JP3979198B2

JP3979198B2 - Nucleic acid immobilization carrier

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Publication number: JP3979198B2
Application number: JP2002189407A
Authority: JP
Inventors: 邦久薙野; 史夫中村; 均信正; 雅史日笠
Original assignee: Toray Industries Inc
Current assignee: Toray Industries Inc
Priority date: 2002-03-25
Filing date: 2002-06-28
Publication date: 2007-09-19
Anticipated expiration: 2022-06-28
Also published as: JP2004003913A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、遺伝子の発現、変異、多型等の同時解析に非常に有用なＤＮＡチップに関する。
【０００２】
【従来の技術】
各種生物の遺伝情報解析の研究が進められており、ヒト遺伝子をはじめとして、多数の遺伝子とその塩基配列、また遺伝子配列にコードされる蛋白質およびこれら蛋白質から二次的に作られる糖鎖に関する情報が急速に明らかにされつつある。配列の明らかにされた遺伝子、蛋白質、糖鎖などの生体高分子の機能については、各種の方法で調べることができる。主なものとしては、核酸についてはノーザンハイブリダイゼーション、あるいはサザンハイブリダイゼーションのような、各種の核酸／核酸間の相補性を利用して各種遺伝子とその生体機能発現との関係を調べることができる。蛋白質については、ウエスタンハイブリダイゼーションに代表されるような、蛋白質／蛋白質間の反応を利用し蛋白質の機能および発現について調べることができる。
【０００３】
近年、多数の遺伝子発現を一度に解析する手法としてＤＮＡマイクロアレイ法（ＤＮＡチップ法）と呼ばれる新しい分析法、ないし方法論が開発され、注目を集めており、一部は販売されている。これらの方法は、いずれも核酸／核酸間ハイブリダイゼーション反応に基づく核酸検出・定量法である点で原理的には従来の方法と同じである。これらの技術は、マイクロアレイ又はチップと呼ばれる平面基板片上に、多数のＤＮＡ断片が整列固定化されたものが用いられている点に大きな特徴がある。マイクロアレイ法の具体的使用法としては、例えば、研究対象細胞の発現遺伝子等を蛍光色素等で標識したサンプルを平面基板片上でハイブリダイゼーションさせ、互いに相補的な核酸（ＤＮＡあるいはＲＮＡ）同士を結合させ、その箇所を蛍光色素等でラベル後、高解像度解析装置で高速に読みとる方法や、電気化学反応にもとづく電流値等の応答を検出する方法が挙げられる。
こうして、サンプル中のそれぞれの遺伝子発現量を迅速に推定できる。
【０００４】
核酸を基板上に固定化するための技術としては、上記ノーザン法同様、ナイロンシート等の上に固定化する方法の他、ガラス等の基板の上にポリリジン等をコーティングして固定化する方法などが開発されている。
【０００５】
予め調製したＤＮＡを固相担体表面に固定する方法としては、一般的に、次の方法が用いられている。すなわち、固定するＤＮＡをＰＣＲによって増幅し、その産物（ＰＣＲ法によって増幅させたＤＮＡ断片）をＤＮＡチップ作製装置を用いて、ポリ陽イオンで表面処理した固相担体表面に点着し、ＤＮＡの荷電を利用して、固相担体に静電結合をさせ、次いで余分な陽イオンをブロッキングするのが一般的である。
【０００６】
また、特殊な方法であるが、シリカＤＮＡチップ上に微小電極のアレイを作製し、電極上にはストレプトアビジンを含むアガロースの浸透層を設けて反応部位とする。この部位をプラスに荷電させることでビオチン化ＤＮＡを固定し、部位の荷電を制御することで、高速で厳密なハイブリダイゼーションを可能にする方法がある（Ｓｏｓｎｏｗｓｋｉ，Ｒ．Ｇ．ｅｔａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９４，１１１９ −１１２３（１９９７））。
【０００７】
ＤＮＡの荷電を利用する方法の変法として、アミノ基で修飾したＰＣＲ産物をＳＳＣ（クエン酸緩衝食塩水）に懸濁させ、これをシリル化したスライドガラス表面に点着し、インキュベートした後、水素化ホウ素ナトリウムによる処理および加熱処理を順に行う方法が報告されている（Ｓｃｈｅｎａ，Ｍ．ｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９３，１０６１４ −１０６１９（１９９６））。
【０００８】
また、電気化学的反応に基づく方法では、金・銀などの電極上に、一本鎖ＤＮＡの５’もしくは３’末端にチオール基を導入し、金・銀などと硫黄との配位結合を介して、固定化されることが一般的である。そして、電極上に固定化されたＤＮＡと検体とをハイブリダイゼーションさせる。その後、一本鎖ＤＮＡと二本鎖ＤＮＡを識別し、二本鎖ＤＮＡに特異的に結合するリガンド（二本鎖結合性リガンド）による電気化学的シグナル（酸化電流値）を読みとるという手段が一般的に用いられている。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
しかし、上記の固定方法では、固定化できるＤＮＡの量が一定にできないため、測定の度にデータがばらつき、データの再現性がとれない、二本鎖のＤＮＡ（例えばＰＣＲ産物）を固定化した場合では、点着された各種ＤＮＡのメルティングポイント（二本鎖が一本鎖に乖離する温度）が統一されておらず、最適な状態でハイブリダイゼーションが行えない、一本鎖のＤＮＡ（例えば合成オリゴＤＮＡ）を固定化した場合では、固定化した一本鎖ＤＮＡ自体が高次構造をとり、最適な状態でハイブリダイゼーションが行えない、さらには、基板上に固定化されたＤＮＡの密度が小さく、結果的に低発現量遺伝子の検出ができない等の種々の問題を抱えている。このような問題を解決するためには、この問題を根本的に解決し、ＤＮＡの固定化効率を高め、なおかつ低コストでＤＮＡを固定する方法の開発が必要である。
【００１０】
本発明の具体的な目的は、担体表面に予め調製した多種類の核酸が効率良く高密度で固定化され、かつ、低コストで製造できる核酸固定担体を提供することである。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
すなわち本発明は、核酸が固定化されている核酸固定化担体であって、
ａ）固定化された核酸は、長い核酸分子と短い核酸分子からなる部分二本鎖を形成し、
ｂ）部分二本鎖核酸は、核酸の片側の末端付近から長さ方向で途中までが二本鎖であり、それ以外は一本鎖であり、
ｃ）部分二本鎖核酸の二本鎖を形成している末端側で、短い核酸分子の末端が担体に固定化されており、
ｄ）部分二本鎖核酸の長い核酸分子の塩基配列が異なっている二種類以上の部分二本鎖核酸が担体上の別の領域に固定化されており、
ｅ）固定化された部分二本鎖核酸の短い核酸分子の全部または一部が、共通の塩基配列を有し、
ｆ）担体上の同一領域に、部分二本鎖核酸と二本鎖核酸の両方が固定されていること、
のａ）〜ｆ）の全てを満たすことを特徴とする核酸固定化担体である。
【００１２】
【発明の実施の形態】
以下に、本発明の核酸高分子固定化担体の詳細について述べる。
【００１３】
１．担体
担体として、好ましく用いられるのは、ガラス、シリコンに代表される無機材からなるものや、ポリエチレンテレフタレート、ポリカーボネート、ポリスチレン、酢酸セルロース、ポリメタクリル酸メチル（ＰＭＭＡ）などのポリマーが挙げられる。これらは、固体であることが必要である。耐薬品性が優れ表面処理が容易であることから、ガラス、シリコンが特に好ましい。これらの担体には、アミノ基、カルボキシル基、アルデヒド基、エポキシ基などの官能基が基板表面と共有結合により導入されていることが好ましい。この官能基の中でも、特に、アミノ基、アルデヒド基が好ましい。このような官能基は、シランカップリング剤を用いて担体表面を処理することで得られる。このようなシランカップリング剤としては３−アミノプロピルトリエトキシシラン、３−アミノプロピルトリメトキシシラン、３−アミノプロピルジエトキシメチルシラン、３−（２−アミノエチルアミノプロピル）トリメトキシシラン、３−（２−アミノエチルアミノプロピル）ジメトキシメチルシラン、３−メルカプトプロピルトリメトキシシラン、ジメトキシ−３−メルカプトプロピルメチルシランなどが挙げられる。
【００１４】
さらに担体としては、疎水性、あるいは親水性に乏しい固相担体であることが好ましい。担体の形状としては、スライドガラスや、シリコンウェーハーなどの平面状のものを好ましく用いることができるが、特に限定されるものではない。
【００１５】
また、ガラス、シリコンに代表される無機材からなるものや、ポリエチレンテレフタレート、ポリカーボネート、ポリスチレン、酢酸セルロース、ポリメタクリル酸メチル（ＰＭＭＡ）などのポリマー上に電極を設けた担体を用意し、この上に核酸を固定化しても良い。このような担体は、好ましくは電気化学的な方法により、ハイブリダイズの検出を行うことができる。
【００１６】
電極として、好ましく用いられるのは、金、銀、白金に代表される金属や、カーボン、ＩＴＯなどが挙げられる、この中でも好ましくは金が用いられる。その理由は、後述するように、金とチオール基の配位結合により核酸を固定化することが容易であるからである。また、担体上に多数の電極を設け、各々の電極に外部に出力する端子を設け、各々の電極上には塩基配列の違う核酸を固定化するれば、一度に多数の遺伝子発現、変異、多型等の同時解析が可能となる。この際、各々の電極の核酸を固定化する部分の面積は、同一であることが好ましい。
【００１７】
２．核酸
本発明の担体に固定化する核酸にはＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡがあるが、特にＤＮＡが好ましい。本発明でいう部分二本鎖核酸の模式図を図１に示す。すなわち、本発明でいう部分二本鎖核酸とは、長い核酸分子と短い核酸分子からなる部分的に二本鎖を形成する核酸を指す。すなわち、核酸の全体が二本鎖を形成しているのではなく、核酸の一部が二本鎖を形成し、その他の部分が一本鎖であるものをいう。また、図１に示すように、本発明の部分二本鎖核酸は、末端付近から途中までは二本鎖を形成し、かつ、その他の部分で一本鎖であることが必要である。なお、本発明における核酸の末端付近とは、核酸の末端（５’末端、もしくは、３’末端）から１０塩基以内のことを指す。
【００１８】
核酸が担体表面に固定化された時の模式図を図２に示す。本発明によると、二本鎖部分によって、担体上に固定化した核酸を「立たせる」ことが可能となり、結果的に、効率よく担体表面に核酸を高密度で固定化することが可能となる。そして、一本鎖部分を検体核酸と反応する（ハイブリダイゼーションする）部分として用いれば、検体と、固定化された核酸とのハイブリダイゼーションの高速化が可能となる。
【００１９】
また、本発明では、共有結合により核酸を担体に結合させることが好ましい。したがって、核酸に化学的修飾を施すことが好ましい。以下に具体例を述べて説明する。まず、５’末端もしくは、３’末端に官能基を導入した一本鎖の核酸を用意する。この核酸の長さは特に限定されないが、５ｍｅｒから、２００ｍｅｒ程度が好ましい。より好ましい範囲は、１０ｍｅｒから５０ｍｅｒの間である。さらに好ましくは、１０ｍｅｒから３０ｍｅｒの間である。また、核酸の末端に導入する官能基としては、アミノ基、アルデヒド基、チオール基、ビオチン、リン酸基、−ＳＨ基（チオール基）などが挙げられるが、この中でも、アミノ基、チオール基が特に好ましく用いることができる。例えば、アミノ基の導入に関しては、ＤＮＡの５’末端のリン酸にアミノ基を有する脂肪族炭化水素鎖を導入する公知の方法（例えばNucleic Acids Res.,11(18),6513-(1983) ）を用いて調製することができる。しかし、好ましくは、オリゴヌクレオチドの５’末端もしくは３’末端に官能基を導入するように化学合成すればよい。そして、この末端に別の一本鎖核酸を用意することが必要である。別の一本鎖核酸とは官能基を導入した核酸の官能基側末端付近からの塩基配列に対し相補的な塩基配列を有するものである。この核酸は、後述する理由により官能基を導入した核酸よりも長いことが必要である。そして、上記二つの核酸をハイブリダイゼーションさせて、官能基が導入されている末端から途中までは二本鎖、それ以外は一本鎖である核酸（部分二本鎖核酸）を調整する。この時のハイブリダイゼーションの条件としては、何ら限定されるものではないが、例えば、前記二種類の核酸溶液を混合し、９５℃程度まで温度を上げた後、アニーリングするなどの方法が挙げられる。そして、前記の一本鎖部分が、検体とハイブリダイゼーションする部分となる。なお、一本鎖部分の長さとして好ましい範囲は、塩基数で１０以上１００以下であり、特に好ましくは１５以上、７０以下である。塩基数が１００より大きいと、一本鎖部分が高次構造を取ってしまうことがある。逆に塩基数が１０より小さいと、ハイブリダイゼーションしても熱的に不安定であり、結果的に検出できないことがある。
