JP3985046B2 - Cytokines to activate dermal papilla cells - Google Patents
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Description
本発明は、毛乳頭細胞に作用するサイトカインに関する。 The present invention relates to cytokines that act on dermal papilla cells.
サイトカインは、タンパク質性のホルモン様物質であり、細胞の増殖、分化、機能発現などの様々な生体の機能を調節している。上皮成長因子（Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ， 以下、ＥＧＦと略称する）などの増殖因子の発見を端緒に、これまで多種類のサイトカインが、主に哺乳動物から発見されている。一般的に、サイトカインは、そのサイトカインに対応する受容体（サイトカイン受容体）を介して、その受容体を発現する細胞に作用する。 Cytokines are proteinaceous hormone-like substances that regulate various biological functions such as cell proliferation, differentiation, and functional expression. With the discovery of growth factors such as epidermal growth factor (hereinafter abbreviated as EGF), many types of cytokines have been discovered mainly in mammals. In general, a cytokine acts on a cell expressing the receptor via a receptor (cytokine receptor) corresponding to the cytokine.
毛乳頭細胞は、毛髪の成長に関わる細胞であることから、養毛剤、育毛剤、発毛剤などの薬剤を開発している製薬業界および化粧品業界が注目している細胞である。これまで前記薬剤に使用されてきた活性物質は、植物由来の物質であった。生体において直接的に毛乳頭細胞に作用しているサイトカインは、前記薬剤に使用される活性物質の好ましい形態であると思われる。しかし、毛乳頭細胞に作用するサイトカインに関しては解明されていない点が多く、かかるサイトカインを含有する前記薬剤の開発には至っていない。 Since dermal papilla cells are cells involved in hair growth, the pharmaceutical industry and the cosmetics industry, which are developing drugs such as hair nourishing agents, hair restorers, and hair growth agents, are attracting attention. The active substances that have been used in the drugs so far have been plant-derived substances. Cytokines that act directly on dermal papilla cells in the body appear to be the preferred form of active substance used in the drug. However, there are many points that have not been elucidated regarding cytokines that act on dermal papilla cells, and the drug containing such cytokines has not yet been developed.
成長阻害ペプチド（Ｇｒｏｗｔｈ−Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｐｅｐｔｉｄｅ、以下、ＧＢＰと略称する）は、カリヤコマユバチ（Ｃｏｔｅｓｉａ ｋａｒｉｙａｉ）に寄生されたアワヨトウ（Ｐｓｅｕｄａｌｅｔｉａ ｓｅｐａｒａｔｅ）の終令幼虫の体液から単離された昆虫のサイトカインである。ＧＢＰは、低分子量のペプチドからなるサイトカインであり、当初は鱗翅目昆虫の幼虫の発育を阻害するサイトカインとして公開された（特許文献１）。その後、ＧＢＰは、細胞増殖を誘導する作用（ヒトケラチノサイト、昆虫のＳｆ９細胞）、昆虫の血球を活性化させる作用などの複数の作用を示すサイトカインであることが明らかとなった（非特許文献１）。また、ＧＢＰを変異させた変異ペプチドの作用なども報告された（非特許文献２）。更に、ヒトケラチノサイトを用いた研究において、ＧＢＰはＥＧＦの受容体を介して作用する可能性が報告された（非特許文献３）。 Growth inhibitory peptide (Growth-Blocking Peptide, hereinafter abbreviated as GBP) is a cytokine insect isolated from the body fluids of the end instar larvae of Kariya Braconidae (Cotesia kariyai) in infested armyworm (Pseudaletia separate). GBP is a cytokine composed of a low molecular weight peptide, and was originally disclosed as a cytokine that inhibits the development of lepidopteran larvae (Patent Document 1). Then, it became clear that GBP is a cytokine having a plurality of actions such as an action of inducing cell proliferation (human keratinocytes, insect Sf9 cells) and an action of activating insect blood cells (Non-patent Document 1). ). Moreover, the effect | action etc. of the mutant peptide which mutated GBP were reported (nonpatent literature 2). Furthermore, in a study using human keratinocytes, it has been reported that GBP may act via an EGF receptor (Non-patent Document 3).
本発明は、毛乳頭細胞に対するＧＢＰの新たな用途を見出した。
毛乳頭細胞を活性化するためのサイトカインの提供。 Providing cytokines to activate dermal papilla cells.
