JP3965546B2 - 環境汚染物質の生態毒性評価方法 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、環境汚染物質の生態毒性評価方法に係り、特に、水環境を汚染する環境汚染物質による生態に対する毒性をバイオアッセイ法により評価する生態毒性評価方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
下水や工場排水、廃棄物処分場からの浸出水等の廃水中に微量含まれる環境汚染物質には、未知の物質が多く、これら廃水が流れ込む河や湖沼等の水環境における汚染実態を的確に把握し、対策を講じることが重大な課題になっている。環境汚染物質には、例えば、合成化学物質（溶剤、農薬、食品添加物、医薬品等）、重金属、合成化学物質が環境中で化学反応や微生物などにより生合成、生分解により生じた変化体、さらには塵芥焼却によるダイオキシンや水処理によるトリハロメタンなどの副生成物のように環境にかかわる処理過程で新たに生成する生成物、また、廃棄物処理場の浸出物、自然毒等がある。
【０００３】
しかし、未知物質を含む環境汚染物質は、個々の物質について定量はおろか定性すら困難な場合が多く、水中の有機物量をＢＯＤ、ＣＯＤ、ＴＯＣなどとして包括評価しているように、生態に対する毒性を総合的に評価する手法の導入が不可欠である。その評価手法の一つとして、現在、最も期待されている手法としてバイオアッセイ（Ｂｉｏａｓｓａｙ）がある。
【０００４】
バイオアッセイは、汚染物質の生態に対する毒性を、生物材料を用いてその応答性から評価する方法であり、急性毒性、遺伝毒性、内分泌撹乱作用などを対象として各種の試験法が開発中であり、既に実用化されている。
【０００５】
このうち、遺伝毒性は、染色体異常、遺伝子突然変異、ＤＮＡ損傷などを指標として、遺伝子に傷害を与える毒性を評価するものである。ＤＮＡ損傷を検出する方法として、ＤＮＡ一本鎖切断とアルカリ易溶出部位を電気泳動法を用いて検出するアルカリ性単細胞ゲル電気泳動法（Ａｌｋａｌｉｎｅ Ｓｉｎｇｌｅ Ｃｅｌｌ Ｇｅｌ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ Ａｓｓａｙ：以下「コメットアッセイ法」という）が開発されている。このコメットアッセイ法は、アルカリ溶解した有核細胞を用い、ＤＮＡの巻き戻し（ｕｎｗｉｎｄｉｎｇ）と電気泳動を行い、ＤＮＡ移動距離（Ｔａｉｌ ｌｅｎｇｔｈ）とＤＮＡモーメント（Ｔａｉｌ ｌｅｎｇｔｈ×ＤＮＡ量）を計測することにより、ＤＮＡの損傷の程度を定量するものであり、ＤＮＡの編成と一本鎖ＤＮＡの移動が効率的に行われ、流れ星状をしたコメットとしてＤＮＡ損傷を観察することができる。
【０００６】
コメットアッセイ法の特長は、ＤＮＡ損傷の検出感度が高く、少数の細胞で数時間の短時間に検定が可能なことがあげられる。また、これまでの生物化学的手法でも、ほとんどの細胞集団で直接、ＤＮＡ損傷の検出ができたが、個々の細胞間での損傷や修復の分布を調べることは不可能であったのに対し、コメットアッセイ法は個々の細胞でのＤＮＡ損傷を定量化できる利点もある。
【０００７】
従来、コメットアッセイ法に用いる細胞としては、ヒト抹消血リンパ球やマウス肝初代培養細胞、チャイニーズ・ハムスター由来の培養細胞株などの生物材料が利用されてきた。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
ところで、水環境の生態毒性評価にコメットアッセイ法を適用する場合、環境汚染物質がまず最初に接触・感知する水環境中の微生物細胞を用いるべきである。
【０００９】
しかしながら、微生物に対してのコメットアッセイの適用は何ら検討されておらず、従ってコメットアッセイ法を利用できる微生物種が明らかにされていないという問題がある。
【００１０】
また、コメットアッセイ法は、上述のように、他の生物化学的手法に比べてＤＮＡ損傷の検出感度が高いものの、従来のヒト抹消血リンパ球等よりも高感度な細胞を提供できる生物材料があれば、それだけコメットアッセイの分析精度を向上させることができる。
【００１１】
本発明は、このような事情に鑑みてなされたもので、環境汚染物質による生態に対する毒性をコメットアッセイ法で評価する上で、検出感度を高めることができるとともに、水環境における環境汚染物質による生態毒性を的確に評価することができるので、汚染の実態把握や対策検討に好適な生態毒性評価方法を提供することを目的とする。
【００１２】
【発明を解決するための手段】
本発明は前記目的を達成するために、環境汚染物質による生態に対する毒性を、アルカリ性単細胞ゲル電気泳動法により評価するための生物材料として、水環境中に生息する微生物を用いることを特徴とする。
【００１３】
また、本発明は前記目的を達成するために、環境汚染物質による生態に対する毒性を評価する生態毒性評価方法において、水環境中に生息する微生物を用い、該微生物の細胞を溶解した後、アルカリ条件下でＤＮＡの巻き戻しと電気泳動を行い、ＤＮＡ移動距離及び／又はＤＮＡモーメントを計測することにより、前記環境汚染物質による細胞のＤＮＡ損傷程度を定量し、該定量結果に基づいて前記環境汚染物質による生態に対する毒性を評価することを特徴とする。
【００１４】
本発明によれば、環境汚染物質による生態に対する毒性をアルカリ性単細胞ゲル電気泳動法（コメットアッセイ法）で評価する上で、水環境中に生息する微生物を用いて、環境汚染物質による微生物細胞のＤＮＡ損傷程度を定量するようにしたので、環境汚染物質による生態毒性を的確に評価することができる。
【００１５】
また、水環境中に生息する微生物として、植物鞭毛虫類の中のＥｕｇｌｅｎａｇｒａｃｉｌｉｓを用いることにより、環境汚染物質による生態に対する毒性をコメットアッセイ法で評価する上で、検出感度を高めることができる。
【００１６】
【発明の実施の形態】
以下、添付図面により本発明の環境汚染物質の生態毒性評価方法の好ましい実施の形態について詳説する。
【００１７】
本発明者等は、コメットアッセイ法に用いる生物材料として、環境汚染物質がまず最初に接触・感知する微生物の適用を鋭意検討した結果、水環境に生息する微生物が適用可能であることを見いだし、境汚染物質による生態に対する毒性を、アルカリ性単細胞ゲル電気泳動法により評価するための生物材料として水環境中に生息する微生物を用いるようにしたものである。
【００１８】
環境汚染物質による生態に対する毒性を評価する具体的な方法としては、水環境中に生息する微生物を用い、該微生物の細胞を溶解した後、アルカリ条件下でＤＮＡの巻き戻しと電気泳動を行い、ＤＮＡ移動距離及び／又はＤＮＡモーメントを計測することにより、環境汚染物質による細胞のＤＮＡ損傷程度を定量し、該定量結果に基づいて前記環境汚染物質による生態に対する毒性を評価するようにした。
【００１９】
また、水環境に生息する微生物のうちの植物鞭毛虫類であるＥｕｇｌｅｎａ ｇｒａｃｉｌｉｓは、従来コメットアッセイの生物材料として使用されていたヒト抹消血リンパ球よりも検出感度を約１０倍以上高くすることが可能である。
【００２０】
以下に、本発明を構成するにあたって行なった、微生物のコメットアッセイ法への適用可能性に関する検討、及びＥｕｇｌｅｎａ ｇｒａｃｉｌｉｓとヒト抹消血リンパ球とについてコメットアッセイに適用したときの比較試験について説明する。