【００２０】
このように調整した末端に官能基が導入され、かつ、一本鎖部分と二本鎖部分の両方を有する核酸（部分二本鎖核酸）と、先に述べた官能基が共有結合で導入された担体とを結合する。例えば、ＤＮＡ末端にアミノ基が導入され、担体表面にカルボキシル基がある場合では、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド(EDC)等の縮合剤、ＤＮＡ末端にアミノ基が導入され、担体表面にアミノ基がある場合ではグルタルアルデヒドなどの架橋剤を用いて共有結合をさせることができる。また、ＤＮＡ末端にアミノ基が導入され、担体表面にアルデヒド基がある場合は、該ＤＮＡの水溶液を担体表面に点着することで、共有結合させることができる。共有結合させる際の温度は、５℃〜９５℃が好ましく、１５℃〜６５℃が更に好ましい。処理時間は通常５分〜２４時間であり、１時間以上が好ましい。
【００２１】
このように調整した末端に官能基が導入され、かつ、一本鎖部分と二本鎖部分の両方を有する核酸（部分二本鎖核酸）とまた、先に述べた電極とを結合する場合にはでは、以下のようにすればよい。すなわち、部分二本核酸の末端にチオール基を導入し、電極として金を用いた場合では、金電極上に該核酸を含む溶液を滴下や点着し、数時間放置することにより電極に該核酸が固定化できる。
【００２２】
なお、プローブ（固定化された部分二本鎖核酸）の密度を調整する観点から、部分二本鎖核酸の二本鎖部分と同じ長さである別の二本鎖核酸を用意し、これらを混合して、電極に固定化する手段も好ましく用いられる。
【００２３】
本発明では、部分二本鎖核酸の一本鎖部分の塩基配列（すなわち、長い核酸分子の塩基配列）が異なるものを二種類以上、担体に固定化する必要がある。具体的には、このような一本鎖部分の塩基配列の異なる各々の部分二本鎖核酸を別々に溶液にしておく。そして、例えば市販のＤＮＡチップ製造装置を用い、各々の部分二本鎖核酸の溶液を別々のスポットに点着し、多種の部分二本鎖核酸を担体表面上に固定化することができる。この場合、担体上に点着した同一のスポットの中では、担体に固定化されている部分二本鎖核酸は同一種類であるが、スポットが異なると、一本鎖部分の塩基配列が異なる部分二本鎖核酸が担体に固定化されていることになる。ただし、スポットが異なると、その中に含まれる部分二本鎖核酸が必ずしも異なる必要はない。すなわち、スポットが別でも、固定化されている部分二本鎖核酸が同じであっても構わない。本発明で重要なのは、一本鎖部分の塩基配列の異なる部分二本鎖核酸が、二種類以上固定化されていることである。このように多種の部分二本鎖核酸を担体に固定化することにより、一度の検体との反応（ハイブリダイゼーション）で遺伝子の発現、変異、多型等の同時解析が可能となる。
【００２４】
先に述べたように、官能基を末端に導入した核酸分子の長さの方が長い場合と、逆に、官能基を末端に導入した核酸分子の長さの方が短い場合を比較すると、以下のような違いがある。
【００２５】
まず、官能基を導入していない一本鎖核酸よりも、官能基を末端に導入した一本鎖核酸が短い場合において、多種の部分二本鎖核酸を担体上に固定した時は、次のような利点がある。この時、二本鎖部分の塩基配列を部分二本鎖核酸の種類によらず、全部共通にしておくと（すなわち、固定化された部分二本鎖核酸の短い核酸分子の全部が、共通の塩基配列を有する：図２では２の部分が共通）、末端に官能基を導入した核酸（短い核酸分子）は一種類のみ用意すればよい。一般に、官能基を核酸末端に導入するコストは大きいが、このような場合は、大幅なコストダウンが可能となる。また、固定化された部分二本鎖核酸の短い核酸分子の全部が共通の塩基配列を有しておらず、固定化された部分二本鎖核酸のうち、一部の短い核酸分子の塩基配列が共通の場合でも、同様の効果が得られる。逆に、官能基を導入していない一本鎖核酸よりも、官能基を末端に導入した一本鎖核酸が長い場合においては、担体に固定化する部分二本鎖核酸の種類分だけ官能基を末端に導入した一本鎖核酸が必要となり、コスト的に不利である。
【００２６】
なお、本発明に於いて上記ＤＮＡを担体に固定化する際に溶解させる溶液は、ＳＳＣ（クエン酸緩衝食塩水）、ＰＢＳ（リン酸緩衝食塩水）、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌなどの一般的な溶液を用いることができるが、溶液中に２価、もしくは３価のカチオンが含まれていることが好ましい。その様な例としては、Ｂａ、Ｃａ、Ｍｇ、Ａｌ、Ｍｎ、Ｓｅ、Ｚｎ、Ｃｒ、Ｇａ、Ｆｅ、Ｃｄ、Ｃｏ、Ｎｉ、Ｍｏ等のカチオンを含む溶液が挙げられる。この中でも、Ｍｇ、Ｃａのカチオンを含む溶液が特に好ましい。具体的には、ＭｇＣｌ₂、ＭｇＢｒ₂、Ｍｇ（Ｃ₂Ｈ₃Ｏ₂）₂、ＭｇＩ₂、Ｍｇ（ＮＯ₃）₂、ＭｇＳＯ₄、ＣａＣｌ₂、ＣａＩ₂、Ｃａ（ＮＯ₃）₂、を含む溶液が挙げられる。
【００２７】
本発明により得られた核酸分子固定化担体は、固定化された核酸の一本鎖部分をプローブとして、検体と反応させてハイブリダイゼーションを行うことにより、検体中の特定の塩基配列を有する核酸の検出に用いることができる。
【００２８】
ハイブリッドの検出には、ハイブリッドを特異的に認識することができる公知の手段を用いることができる。
【００２９】
この中でも、電気化学的な方法は、検体核酸に標識を施す必要がないので好ましい。この場合、一本鎖ＤＮＡと二本鎖ＤＮＡを識別し、二本鎖ＤＮＡに特異的に結合するリガンド（二本鎖結合性リガンド）による電気化学的シグナル（酸化電流値）を読みとるという手段が挙げられる。このリガンドとしては、ヘキスト３３２５８、メチレンブルー、ＦＮＤ（Ｆｅｒｒｏｃｅｎｙｌｎａｐｈｔｈａｌｅｎｅｄｉｉｍｉｄｅ）などの公知のものが挙げられる。
【００３０】
電極に固定化されたＤＮＡと検体ＤＮＡとの反応の結果は、電極に電位を印加し、その際に流れる電流を測定することにより判断することができる。サイクリックボルタンメトリー、ポテンショスタットなどが好ましく用いることができる。
【００３１】
一方、検体中の核酸に標識体（蛍光物質、発光物質、ラジオアイソトープなど）を作用させる場合には、この標識体を検出することでハイブリッドの検出が行える。これら標識体の種類や標識体の導入方法等に関しては、何ら制限されることはなく、従来公知の各種手段を用いることができる。
【００３２】
また、本発明の核酸分子固定化担体に対して用いる検体としては、一本鎖であることが好ましい。このような例としては、ｍＲＮＡから逆転写により合成された、ｃＤＮＡを挙げることができる。この理由は、検体も一本鎖にすることにより、固定化されたＤＮＡとのハイブリダイゼーションの効率を高くすることが可能となるからである。
【００３３】
【実施例】
本発明を以下の実施例によって更に詳細に説明する。但し、本発明はこれら実施例によりその技術的範囲が限定されるものではない。
【００３４】
参考例１
スライドガラスの処理
スライドガラス（松浪ガラス（株）製、白縁磨フロストＮｏ．１）を３ｍｏｌ／ｌ、ＮａＯＨ水溶液に３０分浸し、次いで、超純水で十分に洗浄して乾燥した。そして、１０体積％３−アミノプロピルトリエトキシシランのアセトン溶液に５時間浸した。その後、スライドガラスを引き上げ、アセトンで洗浄した。乾燥後、１重量％グルタルアルデヒド水溶液に１時間浸した。このような処理を施すことにより、図２に示すように、ガラス表面に共有結合を介して、アルデヒド基を導入した。
【００３５】
ＤＮＡの処理
次の塩基配列を持つデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）４種類を合成した。
5'-GGGGCCATCCATAGTCTTCT AAAAAAAAAA TACACGCGTGTATACGTAGG-3'（ＤＮＡ１）
5'-CCATGGGGAAGGTGAAGGTC AAAAAAAAAA TACACGCGTGTATACGTAGG-3'（ＤＮＡ２）
5'-CCTACGTATACACGCGTGTA-3'（ＤＮＡ３；５’末端アミノ化）
5'-AGAAGACTGTGGATGGCCCC-3'（ＤＮＡ４；５’末端ＦＩＴＣ化）
なお、ＤＮＡ３の５’末端はアミノ化されており、また、ＤＮＡ４の５’末端は蛍光体であるＦＩＴＣ（Fluorescein-4-isothiocyanate）標識されている。また、ＤＮＡ１とＤＮＡ３の途中にあるＡの配列が続く部分は、スペーサーに当たる。
【００３６】
次に、ＤＮＡ１、ＤＮＡ２、ＤＮＡ３の３種類のＤＮＡを１０ｍｍｏｌ／ｌのＭｇＣｌ₂水溶液に溶解し、それぞれのＤＮＡの濃度を１００ｐｍｏｌ／μｌとした。ついで、ＤＮＡ１の溶液にＤＮＡ３の溶液を等量混合し、９５℃に一分間保持した後、徐々に冷却し、ＤＮＡ１とＤＮＡ３をハイブリダイゼーションした。これにより、末端（ＤＮＡ１の３’末端）から途中までが二本差であり、それから先は一本差であるＤＮＡを得た（以降ＤＮＡ５とする。ＤＮＡ５は長鎖部分がＤＮＡ１、短鎖部分がＤＮＡ３である）。同様に、ＤＮＡ２の溶液にＤＮＡ３の溶液を等量混合して、末端（ＤＮＡ２の３’末端）から途中までが二本差であり、それから先は一本差であるＤＮＡを得た（以降ＤＮＡ６とする。ＤＮＡ６は長鎖部分がＤＮＡ２、短鎖部分がＤＮＡ３である）。
【００３７】
ＤＮＡのスライドガラスへの固定
上記ＤＮＡ５とＤＮＡ６の溶液を針先で、先に調整したスライドガラスの上に点着した。これを湿度１００％のプラスチック容器に入れて、室温で一晩放置した。次いで、０．２重量％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）水溶液の中にスライドを入れ、２分間振とうし、さらに、純水中で２分間振とうした。さらに、１．５ｇのＮａＢＨ₄に４５０ｍｌのＰＢＳ（ＮａＣｌを８ｇ、Ｎａ₂ＨＰＯ₄・１２Ｈ₂Ｏを２．９ｇ、ＫＣｌを０．２ｇ、ＫＨ₂ＰＯ₄を０．２ｇ純水に溶かし１ｌにメスアップしたもの）、１００％エターノールを１３３ｍｌ加えた溶液を準備した。溶液の準備後、素早く前記スライドグラスをこの溶液に浸し、５分後、スライドガラスを取りだした。このようにして、ＤＮＡと結合していない、スライドガラス上の余分なアルデヒド基をブロッキングした。次いで、０．２重量％ＳＤＳ水溶液、純水の順に洗浄し、乾燥した。
【００３８】
検体とのハイブリダイゼーションとその結果
２×ＳＳＣ（２×ＳＳＣとは、ＮａＣｌ８７．６ｇ、Ｃ₆Ｈ₅Ｏ₇Ｎａ₃・２Ｈ₂Ｏ；クエン酸３ナトリウム水和物４４．２ｇを純水にとかし、１ｌにメスアップしたものである。またＮａＣｌを４３．８ｇ、クエン酸３ナトリウム水和物を２２．１ｇ純水にとかし、１ｌにメスアップしたものを１×ＳＳＣと表記し、これの１０倍濃縮液を１０×ＳＳＣ、５倍希釈液を０．２×ＳＳＣと表記する。）にＭｇＣｌ₂を溶解し、ＭｇＣｌ₂の濃度が１０ｍｍｏｌ／ｌとなるように調整した水溶液にＤＮＡ４を溶解し、ＤＮＡ４の濃度を５０ｐｍｏｌ／μｌとした。ＤＮＡ５とＤＮＡ６を固定化したスライドガラスにこの溶液を滴下し、室温で３０分放置してハイブリダイゼーションを行った。この際には、溶液が乾燥しないように、溶液の上にカバーガラスをかぶせた。次に、２×ＳＳＣの中でスライドグラスを揺らし、カバーガラスを自然に剥離し、洗浄した。さらに、１×ＳＳＣ、０．２×ＳＳＣの順に洗浄した。
【００３９】
ついで、このスライドグラスを蛍光顕微鏡で観察した。そのところ、ＤＮＡ５をスポットした部分からは、ＦＩＴＣからの蛍光が観察されたが、ＤＮＡ６をスポットした部分からは、蛍光は観察されなかった。
【００４０】
また、検体溶液中の検体量（ＤＮＡ４のモル数）を振って、検出限界を調べたところ、検出限界としては、検体量が数百ａｍｏｌと推定された。
【００４１】
参考例２
参考例１と同様なＤＮＡを用意し、スライドガラスにスポッティングする際の溶液とハイブリダイゼーションの際の溶液を、表１の水溶液に変化させた以外は、参考例１と同様な操作を行った。参考例１と同様に、ＤＮＡ５をスポットした部分からは、ＦＩＴＣからの蛍光が観察されたが、ＤＮＡ６をスポットした部分からは、蛍光は観察されなかった。また、表１に本参考例における、ＤＮＡ５をスポットした部分の蛍光強度を示す。
【００４２】
【表１】

