を得た。さらに、ピー・パーネットらが『ザ・ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー』、第２７１巻、３，９６７乃至３，９７０頁（１９９６年）に報告しているアミノ酸配列及び配列表における配列番号１に示す塩基配列に基づいて調製した５´−ＴＣＡＧＴＣＧＡＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＣＡＴＣＡＴＧＡＡＧＡＡ−３´及び５´−ＧＡＡＧＣＧＧＣＣＧＣＡＴＣＡＴＴＡＧＴＧＡＴＧＧＴＧＡＴＧＧＴＧＡＴＧＴＧＴＡＡＡＧＡＣＡＴＧＧＣＣ−３´で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドをそれぞれセンスプライマー及びアンチセンスプライマーとして用い、上記で得た反応物を実施例２−３と同様にＰＣＲ反応させて、配列表における配列番号１１に示す塩基配列と、その塩基配列の５´末端に連結された制限酵素ＳａｌＩによる切断部位と、配列番号１１に示す塩基配列の３´末端に連結された制限酵素ＮｏｔＩによる切断部位及び（Ｈｉｓ）₆タグをコードする塩基配列とを含んでなるＤＮＡ断片を得た。
【００８６】
その後、実施例６−１に示す方法により、このＤＮＡ断片を大腸菌『ＸＬ１−ＢｌｕｅＭＲＦ´Ｋａｎ』に導入して形質転換し、形質転換体からプラスミドＤＮＡを採取し、それが配列表における配列番号１１に示す塩基配列を含んでなることを確認した後、プラスミドベクター『ｐＥＦ−ＢＯＳ』を用いて大腸菌『ＸＬ１−ＢｌｕｅＭＲＦ´Ｋａｎ』に導入し、この発明の組換えＤＮＡ『ｐＥＦＭＩＬ−１８ＲＳＨＴ』を含む形質転換体『ＥＦＭＩＬ１８ＲＳＨＴ』を得た。常法にしたがって分析したところ、この組換えＤＮＡ『ｐＥＦＭＩＬ１８ＲＳＨＴ』においては、この発明のポリペプチドをコードする、配列表における配列番号４に示す塩基配列を含有するｃＤＮＡである『ＥＦＭＩＬ１８ＲＳＨＴｃＤＮＡ』が、図１０に示すように、延長因子１プロモーター『ＥＦ１αＰ』の下流に連結されていた。
【００８７】
【実施例９−２】
〈形質転換体と可溶性ポリペプチドの調製〉
実施例６−２で述べた方法により、実施例９−１の方法により得た形質転換体『ＥＦＭＩＬ１８ＲＳＨＴ』からプラスミドＤＮＡを採取し、これをＣＯＳ−１細胞に導入して、マウス由来の可溶性ポリペプチドをコードするＤＮＡを含む形質転換体を得た。
【００８８】
平底培養瓶に味の素製無血清培地『ＡＳＦ１０４』をとり、これに形質転換したＣＯＳ−１細胞を１×１０⁵個／ｍｌの割合で接種し、常法にしたがって５％ＣＯ₂インキュベーター中、３７℃で３日間培養した。培養物から培養上清を採取し、キアジェン製アフィニティークロマトグラフィー用ゲル『Ｎｉ−ＮＴＡ』のカラムに負荷し、２０ｍＭイミダゾールを含むＰＢＳを通液して非吸着画分を除去した後、カラムに２５０ｍＭイミダゾールを含むＰＢＳを通液し、溶出液を分画採取した。それぞれの画分におけるマウス由来の可溶性ポリペプチドの有無を実施例１−１に示した ¹²⁵Ｉ標識マウスＩＬ−１８を用いる方法により判定し、選別し、合一したところ、配列表における配列番号２５に示すアミノ酸配列のポリペプチドを含む水溶液が原料細胞１０⁸個当り約２ｍｌ得られた。なお、この水溶液の蛋白質含量は約１００μｇ／ｍｌであった。実施例１で述べた方法に準じて調べたところ、斯くして得られた可溶性ポリペプチドはマウスＩＬ−１８をよく中和した。
【００８９】
【実施例１０】
〈液剤〉
安定剤として林原製結晶トレハロース粉末『トレハオース』を１％（ｗ／ｖ）含む生理食塩水に実施例５乃至８に記載されたいずれかの方法により得たポリペプチドのいずれかを１ｍｇ／ｍｌになるように溶解し、常法にしたがって精密濾過により除菌して４種類の液剤を得た。
【００９０】
安定性に優れた本品は、自己免疫疾患を含む感受性疾患を治療・予防するための注射剤、点眼剤、点鼻剤などとして有用である。
【００９１】
【実施例１１】
〈乾燥注射剤〉
安定剤としてシュークロースを１％（ｗ／ｖ）含む生理食塩水１００ｍｌに実施例５乃至８に記載されたいずれかの方法により得たポリペプチドのいずれかを１００ｍｇ溶解し、常法にしたがって精密濾過により除菌した後、バイアル瓶に１ｍｌずつ分注し、凍結乾燥し、密栓して、４種類の粉末製剤を得た。
【００９２】
安定性に優れた本品は、自己免疫疾患を含む感受性疾患を治療・予防するための乾燥注射剤として有用である。
【００９３】
【実施例１２】
〈軟膏剤〉
滅菌蒸留水に和光純薬工業製カルボキシビニルポリマー『ハイビスワコー１０４』と林原製結晶トレハロース粉末『トレハオース』をそれぞれ濃度１．４％（ｗ／ｗ）及び２．０％（ｗ／ｗ）になるように溶解し、実施例５乃至８に記載されたいずれかの方法により得たポリペプチドのいずれかを均一に混合した後、ｐＨ７．２に調整して、１ｇ当り、この発明のポリペプチドを約１ｍｇ含む４種類のペースト製剤を得た。
【００９４】
延展性と安定性に優れた本品は、自己免疫疾患を含む感受性疾患を治療・予防するための軟膏剤として有用である。
【００９５】
【実施例１３】
〈錠剤〉
林原製無水結晶α−マルトース粉末『ファイントース』に実施例５乃至８に記載されたいずれかの方法により得たポリペプチドのいずれかと細胞賦活剤としてのルミンを均一に混合し、得られた混合物を常法により打錠して、製品１錠（約２００ｍｇ）当り、この発明のポリペプチド及びルミンをそれぞれ約１ｍｇ含む４種類の錠剤を得た。
【００９６】
摂取性、安定性に優れ、細胞賦活作用も有する本品は、自己免疫疾患を含む感受性疾患を治療・予防するための錠剤として有用である。
【００９７】
【実験】
〈急性毒性試験〉
常法にしたがって、８週齢のマウスに実施例１０乃至１３の方法により得た種々剤型の感受性疾患剤を経皮、経口又は腹腔内に注射投与した。その結果、被検試料のＬＤ５０は、この発明のポリペプチドの量に換算すると、いずれの投与経路によっても約１ｍｇ／マウス体重以上であった。このことは、この発明のポリペプチドがヒトを含む哺乳類に投与する医薬品に配合して安全であることを裏付けている。
【００９８】
【発明の効果】
以上説明したとおり、この発明はＩＬ−１８を認識する新規な受容体蛋白質の発見に基づくものである。この発明のポリペプチドは、ヒトを含む哺乳類において免疫反応を抑制したり調節する性質を有するので、臓器移植に伴う拒絶反応の緩和や、過剰な免疫反応に起因する種々の疾患の治療・予防に著効を発揮する。さらに、この発明のポリペプチドはＩＬ−１８の生理作用の解明や、ＩＬ−１８Ｒに特異的なモノクローナル抗体を産生し得るハイブリドーマの樹立、さらには、ＩＬ−１８を精製したり検出するためのアフィニティークロマトグラフィーや標識アッセイにも有用である。また、これに加え、この発明のポリペプチド、とりわけ、この発明の可溶性ポリペプチドは、ＩＬ−１８Ｒに対する作動薬や拮抗薬の、生体内又は生体外での検索にも有用である。斯くも有用なるポリペプチドは、組換えＤＮＡ技術を利用するこの発明の方法により、所望量を容易に製造することができる。
【００９９】
この発明は斯くも顕著な作用効果を奏する発明であり、斯界に貢献すること誠に多大な意義のある発明であると言える。
【０１００】
【配列表】

