JP3965448B2

JP3965448B2 - Compounds for introducing substances into specific intracellular sites

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Publication number: JP3965448B2
Application number: JP2000358442A
Authority: JP
Inventors: 秀樹松井; 正之松下
Original assignee: 有限会社プロテオセラピー
Priority date: 2000-11-24
Filing date: 2000-11-24
Publication date: 2007-08-29
Anticipated expiration: 2020-11-24
Also published as: JP2002153288A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、生体膜通過シグナル配列および細胞内の特定部位への選択的導入シグナル配列からなり細胞外から細胞内の特定部位に送達され得る化合物ならびに該化合物の細胞内の特定部位への送達方法に関する。また本発明は、生体膜通過シグナル配列および細胞内の特定部位への選択的導入シグナル配列をコードした塩基配列を含有するベクターに関する。
【０００２】
【従来の技術】
現在、発達した遺伝子工学技術を用い、特定の遺伝子、該遺伝子がコードするタンパク質、および／または該タンパク質の活性化などの分子メカニズムが詳しく研究され、それらの研究に関して多数の論文が発表されている。
【０００３】
たとえば記憶の分子メカニズムに関しては、神経細胞の核内に存在する転写因子ＣＲＥＢのＰＫＡによるリン酸化が記憶の誘導を行うとの報告がある（フレイユー（Frey. U.）ら、サイエンス（Science）、第２６０巻、１６６１〜１６６４頁、１９９３年；アベルティー（Abel, T.）ら、セル（Cell）、第８８巻、６１５〜６２６頁、１９９７年）。加えて、ＰＫＡによる該リン酸化は、ＰＫＩによって阻害されることが知られている（ケンプビーイー（Kemp, B. E.）ら、Methods Enzymol.、第１５９巻、１７３〜１８３頁、１９８８年）。したがって、ＰＫＩを核内に導入すれば記憶の分子メカニズムの誘導を阻害することになり、こうした手法を用いれば、さらなる記憶の分子メカニズムの解明が可能になると考えられる。
【０００４】
また、たとえばアレルギー疾患、具体的にはアトピー性皮膚炎は、ＩＬ−４の産生上昇に起因することが報告されている（ベランティジェイエー（Bellanti JA）ら、Allergy Asthma Proc.、第１９（６）巻、３３７〜３４１頁、１９９８年）。さらにたとえばハンチントン病は、該疾患に関与するタンパク質内部の異常に伸長したポリグルタミン酸に起因することが知られている（リエックスジェイ（Li XJ）ら、ネイチャー（Nature）、第３７８（６５５５）巻、３９８〜４０２頁、１９９５年）。ところで、無細胞系において、ペプチド核酸が転写を抑制するとの報告がなされている（レイエー（Ray A.）ら、FASEBJ、第１４（９）巻、１０４１〜１０６０頁、２０００年）。そこでアトピー性皮膚炎またはハンチントン病の患者に対し、ＩＬ−４遺伝子またはハンチントン病の責任遺伝子に対応するペプチド核酸を適用すれば、それぞれのタンパク質の発現を抑制することができ、好ましい治療薬となることが考えられる。しかしながら、ＰＮＡ単独では細胞膜を通過することができず、生体レベルでの応用には限界があった。
【０００５】
従来、所望の物質を細胞外から細胞内に導入する方法としては、ＴＡＴタンパク質を利用する方法がある。国際公開第ＷＯ００／３４３０８号には、ＴＡＴの部分ペプチド配列を細胞内導入ドメインとして含有した化合物が記載されている。しかしながら本発明者らは、ＴＡＴの細胞内導入ドメイン（ＰＴＤドメイン）が神経細胞に対して毒性を示すことを確認している。ここで示された毒性とは、海馬神経細胞における長期増強および長期抑圧の阻害である。したがって、神経細胞内に治療のための薬剤を導入することが目的の場合、ＴＡＴの細胞内導入ドメインを用いることは好ましくない。また、ＴＡＴの細胞内導入ドメインを利用しない方法として、国際公開第ＷＯ９８／５２６１４号がある。該文献には、６〜２５サブユニットからなり、かつ該サブユニットの少なくとも５０％がグアニジノ基またはアミド基を側鎖に有するポリマーは、生体膜を通過するためのシグナル配列として有用であることを記載している。しかしながら該文献には、所望の物質を細胞内の特定部位に局在化させることについての記載はない。さらにショウジョウバエのアンテナペディアのホメオドメインに由来するペプチドを利用する方法（デロッシディー（Derossi, D）ら、J. Biol. Chem.、第２７１巻、１８１８８〜１８１９３６頁、１９９６年）、またはヘルペスウイルスのＶＰ２２を利用する方法（エリオットジー（Elliott, G.）とオーヘアピー（O' Hare, P）、セル、第８８巻、２２３〜２３３頁、１９９７年）がある。しかし現在のところ、細胞外部に存在する物質を実際に細胞内の特定部位に局在化させたという報告はない。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
前記のように、生体膜、とくに細胞膜を通過し得ない所望の物質に関し、いかにして該物質の細胞外部から細胞内の特定部位への送達を可能とするかが大きな課題となっている。したがって本発明の課題は、細胞外部から細胞内の特定部位に効率的に送達され得る生物活性物質を含有する化合物、該化合物の送達方法および該化合物を製造するために有用なベクターを提供することである。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明は、生体膜通過シグナル配列および細胞内の特定部位への選択的導入シグナル配列を用いることにより細胞内の特定部位に所望の物質を送達することで、前記課題を解決するものである。すなわち本発明は、
（１）生体膜通過シグナル配列および細胞内の特定部位への選択的導入シグナル配列を含有し細胞内の特定部位に局在することができる化合物であり、該生体膜通過シグナル配列がアルギニン９残基〜１３残基からなるペプチド、および該細胞内の特定部位への選択的導入シグナル配列が核移行シグナル配列または後シナプス移行シグナル配列である化合物、
（２）生体膜通過シグナル配列がアルギニン１１残基からなるペプチドである前記（１）記載の化合物、
（３）核移行シグナル配列が配列表の配列番号１に示したペプチド配列からなる前記（１）記載の化合物、
（４）後シナプス移行シグナル配列が、配列表の配列番号２に示したペプチド配列からなる前記（１）記載の化合物、
（５）生物活性物質を含有する前記（１）、（２）、（３）または（４）記載の化合物、
（６）生物活性物質が有機化合物である前記（５）記載の化合物、
（７）有機化合物がペプチド核酸、ペプチドまたはタンパク質である前記（６）記載の化合物、
（８）有機化合物がペプチド核酸である前記（７）記載の化合物からなる転写阻害剤、
（９）有機化合物がペプチドまたはタンパク質である前記（７）記載の化合物、
（１０）ペプチドがＰＫＩの部分ペプチドである前記（９）記載の化合物からなるＰＫＡ阻害剤、
（１１）前記（１）、（２）、（３）、（４）、（５）、（６）、（７）、（８）、（９）または（１０）記載の化合物を細胞外部から細胞膜に接触させることからなる、該化合物を細胞内の特定部位に局在させる方法、
（１２）生体膜通過シグナル配列をコードした塩基配列および細胞内の特定部位への選択的導入シグナル配列をコードした塩基配列を含有するベクターであり、前記（１）記載の化合物の製造に用いるベクター、
（１３）細胞内の特定部位への選択的導入シグナル配列が核移行シグナル配列であり、配列表の配列番号２１に示した塩基配列からなる前記（１２）記載のベクター、および