〔１〕微生物のコメットアッセイ法への適用可能性に関する検討
（実験１）発明者等は、先ず、微生物をコメットアッセイ法へ適用する上での必須条件である細胞溶解性の観点から微生物のスクリーニングを行なった。
【００２１】
(1)供試微生物
植物鞭毛虫Ｅｕｇｌｅｎａ ｇｒａｃｉｌｉｓ（国立環境研究所：ＮＩＥＳ−４９）、酵母Ｓａｃｃａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（武田発酵研 No. ０２０９）、原生動物Ｍｏｎａｓ ｇｕｔｔｕｌａ（環境庁国立環境研究所より分与）とＴｅｔｒａｐｈｙｍｅｎａ ｐｙｒｉｆｏｒｍｉｓ（国立環境研究所：ＮＩＥＳ−４０３）の４種類の微生物を実験に用いた。各微生物は所定の培養液で継代保存しながら、対数増殖期のものを実験に供した。
【００２２】
(2)細胞溶解液の調製
動物細胞で従来から広く用いられてきた非イオン界面活性剤Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００と陰イオン界面活性剤Ｓｏｄｉｕｍｄｏｄｅｃｙｌｓｕｌｆａｔｅ（ＳＤＳ）をそれぞれ所定濃度に調整して用いた。尚、各細胞溶解液は次のように調製した。
【００２３】
Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を含む高塩濃度溶解液は、２．５ＭのＮａＣ１、１００ｍＭのＮａ2 ＥＤＴＡ、１％のＮａ Ｓａｒｃｏｓｉｎａｔｅおよび１０ｍＭのＴｒｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙ１）ａｍｉｎｏ ｍｅｔｈａｎｅを蒸留水で溶解し、ｐＨを１０に調整した。使用時に、所定濃度になるようにＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００（ＳＩＧＭＡ製）と１０％（ｖ／ｖ）のＤｉｍｅｔｈｙ１ Ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ（ＤＭＳＯ）を加えた。なお、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００の濃度は１％（ｖ／ｖ）、５％（ｖ／ｖ）及び１０％（ｖ／ｖ）の３水準とした。
【００２４】
一方、ＳＤＳを含む溶解液は、３００ｍＭのＮａＯＨと３０ｍＭのＮａ2 ＥＤＴＡを蒸留水に溶解し、所定濃度になるようにＳＤＳを加えた。なお、ＳＤＳの濃度は０．０１％（ｗ／ｖ）、０．０５％（ｗ／ｖ）及び０．１％（ｗ／ｖ）の３水準とした。
【００２５】
(3)実験方法
Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を含む高塩濃度溶解液を試験管に入れ、遠心濃縮又は前処理した供試微生物を懸濁させて氷中（４℃）で静置した。所定時間ごとに光学顕微鏡（１００〜２００倍）で細胞状況の変化を観察した。次に、ＳＤＳを含む溶液を使用し、同様の操作・観察を行ったが、ＳＤＳの性質から、氷中ではなく、２５℃で静置した。
【００２６】
(4)実験結果
各微生物の細胞溶解液への溶解性を図１に示した。
【００２７】
図１から分かるように、動物細胞などで広く使用されている１％濃度のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００への溶解性は、植物性鞭毛虫Ｅ．ｇｒａｃｉｌｉｓの場合は、時間経過とともに細胞の形が薄くなり、溶解が確認できたが、静置２時間以上では細胞溶解の進行は観察されなかった。酵母Ｓ．ｓｅｒｅｖｉｓｉａｅの場合は、静置４８時間以上でも細胞溶解は全く確認できなかった。酵母の細胞壁は強固であるので、酵素（β−１，３−Ｇｌｕｃａｎａｓｅ）で前処理し、プロトプラスト化してから試みたが、同様の結果であった。また、原生動物Ｍ．ｇｕｔｔｕｌａの場合は、本菌株の継代培養には、被捕食者Ｍｉｃｒｏｃｙｓｔｉｓ ｓｐ．の存在が不可欠であり、両者が混在した状態で実験に供された。その結果、Ｍｃｒｏｃｙｓｔｉｓ ｓｐ．がバックグラウンドノイズとなって、Ｍ．ｇｕｔｔｕｌａの細胞溶解を判別できなかった。コメットアッセイへの適用でも、目的としたコメット像を特定できないと考えられ、以後の実験には供しなかった。原生動物Ｔ．ｐｙｒｉｆｏｒｍｉｓの場合は、細胞溶解を５分で確認できたので、以後の細胞溶解液の濃度を高めた実験には供試しなかった。
【００２８】
また、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００の濃度を５％、１０％に高めた場合でも、Ｅ．ｇｒａｃｉｌｉｓとＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの２菌株は、１％の場合と同様の結果が得られた。
【００２９】
次に、これら２菌株について、０．０１％、０．０５％、０．１％のそれぞれの濃度のＳＤＳを含む溶解液で同様の実験を行ったところ、Ｅ．ｇｒａｃｉｌｉｓの場合はＳＤＳ濃度にかかわらず３０分間の静置で細胞溶解が認められた。そこで、Ｅ．ｇｒａｃｉｌｉｓについて、細胞が溶解した各濃度で静置開始から５分ごとに状況を観察したところ、５分間で溶解していることを確認できた。一方、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅでは、１２時間でも全く細胞溶解は認められず、先と同様の酵素による前処理でも溶解しなかった。
【００３０】
以上の結果から、界面活性剤の種類や濃度、接触時間などにより差異が認められるものの、０．０１％濃度のＳＤＳ溶液で溶解したＥ．ｇｒａｃｉｌｉｓ、及び１％濃度のＴｒｉｔｏｎ Ｘ─１００で溶解したＴ．ｐｙｒｉｆｏｒｍｉｓの各微生物が、コメットアッセイ法を適用する上での細胞溶解性を有していることが分かった。この為、この２種類の微生物を、以後の実験に供試することにした。なお、細胞溶解時間は５分で問題ないと考えられるが、光学顕微鏡での目視観察の結果であるので、安全を見て１０分間の場合も併せて検討することにした。（実験２）次に、発明者等は、細胞溶解性の実験でスクリーニングされたＥ．ｇｒａｃｉｌｉｓ、及びＴ．ｐｙｒｉｆｏｒｍｉｓの各微生物について、以下の操作条件下でコメットアッセイ法を行い、適用可能性を調べた。また、微生物の適用可能性の実験であることから、本実験では、ＤＮＡ損傷の手段として環境汚染物質ではなくγ線照射により行なった。
【００３１】
(1)試薬の調製
▲１▼寒天溶液は、電気泳動用普通アガロース（ＡＧＡＲＯＳＥ Ｌｏｗ ＥＤＤ、ＳＩＧＭＡ製）と電気泳動用低ゲル化温度アガロース（ＮｕＳＩＥＶＥ ＧＴＧ ＡＧＡＲＯＳＥ、ＦＭＣ Ｂｉｏ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ製）をそれぞれ、ＰＢＳ−Ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．４）に溶解し、０．５％と１．０％の溶液をそれぞれ調製した。以下、前者を普通寒天溶液、後者を低温度寒天溶液と称す。
【００３２】
▲２▼細胞溶解液は、実験１の細胞溶解性のスクリーニングで使用したものを用いた。
【００３３】
