JP3978139B2 - Renillamulleriの緑色蛍光タンパク質をコードするヒト化ポリヌクレオチド配列 - Google Patents
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Description
オワンクラゲ(jellyfish Aequorea victoria)由来の緑色蛍光タンパク質(GFP)は、生化学、分子および細胞生物学、医学診断の分野において生物学的実体の追跡と定量にとって極めて有用な手段となっている(Chalfie et al.,1994,Science 263:802−805;Tsien,1998,Ann,Rev.Biochem.67:509−544)。蛍光は、コファクターまたは基質を必要としないので、このタンパク質は多様な生物体および細胞種に利用できる。GFPは、試験プロモータの下流に挿入することにより、in vivo遺伝子発現を研究するためにリポーター遺伝子として利用されてきた。このタンパク質は、試験タンパク質をGFPに直接融合することにより、多くのタンパク質の細胞内局在化の研究にも利用されており、またGFPは細胞培養と動物の両者において、ウイルスベクターの感染効率をモニタリングするための最良のリポーターとなっている。更に、多くの遺伝子改変がGFPに対して行われ、そのスペクトルシフトが、pH、イオンフラックス、細胞のリン酸化状態のような細胞環境の変化に対応した変異型が生成されている。恐らく、細胞指標としてのGFPの最も有望な役割は、蛍光共鳴エネルギー転移(FRET)技術への応用である。FRETは、一方の発光スペクトルがもう一方の励起スペクトルとオーバーラップする蛍光体により発生する。蛍光体が近接すると、「ドナー」蛍光体の励起により、「アクセプタ」からの発光を引き起こす。従って、このような蛍光体対は、分子相互作用のモニタリングに有用である。タンパク質の蛍光発光スペクトルと励起スペクトルがオーバーラップし、FRETを可能にするのであれば、GFPのような蛍光タンパク質は、in vivoとin vitroにおけるタンパク質の相互作用の分析に有用である。ドナー蛍光タンパク質とアクセプタ蛍光タンパク質は、相互作用の分析を希望するタンパク質を用いて、融合物質として生産できる。このようなGFPの利用方法は、読み出しが直接的で、細胞内局在化と無関係であるため、処理量の多い分析にとって有望である。
本発明は、R.mulleri GFPをコードするヒト化ポリヌクレオチドを提供する。
野生型「R.mulleri緑色蛍光タンパク質」または「R.mulleri GFP」は、配列番号2の核酸配列によりコードされる(引用することにより本明細書の一部をなすものとするWO99/49019)。
本発明は、R.mulleri GFPをコードするヒト化ポリヌクレオチド配列の発見に基づいている。
本明細書に開示されている本発明を提供するために、分子、細胞および生化学的方法を含む多くの方法が併用された。ヒト化配列が望まれるR.mulleri GFPまたは種々のGFP配列をコードするポリヌクレオチドが、直接的な化学合成、ライブラリスクリーニング、PCR増幅を含む技術に精通する者にとって既知の種々の方法のいずれかにより入手される。
R.mulleriの野生型ポリヌクレオチド配列は、以前にWO99/49019に開示されており、本明細書に配列番号2として提供されている。従って、本技術に精通する者は、本技術において既知の方法を用いて(Alvarado−Urbina et al.,(1981)Science 214:270)、配列番号2の配列を合成することにより、野生型R.mulleri GFPをコードするポリヌクレオチドを生産することができる。野生型R.mulleri GFPをコードするポリヌクレオチド配列は、以下に説明されている方法によっても生産できる。
真核細胞を感染させることが可能なバクテリオファージ、プラスミド、ウイルスのような種々のベクターにおけるライブラリの製造方法は、本技術において既知である。発現される遺伝子の大規模な全長クローンを生じる任意の既知のライブラリ生産方法を用いて、R.mulleriから野生型のGFPをコードするポリヌクレオチドを分離するための鋳型を提供することができる。