【０１０１】

【０１０２】

【０１０３】

【０１０４】

【０１０５】

【０１０６】

【０１０７】

【０１０８】

【０１０９】

【０１１０】

【０１１１】

【０１１２】

【０１１３】

【０１１４】

【０１１５】

【０１１６】

【０１１７】

【０１１８】

【０１１９】

【０１２０】

【０１２１】

【０１２２】

【０１２３】

【０１２４】

【０１２５】

【０１２６】

【図面の簡単な説明】
【図１】モノクローナル抗体ＭＡｂ＃１１７−１０Ｃが、ＩＬ−１８と競合してＬ４２８細胞及びＩＬ−１８Ｒに結合する様子を示す図である。
【図２】モノクローナル抗体ＭＡｂ＃１１７−１０Ｃを用いるウェスタン・ブロッティング法により可視化した、ＩＬ−１８Ｒのゲル電気泳動のディスプレー上に表示した中間調画像である。
【図３】モノクローナル抗体ＭＡｂ＃１１７−１０ＣによるＩＬ−１８の活性阻害を示す図である。
【図４】ＩＬ−１８Ｒにモノクローナル抗体ＭＡｂ＃１１７−１０Ｃを用いるイムノアフィニティークロマトグラフィーを適用したときのクロマトグラムである。
【図５】ＩＬ−１８Ｒのペプチド・マップである。
【図６】この発明の組換えＤＮＡである『ｐｃＤＮＡ／ＨｕＩＬ−１８Ｒ』の構造を示す図である。
【図７】この発明の組換えＤＮＡである『ｐＥＦＨＩＬ１８Ｒ−１４』の構造を示す図である。
【図８】この発明の組換えＤＮＡである『ｐＥＦＨＩＬ１８ＲＤ１−２−Ｈ』の構造を示す図である。
【図９】この発明の組換えＤＮＡである『ｐＥＦＨＩＬ１８ＲＤ１−Ｈ』の構造を示す図である。
【図１０】この発明の組換えＤＮＡである『ｐＥＦＭＩＬ１８ＲＳＨＴ』の構造を示す図である。
【符合の説明】
Ｐｃｍｖサイトメガロウイルス・プロモーター
ＥＦ１αＰ延長因子１プロモーター
ＩＬ−１８ＲｃＤＮＡこの発明のポリペプチドをコードするｃＤＮＡ
ＥＦＨＩＬ１８Ｒ−１４ｃＤＮＡこの発明によるヒト由来の可溶性ポリペプチドをコードするｃＤＮＡ
ＨＩＬ１８ＲＤ１−２−ＨｃＤＮＡ
この発明によるヒト由来の可溶性ポリペプチドをコードするｃＤＮＡ
ＨＩＬ１８ＲＤ１−ＨｃＤＮＡこの発明によるヒト由来の可溶性ポリペプチドをコードするｃＤＮＡ
ＥＦＭＩＬ１８ＲＳＨＴｃＤＮＡこの発明によるマウス由来の可溶性ポリペプチドをコードするｃＤＮＡ[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a novel receptor protein that recognizes cytokines, in particular, a novel polypeptide that recognizes interleukin-18 (hereinafter abbreviated as “IL-18”).
[0002]
[Prior art]
IL-18 is a kind of cytokine that is a signal transmitter in the immune system. IL-18 can be found in JP-A-8-27189, JP-A-8-193098 and Harki Okamura et al., “Nature”, Vol. 378, No. 6,552, pages 88 to 91 (1995). As described above, it was described as an interferon-γ inducer at the beginning of discovery. However, Shinpei Ushio et al., “The Journal of Immunology”, 156, 4,274-4,279 (1996). According to the proposal in, it came to be called "IL-18". Mature IL-18 is composed of 157 amino acids, has the property of inducing production of interferon-γ (hereinafter abbreviated as “IFN-γ”) useful as a physiologically active substance in immunocompetent cells, and killer cells. It has the property of enhancing the cytotoxicity and inducing the generation of killer cells. Because of these properties, IL-18 is expected to be widely used as a pharmaceutical agent such as an antiviral agent, an antibacterial agent, an antitumor agent, and an antiimmune disease agent, and intensive research is being advanced.
[0003]
As described above, not only IL-18, but also cytokines are originally produced and secreted as substances responsible for information transmission in the immune system. Therefore, if cytokines are produced excessively in the mammalian body or administered externally, the balance of the immune system may be shifted. The surface of a mammalian cell usually has a site that recognizes a cytokine called a receptor, and the secreted cytokine can only transmit the desired information to the cell by binding to this receptor. . In the normal immune system, cytokines and receptors that recognize cytokines are thought to maintain a certain balance. Therefore, in this field, in order to put IL-18 into practical use as a pharmaceutical, in addition to elucidating the physiological action of IL-18 itself, an IL-18 receptor (hereinafter abbreviated as “IL-18R”). It is expected that the properties and properties of these will be elucidated as soon as possible and mass-produced.
[0004]
[Problems to be solved by the invention]
In view of such circumstances, a first object of the present invention is to provide a polypeptide as IL-18R that is easily mass-produced.
[0005]
Furthermore, the second object of the present invention is to provide use of such a polypeptide as a medicine.
[0006]
In addition, a third object of the present invention is to provide a DNA encoding such a polypeptide.
[0007]
In addition, a fourth object of the present invention is to provide a method for producing such a polypeptide.
[0008]
In addition, a fifth object of the present invention is to provide a neutralizing agent for IL-18 using such a polypeptide.
[0009]
In addition, a sixth object of the present invention is to provide a method for neutralizing IL-18 with such a polypeptide.
[0010]
[Means for Solving the Problems]
When the present inventors diligently studied to solve these problems, it was found that a substance that recognizes IL-18 exists in L428 cells, which are a kind of lymphoblastoid cells derived from Hodgkin's disease patients. I found it. When the present inventor separated this substance and examined its properties and properties, it was found that the essence is a protein, and IL-18 is well recognized and bound even in the separated state. Thus confirmed IL-18R recognizes IL-18 that activates the immune system and neutralizes its physiological activity in mammals including humans. It has been found that it is effective in the treatment and prevention of various diseases caused by immune reactions. Furthermore, when the present inventors diligently searched for L428 cells using the partial amino acid sequence of IL-18R as a clue, they came to obtain DNA encoding IL-18R. The polypeptide obtained by artificially expressing this DNA recognizes IL-18 well and confirms that it has the same physiological activity as IL-18R isolated from L428 cells. The present invention was completed by confirming that a desired amount could be produced by the recombinant DNA technique using such DNA.
[0011]
That is, this invention solves said 1st subject by polypeptide as IL-18R which can be obtained by expression of a gene.
[0012]
This invention solves said 2nd subject by the IL-18R sensitive disease agent which comprises such polypeptide as an active ingredient.
[0013]
This invention solves said 3rd subject with DNA which codes such polypeptide.
[0014]
This invention solves said 4th subject by the manufacturing method of polypeptide including the process of expressing DNA which codes such polypeptide, and the process of extract | collecting the produced | generated polypeptide.
[0015]
This invention solves said 5th subject by the neutralizing agent of IL-18 which uses such polypeptide as an active ingredient.
[0016]
The present invention solves the sixth problem by a method for neutralizing IL-18, wherein the polypeptide is allowed to act on IL-18. The L428 cells used in the present invention have been accepted from the Ministry of International Trade and Industry, the Industrial Technology Institute, and the Biotechnology Institute of Technology, Tsukuba City, Ibaraki Prefecture since December 24, 1996. BP-5777 ”.
[0017]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
The present invention relates to a polypeptide as IL-18R that can be obtained by gene expression. The human-derived polypeptide according to the present invention usually contains one or a plurality of amino acid sequences shown in SEQ ID NOs: 12 to 19 in the sequence listing as a partial amino acid sequence. Contains part or all of the amino acid sequence shown. Moreover, the mouse-derived polypeptide according to the present invention usually contains part or all of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 21 in the sequence listing. Therefore, the polypeptide referred to in the present invention is, for example, a polypeptide in which one or more amino acids are added to the amino acid sequence in addition to the polypeptide containing the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 20 or 21 in the sequence listing. Peptide, in particular, a polypeptide containing an amino acid sequence to which one or more amino acids are added at the C-terminal and / or N-terminal, an amino acid sequence in which one or more of the amino acids in the amino acid sequences shown in SEQ ID NOs: 20 and 21 are deleted Even if the polypeptide contains, in particular, a soluble polypeptide containing the amino acid sequence shown in SEQ ID NOs: 22 to 25, or a polypeptide having a sugar chain bound to the polypeptide as described above, these are expressed by gene expression. As long as it can be obtained and has a function as IL-18R It is intended to embrace all. Incidentally, IL-18 is already known to be derived from humans and mice, and each of them contains 157 amino acids, each of which has the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 26 in the sequence listing (however, The amino acid shown with the sign “Xaa” represents isoleucine or threonine.) And the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 27 in the sequence listing (however, the amino acid shown with the sign “Xaa”) Represents methionine or threonine).
[0018]
The polypeptide of the present invention is usually produced by applying recombinant DNA technology. That is, the DNA encoding the polypeptide is artificially expressed, and the generated polypeptide is collected. The present invention also provides a method for producing the polypeptide using recombinant DNA technology in addition to the DNA encoding the polypeptide. When the production method of the invention is used, a desired amount of the polypeptide can be easily obtained. Is obtained.
[0019]
As the DNA used in the production method of the present invention, as long as it encodes the polypeptide, even DNA obtained from a natural source is artificially modified or chemically synthesized. Also good. That is, in this field, generally, in order to artificially express DNA encoding a certain polypeptide, the expression efficiency of the DNA is improved, or the physiological activity and physical properties of the polypeptide itself are improved. One or more of the bases in the above may be substituted with other bases, or an appropriate base sequence may be linked to DNA. Such changes are naturally possible in the DNA of the present invention, and specifically, the polypeptide of the present invention is encoded as described above to the extent that the finally obtained polypeptide does not lose its intended physiological activity. It goes without saying that a base sequence such as a recognition site by an appropriate restriction enzyme, a start codon, a stop codon, a promoter, and an enhancer can be linked to the 5 ′ end and / or 3 ′ end of the DNA. Therefore, the DNA referred to in the present invention means a DNA encoding a polypeptide as described above, a DNA having a base sequence complementary to the base sequence of the DNA, and an amino acid sequence encoded by the DNA. And all of the DNAs in which one or more of the bases are replaced with other bases.
[0020]
In order to obtain such DNA from a natural source, for example, an oligonucleotide prepared based on the amino acid sequences shown in SEQ ID NOs: 12 to 25 in the sequence listing is used as a probe, and epithelial cells, endothelial cells, stromal cells, chondrocytes, Monocytes, granulocytes, lymphocytes, nerve cells, and cells derived from mammals including humans and mice obtained by culturing them may be searched. In the cell search, a substance capable of inducing the expression of IL-18R gene in such a cell, particularly IL-12 or IL-18, is added to the culture medium in which the cell to be searched is cultured.⁶ When the content is about 0.01 pg to 1 μg, preferably about 1 pg to 100 ng, the target DNA can be easily obtained. Specific examples of desirable cells are obtained by culturing hematopoietic cells such as lymphocytes. For example, in Jun Minowada “Cancer Review”, Vol. 10, pages 1 to 18 (1988). The described JM cells, HDLM-2 cells, MOLT-16 cells and PEER cells, as well as L428 cells (FERM BP-5777), KG-1 cells (ATCC CCL-246), U-937 cells (ATCC CRL) -1593.2) and the like. Of the DNAs thus obtained, human and mouse-derived DNA usually contains part or all of the base sequences shown in SEQ ID NOs: 1 and 2 in the sequence listing, respectively. For example, DNA obtained from L428 cells (FERM BP-5777), which is a type of lymphoblastoid cell derived from a Hodgkin's disease patient, encodes the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 20, as shown in SEQ ID NO: 7 in the Sequence Listing. And a base sequence encoding a signal peptide linked to the 5 ′ end of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1. In addition, the soluble polypeptides of the amino acid sequences shown in SEQ ID NOs: 22 to 25 in the sequence listing are encoded by the base sequences shown in SEQ ID NOs: 3 to 6, respectively. As shown in the base sequences of SEQ ID NOs: 8 to 11, , A base sequence encoding a signal peptide is linked to the 5 'end. Such DNA can also be obtained by ordinary chemical synthesis. In any case, once the DNA is obtained, it can be easily amplified to a desired level by applying the PCR method thereto. The amino acid sequences shown in SEQ ID NOs: 20 and 21 in the Sequence Listing are all the signal peptide amino acid sequence, P. Pernet et al., “The Journal of Biological Chemistry”, Vol. 271, 3 967 to 3,970 (1996). However, this paper does not suggest or teach the fact that the polypeptides having the amino acid sequences shown in SEQ ID NOs: 20 and 21 function as IL-18R.