▲３▼中和用緩衝液は、４００ｍＭのＴｒｉｓ‐ＨＣｌ Ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．４）を用いた。
【００３４】
▲４▼染色液は、Ｅｔｈｉｄｉｕｍ ｂｒｏｍｉｄｅを１ｍｇ／ｍｌとなるように調整し、使用時には２０μｇ／ｍｌの濃度になるように蒸留水で希釈した。
【００３５】
▲５▼アルカリ電気泳動溶液は、３００ｍＭのＮａＯＨと１ｍＭのＮａ2 ＥＤＴＡを蒸留水で溶解した。
【００３６】
(2)実験方法
図２の操作手順で実験を行った。
【００３７】
▲１▼細胞標本の作製は、全フロストのスライドグラス（Ｄａｋｉｎ Ｍｉｃｒｏ Ｓｌｉｄｅｓ No. ２９５８、Ｅｓｃｏ製）上に寒天を３層に重層し、ＰＢＳ−Ｂｕｆｆｅｒで懸濁させた細胞試料を中間層に包埋した。下層は０．５％の普通寒天溶液を、また中間層は１％の普通寒天溶液（３７℃で保温）と細胞試料の等量混合液をそれぞれ氷上４℃で固化し、その上層に低温度寒天溶液を滴下して、同様の操作で固化した。
【００３８】
▲２▼γ線照射によるＤＮＡ損傷は、作製した細胞標本にＤＮＡ損傷を与えるため、 137Ｃｓによるγ線照射（５Ｇｙ、２０分）を氷上で行った。
【００３９】
▲３▼細胞溶解と電気泳動は、γ線照射直後の細胞標本と、γ線を照射しなかった細胞標本（コントロール）をそれぞれ、供試微生物ごとの条件で細胞溶解させた。また、水平型電気泳動装置に細胞溶解後の標本を静置し、４℃に冷却した電気泳動用液を満たして、電気泳動を行った。電気泳動の電圧を２５Ｖ、電流を３００ｍＡに、またＤＮＡの巻き戻し（ｕｎｗｉｎｄｉｎｇ）と電気泳動の各時間をそれぞれ５分、１０分、２０分に設定した。
【００４０】
▲４▼中和および染色は、電気泳動終了後、細胞標本をＴｒｉｓ─ＨＣｌ緩衝液で５分ごとに２〜３回洗浄・中和し、染色液を滴下してからカバーグラスをかけて冷暗所に保存した。
【００４１】
(3)ＤＮＡ損傷の観察と定量方法
上記(2)の手順で調製した細胞標本を蛍光顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ製ＢＸ６０、５１５〜５６０ｎｍの励起フィルターと５９０ｎｍのバリアフィルター）で、１処理群当たり２０〜２５個の細胞を観察した。コメット像が明瞭に現れていると判断された場合には、蛍光顕微鏡に装着した高感度ＣＣＤカメラと自動画像解析装置（ケイオー電子工業(株)製、ＮＥＷ ＶＩＳＩＯＮ ＳＹＳＴＥＭ）を用いて、コメット像を解析した。
【００４２】
(4)実験結果
実験１で得られた知見をもとに、実験２では図３に示した２５種類の操作条件で、供試微生物のコメットアッセイ法への適用可否と最適操作条件を蛍光顕微鏡観察と画像解析により検討した。
【００４３】
▲１▼蛍光顕微鏡観察による微生物のコメットアッセイ法への適用可否
ａ）原生動物Ｔ．ｐｙｒｉｆｏｒｍｉｓでは、γ線照射標本とコントロール標本の両標本でコメット像に多少の差異が認められた。図３のほとんどの操作条件でコメット像が確認され、しかもγ線照射の標本では長いコメット像が現れていた。この結果は、電気泳動時間に起因しており、細胞溶解時間とＤＮＡの巻き戻し（ｕｎｗｉｎｄｉｎｇ）時間には全く影響されていなかった。
【００４４】
ｂ）植物鞭毛虫Ｅ．ｇｒａｃｉｌｉｓでは、γ線照射標本とコントロール標本の両標本でコメット像に差異が認められ、しかも、Ｔ．ｐｙｒｉｆｏｒｍｉｓよりも両標本の差異が明確で、コメット像も明瞭であった。
【００４５】
以上の観察結果から、微生物として植物鞭毛虫であるＥ．ｇｒａｃｉｌｉｓがコメットアッセイに適用できると判断できたので、画像解析装置による定量化を試みた。
【００４６】
▲２▼植物性鞭毛虫Ｅ．ｇｒａｃｉｌｉｓによる画像解析
評価指標の１つであるＴａｉｌ ｌｅｎｇｔｈについてみると、γ線照射の標本のＴａｉｌ ｌｅｎｇｔｈ平均値は５０．７〜１００．２μｍであるのに対し、コントロールの標本のＴａｉｌ ｌｅｎｇｔｈ平均値は３７．５〜６９．７μｍであり、γ線照射標本とコントロール標本の両標本の間にＴａｉｌ ｌｅｎｇｔｈの明確な差異がみられた。また、細胞溶解時間とＤＮＡの巻き戻し（ｕｎｗｉｎｄｉｎｇ）時間よりも、電気泳動時間が長くなるほど、Ｔａｉｌ ｌｅｎｇｔｈも大きな値をとる傾向が認められた。γ線照射標本の一部でバラツキは認められたが、γ線照射標本及びコントロール標本の両標本とも同程度に平均値周りに散布していた。ちなみに、変動係数を算出したところ、γ線照射では２０．４〜４４．２％（平均値：２８．２％）、コントロールでは１６．６〜２９．４％（平均値：２３．２％）であった。
【００４７】
最適操作条件としては、コントロール標本のＴａｉｌ ｌｅｎｇｔｈが短く、γ線照射標本のＴａｉｌ ｌｅｎｇｔｈが長く、コントロールとγ線照射とのＴａｉｌ ｌｅｎｇｔｈ差が大きい方が好ましく、且つバラツキの小さなことが重要である。この観点からＥ．ｇｒａｃｉｌｉｓを用いたＴａｉｌ ｌｅｎｇｔｈ評価の最適操作条件を検討すると、細胞溶解時間を６分に設定し、ＤＮＡの巻き戻し（ｕｎｗｉｎｄｉｎｇ）と電気泳動の各時間を２０分に設定するのが良いと考えられた。
【００４８】
また、Ｔａｉｌ ｍｏｍｅｎｔを評価指標として解析したところ、Ｔａｉｌ ｌｅｎｇｔｈよりも明確に電気泳動時間が長くなるほど、Ｔａｉｌ ｍｏｍｅｎｔも高い値を示し、泳動時間の影響が現れた。これは、Ｔａｉｌ ｍｏｍｅｎｔがＤＮＡ損傷を電気泳動による拡がりで評価する指標であるためであると考えられる。
【００４９】
▲３▼植物性鞭毛虫Ｅ．ｇｒａｃｉｌｉｓを用いたコメットアッセイ法の確認
実験２で特定した最適操作条件の下で、ＤＮＡ損傷程度を変えた場合に、ＤＮＡ損傷程度に応じてＴａｉｌ ｌｅｎｇｔｈが長くなるか、即ち定量化が可能であるか否かの確認を行なった。
【００５０】
γ線の放射量を０．０、２．５、５．０、７．５Ｇｙと増加させた場合（照射時間はすべて２０分間）、Ｔａｉｌ ｌｅｎｇｔｈの評価では、５．０Ｇｙまで放射線量に依存して長くなり、Ｔａｉｌ ｍｏｍｅｎｔの評価では、放射線量７．５Ｇｙまで放射線量に依存して増加した。放射線量７．５ＧｙのＴａｉｌ ｌｅｎｇｔｈは、５．０Ｇｙよりも低い値を示したが、Ｔａｉｌ ｍｏｍｅｎｔの結果から、この原因は拡がりのあるコメット像が形成されたことに起因していると考えられる。Ｔａｉｌ ｌｅｎｇｔｈとＴａｉｌ ｍｏｍｅｎｔの測定値のバラツキを比較した場合、Ｔａｉｌ ｌｅｎｇｔｈの方が小さく、バラツキを考慮すると、ＤＮＡ損傷を検出する場合には、Ｔａｉｌ ｌｅｎｇｔｈが優れていると考えられる。
【００５１】
以上、実験１と実験２との結果から、植物性鞭毛虫Ｅ．ｇｒａｃｉｌｉｓのコメットアッセイへの適用は十分に可能であり、その評価指標としてＴａｉｌ ｌｅｎｇｔｈとＴａｉｌ ｍｏｍｅｎｔの両者を用いることができることを確認できた。
〔２〕Ｅ．ｇｒａｃｉｌｉｓとヒト抹消血リンパ球を、コメットアッセイに適用した比較試験
（実験３）ＤＮＡの損傷手段としてγ線を使用した場合
ヒト抹消血リンパ球は細胞溶解液として１％濃度のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を使用し、Ｅ．ｇｒａｃｉｌｉｓは細胞溶解液として０．０１％ＳＤＳ溶液を使用した以外は、Ｅ．ｇｒａｃｉｌｉｓとヒト抹消血リンパ球ともに図２の操作手順に従って行なった。電気泳動時間は２０分に設定し、評価はＴａｉｌ ｌｅｎｇｔｈにより行なった。