配列番号１記載のアミノ酸配列からなる化学合成可能な、毛乳頭細胞を活性化するためのサイトカインを提供する。 Provided is a cytokine for activating hair papilla cells, which can be chemically synthesized, comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1.
化学合成可能で且つ生物に由来する夾雑物の混入が回避または低減された、毛乳頭細胞を活性化するためのサイトカインを提供し得る。 It is possible to provide a cytokine for activating dermal papilla cells that can be chemically synthesized and that avoids or reduces contamination of organism-derived contaminants.
以下、本発明を詳細に説明する。 Hereinafter, the present invention will be described in detail.
本発明は、前記ＧＢＰの毛乳頭細胞に対する用途を見出した。従って、本発明によって提供されるサイトカインは、前記ＧＢＰ及びそのアナログである。以下、本発明により提供されるサイトカインを「本サイトカイン」と称する。 The present invention has found use of the GBP for hair papilla cells. Therefore, the cytokine provided by the present invention is the GBP and its analogs. Hereinafter, the cytokine provided by the present invention is referred to as “present cytokine”.
本サイトカインが対象とする毛乳頭細胞は、特に限定されないが、好ましくは哺乳動物の毛乳頭細胞、より好ましくはヒトの毛乳頭細胞である。毛根には、毛球というふくらんだ部分があり、その中にある毛母細胞は盛んに***をくり返して毛髪を形成している。成長期の毛球の内側には、毛乳頭組織があり、毛髪を成長させる栄養分が毛細血管から送りこまれる。毛髪の成長には、毛乳頭細胞の活性、毛母細胞の増殖が重要な役割を担っている。従って、これらの細胞の細胞増殖を誘導することにより毛髪の状態を良好に保つことが可能である。 The dermal papilla cells targeted by this cytokine are not particularly limited, but are preferably mammalian dermal papilla cells, more preferably human dermal papilla cells. The hair root has a puffy portion called a hair bulb, and the hair matrix cells in it are actively divided to form hair. Inside the growing hair bulb, there is a dermal papilla tissue, and nutrients that grow the hair are sent from the capillaries. The hair papillary cell activity and hair matrix cell proliferation play important roles in hair growth. Therefore, it is possible to keep the hair in good condition by inducing cell proliferation of these cells.
＜本サイトカインの特長＞
前記ＥＧＦは、アミノ酸５０残基程度からなるものである。このような５０残基程度のサイトカインを化学合成によって大量に調製することは、現在の技術では不可能である。このような技術的背景から、一般的にサイトカインは、生合成に基づく手段により生産される。その手段の代表的な例として、遺伝子組換え技術を利用し、宿主生物（例えば、宿主となる生物の個体または細胞）に所望のサイトカインを生産させる手段がある。このような生合成に基づく手段により前記サイトカインを生産する場合、生合成された前記サイトカインを、その生物に由来する夾雑物から精製する精製工程が必要となる。しかし、複数の精製工程を施して、生産物中の前記サイトカインの純度を上げても、夾雑物を完全に生産物から除去することは困難である。特に、タンパク質性の夾雑物は、同様にタンパク質であるサイトカインと物理化学的な特性が同じなので、除去することは困難である。以上のように、従来のサイトカインには夾雑物の混入という問題があった。
<Features of this cytokine>
The EGF consists of about 50 amino acid residues. Such a cytokine of about 50 residues cannot be prepared in large quantities by chemical synthesis with the current technology. From such technical background, cytokines are generally produced by means based on biosynthesis. As a typical example of such means, there is a means for producing a desired cytokine in a host organism (for example, an individual or a cell of a host organism) using a gene recombination technique. When the cytokine is produced by means based on such biosynthesis, a purification step for purifying the biosynthesized cytokine from contaminants derived from the organism is required. However, even if a plurality of purification steps are performed to increase the purity of the cytokine in the product, it is difficult to completely remove impurities from the product. In particular, proteinaceous impurities are difficult to remove because they have the same physicochemical properties as cytokines, which are also proteins. As described above, the conventional cytokine has a problem of contamination.
一方、本サイトカインは、低分子量（アミノ酸２５残基からなるペプチド）であることを特長とするサイトカインである。２５残基のアミノ酸配列からなるペプチドは、化学合成法による合成が可能である。化学合成によりサイトカインを合成できれば、生物に由来する夾雑物の混入を回避または低減できる。 On the other hand, this cytokine is a cytokine characterized by low molecular weight (a peptide consisting of 25 amino acid residues). A peptide consisting of an amino acid sequence of 25 residues can be synthesized by a chemical synthesis method. If cytokines can be synthesized by chemical synthesis, contamination of living organisms can be avoided or reduced.
