JP3979574B2 - 生体試料用アレイ電極及びその作製方法 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、生体試料を対象にしたアレイ電極（多点電極）及びその作製方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
生体試料を対象にした計測の中で、電極を用いた電気計測、電気化学計測は、時間分解能にすぐれた高感度な計測方法として、従来から広く用いられてきた。例えば、針状に細く引いたガラスキャピラリーに、電極を挿入して計測を行なうパッチクランプ法は、単一の細胞や生体組織中の細胞の電気的活動をモニターする手法として広く用いられている。
【０００３】
又、針状のキャピラリーから細胞近傍の溶液を抽出し、電気化学的に分析するオンラインセンサは、空間分解能に優れた高感度な分析方法として、今後ますます期待されるところである（参考文献：Niwa O, Torimitsu K, Morita M, Osborne P, Yamamoto K. Concentration of extracellular L-glutamate released from cultured nerve cells measured with a small-volume online sensor. Anal. Chem., 1996; 68:1865-1870）。
【０００４】
一方、細胞外活動電位は、試料にダメージを与えることがなく（非浸襲）、細胞の外に置いた電極を使って細胞の活動を計測できる手法である。我々は、以前から、平板状に配置した複数の電極を用いて、複数の神経細胞の電気的活動を多点で同時に計測することに成功している（参考文献：Jimbo Y, Tateno T, Robinson HPC. Simultaneous induction of pathway−specific potentiation and depression in networks in cortical neurons. Biophys. J., 1999; 76:670-678）。この手法は、フォトリソグラフィーによって作製したアレイ型電極によって、培養した神経細胞の細胞外活動電位を同時に多点で計測できるため、結合した細胞、組織の活動を、高時間分解能を持って計測するのに非常に有効である。
【０００５】
又、アレイ型平板電極は、その上に酵素を被覆するなどによって選択性を付与することができ、特定の化学物質を電気化学的に計測することも可能であるため、化学物質の２次元の分布計測に非常に適している（参考文献：Kasai N, Jimbo Y, Niwa O, Matsue T, and Torimitsu K, Real-time multisite observation of glutamate release in rat hippocampal slices, Neuroscience Letters, 2001, 304, 112−116）。
【０００６】
更に、これらの電極は針型、平板型を問わず、生体試料を対象にした計測のみでなく、試料へ局所的な刺激を印加するのにも有効である。この場合、電極により直接電気的な刺激を印加することも可能であるし、キャピラリーに挿入した電極を用いてキャピラリー内に電場を形成させ、あらかじめキャピラリー内に入れておいた刺激溶液を生体試料内あるいは近傍にインジェクト（注入）することで、薬物投与による局所刺激を印加することも可能である。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
脳（多数の神経細胞の集合体）は三次元構造を有しており、三次元構造の状態のままでは多数の細胞を対象とする計測を行なうのは困難である。そのため、従来は、脳神経細胞等の計測を行なう場合、脳を解剖し、神経細胞をばらばらにして、培養により細胞をシャーレ内に保持し、平面型の電極を用いて計測を行なっていた。具体的には、シャーレの底に多数の電極（例えば、８×８のアレイ状の平面電極）を有するものを用いて計測を行なっており、ばらばらにされた細胞等を計測する場合には有用であった。
【０００８】
しかしながら、近年、脳を含めた生体機能の解明に関して世界的な関心が寄せられるに伴い、脳あるいは脳の一部のように立体的な構造をもつ生体試料を、一つ一つの細胞へ分解せずに、その形状を保ったまま計測する必要性が高まっている。
【０００９】
例えば、脳を薄切りにした切片（通常は厚さ２００〜５００μｍ）を用い、ある程度の三次元構造を残した試料を作製することで、三次元構造の生体試料の計測が試みられている。ところが、上述した平面電極では、切片の表面の細胞しか測定することができないため、十分な計測信号が得ることができない。この主たる原因は、切片試料を作製する際に、切片表面の細胞は大きなダメージを受けてしまうためと考えられ、表面の細胞よりもダメージを受けていない内側の細胞を対象とする計測手段が求められている。
【００１０】
更に、立体的な広がりをもつ生体において、その機能を解明するためには、立体的な生体情報を得ることが不可欠であり、そのために三次元における計測が重要である。これらは、今後より微細な計測を可能とするナノテクノロジーの分野の高度化とともに、ますます必要度が高まってくるものと考えられる。
【００１１】
又、生体機能の解明のみならず様々な疾病の治療あるいは感覚器官の代替として、任意の生体微小区域へ電気的刺激を印加する試みも行われており、より高精度に三次元における位置を把握しつつ刺激を印加する方法が求められている。
【００１２】
しかしながら、これまでの電極の形状では、組織の内部の情報を得ることのできる三次元計測や刺激印加は非常に困難であり、可能であっても煩雑な系（システム）を確立させる必要があった。
【００１３】
そのため、複数の任意の電極として、立体的に配置したアレイ電極を用いて、三次元の計測・刺激印加が必要不可欠の段階にきている。
【００１４】
本発明は、上記課題に鑑み、三次元の計測・刺激印加を可能とする生体試料用アレイ電極及びその作製方法を提供する。
【００１６】
【課題を解決するための手段】
上記課題を解決する本発明に係る生体試料用アレイ電極は、複数の電極と、当該電極の先端を三次元に配置するための電極固定用治具とを具備し、
前記電極は、導電線と前記導電線を被覆する絶縁材とからなり、
前記電極固定用治具は、前記電極の先端を三次元に配置するための複数の電極位置合わせ／固定用ホールを設けた電極位置合わせ用治具と、前記電極の他端を固定する本体部とを備えたことを特徴とする。
【００１７】
上記課題を解決する本発明に係る生体試料用アレイ電極は、前記導電線を金属線とし、前記絶縁材をガラス管としたことを特徴とする。
【００１８】
上記課題を解決する本発明に係る生体試料用アレイ電極は、前記電極を、導電線と前記導電線を内包するキャピラリーとからなるものとしたことを特徴とする。
【００１９】
上記課題を解決する本発明に係る生体試料用アレイ電極は、前記導電線を銀／塩化銀線とし、前記キャピラリーをガラス管としたことを特徴とする。
【００２９】
上記課題を解決する本発明に係る生体試料用アレイ電極の作製方法は、複数の電極を三次元に配置した生体試料用アレイ電極の作製方法であって、
前記電極を、導電線と前記導電線を被覆する絶縁材とからなるものとし、
前記電極の先端を固定するための複数の電極位置合わせ／固定用ホールを設けた電極位置合わせ用治具を備えた電極固定用治具を用いて、前記電極の先端を三次元に配置することを特徴とする。
【００３０】
上記課題を解決する本発明に係る生体試料用アレイ電極の作製方法は、前記導電線を金属線とし、前記絶縁材をガラス管とすることを特徴とする。
【００３１】
上記課題を解決する本発明に係る生体試料用アレイ電極の作製方法は、前記電極を、導電線と前記導電線を内包するキャピラリーとからなるものとすることを特徴とする。
【００３２】
上記課題を解決する本発明に係る生体試料用アレイ電極の作製方法は、前記導電線を銀／塩化銀線とし、前記キャピラリーをガラス管とすることを特徴とする。
【００４１】
【発明の実施の形態】
本発明では、複数の電極又はキャピラリーを三次元に（立体的に）配置することにより、生体試料など三次元の構造をもった試料の、三次元領域における計測及び三次元領域への刺激印加が可能となる。又、電極等の立体的な形状を変えることによって、任意の位置に電極を配置することも可能である。
【００４２】
つまり、本発明は、電極等を三次元に配置した立体型のアレイ電極を作製し、それを生体試料へ応用して計測・刺激印加などを行うことができるようにすることに特徴がある。
【００４３】