【００５２】
図４に示した結果から分かるように、Ｅ．ｇｒａｃｉｌｉｓについてのγ線照射とコントロールのＴａｉｌ ｌｅｎｇｔｈの差は、ヒト抹消血リンパ球についてのＴａｉｌ ｌｅｎｇｔｈの差よりも明らかに大きく、それだけ高感度であることを示している。
【００５３】
尚、図４において、ボックスの上、下、中央の線でそれぞれＴａｉｌ ｌｅｎｇｔｈの長い順から最初の四分位数、最後の四分位数、中間を示している。下部のホイスカは最後の十分位数、上部のホイスカは最初の十分位数を示している。また、■は平均値を示している。
【００５４】
（実験４）ＤＮＡの損傷手段としてニトロソグアニジンを使用した場合
ＤＮＡの損傷手段として変異原、発ガン物質であるニトロソグアニジン（Ｎ−ｍｅｔｈｙｌ−Ｎ′−ｎｉｔｒｏ−Ｎ−ｎｉｔｒｏｓｏｇｕａｎｉｄｉｎｅ：略称ＭＮＮＧ）使用した。そして、ＭＮＮＧの濃度を０μＭ（コントロール）、０．５μＭ、１．０μＭ、５．０μＭ、１０μＭ、５０μＭの６水準の所定濃度について、細胞を２時間処理してＤＮＡに損傷を与え、ＭＮＮＧの濃度が幾つになったときに、ＭＮＮＧ処理したＴａｉｌ ｌｅｎｇｔｈがコントロールのＴａｉｌ ｌｅｎｇｔｈよりも長くなるかを調べた。その他の操作条件は、実験３の場合と同様である。
【００５５】
図５（ａ）はＥ．ｇｒａｃｉｌｉｓの結果であり、図５（ｂ）はヒト抹消血リンパ球の結果である。
【００５６】
図５から分かるように、ヒト抹消血リンパ球の場合には、ＭＮＮＧ濃度が１０μＭ以上の処理でＴａｉｌ ｌｅｎｇｔｈがコントロールよりも長くなるのに対し、Ｅ．ｇｒａｃｉｌｉｓの場合には、ＭＮＮＧ濃度が０．５μＭ以上の処理でＴａｉｌ ｌｅｎｇｔｈがコントロールよりも長くなる。このことは、アルカリ性単細胞ゲル電気泳動法により評価するための生物材料として、Ｅ．ｇｒａｃｉｌｉｓの方が従来のコメットアッセイで用いていたヒト抹消血リンパ球よりも１０倍以上感度が高いことを示している。即ち、Ｅ．ｇｒａｃｉｌｉｓは、低濃度の環境汚染物質による生態への毒性評価が可能であることを示唆している。
【００５７】
【発明の効果】
以上説明したように、本発明の環境汚染物質の生態毒性評価方法によれば、環境汚染物質による生態に対する毒性をコメットアッセイ法で評価する上で、検出感度を顕著に高めることが可能である。従って、低濃度の環境汚染物質による生態への毒性評価が可能であり、極めて有用である。
【００５８】
また、下水や工場排水、廃棄物処分場からの浸出水等の廃水が流れ込む河や湖沼等の水環境における環境汚染物質の汚染実態を把握する場合、環境汚染物質がまず最初に接触・感知する水環境中の微生物を使用するので、水環境における環境汚染物質の汚染実態を的確に把握することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】微生物の細胞溶解液への溶解性試験結果の説明図
【図２】コメットアッセイの操作手順を示した説明図
【図３】コメットアッセイの操作条件を説明する説明図
【図４】ＤＮＡ損傷をγ線照射で行なった場合の、Ｅ．ｇｒａｃｉｌｉｓとヒト抹消血リンパ球を、コメットアッセイに適用した比較試験結果を説明する説明図
【図５】ＤＮＡ損傷をニトロソグアニジンで行なった場合の、Ｅ．ｇｒａｃｉｌｉｓとヒト抹消血リンパ球を、コメットアッセイに適用した比較試験結果を説明する説明図
【発明の属する技術分野】
本発明は、環境汚染物質の生態毒性評価方法に係り、特に、水環境を汚染する環境汚染物質による生態に対する毒性をバイオアッセイ法により評価する生態毒性評価方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
下水や工場排水、廃棄物処分場からの浸出水等の廃水中に微量含まれる環境汚染物質には、未知の物質が多く、これら廃水が流れ込む河や湖沼等の水環境における汚染実態を的確に把握し、対策を講じることが重大な課題になっている。環境汚染物質には、例えば、合成化学物質（溶剤、農薬、食品添加物、医薬品等）、重金属、合成化学物質が環境中で化学反応や微生物などにより生合成、生分解により生じた変化体、さらには塵芥焼却によるダイオキシンや水処理によるトリハロメタンなどの副生成物のように環境にかかわる処理過程で新たに生成する生成物、また、廃棄物処理場の浸出物、自然毒等がある。
【０００３】
しかし、未知物質を含む環境汚染物質は、個々の物質について定量はおろか定性すら困難な場合が多く、水中の有機物量をＢＯＤ、ＣＯＤ、ＴＯＣなどとして包括評価しているように、生態に対する毒性を総合的に評価する手法の導入が不可欠である。その評価手法の一つとして、現在、最も期待されている手法としてバイオアッセイ（Ｂｉｏａｓｓａｙ）がある。
【０００４】
バイオアッセイは、汚染物質の生態に対する毒性を、生物材料を用いてその応答性から評価する方法であり、急性毒性、遺伝毒性、内分泌撹乱作用などを対象として各種の試験法が開発中であり、既に実用化されている。
【０００５】
このうち、遺伝毒性は、染色体異常、遺伝子突然変異、ＤＮＡ損傷などを指標として、遺伝子に傷害を与える毒性を評価するものである。ＤＮＡ損傷を検出する方法として、ＤＮＡ一本鎖切断とアルカリ易溶出部位を電気泳動法を用いて検出するアルカリ性単細胞ゲル電気泳動法（Ａｌｋａｌｉｎｅ Ｓｉｎｇｌｅ Ｃｅｌｌ Ｇｅｌ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ Ａｓｓａｙ：以下「コメットアッセイ法」という）が開発されている。このコメットアッセイ法は、アルカリ溶解した有核細胞を用い、ＤＮＡの巻き戻し（ｕｎｗｉｎｄｉｎｇ）と電気泳動を行い、ＤＮＡ移動距離（Ｔａｉｌ ｌｅｎｇｔｈ）とＤＮＡモーメント（Ｔａｉｌ ｌｅｎｇｔｈ×ＤＮＡ量）を計測することにより、ＤＮＡの損傷の程度を定量するものであり、ＤＮＡの編成と一本鎖ＤＮＡの移動が効率的に行われ、流れ星状をしたコメットとしてＤＮＡ損傷を観察することができる。
【０００６】
コメットアッセイ法の特長は、ＤＮＡ損傷の検出感度が高く、少数の細胞で数時間の短時間に検定が可能なことがあげられる。また、これまでの生物化学的手法でも、ほとんどの細胞集団で直接、ＤＮＡ損傷の検出ができたが、個々の細胞間での損傷や修復の分布を調べることは不可能であったのに対し、コメットアッセイ法は個々の細胞でのＤＮＡ損傷を定量化できる利点もある。
【０００７】
従来、コメットアッセイ法に用いる細胞としては、ヒト抹消血リンパ球やマウス肝初代培養細胞、チャイニーズ・ハムスター由来の培養細胞株などの生物材料が利用されてきた。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
ところで、水環境の生態毒性評価にコメットアッセイ法を適用する場合、環境汚染物質がまず最初に接触・感知する水環境中の微生物細胞を用いるべきである。
【０００９】
しかしながら、微生物に対してのコメットアッセイの適用は何ら検討されておらず、従ってコメットアッセイ法を利用できる微生物種が明らかにされていないという問題がある。
【００１０】
また、コメットアッセイ法は、上述のように、他の生物化学的手法に比べてＤＮＡ損傷の検出感度が高いものの、従来のヒト抹消血リンパ球等よりも高感度な細胞を提供できる生物材料があれば、それだけコメットアッセイの分析精度を向上させることができる。