【００４３】
この結果より、スポッティングする際の溶液とハイブリダイゼーションの際の溶液は、Ｍｇ、Ｃａを含むことがより好ましいとわかった。
【００４４】
比較例１
スライドガラスの調整
スライドガラス（松浪ガラス製、白縁磨フロストＮｏ．１）を３ｍｏｌ／ｌ、ＮａＯＨ溶液に３０分浸し、次いで、超純水で十分に洗浄して乾燥した。１０体積％のポリ−Ｌ−リシン（シグマ社製）水溶液に１時間浸水した。このものをプレート用遠心機で遠心し、室温にて乾燥した。
【００４５】
ＤＮＡの処理
次の塩基配列を持つデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）４種類を合成した。
5'-GGGGCCATCCATAGTCTTCT-3'（ＤＮＡ１１）
5'-CCATGGGGAAGGTGAAGGTC-3'（ＤＮＡ１２）
5'-AGAAGACTGTGGATGGCCCC-3'（ＤＮＡ１３；5'末端ＦＩＴＣ化）
ＤＮＡ１１とＤＮＡ１２は化学的な修飾は行っていない。ＤＮＡ１１とＤＮＡ１２を３×ＳＳＣに溶かしそれぞれのＤＮＡの濃度を１００ｐｍｏｌ／μｌとした。
【００４６】
ＤＮＡのスライドガラスへの固定
上記ＤＮＡ１１とＤＮＡ１２の溶液を針先で、先に調整したスライドガラスの上に点着した。乾燥後６０ｍＪのＵＶ光を当てて、クロスリンキングした。次に、ＤＮＡと結合していないスライドガラス表面の余計なアミノ基をブロックするため、ホウ酸、純水、ｐＨ調整用ＮａＯＨ、無水コハク酸、１―メチル−２−ピロリドンを混合した溶液（無水コハク酸３ｇを１８７ｍｌ１―メチル−２−ピロリドンに溶解し、使用直前に１７ｍｌ１ＭＮａ−ｂｏｒａｔｅ(ｐＨ８．０) 溶液を加えたもの）に核酸が固定された面を浸し、振とうした。その後、洗浄して乾燥した。
【００４７】
検体とのハイブリダイゼーションとその結果
２×ＳＳＣの水溶液にＤＮＡ１３を溶解し、ＤＮＡ１３の濃度を５０ｐｍｏｌ／μｌとした。ＤＮＡ１１とＤＮＡ１２を固定化したスライドガラスにこの溶液を滴下し、室温で３０分放置してハイブリダイゼーションを行った。この際には、溶液が乾燥しないように、溶液の上にカバーガラスをかぶせた。次に、２×ＳＳＣの中でスライドグラスを揺らし、カバーガラスを自然に剥離し、洗浄した。さらに、１×ＳＳＣ、０．２×ＳＳＣの順に洗浄した。
【００４８】
ついで、このスライドグラスを蛍光顕微鏡で観察した。そのところ、ＤＮＡ１１をスポットした部分からは、ＦＩＴＣからの蛍光が観察されたが、ＤＮＡ１２をスポットした部分からは、蛍光は観察されなかった。しかしながら、ＦＩＴＣからの蛍光の強度は、参考例１の１／１０であった。これは、本比較例ではスライドガラス上に固定化されたＤＮＡの量が少ないため、結果的にハイブリダイゼーションできる検体ＤＮＡが少なく、蛍光が弱くなったものであると推定された。
【００４９】
比較例２
スライドガラスの調整は参考例１と同様に行った。
【００５０】
ＤＮＡの処理
次の塩基配列を持つデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）４種類を合成した。
5'-GGGGCCATCCATAGTCTTCT-3'（ＤＮＡ１４；5'末端アミノ化）
5'-CCATGGGGAAGGTGAAGGTC-3'（ＤＮＡ１５；5'末端アミノ化）
5'-AGAAGACTGTGGATGGCCCC-3'（ＤＮＡ１６；5'末端ＦＩＴＣ化）
ＤＮＡ１４とＤＮＡ１５をＰＢＳに溶かしそれぞれ濃度１００ｐｍｏｌ／μｌとした。
【００５１】
ＤＮＡのスライドガラスへの固定
上記ＤＮＡ１４とＤＮＡ１５の溶液を針先で、先に調整したスライドガラスの上に点着した。これを湿度１００％のタッパーに入れて、室温で一晩放置した。次いで、０．２重量％ＳＤＳ水溶液の中にスライドを入れ、２分間振とうし、さらに、純水中で２分間振とうした。ついで、１．５ｇのＮａＢＨ₄を４５０ｍｌのＰＢＳに溶かし、１００％エターノールを１３３ｍｌ加えた溶液を準備した。素早く前記スライドグラスをこの溶液に浸した。５分後、スライドを取りだした。このようにして、ＤＮＡと結合していないスライドガラス上の余分なアルデヒド基をブロッキングした。次いで、０．２％ＳＤＳ水溶液、純水の順に洗浄し、乾燥した。
【００５２】
検体とのハイブリダイゼーションとその結果
２×ＳＳＣ水溶液にＤＮＡ１６を溶解し、ＤＮＡ１６の濃度を５０ｐｍｏｌ／μｌとした。ＤＮＡ１４とＤＮＡ１５を固定化したスライドガラスにこの溶液を滴下し、室温で３０分放置してハイブリダイゼーションを行った。この際には、溶液が乾燥しないように、溶液の上にカバーガラスをかぶせた。次に、２×ＳＳＣの中でスライドグラスを揺らし、カバーガラスを自然に剥離し、洗浄した。さらに、１×ＳＳＣ、０．２×ＳＳＣの順に洗浄した。
【００５３】
ついで、このスライドグラスを蛍光顕微鏡で観察した。そのところ、ＤＮＡ１４をスポットした部分からは、ＦＩＴＣからの蛍光が観察されたが、ＤＮＡ１５をスポットした部分からは、蛍光は観察されなかった。しかしながら、ＤＮＡ１４をスポットした部分からのＦＩＴＣからの蛍光の強度は、参考例１の１／１０であった。これは、本比較例ではスライドガラス上に固定化されたＤＮＡの量が少ないため、結果的にハイブリダイゼーションできる検体ＤＮＡが少なく、蛍光が弱くなったものであると推定された。
【００５４】
実施例１
スライドガラスの調整は、参考例１と同様に行った。
【００５５】
ＤＮＡの処理
参考例１で用いた、ＤＮＡ１〜ＤＮＡ６に加えて、ＤＮＡ３と相補的な塩基配列を有するＤＮＡ７を準備した。ＤＮＡ７の具体的な塩基配列は、以下のようになる。
5'-TACACGCGTGTATACGTAGG-3'（ＤＮＡ７）
なお、ＤＮＡ７は化学的な修飾を施していない。
【００５６】
次に、ＤＮＡ７を１０ｍｍｏｌ／ｌのＭｇＣｌ₂水溶液に溶解し、ＤＮＡの濃度を１００ｐｍｏｌ／μｌとした。同様に調整したＤＮＡ３と、ＤＮＡ７の溶液を等量混合して、９５℃に一分間保持した後、徐々に冷却した。このようにして、ＤＮＡ３とＤＮＡ７からなる二本鎖核酸を準備した（以降ＤＮＡ８とする。）。
【００５７】
ＤＮＡのスライドガラスへの固定
参考例１と同様に準備したＤＮＡ５（部分二本鎖核酸）の溶液と、ＤＮＡ８（二本鎖核酸）の溶液を等量混合した。また、同様に調整したＤＮＡ６（部分二本鎖核酸）の溶液とＤＮＡ８（二本鎖核酸）の溶液を等量混合した。次いで、これらの混合核酸溶液を参考例１と同様にスライドガラス上に固定化した。このようにして、スライドグラス上の各々の領域に部分二本鎖核酸と二本鎖核酸の両方を固定した。
【００５８】
検体とのハイブリダイゼーションとその結果
次いで、参考例１と同様にＤＮＡ４を調整し、ハイブリダイゼーションを行い、参考例１と同様な測定を行った。その結果、ＤＮＡ５とＤＮＡ８の両方がスポットされている部分からは、ＦＩＴＣの蛍光が観察されたが、ＤＮＡ６とＤＮＡ８の両方がスポットされている部分からは蛍光は観察されなかった。一方、ＤＮＡ５がスポットされている領域からの蛍光の強度は、参考例１の１．６倍であった。
【００５９】
このように、担体上のプローブ（固定化された部分二本鎖核酸）の密度を調整すると、Ｓ／Ｎが改善できることがわかった。
【００６０】
参考例３
担体上への電極の作製
スライドガラスにクロム、金の順にスパッタリングを行い、面積１ｍｍ^２、表面が金である電極をスライドガラス上に作製した。なお、クロムと金の厚さはそれぞれ、５ｎｍ、５００ｎｍとした。なお、一つのスライドガラス上には、８個の電極を設け、各々外部に出力する端子を設けた。
【００６１】
ＤＮＡの処理
次の塩基配列を持つデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）４種類を合成した。
5'-GGGGCCATCCATAGTCTTCT AAAAAAAAAA TACACGCGTGTATACGTAGG-3'（ＤＮＡ２１）
5'-CCATGGGGAAGGTGAAGGTC AAAAAAAAAA TACACGCGTGTATACGTAGG-3'（ＤＮＡ２２）
5'-CCTACGTATACACGCGTGTA-3'（ＤＮＡ２３；５’チオール化）
5'-AGAAGACTGTGGATGGCCCC-3'（ＤＮＡ２４）。
【００６２】
なお、ＤＮＡ２３の５’末端はチオール化されている。その他のＤＮＡは、化学的な修飾を行っていない。また、ＤＮＡ２１とＤＮＡ２３の途中にあるＡの配列が続く部分は、スペーサーに当たる。
【００６３】
次に、ＤＮＡ２１、ＤＮＡ２２、ＤＮＡ２３の３種類のＤＮＡを１０ｍｍｏｌ／ｌのＭｇＣｌ₂水溶液に溶解し、それぞれのＤＮＡの濃度を１００ｐｍｏｌ／μｌとした。ついで、ＤＮＡ２１の溶液にＤＮＡ２３の溶液を等量混合し、９５℃に一分間保持した後、徐々に冷却し、ＤＮＡ２１とＤＮＡ２３をハイブリダイゼーションした。これにより、末端（ＤＮＡ２１の３’末端）から途中までが二本差であり、それから先は一本差であるＤＮＡを得た（以降ＤＮＡ２５とする。ＤＮＡ２５は長鎖部分がＤＮＡ２１、短鎖部分がＤＮＡ２３である）。同様に、ＤＮＡ２２の溶液にＤＮＡ２３の溶液を等量混合して、末端（ＤＮＡ２２の３’末端）から途中までが二本差であり、それから先は一本差であるＤＮＡを得た（以降ＤＮＡ２６とする。ＤＮＡ２６は長鎖部分がＤＮＡ２２、短鎖部分がＤＮＡ２３である）。
【００６４】
ＤＮＡの電極への固定
上記ＤＮＡ２５とＤＮＡ２６の溶液を１０μｌを電極全体が浸されるように滴下して、乾燥しないように注意しながら、４℃で２時間放置した。なお、ＤＮＡ２５はスライドガラス上のうち４つの電極に滴下した。また、ＤＮＡ２６は、それ以外の残りの電極に滴下した。次いで、電極を純水で洗浄した。これにより、電極上にＤＮＡ２５、ＤＮＡ２６を電極上に固定した。
【００６５】
検体とのハイブリダイゼーションとその結果
続いて、２×ＳＳＣ（２×ＳＳＣとは、ＮａＣｌ８７．６ｇ、Ｃ₆Ｈ₅Ｏ₇Ｎａ₃・２Ｈ₂Ｏ；クエン酸３ナトリウム水和物４４．２ｇを純水にとかし、１ｌにメスアップしたもの）水溶液にＤＮＡ２４を溶解し、ＤＮＡ２４の濃度を５０ｐｍｏｌ／μｌとした。ＤＮＡ２５とＤＮＡ２６を固定化した電極に、この溶液を滴下して、４０℃で３０分放置してハイブリダイゼーションを行った。この際には、溶液が乾燥しないように、溶液の上にカバーガラスをかぶせた。次いで、カバーガラスを静かに剥離し洗浄した。ハイブリダイゼーション後、１０μｍｏｌ／ｌのヘキスト３３２５８溶液中でボルタンメトリーを行い、ヘキスト３３２５８の酸化電流値を測定した。そのときの条件は、掃引速度１００ｍＶ／ｓ、掃引範囲−２００ｍＶから＋８００ｍＶとした。そして、電位が７００ｍＶ付近の電流ピークを測定した。なお、ハイブリダイゼーションを行う前にも同様な測定で電流ピークを測定しておき、ハイブリダイゼーション前後での電流ピークの差を、計８つの電極について、それぞれ求めた。その結果を表２に示す。
【００６６】
【表２】