[0021]
Such DNA expresses the polypeptide when introduced into an appropriate host derived from microorganisms and animals and plants. The DNA of this invention is usually introduced into the host in the form of recombinant DNA. Recombinant DNA comprises the DNA of the present invention and a vector capable of autonomous replication, and can usually be prepared relatively easily by general recombinant DNA techniques as long as DNA is available. Examples of the vector into which the DNA of the present invention can be inserted include plasmid vectors such as pKK223-3, pcDNAI / Amp, BCMGSNeo, pcDL-SRα, pKY4, pCDM8, pCEV4, pME18S, and pEF-BOS. The autonomously replicable vector usually comprises an appropriate base sequence for expressing the DNA of the present invention in an individual host, such as a promoter, enhancer, origin of replication, transcription termination site, splicing sequence and / or selection sequence. . As the promoter, for example, when the heat shock protein promoter or the interferon-α promoter disclosed in JP-A-7-163368 by the same patent applicant is used, the expression of the DNA in the transformant is externally stimulated. It will be possible to control artificially.
[0022]
In order to insert the DNA of the present invention into such a vector, a method conventionally used in this field is used. Specifically, first, a gene containing the DNA of the present invention and a vector capable of autonomous replication are cleaved with a restriction enzyme and / or ultrasound, and then the generated DNA fragment and the vector fragment are ligated. DNA fragments using restriction enzymes that specifically act on nucleotides for gene and vector cleavage, especially AccI, BamHI, BstXI, EcoRI, HindIII, NotI, PstI, SacI, SalI, SmaI, SpeI, XbaI, XhoI, etc. And vector fragments can be easily ligated. In order to link the DNA fragment and the vector fragment, if necessary, after annealing both, DNA ligase may be allowed to act in vivo or in vitro. The recombinant DNA thus obtained can be replicated indefinitely in microorganism- or animal-derived hosts.
[0023]
Such recombinant DNA is appropriately introduced into a host and used for production of the polypeptide. As the host, those derived from microorganisms and animals and plants commonly used in the art can be used. However, when the final use of the polypeptide is a pharmaceutical, a host derived from yeast or mammal is desirable. Specific examples of host cells derived from mammals include, for example, 3T3 cells (ATCC CCL-92), C127I cells (ATCC CRL-1616), CHO-K1 cells (ATCC CCL-61), CV-1 cells (ATCC CCL- 70), COS-1 cells (ATCC CRL-1650), HeLa cells (ATCC CCL-2), MOP-8 cells (ATCC CRL-1709) and mutants thereof, humans, monkeys, mice and hamsters Derived epithelial cells, stromal cells and hematopoietic cells. In order to introduce the DNA of this invention into such a host, for example, the known DEAE-dextran method, calcium phosphate method, electroporation method, lipofection method, microinjection method, retrovirus, adenovirus, herpesvirus Virus infection methods such as vaccinia virus may be used. In order to select a clone producing the polypeptide from the transformant, the transformant is cultured in a culture medium, and a clone in which production of the polypeptide is observed may be selected. Recombinant DNA technology using mammalian host cells is, for example, edited by Toshio Kuroki, Katsutani Taniguchi, Mitsuo Oshimura, “Experimental Medicine Separate Cell Engineering Handbook”, published in 1992 by Yodosha, Takashi Yokota, Kenichi Arai Edited in detail, "Experimental Medicine Separate Bio Manual Series 3 Gene Cloning Experiment", published in 1993 by Yodosha.
[0024]
The transformant thus obtained produces the polypeptide both inside and outside the host when cultured in a culture medium. As the culture medium, a conventional culture medium for cultivating the transformant may be used. Such a culture medium is usually based on buffered water, and sodium ion, potassium ion, calcium ion, phosphorus ion. In addition, inorganic ions such as chloride ions and trace elements according to the metabolic capacity of the host, carbon source, nitrogen source, amino acids, vitamins, etc. are added, and if necessary, serum, hormones, cell growth factors, cell adhesion factors, etc. It is configured to contain. Examples of the individual culture medium include 199 medium, DMEM medium, Ham's F12 medium, IMDM medium, MCDB104 medium, MCDB153 medium, MEM medium, RD medium, RITC80-7 medium, RPMI-1630 medium, and RPMI-1640 medium. And WAJC404 medium. About 1 × 10 6 transformants are added to such a culture medium.^FourTo 1 × 10⁷Pieces / ml, preferably about 1 × 10^FiveTo 1 × 10⁶Inoculate cells / ml and replace with fresh culture medium as necessary. When cultured in suspension or monolayer at a temperature of about 37 ° C. for 1 to 1 week, preferably 2 to 4 days, culture containing the polypeptide Things are obtained. Depending on the type of transformant and culture conditions, the culture thus obtained usually contains about 1 μg to 1 mg of the polypeptide per liter.
[0025]
If necessary, the culture obtained in this manner disrupts the cells or cells with ultrasonic waves, cytolytic enzymes and / or surfactants, and then filters the polypeptide by filtration, centrifugation, etc. Or it isolate | separates and refine | purifies from a cell or those broken material. For purification, cultures from which cells or cells or their crushed materials have been removed, such as salting out, dialysis, filtration, concentration, fractional precipitation, ion exchange chromatography, gel filtration chromatography, adsorption chromatography, isoelectric point Conventional methods in the art for purifying bioactive proteins such as chromatography, hydrophobic chromatography, reverse phase chromatography, affinity chromatography, gel electrophoresis, isoelectric focusing, etc. are applied, if necessary, These are applied in combination as appropriate. Then, depending on the final use form, the purified polypeptide may be concentrated and lyophilized to be liquid or solid. The IL-18 disclosed in JP-A-8-193098 by the same patent applicant and the monoclonal antibody disclosed in Japanese Patent Application No. 8-356426 are extremely useful for purification of the polypeptide. In the case of immunoaffinity chromatography using, a high-purity polypeptide can be obtained with a minimum of time and effort.
[0026]
Since the polypeptide of the present invention has the property of recognizing and binding to IL-18 that activates the immune system to suppress or regulate the immune response in mammals including humans, the polypeptide of the present invention has various properties resulting from excessive immune responses. Effective in the treatment and prevention of diseases. The immune system is originally intended to protect the living body from harmful foreign substances, but sometimes, because of its function, it may cause harmful effects on the living body. When organs such as skin, kidney, liver, heart, bone marrow, etc. are transplanted into mammals, T cells are activated, lymphocytes proliferate, and inflammation occurs due to rejection and immune reaction against allogeneic antigens. Sometimes. The same phenomenon is observed when a heterologous antigen that is not regarded as unique to the host, such as an allergen, invades. In autoimmune diseases, components that should be considered inherently cause allergic reactions. When administered to mammals including humans, the polypeptide of the present invention suppresses or regulates such an immune response, and exhibits remarkable effects in the treatment and prevention of various diseases caused by them. Therefore, the susceptibility disease referred to in the present invention is a disease caused by an enhanced immune response, which means all diseases that IL-18R can be treated or prevented by acting directly or indirectly. Examples include rejection associated with organ transplantation as described above, pernicious anemia, atrophic gastritis, insulin-resistant diabetes, Wegner's granulomatosis, discoid lupus erythematosus, ulcerative colitis, cold agglutinin disease, Goodpasture Syndrome, Crohn's disease, primary biliary cirrhosis, sympathetic ophthalmitis, hyperthyroidism, juvenile diabetes, Sjogren's syndrome, autoimmune hepatitis, autoimmune hemolytic anemia, myasthenia gravis, progressive systemic Sclerosis, systemic lupus erythematosus, multiple cold blood pigmenturia, multiple myositis, multiple nodular arteritis, multiple sclerosis, idiopathic Addison's disease, idiopathic blood Decreasing purpura, Graves' disease, leukopenia, Behcet's disease, early menopause, rheumatoid arthritis, rheumatic fever, chronic thyroiditis, Hodgkin's disease, HIV infection, asthma, atopic dermatitis, allergic rhinitis, Examples include autoimmune diseases and allergic diseases including hay fever and bee venom allergy. The polypeptide of the present invention is also effective for the treatment and prevention of septic shock caused by overproduction or overdosing of IFN-γ.
[0027]
Thus, a sensitive disease agent comprising the polypeptide of the present invention as an active ingredient is an anti-autoimmune disease agent, anti-allergic agent, anti-inflammatory agent, immunosuppressive agent for treating / preventing a sensitive disease as described above. It has a wide variety of uses as a blood-enhancing agent, leukocyte-increasing agent, platelet-increasing agent, analgesic agent, antipyretic agent and the like. Depending on the dosage form and the type and symptom of the susceptible disease, the sensitive disease agent of the present invention is usually prepared in a liquid, suspension, paste or solid form, and the polypeptide of the present invention is prepared in 0.00001 to 100. % (W / w), preferably 0.0001 to 20% (w / w).
[0028]