【００１１】
本発明は、このような事情に鑑みてなされたもので、環境汚染物質による生態に対する毒性をコメットアッセイ法で評価する上で、検出感度を高めることができるとともに、水環境における環境汚染物質による生態毒性を的確に評価することができるので、汚染の実態把握や対策検討に好適な生態毒性評価方法を提供することを目的とする。
【００１２】
【発明を解決するための手段】
本発明は前記目的を達成するために、環境汚染物質による生態に対する毒性を、アルカリ性単細胞ゲル電気泳動法により評価するための生物材料として、水環境中に生息する微生物を用いることを特徴とする。
【００１３】
また、本発明は前記目的を達成するために、環境汚染物質による生態に対する毒性を評価する生態毒性評価方法において、水環境中に生息する微生物を用い、該微生物の細胞を溶解した後、アルカリ条件下でＤＮＡの巻き戻しと電気泳動を行い、ＤＮＡ移動距離及び／又はＤＮＡモーメントを計測することにより、前記環境汚染物質による細胞のＤＮＡ損傷程度を定量し、該定量結果に基づいて前記環境汚染物質による生態に対する毒性を評価することを特徴とする。
【００１４】
本発明によれば、環境汚染物質による生態に対する毒性をアルカリ性単細胞ゲル電気泳動法（コメットアッセイ法）で評価する上で、水環境中に生息する微生物を用いて、環境汚染物質による微生物細胞のＤＮＡ損傷程度を定量するようにしたので、環境汚染物質による生態毒性を的確に評価することができる。
【００１５】
また、水環境中に生息する微生物として、植物鞭毛虫類の中のＥｕｇｌｅｎａｇｒａｃｉｌｉｓを用いることにより、環境汚染物質による生態に対する毒性をコメットアッセイ法で評価する上で、検出感度を高めることができる。
【００１６】
【発明の実施の形態】
以下、添付図面により本発明の環境汚染物質の生態毒性評価方法の好ましい実施の形態について詳説する。
【００１７】
本発明者等は、コメットアッセイ法に用いる生物材料として、環境汚染物質がまず最初に接触・感知する微生物の適用を鋭意検討した結果、水環境に生息する微生物が適用可能であることを見いだし、境汚染物質による生態に対する毒性を、アルカリ性単細胞ゲル電気泳動法により評価するための生物材料として水環境中に生息する微生物を用いるようにしたものである。
【００１８】
環境汚染物質による生態に対する毒性を評価する具体的な方法としては、水環境中に生息する微生物を用い、該微生物の細胞を溶解した後、アルカリ条件下でＤＮＡの巻き戻しと電気泳動を行い、ＤＮＡ移動距離及び／又はＤＮＡモーメントを計測することにより、環境汚染物質による細胞のＤＮＡ損傷程度を定量し、該定量結果に基づいて前記環境汚染物質による生態に対する毒性を評価するようにした。
【００１９】
また、水環境に生息する微生物のうちの植物鞭毛虫類であるＥｕｇｌｅｎａ ｇｒａｃｉｌｉｓは、従来コメットアッセイの生物材料として使用されていたヒト抹消血リンパ球よりも検出感度を約１０倍以上高くすることが可能である。
【００２０】
以下に、本発明を構成するにあたって行なった、微生物のコメットアッセイ法への適用可能性に関する検討、及びＥｕｇｌｅｎａ ｇｒａｃｉｌｉｓとヒト抹消血リンパ球とについてコメットアッセイに適用したときの比較試験について説明する。
〔１〕微生物のコメットアッセイ法への適用可能性に関する検討
（実験１）発明者等は、先ず、微生物をコメットアッセイ法へ適用する上での必須条件である細胞溶解性の観点から微生物のスクリーニングを行なった。
【００２１】
(1)供試微生物
植物鞭毛虫Ｅｕｇｌｅｎａ ｇｒａｃｉｌｉｓ（国立環境研究所：ＮＩＥＳ−４９）、酵母Ｓａｃｃａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（武田発酵研 No. ０２０９）、原生動物Ｍｏｎａｓ ｇｕｔｔｕｌａ（環境庁国立環境研究所より分与）とＴｅｔｒａｐｈｙｍｅｎａ ｐｙｒｉｆｏｒｍｉｓ（国立環境研究所：ＮＩＥＳ−４０３）の４種類の微生物を実験に用いた。各微生物は所定の培養液で継代保存しながら、対数増殖期のものを実験に供した。
【００２２】
(2)細胞溶解液の調製
動物細胞で従来から広く用いられてきた非イオン界面活性剤Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００と陰イオン界面活性剤Ｓｏｄｉｕｍｄｏｄｅｃｙｌｓｕｌｆａｔｅ（ＳＤＳ）をそれぞれ所定濃度に調整して用いた。尚、各細胞溶解液は次のように調製した。
【００２３】
Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を含む高塩濃度溶解液は、２．５ＭのＮａＣ１、１００ｍＭのＮａ2 ＥＤＴＡ、１％のＮａ Ｓａｒｃｏｓｉｎａｔｅおよび１０ｍＭのＴｒｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙ１）ａｍｉｎｏ ｍｅｔｈａｎｅを蒸留水で溶解し、ｐＨを１０に調整した。使用時に、所定濃度になるようにＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００（ＳＩＧＭＡ製）と１０％（ｖ／ｖ）のＤｉｍｅｔｈｙ１ Ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ（ＤＭＳＯ）を加えた。なお、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００の濃度は１％（ｖ／ｖ）、５％（ｖ／ｖ）及び１０％（ｖ／ｖ）の３水準とした。
【００２４】
一方、ＳＤＳを含む溶解液は、３００ｍＭのＮａＯＨと３０ｍＭのＮａ2 ＥＤＴＡを蒸留水に溶解し、所定濃度になるようにＳＤＳを加えた。なお、ＳＤＳの濃度は０．０１％（ｗ／ｖ）、０．０５％（ｗ／ｖ）及び０．１％（ｗ／ｖ）の３水準とした。
【００２５】
(3)実験方法
Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を含む高塩濃度溶解液を試験管に入れ、遠心濃縮又は前処理した供試微生物を懸濁させて氷中（４℃）で静置した。所定時間ごとに光学顕微鏡（１００〜２００倍）で細胞状況の変化を観察した。次に、ＳＤＳを含む溶液を使用し、同様の操作・観察を行ったが、ＳＤＳの性質から、氷中ではなく、２５℃で静置した。
【００２６】
(4)実験結果
各微生物の細胞溶解液への溶解性を図１に示した。
【００２７】
図１から分かるように、動物細胞などで広く使用されている１％濃度のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００への溶解性は、植物性鞭毛虫Ｅ．ｇｒａｃｉｌｉｓの場合は、時間経過とともに細胞の形が薄くなり、溶解が確認できたが、静置２時間以上では細胞溶解の進行は観察されなかった。酵母Ｓ．ｓｅｒｅｖｉｓｉａｅの場合は、静置４８時間以上でも細胞溶解は全く確認できなかった。酵母の細胞壁は強固であるので、酵素（β−１，３−Ｇｌｕｃａｎａｓｅ）で前処理し、プロトプラスト化してから試みたが、同様の結果であった。また、原生動物Ｍ．ｇｕｔｔｕｌａの場合は、本菌株の継代培養には、被捕食者Ｍｉｃｒｏｃｙｓｔｉｓ ｓｐ．の存在が不可欠であり、両者が混在した状態で実験に供された。その結果、Ｍｃｒｏｃｙｓｔｉｓ ｓｐ．がバックグラウンドノイズとなって、Ｍ．ｇｕｔｔｕｌａの細胞溶解を判別できなかった。コメットアッセイへの適用でも、目的としたコメット像を特定できないと考えられ、以後の実験には供しなかった。原生動物Ｔ．ｐｙｒｉｆｏｒｍｉｓの場合は、細胞溶解を５分で確認できたので、以後の細胞溶解液の濃度を高めた実験には供試しなかった。