【００６７】
以上より、電極に固定されたＤＮＡと検体ＤＮＡとがハイブリダイゼーションを形成したかどうかを再現性良く検出できることが分かった。
【００６８】
また、検体溶液中の検体量（ＤＮＡ２４のモル数）を振って、検出限界を調べたところ、検出限界としては、検体量が数十ａｍｏｌと推定された。
【００６９】
参考例４
参考例３と同様なＤＮＡを用意し、電極上に滴下する際の溶液を表３の水溶液に変化させた以外は、参考例３と同様な操作を行った。表３にその結果を示す。なお、ＰＢＳとは、ＮａＣｌを８ｇ、Ｎａ_２ＨＰＯ_４・１２Ｈ_２Ｏを２．９ｇ、ＫＣｌを０．２ｇ、ＫＨ_２ＰＯ_４を０．２ｇ純水に溶かし１ｌにメスアップしたものである。
【００７０】
【表３】

【００７１】
電極に点着する際の溶液が２価もしくは３価のカチオンを含まない場合、再現性にとぼしいことが分かった。またこのカチオンのうちでもＭｇ、Ｃａのカチオンが溶液中に含まれている場合、Ｓ／Ｎが良好となることがわかった。
【００７２】
実施例２
担体上への電極の作製
参考例３と同様に行った。
【００７３】
ＤＮＡの処理
参考例３で用いた、ＤＮＡ２１〜ＤＮＡ２６に加えて、ＤＮＡ２３と相補的な塩基配列を有するＤＮＡ２７を準備した。ＤＮＡ２７の具体的な塩基配列は以下のようになる。
5'-TACACGCGTGTATACGTAGG-3'（ＤＮＡ２７）
なお、ＤＮＡ２７は化学的な修飾を施していない。
【００７４】
次に、ＤＮＡ２７を１０ｍｍｏｌ／ｌのＭｇＣｌ₂水溶液に溶解し、ＤＮＡの濃度を１００ｐｍｏｌ／μｌとした。同様に調整したＤＮＡ２３と、ＤＮＡ２７の溶液を等量混合して、９５℃に一分間保持した後、徐々に冷却した。このようにして、ＤＮＡ２３とＤＮＡ２７からなる二本鎖核酸を準備した（以降ＤＮＡ２８とする。）。
【００７５】
ＤＮＡの電極への固定
参考例３と同様に準備したＤＮＡ２５（部分二本鎖核酸）の溶液と、ＤＮＡ２８（二本鎖核酸）の溶液を等量混合した。次いで、この混合した溶液を参考例３と同様の電極を設けた担体上に、参考例３と同様に電極に固定した。また、同様に調整したＤＮＡ２６（部分二本鎖核酸）の溶液とＤＮＡ２８（二本鎖核酸）の溶液を等量混合し、同様に電極に固定した。このようにして、各々の電極に部分二本鎖核酸と二本鎖核酸の両方を固定した。
【００７６】
検体とのハイブリダイゼーションとその結果
次いで、参考例３と同様にＤＮＡ２４を調整して、ハイブリダイゼーションを行い、参考例３と同様の測定を行った。その結果を表４に示す。
【００７７】
【表４】

【００７８】
このように電極上のプローブ（固定化された部分二本鎖核酸）の密度を調整すると、Ｓ／Ｎが改善できることが分かった。また、再現性にも問題がなかった。
【００７９】
比較例３
担体上への電極の作製
参考例３と同様に行った。
【００８０】
ＤＮＡの処理
次の塩基配列を持つデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）４種類を合成した。
5'-GGGGCCATCCATAGTCTTCT-3'（ＤＮＡ３１；５’末端チオール化）
5'-CCATGGGGAAGGTGAAGGTC-3'（ＤＮＡ３２；５’末端チオール化）
5'-AGAAGACTGTGGATGGCCCC-3'（ＤＮＡ３３）
ＤＮＡ３１とＤＮＡ３２は５’末端をチオール化した。一方ＤＮＡ３３は、化学的な修飾は行っていない。ＤＮＡ３１とＤＮＡ３２を１０ｍｍｏｌ／ｌのＭｇＣｌ₂水溶液に溶解し、それぞれのＤＮＡの濃度を１００ｐｍｏｌ／μｌとした。
【００８１】
ＤＮＡの電極への固定
上記ＤＮＡ３１とＤＮＡ３２の溶液１０μｌを電極全体が浸されるように滴下して、乾燥しないように注意しながら、４℃で２時間放置した。なお、ＤＮＡ３１はスライドガラス上のうち４つの電極に滴下した。また、ＤＮＡ３２は、それ以外の残りの電極に滴下した。次いで、電極を純水で洗浄した。これにより、電極上にＤＮＡ３１、ＤＮＡ３２を電極上に固定した。
【００８２】
検体とのハイブリダイゼーションとその結果
２×ＳＳＣの水溶液にＤＮＡ３３を溶解し、ＤＮＡ３３の濃度を５０ｐｍｏｌ／μｌとした。ＤＮＡ３１とＤＮＡ３２を固定化した電極上にこの溶液を滴下し、４０℃で３０分放置してハイブリダイゼーションを行った。この際には、溶液が乾燥しないように、溶液の上にカバーガラスをかぶせた。次いで、カバーガラスを静かに剥離した後、洗浄し、反応後、参考例３と同様に、１０μｍｏｌ／ｌのヘキスト３３２５８溶液中でボルタンメトリーを行い、ヘキスト３３２５８の酸化電流値を測定した。その結果を表５に示す。
【００８３】
【表５】

