JP4009677B2 - Microorganism for improving protoplast regeneration rate and protoplast regeneration method - Google Patents

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、細胞融合による育種などに用いられるプロトプラストの再生率を向上させる微生物、及びこれを用いるプロトプラストの再生方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
プロトプラスト(Protoplast)は、細菌、菌類、植物細胞などの細胞壁を酵素処理等によって取り除いた原形質体であり、適当な浸透圧条件下では細胞としての諸活性を維持すると共に、高分子物質や粒子の導入、あるいは細胞融合等の操作が可能であるという優れた特性を有している。このため、プロトプラストは、外来性ＤＮＡの導入による形質転換体の作成や細胞融合による育種、特定の遺伝形質を有する細胞の選別等に広く用いられている。
【０００３】
これらの方法を用いて目的の生物体を得るためには、各種操作を行った後、プロトプラストに細胞壁を再生させる必要がある。プロトプラストの再生には、一般的に浸透圧の調整のために高張培地が用いられ、さらに植物、菌類、細菌などの生物種や株によってそれぞれの最適条件が検討されている。例えば、バチルス属間のプロトプラスト融合[Proc. Nat. Acad. Sci., 73, 2147-2150, 2151-2155 (1976)]、ストレプトミセス属間のプロトプラスト融合 [J. Gen. Microbiol., 80, 389-400 (1974)]、ストレプトミセス属とノカルジア属間のプロトプラスト融合（特開昭54-14580）、好アルカリ性バチルス属細菌の形質転換法（特開平8-107784）などの中にはそれぞれの微生物のプロトプラストの再生法が記述されている。しかしながら、プロトプラストは一般的に再生率が低く、特にグラム陰性細菌においては外膜を有するためにプロトプラスト化及びその再生が難しい[Cytobios, 76, 91-95 (1993)]。例えば、グラム陰性菌の一種であるプロビデンス属菌のスフェロプラスト（細胞壁が一部残存しているプロトプラスト）の再生率は10％前後という報告がある[J. Gen. Microbiol., 114, 313-322 (1979)]。
【０００４】
プロトプラストの再生率を向上させる手段として、例えば特開平6-217759にはカラジーナン及びポリアミンを含有する固体培地を用いる酵母プロトプラストの再生法が述べられているが、細菌プロトプラストの再生についての記述はない。また、特開平8-56654には疎水化多糖含有培地で培養することにより植物プロトプラストが安定化されることが述べられているが、再生率の向上についての記述はない。一方、大腸菌を長期間培養することによって自然に生じるプロトプラスト様細胞の再生が、グラム陽性細菌サルシナ・ルテア ［Sarcina lutea , 現在名ミクロコッカス・ルテウス（Micrococcus luteus）］を添加することによって促進されることが報告されている［Nature, 181,566-567 (1958)］。しかし、その詳細は明らかにされておらず、大腸菌以外の細菌のプロトプラストへの適用やサルシナ（ミクロコッカス）属以外の微生物による促進についての記述はない。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
上述のように、プロトプラストを用いる技術においては再生率の低さが１つの障害となっており、微生物、特にグラム陰性細菌のプロトプラスト再生に関しては有効な技術が確立されていない。そこで、本発明の目的は、グラム陰性細菌を含む微生物のプロトプラストの再生率を向上させる技術を提供することにある。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決する手段としてプロトプラストの再生率を向上させる微生物に着目し、鋭意検討を重ねた結果、ミクロコッカス属、バチルス属、エシェリヒア属、スポロサルシナ属に属する微生物が、細菌プロトプラストの再生率を向上させることを見出し、本発明を完成した。すなわち本発明は、ミクロコッカス属、バチルス属、エシェリヒア属、あるいはスポロサルシナ属に属し、プロトプラストの再生率を向上させる微生物を、シュードモナス属細菌のプロトプラストの再生時、共存させることを特徴とするプロトプラストの再生方法に関する。
【０００７】
【発明の実施の形態】
本発明の微生物は、ミクロコッカス属、バチルス属、エシェリヒア属、スポロサルシナ属に属し、プロトプラストの再生時に共存させることによってその再生率を向上させることができるものであればいずれでもよく、このような微生物は保存菌株の中から選択することができ、また自然界から新たに分離することもできる。本発明のミクロコッカス属に属する微生物としては、ミクロコッカス・ルテウス(Micrococcus luteus) IFO 3763, IFO 13867, IAM 1099 、ミクロコッカス・ピロゲネス(Micrococcus pyrogenes) IFO 3340、ミクロコッカス・バリアンス(Micrococcus varians) IFO 3765 を挙げることができる。バチルス属に属する微生物としては、バチルス・スブチリス(Bacillus subtilis) IFO 3026、バチルス・メガテリウム(Bacillus megaterium) IAM 1166、バチルス・スフェリカス(Bacillus sphaericus) IFO 3525 を挙げることができる。エシェリヒア属に属する微生物としては、エシェリヒア・コリ(Escherichia coli) IFO 3208 を挙げることができる。スポロサルシナ属に属する微生物としては、スポロサルシナ・ウレアエ(Sporosarcina ureae) SCRC-R04 (FERM P-8178) を挙げることができる。これらの菌株は、それぞれの番号のもとに菌株保存施設で保存されており、各々の施設より自由に入手することができる。