（１４）細胞内の特定部位への選択的導入シグナル配列が後シナプス移行シグナル配列であり、配列表の配列番号２４に示した塩基配列からなる前記（１２）記載のベクターに関する。
【０００８】
これら細胞内の特定部位に送達され得る化合物、該化合物の送達方法、および該化合物を製造するために有用なベクターは、以下で説明する本発明の実施態様に基づいて得ることができる。
【０００９】
【発明の実施の形態】
本発明において用いられる「生体膜通過シグナル配列」とは、細胞に見いだされる生体膜を通過し得るシグナル配列を意味する。生体膜通過シグナル配列は、連続したアルギニンからなるペプチド配列であり、好ましくはアルギニン９〜１３残基、より好ましくはアルギニン１１残基である。連続したアルギニンが８残基以下または１４残基以上の場合は、該ペプチドに依存した細胞外部から細胞内への生体膜通過の効率が低下する。
【００１０】
「細胞内の特定部位」とは、たとえば核内、後シナプス、前シナプス、ミトコンドリア、ゴルジ体などの細胞小器官の内部または膜上を意味する。また、細胞内の特定部位には細胞膜上も含まれる。
【００１１】
「細胞内の特定部位への選択的導入シグナル配列」とは、細胞内の特定部位に送達するためのシグナル配列として働くものを意味し、このような作用を有するものであればいずれのシグナル配列を用いてもよい。たとえば該シグナル配列としては、細胞質から核内への移行を可能とする核移行シグナル配列、細胞質から後シナプスへの移行を可能とする後シナプス移行シグナル配列、細胞質から細胞膜への移行を可能とする細胞膜移行シグナル配列、細胞質からゴルジ体への移行を可能とするゴルジ体移行シグナル配列または細胞質から前シナプスへの移行を可能とする前シナプス移行シグナル配列などを挙げることができる。具体的には、たとえば核移行シグナル配列としてはＳＶ４０核移行シグナルであるアミノ酸配列ＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号１）（ベンディットジェイオー（Benditt JO）ら、Proc Natl Acad Sci U S A、第８６（２３）巻、９３２７〜９３３１頁、１９８９年；リースエイチピー（Rihs HP）ら、ＥＭＢＯＪ、第１０（３）巻、６３３〜６３９頁、１９９１年）を、後シナプス移行シグナル配列としてはアミノ酸配列ＬＩＥＳＤＶ（配列番号２）（セトウエム（Setou M）ら、サイエンス、第２８８（５４７２）巻、１７９６〜１８０２頁）などを挙げることができる。
【００１２】
本明細書中における「生物活性物質」とは、生体反応を生じさせる物質の総称を意味する。生物活性物質としては、たとえばペプチド核酸、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質などの有機化合物が挙げられる。ペプチド核酸、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質などの生物活性物質は、糖または脂質などにより修飾されていてもよい。核酸としては、安定性に優れているという理由、および転写抑制を目的とする場合は二重鎖ＤＮＡに高い親和性をもって結合するという理由から、ペプチド核酸が好ましい。ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質は、Ｌ−アミノ酸のみならず、その一部または全部がＤ−アミノ酸もしくは人工アミノ酸より構成されていてもよい。さらに、これらペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質は、これらの２つ以上からなる融合体であってもよく、たとえば２つのペプチドの融合体、ペプチドとタンパク質の融合体または２つのタンパク質の融合体であってもよい。本発明によれば、具体的なペプチド核酸としては、疾患の原因となる遺伝子の転写を抑制する目的で該遺伝子のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を有するペプチド核酸、たとえばアレルギーに関与するタンパクとして知られるＩＬ−４遺伝子の部分核酸５´−ＴＣＴＣＡＣＣＴＣＣＣＡＡＣＴ−３´（配列番号３）、またはハンチントン病遺伝子の部分核酸５´−ＡＧＧＧＴＣＧＣＣＡＴＧＧＣＧＧＴＣ−３´（配列番号４）などを用いることができる。またペプチドとしては、ＰＫＡの働きを抑制する目的で、ＰＫＩの部分ペプチドＦＩＡＳＧＲＴＧＲＲＮＡＩ（配列番号５）を用いることができる。本明細書において、「ＩＬ−４」は、サイトカインの一種であるインターロイキン４を意味する。また本明細書において、「ＰＫＩ」はプロテインキナーゼＡ（以下、ＰＫＡと略称する）インヒビターを意味する。
【００１３】
本発明の化合物の細胞外部から細胞内の特定部位への局在化は、該化合物を細胞外部に面した細胞膜に接触させることによって達成することができる。本発明の化合物を細胞外部に面した細胞膜に接触させる方法としては、たとえば細胞として培養細胞を用いる場合、該化合物を培養細胞の培養液に添加するだけでよい。さらにたとえば、細胞として哺乳動物体内の細胞を用いる場合、該化合物を静脈より投与するまたは皮膚より吸収させることによって、該化合物を細胞内の特定部位に局在させることができる。あるいは、点眼薬として角膜より該化合物を導入することもできる。
【００１４】
本発明の化合物の製造に用いるベクターは、生体膜通過シグナル配列をコードした塩基配列および細胞内の特定部位への選択的導入シグナル配列をコードした塩基配列を含む塩基配列を、骨格となるベクターに連結することによって製造することができる。骨格となるベクターに制限はなく、当業者が適宜選択することができる。該ベクターとしては、たとえばプラスミドベクターなどを用いることができる。プラスミドベクターとしては、たとえばｐＥＴベクター（ノバゲン社（Novagen, Inc.）製）、具体的にはｐＥＴ−２１ａ（＋）またはｐＥＴ−２８ａ（＋）（ノバゲン社製）が好ましい。骨格となるベクターに挿入するための塩基配列は、生体膜通過シグナル配列をコードした塩基配列の３´側に細胞内の特定部位への選択的導入シグナル配列をコードした塩基配列を配置させてもよいし、生体膜通過シグナル配列をコードした塩基配列の５´側に細胞内の特定部位への選択的導入シグナル配列をコードした塩基配列を配置させてもよい。また、シグナル配列をコードした２つの塩基配列の間には、シグナル配列に関係のない数個の塩基、たとえばグリシンをコードする３塩基などを挿入するのが好ましい。さらに本発明のベクターは、ヒスチジンタグもしくはフラッグ（ＦＬＡＧ）タグのようなタグまたはグリーン蛍光タンパク質などの標識を目的化合物に付加するための塩基配列を含んでいてもよい。
【００１５】
前記ベクターの製造法に制限はないが、たとえば、少なくとも生体膜通過シグナル配列および細胞内の特定部位への選択的導入シグナル配列をコードした塩基配列ならびにベクターに挿入されるための制限部位を両末端に含有するオリゴヌクレオチドを合成し、該オリゴヌクレオチドを骨格となるベクターに挿入することによって得ることができる。オリゴヌクレオチドの合成法は当業者に周知であり、市販の核酸自動合成機を用いることもできる。また、制限部位は用いるベクターによって適宜選択することができ、たとえば骨格となるベクターとしてｐＥＴ−２１ａ（＋）を用いる場合、制限部位としてはＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩの認識配列を選択することができる。
【００１６】
本発明の化合物が含有する生物活性物質がペプチド核酸の場合、該化合物は、シグナル配列と生物活性物質を還元条件下でジスルフィド結合させることにより製造することができる。具体的には、ペプチド核酸の合成段階でそのアミノ末端にシステインを付加し、また、生体膜通過シグナル配列および細胞内の特定部位への選択的導入シグナル配列を含有するペプチドの合成段階でもそのカルボキシル末端にシステインを付加しておく。ついで、これら２つの物質を還元条件下、たとえば５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．２、１００ｍＭ塩化ナトリウム、１０ｍＭ塩化マグネシウム、１ｍＭエチレングリコール４酢酸を含む溶液中で１時間ジスルフィド結合させ、高性能液体クロマトグラフィーにより精製する。