【００８４】
これより、この方法では、電流値のばらつきが大きく、再現性にとぼしいことが分かった。
【００８５】
【発明の効果】
本発明によれば、あらかじめ調整した多種類の核酸を担体表面に高密度で固定化できる。このため、検出する際のＳ／Ｎが良好である。また、データの再現性も改善でき、かつ、低コストで核酸固定化担体を製造できる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明で用いる部分二本鎖核酸の模式図
【図２】担体に部分二本鎖核酸を固定化したときの模式図
【図３】参考例１で行った、ガラス表面処理の模式図
【符号の説明】
１長い核酸分子
２短い核酸分子
４官能基
６担体
７ガラス基板[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a DNA chip that is very useful for simultaneous analysis of gene expression, mutation, polymorphism and the like.
[0002]
[Prior art]
Research on genetic information analysis of various organisms is underway, including human genes, many genes and their base sequences, proteins encoded by the gene sequences, and information on sugar chains that are secondarily produced from these proteins Is being revealed rapidly. The functions of biopolymers such as genes, proteins, and sugar chains whose sequences have been clarified can be examined by various methods. Mainly, with respect to nucleic acids, the relationship between various genes and their expression of biological functions can be examined by utilizing complementarity between various nucleic acids / nucleic acids such as Northern hybridization or Southern hybridization. With respect to proteins, the function and expression of proteins can be examined using protein / protein reactions, as typified by Western hybridization.
[0003]
In recent years, a new analysis method or methodology called a DNA microarray method (DNA chip method) has been developed as a method for analyzing a large number of gene expressions at once, and has attracted attention, and some of them are sold. In principle, these methods are the same as the conventional methods in that they are nucleic acid detection / quantification methods based on a nucleic acid / nucleic acid hybridization reaction. These techniques have a great feature in that a large number of DNA fragments are aligned and fixed on a flat substrate piece called a microarray or a chip. As a specific method of using the microarray method, for example, a sample obtained by labeling a gene expressed in a cell to be studied with a fluorescent dye or the like is hybridized on a flat substrate piece, and complementary nucleic acids (DNA or RNA) are bound to each other. Examples of the method include a method in which the portion is labeled with a fluorescent dye and then read with a high resolution analyzer at high speed, and a method of detecting a response such as a current value based on an electrochemical reaction.
In this way, the expression level of each gene in the sample can be quickly estimated.
[0004]
As a technique for immobilizing nucleic acid on a substrate, as in the Northern method, in addition to a method of immobilizing on a nylon sheet or the like, a method of immobilizing by coating polylysine or the like on a substrate of glass or the like Has been developed.
[0005]
Generally, the following method is used as a method for immobilizing DNA prepared in advance on the surface of a solid phase carrier. That is, the DNA to be immobilized is amplified by PCR, and the product (DNA fragment amplified by the PCR method) is spotted on the surface of a solid phase carrier surface-treated with polycation using a DNA chip production apparatus. Generally, the solid phase carrier is electrostatically coupled using electric charge, and then excess cations are blocked.
[0006]
As a special method, an array of microelectrodes is produced on a silica DNA chip, and an agarose permeation layer containing streptavidin is provided on the electrode to serve as a reaction site. There is a method of immobilizing biotinylated DNA by positively charging this site and controlling the charge of the site to enable high-speed and precise hybridization (Sosnowski, RG et al. Proc. Natl. .Acad.Sci.USA94, 1119-1123 (1997)).
[0007]
As a modification of the method using the charge of DNA, an amino group-modified PCR product is suspended in SSC (citrate buffered saline), spotted on a silylated glass slide, incubated, A method of sequentially performing treatment with sodium borohydride and heat treatment has been reported (Schena, M. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 10614-10619 (1996)).
[0008]
In addition, in the method based on electrochemical reaction, a thiol group is introduced into the 5 ′ or 3 ′ end of single-stranded DNA on an electrode such as gold or silver, and a coordinate bond between gold, silver or the like and sulfur is formed. It is common to be fixed via. Then, the DNA immobilized on the electrode and the specimen are hybridized. After that, it is common to distinguish between single-stranded DNA and double-stranded DNA, and to read the electrochemical signal (oxidation current value) from a ligand that specifically binds to double-stranded DNA (double-stranded binding ligand) Has been used.
[0009]
[Problems to be solved by the invention]
However, since the amount of DNA that can be immobilized cannot be made constant in the above-described immobilization method, double-stranded DNA (for example, PCR product) is immobilized because the data varies at each measurement and the data cannot be reproducible. In some cases, the melting point (temperature at which the double strands dissociate into single strands) of the various DNAs that are spotted is not uniform, and single-stranded DNA that cannot be hybridized in an optimal state (for example, When the synthetic oligo DNA is immobilized, the immobilized single-stranded DNA itself has a higher-order structure and cannot be hybridized in an optimum state. Furthermore, the density of the DNA immobilized on the substrate It has various problems such as being small and consequently unable to detect a low expression gene. In order to solve such a problem, it is necessary to fundamentally solve this problem, increase the efficiency of DNA immobilization, and develop a method for immobilizing DNA at a low cost.
[0010]
A specific object of the present invention is to provide a nucleic acid-immobilized carrier on which many types of nucleic acids prepared in advance on the surface of the carrier are efficiently and densely immobilized and can be produced at low cost.
[0011]
[Means for Solving the Problems]
  That is, the present invention is a nucleic acid immobilization carrier on which a nucleic acid is immobilized,
a) the immobilized nucleic acid forms a partial double strand consisting of a long nucleic acid molecule and a short nucleic acid molecule;
b) The partial double-stranded nucleic acid is double-stranded in the length direction from the vicinity of one end of the nucleic acid, and is otherwise single-stranded,
c) On the terminal side forming the double strand of the partial double-stranded nucleic acid, the end of the short nucleic acid molecule is immobilized on the carrier,
d) Two or more types of partial double-stranded nucleic acids having different base sequences of long nucleic acid molecules of the partial double-stranded nucleic acid are immobilized in different regions on the carrier,
e) All or some of the short nucleic acid molecules of the immobilized partial double-stranded nucleic acid have a common base sequence.Shi,
f) Both partial double-stranded nucleic acid and double-stranded nucleic acid are immobilized in the same region on the carrier,
A) ~fA nucleic acid-immobilized carrier characterized by satisfying all of
[0012]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
Details of the nucleic acid polymer-immobilized carrier of the present invention will be described below.
[0013]
1. Carrier
Preferred examples of the carrier include those made of inorganic materials such as glass and silicon, and polymers such as polyethylene terephthalate, polycarbonate, polystyrene, cellulose acetate, and polymethyl methacrylate (PMMA). These need to be solid. Glass and silicon are particularly preferable because of excellent chemical resistance and easy surface treatment. In these carriers, functional groups such as amino groups, carboxyl groups, aldehyde groups, and epoxy groups are preferably introduced into the substrate surface by covalent bonds. Among these functional groups, an amino group and an aldehyde group are particularly preferable. Such a functional group can be obtained by treating the carrier surface with a silane coupling agent. Examples of such silane coupling agents include 3-aminopropyltriethoxysilane, 3-aminopropyltrimethoxysilane, 3-aminopropyldiethoxymethylsilane, 3- (2-aminoethylaminopropyl) trimethoxysilane, 3- (2-aminoethylaminopropyl) dimethoxymethylsilane, 3-mercaptopropyltrimethoxysilane, dimethoxy-3-mercaptopropylmethylsilane and the like.
[0014]
Furthermore, the carrier is preferably a solid phase carrier that is hydrophobic or poorly hydrophilic. The shape of the carrier can be preferably a flat shape such as a slide glass or a silicon wafer, but is not particularly limited.
[0015]
In addition, a carrier made of an inorganic material typified by glass or silicon, or a carrier provided with an electrode on a polymer such as polyethylene terephthalate, polycarbonate, polystyrene, cellulose acetate, or polymethyl methacrylate (PMMA) is prepared. Nucleic acids may be immobilized. Such a carrier is preferably capable of detecting hybridization by an electrochemical method.
[0016]
Preferred examples of the electrode include metals such as gold, silver, and platinum, carbon, ITO, and the like. Among these, gold is preferably used. The reason is that, as will be described later, it is easy to immobilize a nucleic acid by a coordinate bond between gold and a thiol group. In addition, if a large number of electrodes are provided on the carrier, a terminal for outputting to each electrode is provided, and nucleic acids having different base sequences are immobilized on each electrode, a large number of gene expressions, mutations, Simultaneous analysis of polymorphism and the like is possible. At this time, it is preferable that the area of the portion where the nucleic acid of each electrode is immobilized is the same.
[0017]
2. Nucleic acid
The nucleic acid to be immobilized on the carrier of the present invention includes DNA, RNA, and PNA, and DNA is particularly preferable. A schematic diagram of the partial double-stranded nucleic acid referred to in the present invention is shown in FIG. That is, the partial double-stranded nucleic acid referred to in the present invention refers to a nucleic acid that partially forms a double strand consisting of a long nucleic acid molecule and a short nucleic acid molecule. That is, the whole nucleic acid does not form a double strand, but a portion of the nucleic acid forms a double strand and the other portion is a single strand. In addition, as shown in FIG. 1, the partial double-stranded nucleic acid of the present invention needs to form a double strand from the vicinity of the end to the middle and be a single strand in other portions. In the present invention, the term “near the end of a nucleic acid” refers to within 10 bases from the end (5 ′ end or 3 ′ end) of the nucleic acid.
[0018]
FIG. 2 shows a schematic diagram when the nucleic acid is immobilized on the surface of the carrier. According to the present invention, the double-stranded portion makes it possible to “stand” the nucleic acid immobilized on the carrier, and as a result, the nucleic acid can be efficiently immobilized at a high density on the surface of the carrier. . If the single-stranded portion is used as a portion that reacts (hybridizes) with the sample nucleic acid, the hybridization between the sample and the immobilized nucleic acid can be accelerated.
[0019]
In the present invention, it is preferable to bind the nucleic acid to the carrier by a covalent bond. Therefore, it is preferable to chemically modify the nucleic acid. A specific example will be described below. First, a single-stranded nucleic acid having a functional group introduced at the 5 'end or 3' end is prepared. The length of this nucleic acid is not particularly limited, but is preferably about 5 mer to 200 mer. A more preferred range is between 10 mer and 50 mer. More preferably, it is between 10 mer and 30 mer. Examples of the functional group introduced at the end of the nucleic acid include amino groups, aldehyde groups, thiol groups, biotin, phosphate groups, and —SH groups (thiol groups). Among these, amino groups and thiol groups are preferred. It can be particularly preferably used. For example, with respect to the introduction of an amino group, a known method for introducing an aliphatic hydrocarbon chain having an amino group into the phosphoric acid at the 5 ′ end of DNA (for example, Nucleic Acids Res., 11 (18), 6153- (1983) ) Can be used. However, preferably, it may be chemically synthesized so as to introduce a functional group at the 5 'end or 3' end of the oligonucleotide. It is necessary to prepare another single-stranded nucleic acid at this end. Another single-stranded nucleic acid has a base sequence complementary to the base sequence from the vicinity of the functional group side end of the nucleic acid into which the functional group is introduced. This nucleic acid needs to be longer than a nucleic acid into which a functional group has been introduced for the reasons described below. Then, the above two nucleic acids are hybridized to prepare a nucleic acid (partial double-stranded nucleic acid) that is double-stranded from the end where the functional group has been introduced to the middle, and otherwise single-stranded. The conditions for hybridization at this time are not particularly limited, and examples thereof include a method of mixing the two kinds of nucleic acid solutions, raising the temperature to about 95 ° C., and then annealing. The single-stranded portion becomes a portion that hybridizes with the specimen. A preferred range for the length of the single-stranded portion is 10 to 100 in terms of the number of bases, and particularly preferably 15 to 70. When the number of bases is greater than 100, the single-stranded portion may take a higher order structure. On the other hand, if the number of bases is smaller than 10, it is thermally unstable even after hybridization, and as a result may not be detected.