The sensitive disease agent of the present invention is not only in the form of the polypeptide alone, but also physiologically acceptable, for example, carriers, excipients, diluents, adjuvants, stabilizers, and further if necessary Further, a form as a composition with one or a plurality of other physiologically active substances is also included. Examples of the stabilizer include proteins such as serum albumin and gelatin, buffers such as glucose, sucrose, lactose, maltose, trehalose, sorbitol, maltitol, mannitol, lactitol, and citrate or phosphate. Examples of other physiologically active substances that can be used in combination with the agent include, for example, FK506, glucocorticoid, cyclophosphamide, nitrogen mustard, triethylenethiophosphamide, buzurphan, phenylamine mustard, chlorambucil, azathioprine, 6 -Mercaptopurine, 6-thioguanine, 6-azaguanine, 8-azaguanine, fluorouracil, cytarabine, methotrexate, aminopterin, mitomycin C, daunorubicin hydrochloride, actinomycin In addition to IL-18, receptors for cytokines other than IL-18, chromomycin A3, bleomycin hydrochloride, doxorubicin hydrochloride, cyclosporin A, L-asparaginase, vincristine, vinblastine, hydroxyurea, procarbazine hydrochloride, corticosteroids, gold preparation, etc. Antagonists such as interleukin-1 receptor protein, interleukin-2 receptor protein, interleukin-5 receptor protein, interleukin-6 receptor protein, interleukin-8 receptor protein and interleukin-12 receptor Respective antibodies against proteins, further antagonists for TNF-α receptor, TNF-β receptor, interleukin-1 receptor, interleukin-5 receptor and interleukin-8 receptor, etc. And the like.
[0029]
Furthermore, the susceptible disease agent of the present invention also includes a dosage unit form of the drug, which includes the polypeptide, for example, a single dose or an integral multiple thereof (up to 4 times) or Meaning a drug comprising a quantity corresponding to its divisor (up to 1/40) and in a physically unitary dosage form suitable for dosing. Examples of such drugs in dosage unit form include injections, solutions, powders, granules, tablets, capsules, sublinguals, eye drops, nasal drops, suppositories, and the like. The sensitive disease agent of the present invention may be administered orally or parenterally, and in any case, it exhibits an effect on the treatment and prevention of the sensitive disease. Although depending on the type and symptoms of the sensitive disease, specifically, about 1 μg to 1 g / dose, usually about 10 μg to 100 mg / dose of the polypeptide per adult while observing the patient's symptoms and the course after administration. May be administered orally at a dose of 1 to 4 times / day or 1 to 5 times / week for 1 day to 1 year, or may be administered parenterally intradermally, subcutaneously, intramuscularly or intravenously.
[0030]
By the way, the DNA encoding the polypeptide of the present invention is also useful for so-called “gene therapy”. That is, in normal gene therapy, the DNA of the present invention is inserted into a virus-derived vector such as a retrovirus, adenovirus, adeno-associated virus, or encapsulated in a liposome such as a cationic polymer or a membrane fusion liposome. It is buried and injected directly into a patient suffering from a disease sensitive to IL-18R in this state, or lymphocytes are collected from the patient, introduced in vitro, and then autotransplanted into the patient. In adoptive gene therapy, when the DNA of the present invention is introduced into effect cells in the same manner as in normal gene therapy, for example, the cytotoxicity of the effect cells against target cells such as tumor cells and virus-infected cells is increased. Can increase and strengthen adoptive immunotherapy. Furthermore, in tumor vaccine gene therapy, the DNA of the present invention is introduced into tumor cells removed from a patient in the same manner as in normal gene therapy, and is allowed to grow in vitro until reaching a certain number. It is transplanted. The transplanted tumor cells act as a vaccine in the patient and exert strong and antigen-specific anti-tumor immunity. Thus, the DNA of the present invention can be used for gene therapy for various diseases including, for example, malignant tumors, viral diseases, infectious diseases and autoimmune diseases, as well as rejection and excess associated with organ transplantation and allergic diseases. It will be effective in suppressing the immune response. The general procedures for carrying out these gene therapies are, for example, edited by Takashi Shimada, Izumi Saito, Toshiya Ozawa, “Experimental Medicine Separate Bio Manual UP Series Basic Technology of Gene Therapy”, 1996, published by Yodosha. Also detailed. Furthermore, the DNA encoding the polypeptide of the present invention can be obtained by applying a hybridization method or PCR method using a part or all of the polypeptide as a probe or primer to DNA or RNA derived from various mammals. DNA encoding a substance structurally related to the peptide, for example, DNA encoding a polypeptide as an IL-18R of a different origin from the individual DNA disclosed in the present invention, and further, an action on IL-18R It is also useful for searching DNA encoding drugs and antagonists.
[0031]
Further, since the polypeptide of the present invention has a property of recognizing and binding IL-18, it is naturally useful in affinity chromatography and labeling assay for purifying and detecting IL-18. In addition to this, the polypeptide of the present invention, particularly the soluble polypeptide of the present invention, is also useful for in vivo or in vitro searches for agonists and antagonists to IL-18R. Furthermore, since the polypeptide of the present invention has the property of recognizing and binding to IL-18 and neutralizing its physiological action, the neutralizing agent of the present invention comprising the polypeptide as an active ingredient and IL The neutralization method of the present invention in which the polypeptide is allowed to act on -18 is useful for treatment of various diseases caused by excessive production of IL-18 or excessive administration of IL-18.
[0032]
Hereinafter, the embodiments of the present invention will be described with reference to examples. The methods used in Examples 1 to 9 below are conventional in this field. For example, Toshio Kuroki, Katsutani Taniguchi, Mitsuo Oshimura, “Experimental Medicine Separate Cell Engineering Handbook”, published in 1992 by Yodosha Also edited in detail by Yokota Takashi and Arai Kenichi, “Experimental Medicine Separate Bio-Bio Series 3 Gene Cloning Experiment”, published in 1993 by Yodosha.
[0033]
[Example 1]
<Preparation and Characterization of IL-18R>
[0034]
Example 1-1
<Preparation of IL-18R>
A type of lymphoblastoid cell line derived from a Hodgkin's disease patient subcutaneously in the back after injection of rabbit anti-lymphocyte antibody into the abdominal cavity of a newborn hamster by the conventional method L428 cells (FERM BP-5777) are about 5 × 10^FiveIndividual / animal injection transplantation was carried out for 3 weeks in the usual manner. Tumor masses (about 10 g / animal) generated subcutaneously were removed, dispersed in serum-free RPMI-1640 medium (pH 7.4) by a conventional method, and washed to obtain proliferating cells.
[0035]
A mixed solution (volume ratio 9: 1) of 0.83% (w / v) ammonium chloride and 170 mM Tris-HCl buffer (pH 7.7) was added to the proliferating cells 10 times the wet weight of the cells and stirred. After that, the cells were collected by centrifugation at 2,000 rpm for 10 minutes. Next, the cells were suspended in an appropriate amount of phosphate buffered saline (hereinafter referred to as “PBS”), stirred, centrifuged at 2,000 rpm, and recovered again, and 10 mM Tris-HCl buffer containing 1 mM magnesium chloride. Cell density about 1 x 10 in liquid (pH 7.2)⁸10 ml Tris-hydrochloric acid buffer (pH 7.2) each containing 1 mM magnesium chloride and 1 M sucrose, and the final concentration of sucrose is suspended by a cell crusher “Polytron” manufactured by Kinematica. After adding so that it might become 0.2M, it centrifuged at 1,000 rpm and the supernatant was extract | collected, this was further centrifuged at 25,000 rpm for 60 minutes, and the precipitation part was extract | collected. Appropriate amounts of 12 mM 3-[(3-colamidopropyl) dimethylammonio] -1-propanesulfonate (hereinafter referred to as “CHAPS”), 10 mM EDTA and 1 mM phenylmethylsulfonyl fluoride were added to the precipitate, After stirring at 4 ° C. for 16 hours, the mixture was centrifuged at 25,000 rpm for 60 minutes, and the supernatant was collected.
[0036]
This supernatant was loaded onto a column of Pharmacia affinity chromatography gel “Wheat Germ Lectin Sepharose 6B” equilibrated with PBS containing 12 mM CHAPS, and the column was washed with PBS containing 12 mM CHAPS. While monitoring the protein content of the eluate by the absorbance with respect to ultraviolet rays having a wavelength of 280 nm, PBS containing 0.5 M N-acetyl-D-glucosamine and 12 mM CHAPS was passed through each. When fractions having an absorbance of 0.16 to 0.20 were collected and combined, an aqueous solution having a protein content of about 1 mg / ml was obtained as the source cell 10.¹²About 25 l was obtained per piece.
[0037]
Divide a portion of this aqueous solution and follow conventional methods¹²⁵Add 4 ng of human IL-18 labeled with I and incubate at 4 ° C. for 1 hour, add γ-globulin and polyethylene glycol “polyethylene glycol 6000” with an average molecular weight of 6,000 daltons as carriers, The mixture was allowed to stand for 30 minutes to cause a binding reaction, and then the reaction product was centrifuged at 6,000 rpm for 5 minutes. The resulting precipitate was collected and the radioactivity intensity was measured. at the same time, ¹²⁵A system using 3 μg of unlabeled human IL-18 in addition to I-labeled human IL-18 was provided and treated in the same manner as described above as a control. When compared with the control, the radioactivity intensity of the precipitate produced from the test aqueous solution was significantly higher. This indicates that the aqueous solution obtained above contains IL-18R, and when it was allowed to act on IL-18, this IL-18R recognized and bound IL-18.
[0038]
Example 1-2
<Binding to monoclonal antibody>
L428 cells (FERM BP-5777) cells in RPMI-1640 medium (pH 7.4) containing 0.1% (w / v) sodium azide and supplemented with 0.1% (v / v) bovine serum albumin. Density 4 × 10⁷The monoclonal antibody MAb # 117-10C specific for human IL-18R obtained by the method described in Japanese Patent Application No. 8-356426 by the same patent applicant was suspended. Separately supplemented with 0.1% (v / v) bovine serum albumin to a concentration of 0.019 μg / ml, 0.209 μg / ml, 2.3 μg / ml, 25.3 μg / ml or 139.5 μg / ml In RPMI-1640 medium (pH 7.4).
[0039]
Next, take 50 μl of the cell suspension prepared above, add 50 μl of any of the above monoclonal antibody solutions having different concentrations, and shake at 4 ° C. for 2 hours.¹²⁵50 μl of RPMI-1640 medium (pH 7.5) containing 4 ng of human IL-18 labeled with I and supplemented with 0.1% (v / v) bovine serum albumin was added and shaken at the same temperature for another 30 minutes. Thereafter, 200 μl of dibutyl phthalate / dioctyl phthalate mixture (volume ratio 1: 1) is added to each cell suspension and centrifuged at 20 ° C. and 10,000 rpm for 5 minutes, and then the precipitate containing the cells is collected and made by Aloka. The radioactivity intensity was measured using a gamma counter “ARC-300 type”.
[0040]
At the same time, while omitting monoclonal antibodies,¹²⁵A system in which 4 μg of I-labeled human IL-18 and 4 μg of unlabeled human IL-18 are added (non-specific binding section) and a system in which unlabeled human IL-18 is not added (total binding section) are provided. Treated in the same way. Then, the radioactivity intensity observed in the “total binding zone” and “non-specific binding zone” and the radioactivity intensity observed in the test zone are substituted into the equation shown in Equation 1, respectively, and the inhibition rate (%) is calculated. Calculated. The results are shown in FIG.
[0041]
[Expression 1]