【００１７】
なお、ペプチド核酸のオリゴマーは、ハンベイジェイシー（Hanvey JC）らの文献（サイエンス、第２５８（５０８７）巻、１４８１〜１４８５頁、１９９２年）にしたがって合成することができる。ＥＸＰＥＤＩＴＥ８９０９合成装置を使用して合成することができる。あるいは、ジイソプロピルエチルアミンおよび２，６−ルチジンの存在下で、ホスファチジルセリン−ポリエチレングリコール−ＰＡＬ（ペルセプティブバイオシステムズ社（PerSeptive Biosystems）製）樹脂とフルオレニルメトキシカルボニル保護基を有するヌクレオベースモノマーズ（fluorenylmethoxycarbonyl-protected nucleobase monomers）（ペルセプティブバイオシステムズ社製）を用いて合成することもできる。合成されたペプチド核酸のオリゴマーをレジンから遊離し、保護基は２０容量％ｍ−クレゾールを含有する８０％トリフルオロ酢酸の存在下で２時間常温に放置することにより切り離すことができる。ついで、ペプチド核酸のオリゴマーを-２０℃のエチルエーテルで沈澱させ、逆相ＨＰＬＣで５５℃にて精製することができる。
【００１８】
本発明の化合物が含有する生物活性物質がペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質の場合、該化合物は市販のペプチド合成機により合成することができる。また該化合物は、生物活性物質をコードする塩基配列を前記ベクターに連結した組換えベクターで宿主細胞を形質転換し、得られた形質転換体を培養し、その培養物から目的の化合物を採取することによっても得ることができる。
【００１９】
前記ベクターを用いて本発明の化合物を得る場合、形質転換に用いる宿主細胞に制限はなく、組換えベクターの複製および発現が可能であればいかなるものを用いてもよい。該宿主細胞としては、たとえば大腸菌などを挙げることができる。具体的には、たとえば大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）（ストラタジーン社（STRATAGENE）製）を用いるてもよい。組換えベクターを用いる宿主の形質転換は、当業者に周知の方法によって適宜実施することができ、たとえば氷中３０分間にてインキュベートしたのち４２℃でインキュベートすることにより、実施することができる。
【００２０】
当該形質転換体の培養条件は、宿主細胞により適宜選択でき、特定の条件に限定されない。培養は通常この技術分野で用いられる培地および培養条件下で行うことができる。宿主細胞が大腸菌の場合、たとえば炭素源としては、グルコース、グリセロール、でんぷんなどを、窒素源としては硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、酢酸アンモニウムなどのアンモニウム塩、硝酸塩、トリプトン、ペプトンなどを用いることができる。その他微量の無機金属類、ビタミン類、成長促進因子、たとえばチアミン、ビオチンを含む酵母エキスなどを添加してもよい。これらの培地成分は形質転換体の生育を阻害しない濃度であればよい。培地は通常ｐＨ７．０〜７．５に調整し、滅菌して使用する。培養温度の範囲は形質転換体が生育し得る温度であればよく、通常は３０〜３７℃で培養するのが好ましい。形質転換体を液体培養する場合は、振とう培養または通気撹拌培養が好ましい。培養時間は種々の培養条件によって異なるが、振とう培養または通気撹拌培養の場合は１４〜１９時間培養するのが適当である。また、用いる組換えベクターにラクトースプロモーターが存在する場合は、６００ｎｍの吸光度が０．６〜０．８になるまで３７℃で培養した後、イソプロピルチオガラクトシド（ＩＰＴＧ）を加えてさらに培養することにより、目的化合物の発現を誘導してもよい。
【００２１】
培養終了後、遠心分離、濾過または共沈などの通常の方法によって、培養液から菌体細胞壁などの不溶物を除去した目的の化合物を含有する溶液を得ることができる。また当業者に周知の手段により、該化合物を含有する濃縮液を得ることもできる。このようにして得られた化合物は、さらに硫安分画法、有機溶媒分画法、透析、等電点沈殿法またはカラムクロマトグラフィーなど、通常のタンパク質の精製法を単独または組み合わせて用いることにより、精製することもできる。
【００２２】
【実施例】
本発明を以下に実施例をあげて説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００２３】
実施例１
（１）組換えベクターの作製
生体膜通過シグナル配列を含有するペプチドと増強グリーン蛍光タンパク質（Enhanced Green Fluorescence Protein）（以下、ＥＧＦＰと略称する）との融合タンパク質を製造するために、以下のプライマーを用いた。該核酸を得るための５´側のプライマーは、制限酵素の認識配列、生体膜通過シグナル配列をコードする塩基配列およびＥＧＦＰ遺伝子の５´側の一部と同一の塩基配列を含有した塩基配列からなる。３´側のプライマーとしては、配列番号６の塩基配列からなるオリゴマーを用いた。本実施例において、生体膜通過シグナル配列としては、ＴＡＴの細胞内導入ドメイン、または連続するアルギニン１１残基、９残基もしくは７残基を用いた。以下、ＴＡＴを含有する前記融合タンパク質をＴＡＴ−ＥＧＦＰ、連続するアルギニン１１残基を含有する前記融合タンパク質を１１Ｒ−ＥＧＦＰ、連続するアルギニン９残基を含有する前記融合タンパク質を９Ｒ−ＥＧＦＰ、連続するアルギニン７残基を含有する前記融合タンパク質を７Ｒ−ＥＧＦＰとする。また、生体膜通過シグナル配列を有さないＥＧＦＰのみの融合タンパク質をコントロールとして用いた。それぞれの融合タンパク質をコードする核酸を得るために、ＴＡＴ−ＥＧＦＰに対しては配列番号７、１１Ｒ−ＥＧＦＰに対しては配列番号８、９Ｒ−ＥＧＦＰに対しては配列番号９、７Ｒ−ＥＧＦＰに対しては配列番号１０およびコントロールの融合タンパク質に対しては配列番号１１に示す塩基配列を、ポリメラーゼ連鎖反応（以下、ＰＣＲと略称する）における５´側のプライマーとして用いた。
【００２４】
前記融合タンパク質をコードする核酸を得るために、それぞれのプライマーを用い、１０ｎｇのＥＧＦＰ遺伝子（クロンテク社（Clontech Inc）製）を鋳型としてＰＣＲを実施した。ＰＣＲは、９４℃で３０秒間、６２℃で３０秒間および７２℃で１分間を１サイクルとし、これを３０サイクル行うことで実施した。
【００２５】
ＰＣＲ終了後、１．５％の低融点アガロース（ギブコビーアールエル社（GIBCO BRL）製）ゲルを用いた電気泳動にて反応溶液を展開し、目的のＰＣＲ産物を含むゲルを切り取った。ついで、該ゲル切片に対してＱＩＡＥＸＩＩＧｅｌＥｘｔｒａｃｔｉｏｎＫｉｔ（キアゲン社（QIAGEN）製）を用い、該キットのプロトコールにしたがってＰＣＲ産物を精製した。最終的に、精製したＰＣＲ産物を１０μｌの純水に溶解させた。ついで、ＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩをそれぞれ５ユニット用いて該ＰＣＲ産物を３７℃で４時間かけて消化したのち、該反応液を６５℃で１５分間インキュベーションすることにより制限酵素を失活させた。
【００２６】
一方、ｐＥＴ−２１ａ（＋）（ノバゲン社製）１μｇを、ＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩをそれぞれ５ユニット用いて３７℃で４時間かけて消化したのち、１％アガロースゲルを用いる電気泳動にて該反応溶液を展開した。展開後、ＱＩＡＥＸＩＩＧｅｌＥｘｔｒａｃｔｉｏｎＫｉｔ（キアゲン社製）を用い、該キットのプロトコールにしたがいｐＥＴ−２１ａ（＋）を精製した。
【００２７】
前記のように調製したＰＣＲ産物およびｐＥＴ−２１ａ（＋）を２：１のモル比で混合し、ＤＮＡＬｉｇａｔｉｏｎＫｉｔＶｅｒ．１（宝酒造株式会社製）を用いて１６℃で１時間ライゲーションを行うことにより、組換えベクターを得た。
【００２８】