[0020]
A nucleic acid having both a single-stranded portion and a double-stranded portion (partial double-stranded nucleic acid) and a functional group described above are introduced by a covalent bond at the terminal thus adjusted. The carrier is bound. For example, when an amino group is introduced at the DNA end and a carboxyl group is present on the carrier surface, a condensing agent such as 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC) or an amino group is introduced at the DNA end In the case where an amino group is present on the surface of the carrier, a covalent bond can be formed using a cross-linking agent such as glutaraldehyde. When an amino group is introduced at the DNA terminal and an aldehyde group is present on the surface of the carrier, covalent bonding can be achieved by spotting an aqueous solution of the DNA onto the surface of the carrier. The temperature for covalent bonding is preferably 5 ° C to 95 ° C, and more preferably 15 ° C to 65 ° C. The treatment time is usually 5 minutes to 24 hours, preferably 1 hour or longer.
[0021]
When a functional group is introduced at the terminal thus adjusted and a nucleic acid having both a single-stranded part and a double-stranded part (partial double-stranded nucleic acid) is bound to the electrode described above Then, you can do as follows. That is, when gold is used as the electrode by introducing a thiol group at the end of the partial double nucleic acid, a solution containing the nucleic acid is dropped or spotted on the gold electrode, and left for several hours to leave the nucleic acid on the electrode. Can be fixed.
[0022]
In addition, from the viewpoint of adjusting the density of the probe (immobilized partial double-stranded nucleic acid), prepare another double-stranded nucleic acid having the same length as the double-stranded portion of the partial double-stranded nucleic acid. A means for mixing and fixing to the electrode is also preferably used.
[0023]
In the present invention, it is necessary to immobilize two or more types having different base sequences of the single-stranded portion of the partial double-stranded nucleic acid (that is, the base sequence of the long nucleic acid molecule) on the carrier. Specifically, each partial double-stranded nucleic acid having a different base sequence of such a single-stranded part is separately made into a solution. Then, for example, using a commercially available DNA chip production apparatus, each partial double-stranded nucleic acid solution can be spotted on separate spots, and various kinds of partial double-stranded nucleic acids can be immobilized on the surface of the carrier. In this case, in the same spot spotted on the carrier, the partial double-stranded nucleic acid immobilized on the carrier is of the same type, but if the spot is different, the part of the single-stranded part having a different base sequence The double-stranded nucleic acid is immobilized on the carrier. However, if the spots are different, the partial double-stranded nucleic acid contained therein does not necessarily have to be different. That is, even if the spots are different, the immobilized partial double-stranded nucleic acids may be the same. What is important in the present invention is that two or more types of partial double-stranded nucleic acids having different single-stranded base sequences are immobilized. By immobilizing various partial double-stranded nucleic acids on the carrier in this way, it is possible to simultaneously analyze gene expression, mutation, polymorphism, etc. by a single reaction (hybridization) with a sample.
[0024]
As described above, when the length of a nucleic acid molecule introduced with a functional group at the end is longer, and conversely, when the length of the nucleic acid molecule introduced with a functional group at the end is shorter, There are the following differences.
[0025]
First, when a single-stranded nucleic acid introduced with a functional group at its end is shorter than a single-stranded nucleic acid into which a functional group has not been introduced, a variety of partially double-stranded nucleic acids are immobilized on a carrier. There are such advantages. At this time, if the base sequence of the double-stranded portion is the same regardless of the type of the partial double-stranded nucleic acid (that is, all the short nucleic acid molecules of the immobilized partial double-stranded nucleic acid are the same) It has a base sequence (the part 2 is common in FIG. 2), and only one kind of nucleic acid (short nucleic acid molecule) having a functional group introduced at the end may be prepared. In general, the cost of introducing a functional group at the end of a nucleic acid is high, but in such a case, the cost can be significantly reduced. Further, not all of the short nucleic acid molecules of the immobilized partial double-stranded nucleic acid have a common base sequence, and among the immobilized partial double-stranded nucleic acids, the base sequence of some of the short nucleic acid molecules The same effect can be obtained even when is common. Conversely, if the single-stranded nucleic acid introduced with a functional group at its end is longer than the single-stranded nucleic acid without a functional group introduced, the functional group is equivalent to the type of partial double-stranded nucleic acid immobilized on the carrier. Is a disadvantage in terms of cost.
[0026]
In the present invention, the solution to be dissolved when the DNA is immobilized on a carrier is a general solution such as SSC (citrate buffered saline), PBS (phosphate buffered saline), Tris-HCl, or the like. Although it can be used, it is preferable that a divalent or trivalent cation is contained in the solution. Examples of such a solution include solutions containing cations such as Ba, Ca, Mg, Al, Mn, Se, Zn, Cr, Ga, Fe, Cd, Co, Ni, and Mo. Among these, a solution containing Mg and Ca cations is particularly preferable. Specifically, MgCl₂, MgBr₂, Mg (C₂H_ThreeO₂)₂, MgI₂, Mg (NO_Three)₂, MgSO_Four, CaCl₂, CaI₂, Ca (NO_Three)₂The solution containing these is mentioned.
[0027]
The nucleic acid molecule-immobilized carrier obtained by the present invention uses a single-stranded portion of the immobilized nucleic acid as a probe and reacts with the sample to perform hybridization, whereby the nucleic acid having a specific base sequence in the sample is obtained. Can be used for detection.
[0028]
For detecting the hybrid, a known means capable of specifically recognizing the hybrid can be used.
[0029]
Among these, the electrochemical method is preferable because it is not necessary to label the sample nucleic acid. In this case, there is a means for distinguishing between single-stranded DNA and double-stranded DNA and reading an electrochemical signal (oxidation current value) by a ligand (double-stranded binding ligand) that specifically binds to double-stranded DNA. Can be mentioned. Examples of the ligand include well-known ligands such as Hoechst 33258, methylene blue, and FND (Ferrocenyl naphthalene diimide).
[0030]
The result of the reaction between the DNA immobilized on the electrode and the sample DNA can be determined by applying a potential to the electrode and measuring the current flowing at that time. Cyclic voltammetry, potentiostat, etc. can be preferably used.
[0031]
On the other hand, when a label (fluorescent substance, luminescent substance, radioisotope, etc.) is allowed to act on the nucleic acid in the specimen, the hybrid can be detected by detecting this label. There are no restrictions on the type of the labeled body and the method for introducing the labeled body, and various conventionally known means can be used.
[0032]
In addition, the sample used for the nucleic acid molecule-immobilized carrier of the present invention is preferably single-stranded. Examples of such include cDNA synthesized from mRNA by reverse transcription. This is because the efficiency of hybridization with the immobilized DNA can be increased by making the specimen also single-stranded.
[0033]
【Example】
The invention is illustrated in more detail by the following examples. However, the technical scope of the present invention is not limited by these examples.
[0034]
  Reference example 1
  Glass slide processing
  A slide glass (manufactured by Matsunami Glass Co., Ltd., white edge polished frost No. 1) was dipped in 3 mol / l of an aqueous NaOH solution for 30 minutes, and then thoroughly washed with ultrapure water and dried. Then, it was immersed in an acetone solution of 10% by volume 3-aminopropyltriethoxysilane for 5 hours. Thereafter, the slide glass was pulled up and washed with acetone. After drying, it was immersed in an aqueous 1% glutaraldehyde solution for 1 hour. By performing such treatment, an aldehyde group was introduced into the glass surface through a covalent bond as shown in FIG.
[0035]
DNA processing
Four types of deoxyribonucleic acid (DNA) having the following base sequences were synthesized.
5'-GGGGCCATCCATAGTCTTCT AAAAAAAAAA TACACGCGTGTATACGTAGG-3 '(DNA1)
5'-CCATGGGGAAGGTGAAGGTC AAAAAAAAAA TACACGCGTGTATACGTAGG-3 '(DNA2)
5'-CCTACGTATACACGCGTGTA-3 '(DNA3; 5' terminal amination)
5'-AGAAGACTGTGGATGGCCCC-3 '(DNA4; 5' terminal FITC)
The 5 'end of DNA3 is aminated, and the 5' end of DNA4 is labeled with FITC (Fluorescein-4-isothiocyanate) which is a fluorescent substance. Further, the part of the DNA 1 and the DNA 3 in the middle of the sequence A corresponds to a spacer.
[0036]
Next, three kinds of DNA, DNA1, DNA2, and DNA3, were added to 10 mmol / l MgCl.₂It melt | dissolved in the aqueous solution and the density | concentration of each DNA was 100 pmol / microliter. Next, an equal amount of the DNA3 solution was mixed with the DNA1 solution, kept at 95 ° C. for 1 minute, and then gradually cooled to hybridize DNA1 and DNA3. As a result, a DNA having a double difference from the end (3 ′ end of DNA1) to the middle and then a single difference was obtained (hereinafter referred to as DNA5. DNA5 has a long chain portion of DNA1 and a short chain portion. Is DNA3). Similarly, an equal amount of the DNA3 solution was mixed with the DNA2 solution to obtain a DNA having two differences from the end (3 ′ end of DNA2) to the middle, and then a single difference (hereinafter DNA6). DNA6 has a long chain part of DNA2 and a short chain part of DNA3).
[0037]
Fixation of DNA to glass slide
The solution of DNA5 and DNA6 was spotted on the slide glass prepared earlier with a needle tip. This was put in a 100% humidity plastic container and left overnight at room temperature. Next, the slide was placed in a 0.2 wt% SDS (sodium dodecyl sulfate) aqueous solution, shaken for 2 minutes, and further shaken in pure water for 2 minutes. In addition, 1.5 g NaBH_Four450 ml PBS (8 g NaCl, Na₂HPO_Four・ 12H₂2.9 g of O, 0.2 g of KCl, KH₂PO_FourWas dissolved in 0.2 g of pure water and made up to 1 l), and a solution containing 133 ml of 100% ethanol was prepared. After preparing the solution, the slide glass was immediately immersed in this solution, and after 5 minutes, the slide glass was taken out. In this way, excess aldehyde groups on the slide glass that were not bound to DNA were blocked. Subsequently, it was washed in order of 0.2 wt% SDS aqueous solution and pure water and dried.
[0038]
Hybridization with the sample and the results
2 × SSC (2 × SSC is NaCl 87.6 g, C₆H_FiveO₇Na_Three・ 2H₂O: 44.2 g of trisodium citrate hydrate dissolved in pure water and made up to 1 l. Further, 43.8 g of NaCl, 22.1 g of trisodium citrate hydrate dissolved in 22.1 g of pure water, and made up to 1 liter, expressed as 1 × SSC, and 10 times concentrated solution thereof is 10 × SSC, 5 times. The diluted solution is expressed as 0.2 × SSC. ) MgCl₂Dissolved in MgCl₂DNA4 was dissolved in an aqueous solution adjusted to a concentration of 10 mmol / l to a DNA4 concentration of 50 pmol / μl. This solution was dropped onto a glass slide on which DNA5 and DNA6 were immobilized, and allowed to stand at room temperature for 30 minutes for hybridization. At this time, a cover glass was placed on the solution so that the solution did not dry. Next, the slide glass was shaken in 2 × SSC, and the cover glass was naturally peeled off and washed. Furthermore, it wash | cleaned in order of 1 * SSC and 0.2 * SSC.
[0039]
Subsequently, this slide glass was observed with a fluorescence microscope. As a result, fluorescence from FITC was observed from the portion spotted with DNA5, but no fluorescence was observed from the portion spotted with DNA6.
[0040]
Further, when the detection limit was examined by shaking the sample amount (number of moles of DNA 4) in the sample solution, the sample amount was estimated to be several hundred amol as the detection limit.
[0041]
  Reference example 2
  Reference example 1Except that the same DNA solution as described in Table 1 was prepared, and the solution for spotting on the slide glass and the solution for hybridization were changed to the aqueous solutions shown in Table 1.Reference example 1The same operation was performed.Reference example 1Similarly, fluorescence from FITC was observed from the portion spotted with DNA5, but no fluorescence was observed from the portion spotted with DNA6. Table 1 shows the bookReference exampleShows the fluorescence intensity of the portion spotted with DNA5.
[0042]
[Table 1]