【０００８】
この発明が対象とするプロトプラストは、細菌や菌類、あるいは植物細胞のプロトプラストであるが、これにはスフェロプラストやプロトプラスト様細胞も包含される。その調製は公知の方法に従って行うことができる。例えば細菌のプロトプラストを調製する場合には、まず一般的な細菌用培地（普通栄養培地、ＬＢ培地など）に該細菌を接種して培養し、菌体を得る。次いでこの菌体を、浸透圧を調整する物質（スクロース、ソルビトールなど）を含む高張緩衝液に懸濁し、細胞壁分解酵素（リゾチームなど）を作用させて細胞壁を除去する。このようにして調製したプロトプラストは細胞融合などの処理を行ったあと、同じく公知の方法で再生させるが、その再生用培地に本発明の再生率を向上させる微生物を添加することにより、再生率を向上させることができる。
【０００９】
以下、実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００１０】
【実施例】
【００１１】
実施例１. 各種菌株の菌体添加によるシュードモナス・プチダ PpG7 株のプロトプラスト再生率の向上
（１）プロトプラストの調製
LB平板培地（酵母エキス0.5％、トリプトン1％、食塩1％、寒天2％、pH7）にシュードモナス・プチダ PpG7 株を塗布し、30℃で24時間培養した。一白金耳分の菌体をLB液体培地（酵母エキス0.5％、トリプトン1％、食塩1％、pH7）5mlに接種し、30℃で振盪培養した。11時間後、培養液10μlをLB液体培地50mlが入った三角フラスコに接種し、25℃で12時間振盪培養した。培養液の濁度 (OD₆₁₀) は6.22であった。この培養液から9.6mlを採取して遠心分離により菌体を集め、これをプロトプラスト調製用緩衝液［ビシン｛N,N-ビス（２−ヒドロキシエチル）グリシン｝30mM、ショ糖20％、エチレンジアミン２酢酸ナトリウム3mM、塩化カリウム33mM、pH7］10mlに懸濁した。これに最終濃度が0.5mg/mlとなるようにリゾチームを加え、4℃で30分間、60往復／分で振盪したのち、25℃で7時間静置した。
【００１２】
（２）プロトプラスト再生率を向上させる微生物菌体の調製
プロトプラスト再生率を向上させる微生物菌体の調製は次のようにして行った。すなわち、LB液体培地10mlに微生物を接種し、30℃で24〜48時間振盪培養した。培養液の濁度(OD₆₁₀) を表１に示す。
【００１３】

【００１４】
得られた培養液から遠心分離により菌体を集め、1mlのLB液体培地に懸濁して菌体サンプルとした。
【００１５】
（３）プロトプラスト再生率の測定
（１）で調製したプロトプラスト懸濁液の細胞濃度を、検鏡により細菌用計算盤を用いて算出し、プロトプラスト調製用緩衝液で希釈して、細胞濃度を1.25×10⁵個／mlに調製した。この希釈液100μlと、（２）で調製した菌体サンプル250μl、LB液体培地150μlを混合し、そのうちの100μlずつを再生用プレート（LB平板培地にショ糖5％、塩化マグネシウム10mM、塩化カルシウム10mMを添加した培地）４枚に塗布して、23℃で培養した。なお、この再生用プレートには菌体サンプルの増殖を抑えるため、アンピシリン 50μg/mlを添加した。シュードモナス・プチダ PpG7 株は、この濃度のアンピシリンに対して耐性である。４日後、再生用プレート上に出現したコロニーの数を測定し、再生率を算出した。再生率は出現コロニー数÷播種した細胞数×100で算出される。各種菌株の菌体サンプルを添加した時の再生率を図１に示す。いずれの菌株においても、コントロールのサンプル無添加に比べて明らかな再生率の向上がみられた。
【００１６】
実施例２. ミクロコッカス・ルテウス IAM 1099 株の、プロトプラスト再生率向上活性と菌体濃度との関係
LB液体培地5mlにミクロコッカス・ルテウス IAM 1099 株を接種し、25℃で48時間振盪培養した後、全量をLB液体培地100mlに接種して、25℃で24時間振盪培養した。培養液の濁度(OD₆₁₀)は10.98であった。この培養液から遠心分離により菌体を集め、LB液体培地10mlに懸濁した。この菌体サンプルをLB液体培地で10倍、100倍、1000倍、10000倍に希釈したものを用い、実施例１の（３）の方法に従って活性試験を行った。その結果を図２に示す。菌体濃度とプロトプラスト再生率には相関関係がみられ、菌体濃度が低くなるほど活性は低下したが、1000倍希釈液を用いた場合でも、対照（菌体無添加）に比べて約1.33倍の再生率を示した。
【００１７】
【発明の効果】
本発明によれば、再生率の低いプロトプラストを高頻度に再生することができ、これによって例えば細胞工学やバイオテクノロジー分野におけるプロトプラストを用いる技術の有用性を高めることが可能である。
【図面の簡単な説明】
【図１】 シュードモナス・プチダ PpG7 株のプロトプラストの再生率と、これに各種菌株の菌体を添加した時の再生率を示す。
【図２】 シュードモナス・プチダ PpG7 株のプロトプラストの再生率と、これにミクロコッカス・ルテウス IAM 1099 株の各希釈段階の菌体を添加した時の再生率を示す。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a microorganism for improving the regeneration rate of protoplasts used for breeding by cell fusion and the like, and a method for regenerating protoplasts using the same.
[0002]
[Prior art]