以上のように、本サイトカインは、従来のサイトカインの問題を克服したサイトカインである。 As described above, this cytokine is a cytokine that has overcome the problems of conventional cytokines.
＜本サイトカインの配列＞
本サイトカインは、配列番号１記載のアミノ酸配列からなるサイトカインである。
また、本サイトカインは、配列番号１記載のアミノ酸配列からなるサイトカインのアナログ（類似体）であってもよい。前記アナログは、例えば、配列番号１記載のアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つ配列番号１記載のアミノ酸配列からなるサイトカインと同じ活性を有するサイトカインであってもよい（このようなサイトカインの例は、例えば上記の非特許文献２などに例示されている）。また、前記アナログは、例えば、これらのサイトカインにおいて、いくつかの官能基が他の官能基で置換され、且つ配列番号１記載のアミノ酸配列からなるサイトカインと同じ活性を有するサイトカインであってもよい（このようなサイトカインの例は、例えば上記の特許文献１などに例示されている）。
<Sequence of this cytokine>
This cytokine is a cytokine consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1.
In addition, the cytokine may be an analog (analogue) of the cytokine consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1. The analog has, for example, an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted, or added in the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1, and has the same activity as a cytokine consisting of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1. (Examples of such cytokine are exemplified in Non-Patent Document 2 above). Further, the analog may be, for example, a cytokine having some functional groups substituted with other functional groups and having the same activity as the cytokine consisting of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1 ( Examples of such cytokines are exemplified in the above-mentioned Patent Document 1).
配列番号１記載のアミノ酸配列は、図１においても示される２５残基からなる配列、即ちアミノ酸の一文字表記により、ＥＮＦＳＧＧＣＶＡＧＹＭＲＴＰＤＧＲＣＫＰＴＦＹＱで表される配列である。 The amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1 is a 25-residue sequence also shown in FIG. 1, that is, a sequence represented by ENFSSGGCVAGYMRTPGRCKPTFYQ by one-letter amino acid notation.
＜本サイトカインの調製＞
本サイトカインは、当業者であれば、例えばｔ−Ｂｏｃ法、Ｆ−ｍｏｃ法などの公知のペプチドの化学合成法に従って合成することができる。また、本サイトカインは、上記の特許文献１の記載にしたがって合成することも可能である。更に、本サイトカインは、ペプチドを化学合成する会社に委託して合成することも可能である。
<Preparation of this cytokine>
Those skilled in the art can synthesize this cytokine according to known peptide chemical synthesis methods such as t-Boc method and F-moc method. Moreover, this cytokine can also be synthesize | combined according to description of said patent document 1. FIG. Furthermore, the cytokine can be synthesized by consigning to a company that chemically synthesizes peptides.
＜本サイトカインの作用＞
本サイトカインは、毛乳頭細胞を活性化する。
本発明において「活性化」の用語は、毛乳頭細胞に関して用いられる場合、細胞増殖を誘導することを意味する。また、本発明において「細胞増殖」の用語は、他に特に説明がない場合、本サイトカインの作用（または存在）する条件下で毛乳頭細胞の細胞***を生じ、本サイトカインが作用（または存在）しない条件下と比較して細胞数が増加することを意味している。細胞***は、細胞***に至るシグナル伝達経路が活性化し、前記経路の活性化の途上で生じるＤＮＡ複製などを経た後に達成される現象である。従って、前記用語は、本サイトカインが作用（または存在）する条件下でＤＮＡ複製を生じ、本サイトカインが作用（または存在）しない条件下と比較して細胞内のＤＮＡ量が増加することをも意味している。
<Action of this cytokine>
The cytokine activates dermal papilla cells.
In the present invention, the term “activation”, when used with respect to hair papilla cells, means to induce cell proliferation. Further, in the present invention, the term “cell proliferation”, unless otherwise specified, causes cell division of hair papilla cells under the condition (or presence) of the cytokine, and the cytokine acts (or exists). This means that the number of cells increases as compared to the case where no. Cell division is a phenomenon that is achieved after a signal transduction pathway leading to cell division is activated and undergoes DNA replication or the like that occurs during the activation of the pathway. Therefore, the term also means that DNA replication occurs under conditions where the cytokine acts (or exists), and that the amount of DNA in the cell increases compared to conditions where the cytokine does not act (or exists). is doing.