[0042]
Further, 50 μl of an aqueous solution containing IL-18R obtained by the method of Example 1-1 was taken, 50 μl of monoclonal antibody MAb # 117-10C prepared to the same concentration as above was added, and shaken at 4 ° C. for 2 hours. After¹²⁵4 ng of I-labeled human IL-18 was added and shaken at the same temperature for another 30 minutes. Thereafter, 50 μl of 4 mg / ml γ-globulin was added and allowed to stand for 30 minutes under ice cooling, then 250 μl of PBS containing 20% (w / v) polyethylene glycol was added and allowed to stand for another 30 minutes under ice cooling. Centrifugation was performed at 4 ° C. and 6,000 rpm for 5 minutes, the precipitate was collected, and the radioactivity intensity was measured in the same manner as described above.
[0043]
At the same time, while omitting monoclonal antibodies,¹²⁵A system in which 4 μg of I-labeled human IL-18 and 4 μg of unlabeled human IL-18 are added (non-specific binding section) and a system in which unlabeled human IL-18 is not added (total binding section) are provided. Treated in the same way. Then, the radioactivity intensity observed in the “total binding zone” and “non-specific binding zone” and the radioactivity intensity observed in the test zone are substituted into the equation shown in Equation 1, respectively, and the inhibition rate (%) is calculated. Calculated. The results are also shown in FIG.
[0044]
As can be seen in FIG. 1, both when using L428 cells and when using IL-18R in solution, as the concentration of monoclonal antibody MAb # 117-10C increases, IL-18 L428 cells and IL- Binding to 18R was more strongly inhibited. This indicates that monoclonal antibody MAb # 117-10C bound IL-18R, which is thought to be present on the surface of IL-18R and L428 cells in solution, in competition with IL-18, as well as Example 1. The aqueous solution obtained by the method -1 contains a protein having a property of recognizing IL-18, that is, IL-18R, and the monoclonal antibody MAb # 117-10C is a monoclonal antibody that specifically reacts with IL-18R. It shows that there is.
[0045]
Example 1-3
<Western blotting analysis>
A part of the IL-18R aqueous solution obtained by the method of Example 1-1 was taken, and a mixed solution composed of 2.5% (w / v) sodium dodecyl sulfate and 50% (v / v) glycerin was added to 2/3. After adding a volume and incubating at 37 ° C. for 1 hour, a protein component was separated by applying a gradient SDS-PAGE having a gel concentration of 10 to 20% in the absence of a reducing agent according to a conventional method. The gel was transferred onto a nitrocellulose membrane by a conventional method, immersed in an appropriate amount of Dainippon Pharmaceutical's immobilizing agent “Block Ace” for 1 hour, and further disclosed in the specification of Japanese Patent Application No. 8-356426 by the same patent applicant. 50 mM Tris-HCl containing monoclonal antibodies MAb # 117-10C, Block Ace and Tween 20 obtained by the prepared method at concentrations of 10 μg / ml, 10% (v / v) and 0.05% (v / v), respectively After immersing in a buffer (pH 7.5) for 1 hour, excess antibody was removed by washing with 50 mM Tris-HCl buffer (pH 7.5) containing 0.05% (v / v) Tween 20. Tris-HCl buffer containing appropriate amounts of rabbit anti-mouse immunoglobulin antibodies labeled with horseradish peroxidase on nitrocellulose membrane and 10% (v / v) block ace and 0.05% (v / v) Tween 20 respectively. After being soaked in a solution (pH 7.5) for 1 hour and reacted with 50 mM Tris-HCl buffer solution (pH 7.5) containing 0.05% (v / v) Tween 20, an Amersham staining kit “ECL” The color was developed using “kit”.
[0046]
At the same time, a system in which the monoclonal antibody MAb # 117-10C was omitted was provided and treated in the same manner as above to serve as a control. The molecular weight markers include bovine serum albumin (67,000 dalton), ovalbumin (45,000 dalton), carbonic anhydrolase (30,000 dalton), trypsin inhibitor (20,100 dalton) and α-lactalbumin ( 14,400 Dalton) was used. The results are shown in FIG.
[0047]
In the gel electrophoresis image of FIG. 2, a band that is not seen in Lane 3 with no monoclonal antibody added is observed in Lane 2 with a monoclonal antibody added, but this band is a band corresponding to IL-18R.
[0048]
Example 1-4
<Inhibition of activity against IL-18>
KG-1 cells (ATCC CCL-246), a type of cell line derived from a patient with human acute myeloid leukemia, each containing 100 μg / ml kanamycin and 18.8 mM disodium hydrogen phosphate, 10% (v / v) Cell density 1 x 10 in RPMI-1640 medium (pH 7.2) supplemented with fetal bovine serum⁷The monoclonal antibody MAb # 117-10C obtained by the method disclosed in Japanese Patent Application No. 8-356426 by the same patent applicant was added to a concentration of 10 μg / ml. Thereafter, it was incubated at 37 ° C. for 30 minutes.
[0049]
Next, 50 μl / well of the KG-1 cell suspension was dispensed into a 96-well microplate, and human IL-18 was added to the same fresh medium as described above at a concentration of 0 ng / ml, 1.56 ng / ml, 3. Add 10 μl / well of lysed to 12 ng / ml, 6.25 ng / ml, 12.5 ng / ml, 25 ng / ml or 50 ng / ml, and add the concentration to the same fresh medium as above Lipopolysaccharide dissolved to 5 μg / ml was added in an amount of 50 μl / well and incubated at 37 ° C. for 24 hours. The culture supernatant was collected, and its IFN-γ content was examined by a general enzyme immunoassay. In parallel, for each human IL-18 concentration, a system in which the monoclonal antibody MAb # 117-10C was omitted was provided, and these were treated in the same manner as above to serve as controls. The results are shown in FIG. The IFN-γ content shown in FIG. 3 is expressed in terms of international units (IU) based on the IFN-γ standard (Gg23-901-530) obtained from the National Institutes of Health (NIH). .
[0050]
The results shown in FIG. 3 indicate that the presence of monoclonal antibody MAb # 117-10C inhibits the induction of IFN-γ production by IL-18 in KG-1 cells as immunocompetent cells. This indicates that monoclonal antibody MAb # 117-10C competes with IL-18 to block IL-18R present on the surface of KG-1 cells, and as a result, IL-18 transmits information to KG-1 cells. Shows that it has prevented.
[0051]
Example 1-5
<Purification of IL-18R>
78 mg of monoclonal antibody MAb # 117-10C obtained by the method described in the specification of Japanese Patent Application No. 8-356426 by the same patent applicant is dissolved in an appropriate amount of distilled water, and the solution is dissolved in borate buffer containing 0.5 M sodium chloride. Dialyzed against the liquid (pH 8.5) at 4 ° C. for 16 hours. Then, according to a conventional method, an appropriate amount of cyanogen bromide activated gel “CNBr-activated Sepharose 4B” manufactured by Pharmacia is added to the dialysis internal solution, and the mixture is reacted at 4 ° C. for 18 hours with gentle stirring to give monoclonal antibody to the gel. MAb # 117-10C was immobilized.
[0052]
Next, the above gel is packed in a column shape in a plastic cylindrical tube, equilibrated with PBS containing 2 mM CHAPS, and then loaded with an aqueous solution containing IL-18R obtained by the method of Example 1-1. PBS containing CHAPS was passed through to remove non-adsorbed components. Thereafter, 8 ml of the eluate was collected while passing 35 mM ethylamine (pH 10.8) containing 2 mM CHAPS through the column, and the presence or absence of IL-18R in each fraction was determined according to Example 1-1.¹²⁵The determination was made by a method using I-labeled human IL-18. The chromatogram obtained at this time is shown in FIG.
[0053]
As shown in FIG. 4, when immunoaffinity chromatography using monoclonal antibody MAb # 117-10C is applied to a mixture containing IL-18R and a contaminant such as an aqueous solution containing IL-18R of Example 1-1, IL-18R eluted as a sharp single peak. Fractions corresponding to this single peak were collected, combined, and lyophilized to obtain purified IL-18R solid.
[0054]
Thereafter, a part of IL-18R purified in this way was taken, incubated at 100 ° C. in PBS for 5 minutes, and then the residual activity was measured by the method of Example 1-2. Was not observed at all, and was found to be deactivated by heating. This confirms that the nature of this receptor is a protein.
[0055]
Further, the purified IL-18R obtained as described above was dissolved in an appropriate amount of PBS, dialyzed overnight against PBS at room temperature, and then subjected to the method of Example 1-1.¹²⁵Appropriate amount of I-labeled human IL-18 and Pierce cross-linking reagent “BS^ThreeAfter adding 1 mM each, the mixture was allowed to stand at 0 ° C. for 2 hours to obtain IL-18R.¹²⁵A complex with I-labeled human IL-18 was formed. Tris-hydrochloric acid buffer (pH 7.5) is added to the reaction product to a concentration of 50 mM, and the reaction is stopped by allowing it to stand at 0 ° C. for an additional 1 hour. After separating protein components by applying SDS-PAGE using dithiothreitol as an autoradiogram, autoradiogram analysis was performed.
[0056]
When calculated based on the mobility of the molecular weight marker in the obtained autoradiogram, this IL-18R and¹²⁵The molecular weight of the complex with I-labeled human IL-18 was found to be apparently about 50,000 to 200,000 daltons. Since the molecular weight of human IL-18 is about 20,000 daltons, assuming that one molecule of human IL-18 is bound to IL-18R, the molecular weight of IL-18R is about 30,000 to 180,000 daltons. become.
[0057]
Example 1-6
<Peptide mapping of IL-18R>
The purified IL-18R obtained by the method of Example 1-5 was subjected to gel electrophoresis by SDS-PAGE with a gel concentration of 7.5% (w / v) containing 2% (w / v) dithiothreitol as a reducing agent. Electrophoresis, staining the gel by immersing it in a mixture of 40% (v / v) aqueous methanol containing 0.1% (w / v) Coomassie Brilliant Blue and 1% (v / v) acetic acid aqueous solution for 5 minutes, After decoloring by immersing in a mixed solution of 40% (v / v) aqueous methanol and 1% (v / v) acetic acid aqueous solution for 2 hours, the stained portion corresponding to a molecular weight of about 80,000 to 110,000 daltons in the gel was removed. Cut out, 50% (v / v) aqueous acetonitrile containing 0.2 M ammonium carbonate was added and shaken repeatedly at room temperature. Next, the gel was vacuum-dried, 0.2M ammonium carbonate (pH 8.0) was added, and the gel was swollen by allowing it to stand for 5 minutes. The Promega trypsin preparation “Sequencing Grade Modified Trypsin” was reduced to 0. Appropriate amounts of 1 mM hydrochloric acid and 0.2 M ammonium carbonate (pH 8.9) each containing 1 μg / μl were added and reacted at 37 ° C. overnight. After stopping the reaction with 10% (v / v) aqueous trifluoroacetic acid, a mixture of 0.1% (v / v) aqueous trifluoroacetic acid and 60% (v / v) aqueous acetonitrile was added to the reaction, After shaking at room temperature, the supernatant was collected, dried in vacuum, and centrifuged to obtain a concentrate containing peptide fragments.
[0058]
The concentrate was loaded onto a Pharmacia column for high performance liquid chromatography “μRPC C2 / C18 SC2.1 / 10” that had been equilibrated in advance with an aqueous 0.065% (v / v) trifluoroacetic acid solution. 0.055% containing 80% (v / v) aqueous acetonitrile under a gradient of acetonitrile where the acetonitrile concentration increases linearly from 0% (v / v) to 80% (v / v) in 160 minutes from v / v) An aqueous trifluoroacetic acid solution was passed at a flow rate of 100 μl / min. The eluate is fractionated while monitoring the absorbance of the eluate at a wavelength of 214 nm. About 45 minutes, about 50 minutes, about 55 minutes, about 58 minutes, about 62 minutes, and about 72 minutes after the start of elution The peptide fragments eluted after about 75 minutes and about 77 minutes were collected separately. According to a conventional method, these peptide fragments (hereinafter referred to as “peptide fragment 1”, “peptide fragment 2”, “peptide fragment 3”, “peptide fragment 4”, “peptide fragment 5”, “peptide fragment” in order of elution time) 6 ”,“ peptide fragment 7 ”and“ peptide fragment 8 ”) were examined with a protein sequencer“ 473A type ”manufactured by Perkin Elmer. It was found to have the amino acid sequences shown in SEQ ID NOs: 12 to 19. The peptide map obtained at this time is shown in FIG.
[0059]
[Example 2]
<Preparation of DNA>
[0060]
Example 2-1
<Preparation of total RNA>
According to a conventional method, L428 cells (FERM BP-5777) were suspended in RPMI-1640 medium (pH 7.2) supplemented with 10% (v / v) fetal bovine serum, and the culture scale was increased at 37 ° C. Allowed to grow. When the desired cell density is reached, proliferating cells are collected and suspended in 10 mM aqueous sodium citrate (pH 7.0) each containing 6 M guanidine isothiocyanate and 0.5% (w / v) sarcosyl. Then, it was crushed with a homogenizer.
[0061]