上述したような立体型のアレイ電極の最も単純な作製方法としては、以下のようなものが考えられる。
(I)針状の電極を三次元に配置する。
(II)キャピラリーを三次元に配置する。
【００４４】
又、他の作製方法として、以下のようなものも考えられる。
(III)金属や金属酸化物、カーボン、有機物を含む導電性材料・半導体材料を三次元の電極に加工し、不要部分をレジストなどの絶縁材料で被覆する。
この方法では、導電性材料・半導体材料を溶出等によって積層する方法だけでなく、現在可能な微細加工技術を用いて、微小で多様な形状の複数の凸部を電極として作製することが考えられる。具体的な微細加工技術としては、フォトリソグラフィーを用いたエッチング法、リフトオフ法、メッキ法等がある。
【００４５】
更に、他の作製方法として、以下のようなものも考えられる。
(IV)絶縁性の材料を用いてあらかじめ凸部を成形し、その凸部に金属や金属酸化物、有機物を含む導電性材料・半導体材料を被覆して電極とする。
【００４６】
前記凸部は、例えば、それぞれの凸部に電位を印加することによって、先端のみを鋭利に加工することができる（電解エッチング等）。凸部の先端を鋭利にすることで、生体試料の内部に電極先端を到達させることが可能となり、全体のサイズを小さくすれば、生体内に埋め込むことも可能である。又、作製したアレイ電極を絶縁膜で被覆し、必要な電極に電場を形成することによって、その電極の先端部のみ絶縁膜を除去し、任意の位置に電極を配置することも可能である。
【００４７】
上記方法で作製した立体型のアレイ電極は、個々の電極を独立して導通を取ることによって、異なる位置における電気計測、電気化学計測が可能となり、更に、各電極を通して電気的な刺激を局所的に印加することで電気刺激印加が可能となる。
【００４８】
以下、実施例及び図面を用いて本発明を更に具体的に説明する。なお、本発明は以下の実施例のみに限定されるものではない。
【００４９】
（実施例１）
図１は、本発明に係る実施形態の一例を示す生体試料用アレイ電極の概略図である。詳細な構造がわかるように、その一部を拡大して示した。
【００５０】
本実施例の生体試料用アレイ電極は、生体試料の電気計測で用いられる針状の電極を複数用いて、三次元に（立体的に）配置したものである。これは、前述した(I)の生体試料用アレイ電極の作製方法によるものである。
【００５１】
図１に示すように、生体試料用アレイ電極１は、複数の針状の電極２を有しており、電極２は、電極固定用治具３により、その先端が三次元の配置になるように固定されている。電極２の他の端部には計測機器等に接続するためのリード端子４が接続されており、電極固定用治具３の本体部分に固定されている。
【００５２】
電極固定用治具３は、電極２の先端を三次元に配置するための電極位置合わせ治具５を備えており、電極位置合わせ治具５に設けた電極位置合わせ／固定用ホール５ａ（ホール直径０．１７ミリメートル、ホール中心同士の間隔は０．３ミリメートル）を用いて電極２を固定し、基板６上の生体試料７の任意の位置の電気計測を行なうことができる（図１の拡大図Ａ参照。拡大図Ａは、電極位置合わせ治具５の上面図及び側面図を示す。）。又、電極２は、導電線となる細いタングステン線８と絶縁材となるガラス管９を有しており、ガラス管９がタングステン線８を、その先端部分を除き、被覆するような針状の電極となっている（図１の拡大図Ｂ参照）。
【００５３】
上記電極位置合わせ治具５を用いれば、０．３ミリメートル離れた複数の位置における電気的な信号を、同時に計測することが可能である。又、電極位置合わせ／固定用ホール５ａの中心間距離を更に小さくすれば、より高空間分解能の計測も可能である。更に、異なる長さの針状の電極２を用いることで、任意の高さ方向の位置に電極２を配置することも可能となり、立体的な生体試料の電気計測等も可能となる。
【００５４】
なお、本実施例では電極の導電線の材料としてタングステンを用いたが、その他の金属や金属酸化物、半導体材料、カーボンなどを使用することも可能である。更に、絶縁材としてガラス管を用いて電極を絶縁封止しているが、それ以外のレジスト等の有機材料や窒化珪素などの半導体用絶縁材料も使用することが可能である。
【００５５】
（実施例２）
図２は、本発明に係る実施形態の他の一例を示す生体試料用アレイ電極の概略図である。詳細な構造がわかるように、その一部を拡大して示した。
【００５６】
本実施例の生体試料用アレイ電極は、生体試料内あるいはその近傍の微小領域における電気計測を行うためのキャピラリーを複数用いて、三次元に（立体的に）配置したものである。これは、前述した(II)の生体試料用アレイ電極の作製方法によるものである。
【００５７】
図２に示すように、生体試料用アレイ電極１１は、複数のキャピラリー／電極１２を有しており、キャピラリー／電極１２は、キャピラリー／電極固定用治具１３により、その先端が三次元に配置なるように固定されている。キャピラリー／電極１２の他の端部には計測機器等に接続するためのリード端子１４が接続されており、キャピラリー／電極固定用治具１３の本体部分に固定されている。
【００５８】
キャピラリー／電極固定用治具１３としては、図１に示したものと同様のものを用いており、キャピラリー／電極１２の先端を三次元に配置するためのキャピラリー位置合わせ治具１５を備えており、キャピラリー位置合わせ治具１５に設けたキャピラリー位置合わせ／固定用ホール１５ａ（ホール直径０．１７ミリメートル、ホール中心同士の間隔は０．３ミリメートル）を用いてキャピラリー／電極１２を固定し、基板１６上の生体試料１７の任意の位置の電気計測を行なっている（図２の拡大図Ｃ参照。拡大図Ｃは、キャピラリー位置合わせ治具１５の上面図及び側面図を示す。）。又、キャピラリー／電極１２は、導電線となる細い銀／塩化銀線１８と絶縁材となるガラス管１９を有しており、ガラス管１９が、その先端部に開口部を有し、銀／塩化銀線１８を、その内部に完全に内包したものとなっている（図２の拡大図Ｄ参照）。銀／塩化銀線１８は、銀及び塩化銀の適切な組成比で構成されている。又、キャピラリー／電極１２のガラス管１２は、スポイト状の形状を有しているため、その中に任意の溶液２０を保持することができる。
【００５９】
上記キャピラリー位置合わせ治具１５は、図１に示す生体試料用アレイ電極１の電極位置合わせ治具５と同様のものであり、これを用いれば、０．３ミリメートル離れた複数の位置における電気的な信号を、同時に計測することが可能である。又、キャピラリー位置合わせ／固定用ホール１５ａの中心間距離を更に小さくすれば、より高空間分解能の計測も可能である。更に、異なる長さのキャピラリー／電極１２を用いることで、任意の高さ方向の位置にキャピラリー／電極１２を配置することも可能となり、立体的な生体試料の電気計測等も可能となる。
【００６０】
又、銀／塩化銀線１８に電位パルスを印加することで、特定のキャピラリー／電極１２の内部の溶液２０をインジェクト（注入）することが可能であり、これにより局所的な薬物刺激の印加が可能となる。更に、任意の位置に固定したキャピラリー／電極１２によって、生体試料内あるいは近傍の任意の複数の三次元微小領域から、試料溶液をサンプリングすることにより電気化学計測が可能となる。
【００６１】
なお、ここでは電気計測用の電極の導電線の材料として銀／塩化銀を用いたが、そのほかの金属や金属酸化物、半導体材料、カーボンなどを使用することも可能である。
【００６２】
（参考例３）
図３は、参考例となる生体試料用アレイ電極及びその作製方法を説明する概略図である。
【００６３】
本参考例の生体試料用アレイ電極は、絶縁性の基板上の導電線を立体的に加工して、三次元に配置して作製したものである。これは、前述した(III)の生体試料用アレイ電極の作製方法によるものである。以下、この方法を説明する（図３参照。なお、下記（１）〜（６）は図３中の工程（１）〜（６）に対応する。）。
【００６４】
（１）絶縁性の基板となる透明なアクリル基板２２を用意する。
（２）アクリル基板２２上にパッド部２３をフォトリソグラフィーにより作製する。
（３）導電線となる複数のタングステン細線２４を配列し、接着剤２５で互いを固着する。複数のタングステン細線２４は、１本ずつ絶縁被覆されている。
（４）タングステン細線２４の先端部分の被覆を剥がし、垂直に折曲げて、三次元の電極部２６を成形し、タングステン細線２４の他端側を任意の形状に折曲げて、パッド部２３の位置と重なるようにリード部２７を成形する。この時、三次元の電極となるタングステン細線２４の先端部分の長さや折曲げる角度等を変えることによって、電極部２６を三次元の自由な位置に配置することが可能となる。
（５）アクリル基板２２上のパッド部２３にリード線２７の端部の位置が合うようにタングステン細線２４を固定し、導電性ペースト２８を用いてリード部２７をパッド部２３に固定する。