また、本発明において「細胞増殖を誘導する」とは、他に特に説明がない場合、細胞増殖を生じさせること及び既に生じている細胞増殖を促進（または延長）することを意味している。 Further, in the present invention, “inducing cell proliferation” means causing cell proliferation and promoting (or prolonging) cell proliferation that has already occurred unless otherwise specified.
＜発明の態様＞
以下、本発明の代表的な態様について説明する。
<Aspect of the Invention>
Hereinafter, typical embodiments of the present invention will be described.
［培 地]
一態様において、本発明は、本サイトカインを増殖因子として含有する培地（以下、このような培地を本培地と称する）として具現化されてもよい。この培地の組成は、増殖因子として本サイトカインを用いる以外は、毛乳頭細胞を培養する場合に用いられる通常の組成を使用すればよい。
[Culture medium]
In one aspect, the present invention may be embodied as a medium containing the cytokine as a growth factor (hereinafter, such a medium is referred to as the present medium). The composition of this medium may be the usual composition used for culturing hair papilla cells, except that the present cytokine is used as a growth factor.
培養時の本サイトカインの濃度は、予備実験を行って決定すればよいが、例えば、１０−７〜１０−３ｍＭの範囲、好ましくは１０−７〜１０−４ｍＭの範囲、より好ましくは１０−６〜１０−５ｍＭの範囲、最も好ましくは１０−５ｍＭを使用すればよい。或いは、例えば、１０−１１〜１０−４ｍＭの範囲、好ましくは１０−１１〜１０−７ｍＭの範囲、より好ましくは１０−１０〜１０−７ｍＭの範囲、更に好ましくは１０−９〜１０−８ｍＭの範囲、最も好ましくは１０−９ｍＭまたは１０−８ｍＭの濃度を使用すればよい。 The concentration of this cytokine at the time of culturing may be determined by conducting a preliminary experiment. For example, the concentration is 10 −7 to 10 −3 mM, preferably 10 −7 to 10 −4 mM, more preferably 10 A range of −6 to 10 −5 mM, most preferably 10 −5 mM may be used. Alternatively, for example, in the range of 10 −11 to 10 −4 mM, preferably in the range of 10 −11 to 10 −7 mM, more preferably in the range of 10 −10 to 10 −7 mM, still more preferably 10 −9 to 10 −10. A concentration in the range of −8 mM, most preferably 10 −9 mM or 10 −8 mM may be used.
本サイトカインは、上述のように夾雑物の混入が回避または低減し得るという特長を具備する。従って、本サイトカインを増殖因子として含有する培地も、血清や従来のサイトカインを増殖因子として含有する従来の培地と比較して、夾雑物の混入が回避または低減され得る。このような特長から、本培地は、例えば、次のような用途に好適である。 As described above, the present cytokine has a feature that contamination can be avoided or reduced. Therefore, the medium containing the present cytokine as a growth factor can avoid or reduce contamination by contamination compared to the conventional medium containing serum or conventional cytokine as a growth factor. Due to such features, the present medium is suitable for the following uses, for example.
（ａ）基礎研究用：本培地は、基礎研究において、研究対象となる毛乳頭細胞を継代培養する用途に好適である。この理由として、一般にサイトカインは低濃度で細胞に作用しえるので、培地に増殖因子として添加したサイトカインに加えて夾雑物として他のサイトカインが含まれている場合、この他のサイトカインが毛乳頭細胞に作用して実験結果に影響する可能性があることなどが挙げられる。本培地は、夾雑物の混入が回避または低減されているため、夾雑物が実験結果に影響する可能性が少ない。 (A) For basic research: This medium is suitable for use in subculturing hair papilla cells to be studied in basic research. The reason for this is that cytokines can generally act on cells at low concentrations, so if other cytokines are included as contaminants in addition to the cytokine added as a growth factor in the medium, these other cytokines are present in the dermal papilla cells. This may affect the experimental results. In this medium, since contamination is avoided or reduced, the contamination is less likely to affect the experimental results.