Next, 0.1 M EDTA (pH 7.5) containing 5.7 M cesium chloride was injected into a 35 ml centrifuge tube, and the cell disruption obtained above was overlaid on top of this, and in this state, 20 ° C. The RNA fraction was collected by ultracentrifugation at 25,000 rpm for 20 hours. Take this RNA fraction in a 15-ml centrifuge tube, add an equal volume of chloroform / 1-butanol mixture (volume ratio 4: 1), shake for 5 minutes, centrifuge at 4 ° C., 10,000 rpm for 10 minutes, A 2.5-fold volume of ethanol was added thereto, and the mixture was allowed to stand at −20 ° C. for 2 hours to precipitate total RNA. This precipitate was collected, washed with 75% (v / v) aqueous ethanol, and then dissolved in 0.5 ml of sterile distilled water to obtain an aqueous solution containing total RNA derived from L428 cells.
[0062]
Example 2-2
<Preparation of mRNA>
0.5 ml of 10 mM Tris-HCl buffer (pH 7.5) each containing 1 mM EDTA and 0.1% (w / v) sarkosyl was added to the aqueous solution containing total RNA obtained by the method of Example 2-1, and the total amount was Was 1 ml. To this mixture, 1 ml of Nippon Roche Oligo (dT) 30 latex “Oligotex dT30 Super” was added, reacted at 65 ° C. for 5 minutes, and then rapidly cooled in an ice bath. Next, 0.2 ml of 5M sodium chloride was added to the reaction and incubated at 37 ° C. for 10 minutes, followed by centrifugation at 25 ° C. and 10,000 rpm for 10 minutes. The resulting pellet-like precipitate was collected and sterilized by distillation. It was suspended in 0.5 ml of water and incubated at 65 ° C. for 5 minutes to elute the mRNA from the latex. An appropriate amount of ethanol was added to the obtained aqueous solution, and the resulting precipitate was collected and lyophilized to obtain a solid product of mRNA.
[0063]
Example 2-3
<Preparation of DNA fragment encoding polypeptide>
In a 0.5 ml reaction tube, 4 μl of 25 mM magnesium chloride, 2 μl of 100 mM Tris-HCl buffer (pH 8.3) containing 500 mM potassium chloride, 1 μl of 25 mM dNTP mix, 0.5 μl of 40 units / μl ribonuclease inhibitor, and After adding 1 μl each of 200 units / μl reverse transcriptase, 10 ng of an appropriate amount of 50 μM random hexanucleotide and mRNA obtained by the method of Example 2-2 were added, and the total amount was made up to 20 μl with sterile distilled water. The resulting mixture was incubated at 42 ° C. for 20 minutes, and further incubated at 99 ° C. for 5 minutes to terminate the reaction and obtain a reaction product containing the first strand cDNA.
[0064]
Take 20 μl of this reaction product, add 2.5 μl / μl of Stratagene DNA polymerase “Cloned Pfu Polymerase” 1 μl, Stratagene dedicated buffer 10 μl and 25 mM dNTP mix 1 μl, respectively. 5′-TCAGTCGACGCCACCCATGAATTGTAGAGAA-3 ′ prepared based on the amino acid sequence reported in “The Journal of Biological Chemistry”, Vol. 271, pages 3,967 to 3,970 (1996) et al. And 5′-GAAGCGGCCGCATCATATAAGACTCGGAAAGAAC-3 ′ oligonucleotide 0.1 μg as a sense primer and an antisense primer, respectively, and the whole amount with sterile distilled water 100 μl. The cycle of incubating the mixture at 95 ° C. for 1 minute, 42 ° C. for 2 minutes, 72 ° C. for 3 minutes in this order was repeated three times, and then 95 ° C. for 1 minute, 60 ° C. for 2 minutes, and 72 ° C. The PCR reaction was performed by repeating the cycle of incubating in this order for 3 minutes 35 times.
[0065]
50 ng of the obtained PCR product was added, 1 ng of a plasmid vector “pCR-Script Cam SK (+)” made by Stratagene was added thereto, and further a DNA ligation kit “DNA ligation kit version 2” made by Takara Shuzo was used. The reaction was carried out at 2 ° C. for 2 hours, and the DNA fragment as the PCR product was inserted into the plasmid vector. A part of the reaction product was taken and transformed into E. coli strain “XL1-Blue MRF′Kan” manufactured by Stratagene according to a conventional method.
[0066]
[Example 3]
<Preparation of recombinant DNA>
The transformant obtained by the method of Example 2-3 was inoculated into LB medium (pH 7.5) containing 30 μg / ml of chloramphenicol, cultured at 37 ° C. for 18 hours, and then the cells were collected from the culture. This was treated according to a conventional method to obtain plasmid DNA. After confirming that this plasmid DNA contains the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 7 in the sequence listing by the dideoxy method, the restriction enzymes NotI and SalI were allowed to act on each of the resulting DNA fragments 100 ng. And 10 ng of the plasmid vector “pcDNAI / Amp” made by Invitrogen, which had been cut in the same manner with XhoI in advance, and added using Takara Shuzo's ligation kit “Ligation Kit Version 2” for 2 hours at 16 ° C. I let you. A part of the reaction product is taken and introduced into “XL1-Blue MRF′Kan” according to a conventional method, and a transformant “cDNA / HuIL-18R” containing the recombinant DNA “pcDNA / HuIL-18R” of the present invention is used. I got. When analyzed according to a conventional method, the recombinant DNA “pcDNA / HuIL-18R” is a cDNA containing the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing, encoding the polypeptide of the present invention. As shown in FIG. 6, “cDNA” was ligated downstream of the cytomegalovirus promoter Pcmv.
[0067]
[Example 4]
<Preparation of transformant>
The transformant “cDNA / HuIL-18R” obtained by the method of Example 3 was inoculated into LB medium (pH 7.5) containing 100 μg / ml of ampicillin, cultured at 37 ° C. for 18 hours, and then cultured from the culture. Was collected according to a conventional method, and plasmid DNA was collected. Separately, COS-1 cells (ATCC CRL-1650), which is a kind of fibroblast cell line derived from the kidney of African green monkeys, were proliferated according to a conventional method, and 20 μg of the plasmid DNA obtained above was taken, Usually 1 x 10 by general electroporation method⁷The product was introduced into a single COS-1 cell to obtain a transformant containing the DNA of the present invention.
[0068]
[Example 5]
<Manufacture of polypeptides>
A DMEM medium (pH 7.2) supplemented with 10% (v / v) fetal calf serum is taken into a flat bottom culture bottle, and 1 × 10 6 of the transformant obtained by the method of Example 4 is added thereto.^FiveInoculate at a rate of 5 / ml / ml₂The cells were cultured at 37 ° C. for 3 days in an incubator. After removing the culture solution from the culture, PBS containing 5 mM EDTA and 0.02% (w / v) sodium azide was injected into the culture bottle to desorb the proliferating cells.
[0069]
The proliferating cells were washed with PBS, and then washed again with a buffer solution (pH 7.4) containing 20 mM HEPES, 10 mM potassium chloride, 1.5 mM magnesium chloride and 0.1 mM EDTA (hereinafter referred to as “hypotonic buffer”). And the cell density is 2 × 10⁷The suspension was suspended in a hypotonic buffer so that the number of cells / ml was reached. This cell suspension was homogenized on ice with a Dounce homogenizer, centrifuged at 15,000 rpm for 5 minutes to remove cell nuclei and unbroken cells, and then dialyzed overnight against PBS containing 2 mM CHAPS.
[0070]
The dialyzate was loaded onto a column on which the monoclonal antibody MAb # 117-10C prepared by the method described in Example 1-5 was immobilized, and PBS containing 12 mM CHAPS was passed through to remove non-adsorbed components. Thereafter, 35 mM ethylamine (pH 10.8) containing 2 mM CHAPS was passed through the column, and the eluate was fractionated. And the presence or absence of the human-derived polypeptide in each fraction was shown in Example 1-1.¹²⁵As a result of determination, selection and combination by a method using I-labeled human IL-18, an aqueous solution containing a polypeptide having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 20 in the sequence listing is used as the source cell 10.⁸About 2 ml was obtained per piece. The protein content of this aqueous solution was about 10 μg / ml.
[0071]
The method described in Example 1 was applied to the polypeptide of the present invention thus obtained, and the physicochemical properties thereof were examined. As a result, the polypeptide obtained in this example has the amino acid sequences shown in SEQ ID NOs: 12 to 19 in the Sequence Listing as partial amino acid sequences, and exhibits the same physiological activity as IL-18R derived from L428 cells. It was.
[0072]
[Example 6]
<Human-derived soluble polypeptide>
[0073]
Example 6-1
<Preparation of recombinant DNA>
Into a 0.5 ml reaction tube, 1 ng of recombinant DNA “pcDNA / HuIL-18R” obtained by the method of Example 3 and 10 μl of 10 × PCR buffer and 1 μl of 25 mM dNTP mix were taken, and 2.5 units / μl of Pfu DNA. After adding 1 μl of polymerase, 5′-TCAGTCGACGCCACCATGAATTTGTAGAGAATTA-3 ′ and 5′-GAAGCGGCCGCATCATATTCTTTGATGACAGTGTG-3 ′, respectively, were added in an appropriate amount as a sense primer and an antisense primer to make 100 μl with sterile distilled water. . The mixture was then incubated 3 times in the order of 94 ° C. for 1 minute, 42 ° C. for 2 minutes, 72 ° C. for 3 minutes, followed by 94 ° C. for 1 minute, 60 ° C. The PCR was carried out by repeating the cycle of incubating in this order for 2 minutes at 72 ° C for 3 minutes in this order 35 times.
[0074]
Take 50 ng of the obtained PCR product, add 1 ng of Takara Shuzo's plasmid vector “pCR-Script SK (+)” to this, and further use Takara Shuzo's DNA ligation kit “DNA ligation kit version 2” at 16 ° C. The reaction was allowed to proceed for 2 hours, and a DNA fragment as a PCR product was inserted into the plasmid vector. A part of the reaction product was taken, and Escherichia coli “XL1-Blue MRF′Kan” manufactured by Stratagene was transformed according to a conventional method.
[0075]
The transformant obtained above was inoculated into LB medium (pH 7.5) containing 100 μg / ml of ampicillin and cultured at 37 ° C. for 18 hours, and then the cells were collected from the culture, and this was obtained according to a conventional method. Treatment gave plasmid DNA. After confirming that this plasmid DNA contains the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 10 in the sequence listing by the dideoxy method, restriction enzymes NotI and SalI were allowed to act on each of the resulting DNA fragments 100 ng in advance. Prepared according to the method described in S. Mizushima et al., “New Clay Acid Research”, Vol. 18, No. 17, 5,332 (1990), which had been cut with NotI and XhoI. 10 ng of the plasmid vector “pEF-BOS” was added, and the mixture was reacted at 16 ° C. for 2 hours using a Takara Shuzo ligation kit “Ligation Kit Version 2”. A part of the reaction product is taken and introduced into “XL1-Blue MRF′Kan” according to a conventional method to obtain a transformant “EFHIL18R-14” containing the recombinant DNA “pEFHIL18R-14” of the present invention. It was. When analyzed according to a conventional method, this recombinant DNA “pEFHIL18R-14” contains “EFHIL18R-14 cDNA” which is a cDNA containing the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 6 in the sequence listing, encoding the polypeptide of the present invention. ] Was ligated downstream of the elongation factor 1 promoter “EF1αP”, as shown in FIG.
[0076]
Example 6-2
<Preparation of transformant>
The transformant “EFHIL18R-14” obtained by the method of Example 6-1 was inoculated into LB medium (pH 7.5) containing 100 μg / ml of ampicillin, cultured at 37 ° C. for 18 hours, and then cultured from the culture. Was collected according to a conventional method, and plasmid DNA was collected. Separately, COS-1 cells (ATCC CRL-1650), which is a kind of fibroblast cell line derived from the kidney of African green monkeys, were proliferated according to a conventional method, and 20 μg of the plasmid DNA obtained above was taken, Usually 1 x 10 by general electroporation method⁷The product was introduced into a single COS-1 cell to obtain a transformant containing the DNA of the present invention.
[0077]
Example 6-3
<Production of soluble polypeptide>
Take Ajinomoto's serum-free medium “ASF104” in a flat-bottom culture bottle, and transfer the transformant obtained by the method of Example 6-2 to 1 ×.10 ⁵ PiecesInoculated at a rate of 5ml / ml and 5% CO according to conventional methods₂The cells were cultured at 37 ° C. for 3 days in an incubator. The culture supernatant was collected from the culture, loaded onto a column on which the monoclonal antibody MAb # 117-10C obtained by the method of Example 1-5 was immobilized, and passed through PBS containing 12 mM CHAPS, and the non-adsorbed fraction. Was excluded. Thereafter, 35 mM ethylamine (pH 10.8) containing 2 mM CHAPS was passed through the column, and the eluate was fractionated. And the presence or absence of the human-derived soluble polypeptide in each fraction was shown in Example 1-1.¹²⁵As a result of determination, selection and combination by a method using I-labeled human IL-18, an aqueous solution containing a polypeptide having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 22 in the sequence listing is used as the source cell 10.⁸About 2 ml was obtained per piece. The protein content of this aqueous solution was about 10 μg / ml.