（６）最終処理として、電極部２６とパッド部２３以外を絶縁被覆材２９により被覆する。
【００６５】
上記作製手順により生体試料用アレイ電極２１は、所望の三次元の位置に配置された複数の電極を有するものとなる。
【００６６】
本参考例では電極の導電線の材料として細いタングステン線を用いたが、そのほかの金属や金属酸化物、半導体材料、カーボンなどを使用することも可能である。又、絶縁被覆されたタングステン細線を用いて三次元電極を成形しており、更に、上記作製手順（６）において最終的な絶縁被覆を行っているが、絶縁被覆されていないタングステン細線を用いることも可能である。
【００６７】
上記生体試料用アレイ電極２１を用いた計測方法としては、シャーレ中心に電極部２６を上にして上記生体試料用アレイ２１を配置し、パッド部２３を計測器等と接続し、この電極部２６上に脳等の切片試料を乗せて計測する。電極部２６が三次元的な分布を有するため、切片試料の深さ方向の計測が可能となり、従来の方法に比べて、ダメージを受けていない神経細胞を確実に測定でき、神経細胞活動の大きな信号を得ることができる。これは、他の参考例においても同様である。
【００６８】
（参考例４）
図４は、他の参考例となる生体試料用アレイ電極及びその作製方法を説明する概略図である。
【００６９】
本参考例の生体試料用アレイ電極は、絶縁性の基板上に非導電性材料の成形により三次元体を作製し、その三次元体に導電性材料を被覆して、立体的に配置する電極としたものである。これは、前述した(IV)の生体試料用アレイ電極の作製方法によるものである。以下、この方法を説明する（図４参照。なお、下記（１）〜（７）は図４中の工程（１）〜（７）に対応する。）。
【００７０】
（１）絶縁性の基板となる透明なアクリル基板３２を用意する。
（３）アクリル基板３２上の全面に成形加工可能な非導電性樹脂３３（例えば、ポリジメチルシロキサン等）を厚くコーティングし、その上からアルミニウム製の三次元加工用のメタルマスク３４を圧迫させて、任意の形状の三次元体３５を成形する。
（４）アルミニウム製のメタルマスク３６を用いて、アクリル基板３２をマスキングする。
（６）マスキングにより、アクリル基板３２上の電極部３７、リード部３８、パッド部３９の必要な部分にのみ白金をスパッタにより堆積する。この時、電極部３７は、三次元体３５上に導電性材料となる白金が被覆されて形成される。
（７）最終処理として、電極部３７とパッド部３９以外のリード部３８等の不要な部分はレジスト４０によりコーティングして絶縁被覆し、測定や刺激印加に支障がないようにする。
【００７１】
又、他の作製手順として、以下の手順も可能である。
（１）絶縁性の基板となる透明なアクリル基板３２を用意する。
（２）アクリル基板３２上にあらかじめリード部３８及びパッド部３９をフォトリソグラフィーにより作製する。
（３）アクリル基板３２上の全面に成形加工可能な非導電性樹脂３３（例えば、ポリジメチルシロキサン等）を厚くコーティングし、その上からアルミニウム製の三次元加工用のメタルマスク３４を圧迫させて、任意の形状の三次元体３５を成形する。
（５）アルミニウム製のメタルマスク３６ｂを用いて、アクリル基板３２をマスキングする。
（６）マスキングにより、アクリル基板３２上の電極部３７にのみ白金をスパッタにより堆積する。この時、電極部３７は、三次元体３５上に導電性材料となる白金が被覆されて形成される。
（７）最終処理として、電極部３７とパッド部３９以外のリード部３８等の不要な部分はレジスト４０によりコーティングして絶縁被覆し、測定や刺激印加に支障がないようにする。
【００７２】
上記作製手順により生体試料用アレイ電極３１は、所望の三次元の位置に配置された複数の電極を有するものとなる。本参考例では、メタルマスク３４の形状を変えることによって任意の形状の三次元の電極が形成可能であり、又、三次元体を構成するものとして樹脂を用いることで加工が簡便となる。
【００７３】
（参考例５）
図５は、他の参考例となる生体試料用アレイ電極及びその作製方法を説明する概略図である。
【００７４】
本参考例の生体試料用アレイ電極は、絶縁性の基板上に非導電性材料の成形により三次元体を作製し、その三次元体に導電性材料を被覆して、立体的に配置する電極としたものである。これは、前述した(IV)の生体試料用アレイ電極の作製方法によるものである。以下、この方法を説明する（図５参照。なお、下記（１）〜（７）は図５中の工程（１）〜（７）に対応する。）。
【００７５】
（１）絶縁性の基板となる透明なアクリル基板４２を用意する。
（３）アクリル基板４２上の全面に非導電性を有する光反応性樹脂４３（例えば、フォトレジスト等）を厚くコーティングし、フォトリソグラフィーにより電極となる部分をパターニングする（図５（３）で示す白抜き部分）。
（４）エッチングによって不要部分（パターニングされていない部分）の光反応性樹脂４３を除去し、電極部を構成する三次元体４４を成形する。
（６）図４に示すメタルマスク３６ａと同様のメタルマスクを用いてマスキングを行い、白金をスパッタすることによりパターニングを行い、アクリル基板４２上に電極部４５、リード部４６、パッド部４７となる必要な部分にのみ導電性を与える。この時、電極部４５は、三次元体４４上に導電性材料となる白金が被覆されて形成される。
（７）最終処理として、電極部４５とパッド部４７以外のリード部４６等の不要な部分はレジスト４８によりコーティングして絶縁被覆し、測定や刺激印加に支障がないようにする。
【００７６】
又、他の作製手順として、以下の手順も可能である。
（１）絶縁性の基板となる透明なアクリル基板４２を用意する。
（２）アクリル基板４２上にあらかじめリード４６部及びパッド部４７をフォトリソグラフィーにより作製する。
（３）アクリル基板４２上の全面に非導電性を有する光反応性樹脂４３（例えば、フォトレジスト等）を厚くコーティングし、フォトリソグラフィーにより電極となる部分をパターニングする。
（５）エッチングによって不要部分の光反応性樹脂４３を除去し、電極部を構成する三次元体４４を成形する。
（６）図４に示すメタルマスク３６ｂと同様のメタルマスクを用いてマスキングを行い、白金をスパッタすることによりパターニングを行い、アクリル基板４２上に電極部４５となる必要な部分に導電性を与える。この時、電極部４５は、三次元体４４上に導電性材料となる白金が被覆されて形成される。
（７）最終処理として、電極部４５とパッド部４７以外のリード部４６等の不要な部分はレジスト４８によりコーティングして絶縁被覆し、測定や刺激印加に支障がないようにする。
【００７７】
上記作製手順により生体試料用アレイ電極４１は、所望の三次元の位置に配置された複数の電極を有するものとなる。
【００７８】
この作製方法では、三次元電極の形状を任意に形成することが困難であるが、一般的に使用されているフォトレジスト等を使用することが可能であるため、簡便に凸型の電極を加工することができるという点で優れている。
【００７９】
（参考例６）
図６は、他の参考例となる生体試料用アレイ電極及びその作製方法を説明する概略図である。
【００８０】
本参考例の生体試料用アレイ電極は、絶縁性の基板上の導電性材料の成形により、立体的に配置する電極としたものである。これは、前述した(III)の生体試料用アレイ電極の作製方法によるものである。以下、この方法を説明する（図６参照。なお、下記（１）〜（８）は図６中の工程（１）〜（８）に対応する。）。
【００８１】
（１）絶縁性の基板となる透明なアクリル基板５２を用意する。
（３）アクリル基板５２上の全面に導電性材料となる白金５３をスパッタにより厚くコーティングし、フォトリソグラフィーにより電極となる部分をパターニングする（図６（３）の白抜きの部分）。
（４）エッチングによって不要部分（パターニングされていない部分）の白金５３を除去し、導電性を持つ三次元体となる電極部５４を成形する。
（６）図４に示すメタルマスク３６ａと同様のメタルマスクを用いてマスキングを行い、白金をスパッタすることによりパターニングを行い、基板上にリード部５５、パッド部５６となる必要な部分に導電性を与える。
（７）電極部５４とパッド部５６以外のリード部５５等の不要な部分はレジスト５７によりコーティングして絶縁被覆し、測定や刺激印加に支障がないようにする。
（８）最終処理として、エッチング、電解エッチング、メッキ等を用いて電極部５４を任意の形状、例えば針状に成形する。但し、この工程は必ずしも必要ではない。
【００８２】
又、他の作製手順として、以下の手順も可能である。
（１）絶縁性の基板となる透明なアクリル基板５２を用意する。
（２）アクリル基板５２上にあらかじめリード５５部及びパッド部５６をフォトリソグラフィーにより作製する。