（２）融合タンパク質の発現および精製
（１）にて作製した組換えベクターで大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）（ギブコ（GIBCO）社製）を形質転換させた。すなわち、組換えベクターを含むライゲーション液２μｌをＢＬ２１（ＤＥ３）と穏かに混和した後、氷中で３０分間放置した。ついで、４２℃で６０秒間インキュベートし、氷中で１分間冷却して形質転換体を得た。
【００２９】
該形質転換体を１００μｇ／ｍｌアンピシリン含有ＬＢ寒天培地（ペプトン１０ｇ／ｌ、酵母エキス５ｇ／ｌ、塩化ナトリウム５ｇ／ｌ、寒天１２ｇ／ｌ）に塗布し、３７℃で一晩培養した。形成されたコロニーの１つを１００μｇ／ｍｌアンピシリン含有ＬＢ液体培地（ペプトン１０ｇ／ｌ、酵母エキス５ｇ／ｌ、塩化ナトリウム５ｇ／ｌ）１ｌに接種し、吸光度のＯＤ６００が０．８になるまで３７℃にて振とう培養した。培養後、遠心分離機にて菌体を回収し、溶解液（２０ｍＭヘペス（ＨＥＰＥＳ）（pH８．０）、１００ｍＭ塩化ナトリウム、８Ｍ尿素、２０ｍＭイミダゾール）１００ｍｌを加えて該菌体を溶かした。このように処理した菌体を超音波破砕装置により破砕し、ついで遠心分離機にて不溶成分を除去した後、Ｎｉ−ＮＴＡアガロース（インビトロゲン社（Invitrogen）製）のカラムに付して、目的の融合タンパク質を精製した。精製されたＴＡＴ−ＥＧＦＰのアミノ酸配列を配列番号１２に、１１Ｒ−ＥＧＦＰのアミノ酸配列を配列番号１３に、９Ｒ−ＥＧＦＰのアミノ酸配列を配列番号１４に、７Ｒ−ＥＧＦＰのアミノ酸配列を配列番号１５に、コントロールのアミノ酸配列を配列番号１６に示す。
【００３０】
（３）Ｃｏｓ−７への融合タンパク質の導入
１０％ウシ胎児血清含有ダルベッコ改変イーグル培地（以下、ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳと略称する）を用い、シャーレ内のガラスカバースリップ上にＣｏｓ−７を播種（２×１０⁵細胞個／ｃｍ²）して、炭酸ガス培養装置（３７℃、５％炭酸ガス濃度に設定）にて培養した。（２）にて精製したＴＡＴ−ＥＧＦＰ、１１Ｒ−ＥＧＦＰ、９Ｒ−ＥＧＦＰ、７Ｒ−ＥＧＦＰまたはコントロール１μＭを該培養液に添加し、前記同様の条件に設定した炭酸ガス培養装置にて３０分間インキュベーションした。ついで培地を交換し、同様の条件でさらに３０分間インキュベーションした。インキュベーション後、４％パラホルムアルデヒドで細胞を固定し、４９０ｎＭの励起によるＥＧＦＰの蛍光を蛍光顕微鏡で観察した。それらの顕微鏡写真を図１に示した。図中、（ａ）はコントロールの融合タンパク質、（ｂ）はＴＡＴ−ＥＧＦＰ、（ｃ）は１１Ｒ−ＥＧＦＰ、（ｄ）は９Ｒ−ＥＧＦＰおよび（ｅ）は７Ｒ−ＥＧＦＰを添加して培養した細胞を示す。（ｂ）（ｃ）および（ｄ）の灰色または灰白色は、細胞内でＥＧＦＰが発光していることを意味する。（ａ）および（ｅ）においては、ＥＧＦＰの強いシグナルは観察されなかった。
【００３１】
その結果、（ｂ）ではＣｏｓ−７細胞内にシグナルが観察されたが、（ｃ）に比較して微弱である。また、（ｃ）、（ｄ）および（ｅ）の比較により、連続したアルギニン数が減少するにしたがい、シグナルの強度も弱まることが観察された。コントロールとして用いたＥＧＦＰに関しては、シグナルが観察されなかった。なお、比較時のレーザーの強さは一定である。
【００３２】
実施例２
Ｃｏｓ−７内に導入された融合タンパク質量を、比較するために以下の操作を行った。シャーレ内のガラスカバースリップ上に播種（２×１０⁵細胞個／ｃｍ²）したＣｏｓ−７を、ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳを用いて、炭酸ガス培養装置にて実施例１（３）と同様の条件で培養した。ついで培地を交換し、さらに３０分間同様の条件でインキュベーションした。インキュベーション後、実施例１（２）にて精製した融合タンパク質１μｇを実施例１（３）と同様にして培養液に添加し、炭酸ガス培養装置にて３０分間インキュベーションした。ついで培地を交換し、さらに３０分間同様の条件でインキュベーションした。
【００３３】
インキュベーション後に細胞を回収し、該細胞からタンパク質を抽出したのち、ＥＣＬウエスタンブロッテイング検出システム（アマシャム社（Amersham）製）を用いてそれぞれの融合タンパク質量を比較した。すなわち、抽出したタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥにて展開し、分離されたタンパク質をニトロセルロース膜に電気的にブロッティングした。ついで該ニトロセルロース膜を、５％粉ミルクを含有した０．２％ツイーン２０（Tween 20）およびＴＢＳ（トリス３ｇ／ｌ、塩化ナトリウム８ｇ／ｌ、塩化カリウム０．２ｇ／ｌ、ｐＨ７．４）溶液中で、室温で２時間抗体と反応させた。ついで、該抗体に二次抗体を結合させ、２次抗体に付加されている標識の化学発光量から、導入した融合タンパク質量を推定した。測定結果を図２に示す。縦軸は、それぞれのタンパク質量を１１Ｒ−ＥＧＦＰのタンパク質量に対するパーセンテージで示したものである。図２に示すように、１１Ｒ−ＥＧＦＰは、ＴＡＴ−ＧＦＰに比較して４倍程度導入効率がよいことが確認された（ｎ＝３）。また、１１Ｒ−ＥＧＦＰは、９Ｒ−ＥＧＦＰおよび７Ｒ−ＥＧＦＰと比較しても、優れた導入効率を示した。なお、図中のＥＧＦＰはコントロールを意味し、生体膜通過シグナル配列を有さないＥＧＦＰのみの融合タンパク質である。
【００３４】
実施例３
（１）融合ペプチドの合成および精製
フルオレセインイソチオシアネート（以下、ＦＩＴＣと略称する）、連続したアルギニン１１残基およびＰＫＩからなる融合ペプチド（以下、１１Ｒ−ＰＫＩと略称する）、ならびにＦＩＴＣ、核移行シグナル配列（以下、ＮＬＳと略称する）、連続したアルギニン１１残基およびＰＫＩからなる融合ペプチド（以下、ＮＬＳ−１１Ｒ−ＰＫＩと略称する）を人工合成し、高性能液体クロマトグラフィーにて該ペプチドを精製した。１１Ｒ−ＰＫＩのペプチド配列を配列番号１７に、ＮＬＳ−１１Ｒ−ＰＫＩを配列番号１８に示す。ＦＩＴＣは、それぞれのペプチドのアミノ末端に付加されている。なお、合成された融合ペプチドは、高性能液体クロマトグラフィーにより９９．８％まで精製された。
【００３５】
（２）神経細胞の調製
神経細胞培養は、ヤンゼット（Yan, Z.）らの文献（Nat. Neurosci.、第２巻、１３〜１７頁、２０００年）にしたがって実施した。すなわち、１８週の胎児ラット（ジャパンエスエルシー社（Japan SLC Inc.）製）海馬を外科的に取り出し、トリプシン（０．２５％トリプシン、１０ｍＭＥＤＴＡ）を用いて神経細胞を分離した。分離した神経細胞をラミニン／ポリＤ−リシンでコートしたガラスカバースリップ上に播種（２×１０⁵細胞個／ｃｍ²）し、無血清神経基本培地（serum-free Neurobasal medium）（ギブコビーアールエル社製）にB２７サプリメンツ（B27 supplements）（ギブコビーアールエル社製）を添加した培地を用いて、炭酸ガス培養装置（３７℃、５％炭酸ガス濃度に設定）にて培養した。
【００３６】
（３）神経細胞への融合ペプチドの導入
１１Ｒ−ＰＫＩまたはＮＬＳ−１１Ｒ−ＰＫＩの１μＭを、（２）にて調製した神経細胞の培養液中に添加し、該炭酸ガス培養装置にて３０分間インキュベーションした。ついで培地を交換し、さらに３０分間同様の条件で細胞をインキュベーションした。インキュベーション後、４％パラホルムアルデヒドで該細胞を固定し、ＦＩＴＣの蛍光を蛍光顕微鏡で観察した。それらの顕微鏡写真を図３に示す。図中、（ａ）は１１Ｒ−ＰＫＩを導入した細胞であり、（ｂ）はＮＬＳ−１１Ｒ−ＰＫＩを導入した細胞である。灰色または灰白色は、細胞内でＦＩＴＣが発光している部分を示す。その結果、（ａ）において１１Ｒ−ＰＫＩは神経細胞全体に導入され、ＮＬＳ−１１Ｒ−ＰＫＩは神経細胞の核内に導入されている様子が観察された。１はＦＩＴＣで染色された神経細胞を示し、２はＦＩＴＣで染色された神経細胞の核を示す。
【００３７】
実施例４