R.mulleri GFPコード配列は、本明細書に説明されているcDNAライブラリ内部の配列のポリメラーゼ連鎖反応(PCR)増幅により分離できる。多数のPCR法が本技術に精通する者にとって既知である。熱サイクルPCR(Mullis and Faloona,1987,Methods Enzymol.,155:335−350;PCR法の概説に関しては、PCR Protcols,1990,Academic Press,サンディエゴ、カリフォルニア州、米国も参照。)は、目的の標的配列を増幅するために、熱安定性DNA依存性DNAポリメラーゼにより触媒される複数回のDNA複製を用いている。要約すると、増幅される配列の片方の鎖と反対の鎖でアニールするように、プライマーが選択される。プライマーは、鋳型依存性熱安定性DNAポリメラーゼを用いて、アニールされ、伸長され、続いて熱変性と、元の鋳型配列と新たに伸長された鋳型配列の両方へのプライマーのアニーリングが起こり、その後プライマー伸長が行われる。このようなサイクルの繰り返しにより、2つのプライマーの間で指数関数的増幅が起こる。
本発明のGFPをコードするポリヌクレオチドのもう1つの分離方法は、GFPの励起スペクトル範囲の光を照射されると、GFPの発光スペクトル範囲の蛍光を示すクローンに関する、ラムダファージ発現ライブラリのような、発現ライブラリのスクリーニングを含む。この方法において、クローンは、大きなプール内から直接識別することができる。ラムダファージ発現ライブラリを培養皿に蒔き、挿入物によりコードされたポリペプチドの発現を誘導する標準的な方法は、本技術において十分確立されている。蛍光励起および発光によるスクリーニングは、下記の明細書に説明されている様に、分光蛍光計測計を用いて、または蛍光プラークの視認によっても行われる。いずれの方法でも、蛍光プラークを採集し、使用して、新鮮な培養物を1回以上、再感染させ、純粋な培養物を提供する。これにより、GFP挿入配列が測定され、サブクローニングされる。
本発明は、ヒト細胞においてコードされたGFPポリペプチドの発現を増強するR.mulleriのヒト化型を示す改変された核酸配列を提供する。本発明において有用なR.mulleri GFPをコードするヒト化ポリペプチドを作製するために、ポリペプチドをコードする核酸配列を、哺乳動物またはヒト細胞においてその発現を増強するために改変することができる。R.mulleriのコドンの利用は、R.mulleriにおける発現に関しては最適であるが、哺乳動物またはヒト系における発現に関しては最適でない。従って、高等真核生物において発現するためにウミシイタケ(sea pansy)から分離された配列の適応には、哺乳動物またはヒト系において望ましくない特異的なコドンを、これらの系においてより一般的に使用されるコドンに改変することを含む。このいわゆる「ヒト化」は、本技術において既知の下記明細書に説明されている様に、より望ましくないコドンの部位特異的突然変異により達成される。ヒト遺伝子発現に好ましいコドンは、表1に一覧されている。表のコドンは、ヒト遺伝子における相対的利用が低下する順に左から右に配列されている。
本発明のヒト化GFPをコードするポリヌクレオチドを含む組み換えベクター由来のR.mulleri GFPポリペプチド(例えば、配列番号2のアミノ酸配列を持つポリペプチド)の生産は、本技術に精通する者にとって既知の多くの方法で達成される。例えば、本技術に精通する者にとって既知の多くの方法のいずれかにより、プラスミド、バクテリオファージまたはウイルスを原核細胞または真核細胞に導入することができる。R.mulleri GFPをコードするポリヌクレオチドを原核細胞または真核細胞に導入した後、発現されたGFPポリペプチドを本技術において既知の、あるいは本明細書に説明されている方法を用いて分離することができる。有用なベクター、細胞、細胞にベクターを導入する方法およびGFPポリペプチドの検出分離方法も下記本明細書に説明されている。
本発明のGFPポリペプチドの発現に有用な、本技術において既知であり、かつ入手可能な多くのベクターが存在する。特定のベクターの選択は、明らかにGFPポリペプチドの使用目的によって左右される。例えば、選択されたベクターは、細胞種が原核細胞であろうと、真核細胞であろうと、所望の細胞種においてポリペプチドを発現させなくてはならない。多くのベクターが、作動可能に結合された遺伝子配列の原核細胞のベクター複製と真核細胞の発現との両者を可能にする配列を含む。