【００２８】
また、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００の濃度を５％、１０％に高めた場合でも、Ｅ．ｇｒａｃｉｌｉｓとＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの２菌株は、１％の場合と同様の結果が得られた。
【００２９】
次に、これら２菌株について、０．０１％、０．０５％、０．１％のそれぞれの濃度のＳＤＳを含む溶解液で同様の実験を行ったところ、Ｅ．ｇｒａｃｉｌｉｓの場合はＳＤＳ濃度にかかわらず３０分間の静置で細胞溶解が認められた。そこで、Ｅ．ｇｒａｃｉｌｉｓについて、細胞が溶解した各濃度で静置開始から５分ごとに状況を観察したところ、５分間で溶解していることを確認できた。一方、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅでは、１２時間でも全く細胞溶解は認められず、先と同様の酵素による前処理でも溶解しなかった。
【００３０】
以上の結果から、界面活性剤の種類や濃度、接触時間などにより差異が認められるものの、０．０１％濃度のＳＤＳ溶液で溶解したＥ．ｇｒａｃｉｌｉｓ、及び１％濃度のＴｒｉｔｏｎ Ｘ─１００で溶解したＴ．ｐｙｒｉｆｏｒｍｉｓの各微生物が、コメットアッセイ法を適用する上での細胞溶解性を有していることが分かった。この為、この２種類の微生物を、以後の実験に供試することにした。なお、細胞溶解時間は５分で問題ないと考えられるが、光学顕微鏡での目視観察の結果であるので、安全を見て１０分間の場合も併せて検討することにした。（実験２）次に、発明者等は、細胞溶解性の実験でスクリーニングされたＥ．ｇｒａｃｉｌｉｓ、及びＴ．ｐｙｒｉｆｏｒｍｉｓの各微生物について、以下の操作条件下でコメットアッセイ法を行い、適用可能性を調べた。また、微生物の適用可能性の実験であることから、本実験では、ＤＮＡ損傷の手段として環境汚染物質ではなくγ線照射により行なった。
【００３１】
(1)試薬の調製
▲１▼寒天溶液は、電気泳動用普通アガロース（ＡＧＡＲＯＳＥ Ｌｏｗ ＥＤＤ、ＳＩＧＭＡ製）と電気泳動用低ゲル化温度アガロース（ＮｕＳＩＥＶＥ ＧＴＧ ＡＧＡＲＯＳＥ、ＦＭＣ Ｂｉｏ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ製）をそれぞれ、ＰＢＳ−Ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．４）に溶解し、０．５％と１．０％の溶液をそれぞれ調製した。以下、前者を普通寒天溶液、後者を低温度寒天溶液と称す。
【００３２】
▲２▼細胞溶解液は、実験１の細胞溶解性のスクリーニングで使用したものを用いた。
【００３３】
▲３▼中和用緩衝液は、４００ｍＭのＴｒｉｓ‐ＨＣｌ Ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．４）を用いた。
【００３４】
▲４▼染色液は、Ｅｔｈｉｄｉｕｍ ｂｒｏｍｉｄｅを１ｍｇ／ｍｌとなるように調整し、使用時には２０μｇ／ｍｌの濃度になるように蒸留水で希釈した。
【００３５】
▲５▼アルカリ電気泳動溶液は、３００ｍＭのＮａＯＨと１ｍＭのＮａ2 ＥＤＴＡを蒸留水で溶解した。
【００３６】
(2)実験方法
図２の操作手順で実験を行った。
【００３７】
▲１▼細胞標本の作製は、全フロストのスライドグラス（Ｄａｋｉｎ Ｍｉｃｒｏ Ｓｌｉｄｅｓ No. ２９５８、Ｅｓｃｏ製）上に寒天を３層に重層し、ＰＢＳ−Ｂｕｆｆｅｒで懸濁させた細胞試料を中間層に包埋した。下層は０．５％の普通寒天溶液を、また中間層は１％の普通寒天溶液（３７℃で保温）と細胞試料の等量混合液をそれぞれ氷上４℃で固化し、その上層に低温度寒天溶液を滴下して、同様の操作で固化した。
【００３８】
▲２▼γ線照射によるＤＮＡ損傷は、作製した細胞標本にＤＮＡ損傷を与えるため、 137Ｃｓによるγ線照射（５Ｇｙ、２０分）を氷上で行った。
【００３９】
▲３▼細胞溶解と電気泳動は、γ線照射直後の細胞標本と、γ線を照射しなかった細胞標本（コントロール）をそれぞれ、供試微生物ごとの条件で細胞溶解させた。また、水平型電気泳動装置に細胞溶解後の標本を静置し、４℃に冷却した電気泳動用液を満たして、電気泳動を行った。電気泳動の電圧を２５Ｖ、電流を３００ｍＡに、またＤＮＡの巻き戻し（ｕｎｗｉｎｄｉｎｇ）と電気泳動の各時間をそれぞれ５分、１０分、２０分に設定した。
【００４０】
▲４▼中和および染色は、電気泳動終了後、細胞標本をＴｒｉｓ─ＨＣｌ緩衝液で５分ごとに２〜３回洗浄・中和し、染色液を滴下してからカバーグラスをかけて冷暗所に保存した。
【００４１】
(3)ＤＮＡ損傷の観察と定量方法
上記(2)の手順で調製した細胞標本を蛍光顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ製ＢＸ６０、５１５〜５６０ｎｍの励起フィルターと５９０ｎｍのバリアフィルター）で、１処理群当たり２０〜２５個の細胞を観察した。コメット像が明瞭に現れていると判断された場合には、蛍光顕微鏡に装着した高感度ＣＣＤカメラと自動画像解析装置（ケイオー電子工業(株)製、ＮＥＷ ＶＩＳＩＯＮ ＳＹＳＴＥＭ）を用いて、コメット像を解析した。
【００４２】
(4)実験結果
実験１で得られた知見をもとに、実験２では図３に示した２５種類の操作条件で、供試微生物のコメットアッセイ法への適用可否と最適操作条件を蛍光顕微鏡観察と画像解析により検討した。
【００４３】
▲１▼蛍光顕微鏡観察による微生物のコメットアッセイ法への適用可否
ａ）原生動物Ｔ．ｐｙｒｉｆｏｒｍｉｓでは、γ線照射標本とコントロール標本の両標本でコメット像に多少の差異が認められた。図３のほとんどの操作条件でコメット像が確認され、しかもγ線照射の標本では長いコメット像が現れていた。この結果は、電気泳動時間に起因しており、細胞溶解時間とＤＮＡの巻き戻し（ｕｎｗｉｎｄｉｎｇ）時間には全く影響されていなかった。
【００４４】
ｂ）植物鞭毛虫Ｅ．ｇｒａｃｉｌｉｓでは、γ線照射標本とコントロール標本の両標本でコメット像に差異が認められ、しかも、Ｔ．ｐｙｒｉｆｏｒｍｉｓよりも両標本の差異が明確で、コメット像も明瞭であった。
【００４５】
以上の観察結果から、微生物として植物鞭毛虫であるＥ．ｇｒａｃｉｌｉｓがコメットアッセイに適用できると判断できたので、画像解析装置による定量化を試みた。
【００４６】
▲２▼植物性鞭毛虫Ｅ．ｇｒａｃｉｌｉｓによる画像解析