ルワイエフ（Lu Y. F.）らの文献（Eur. J. Neurosci.、第１１巻、７５〜８２頁、１９９９年）にしたがい、７週のウイスターラットより海馬スライスを作製した。すなわち、ラットをエーテル麻酔下で断頭屠殺し、頭蓋骨を素早く取り除き、脳を摘出する。取り出した脳を、９５％Ｏ₂および５％ＣＯ₂の混合ガスで飽和させて氷冷した人工脳脊髄液（１２４ｍＭ塩化ナトリウム、４．４ｍＭ塩化カリウム、２．５ｍＭ塩化カルシウム、１．３ｍＭ硫酸マグネシウム、１ｍＭリン酸二水素一ナトリウム、２６ｍＭ炭酸水素ナトリウム、１０ｍＭグルコース）（以下、ＡＣＳＦと略称する）中にて１分間放置する。ついで、９５％Ｏ₂および５％ＣＯ₂で飽和させたＡＣＳＦ（以下、９５％Ｏ₂+５％ＣＯ₂+ＡＣＳＦと略称する）を満たしたシャーレに脳を移し、脳べラを用いて海馬を摘出する。取り出した海馬はマキルウェイン組織チョッパー（McILwain tissue chopper）を用いて厚さ４００μｍのスライスにする。該スライスを、９５％Ｏ₂+５％ＣＯ₂+ＡＣＳＦを満たした器に入れ、酸素を充分に供給しながら、室温で４０分間インキュンベーションした。
【００３８】
該海馬スライスを、実施例２（１）にて得たＮＬＳ−１１Ｒ−ＰＫＩを１μＭ含有し９５％Ｏ₂+５％ＣＯ₂+ＡＣＳＦを用いて、３０℃で１時間環流した。ついで、９５％Ｏ₂+５％ＣＯ₂+ＡＣＳＦのみを用い、該スライスをさらに３０分間環流した。環流後、該スライスを４％パラホルムアルデヒドで固定し、該スライスに５０００倍希釈したＭＡＰ−２抗体（シグマ社（Sigma）製）を反応させた。なお、ＭＡＰ−２は神経細胞の特異的マーカーであり、樹状突起に存在する。ついで、５００倍希釈したローダミン二次抗体（ケミコンインターナショナル社（CHEMICON international）製）で該スライスを染色したのち、蛍光顕微鏡にて観察した。その結果、ローダミンが発する赤橙色光とＦＩＴＣが発する黄緑色の光はほぼ重なることがなく、すなわちＭＡＰ−２が樹状突起に存在するのに対して、ＮＬＳ−１１Ｒ−ＰＫＩは神経細胞核内に導入されている様子が肉眼で確認できた。図４は、該スライスの蛍光顕微鏡写真である。図中、３は神経細胞を示す。また、４で示した白色部分は導入されたＮＬＳ−１１Ｒ−ＰＫＩの存在によりＦＩＴＣで染色された神経細胞の核を、５で示した灰色部分はＭＡＰ−２の存在によりローダミンで染色された樹状突起を示す。
【００３９】
実施例５
海馬のスライスを、１００ｎＭもしくは１μＭのＮＬＳ−１１Ｒ−ＰＫＩまたは１００ｎＭもしくは１μＭの１１Ｒ−ＰＫＩを含有し９５％Ｏ₂および５％ＣＯ₂で飽和した９５％Ｏ₂+５％ＣＯ₂+ＡＣＳＦを用いて、実施例３と同様に３０℃で１時間環流した。続いて該ペプチドを含有しないＡＣＳＦのみを用い、さらに３０分間環流した。最終濃度が１０μＭのフォルスコリン（カルバイオケム社（Calbiochem）製）を含有する９５％Ｏ₂+５％ＣＯ₂+ＡＣＳＦにより、該スライスを１０分間刺激した。なお、フォルスコリンは、ＰＫＡを活性化させる薬剤である。ついで、該スライスに０．１％ＳＤＳ溶液を３００μｌ添加することにより反応を停止させた。本実施例において、ネガティブコントロールとしては、融合ペプチドを含有しない９５％Ｏ₂+５％ＣＯ₂+ＡＣＳＦのみを用いて環流し、つづくフォルスコリン刺激を行わないスライスを用いた（コントロール１）。ポジティブコントロールとしては、融合ペプチドを含有しない９５％Ｏ₂+５％ＣＯ₂+ＡＣＳＦのみを用いて環流し、つづくフォルスコリン刺激を行ったスライスを用いた（コントロール２）。
【００４０】
ついで、スライスを超音波破砕装置により破砕し、それぞれ１０μｇのタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離した後、タンパク質をニトロセルロース膜に電気的にブロッティングした。ついで、ｐｈｏｓｐｈｏ−ＣＲＥＢ（Ｓ１３３）（ニューイングランドバイオラブ社（New England Biolab）製）抗体およびｐｈｏｓｐｈｏ−ＧｌｕＲ１（アップステイトバイオテクノロジー社（UPSTATE biotechnology）製）を用いてウェスタンブロットを、実施例１（４）と同様の手順にて行った。ｐｈｏｓｐｈｏ−ＣＲＥＢはリン酸化されたＣＲＥＢを認識する抗体であり、ｐｈｏｓｐｈｏ−ＧｌｕＲ１はリン酸化されたＧｌｕＲ１を認識する抗体である。なお、ＧｌｕＲ１は後シナプスに特異的に発現しているタンパク質であり、ＣＲＥＢ同様にＰＫＡによりリン酸化されることが知られている。
【００４１】
図５にウェスタンブロットの結果を示す。図５に示されるように、ＮＬＳ−１１Ｒ−ＰＫＩは、ＣＲＥＢのリン酸化のみを阻害し、ＧｌｕＲ１のリン酸化には影響しない。すなわち、ＮＬＳ−１１Ｒ−ＰＫＩは、核内でのみ機能を発揮していることが確認された。一方、１１Ｒ−ＰＫＩは、ＣＲＥＢおよびＧｌｕＲ１双方のリン酸化を阻害することが確認された。なおアクチンは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに用いたそれぞれのタンパク質量が等量であることを示す。また、図中の＋はフォルスコリンによる刺激を実施したことを示し、−はフォルスコリンによる刺激を実施しなかったことを示す。
【００４２】
実施例６
７〜８週の雄Ｃ５７ＢＬ６マウスより海馬スライスを作製した。４００μｍの厚さのスライスを、ＮＬＳ−１１Ｒ−ＰＫＩまたはＮＬＳ−１１Ｒ−ＧＦＰ（配列番号１９）１μＭを含有し９５％Ｏ₂+５％ＣＯ₂+ＡＣＳＦを用いて、融合ペプチドおよび興奮性シナプス後電位（以下、ＥＰＳＰと略称する）が安定するまで２８．５±０．５℃にて４５分間環流した。ついで、該スライスを、融合ペプチドを含有しない９５％Ｏ₂+５％ＣＯ₂+ＡＣＳＦで環流した。９５％Ｏ₂+５％ＣＯ₂+ＡＣＳＦのみを用いた環流を実施してから３０分後に、海馬スライスへの刺激を行った。本実施例におけるテスト刺激は、０．０１７Ｈｚである。刺激の強さは、１００Ｈｚ、１秒間でＥＰＳＰカーブの最大刺激を得ることのできる、５０％に設定した。
【００４３】
刺激装置（日本光電社製）を用いて１００Ｈｚ、１秒の刺激を５分間隔で３回行うことにより超長期増強（以下、Ｌ−ＬＴＰと略称する）を誘導した。解析は、マッキントシュ解析ソフトＭａｃＬＡＢ（アップルコンピュータ社（Apple Computer）製）にて行った。記録の結果を図６に示す。また、図７は、刺激してから３時間後のＥＰＳＰスロープを示す。図７中のコントロールとは、融合ペプチドを用いずに環流したスライスを意味する。また、図中の＊は、コントロールと比較しＰ＜０．０１であることを意味する。なお、Ｌ−ＬＴＰとは、１００Ｈｚ、１秒の刺激を５分間隔で３回行うことにより、海馬におけるＥＰＳＰが３時間以上増強する現象である。
【００４４】
図６および図７に示されたように、ＮＬＳ−１１Ｒ−ＰＫＩはＬ−ＬＴＰの誘導を阻害し、ＮＬＳ−１１Ｒ−ＧＦＰはＬ−ＬＴＰの誘導に影響しないという結果を得た。このＬ−ＬＴＰの誘導には核内に存在するＣＲＥＢのリン酸化が必須であるとされており、すなわち本実施例においても、ＮＬＳ−１１Ｒ−ＰＫＩが細胞外部から添加されただけで核内に導入され、機能したことが確認できた。
【００４５】
実施例７
アルギニン１１残基をコードする核酸配列、核移行シグナル配列をコードする核酸配列、ならびにＢａｍＨＩおよびＮｄｅＩの認識配列を含むオリゴヌクレオチドを合成した。該オリゴヌクレオチド配列を配列番号２０に示す。ついで、ＢａｍＨＩおよびＮｄｅＩをそれぞれ５ユニット用い、該オリゴヌクレオチドを３７℃で４時間かけて消化した。また、ｐＥＴ−２１ａ（＋）１μｇを、制限酵素としてＢａｍＨＩおよびＮｄｅＩを用いたほかは実施例１（１）と同様にして調製した。
【００４６】