（３）アクリル基板５２上の全面に導電性材料となる白金５３をスパッタにより厚くコーティングし、フォトリソグラフィーにより電極となる部分をパターニングする。
（５）エッチングによって不要部分の白金５３を除去し、導電性を持つ三次元体となる電極部５４を成形する。
（７）電極部５４とパッド部５６以外のリード部５５等の不要な部分はレジスト５７によりコーティングして絶縁被覆し、測定や刺激印加に支障がないようにする。
（８）最終処理として、エッチング、電解エッチング、メッキ等を用いて電極部５４を任意の形状、例えば針状に成形する。但し、この工程も必ずしも必要ではない。
【００８３】
上記作製手順により生体試料用アレイ電極５１は、所望の三次元の位置に配置された複数の電極を有するものとなる。更に、この作製方法では、三次元の電極の形状を電解エッチング等により任意に形成することが可能となる。
【００８４】
（参考例７）
図７は、他の参考例となる生体試料用アレイ電極及びその作製方法を説明する概略図である。
【００８５】
本参考例の生体試料用アレイ電極は、絶縁性の基板上の導電性材料の成形により、立体的に配置する電極としたものである。これは、前述した(III)の生体試料用アレイ電極の作製方法によるものであり、パターニングする時、基板との密着性が低い導電性材料（金属）を用いる場合に、しばしば用いられるリフトオフ法によるものである。以下、この方法を説明する（図７参照。なお、下記（１）〜（７）は図７中の工程（１）〜（７）に対応する。）。
【００８６】
（１）絶縁性の基板となる透明なアクリル基板６２を用意する。
（２）アクリル基板６２上にあらかじめリード部６３及びパッド部６４をフォトリソグラフィーにより作製する。
（３）アクリル基板６２上の全面に光反応性樹脂となるフォトレジスト６５をコーティングし、フォトリソグラフィーにより電極となる部分をパターニングする（図７（３）の白抜き部分）。この時、電極となる部分にはフォトレジスト６５が存在しないようにパターニングされている。
（４）アクリル基板６２上の全面に導電性材料となる金６６をスパッタにより厚くコーティングする。
（５）リフトオフ用の溶液に浸漬させることにより、パターニングされたフォトレジスト６５が除去され、それとともにその上にコーティングされた金６６も除去されて、三次元の電極部６７が形成される。
（６）電極部６７とパッド部６４以外のリード部６３等の不要な部分はレジスト６８によりコーティングして絶縁被覆し、測定や刺激印加に支障がないようにする。
（７）最終処理として、エッチング、電解エッチング、メッキ等を用いて電極部６７を任意の形状、例えば針状に成形する。但し、この工程は必ずしも必要ではない。
【００８７】
上記作製手順により生体試料用アレイ電極６１は、所望の三次元の位置に配置された複数の電極を有するものとなる。更に、この作製方法でも、三次元の電極の形状を電解エッチング等により任意に形成することが可能となる。
【００８８】
なお、参考例中の基板材料にはアクリル樹脂以外にもガラスなどを用いることができ、ガラス、アクリル樹脂などの透明な基板を用いれば、顕微鏡で生体試料を観察しながら使用することができる。又、電極材料にはタングステン、白金、金以外にもそのほかの金属、金属酸化物、カーボン、有機物等の導電性高分子などの導電性材料、半導体材料などを用いることができ、必要であればこれらを組み合わせることも可能である。非導電性樹脂にもその他の多くの種類のものを用いることができ、必要であればこれらを組み合わせることも可能である。
【００８９】
本発明に係る三次元の電極配置構造を持つアレイ電極は、三次元構造を有する生体組織を対象にした生体信号や神経伝達物質の計測に極めて有効であり、更に、電極表面上に酵素（タンパク質）などの特異性を持たせた物質を修飾することで選択性を与え、より高機能な電極として電気化学計測に応用することも可能である。この場合、特定の物質の分布や、刺激に対する分布の変化を把握することで、生体におけるその物質の作用やメカニズムの解明につながる。
【００９０】
又、三次元的な計測だけでなく、任意の三次元的な位置に刺激を与えることができ、電気的な刺激の場合は、視覚や聴覚などの感覚器官の障害、運動機能障害の治療やリハビリテーションにも広く応用が可能である。例えば、微細加工技術を用いて微小な三次元のアレイ電極を作製すれば、微小生体試料の中で必要な部位の情報を数百μｍ間隔で適宜取得し、又刺激印可することができる。
【００９２】
【発明の効果】
請求項１乃至請求項２に係る発明によれば、複数の電極と、当該電極の先端を三次元に配置するための電極固定用治具とを具備し、前記電極は、導電線と前記導電線を被覆する絶縁材とからなり、前記電極固定用治具は、前記電極の先端を三次元に配置するための複数の電極位置合わせ／固定用ホールを設けた電極位置合わせ用治具と、前記電極の他端を固定する本体部とを備えたので、立体的な生体試料における電気的な信号を、高感度、高時間分解能、高空間分解能で、三次元的に同時に計測することができ、又、三次元的に局所に刺激印加をすることができる。更に、電極上に酵素などの特異性を持たせた物質を修飾することで選択性を与え、より高機能な電極として電気化学計測に応用することも可能である。
【００９３】
請求項３乃至請求項４に係る発明によれば、前記電極を、導電線と前記導電線を内包するキャピラリーとからなるものとしたので、立体的な生体試料における電気的な信号を、高感度、高時間分解能、高空間分解能で、三次元的に同時に計測し、又刺激印加をすることができるだけではなく、更に、キャピラリー内に薬物等を保持することができるため、局所的な薬物刺激の印可が可能となり、又、生体試料の溶液をサンプリングすることで電気化学計測も可能となる。
【００９８】
請求項５乃至請求項６に係る発明によれば、
複数の電極を三次元に配置した生体試料用アレイ電極の作製方法であって、前記電極を、導電線と前記導電線を被覆する絶縁材とからなるものとし、前記電極の先端を固定するための複数の電極位置合わせ／固定用ホールを設けた電極位置合わせ用治具を備えた電極固定用治具を用いて、前記電極の先端を三次元に配置するので、立体的な生体試料における電気的な信号を、高感度、高時間分解能、高空間分解能で、三次元的に同時に計測し、又刺激印加をすることができるアレイ電極を作ることができる。
【００９９】
請求項７乃至請求項８に係る発明によれば、前記電極を、導電線と前記導電線を内包するキャピラリーとからなるものとするので、立体的な生体試料における電気的な信号を、高感度、高時間分解能、高空間分解能で、三次元的に同時に計測し、又刺激印加をすることができるだけではなく、更に、局所的な薬物刺激の印可や生体試料の電気化学計測も可能となるアレイ電極を作ることができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】 本発明に係る実施形態の一例を示す生体試料用アレイ電極の概略図である。
【図２】 本発明に係る実施形態の他の一例を示す生体試料用アレイ電極の概略図である。
【図３】 参考例となる生体試料用アレイ電極及びその作製方法を説明する概略図である。
【図４】 他の参考例となる生体試料用アレイ電極及びその作製方法を説明する概略図である。
【図５】 他の参考例となる生体試料用アレイ電極及びその作製方法を説明する概略図である。
【図６】 他の参考例となる生体試料用アレイ電極及びその作製方法を説明する概略図である。
【図７】 他の参考例となる生体試料用アレイ電極及びその作製方法を説明する概略図である。
【符号の説明】
１ 生体試料用アレイ電極
２ 電極
３ 電極固定用治具
４ リード線
５ 電極位置合わせ治具
５ａ 電極位置合わせ／固定用ホール
６ 基板
７ 生体試料
８ タングステン線
９ ガラス管
【発明の属する技術分野】
本発明は、生体試料を対象にしたアレイ電極（多点電極）及びその作製方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
生体試料を対象にした計測の中で、電極を用いた電気計測、電気化学計測は、時間分解能にすぐれた高感度な計測方法として、従来から広く用いられてきた。例えば、針状に細く引いたガラスキャピラリーに、電極を挿入して計測を行なうパッチクランプ法は、単一の細胞や生体組織中の細胞の電気的活動をモニターする手法として広く用いられている。
【０００３】