[0078]
The method described in Example 1 was applied to the thus obtained soluble polypeptide of the present invention, and its physicochemical properties were examined. As a result, the soluble polypeptide obtained in this example contained the amino acid sequences shown in SEQ ID NOs: 12 to 17 and SEQ ID NO: 19 in the sequence listing as partial amino acid sequences, respectively, and was similar to IL-18R derived from L428 cells. Showed physiological activity.
[0079]
[Example 7]
<Human-derived soluble polypeptide>
Into a 0.5 ml reaction tube, 1 ng of the recombinant DNA “pEFHIL18R-14” obtained by the method of Example 6-1, 10 μl of 10 × PCR buffer and 1 μl of 25 mM dNTP mix were taken, and 2.5 units / μl of Pfu DNA. 1 μl of polymerase was added, and further, as a sense primer and an antisense primer, 5′-TCAGTCCGCGCCACCCATGAATTTGTAGAG-3 ′ and 5′-GAAGCGGCCCCTCATTAGTGATGGGTGATGGTGATGTGCAACATGGTTTAAGCTT-3 ′ were added to each of the oligonucleotides after sterilization. The total volume was made up to 100 μl with water. This cycle of incubating the mixture at 94 ° C. for 1 minute, 42 ° C. for 2 minutes, 72 ° C. for 3 minutes in this order was repeated three times, followed by 94 ° C. for 1 minute, 60 ° C. for 1 minute, and 72 ° C. A cycle of incubation in this order for 1 minute was repeated 35 times to cause a PCR reaction, the base sequence shown in SEQ ID NO: 5 in the sequence listing, the cleavage site by the restriction enzyme SalI linked to the 5 ′ end of the base sequence and the Kozak sequence, Then, the restriction site NotI ligated to the 3 ′ end and the cleavage site (His)₆A DNA fragment consisting of the base sequence encoding the tag was obtained. This DNA fragment was introduced into the Stratagene E. coli strain “XL1-Blue MRF′Kan” in the same manner as in Example 6-1, and a transformant containing the recombinant DNA “pEFHIL18RD1-2-H” of the present invention was obtained. Obtained. When analyzed according to a conventional method, in this recombinant DNA, “HIL18RD1-2-H”, which is a cDNA encoding the polypeptide of the present invention and containing the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 5 in the sequence listing, is shown in FIG. As shown in FIG. 8, it was ligated downstream of the elongation factor promoter “EF1αP”.
[0080]
Using the transformant thus obtained, the recombinant DNA “pEFHIL18RD1-2-H” was introduced into COS-1 cells in the same manner as in Example 6-2, and then the COS-1 cells were treated as Examples. Culture was performed as in 6-3. The culture supernatant is collected from the culture, concentrated by membrane filtration, loaded onto a column of affinity chromatography gel “Ni-NTA Spin Kit” manufactured by Qiagen, and passed through PBS containing 20 mM imidazole. The adsorbed fraction was removed. Thereafter, PBS containing 250 mM imidazole was passed through the column, and the eluate was fractionated. On the other hand, the presence or absence of a human-derived soluble polypeptide in each fraction was shown in Example 1-1.¹²⁵As a result of determination, selection and combination by a method using I-labeled human IL-18, an aqueous solution containing a polypeptide having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 23 in the sequence listing is used as the source cell 10.⁸About 2 ml was obtained per piece. The protein content of this aqueous solution was about 10 μg / ml.
[0081]
The method described in Example 1 was applied to the thus obtained soluble polypeptide of the present invention, and its physicochemical properties were examined. As a result, the soluble polypeptide obtained in this example contains a part of or all of the amino acid sequences shown in SEQ ID NOs: 14 to 16 and 19 in the sequence listing as a partial amino acid sequence, and is derived from L428 cells. It showed the same physiological activity as IL-18R.
[0082]
[Example 8]
<Human-derived soluble polypeptide>
Example 7 except that 5'-TCAGTCGACGCCACCCATGAATTGTTAGAG-3 'and 5'-GAAGCGCCGCCTCATTAGTGATGGGTGATGGTGATGTCTTTCAGGTGAAAACAGCT-3' were used as the sense primer and the antisense primer, respectively. A transformant containing the recombinant DNA “pEFHIL18RD1-H” of the invention was obtained. When analyzed according to a conventional method, in this recombinant DNA, “HIL18RD1-H”, which is a cDNA encoding the polypeptide of the present invention and containing the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 3 in the sequence listing, is shown in FIG. As shown, it was ligated downstream of the elongation factor promoter “EF1αP”. Thereafter, the recombinant DNA was introduced into COS-1 cells and expressed in the same manner as in Example 7. As a result, an aqueous solution containing the polypeptide having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 24 in the sequence listing was used as the source cell 10.⁸About 2 ml was obtained per piece. The protein content of this aqueous solution was about 10 μg / ml.
[0083]
The method described in Example 1 was applied to the thus obtained soluble polypeptide of the present invention, and its physicochemical properties were examined. As a result, the soluble polypeptide obtained in this example contains the amino acid sequences shown in SEQ ID NOs: 14 and 15 in the sequence listing as partial amino acid sequences, respectively, and has the same physiological activity as IL-18R derived from L428 cells. showed that.
[0084]
[Example 9]
<Soluble polypeptide derived from mouse>
[0085]
Example 9-1
<Preparation of recombinant DNA>
A reaction product containing a first strand cDNA was obtained in the same manner as in Example 2-3 except that mRNA prepared from mouse hepatocytes according to a conventional method was used instead of mRNA derived from L428 cells. Furthermore, the amino acid sequences reported by P. Pernet et al. In The Journal of Biological Chemistry, Vol. 271, pages 3,967 to 3,970 (1996) and SEQ ID NOs: 5′-TCAGTCGACGCCACCATGCATCATGAAGAA-3 ′ and 5′-GAAGCGGCCGCGCATCATTAGTGATGGGTGATGGTGATGTGGTAAGAGATGGGCC-3 ′ prepared as a primer based on the nucleotide sequence shown in FIG. The product was subjected to PCR reaction in the same manner as in Example 2-3, and the base sequence shown in SEQ ID NO: 11 in the sequence listing and the restriction enzyme SalI linked to the 5 ′ end of the base sequence were used. A cleavage site, a cleavage site by restriction enzyme NotI linked to the 3 ′ end of the base sequence shown in SEQ ID NO: 11, and (His)₆A DNA fragment comprising a base sequence encoding the tag was obtained.
[0086]
Thereafter, this DNA fragment was introduced into E. coli “XL1-Blue MRF′Kan” and transformed by the method shown in Example 6-1, and plasmid DNA was collected from the transformant. 11 was introduced into E. coli “XL1-Blue MRF′Kan” using a plasmid vector “pEF-BOS”, and the recombinant DNA “pEFMIL-18RSHT” of the present invention was introduced. A transformant containing “EFMIL18RSHT” was obtained. When analyzed according to a conventional method, in this recombinant DNA “pEFMIL18RSHT”, “EFMIL18RSHT cDNA” which is a cDNA encoding the polypeptide of the present invention and containing the base sequence shown in SEQ ID NO: 4 in the sequence listing is shown in FIG. As shown in FIG. 10, it was ligated downstream of the elongation factor 1 promoter “EF1αP”.
[0087]
Example 9-2
<Preparation of transformant and soluble polypeptide>
Plasmid DNA was collected from the transformant “EFMIL18RSHT” obtained by the method of Example 9-1 by the method described in Example 6-2, and this was introduced into COS-1 cells. A transformant containing DNA encoding the peptide was obtained.
[0088]
Take Ajinomoto's serum-free medium “ASF104” in a flat bottom culture bottle, and transform COS-1 cells into 1 × 10^FiveInoculate at a rate of 1 / ml, 5% CO according to conventional methods₂The cells were cultured at 37 ° C. for 3 days in an incubator. The culture supernatant is collected from the culture, loaded onto a column of Qiagen affinity chromatography gel “Ni-NTA”, passed through PBS containing 20 mM imidazole to remove the non-adsorbed fraction, and then 250 mM in the column. PBS containing imidazole was passed through and the eluate was fractionated. The presence or absence of a mouse-derived soluble polypeptide in each fraction was shown in Example 1-1.¹²⁵As a result of determination, selection and combination by a method using I-labeled mouse IL-18, an aqueous solution containing a polypeptide having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 25 in the sequence listing is used as the source cell 10⁸About 2 ml was obtained per piece. The protein content of this aqueous solution was about 100 μg / ml. When examined according to the method described in Example 1, the soluble polypeptide thus obtained well neutralized mouse IL-18.
[0089]
[Example 10]
<Liquid>
One of the polypeptides obtained by any of the methods described in Examples 5 to 8 in physiological saline containing 1% (w / v) Hayashibara crystal trehalose powder “Trehaose” as a stabilizer to 1 mg / ml. The resulting solution was dissolved and sterilized by microfiltration according to a conventional method to obtain four types of liquid agents.
[0090]
This product with excellent stability is useful as an injection, eye drops, nasal drops, etc. for treating and preventing sensitive diseases including autoimmune diseases.
[0091]
Example 11
<Dry injection>
100 mg of any of the polypeptides obtained by any of the methods described in Examples 5 to 8 was dissolved in 100 ml of physiological saline containing 1% (w / v) sucrose as a stabilizer, and precision was obtained according to a conventional method. After sterilization by filtration, 1 ml was dispensed into vials, lyophilized, and sealed to obtain four types of powder formulations.
[0092]
This product with excellent stability is useful as a dry injection for treating and preventing sensitive diseases including autoimmune diseases.
[0093]
Example 12
<Ointment>
Concentrations of 1.4% (w / w) and 2.0% (w / w) of carboxyvinyl polymer “Hibiswako 104” manufactured by Wako Pure Chemical Industries and crystal trehalose powder “Trehaose” manufactured by Hayashibara in sterile distilled water And uniformly mixing any of the polypeptides obtained by any of the methods described in Examples 5 to 8, and then adjusting the pH to 7.2. Four paste formulations containing about 1 mg were obtained.
[0094]
This product with excellent spreadability and stability is useful as an ointment for treating and preventing sensitive diseases including autoimmune diseases.
[0095]
Example 13
<tablet>
Any of the polypeptides obtained by any of the methods described in Examples 5 to 8 and lumine as a cell activator were uniformly mixed with Hayashibara's anhydrous crystal α-maltose powder “Finetose”, and the resulting mixture Was tableted by a conventional method to obtain 4 types of tablets each containing about 1 mg of the polypeptide of the present invention and lumine per tablet (about 200 mg).
[0096]
This product, which is excellent in uptake and stability and also has a cell activation effect, is useful as a tablet for treating and preventing sensitive diseases including autoimmune diseases.
[0097]
[Experiment]
<Acute toxicity test>
According to a conventional method, various types of sensitive disease agents obtained by the methods of Examples 10 to 13 were administered to 8 week-old mice by transdermal, oral or intraperitoneal injection. As a result, when converted to the amount of the polypeptide of the present invention, the LD50 of the test sample was about 1 mg / mouse body weight or more by any administration route. This confirms that the polypeptide of the present invention is safe when combined with pharmaceuticals administered to mammals including humans.
[0098]
【The invention's effect】
As described above, the present invention is based on the discovery of a novel receptor protein that recognizes IL-18. Since the polypeptide of the present invention has the property of suppressing or regulating the immune response in mammals including humans, it can be used for alleviating rejection associated with organ transplantation and treating / preventing various diseases caused by excessive immune response. Demonstrate the effect. Furthermore, the polypeptide of the present invention can elucidate the physiological action of IL-18, establish a hybridoma capable of producing a monoclonal antibody specific for IL-18R, and further affinity for purifying and detecting IL-18. It is also useful for chromatography and labeling assays. In addition to this, the polypeptide of the present invention, particularly the soluble polypeptide of the present invention, is also useful for in vivo or in vitro searches for agonists and antagonists to IL-18R. Such a useful polypeptide can be easily produced in a desired amount by the method of the present invention utilizing recombinant DNA technology.
[0099]
This invention is an invention that exhibits such a remarkable effect, and it can be said that it is a very significant invention to contribute to this field.
[0100]
[Sequence Listing]