（ｂ）再生医療用：再生医療において、細胞をインビトロで増殖させるための培地は不可欠である。再生医療において、被験者から採取された細胞は、インビトロで増殖され、被検者の体に戻され、被験者の組織、器官などを再生する。このように、再生医療においては、培養された細胞が身体に戻されることから、その戻される細胞が培養中に病原体に汚染することがないように管理する必要がある。培養中に細胞が病原体で汚染された場合、その細胞のみならず、その細胞を移植された被検者がその病原体に感染する危険性が高くなる。本培地は、夾雑物の混入が回避または低減されているため、夾雑物として混入し得る病原体（例えば、プリオン、ウイルス、細菌、真菌、原虫など）に、細胞が感染する可能性を回避または低減し得る。 (B) For regenerative medicine: In regenerative medicine, a medium for growing cells in vitro is indispensable. In regenerative medicine, cells collected from a subject are proliferated in vitro and returned to the subject's body to regenerate the tissues and organs of the subject. Thus, in regenerative medicine, since cultured cells are returned to the body, it is necessary to manage the returned cells so that they are not contaminated by pathogens during culture. When a cell is contaminated with a pathogen during the culture, not only the cell but also a subject transplanted with the cell has a high risk of being infected with the pathogen. This medium avoids or reduces contamination, and thus avoids or reduces the possibility of cells being infected by pathogens (eg prions, viruses, bacteria, fungi, protozoa, etc.) that can be contaminated as contaminants. Can do.
［細胞増殖剤および養毛剤］
また、別の態様において、本発明は、本サイトカインを主成分（活性成分）として含有する細胞増殖剤として具現化されてもよい。この細胞増殖剤を投与することにより、投与部位に存在する毛乳頭細胞が活性化して増殖する。更に、別の態様において、本発明は、本サイトカインを主成分（活性成分）として含有する養毛剤として具現化されてもよい。この養毛剤により、上記に記載したように、投与部位に存在する毛乳頭細胞が活性化して増殖し、結果的に毛髪の状態を良好に保つことが可能である。
[Cell proliferation agent and hair nourishing agent]
Moreover, in another aspect, this invention may be embodied as a cell proliferation agent containing this cytokine as a main component (active ingredient). By administering this cell proliferating agent, dermal papilla cells present at the administration site are activated and proliferated. Furthermore, in another aspect, the present invention may be embodied as a hair nourishing agent containing the present cytokine as a main component (active ingredient). As described above, this hair nourishing agent activates and proliferates the hair papilla cells present at the administration site, and as a result, it is possible to maintain a good hair state.
当業者であれば、本サイトカインを含有するこれらの薬剤を、皮膚（例えば、頭皮、頭髪）などの投与部位に応じて、各種の担体、賦形剤などを加えて適切な製剤（例えば、軟膏剤、噴霧剤）に製剤化できる。なお、「養毛剤」の用語は、適切な場合には発毛剤、育毛剤などの他の用語に置き換えてもよいだろう。 Those skilled in the art will add these drugs containing the present cytokine to various preparations (for example, ointments) by adding various carriers, excipients, etc., depending on the administration site such as the skin (for example, scalp, hair) Preparations and sprays). It should be noted that the term “hair restoring agent” may be replaced with other terms such as a hair growth agent and a hair restoring agent, as appropriate.
本発明を以下の実施例によって更に具体的に説明するが、本発明はこれら実施例により限定されるものではない。 The present invention will be described more specifically with reference to the following examples, but the present invention is not limited to these examples.