[0043]
From this result, it was found that the solution for spotting and the solution for hybridization contained Mg and Ca more preferably.
[0044]
Comparative Example 1
Adjustment of slide glass
A slide glass (manufactured by Matsunami Glass, white rim polished frost No. 1) was immersed in a 3 mol / l, NaOH solution for 30 minutes, and then thoroughly washed with ultrapure water and dried. It was immersed in a 10% by volume poly-L-lysine (Sigma) aqueous solution for 1 hour. This was centrifuged with a plate centrifuge and dried at room temperature.
[0045]
DNA processing
Four types of deoxyribonucleic acid (DNA) having the following base sequences were synthesized.
5'-GGGGCCATCCATAGTCTTCT-3 '(DNA11)
5'-CCATGGGGAAGGTGAAGGTC-3 '(DNA12)
5'-AGAAGACTGTGGATGGCCCC-3 '(DNA13; 5' terminal FITC)
DNA11 and DNA12 are not chemically modified. DNA11 and DNA12 were dissolved in 3 × SSC to adjust the concentration of each DNA to 100 pmol / μl.
[0046]
Fixation of DNA to glass slide
The solution of DNA11 and DNA12 was spotted on the slide glass prepared earlier with a needle tip. After drying, 60 mJ UV light was applied to perform cross-linking. Next, in order to block unnecessary amino groups on the surface of the slide glass not bonded to DNA, a solution (anhydrous solution) containing boric acid, pure water, pH adjusting NaOH, succinic anhydride, and 1-methyl-2-pyrrolidone is mixed. 3 g of succinic acid was dissolved in 187 ml of 1-methyl-2-pyrrolidone, and the surface on which the nucleic acid was immobilized was immersed in 17 ml of 1M Na-borate (pH 8.0) solution immediately before use) and shaken. Thereafter, it was washed and dried.
[0047]
Hybridization with the sample and the results
DNA 13 was dissolved in 2 × SSC aqueous solution to adjust the concentration of DNA 13 to 50 pmol / μl. This solution was dropped onto a glass slide on which DNA 11 and DNA 12 were immobilized, and allowed to stand at room temperature for 30 minutes for hybridization. At this time, a cover glass was placed on the solution so that the solution did not dry. Next, the slide glass was shaken in 2 × SSC, and the cover glass was naturally peeled off and washed. Furthermore, it wash | cleaned in order of 1 * SSC and 0.2 * SSC.
[0048]
  Subsequently, this slide glass was observed with a fluorescence microscope. As a result, fluorescence from FITC was observed from the spot where DNA 11 was spotted, but no fluorescence was observed from the spot where DNA 12 was spotted. However, the intensity of fluorescence from FITC isReference example 11/10 of that. This is presumed that, in this comparative example, the amount of DNA immobilized on the slide glass was small, and as a result, the sample DNA that could be hybridized was small and the fluorescence was weakened.
[0049]
  Comparative Example 2
  Adjustment of the slide glassReference example 1As well as.
[0050]
DNA processing
Four types of deoxyribonucleic acid (DNA) having the following base sequences were synthesized.
5'-GGGGCCATCCATAGTCTTCT-3 '(DNA14; 5' terminal amination)
5'-CCATGGGGAAGGTGAAGGTC-3 '(DNA15; 5' terminal amination)
5'-AGAAGACTGTGGATGGCCCC-3 '(DNA16; 5' terminal FITC)
DNA14 and DNA15 were dissolved in PBS to a concentration of 100 pmol / μl.
[0051]
Fixation of DNA to glass slide
The solution of DNA14 and DNA15 was spotted on the slide glass prepared earlier with a needle tip. This was put in a 100% humidity tapper and left at room temperature overnight. Next, the slide was placed in a 0.2 wt% SDS aqueous solution, shaken for 2 minutes, and further shaken in pure water for 2 minutes. Then 1.5 g NaBH_FourWas dissolved in 450 ml of PBS, and 133 ml of 100% ethanol was added. The slide glass was quickly immersed in this solution. After 5 minutes, the slide was removed. In this way, excess aldehyde groups on the glass slide not bound to DNA were blocked. Next, the 0.2% SDS aqueous solution and pure water were washed in that order and dried.
[0052]
Hybridization with the sample and the results
DNA 16 was dissolved in 2 × SSC aqueous solution to adjust the concentration of DNA 16 to 50 pmol / μl. This solution was dropped onto a glass slide on which DNA14 and DNA15 were immobilized, and allowed to stand at room temperature for 30 minutes for hybridization. At this time, a cover glass was placed on the solution so that the solution did not dry. Next, the slide glass was shaken in 2 × SSC, and the cover glass was naturally peeled off and washed. Furthermore, it wash | cleaned in order of 1 * SSC and 0.2 * SSC.
[0053]
Subsequently, this slide glass was observed with a fluorescence microscope. As a result, fluorescence from FITC was observed from the portion spotted with DNA14, but no fluorescence was observed from the portion spotted with DNA15. However, the intensity of fluorescence from FITC from the spot where DNA 14 is spotted isReference example 11/10 of that. This is presumed that, in this comparative example, the amount of DNA immobilized on the slide glass was small, and as a result, the sample DNA that could be hybridized was small and the fluorescence was weakened.
[0054]
  Example 1
  Adjustment of the slide glassReference example 1As well as.
[0055]
  DNA processing
  Reference example 1In addition to DNA1 to DNA6 used in Step 1, DNA7 having a base sequence complementary to DNA3 was prepared. The specific base sequence of DNA7 is as follows.
5'-TACACGCGTGTATACGTAGG-3 '(DNA7)
  DNA7 is not chemically modified.
[0056]
Next, DNA7 was treated with 10 mmol / l MgCl.₂The DNA concentration was 100 pmol / μl after dissolution in an aqueous solution. Equal amounts of DNA3 and DNA7 solution prepared in the same manner were mixed and kept at 95 ° C. for 1 minute, and then gradually cooled. Thus, a double-stranded nucleic acid consisting of DNA3 and DNA7 was prepared (hereinafter referred to as DNA8).
[0057]
  Fixation of DNA to glass slide
  Reference example 1A solution of DNA5 (partial double-stranded nucleic acid) prepared in the same manner as in Example 1 and a solution of DNA8 (double-stranded nucleic acid) were mixed in equal amounts. Further, an equal amount of a solution of DNA6 (partial double-stranded nucleic acid) prepared in the same manner and a solution of DNA8 (double-stranded nucleic acid) were mixed. Then, these mixed nucleic acid solutionsReference example 1The sample was immobilized on a slide glass in the same manner as described above. In this way, both the partial double-stranded nucleic acid and the double-stranded nucleic acid were fixed to each region on the slide glass.
[0058]
  Hybridization with the sample and the results
  ThenReference example 1Prepare DNA4 in the same way as above, perform hybridization,Reference example 1The same measurement was performed. As a result, FITC fluorescence was observed from a portion where both DNA5 and DNA8 were spotted, but no fluorescence was observed from a portion where both DNA6 and DNA8 were spotted. On the other hand, the intensity of fluorescence from the area where DNA5 is spotted isReference example 1It was 1.6 times.
[0059]
Thus, it was found that S / N can be improved by adjusting the density of the probe (immobilized partial double-stranded nucleic acid) on the carrier.
[0060]
  Reference example 3
  Fabrication of electrodes on a carrier
  Sputtering is performed on the slide glass in the order of chromium and gold, and the area is 1mm.²An electrode having a gold surface was prepared on a slide glass. The thicknesses of chromium and gold were 5 nm and 500 nm, respectively. Note that eight electrodes were provided on one slide glass, and terminals for outputting to the outside were provided.
[0061]
DNA processing
Four types of deoxyribonucleic acid (DNA) having the following base sequences were synthesized.
5'-GGGGCCATCCATAGTCTTCT AAAAAAAAAA TACACGCGTGTATACGTAGG-3 '(DNA21)
5'-CCATGGGGAAGGTGAAGGTC AAAAAAAAAA TACACGCGTGTATACGTAGG-3 '(DNA22)
5'-CCTACGTATACACGCGTGTA-3 '(DNA23; 5' thiolation)
5′-AGAAGACTGTGGATGGCCCC-3 ′ (DNA24).
[0062]
The 5 'end of DNA 23 is thiolated. Other DNAs are not chemically modified. Further, the part of the DNA 21 and the DNA 23 in the middle of the sequence A is a spacer.
[0063]
Next, three types of DNA, DNA21, DNA22, and DNA23, were added to 10 mmol / l MgCl.₂It melt | dissolved in the aqueous solution and the density | concentration of each DNA was 100 pmol / microliter. Next, an equal amount of the DNA23 solution was mixed with the DNA21 solution, kept at 95 ° C. for 1 minute, and then gradually cooled to hybridize the DNA21 and DNA23. As a result, a DNA having a double difference from the end (3 ′ end of DNA 21) to the middle and then a single difference was obtained. Is DNA23). Similarly, an equal amount of a solution of DNA23 was mixed with a solution of DNA22, and DNA having a difference of two from the end (3 ′ end of DNA22) to the middle was obtained. DNA26 has a long chain part of DNA22 and a short chain part of DNA23).
[0064]
Fixation of DNA to electrode
10 μl of the DNA25 and DNA26 solution was dropped so that the entire electrode was immersed, and the solution was allowed to stand at 4 ° C. for 2 hours, taking care not to dry it. In addition, DNA25 was dripped at four electrodes among the slide glasses. Moreover, DNA26 was dripped at the other remaining electrodes. Next, the electrode was washed with pure water. Thereby, DNA25 and DNA26 were fixed on the electrode.
[0065]
Hybridization with the sample and the results
Subsequently, 2 × SSC (2 × SSC is NaCl 87.6 g, C₆H_FiveO₇Na_Three・ 2H₂O: 44.2 g of trisodium citrate hydrate dissolved in pure water and made up to 1 l) DNA24 was dissolved in an aqueous solution to adjust the concentration of DNA24 to 50 pmol / μl. This solution was dropped onto an electrode on which DNA25 and DNA26 were immobilized, and allowed to stand at 40 ° C. for 30 minutes for hybridization. At this time, a cover glass was placed on the solution so that the solution did not dry. Next, the cover glass was gently peeled off and washed. After hybridization, voltammetry was performed in 10 μmol / l Hoechst 33258 solution, and the oxidation current value of Hoechst 33258 was measured. The conditions at that time were a sweep speed of 100 mV / s and a sweep range of -200 mV to +800 mV. And the electric current peak in the vicinity of 700 mV was measured. In addition, the current peak was measured by the same measurement before hybridization, and the difference between the current peaks before and after hybridization was determined for each of the eight electrodes. The results are shown in Table 2.
[0066]
[Table 2]