選択された宿主細胞種における本発明のヒト化GFPコード配列を発現できる任意のプラスミドベクターが、本発明に利用できる。本発明において有用なプラスミドベクターは、本発明に有用なベクターの上記の特性のいずれか、または全てを有することができる。本発明に有用なプラスミドベクターには、以下の例が含まれるが、これらに限定されない。細菌pQE70、pQE60、pQE−9(Quiagen)pBs、pTrc99A、pKK223−3、pKK233−3、pDR540およびpRIT5(Pharmacia);真核生物−pWLneo、pSV2cat、pOG44、pXXT1、pSG(Stratagene製)pSVK3、pBPV、pMSGおよびpSVL(Pharmacia)。しかし、その他のプラスミドまたはベクターも、宿主において複製可能で、生存可能である限り、使用することができる。
本発明に有用な既知のバクテリオファージ由来ベクターが多数存在する。これらの中で最も重要なのは、挿入物によりコードされたポリペプチドを誘発性発現できるLambda Zap IIまたはLambda−Zap Express ベクター(Stratagen製)のようなλに基づくベクターである。
多くの種々のウイルスベクターが、本発明に有用であり、細胞においてそれからR.mulleri GFPをコードするヒト化配列の導入と発現を可能にする任意のウイルスベクターが、本発明の方法における利用に許容可能である。外来核酸を細胞に導入するために使用できるウイルスベクターには、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ関連ウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、セムリキ森林熱ウイルス(アルファウイルス)ベクターが含まれるが、これらに限定されない。欠陥レトロウイルスは、遺伝子導入における利用に関して十分特徴が明らかにされている(概説は、Miller,A.D.(1990)Blood 76:271)参照。組み換えレトロウイルスの生産プロトコルとこのようなウイルスによるin vitroまたはin vivoでの細胞感染プロトコルは、Current Protocols in Molecular Biology,Ausubel,F.M.et al.(編)Greene Publishing Associates,(1989)、Sections 9.10−9.14およびその他の標準実験マニュアルに記載されている。
R.mulleri GFPまたはヒト化R.mulleri GFPをコードする遺伝子を持つ組み換えベクターを導入でき、その中でベクターがGFPの発現を駆動できる任意の細胞が本発明に有用である。すなわち、本発明のGFP分子の利用が広範囲にわたることから、本発明のGFP分子が発現され、好ましくは検出される任意の細胞が適切な宿主であり、この場合宿主細胞は好ましくは哺乳動物細胞であり、より好ましくはヒト細胞である。原核生物と真核生物の両者の多種多様な生物体から、GFPをコードする配列を宿主細胞に導入するために適したベクターは、本明細書に説明されており、あるいは本技術に精通する者にとって既知である。
GFPをコードするベクターは、本技術に精通する者にとって既知の多くの適切な方法のいずれによっても、選択された宿主細胞に導入できる。例えば、GFP構築物は、λまたはM13のような大腸菌バクテリオファージベクター粒子の場合には、感染により適切な細菌細胞に導入でき、あるいはプラスミドベクターの場合またはバクテリオファージでの場合には、多くの形質転換方法のいずれかにより導入できる。例えば、標準塩化カルシウムを介する細菌の形質転換は、裸のDNAを細菌に導入するために今でも一般的に利用されている(Sambrook et al.,1989、Molecular Cloning,A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,ニューヨーク)が、エレクトロポレーションも利用できる(Ausubel et al.,1988,Current Protocols in Molecular Biology,(John Wiley & Sons,Inc.ニューヨーク、ニューヨーク州)。