評価指標の１つであるＴａｉｌ ｌｅｎｇｔｈについてみると、γ線照射の標本のＴａｉｌ ｌｅｎｇｔｈ平均値は５０．７〜１００．２μｍであるのに対し、コントロールの標本のＴａｉｌ ｌｅｎｇｔｈ平均値は３７．５〜６９．７μｍであり、γ線照射標本とコントロール標本の両標本の間にＴａｉｌ ｌｅｎｇｔｈの明確な差異がみられた。また、細胞溶解時間とＤＮＡの巻き戻し（ｕｎｗｉｎｄｉｎｇ）時間よりも、電気泳動時間が長くなるほど、Ｔａｉｌ ｌｅｎｇｔｈも大きな値をとる傾向が認められた。γ線照射標本の一部でバラツキは認められたが、γ線照射標本及びコントロール標本の両標本とも同程度に平均値周りに散布していた。ちなみに、変動係数を算出したところ、γ線照射では２０．４〜４４．２％（平均値：２８．２％）、コントロールでは１６．６〜２９．４％（平均値：２３．２％）であった。
【００４７】
最適操作条件としては、コントロール標本のＴａｉｌ ｌｅｎｇｔｈが短く、γ線照射標本のＴａｉｌ ｌｅｎｇｔｈが長く、コントロールとγ線照射とのＴａｉｌ ｌｅｎｇｔｈ差が大きい方が好ましく、且つバラツキの小さなことが重要である。この観点からＥ．ｇｒａｃｉｌｉｓを用いたＴａｉｌ ｌｅｎｇｔｈ評価の最適操作条件を検討すると、細胞溶解時間を６分に設定し、ＤＮＡの巻き戻し（ｕｎｗｉｎｄｉｎｇ）と電気泳動の各時間を２０分に設定するのが良いと考えられた。
【００４８】
また、Ｔａｉｌ ｍｏｍｅｎｔを評価指標として解析したところ、Ｔａｉｌ ｌｅｎｇｔｈよりも明確に電気泳動時間が長くなるほど、Ｔａｉｌ ｍｏｍｅｎｔも高い値を示し、泳動時間の影響が現れた。これは、Ｔａｉｌ ｍｏｍｅｎｔがＤＮＡ損傷を電気泳動による拡がりで評価する指標であるためであると考えられる。
【００４９】
▲３▼植物性鞭毛虫Ｅ．ｇｒａｃｉｌｉｓを用いたコメットアッセイ法の確認
実験２で特定した最適操作条件の下で、ＤＮＡ損傷程度を変えた場合に、ＤＮＡ損傷程度に応じてＴａｉｌ ｌｅｎｇｔｈが長くなるか、即ち定量化が可能であるか否かの確認を行なった。
【００５０】
γ線の放射量を０．０、２．５、５．０、７．５Ｇｙと増加させた場合（照射時間はすべて２０分間）、Ｔａｉｌ ｌｅｎｇｔｈの評価では、５．０Ｇｙまで放射線量に依存して長くなり、Ｔａｉｌ ｍｏｍｅｎｔの評価では、放射線量７．５Ｇｙまで放射線量に依存して増加した。放射線量７．５ＧｙのＴａｉｌ ｌｅｎｇｔｈは、５．０Ｇｙよりも低い値を示したが、Ｔａｉｌ ｍｏｍｅｎｔの結果から、この原因は拡がりのあるコメット像が形成されたことに起因していると考えられる。Ｔａｉｌ ｌｅｎｇｔｈとＴａｉｌ ｍｏｍｅｎｔの測定値のバラツキを比較した場合、Ｔａｉｌ ｌｅｎｇｔｈの方が小さく、バラツキを考慮すると、ＤＮＡ損傷を検出する場合には、Ｔａｉｌ ｌｅｎｇｔｈが優れていると考えられる。
【００５１】
以上、実験１と実験２との結果から、植物性鞭毛虫Ｅ．ｇｒａｃｉｌｉｓのコメットアッセイへの適用は十分に可能であり、その評価指標としてＴａｉｌ ｌｅｎｇｔｈとＴａｉｌ ｍｏｍｅｎｔの両者を用いることができることを確認できた。
〔２〕Ｅ．ｇｒａｃｉｌｉｓとヒト抹消血リンパ球を、コメットアッセイに適用した比較試験
（実験３）ＤＮＡの損傷手段としてγ線を使用した場合
ヒト抹消血リンパ球は細胞溶解液として１％濃度のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を使用し、Ｅ．ｇｒａｃｉｌｉｓは細胞溶解液として０．０１％ＳＤＳ溶液を使用した以外は、Ｅ．ｇｒａｃｉｌｉｓとヒト抹消血リンパ球ともに図２の操作手順に従って行なった。電気泳動時間は２０分に設定し、評価はＴａｉｌ ｌｅｎｇｔｈにより行なった。
【００５２】
図４に示した結果から分かるように、Ｅ．ｇｒａｃｉｌｉｓについてのγ線照射とコントロールのＴａｉｌ ｌｅｎｇｔｈの差は、ヒト抹消血リンパ球についてのＴａｉｌ ｌｅｎｇｔｈの差よりも明らかに大きく、それだけ高感度であることを示している。
【００５３】
尚、図４において、ボックスの上、下、中央の線でそれぞれＴａｉｌ ｌｅｎｇｔｈの長い順から最初の四分位数、最後の四分位数、中間を示している。下部のホイスカは最後の十分位数、上部のホイスカは最初の十分位数を示している。また、■は平均値を示している。
【００５４】
（実験４）ＤＮＡの損傷手段としてニトロソグアニジンを使用した場合
ＤＮＡの損傷手段として変異原、発ガン物質であるニトロソグアニジン（Ｎ−ｍｅｔｈｙｌ−Ｎ′−ｎｉｔｒｏ−Ｎ−ｎｉｔｒｏｓｏｇｕａｎｉｄｉｎｅ：略称ＭＮＮＧ）使用した。そして、ＭＮＮＧの濃度を０μＭ（コントロール）、０．５μＭ、１．０μＭ、５．０μＭ、１０μＭ、５０μＭの６水準の所定濃度について、細胞を２時間処理してＤＮＡに損傷を与え、ＭＮＮＧの濃度が幾つになったときに、ＭＮＮＧ処理したＴａｉｌ ｌｅｎｇｔｈがコントロールのＴａｉｌ ｌｅｎｇｔｈよりも長くなるかを調べた。その他の操作条件は、実験３の場合と同様である。
【００５５】
図５（ａ）はＥ．ｇｒａｃｉｌｉｓの結果であり、図５（ｂ）はヒト抹消血リンパ球の結果である。
【００５６】
図５から分かるように、ヒト抹消血リンパ球の場合には、ＭＮＮＧ濃度が１０μＭ以上の処理でＴａｉｌ ｌｅｎｇｔｈがコントロールよりも長くなるのに対し、Ｅ．ｇｒａｃｉｌｉｓの場合には、ＭＮＮＧ濃度が０．５μＭ以上の処理でＴａｉｌ ｌｅｎｇｔｈがコントロールよりも長くなる。このことは、アルカリ性単細胞ゲル電気泳動法により評価するための生物材料として、Ｅ．ｇｒａｃｉｌｉｓの方が従来のコメットアッセイで用いていたヒト抹消血リンパ球よりも１０倍以上感度が高いことを示している。即ち、Ｅ．ｇｒａｃｉｌｉｓは、低濃度の環境汚染物質による生態への毒性評価が可能であることを示唆している。
【００５７】
【発明の効果】
以上説明したように、本発明の環境汚染物質の生態毒性評価方法によれば、環境汚染物質による生態に対する毒性をコメットアッセイ法で評価する上で、検出感度を顕著に高めることが可能である。従って、低濃度の環境汚染物質による生態への毒性評価が可能であり、極めて有用である。
【００５８】
また、下水や工場排水、廃棄物処分場からの浸出水等の廃水が流れ込む河や湖沼等の水環境における環境汚染物質の汚染実態を把握する場合、環境汚染物質がまず最初に接触・感知する水環境中の微生物を使用するので、水環境における環境汚染物質の汚染実態を的確に把握することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】微生物の細胞溶解液への溶解性試験結果の説明図
【図２】コメットアッセイの操作手順を示した説明図
【図３】コメットアッセイの操作条件を説明する説明図
【図４】ＤＮＡ損傷をγ線照射で行なった場合の、Ｅ．ｇｒａｃｉｌｉｓとヒト抹消血リンパ球を、コメットアッセイに適用した比較試験結果を説明する説明図
【図５】ＤＮＡ損傷をニトロソグアニジンで行なった場合の、Ｅ．ｇｒａｃｉｌｉｓとヒト抹消血リンパ球を、コメットアッセイに適用した比較試験結果を説明する説明図
Claims (5)
- 環境汚染物質による生態に対する毒性を、アルカリ性単細胞ゲル電気泳動法により評価するための生物材料として、水環境中に生息する微生物を用いることを特徴とする環境汚染物質の生態毒性評価方法。
- 環境汚染物質による生態に対する毒性を評価する環境汚染物質の生態毒性評価方法において、
水環境中に生息する微生物を用い、該微生物の細胞を溶解した後、アルカリ条件下でＤＮＡの巻き戻しと電気泳動を行い、ＤＮＡ移動距離及び／又はＤＮＡモーメントを計測することにより、前記環境汚染物質による細胞のＤＮＡ損傷程度を定量し、該定量結果に基づいて前記環境汚染物質による生態に対する毒性を評価することを特徴とする環境汚染物質の生態毒性評価方法。 - 前記微生物は、植物鞭毛虫類であることを特徴とする請求項１又は２の環境汚染物質の生態毒性評価方法。