又、針状のキャピラリーから細胞近傍の溶液を抽出し、電気化学的に分析するオンラインセンサは、空間分解能に優れた高感度な分析方法として、今後ますます期待されるところである（参考文献：Niwa O, Torimitsu K, Morita M, Osborne P, Yamamoto K. Concentration of extracellular L-glutamate released from cultured nerve cells measured with a small-volume online sensor. Anal. Chem., 1996; 68:1865-1870）。
【０００４】
一方、細胞外活動電位は、試料にダメージを与えることがなく（非浸襲）、細胞の外に置いた電極を使って細胞の活動を計測できる手法である。我々は、以前から、平板状に配置した複数の電極を用いて、複数の神経細胞の電気的活動を多点で同時に計測することに成功している（参考文献：Jimbo Y, Tateno T, Robinson HPC. Simultaneous induction of pathway−specific potentiation and depression in networks in cortical neurons. Biophys. J., 1999; 76:670-678）。この手法は、フォトリソグラフィーによって作製したアレイ型電極によって、培養した神経細胞の細胞外活動電位を同時に多点で計測できるため、結合した細胞、組織の活動を、高時間分解能を持って計測するのに非常に有効である。
【０００５】
又、アレイ型平板電極は、その上に酵素を被覆するなどによって選択性を付与することができ、特定の化学物質を電気化学的に計測することも可能であるため、化学物質の２次元の分布計測に非常に適している（参考文献：Kasai N, Jimbo Y, Niwa O, Matsue T, and Torimitsu K, Real-time multisite observation of glutamate release in rat hippocampal slices, Neuroscience Letters, 2001, 304, 112−116）。
【０００６】
更に、これらの電極は針型、平板型を問わず、生体試料を対象にした計測のみでなく、試料へ局所的な刺激を印加するのにも有効である。この場合、電極により直接電気的な刺激を印加することも可能であるし、キャピラリーに挿入した電極を用いてキャピラリー内に電場を形成させ、あらかじめキャピラリー内に入れておいた刺激溶液を生体試料内あるいは近傍にインジェクト（注入）することで、薬物投与による局所刺激を印加することも可能である。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
脳（多数の神経細胞の集合体）は三次元構造を有しており、三次元構造の状態のままでは多数の細胞を対象とする計測を行なうのは困難である。そのため、従来は、脳神経細胞等の計測を行なう場合、脳を解剖し、神経細胞をばらばらにして、培養により細胞をシャーレ内に保持し、平面型の電極を用いて計測を行なっていた。具体的には、シャーレの底に多数の電極（例えば、８×８のアレイ状の平面電極）を有するものを用いて計測を行なっており、ばらばらにされた細胞等を計測する場合には有用であった。
【０００８】
しかしながら、近年、脳を含めた生体機能の解明に関して世界的な関心が寄せられるに伴い、脳あるいは脳の一部のように立体的な構造をもつ生体試料を、一つ一つの細胞へ分解せずに、その形状を保ったまま計測する必要性が高まっている。
【０００９】
例えば、脳を薄切りにした切片（通常は厚さ２００〜５００μｍ）を用い、ある程度の三次元構造を残した試料を作製することで、三次元構造の生体試料の計測が試みられている。ところが、上述した平面電極では、切片の表面の細胞しか測定することができないため、十分な計測信号が得ることができない。この主たる原因は、切片試料を作製する際に、切片表面の細胞は大きなダメージを受けてしまうためと考えられ、表面の細胞よりもダメージを受けていない内側の細胞を対象とする計測手段が求められている。
【００１０】
更に、立体的な広がりをもつ生体において、その機能を解明するためには、立体的な生体情報を得ることが不可欠であり、そのために三次元における計測が重要である。これらは、今後より微細な計測を可能とするナノテクノロジーの分野の高度化とともに、ますます必要度が高まってくるものと考えられる。
【００１１】
又、生体機能の解明のみならず様々な疾病の治療あるいは感覚器官の代替として、任意の生体微小区域へ電気的刺激を印加する試みも行われており、より高精度に三次元における位置を把握しつつ刺激を印加する方法が求められている。
【００１２】
しかしながら、これまでの電極の形状では、組織の内部の情報を得ることのできる三次元計測や刺激印加は非常に困難であり、可能であっても煩雑な系（システム）を確立させる必要があった。
【００１３】
そのため、複数の任意の電極として、立体的に配置したアレイ電極を用いて、三次元の計測・刺激印加が必要不可欠の段階にきている。
【００１４】
本発明は、上記課題に鑑み、三次元の計測・刺激印加を可能とする生体試料用アレイ電極及びその作製方法を提供する。
【００１６】
【課題を解決するための手段】
上記課題を解決する本発明に係る生体試料用アレイ電極は、複数の電極と、当該電極の先端を三次元に配置するための電極固定用治具とを具備し、
前記電極は、導電線と前記導電線を被覆する絶縁材とからなり、
前記電極固定用治具は、前記電極の先端を三次元に配置するための複数の電極位置合わせ／固定用ホールを設けた電極位置合わせ用治具と、前記電極の他端を固定する本体部とを備えたことを特徴とする。
【００１７】
上記課題を解決する本発明に係る生体試料用アレイ電極は、前記導電線を金属線とし、前記絶縁材をガラス管としたことを特徴とする。
【００１８】
上記課題を解決する本発明に係る生体試料用アレイ電極は、前記電極を、導電線と前記導電線を内包するキャピラリーとからなるものとしたことを特徴とする。
【００１９】
上記課題を解決する本発明に係る生体試料用アレイ電極は、前記導電線を銀／塩化銀線とし、前記キャピラリーをガラス管としたことを特徴とする。
【００２９】
上記課題を解決する本発明に係る生体試料用アレイ電極の作製方法は、複数の電極を三次元に配置した生体試料用アレイ電極の作製方法であって、
前記電極を、導電線と前記導電線を被覆する絶縁材とからなるものとし、
前記電極の先端を固定するための複数の電極位置合わせ／固定用ホールを設けた電極位置合わせ用治具を備えた電極固定用治具を用いて、前記電極の先端を三次元に配置することを特徴とする。
【００３０】
上記課題を解決する本発明に係る生体試料用アレイ電極の作製方法は、前記導電線を金属線とし、前記絶縁材をガラス管とすることを特徴とする。
【００３１】
上記課題を解決する本発明に係る生体試料用アレイ電極の作製方法は、前記電極を、導電線と前記導電線を内包するキャピラリーとからなるものとすることを特徴とする。
【００３２】
上記課題を解決する本発明に係る生体試料用アレイ電極の作製方法は、前記導電線を銀／塩化銀線とし、前記キャピラリーをガラス管とすることを特徴とする。
【００４１】
【発明の実施の形態】
本発明では、複数の電極又はキャピラリーを三次元に（立体的に）配置することにより、生体試料など三次元の構造をもった試料の、三次元領域における計測及び三次元領域への刺激印加が可能となる。又、電極等の立体的な形状を変えることによって、任意の位置に電極を配置することも可能である。
【００４２】
つまり、本発明は、電極等を三次元に配置した立体型のアレイ電極を作製し、それを生体試料へ応用して計測・刺激印加などを行うことができるようにすることに特徴がある。
【００４３】
上述したような立体型のアレイ電極の最も単純な作製方法としては、以下のようなものが考えられる。
(I)針状の電極を三次元に配置する。
(II)キャピラリーを三次元に配置する。
【００４４】
又、他の作製方法として、以下のようなものも考えられる。
(III)金属や金属酸化物、カーボン、有機物を含む導電性材料・半導体材料を三次元の電極に加工し、不要部分をレジストなどの絶縁材料で被覆する。
この方法では、導電性材料・半導体材料を溶出等によって積層する方法だけでなく、現在可能な微細加工技術を用いて、微小で多様な形状の複数の凸部を電極として作製することが考えられる。具体的な微細加工技術としては、フォトリソグラフィーを用いたエッチング法、リフトオフ法、メッキ法等がある。
【００４５】
更に、他の作製方法として、以下のようなものも考えられる。
(IV)絶縁性の材料を用いてあらかじめ凸部を成形し、その凸部に金属や金属酸化物、有機物を含む導電性材料・半導体材料を被覆して電極とする。
【００４６】