本発明のポリヌクレオチドによりコードされたGFPポリペプチドに結合する抗体は、例えば、タンパク質生成において、またタンパク質会合分析(protein association assay)において有用である。本発明において有用な抗体は、全抗体(whole antibody)、抗体断片、多機能抗体凝集体または一般に、抗体由来の1つ以上の特異的結合部位を含む物質が含まれる。抗体断片は、一本鎖Fv断片のような、Fv、FaまたはF(ab’)2断片またはそれらの誘導体が可能である。抗体または抗体断片は、非組み換え、組み換え、ヒト化のいずれでもよい。抗体は免疫グロブリンイソタイプ、例えば、IgG、IgM等である。更に、適切であれば、免疫グロブリンまたはその断片の凝集体、ポリマー、誘導体および複合体が利用できる。
その内容を引用することにより本明細書の一部をなすものとする、Ward and Cormier(1979,J.Biol.Chem.254:781−788)およびMatthews et al.(1977,Biochemistry 16:85−91)により説明されている方法により、必要により、R.mulleri GFPはR.mulleriから精製される。本技術に精通する者は、凍結溶解および14,000xgの遠心分離による透明溶解液の調製後に、同様の手順を、細菌により発現されるR.mulleri GFPに適用できる。要約すると、Matthews et al.およびWard and Cormierにより用いられた方法は、DEAE−セルロース、セファデックス G−100、およびDTNB(5,5’−ジチオビス(2−ニトロ安息香酸)−セファデックスカラムによる連続クロマトグラフィー、および1mMのトリス(pH8.0)、0.1mMのEDTAに対する透析を含む。次に、GFPを含む透析された分画(蛍光により識別)を、酸処理により不純物を沈殿させ、続いて上清を中和し、これを凍結乾燥する。低塩(最初10mMから1mM)とpHを7.5から8.5の範囲にすることが、凍結乾燥で活性を維持するために重要である。凍結乾燥試料を水に再懸濁し、直ちに遠心分離し、溶けにくい不純物を除去し、セファデックスG−75カラムにかける。GFPを、1.0mMのトリス(pH8.0)、0.1mMのEDTAに溶出する。試料を不完全凍結乾燥により濃縮し、5mMの酢酸ナトリウム、5mMのイミダゾール、1mMのEDTA、pH7.5、に対して透析し、続いて同じ透析緩衝液において平衡化されたDEAE−BioGel−Aカラムでクロマトグラフィーにかける。GFPを、同じ酢酸/イミダゾール緩衝液においてpH6.9〜4.9の連続酸性グラジエントで溶出する。GFPを含む分画を1.0mMのトリス塩酸、0.1mMのEDTA、pH8.0に対して透析後、試料を部分凍結乾燥により濃縮し、セファデックスG−25(Superfine)カラムを通過させる。次に、GFPを含む分画を、pH8.0のトリス/EDTA緩衝液におけるDEAE−BioGel−Aカラムに加え、続いて20mMのグリシン、5mMのトリス塩酸、5mMのEDTAにより形成されるpH8.5から10.5の連続アルカリ性グラジエントで溶出する。GFPを含む分画は、実質的に均一のR.mulleri GFPを含む。
R.mulleri GFPをコードするヒト化ポリヌクレオチド配列は、多くの異なる方法で有用である。一般に、R.mulleri GFPをコードするポリヌクレオチド配列は、オワンクラゲGFPを用いて実施できる任意の工程または分析において有用である。更に、哺乳動物細胞において発現と蛍光強度が増強されるため、R.mulleri GFPをコードするヒト化ポリヌクレオチド配列は、オワンクラゲGFPを用いて実施されるよりも、工程および分析において有用である。
R.mulleri GFPをコードするヒト化ポリヌクレオチドは、バックグラウンドのトランスフェクションされていない細胞から、トランスフェクションされた哺乳動物細胞を識別するための選択マーカーとして導入できる。あるいは、ヒト化R.mulleri GFPのトランスフェクションは、異なる細胞種が存在する環境に細胞を曝露する前に、単離された細胞または類似細胞の集団をあらかじめ標識するために利用できる。元の細胞だけにGFPが検出されるため、このような細胞の位置を決定し、全集団と比較することができる。
本発明のヒト化R.mulleri GFP遺伝子により、一連の転写調節配列が、特定の遺伝子、細胞または器官、好ましくは哺乳動物細胞、好ましくはヒト細胞と共に利用するの適切であるかどうかを検討することができる。これは、組み換え発現および高レベルのタンパク質産生における利用に好適な転写調節配列を識別する様なin vitro利用にも、ヒト対象における前臨床試験または遺伝子治療の様にin vivo利用にも応用できる。