Protoplast is a protoplast from which cell walls of bacteria, fungi, plant cells, etc. have been removed by enzymatic treatment, etc., maintaining various activities as cells under appropriate osmotic pressure conditions, and polymer substances and particles It has an excellent characteristic that operation such as introduction or cell fusion is possible. For this reason, protoplasts are widely used for the production of transformants by introducing foreign DNA, breeding by cell fusion, selection of cells having a specific genetic trait, and the like.
[0003]
In order to obtain a target organism using these methods, it is necessary to regenerate the cell wall in the protoplast after various operations. For regeneration of protoplasts, a hypertonic medium is generally used to adjust the osmotic pressure, and the optimum conditions for each species and strain such as plants, fungi, and bacteria are examined. For example, protoplast fusion between Bacillus [Proc. Nat. Acad. Sci., 73, 2147-2150, 2151-2155 (1976)], protoplast fusion between Streptomyces [J. Gen. Microbiol., 80, 389 -400 (1974)], protoplast fusion between Streptomyces and Nocardia (Japanese Patent Laid-Open No. 54-14580), transformation method of alkalophilic Bacillus (Japanese Patent Laid-Open No. 8-107784), etc. The protoplast regeneration method is described. However, protoplasts generally have a low regeneration rate, and in particular, gram-negative bacteria have an outer membrane that makes protoplasts and their regeneration difficult [Cytobios, 76, 91-95 (1993)]. For example, there is a report that the regeneration rate of spheroplasts of genus Providence, a kind of Gram-negative bacteria (protoplasts with some remaining cell walls) is around 10% [J. Gen. Microbiol., 114, 313- 322 (1979)].
[0004]
As a means for improving the regeneration rate of protoplasts, for example, JP-A-6-217759 describes a method for regenerating yeast protoplasts using a solid medium containing carrageenan and polyamine, but there is no description about the regeneration of bacterial protoplasts. Japanese Patent Application Laid-Open No. 8-56654 describes that plant protoplasts are stabilized by culturing in a hydrophobized polysaccharide-containing medium, but there is no description about improvement of regeneration rate. On the other hand, regeneration of protoplast-like cells that naturally occur after long-term culture of Escherichia coli can be promoted by adding the Gram-positive bacterium Sarcina lutea (currently Micrococcus luteus). Have been reported [Nature, 181,566-567 (1958)]. However, the details are not clarified, and there is no description about application to bacteria protoplasts other than E. coli and promotion by microorganisms other than the genus Sarsina (Micrococcus).