＜実施例１＞
ＧＢＰの増殖活性
ヒト頭髪毛乳頭細胞（Ｔｏｙｏｂｏ社製）を、毛乳頭細胞増殖培地（毛乳頭細胞増殖培地（ＰＣＧＭ） Ｃｏｄｅ Ｎｏ．ＴＰＧＭ−２５０、Ｔｏｙｏｂｏ社製）に増殖用添加物（１％牛脳下垂体抽出液、１％牛胎児血清、０．５％インシュリン・トランスフェリン・トリヨードサイロニン混液、０．５％サイプロテインアセテートを添加した培養液を用いて培養した。９６ウェルプレートを使い１００μＬ／ウェルの培養液で、ヒト頭髪毛乳頭細胞を１５００細胞／ウェルの細胞濃度で蒔き、３７℃、５％ＣＯ２、加湿状態で１日培養する。培養液を吸い取り、１００μＬ／ウェルの毛乳頭細胞増殖培地に０．５％牛胎児血清を添加した培養液（以下、この組成の培養液を血清含有培地と称する）を用いて１回洗浄して、さらに１００μＬ／ウェルの血清含有培地を加え３７℃、５％ＣＯ２、加湿状態で１日培養する。
<Example 1>
Growth activity of GBP
Human hair hair papilla cells (manufactured by Toyobo) are added to hair papilla cell growth medium (hair papilla cell growth medium (PCGM) Code No. TPGM-250, manufactured by Toyobo) with a proliferation additive (1% bovine pituitary extraction). 1% fetal bovine serum, 0.5% insulin / transferrin / triiodothyronine mixed solution, and 0.5% cyprotein acetate added to the culture solution, and cultured at 100 μL / well using a 96-well plate. Human hair hair papilla cells are seeded with a liquid at a cell concentration of 1500 cells / well, and cultured for one day at 37 ° C., 5% CO 2 , in a humidified state, and the culture solution is blotted and added to 100 μL / well hair papilla cell growth medium. Wash once with a culture solution supplemented with 0.5% fetal bovine serum (hereinafter, the culture solution of this composition is referred to as a serum-containing medium), and further 100 μL / well. Add the serum-containing medium of the gel and culture at 37 ° C., 5% CO 2 , in a humidified state for 1 day.
血清含有培地にＧＢＰ（図１）を１０−９〜１００mＭの濃度で添加した培養液を作製し、前記プレート中の培養液をこのＧＢＰを添加した培養液に交換し、３７℃、５％ＣＯ２、加湿状態で３日間培養する。 A culture solution in which GBP (FIG. 1) was added to the serum-containing medium at a concentration of 10 −9 to 100 mM was prepared, and the culture solution in the plate was replaced with the culture solution to which this GBP was added. 2. Incubate for 3 days in a humidified state.
３日後の１ウェル当たりの細胞数を、細胞内のアデノシン３燐酸（ＡＴＰ）量を測定することによって比較した。この測定は、Ｖｉａｌｉｇｈｔ ＨＳ（ＬｕｍｉＴｅｃｈ社製）を用いて、この製品に添付された説明書に従い以下のようにおこなった。３日間培養した各ウェルにヌクレオチド放出試薬１００μＬを加え５分間室温で静置し、ＡＴＰを抽出した。蛍光測定用の白色プレート中の各ウェルに、上記で抽出した各々のＡＴＰ抽出液１８０μＬを移しかえ、その各々の抽出液に２０μＬのＡＴＰモニタリング試薬を加え、蛍光／発光／吸光マルチプレートリーダー：Ｇｅｎｉｏｓ（テカン社製）を用いて、その蛍光強度を測定した。この結果を図２のグラフに示す。 The number of cells per well after 3 days was compared by measuring the amount of intracellular adenosine triphosphate (ATP). This measurement was performed as follows using Vialight HS (manufactured by LumiTech) according to the instructions attached to this product. To each well cultured for 3 days, 100 μL of a nucleotide releasing reagent was added and left at room temperature for 5 minutes to extract ATP. Transfer 180 μL of each ATP extract extracted above to each well in a white plate for fluorescence measurement, add 20 μL of ATP monitoring reagent to each extract, and add fluorescence / luminescence / absorption multiplate reader: Genios The fluorescence intensity was measured using Tecan Corporation. The result is shown in the graph of FIG.
図２において、コントロールは、ＧＢＰを添加していない培養液で培養した陰性コントロールの増殖活性を示す。この陰性コントロールの蛍光強度を１００％として、他のサンプルの蛍光強度を％に変換してグラフ中に示した。この実施例の結果、１０−８〜１０−４ ｍＭのＧＢＰによって、陰性コントロール（ＧＢＰ無添加）と比較して約１１０〜１４０％の細胞増殖が観察された（図２）。 In FIG. 2, the control shows the growth activity of the negative control cultured in a culture solution not added with GBP. The fluorescence intensity of this negative control was taken as 100%, and the fluorescence intensity of other samples was converted to% and shown in the graph. As a result of this example, about 110 to 140% cell growth was observed with 10 −8 to 10 −4 mM GBP as compared to negative control (no GBP added) (FIG. 2).