R.mulleri GFPをコードするヒト化ポリヌクレオチド配列は、転写を調節する化合物を検出するためのスクリーニング分析において有用である。本発明のこの点において、ヒト化R.mulleri GFPコード配列は、検出を希望する物質により誘導されることが判明しているプロモータの下流に配置される。細胞におけるGFPの発現は通常サイレントで、選択された物質を含む組成物に細胞を曝露することにより活性化される。例えば、脂溶性の転写調節物質、トキシン、ホルモン、サイトカイン、成長因子またはその他の定義された分子に反応するプロモータを使用する場合、特定の定義された分子を決定できる。例えば、試料中にエストロゲンが存在するかどうかをテストするために、エストロゲン反応性制御配列をGFPに結合できる。
多くの従来のFACS分析は、精製された抗体に結合された蛍光色素を利用しなくてはならない。蛍光標識された融合タンパク質は、FACS利用において、抗体よりも好ましい。なぜならば、細胞を蛍光標識試薬とインキュベーションする必要がなく、抗体複合体の非特異的結合によるバックグラウンドがないからである。GFPは、蛍光が安定で種に非依存性で、基質もコファクターも不要なため、FACSにおける利用に特に適している。
ヒト化R.mulleri GFP遺伝子は、融合タンパク質の一部として利用でき、標識されたタンパク質の位置が識別可能となる。GFPと外因性タンパク質の融合体は、GFPの蛍光と生理的機能および/またはターゲティング機能のような宿主タンパク質の機能の両者を保存しなくてはならない。
[実施例1. R.mulleri GFPをコードするヒト化遺伝子と野生型遺伝子の発現の比較]
ヒト化R.mulleri GFPコード配列は、種々のヒト、齧歯類、サル細胞系において発現を検討することができる。蛍光レベルは、rGFPよりもヒト化rGFP(hrGFP)の方が十分高いと予想される。hrGFPまたはヒト化レッドシフトエクオリンGFP(EGFP)をコードする単一のコピープロウイルス発現カセットを持つ細胞集団間の直接比較において、相対的蛍光強度は、2つの遺伝子間で同等であると予想される。
[発現の増強] ヒト細胞におけるヒト化R.mulleri GFP核酸配列の発現の増強を確認するために、ヒト細胞の形質導入のためにヒト化配列をコードするウイルス粒子の生産を、293細胞を、3μgのレトロウイルスパッケージングベクターpVPack−GP、pVPack−VSV−G(Stratagene製)、pCFB−hmGFP(ヒト化R.mulleri GFP;図6)のそれぞれを用いて同時感染することにより実施した。トランスフェクションは、Pear et al.(1997,Methods in Molecular Medicine:Gene Therapy Protocols,Robbind(編)Humana Press,トタワ、ニュージャージー州)の方法に従い、但しMBSトランスフェクションキット(Stratagene製)を用いる点を改変して実施した。その後、2x105個のHeLa細胞を、ウイルスを含まないか(図7、灰色曲線)、あるいはpCFB−hmGFPを用いて調製されたウイルスを含む(図7、黒い曲線)組織培養上清により感染させた。72時間後、細胞をトリプシン処理し、標準FITCHフィルターを用いてFACS(Cytometry Research Services、ソレントバレー、カリフォルニア州)により分析した(図7)。
その他の実施例は、本技術に精通する者にとって明らかである。前記の詳細な説明は、本発明を明瞭にすることのみを目的として提供され、単に例示的なものであることは明らかである。本発明の精神と範囲は、上記実施例に限定されず、請求の範囲により包含されるものである。
Claims (17)
- R.mulleri GFPをコードするヒト化ポリヌクレオチドであって、該ポリヌクレオチドは配列番号1の配列を含むヒト化ポリヌクレオチド。
- 請求項1に記載のポリヌクレオチドを含む組み換えベクター。
- 請求項2に記載の組み換えベクターを含む細胞。
- (a)R.mulleri GFPをコードするヒト化ポリヌクレオチド配列であって、該ヒト化ポリヌクレオチドは配列番号1の配列を含むヒト化ポリヌクレオチド配列を含む組み換えベクターを細胞に導入するステップと、
(b)工程(a)の細胞を培養するステップと、