前記のように調製したオリゴヌクレオチドおよびｐＥＴ−２１ａ（＋）を２：１のモル比で混合し、ＤＮＡＬｉｇａｔｉｏｎＫｉｔＶｅｒ．１（宝酒造株式会社製）を用いて１６℃で１時間ライゲーションを行うことにより、組換えベクターを作製した。ついで、該ライゲーション液２μｌをライゲーション液として用いたほかは、実施例１（２）と同様にして形質転換体を得た。つづいて、該形質転換体を形質転換体として用いたほかは、実施例１（２）と同様にしてアンピシリン含有ＬＢ寒天培地上で培養し、形成されたコロニーの１つを１ｌのアンピシリン含有ＬＢ液体培地に接種し、３７℃にて一晩振とう培養した。培養後、菌液を遠心して集菌し、該菌体から定法によりプラスミドＤＮＡを調製し、本ベクターをＰＥＴ−１１Ｒ−ＮＬＳと命名した。配列番号２１に該ベクターの塩基配列を、また図８に該ベクターの模式図を示す。図中、Ｔ７はＴ７プロモータ、ＭＣＳはマルチクローニングサイトであり、ＮＳＬは核移行シグナル配列をコードすることを示す。
【００４７】
実施例８
（１）アルギニン１１残基をコードする核酸を含有するベクターの作製
アルギニン１１残基をコードする核酸配列ならびにＢａｍＨＩおよびＮｄｅＩの認識配列を含むオリゴヌクレオチドを合成した。該オリゴヌクレオチド配列を配列番号２２に示す。ついで、ＢａｍＨＩおよびＮｄｅＩをそれぞれ５ユニット用い、該オリゴヌクレオチドを３７℃で４時間かけて消化した。また、ｐＥＴ−２１ａ（＋）、制限酵素としてＢａｍＨＩおよびＮｄｅＩを用いたほかは実施例１（１）と同様にして調製した。
【００４８】
前記のように調製したオリゴヌクレオチドおよびｐＥＴ−２１ａ（＋）を２：１のモル比で混合し、ＤＮＡＬｉｇａｔｉｏｎＫｉｔＶｅｒ．１（宝酒造株式会社製）を用いて１６℃で１時間ライゲーションを行うことにより、組換えベクターを作製した。ついで、該ライゲーション液２μｌをライゲーション液として用いたほかは、実施例１（２）と同様にして形質転換体を得た。つづいて、該形質転換体を形質転換体として用いたほかは、実施例１（２）と同様にしてアンピシリン含有ＬＢ寒天培地上で培養し、形成されたコロニーの１つを１ｌのアンピシリン含有ＬＢ液体培地に接種し、３７℃にて一晩振とう培養した。培養後、菌液を遠心して集菌し、該菌体から定法によりプラスミドＤＮＡを調製した。
【００４９】
（２）後シナプス移行シグナル配列の挿入
後シナプス移行シグナル配列（ＰＳＤともいう）をコードする塩基配列ならびにＮｏｔＩおよびＸｈｏＩの認識配列を含む配列番号２３に示すオリゴヌクレオチドを合成した。ついで、ＮｏｔＩおよびＸｈｏＩをそれぞれ５ユニット用い、該オリゴヌクレオチドを３７℃で４時間かけて消化した。また、（１）にて調製した組換えベクターも同様にＮｏｔＩおよびＸｈｏＩで消化した。
【００５０】
前記のように調製したオリゴヌクレオチドおよびベクターを２：１のモル比で混合し、ＤＮＡＬｉｇａｔｉｏｎＫｉｔＶｅｒ．１（宝酒造株式会社製）を用いて１６℃で１時間ライゲーションを行うことにより、組換えベクターを作製した。ついで、該ライゲーション液２μｌをライゲーション液として用いたほかは、実施例１（２）と同様にして形質転換体を得た。つづいて、該形質転換体を形質転換体として用いたほかは、実施例１（２）と同様にしてアンピシリン含有ＬＢ寒天培地上で培養し、形成されたコロニーの１つを１ｌのアンピシリン含有ＬＢ液体培地に接種し、３７℃にて一晩振とう培養した。培養後、菌液を遠心して集菌し、該菌体から定法によりプラスミドＤＮＡを調製した。本ベクターをＰＥＴ−１１Ｒ−ＰＳＤと命名した。配列番号２４に該ベクターの塩基配列を、また図９に該ベクターの模式図を示す。図中、Ｔ７はＴ７プロモータ、ＭＣＳはマルチクローニングサイトであり、ＰＳＤは後シナプス移行配列をコードすることを示す。
【００５１】
【発明の効果】
本発明により、生体膜通過シグナル配列、細胞内の特定部位への選択的導入シグナル配列および生物活性物質からなり細胞外部から細胞内の特定部位に効率的に送達され得る化合物ならびに該化合物の送達方法を提供した。本発明を用いれば、通常であれば細胞膜を通過しない化合物であっても、本発明に基づいて目的化合物を製造し、該化合物を細胞に接触させるだけで、細胞内の特定部位に局在させることが可能となる。したがって、たとえば薬剤として作用するペプチドを細胞核内に局在させることが望まれる場合などに、本発明の化合物は非常に有効である。さらに本発明は、該化合物を製造するために有用なベクターをも提供した。該ベクターを用いれば、生体膜通過シグナル配列、細胞内の特定部位への選択的導入シグナル配列および生物活性物質からなり細胞外部から細胞内の特定部位に効率的に送達され得る化合物を容易に製造することができる。
【００５２】
【配列表フリーテキスト】
配列番号６：ＥＧＦＰとの融合タンパク質をコードする核酸配列を得るためのポリメラーゼ連鎖反応用３´プライマー
配列番号７：ＴＡＴ−ＥＧＦＰをコードする核酸配列を得るためのポリメラーゼ連鎖反応用５´プライマー
配列番号８：１１Ｒ−ＥＧＦＰをコードする核酸配列を得るためのポリメラーゼ連鎖反応用５´プライマー
配列番号９：９Ｒ−ＥＧＦＰをコードする核酸配列を得るためのポリメラーゼ連鎖反応用５´プライマー
配列番号１０：７Ｒ−ＥＧＦＰをコードする核酸配列を得るためのポリメラーゼ連鎖反応用５´プライマー
配列番号１１：ＥＧＦＰをコードする核酸配列を得るためのポリメラーゼ連鎖反応用５´プライマー
配列番号１２：ＴＡＴ−ＥＧＦＰのアミノ酸配列
配列番号１３：１１Ｒ−ＥＧＦＰのアミノ酸配列
配列番号１４：９Ｒ−ＥＧＦＰのアミノ酸配列
配列番号１５：７Ｒ−ＥＧＦＰのアミノ酸配列
配列番号１６：ＥＧＦＰとヒスチジンタグを含む融合タンパク質のアミノ酸配列配列番号１７：１１Ｒ−ＰＫＩのアミノ酸配列
配列番号１８：ＮＬＳ−１１Ｒ−ＰＫＩのアミノ酸配列
配列番号１９：ＮＬＳ−１１Ｒ−ＧＦＰのアミノ酸配列
配列番号２０：ＰＥＴ−１１Ｒ−ＮＬＳを製造するためのオリゴヌクレオチドリンカー
配列番号２１：ＰＥＴ−１１Ｒ−ＮＬＳの塩基配列
配列番号２２：アルギニン１１残基をコードするオリゴヌクレオチドリンカー
配列番号２３：ＰＳＤをコードするオリゴヌクレオチドリンカー
配列番号２４：ＰＥＴ−１１Ｒ−ＰＳＤの塩基配列
【００５３】
【配列表】

【図面の簡単な説明】
【図１】コントロールの融合タンパク質（ａ）、ＴＡＴ−ＥＧＦＰ（ｂ）、１１Ｒ−ＥＧＦＰ（ｃ）、９Ｒ−ＥＧＦＰ（ｄ）または７Ｒ−ＥＧＦＰ（ｅ）を導入されたＣｏｓ−７の蛍光顕微鏡写真である。
【図２】Ｃｏｓ−７に導入された１１Ｒ−ＥＧＦＰのタンパク質量に対するそれぞれの融合タンパク質量を示す図である。
【図３】１１Ｒ−ＰＫＩ（ａ）またはＮＬＳ−１１Ｒ−ＰＫＩ（ｂ）を導入された神経細胞の蛍光顕微鏡写真である。
【図４】ＦＩＴＣおよびローダミンで染色された海馬スライスの蛍光顕微鏡写真である。
【図５】ＮＬＳ−１１Ｒ−ＰＫＩまたは１１Ｒ−ＰＫＩによるＣＲＥＢのリン酸化阻害を示す図である。
【図６】海馬スライスの電気生理学的変化を示す図である。
【図７】刺激してから３時間後のＥＰＳＰを示す棒グラフである。
【図８】ＰＥＴ−１１Ｒ−ＮＬＡの模式図である。
【図９】ＰＥＴ−１１Ｒ−ＰＳＤの模式図である。
【符号の説明】
１培養神経細胞
２培養神経細胞の核
３海馬スライスにおける神経細胞
４海馬スライスにおける神経細胞の核
５海馬スライスにおける神経細胞の樹状突起[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a compound comprising a biological membrane passage signal sequence and a selective introduction signal sequence to a specific site in a cell, which can be delivered from outside the cell to a specific site in the cell, and a method for delivering the compound to a specific site in the cell About. The present invention also relates to a vector containing a base sequence encoding a signal transmembrane signal sequence and a signal sequence for selective introduction into a specific site in a cell.