前記凸部は、例えば、それぞれの凸部に電位を印加することによって、先端のみを鋭利に加工することができる（電解エッチング等）。凸部の先端を鋭利にすることで、生体試料の内部に電極先端を到達させることが可能となり、全体のサイズを小さくすれば、生体内に埋め込むことも可能である。又、作製したアレイ電極を絶縁膜で被覆し、必要な電極に電場を形成することによって、その電極の先端部のみ絶縁膜を除去し、任意の位置に電極を配置することも可能である。
【００４７】
上記方法で作製した立体型のアレイ電極は、個々の電極を独立して導通を取ることによって、異なる位置における電気計測、電気化学計測が可能となり、更に、各電極を通して電気的な刺激を局所的に印加することで電気刺激印加が可能となる。
【００４８】
以下、実施例及び図面を用いて本発明を更に具体的に説明する。なお、本発明は以下の実施例のみに限定されるものではない。
【００４９】
（実施例１）
図１は、本発明に係る実施形態の一例を示す生体試料用アレイ電極の概略図である。詳細な構造がわかるように、その一部を拡大して示した。
【００５０】
本実施例の生体試料用アレイ電極は、生体試料の電気計測で用いられる針状の電極を複数用いて、三次元に（立体的に）配置したものである。これは、前述した(I)の生体試料用アレイ電極の作製方法によるものである。
【００５１】
図１に示すように、生体試料用アレイ電極１は、複数の針状の電極２を有しており、電極２は、電極固定用治具３により、その先端が三次元の配置になるように固定されている。電極２の他の端部には計測機器等に接続するためのリード端子４が接続されており、電極固定用治具３の本体部分に固定されている。
【００５２】
電極固定用治具３は、電極２の先端を三次元に配置するための電極位置合わせ治具５を備えており、電極位置合わせ治具５に設けた電極位置合わせ／固定用ホール５ａ（ホール直径０．１７ミリメートル、ホール中心同士の間隔は０．３ミリメートル）を用いて電極２を固定し、基板６上の生体試料７の任意の位置の電気計測を行なうことができる（図１の拡大図Ａ参照。拡大図Ａは、電極位置合わせ治具５の上面図及び側面図を示す。）。又、電極２は、導電線となる細いタングステン線８と絶縁材となるガラス管９を有しており、ガラス管９がタングステン線８を、その先端部分を除き、被覆するような針状の電極となっている（図１の拡大図Ｂ参照）。
【００５３】
上記電極位置合わせ治具５を用いれば、０．３ミリメートル離れた複数の位置における電気的な信号を、同時に計測することが可能である。又、電極位置合わせ／固定用ホール５ａの中心間距離を更に小さくすれば、より高空間分解能の計測も可能である。更に、異なる長さの針状の電極２を用いることで、任意の高さ方向の位置に電極２を配置することも可能となり、立体的な生体試料の電気計測等も可能となる。
【００５４】
なお、本実施例では電極の導電線の材料としてタングステンを用いたが、その他の金属や金属酸化物、半導体材料、カーボンなどを使用することも可能である。更に、絶縁材としてガラス管を用いて電極を絶縁封止しているが、それ以外のレジスト等の有機材料や窒化珪素などの半導体用絶縁材料も使用することが可能である。
【００５５】
（実施例２）
図２は、本発明に係る実施形態の他の一例を示す生体試料用アレイ電極の概略図である。詳細な構造がわかるように、その一部を拡大して示した。
【００５６】
本実施例の生体試料用アレイ電極は、生体試料内あるいはその近傍の微小領域における電気計測を行うためのキャピラリーを複数用いて、三次元に（立体的に）配置したものである。これは、前述した(II)の生体試料用アレイ電極の作製方法によるものである。
【００５７】
図２に示すように、生体試料用アレイ電極１１は、複数のキャピラリー／電極１２を有しており、キャピラリー／電極１２は、キャピラリー／電極固定用治具１３により、その先端が三次元に配置なるように固定されている。キャピラリー／電極１２の他の端部には計測機器等に接続するためのリード端子１４が接続されており、キャピラリー／電極固定用治具１３の本体部分に固定されている。
【００５８】
キャピラリー／電極固定用治具１３としては、図１に示したものと同様のものを用いており、キャピラリー／電極１２の先端を三次元に配置するためのキャピラリー位置合わせ治具１５を備えており、キャピラリー位置合わせ治具１５に設けたキャピラリー位置合わせ／固定用ホール１５ａ（ホール直径０．１７ミリメートル、ホール中心同士の間隔は０．３ミリメートル）を用いてキャピラリー／電極１２を固定し、基板１６上の生体試料１７の任意の位置の電気計測を行なっている（図２の拡大図Ｃ参照。拡大図Ｃは、キャピラリー位置合わせ治具１５の上面図及び側面図を示す。）。又、キャピラリー／電極１２は、導電線となる細い銀／塩化銀線１８と絶縁材となるガラス管１９を有しており、ガラス管１９が、その先端部に開口部を有し、銀／塩化銀線１８を、その内部に完全に内包したものとなっている（図２の拡大図Ｄ参照）。銀／塩化銀線１８は、銀及び塩化銀の適切な組成比で構成されている。又、キャピラリー／電極１２のガラス管１２は、スポイト状の形状を有しているため、その中に任意の溶液２０を保持することができる。
【００５９】
上記キャピラリー位置合わせ治具１５は、図１に示す生体試料用アレイ電極１の電極位置合わせ治具５と同様のものであり、これを用いれば、０．３ミリメートル離れた複数の位置における電気的な信号を、同時に計測することが可能である。又、キャピラリー位置合わせ／固定用ホール１５ａの中心間距離を更に小さくすれば、より高空間分解能の計測も可能である。更に、異なる長さのキャピラリー／電極１２を用いることで、任意の高さ方向の位置にキャピラリー／電極１２を配置することも可能となり、立体的な生体試料の電気計測等も可能となる。
【００６０】
又、銀／塩化銀線１８に電位パルスを印加することで、特定のキャピラリー／電極１２の内部の溶液２０をインジェクト（注入）することが可能であり、これにより局所的な薬物刺激の印加が可能となる。更に、任意の位置に固定したキャピラリー／電極１２によって、生体試料内あるいは近傍の任意の複数の三次元微小領域から、試料溶液をサンプリングすることにより電気化学計測が可能となる。
【００６１】
なお、ここでは電気計測用の電極の導電線の材料として銀／塩化銀を用いたが、そのほかの金属や金属酸化物、半導体材料、カーボンなどを使用することも可能である。
【００６２】
（参考例３）
図３は、参考例となる生体試料用アレイ電極及びその作製方法を説明する概略図である。
【００６３】
本参考例の生体試料用アレイ電極は、絶縁性の基板上の導電線を立体的に加工して、三次元に配置して作製したものである。これは、前述した(III)の生体試料用アレイ電極の作製方法によるものである。以下、この方法を説明する（図３参照。なお、下記（１）〜（６）は図３中の工程（１）〜（６）に対応する。）。
【００６４】
（１）絶縁性の基板となる透明なアクリル基板２２を用意する。
（２）アクリル基板２２上にパッド部２３をフォトリソグラフィーにより作製する。
（３）導電線となる複数のタングステン細線２４を配列し、接着剤２５で互いを固着する。複数のタングステン細線２４は、１本ずつ絶縁被覆されている。
（４）タングステン細線２４の先端部分の被覆を剥がし、垂直に折曲げて、三次元の電極部２６を成形し、タングステン細線２４の他端側を任意の形状に折曲げて、パッド部２３の位置と重なるようにリード部２７を成形する。この時、三次元の電極となるタングステン細線２４の先端部分の長さや折曲げる角度等を変えることによって、電極部２６を三次元の自由な位置に配置することが可能となる。
（５）アクリル基板２２上のパッド部２３にリード線２７の端部の位置が合うようにタングステン細線２４を固定し、導電性ペースト２８を用いてリード部２７をパッド部２３に固定する。
（６）最終処理として、電極部２６とパッド部２３以外を絶縁被覆材２９により被覆する。
【００６５】
上記作製手順により生体試料用アレイ電極２１は、所望の三次元の位置に配置された複数の電極を有するものとなる。
【００６６】
本参考例では電極の導電線の材料として細いタングステン線を用いたが、そのほかの金属や金属酸化物、半導体材料、カーボンなどを使用することも可能である。又、絶縁被覆されたタングステン細線を用いて三次元電極を成形しており、更に、上記作製手順（６）において最終的な絶縁被覆を行っているが、絶縁被覆されていないタングステン細線を用いることも可能である。
【００６７】
上記生体試料用アレイ電極２１を用いた計測方法としては、シャーレ中心に電極部２６を上にして上記生体試料用アレイ２１を配置し、パッド部２３を計測器等と接続し、この電極部２６上に脳等の切片試料を乗せて計測する。電極部２６が三次元的な分布を有するため、切片試料の深さ方向の計測が可能となり、従来の方法に比べて、ダメージを受けていない神経細胞を確実に測定でき、神経細胞活動の大きな信号を得ることができる。これは、他の参考例においても同様である。