(c)該細胞からR.mulleri GFPを分離するステップと
を含むR.mulleri GFPの生産方法。 - 前記細胞が哺乳動物細胞である請求項4に記載の方法。
- 前記細胞がヒト細胞である請求項4に記載の方法。
- (a)関心あるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を、R.mulleri GFPをコードするヒト化ポリヌクレオチドであって、該ヒト化ポリヌクレオチドは配列番号1の配列を含むヒト化ポリヌクレオチドに、結合されたポリヌクレオチド配列がインフレームで融合される様に結合するステップと、
(b)該結合されたポリヌクレオチド配列を細胞に導入するステップと、
(c)該結合されたポリヌクレオチド配列によりコードされたポリペプチドの位置を決定するステップと
を含む、細胞における関心あるポリペプチドの位置決定方法。 - (a)組み換えベクターを細胞集団に導入するステップであって、該組み換えベクターは、R.mulleri GFPをコードするヒト化ポリヌクレオチドであって、該ヒト化ポリヌクレオチドは配列番号1の配列を含むヒト化ポリヌクレオチドを含み、該細胞は該ヒト化ポリヌクレオチドを発現することができ、
(b)該集団に、R.mulleri GFPの励起スペクトルの範囲の光を照射するステップと、
(c)該集団において、R.mulleri GFPの発光スペクトルにおける蛍光を検出するステップと、それにより該組み換えベクターが導入された細胞を識別するステップと
を含む、組み換えベクターが導入された細胞の識別方法。 - 前記GFPが融合ポリペプチドとして発現される請求項8に記載の方法。
- 前記GFPが別個のポリペプチドとして発現される請求項8に記載の方法。
- 前記細胞がFACS分析により識別される請求項8に記載の方法。
- (a)転写調節配列を含む核酸配列を、R.mulleri GFPをコードするヒト化核酸配列であって、該ヒト化核酸は配列番号1の配列を含むヒト化核酸配列に作動可能に結合させるステップと、これによりリポーター構築物を生成させるステップと、
(b)該リポーター構築物を細胞に導入するステップと、
(c)該細胞において、該転写調節配列の活性を反映するR.mulleri GFP蛍光を検出するステップと
を含む、転写調節配列活性のモニタリング方法。 - (a)活性調節因子の存在に反応する転写調節配列を含む核酸配列を、R.mulleri GFPをコードするヒト化核酸配列であって、該ヒト化核酸配列は配列番号1の配列を含むヒト化核酸配列に作動可能に結合させるステップと、これによりリポーター構築物を生成させるステップと、
(b)該リポーター構築物を細胞に導入するステップと、
(c)該細胞において、該活性調節因子の存在を示すR.mulleri GFP蛍光を検出するステップと
を含む、転写調節配列の活性調節因子の検出方法。 - (a)転写調節配列を含む核酸配列を、R.mulleri GFPをコードするヒト化核酸配列であって、該ヒト化核酸は配列番号1の配列を含むヒト化核酸配列に作動可能に結合させるステップと、これによりリポーター構築物を生成させるステップと、
(b)該リポーター構築物を細胞に導入するステップと、
(c)該細胞を該転写調節配列の候補阻害剤に接触させるステップと、
(d)該候補阻害剤が存在しない場合と比較した蛍光の減少は、該候補阻害剤が、該転写調節配列の活性を阻害することを示す、該細胞におけるR.mulleri GFP蛍光を検出するステップと
を含む、転写調節配列の阻害剤のスクリーニング方法。 - (a)R.mulleri GFPをコードするヒト化核酸配列であって、該ヒト化核酸は配列番号1の配列を含むヒト化核酸配列を、相対分子量が既知のポリペプチドをコードする核酸配列に、結合された分子が融合ポリペプチドをコードするようにインフレームで結合するステップと、
(b)(a)の結合された核酸配列を細胞に導入するステップと、
(c)相対分子量マーカーである該融合ポリペプチドを該細胞から分離するステップと
を含む、蛍光分子量マーカーの製造方法。 - 前記細胞が哺乳動物細胞である請求項7、8、12、13、14または15に記載の方法。
- 前記細胞がヒト細胞である請求項7、8、12、13、14または15に記載の方法。
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