[0005]
[Problems to be solved by the invention]
As described above, in the technology using protoplasts, a low regeneration rate is one obstacle, and no effective technology has been established for protoplast regeneration of microorganisms, particularly gram-negative bacteria. Therefore, an object of the present invention is to provide a technique for improving the protoplast regeneration rate of microorganisms containing Gram-negative bacteria.
[0006]
[Means for Solving the Problems]
The inventors of the present invention focused on microorganisms that improve the protoplast regeneration rate as a means for solving the above problems, and as a result of intensive studies, microorganisms belonging to the genus Micrococcus, Bacillus, Escherichia, and Sporosarcina are bacteria. The inventors have found that the protoplast regeneration rate can be improved, and have completed the present invention. That is, the present invention relates to protoplast regeneration characterized in that a microorganism that belongs to the genus Micrococcus, Bacillus, Escherichia, or Sporosarcina, and coexists with a microorganism that improves the protoplast regeneration rate during the regeneration of protoplasts of Pseudomonas bacteria. Regarding the method.
[0007]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
The microorganism of the present invention may be any microorganism as long as it belongs to the genus Micrococcus, Bacillus, Escherichia, Sporosarcina, and can improve the regeneration rate by coexisting at the time of protoplast regeneration. Can be selected from stored strains and can be newly isolated from nature. The microorganism belonging to the genus Micrococcus of the present invention includes Micrococcus luteus IFO 3763, IFO 13867, IAM 1099, Micrococcus pyrogenes IFO 3340, Micrococcus varians IFO 3765 Can be mentioned. Examples of microorganisms belonging to the genus Bacillus include Bacillus subtilis IFO 3026, Bacillus megaterium IAM 1166, and Bacillus sphaericus IFO 3525. Examples of microorganisms belonging to the genus Escherichia include Escherichia coli IFO 3208. Examples of microorganisms belonging to the genus Sporosarcina include Sporosarcina ureae SCRC-R04 (FERM P-8178). These strains are stored in the strain storage facility under the respective numbers, and can be freely obtained from each facility.
[0008]
The protoplasts targeted by this invention are protoplasts of bacteria, fungi, or plant cells, including spheroplasts and protoplast-like cells. The preparation can be performed according to a known method. For example, when preparing bacterial protoplasts, first, the bacteria are inoculated and cultured in a general bacterial medium (normal nutrient medium, LB medium, etc.) to obtain bacterial cells. Next, the cells are suspended in a hypertonic buffer containing a substance that adjusts osmotic pressure (sucrose, sorbitol, etc.), and a cell wall degrading enzyme (lysozyme, etc.) is allowed to act to remove the cell wall. The protoplasts thus prepared are treated by cell fusion or the like and then regenerated by a known method. However, the regeneration rate can be increased by adding a microorganism that improves the regeneration rate of the present invention to the regeneration medium. Can be improved.
[0009]
EXAMPLES Hereinafter, although an Example is given and this invention is demonstrated further in detail, this invention is not limited to these Examples.
[0010]
【Example】
[0011]
Example 1. Improvement of protoplast regeneration rate of Pseudomonas putida PpG7 by addition of various strains (1) Preparation of protoplasts
Pseudomonas putida PpG7 strain was applied to LB plate medium (yeast extract 0.5%, tryptone 1%, salt 1%, agar 2%, pH 7) and cultured at 30 ° C. for 24 hours. The cells of one platinum loop were inoculated into 5 ml of LB liquid medium (0.5% yeast extract, 1% tryptone, 1% sodium chloride, pH 7), and cultured with shaking at 30 ° C. After 11 hours, 10 μl of the culture solution was inoculated into an Erlenmeyer flask containing 50 ml of LB liquid medium, and cultured with shaking at 25 ° C. for 12 hours. The turbidity (OD ₆₁₀ ) of the culture was 6.22. 9.6 ml was collected from this culture solution, and the cells were collected by centrifugation, and this was collected into a protoplast preparation buffer solution [bicine {N, N-bis (2-hydroxyethyl) glycine} 30 mM, sucrose 20%, ethylenediamine 2 It was suspended in 10 ml of sodium acetate 3 mM, potassium chloride 33 mM, pH 7]. Lysozyme was added to this so that the final concentration was 0.5 mg / ml, and the mixture was shaken at 4 ° C. for 30 minutes and 60 reciprocations / minute, and then allowed to stand at 25 ° C. for 7 hours.