【００６８】
（参考例４）
図４は、他の参考例となる生体試料用アレイ電極及びその作製方法を説明する概略図である。
【００６９】
本参考例の生体試料用アレイ電極は、絶縁性の基板上に非導電性材料の成形により三次元体を作製し、その三次元体に導電性材料を被覆して、立体的に配置する電極としたものである。これは、前述した(IV)の生体試料用アレイ電極の作製方法によるものである。以下、この方法を説明する（図４参照。なお、下記（１）〜（７）は図４中の工程（１）〜（７）に対応する。）。
【００７０】
（１）絶縁性の基板となる透明なアクリル基板３２を用意する。
（３）アクリル基板３２上の全面に成形加工可能な非導電性樹脂３３（例えば、ポリジメチルシロキサン等）を厚くコーティングし、その上からアルミニウム製の三次元加工用のメタルマスク３４を圧迫させて、任意の形状の三次元体３５を成形する。
（４）アルミニウム製のメタルマスク３６を用いて、アクリル基板３２をマスキングする。
（６）マスキングにより、アクリル基板３２上の電極部３７、リード部３８、パッド部３９の必要な部分にのみ白金をスパッタにより堆積する。この時、電極部３７は、三次元体３５上に導電性材料となる白金が被覆されて形成される。
（７）最終処理として、電極部３７とパッド部３９以外のリード部３８等の不要な部分はレジスト４０によりコーティングして絶縁被覆し、測定や刺激印加に支障がないようにする。
【００７１】
又、他の作製手順として、以下の手順も可能である。
（１）絶縁性の基板となる透明なアクリル基板３２を用意する。
（２）アクリル基板３２上にあらかじめリード部３８及びパッド部３９をフォトリソグラフィーにより作製する。
（３）アクリル基板３２上の全面に成形加工可能な非導電性樹脂３３（例えば、ポリジメチルシロキサン等）を厚くコーティングし、その上からアルミニウム製の三次元加工用のメタルマスク３４を圧迫させて、任意の形状の三次元体３５を成形する。
（５）アルミニウム製のメタルマスク３６ｂを用いて、アクリル基板３２をマスキングする。
（６）マスキングにより、アクリル基板３２上の電極部３７にのみ白金をスパッタにより堆積する。この時、電極部３７は、三次元体３５上に導電性材料となる白金が被覆されて形成される。
（７）最終処理として、電極部３７とパッド部３９以外のリード部３８等の不要な部分はレジスト４０によりコーティングして絶縁被覆し、測定や刺激印加に支障がないようにする。
【００７２】
上記作製手順により生体試料用アレイ電極３１は、所望の三次元の位置に配置された複数の電極を有するものとなる。本参考例では、メタルマスク３４の形状を変えることによって任意の形状の三次元の電極が形成可能であり、又、三次元体を構成するものとして樹脂を用いることで加工が簡便となる。
【００７３】
（参考例５）
図５は、他の参考例となる生体試料用アレイ電極及びその作製方法を説明する概略図である。
【００７４】
本参考例の生体試料用アレイ電極は、絶縁性の基板上に非導電性材料の成形により三次元体を作製し、その三次元体に導電性材料を被覆して、立体的に配置する電極としたものである。これは、前述した(IV)の生体試料用アレイ電極の作製方法によるものである。以下、この方法を説明する（図５参照。なお、下記（１）〜（７）は図５中の工程（１）〜（７）に対応する。）。
【００７５】
（１）絶縁性の基板となる透明なアクリル基板４２を用意する。
（３）アクリル基板４２上の全面に非導電性を有する光反応性樹脂４３（例えば、フォトレジスト等）を厚くコーティングし、フォトリソグラフィーにより電極となる部分をパターニングする（図５（３）で示す白抜き部分）。
（４）エッチングによって不要部分（パターニングされていない部分）の光反応性樹脂４３を除去し、電極部を構成する三次元体４４を成形する。
（６）図４に示すメタルマスク３６ａと同様のメタルマスクを用いてマスキングを行い、白金をスパッタすることによりパターニングを行い、アクリル基板４２上に電極部４５、リード部４６、パッド部４７となる必要な部分にのみ導電性を与える。この時、電極部４５は、三次元体４４上に導電性材料となる白金が被覆されて形成される。
（７）最終処理として、電極部４５とパッド部４７以外のリード部４６等の不要な部分はレジスト４８によりコーティングして絶縁被覆し、測定や刺激印加に支障がないようにする。
【００７６】
又、他の作製手順として、以下の手順も可能である。
（１）絶縁性の基板となる透明なアクリル基板４２を用意する。
（２）アクリル基板４２上にあらかじめリード４６部及びパッド部４７をフォトリソグラフィーにより作製する。
（３）アクリル基板４２上の全面に非導電性を有する光反応性樹脂４３（例えば、フォトレジスト等）を厚くコーティングし、フォトリソグラフィーにより電極となる部分をパターニングする。
（５）エッチングによって不要部分の光反応性樹脂４３を除去し、電極部を構成する三次元体４４を成形する。
（６）図４に示すメタルマスク３６ｂと同様のメタルマスクを用いてマスキングを行い、白金をスパッタすることによりパターニングを行い、アクリル基板４２上に電極部４５となる必要な部分に導電性を与える。この時、電極部４５は、三次元体４４上に導電性材料となる白金が被覆されて形成される。
（７）最終処理として、電極部４５とパッド部４７以外のリード部４６等の不要な部分はレジスト４８によりコーティングして絶縁被覆し、測定や刺激印加に支障がないようにする。
【００７７】
上記作製手順により生体試料用アレイ電極４１は、所望の三次元の位置に配置された複数の電極を有するものとなる。
【００７８】
この作製方法では、三次元電極の形状を任意に形成することが困難であるが、一般的に使用されているフォトレジスト等を使用することが可能であるため、簡便に凸型の電極を加工することができるという点で優れている。
【００７９】
（参考例６）
図６は、他の参考例となる生体試料用アレイ電極及びその作製方法を説明する概略図である。
【００８０】
本参考例の生体試料用アレイ電極は、絶縁性の基板上の導電性材料の成形により、立体的に配置する電極としたものである。これは、前述した(III)の生体試料用アレイ電極の作製方法によるものである。以下、この方法を説明する（図６参照。なお、下記（１）〜（８）は図６中の工程（１）〜（８）に対応する。）。
【００８１】
（１）絶縁性の基板となる透明なアクリル基板５２を用意する。
（３）アクリル基板５２上の全面に導電性材料となる白金５３をスパッタにより厚くコーティングし、フォトリソグラフィーにより電極となる部分をパターニングする（図６（３）の白抜きの部分）。
（４）エッチングによって不要部分（パターニングされていない部分）の白金５３を除去し、導電性を持つ三次元体となる電極部５４を成形する。
（６）図４に示すメタルマスク３６ａと同様のメタルマスクを用いてマスキングを行い、白金をスパッタすることによりパターニングを行い、基板上にリード部５５、パッド部５６となる必要な部分に導電性を与える。
（７）電極部５４とパッド部５６以外のリード部５５等の不要な部分はレジスト５７によりコーティングして絶縁被覆し、測定や刺激印加に支障がないようにする。
（８）最終処理として、エッチング、電解エッチング、メッキ等を用いて電極部５４を任意の形状、例えば針状に成形する。但し、この工程は必ずしも必要ではない。
【００８２】
又、他の作製手順として、以下の手順も可能である。
（１）絶縁性の基板となる透明なアクリル基板５２を用意する。
（２）アクリル基板５２上にあらかじめリード５５部及びパッド部５６をフォトリソグラフィーにより作製する。
（３）アクリル基板５２上の全面に導電性材料となる白金５３をスパッタにより厚くコーティングし、フォトリソグラフィーにより電極となる部分をパターニングする。
（５）エッチングによって不要部分の白金５３を除去し、導電性を持つ三次元体となる電極部５４を成形する。
（７）電極部５４とパッド部５６以外のリード部５５等の不要な部分はレジスト５７によりコーティングして絶縁被覆し、測定や刺激印加に支障がないようにする。
（８）最終処理として、エッチング、電解エッチング、メッキ等を用いて電極部５４を任意の形状、例えば針状に成形する。但し、この工程も必ずしも必要ではない。
【００８３】
上記作製手順により生体試料用アレイ電極５１は、所望の三次元の位置に配置された複数の電極を有するものとなる。更に、この作製方法では、三次元の電極の形状を電解エッチング等により任意に形成することが可能となる。
【００８４】
（参考例７）
図７は、他の参考例となる生体試料用アレイ電極及びその作製方法を説明する概略図である。
【００８５】