[0067]
From the above, it was found that it was possible to detect with good reproducibility whether the DNA immobilized on the electrode and the sample DNA formed hybridization.
[0068]
Further, when the detection limit was examined by shaking the sample amount (number of moles of DNA 24) in the sample solution, the sample amount was estimated to be several tens of amol as the detection limit.
[0069]
Reference example 4
Reference example 3Except that the same DNA was prepared and the solution at the time of dropping on the electrode was changed to the aqueous solution shown in Table 3.Reference example 3The same operation was performed. Table 3 shows the results. PBS means 8g NaCl, Na₂HPO₄・ 12H₂2.9 g of O, 0.2 g of KCl, KH₂PO₄Was dissolved in 0.2 g of pure water and made up to 1 l.
[0070]
[Table 3]

[0071]
It was found that reproducibility was unsatisfactory when the solution when spotted on the electrode did not contain a divalent or trivalent cation. It was also found that S / N was good when Mg and Ca cations were contained in the solution.
[0072]
  Example 2
  Fabrication of electrodes on a carrier
  Reference example 3As well as.
[0073]
  DNA processing
  Reference example 3In addition to DNA21 to DNA26 used in the above, DNA27 having a base sequence complementary to DNA23 was prepared. The specific base sequence of DNA27 is as follows.
5'-TACACGCGTGTATACGTAGG-3 '(DNA27)
  DNA 27 is not chemically modified.
[0074]
Next, DNA27 was converted to 10 mmol / l MgCl2.₂The DNA concentration was 100 pmol / μl after dissolution in an aqueous solution. Equal amounts of similarly prepared DNA23 and DNA27 solution were mixed and kept at 95 ° C. for 1 minute, and then gradually cooled. In this way, a double-stranded nucleic acid consisting of DNA23 and DNA27 was prepared (hereinafter referred to as DNA28).
[0075]
  Fixation of DNA to electrode
  Reference example 3A solution of DNA25 (partial double-stranded nucleic acid) prepared in the same manner as in Example 1 and a solution of DNA28 (double-stranded nucleic acid) were mixed in equal amounts. The mixed solution is thenReference example 3On a carrier provided with an electrode similar toReference example 3It fixed to the electrode similarly. Further, an equal amount of a solution of DNA26 (partial double-stranded nucleic acid) prepared in the same manner and a solution of DNA28 (double-stranded nucleic acid) were mixed and fixed in the same manner. In this way, both the partial double-stranded nucleic acid and the double-stranded nucleic acid were immobilized on each electrode.
[0076]
  Hybridization with the sample and the results
  ThenReference example 3In the same manner as described above, DNA24 is prepared and hybridized.Reference example 3The same measurement was performed. The results are shown in Table 4.
[0077]
[Table 4]

[0078]
Thus, it was found that the S / N can be improved by adjusting the density of the probe (immobilized partial double-stranded nucleic acid) on the electrode. There was no problem in reproducibility.
[0079]
  Comparative Example 3
  Fabrication of electrodes on a carrier
  Reference example 3As well as.
[0080]
DNA processing
Four types of deoxyribonucleic acid (DNA) having the following base sequences were synthesized.
5'-GGGGCCATCCATAGTCTTCT-3 '(DNA31; 5' terminal thiolation)
5'-CCATGGGGAAGGTGAAGGTC-3 '(DNA32; 5' terminal thiolation)
5'-AGAAGACTGTGGATGGCCCC-3 '(DNA33)
DNA31 and DNA32 were thiolated at the 5 'end. On the other hand, DNA33 is not chemically modified. DNA 31 and DNA 32 were added at 10 mmol / l MgCl.₂It melt | dissolved in the aqueous solution and the density | concentration of each DNA was 100 pmol / microliter.
[0081]
Fixation of DNA to electrode
10 μl of the above DNA 31 and DNA 32 solution was added dropwise so that the entire electrode was immersed, and left at 4 ° C. for 2 hours, taking care not to dry it. In addition, DNA31 was dripped at four electrodes among the slide glasses. Moreover, DNA32 was dripped at the other remaining electrodes. Next, the electrode was washed with pure water. Thereby, DNA31 and DNA32 were fixed on the electrode.
[0082]
  Hybridization with the sample and the results
  DNA33 was dissolved in a 2 × SSC aqueous solution to adjust the concentration of DNA33 to 50 pmol / μl. This solution was dropped onto an electrode on which DNA 31 and DNA 32 were immobilized, and allowed to stand at 40 ° C. for 30 minutes for hybridization. At this time, a cover glass was placed on the solution so that the solution did not dry. Next, after gently peeling off the cover glass, washing, after reaction,Reference example 3In the same manner as above, voltammetry was performed in a 10 μmol / l Hoechst 33258 solution, and the oxidation current value of Hoechst 33258 was measured. The results are shown in Table 5.
[0083]
[Table 5]

[0084]
From this, it was found that this method has a large variation in the current value and is reproducible.
[0085]
【The invention's effect】
According to the present invention, many kinds of nucleic acids prepared in advance can be immobilized on the surface of the carrier at high density. For this reason, S / N at the time of detection is favorable. In addition, the reproducibility of data can be improved, and a nucleic acid-immobilized carrier can be produced at a low cost.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a schematic diagram of a partial double-stranded nucleic acid used in the present invention.
FIG. 2 is a schematic diagram when a partially double-stranded nucleic acid is immobilized on a carrier.
[Fig. 3]Reference example 1Schematic diagram of glass surface treatment performed in
[Explanation of symbols]
1 Long nucleic acid molecule
2 Short nucleic acid molecules
4 Functional groups
6 Carrier
7 Glass substrate

Claims

核酸が固定化されている核酸固定化担体であって、
ａ）固定化された核酸は、長い核酸分子と短い核酸分子からなる部分二本鎖を形成し、
ｂ）部分二本鎖核酸は、核酸の片側の末端付近から長さ方向で途中までが二本鎖であり、それ以外は一本鎖であり、
ｃ）部分二本鎖核酸の二本鎖を形成している末端側で、短い核酸分子の末端が担体に固定化されており、
ｄ）部分二本鎖核酸の長い核酸分子の塩基配列が異なっている二種類以上の部分二本鎖核酸が担体上の別の領域に固定化されており、
ｅ）固定化された部分二本鎖核酸の短い核酸分子の全部または一部が、共通の塩基配列を有し、
ｆ）担体上の同一領域に、部分二本鎖核酸と二本鎖核酸の両方が固定されていること、
のａ）〜ｆ）の全てを満たすことを特徴とする核酸固定化担体。A nucleic acid immobilization carrier on which a nucleic acid is immobilized,
a) the immobilized nucleic acid forms a partial double strand consisting of a long nucleic acid molecule and a short nucleic acid molecule;
b) The partial double-stranded nucleic acid is double-stranded in the length direction from the vicinity of one end of the nucleic acid, and is otherwise single-stranded,
c) The end of the short nucleic acid molecule is immobilized on the carrier at the end forming the double strand of the partial double-stranded nucleic acid,
d) Two or more types of partial double-stranded nucleic acids whose base sequences of long nucleic acid molecules of the partial double-stranded nucleic acid are different are immobilized in another region on the carrier,
e) all or part of the immobilized partially double stranded nucleic short nucleic acid molecules, have a common nucleotide sequence,
f) Both partial double-stranded nucleic acid and double-stranded nucleic acid are immobilized in the same region on the carrier,
A) to a nucleic acid-immobilized carrier satisfying all of a) to f ).

核酸の末端と担体が、共有結合を介して固定化されていることを特徴とする請求項１記載の核酸固定化担体。 The nucleic acid-immobilized carrier according to claim 1, wherein the end of the nucleic acid and the carrier are immobilized via a covalent bond.

２価もしくは３価カチオンを含む核酸固定化用溶液を用いて作製されたことを特徴とする請求項１記載の核酸固定化担体。 2. The nucleic acid immobilization carrier according to claim 1, wherein the nucleic acid immobilization carrier is prepared using a nucleic acid immobilization solution containing a divalent or trivalent cation.

マグネシウム、カルシウムの少なくとも一つを含む核酸固定化用溶液を用いて作製されたことを特徴とする請求項１記載の核酸固定化担体。 The nucleic acid immobilization carrier according to claim 1, wherein the nucleic acid immobilization carrier is prepared using a nucleic acid immobilization solution containing at least one of magnesium and calcium.

部分二本鎖核酸が電極上に固定化されていることを特徴とする請求項１記載の核酸固定化担体。 The nucleic acid-immobilized carrier according to claim 1, wherein the partially double-stranded nucleic acid is immobilized on an electrode.

請求項１記載の核酸固定化担体の固定化された核酸と検体核酸とのハイブリッドを検出する方法であって、二本鎖核酸を特異的に認識して結合しかつ電気化学的に活性な二本鎖認識体の電流値を検出または／および測定するハイブリッド検出方法。 A method for detecting a hybrid of a nucleic acid immobilized on a nucleic acid-immobilized carrier according to claim 1 and a sample nucleic acid, wherein the nucleic acid is specifically recognized and bound to a double-stranded nucleic acid and is electrochemically active. A hybrid detection method for detecting or / and measuring a current value of a strand recognizing body.