[0101]

[0102]

[0103]

[0104]

[0105]

[0106]

[0107]

[0108]

[0109]

[0110]

[0111]

[0112]

[0113]

[0114]

[0115]

[0116]

[0117]

[0118]

[0119]

[0120]

[0121]

[0122]

[0123]

[0124]

[0125]

[0126]

[Brief description of the drawings]
FIG. 1 shows how monoclonal antibody MAb # 117-10C competes with IL-18 and binds to L428 cells and IL-18R.
FIG. 2 is a halftone image displayed on a gel electrophoresis display of IL-18R, visualized by Western blotting using monoclonal antibody MAb # 117-10C.
FIG. 3 shows inhibition of IL-18 activity by monoclonal antibody MAb # 117-10C.
FIG. 4 is a chromatogram when immunoaffinity chromatography using monoclonal antibody MAb # 117-10C is applied to IL-18R.
FIG. 5 is a peptide map of IL-18R.
FIG. 6 is a view showing the structure of “pcDNA / HuIL-18R” which is a recombinant DNA of the present invention.
FIG. 7 is a view showing the structure of “pEFHIL18R-14”, which is a recombinant DNA of the present invention.
FIG. 8 is a diagram showing the structure of “pEFHIL18RD1-2-H” which is the recombinant DNA of the present invention.
FIG. 9 is a diagram showing the structure of “pEFHIL18RD1-H” which is the recombinant DNA of the present invention.
FIG. 10 is a view showing the structure of “pEFMIL18RSHT” which is a recombinant DNA of the present invention.
[Explanation of sign]
Pcmv cytomegalovirus promoter
EF1αP elongation factor 1 promoter
IL-18R cDNA cDNA encoding the polypeptide of the present invention
EFHIL18R-14 cDNA cDNA encoding soluble polypeptide derived from human according to the present invention
HIL18RD1-2-H cDNA
CDNA encoding a human-derived soluble polypeptide according to the present invention
HIL18RD1-H cDNA cDNA encoding soluble polypeptide derived from human according to the present invention
EFMIL18RSHT cDNA cDNA encoding soluble polypeptide derived from mouse according to the present invention

Claims

配列表における配列番号２４又は２５に示すアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドを有効成分とするインターロイキン−１８の中和剤。 The neutralizing agent of interleukin-18 which uses the polypeptide which comprises the amino acid sequence shown to sequence number 24 or 25 in a sequence table as an active ingredient.

配列表における配列番号２４又は２５に示すアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドを試料に作用させることを特徴とするインターロイキン−１８の検出方法。A method for detecting interleukin-18, which comprises allowing a polypeptide comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 24 or 25 in the sequence listing to act on a sample .

配列表における配列番号２０又は２１に示すアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドを認識し、インターロイキン−１８受容体へのインターロイキン−１８の結合を阻害する抗体を有効成分とするインターロイキン−１８の中和剤。 Interleukin-18 comprising an antibody that recognizes a polypeptide comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 20 or 21 in the sequence listing and inhibits the binding of interleukin-18 to the interleukin-18 receptor as an active ingredient Neutralizer.