本参考例の生体試料用アレイ電極は、絶縁性の基板上の導電性材料の成形により、立体的に配置する電極としたものである。これは、前述した(III)の生体試料用アレイ電極の作製方法によるものであり、パターニングする時、基板との密着性が低い導電性材料（金属）を用いる場合に、しばしば用いられるリフトオフ法によるものである。以下、この方法を説明する（図７参照。なお、下記（１）〜（７）は図７中の工程（１）〜（７）に対応する。）。
【００８６】
（１）絶縁性の基板となる透明なアクリル基板６２を用意する。
（２）アクリル基板６２上にあらかじめリード部６３及びパッド部６４をフォトリソグラフィーにより作製する。
（３）アクリル基板６２上の全面に光反応性樹脂となるフォトレジスト６５をコーティングし、フォトリソグラフィーにより電極となる部分をパターニングする（図７（３）の白抜き部分）。この時、電極となる部分にはフォトレジスト６５が存在しないようにパターニングされている。
（４）アクリル基板６２上の全面に導電性材料となる金６６をスパッタにより厚くコーティングする。
（５）リフトオフ用の溶液に浸漬させることにより、パターニングされたフォトレジスト６５が除去され、それとともにその上にコーティングされた金６６も除去されて、三次元の電極部６７が形成される。
（６）電極部６７とパッド部６４以外のリード部６３等の不要な部分はレジスト６８によりコーティングして絶縁被覆し、測定や刺激印加に支障がないようにする。
（７）最終処理として、エッチング、電解エッチング、メッキ等を用いて電極部６７を任意の形状、例えば針状に成形する。但し、この工程は必ずしも必要ではない。
【００８７】
上記作製手順により生体試料用アレイ電極６１は、所望の三次元の位置に配置された複数の電極を有するものとなる。更に、この作製方法でも、三次元の電極の形状を電解エッチング等により任意に形成することが可能となる。
【００８８】
なお、参考例中の基板材料にはアクリル樹脂以外にもガラスなどを用いることができ、ガラス、アクリル樹脂などの透明な基板を用いれば、顕微鏡で生体試料を観察しながら使用することができる。又、電極材料にはタングステン、白金、金以外にもそのほかの金属、金属酸化物、カーボン、有機物等の導電性高分子などの導電性材料、半導体材料などを用いることができ、必要であればこれらを組み合わせることも可能である。非導電性樹脂にもその他の多くの種類のものを用いることができ、必要であればこれらを組み合わせることも可能である。
【００８９】
本発明に係る三次元の電極配置構造を持つアレイ電極は、三次元構造を有する生体組織を対象にした生体信号や神経伝達物質の計測に極めて有効であり、更に、電極表面上に酵素（タンパク質）などの特異性を持たせた物質を修飾することで選択性を与え、より高機能な電極として電気化学計測に応用することも可能である。この場合、特定の物質の分布や、刺激に対する分布の変化を把握することで、生体におけるその物質の作用やメカニズムの解明につながる。
【００９０】
又、三次元的な計測だけでなく、任意の三次元的な位置に刺激を与えることができ、電気的な刺激の場合は、視覚や聴覚などの感覚器官の障害、運動機能障害の治療やリハビリテーションにも広く応用が可能である。例えば、微細加工技術を用いて微小な三次元のアレイ電極を作製すれば、微小生体試料の中で必要な部位の情報を数百μｍ間隔で適宜取得し、又刺激印可することができる。
【００９２】
【発明の効果】
請求項１乃至請求項２に係る発明によれば、複数の電極と、当該電極の先端を三次元に配置するための電極固定用治具とを具備し、前記電極は、導電線と前記導電線を被覆する絶縁材とからなり、前記電極固定用治具は、前記電極の先端を三次元に配置するための複数の電極位置合わせ／固定用ホールを設けた電極位置合わせ用治具と、前記電極の他端を固定する本体部とを備えたので、立体的な生体試料における電気的な信号を、高感度、高時間分解能、高空間分解能で、三次元的に同時に計測することができ、又、三次元的に局所に刺激印加をすることができる。更に、電極上に酵素などの特異性を持たせた物質を修飾することで選択性を与え、より高機能な電極として電気化学計測に応用することも可能である。
【００９３】
請求項３乃至請求項４に係る発明によれば、前記電極を、導電線と前記導電線を内包するキャピラリーとからなるものとしたので、立体的な生体試料における電気的な信号を、高感度、高時間分解能、高空間分解能で、三次元的に同時に計測し、又刺激印加をすることができるだけではなく、更に、キャピラリー内に薬物等を保持することができるため、局所的な薬物刺激の印可が可能となり、又、生体試料の溶液をサンプリングすることで電気化学計測も可能となる。
【００９８】
請求項５乃至請求項６に係る発明によれば、
複数の電極を三次元に配置した生体試料用アレイ電極の作製方法であって、前記電極を、導電線と前記導電線を被覆する絶縁材とからなるものとし、前記電極の先端を固定するための複数の電極位置合わせ／固定用ホールを設けた電極位置合わせ用治具を備えた電極固定用治具を用いて、前記電極の先端を三次元に配置するので、立体的な生体試料における電気的な信号を、高感度、高時間分解能、高空間分解能で、三次元的に同時に計測し、又刺激印加をすることができるアレイ電極を作ることができる。
【００９９】
請求項７乃至請求項８に係る発明によれば、前記電極を、導電線と前記導電線を内包するキャピラリーとからなるものとするので、立体的な生体試料における電気的な信号を、高感度、高時間分解能、高空間分解能で、三次元的に同時に計測し、又刺激印加をすることができるだけではなく、更に、局所的な薬物刺激の印可や生体試料の電気化学計測も可能となるアレイ電極を作ることができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】 本発明に係る実施形態の一例を示す生体試料用アレイ電極の概略図である。
【図２】 本発明に係る実施形態の他の一例を示す生体試料用アレイ電極の概略図である。
【図３】 参考例となる生体試料用アレイ電極及びその作製方法を説明する概略図である。
【図４】 他の参考例となる生体試料用アレイ電極及びその作製方法を説明する概略図である。
【図５】 他の参考例となる生体試料用アレイ電極及びその作製方法を説明する概略図である。
【図６】 他の参考例となる生体試料用アレイ電極及びその作製方法を説明する概略図である。
【図７】 他の参考例となる生体試料用アレイ電極及びその作製方法を説明する概略図である。
【符号の説明】
１ 生体試料用アレイ電極
２ 電極
３ 電極固定用治具
４ リード線
５ 電極位置合わせ治具
５ａ 電極位置合わせ／固定用ホール
６ 基板
７ 生体試料
８ タングステン線
９ ガラス管
Claims (8)
- 複数の電極と、当該電極の先端を三次元に配置するための電極固定用治具とを具備し、
前記電極は、導電線と前記導電線を被覆する絶縁材とからなり、
前記電極固定用治具は、前記電極の先端を三次元に配置するための複数の電極位置合わせ／固定用ホールを設けた電極位置合わせ用治具と、前記電極の他端を固定する本体部とを備えたことを特徴とする生体試料用アレイ電極。 - 請求項１記載の生体試料用アレイ電極において、
前記導電線を金属線とし、前記絶縁材をガラス管としたことを特徴とする生体試料用アレイ電極。 - 請求項１記載の生体試料用アレイ電極において、
前記電極を、導電線と前記導電線を内包するキャピラリーとからなるものとしたことを特徴とする生体試料用アレイ電極。 - 請求項３記載の生体試料用アレイ電極において、
前記導電線を銀／塩化銀線とし、前記キャピラリーをガラス管としたことを特徴とする生体試料用アレイ電極。 - 複数の電極を三次元に配置した生体試料用アレイ電極の作製方法であって、
前記電極を、導電線と前記導電線を被覆する絶縁材とからなるものとし、
前記電極の先端を固定するための複数の電極位置合わせ／固定用ホールを設けた電極位置合わせ用治具を備えた電極固定用治具を用いて、前記電極の先端を三次元に配置することを特徴とする生体試料用アレイ電極の作製方法。 - 請求項５記載の生体試料用アレイ電極の作製方法において、
前記導電線を金属線とし、前記絶縁材をガラス管とすることを特徴とする生体試料用アレイ電極の作製方法。 - 請求項５記載の生体試料用アレイ電極の作製方法において、
前記電極を、導電線と前記導電線を内包するキャピラリーとからなるものとすることを特徴とする生体試料用アレイ電極の作製方法。 - 請求項７記載の生体試料用アレイ電極の作製方法において、
前記導電線を銀／塩化銀線とし、前記キャピラリーをガラス管とすることを特徴とする生体試料用アレイ電極の作製方法。
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