[0002]
[Prior art]
At present, using advanced genetic engineering techniques, molecular mechanisms such as specific genes, proteins encoded by the genes, and / or activation of the proteins have been studied in detail, and numerous papers have been published regarding these studies. .
[0003]
For example, regarding the molecular mechanism of memory, it has been reported that phosphorylation of the transcription factor CREB present in the nucleus of nerve cells by PKA induces memory (Frey. U. et al., Science, 260, 1661-1664, 1993; Abel, T. et al., Cell 88, 615-626, 1997). In addition, the phosphorylation by PKA is known to be inhibited by PKI (Kemp, BE et al., Methods Enzymol., 159, 173-183, 1988). Therefore, when PKI is introduced into the nucleus, induction of the molecular mechanism of memory is inhibited, and it is considered that further elucidation of the molecular mechanism of memory becomes possible by using such a technique.
[0004]
For example, it has been reported that allergic diseases, specifically atopic dermatitis, are caused by increased production of IL-4 (Bellanti JA et al., Allergy Asthma Proc., 19th (6)). 337-341, 1998). Further, for example, Huntington's disease is known to be caused by abnormally elongated polyglutamic acid inside a protein involved in the disease (Li XJ et al., Nature, Vol. 378 (6555)). 398-402, 1995). Incidentally, it has been reported that peptide nucleic acids suppress transcription in a cell-free system (Ray A. et al., FASEBJ, 14 (9), 1041-1060, 2000). Therefore, if a peptide nucleic acid corresponding to the IL-4 gene or a gene responsible for Huntington's disease is applied to atopic dermatitis or a patient with Huntington's disease, the expression of each protein can be suppressed, which is a preferable therapeutic agent It is possible. However, PNA alone cannot pass through the cell membrane, and its application at the biological level is limited.
[0005]
Conventionally, as a method for introducing a desired substance into the cell from outside the cell, there is a method using TAT protein. International Publication No. WO 00/34308 describes a compound containing a partial peptide sequence of TAT as an intracellular transduction domain. However, the present inventors have confirmed that the intracellular transduction domain (PTD domain) of TAT is toxic to neurons. The toxicity shown here is long-term potentiation and inhibition of long-term suppression in hippocampal neurons. Therefore, when the purpose is to introduce a therapeutic agent into nerve cells, it is not preferable to use the intracellular introduction domain of TAT. Further, as a method not using the TAT intracellular transduction domain, there is International Publication No. WO 98/52614. According to this document, a polymer composed of 6 to 25 subunits and having at least 50% of the subunits having a guanidino group or an amide group in a side chain is useful as a signal sequence for passing through a biological membrane. It is described. However, this document does not describe the localization of a desired substance at a specific site in a cell. Further, a method using a peptide derived from the Drosophila antennapedia homeodomain (Derossi, D. et al., J. Biol. Chem., 271, 18188-181936, 1996), or the herpesvirus There are methods using VP22 (Elliott, G. and O 'Hare, P, Cell, Vol. 88, pages 223-233, 1997). However, at present, there is no report that a substance existing outside the cell is actually localized at a specific site in the cell.
[0006]
[Problems to be solved by the invention]
As described above, regarding a desired substance that cannot pass through a biological membrane, in particular, a cell membrane, how to enable delivery of the substance from the outside of the cell to a specific site in the cell has become a big issue. Accordingly, an object of the present invention is to provide a compound containing a biologically active substance that can be efficiently delivered from the outside of the cell to a specific site in the cell, a method for delivering the compound, and a vector useful for producing the compound. It is.
[0007]
[Means for Solving the Problems]
This invention solves the said subject by delivering a desired substance to the specific site | part in a cell by using a biomembrane passage signal sequence and the selective introduction | transduction signal sequence to the specific site | part in a cell. That is, the present invention
(1) A compound that contains a signal translocation signal through a biological membrane and a signal sequence for selective introduction into a specific site in a cell, and can be localized at a specific site in the cell. A peptide comprising a group to 13 residues, and a compound wherein the signal sequence for selective introduction into a specific site in the cell is a nuclear translocation signal sequence or a post-synaptic translocation signal sequence
(2) The compound according to the above (1), wherein the biological membrane passage signal sequence is a peptide consisting of 11 residues of arginine,
(3) The compound according to the above (1), wherein the nuclear translocation signal sequence consists of the peptide sequence shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing,
(4) The compound according to (1) above, wherein the post-synaptic transition signal sequence consists of the peptide sequence shown in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing,
(5) The compound according to (1), (2), (3) or (4), which contains a biologically active substance,
(6) The compound according to (5), wherein the biologically active substance is an organic compound,
(7) The compound according to the above (6), wherein the organic compound is a peptide nucleic acid, peptide or protein,
(8) a transcription inhibitor comprising the compound according to (7), wherein the organic compound is a peptide nucleic acid;
(9) The compound according to (7), wherein the organic compound is a peptide or protein,
(10) A PKA inhibitor comprising the compound according to (9), wherein the peptide is a partial peptide of PKI,
(11) The compound described in the above (1), (2), (3), (4), (5), (6), (7), (8), (9) or (10) A method of localizing the compound at a specific site in a cell, comprising contacting the cell membrane;
(12) A vector comprising a base sequence encoding a biological membrane passage signal sequence and a base sequence encoding a selective introduction signal sequence to a specific site in a cell, and a vector used for the production of the compound according to (1) ,
(13) The vector according to (12) above, wherein the signal sequence for selective introduction into a specific site in the cell is a nuclear translocation signal sequence, and comprises the base sequence shown in SEQ ID NO: 21 in the sequence listing;
(14) The vector according to (12), wherein the signal sequence for selective introduction into a specific site in the cell is a post-synaptic translocation signal sequence, and comprises the base sequence shown in SEQ ID NO: 24 in the sequence listing.
[0008]
Compounds that can be delivered to specific sites within these cells, methods of delivering the compounds, and vectors useful for producing the compounds can be obtained based on embodiments of the invention described below.
[0009]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
The “biological membrane passage signal sequence” used in the present invention means a signal sequence that can pass through a biological membrane found in cells. The biological membrane passage signal sequence is a peptide sequence composed of continuous arginine, preferably 9 to 13 residues of arginine, more preferably 11 residues of arginine. When the continuous arginine is 8 residues or less or 14 residues or more, the efficiency of passage through the biological membrane from the outside of the cell into the cell depending on the peptide decreases.
[0010]
The “specific site in the cell” means, for example, the inside of an organelle such as the nucleus, the post-synapse, the pre-synapse, the mitochondria, the Golgi apparatus, or the membrane. Further, the specific site within the cell includes the cell membrane.
[0011]
The “selective introduction signal sequence to a specific site in a cell” means a signal sequence that serves as a signal sequence for delivery to a specific site in a cell, and any signal sequence has such an action. May be used. For example, the signal sequence includes a nuclear translocation signal sequence that enables translocation from the cytoplasm into the nucleus, a post-synaptic translocation signal sequence that allows translocation from the cytoplasm to the post-synapse, and translocation from the cytoplasm to the cell membrane. Examples thereof include a cell membrane transition signal sequence, a Golgi transition signal sequence that enables a transition from the cytoplasm to the Golgi apparatus, or a presynaptic transition signal sequence that allows a transition from the cytoplasm to the presynapse. Specifically, for example, as the nuclear translocation signal sequence, the amino acid sequence PKKKRV (SEQ ID NO: 1) which is the SV40 nuclear translocation signal (Benditt JO et al., Proc Natl Acad Sci USA, Vol. 86 (23), 9327- 9331, 1989; Rihs HP et al., EMBO J, 10 (3), 633-639, 1991), and the amino acid sequence LIESDV (SEQ ID NO: 2) as the post-synaptic transition signal sequence ( Setou M et al., Science, Vol. 288 (5472), pages 1796 to 1802).