[0012]
(2) Preparation of microbial cells for improving protoplast regeneration rate Preparation of microbial cells for improving protoplast regeneration rate was performed as follows. Specifically, 10 ml of LB liquid medium was inoculated with microorganisms and cultured with shaking at 30 ° C. for 24-48 hours. Table 1 shows the turbidity (OD ₆₁₀ ) of the culture solution.
[0013]

[0014]
Bacterial cells were collected from the obtained culture broth by centrifugation and suspended in 1 ml of LB liquid medium to prepare a cell sample.
[0015]
(3) Measurement of Protoplast Regeneration Rate The cell concentration of the protoplast suspension prepared in (1) was calculated using a bacterial calculator with a microscope, diluted with a protoplast preparation buffer, and the cell concentration was 1.25. × 10 ⁵ / ml. Mix 100 μl of this diluted solution with 250 μl of the bacterial cell sample prepared in (2) and 150 μl of LB liquid medium, and 100 μl of each is mixed with a plate for regeneration (LB plate medium with 5% sucrose, 10 mM magnesium chloride, 10 mM calcium chloride). The medium was added to 4 plates and cultured at 23 ° C. In addition, 50 μg / ml of ampicillin was added to this regeneration plate in order to suppress the growth of the bacterial cell sample. Pseudomonas putida PpG7 strain is resistant to this concentration of ampicillin. Four days later, the number of colonies that appeared on the regeneration plate was measured, and the regeneration rate was calculated. The regeneration rate is calculated by the number of appearance colonies divided by the number of seeded cells × 100. The regeneration rate when the bacterial cell samples of various strains are added is shown in FIG. In any of the strains, a clear improvement in the regeneration rate was observed as compared with the case where no control sample was added.
[0016]
Example 2. Relationship between the activity of improving the protoplast regeneration rate and the cell concentration of Micrococcus luteus IAM 1099 strain
Micrococcus luteus IAM 1099 strain was inoculated in 5 ml of LB liquid medium, and after shaking culture at 25 ° C. for 48 hours, the whole amount was inoculated into 100 ml of LB liquid medium and cultured at 25 ° C. for 24 hours with shaking. The turbidity (OD ₆₁₀ ) of the culture was 10.98. The cells were collected from this culture by centrifugation and suspended in 10 ml of LB liquid medium. Using this bacterial cell sample diluted 10-fold, 100-fold, 1000-fold, and 10000-fold with an LB liquid medium, an activity test was performed according to the method of Example 1 (3). The result is shown in FIG. There was a correlation between the bacterial cell concentration and the protoplast regeneration rate, and the activity decreased as the bacterial cell concentration decreased. However, even when a 1000-fold diluted solution was used, it was approximately 1.33 times that of the control (no bacterial cell added). Showed the regeneration rate.
[0017]
【The invention's effect】
According to the present invention, a protoplast having a low regeneration rate can be regenerated at a high frequency, and thereby, for example, the usefulness of a technique using a protoplast in the field of cell engineering or biotechnology can be enhanced.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 shows the regeneration rate of Pseudomonas putida PpG7 protoplasts and the regeneration rate when cells of various strains are added thereto.
FIG. 2 shows the protoplast regeneration rate of Pseudomonas putida PpG7 strain and the regeneration rate when cells of each dilution stage of Micrococcus luteus IAM 1099 strain were added thereto.

Claims (1)

シュードモナス(Pseudomonas)属細菌のプロトプラストの再生時に、ミクロコッカス(Micrococcus)属、バチルス(Bacillus)属、エシェリヒア(Escherichia)属、又はスポロサルシナ(Sporosarcina)属に属し、プロトプラストの再生率を向上させる微生物を共存させることを特徴とする、シュードモナス属細菌のプロトプラストの再生方法。During reproduction of protoplasts of Pseudomonas (Pseudomonas) bacteria, Micrococcus (Micrococcus) genus Bacillus (Bacillus) genus Escherichia (Escherichia) genus, or belong to Sporosarcina (Sporosarcina) genus, coexisting microorganisms to improve the regeneration rate of protoplasts A method for regenerating a protoplast of Pseudomonas bacteria characterized by comprising

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