＜実施例２＞
無血清培地におけるＧＢＰの増殖活性
ヒト頭髪毛乳頭細胞（Ｔｏｙｏｂｏ社製）を、毛乳頭細胞増殖培地（Ｔｏｙｏｂｏ社製）＋増殖用添加物（１％牛脳下垂体抽出液、１％牛胎児血清、０．５％インシュリン・トランスフェリン・トリヨードサイロニン混液、０．５％サイプロテロンアセテート溶液）を添加した培養液を用いて培養した。９６ウェルプレートを使い１００μＬ／ウェルの培養液で、ヒト頭髪毛乳頭細胞を１５００細胞／ウェルで蒔き３７℃、５％ ＣＯ２、加湿状態で１日培養する。培養液を吸い取り、１００μＬ／ウェルの毛乳頭細胞増殖培地に０．５％牛胎児血清を添加した培養液で１回洗浄して、１００μＬ／ウェルの毛乳頭細胞増殖培地（血清なし）を加え３７℃、５％ ＣＯ２、加湿状態で１日培養する。
<Example 2>
Growth activity of GBP in serum-free medium
Human hair hair papilla cells (Toyobo), hair papilla cell growth medium (Toyobo) + proliferation additive (1% bovine pituitary extract, 1% fetal bovine serum, 0.5% insulin transferrin) -Triiodothyronine mixed solution, 0.5% cyproterone acetate solution) was used for culture. Human hair papilla cells are seeded at 1500 cells / well in a culture solution of 100 μL / well using a 96-well plate and cultured at 37 ° C., 5% CO 2 , in a humidified state for 1 day. The culture solution is sucked out, washed once with a culture solution obtained by adding 0.5% fetal bovine serum to 100 μL / well hair papilla cell growth medium, and then added with 100 μL / well hair papilla cell growth medium (no serum). ℃, 5% CO 2, and cultured 1 day in a humidified state.
毛乳頭細胞増殖培地（血清なし）にＧＢＰを１０−９〜１０ｍＭ添加した培養液を作製し、前記プレート中の培養液をこのＧＢＰを添加した培養液に交換し、３７℃、５％ ＣＯ２、加湿状態で３日培養する。 A culture solution in which 10 −9 to 10 mM of GBP was added to the hair papilla cell growth medium (without serum) was prepared, and the culture solution in the plate was replaced with the culture solution to which this GBP was added, at 37 ° C., 5% CO 2. Incubate for 3 days in a humidified state.
３日後の１ウェル当たりの細胞数を細胞内ＡＴＰ量の量を測定することによって比較した。その測定はＶｉａｌｉｇｈｔ ＨＳ（ＬｕｍｉＴｅｃｈ社製）を用いて、この製品に添付された説明書に従い以下のようにおこなった。３日培養した各ウェルにヌクレオチド放出試薬１００μＬを加え５分間室温で静置し、ＡＴＰを抽出した。蛍光測定用の白色プレート中の各ウェルに、上記で抽出した各々のＡＴＰ抽出液１８０μＬを移しかえ、その各々の抽出液に２０μＬのＡＴＰモニタリング試薬を加え、蛍光／発光／吸光マルチプレートリーダー：Ｇｅｎｉｏｓ（テカン社製）を用いてその蛍光を測定した。本実施例の結果を図３に示す。 The number of cells per well after 3 days was compared by measuring the amount of intracellular ATP. The measurement was performed as follows using Vialight HS (manufactured by LumiTech) according to the instructions attached to this product. To each well cultured for 3 days, 100 μL of nucleotide releasing reagent was added and left at room temperature for 5 minutes to extract ATP. Transfer 180 μL of each ATP extract extracted above to each well in a white plate for fluorescence measurement, add 20 μL of ATP monitoring reagent to each extract, and add fluorescence / luminescence / absorption multiplate reader: Genios The fluorescence was measured using Tecan Corporation. The results of this example are shown in FIG.
図３において、血清を添加しない毛乳頭細胞増殖培地で培養した陰性コントロールの蛍光強度を１００％として、他のサンプルの蛍光強度を％に変換してグラフ中に示した。ＧＢＰ濃度が１０−４〜１０−７ ｍＭの間で１００％以上の活性を示した（図３）。 In FIG. 3, the fluorescence intensity of the negative control cultured in the hair papilla cell growth medium without addition of serum was taken as 100%, and the fluorescence intensity of other samples was converted to% and shown in the graph. An activity of 100% or more was exhibited when the GBP concentration was between 10 −4 and 10 −7 mM (FIG. 3).
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