- 前記植物鞭毛虫類は、Ｅｕｇｌｅｎａ ｇｒａｃｉｌｉｓであることを特徴とする請求項３の環境汚染物質の生態毒性評価方法。
- 前記生態毒性評価を行なうことにより、水環境における前記環境汚染物質の汚染状態を評価することを特徴とする請求項１〜４のいずれか１の環境汚染物質の生態毒性評価方法。
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| Klobučar et al. | Application of the micronucleus and comet assays to mussel Dreissena polymorpha haemocytes for genotoxicity monitoring of freshwater environments | |
| Hayashi et al. | Development of genotoxicity assay systems that use aquatic organisms | |
| Gill et al. | An automated high-throughput assay for survival of the nematode Caenorhabditis elegans | |
| Shugart | Environmental genotoxicology | |
| Leme et al. | Chromosome aberration and micronucleus frequencies in Allium cepa cells exposed to petroleum polluted water—a case study | |
| Russo et al. | Assessment of environmental stress by the micronucleus test and the Comet assay on the genome of teleost populations from two natural environments | |
| Forster et al. | Simultaneous fluorescent gram staining and activity assessment of activated sludge bacteria | |
| Klobučar et al. | Genotoxicity monitoring of freshwater environments using caged carp (Cyprinus carpio) | |
| Lemos et al. | Evaluation of environmental waters using the comet assay in Tilapia rendalli | |
| Borgmann et al. | Assessing the cause of impacts on benthic organisms near Rouyn-Noranda, Quebec | |
| Diaper et al. | Survival of Staphylococcus aureus in lakewater monitored by flow cytometry | |
| Niyommaneerat et al. | Development of a chronic sediment toxicity test using the benthic ostracod Heterocypris incongruens and their application to toxicity assessments of urban road dust | |
| Babapoor et al. | Biosensor design for detection of mercury in contaminated soil using rhamnolipid biosurfactant and luminescent bacteria | |
| Bitton et al. | Short‐term toxicity assay based on daphnid feeding behavior | |
| Machado et al. | Optimization of a microplate-based assay to assess esterase activity in the alga Pseudokirchneriella subcapitata | |
| JP3965546B2 (ja) | 環境汚染物質の生態毒性評価方法 | |
| Wedderburn et al. | Biomarkers of biochemical and cellular stress in Carcinus maenas: an in situ field study | |
| Catala et al. | Effectiveness of CSE to counterstain particles and dead bacterial cells with permeabilised membranes: application to viability assessment in waters | |
| Taguri et al. | A rapid detection method using flow cytometry to monitor the risk of Legionella in bath water | |
| CN103930566B (zh) | 用于测定水中生物污染物的***和方法 | |
| Matsumoto et al. | Investigation of the genotoxic potential of the waters of a river receiving tannery effluents by means of the in vitro comet assay | |
| Kang et al. | Analysis of fish DNA biomarkers as a molecular-level approach for ecological health assessments in an urban stream | |
| Delatolla et al. | Rapid and reliable quantification of biofilm weight and nitrogen content of biofilm attached to polystyrene beads | |
| CN103472046A (zh) | 一种基于活性氧自由基水平分析蔬菜重金属污染的方法 | |
| Tayler et al. | Investigations of the localisation of bacterial activity on sandstone from ancient monuments |
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