[0012]
The term “biologically active substance” in the present specification means a general term for substances that cause a biological reaction. Examples of biologically active substances include organic compounds such as peptide nucleic acids, peptides, polypeptides or proteins. Biologically active substances such as peptide nucleic acids, peptides, polypeptides or proteins may be modified with sugars or lipids. As the nucleic acid, a peptide nucleic acid is preferable because it is excellent in stability and, for the purpose of transcriptional repression, it binds to double-stranded DNA with high affinity. The peptide, polypeptide or protein may be composed not only of L-amino acids but also part or all of D-amino acids or artificial amino acids. Further, the peptide, polypeptide or protein may be a fusion comprising two or more of these, for example, a fusion of two peptides, a fusion of a peptide and a protein or a fusion of two proteins. Also good. According to the present invention, specific peptide nucleic acids include peptide nucleic acids having a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence of the gene for the purpose of suppressing transcription of the gene causing the disease, such as a protein involved in allergy. A known partial nucleic acid 5′-TCTCACCTCCCCAACT-3 ′ (SEQ ID NO: 3) of IL-4 gene, partial nucleic acid 5′-AGGGTCGCCATGGCGTC-3 ′ (SEQ ID NO: 4) of Huntington's disease gene, or the like can be used. Moreover, as a peptide, the partial peptide FIASGRTGRRNAI (sequence number 5) of PKI can be used in order to suppress the function of PKA. In this specification, “IL-4” means interleukin 4 which is a kind of cytokine. In the present specification, “PKI” means a protein kinase A (hereinafter abbreviated as PKA) inhibitor.
[0013]
Localization of the compound of the present invention from outside the cell to a specific site in the cell can be achieved by bringing the compound into contact with a cell membrane facing the outside of the cell. As a method of bringing the compound of the present invention into contact with the cell membrane facing the outside of the cell, for example, when a cultured cell is used as the cell, it is only necessary to add the compound to the culture solution of the cultured cell. Further, for example, when a cell in a mammalian body is used as the cell, the compound can be localized at a specific site in the cell by administering it intravenously or by absorbing it from the skin. Alternatively, the compound can be introduced from the cornea as an eye drop.
[0014]
The vector used for the production of the compound of the present invention is a skeleton vector comprising a base sequence that encodes a biological membrane passage signal sequence and a base sequence that encodes a signal sequence for selective introduction into a specific site in a cell. It can be manufactured by connecting. There is no restriction | limiting in the vector used as frame | skeleton, Those skilled in the art can select suitably. As the vector, for example, a plasmid vector can be used. As the plasmid vector, for example, a pET vector (manufactured by Novagen, Inc.), specifically, pET-21a (+) or pET-28a (+) (manufactured by Novagen) is preferable. The base sequence for insertion into the skeleton vector may be the base sequence encoding the selective introduction signal sequence to a specific site in the cell on the 3 'side of the base sequence encoding the biological membrane passage signal sequence. Alternatively, a base sequence encoding a selective introduction signal sequence to a specific site in the cell may be arranged on the 5 ′ side of the base sequence encoding the biological membrane passage signal sequence. Moreover, it is preferable to insert several bases unrelated to the signal sequence, for example, 3 bases encoding glycine, between two base sequences encoding the signal sequence. Furthermore, the vector of the present invention may contain a base sequence for adding a tag such as a histidine tag or a flag (FLAG) tag or a label such as green fluorescent protein to a target compound.
[0015]
The method for producing the vector is not limited, but, for example, at least both ends of the base sequence encoding a signal signal passing through a biological membrane and a signal sequence for selective introduction into a specific site in a cell, and a restriction site for insertion into a vector. Can be obtained by synthesizing the oligonucleotide contained in, and inserting the oligonucleotide into a backbone vector. Oligonucleotide synthesis methods are well known to those skilled in the art, and a commercially available nucleic acid automatic synthesizer can also be used. The restriction site can be appropriately selected depending on the vector to be used. For example, when pET-21a (+) is used as the backbone vector, recognition sequences for NdeI and BamHI can be selected as the restriction site.
[0016]
When the bioactive substance contained in the compound of the present invention is a peptide nucleic acid, the compound can be produced by disulfide bonding between a signal sequence and the bioactive substance under reducing conditions. Specifically, a cysteine is added to the amino terminus at the peptide nucleic acid synthesis stage, and the carboxyl group is also synthesized at the synthesis stage of a peptide containing a signal transmembrane signal sequence and a signal sequence for selective introduction into a specific site in a cell. Add cysteine to the terminal. These two substances are then disulfide-bonded under reducing conditions, for example, in a solution containing 50 mM sodium phosphate, pH 7.2, 100 mM sodium chloride, 10 mM magnesium chloride, 1 mM ethylene glycol tetraacetic acid for 1 hour and subjected to high performance liquid chromatography. Purify by
[0017]
Peptide nucleic acid oligomers can be synthesized according to Hanvey JC et al. (Science, 258 (5087), 1481-1485, 1992). It can be synthesized using the EXPEDITE 8909 synthesizer. Alternatively, a phosphatidylserine-polyethylene glycol-PAL (PerSeptive Biosystems) resin and a nucleobase monomer having a fluorenylmethoxycarbonyl protecting group in the presence of diisopropylethylamine and 2,6-lutidine. -protected nucleobase monomers) (manufactured by Perceptive Biosystems). The synthesized peptide nucleic acid oligomer is released from the resin, and the protecting group can be cleaved by leaving it at room temperature for 2 hours in the presence of 80% trifluoroacetic acid containing 20% by volume m-cresol. The peptide nucleic acid oligomer can then be precipitated with -20 ° C ethyl ether and purified by reverse phase HPLC at 55 ° C.
[0018]
When the biologically active substance contained in the compound of the present invention is a peptide, polypeptide or protein, the compound can be synthesized by a commercially available peptide synthesizer. The compound is transformed into a host cell with a recombinant vector in which a base sequence encoding a biologically active substance is linked to the vector, the resulting transformant is cultured, and the target compound is collected from the culture. Can also be obtained.
[0019]
When the compound of the present invention is obtained using the vector, the host cell used for transformation is not limited, and any host cell can be used as long as the recombinant vector can be replicated and expressed. Examples of the host cell include Escherichia coli. Specifically, for example, Escherichia coli BL21 (DE3) (manufactured by Stratagene) may be used. Transformation of a host using the recombinant vector can be appropriately performed by a method well known to those skilled in the art, for example, by incubation at 42 ° C. for 30 minutes in ice.
[0020]
The culture conditions for the transformant can be appropriately selected depending on the host cell, and are not limited to specific conditions. Culturing can be performed under the medium and culture conditions usually used in this technical field. When the host cell is Escherichia coli, for example, glucose, glycerol, starch and the like can be used as the carbon source, and ammonium salts such as ammonium sulfate, ammonium nitrate and ammonium acetate, nitrate, tryptone and peptone can be used as the nitrogen source. In addition, a small amount of inorganic metals, vitamins, growth promoting factors such as thiamine, yeast extract containing biotin and the like may be added. These medium components may be in concentrations that do not inhibit the growth of transformants. The medium is usually adjusted to pH 7.0 to 7.5 and sterilized before use. The culture temperature may be any temperature at which the transformant can grow, and it is usually preferable to culture at 30 to 37 ° C. When the transformant is subjected to liquid culture, shaking culture or aeration and agitation culture is preferable. The culture time varies depending on various culture conditions, but in the case of shaking culture or aeration and agitation culture, it is appropriate to culture for 14 to 19 hours. When the lactose promoter is present in the recombinant vector to be used, after culturing at 37 ° C. until the absorbance at 600 nm reaches 0.6 to 0.8, isopropylthiogalactoside (IPTG) is added and further cultured. The expression of the target compound may be induced.
[0021]
After completion of the culture, a solution containing the target compound from which insoluble matters such as the cell walls of the cells have been removed from the culture solution can be obtained by an ordinary method such as centrifugation, filtration or coprecipitation. A concentrated solution containing the compound can also be obtained by means well known to those skilled in the art. The compound thus obtained can be obtained by further using ordinary protein purification methods such as ammonium sulfate fractionation, organic solvent fractionation, dialysis, isoelectric precipitation or column chromatography, alone or in combination. It can also be purified.
[0022]
【Example】
The present invention will be described below with reference to examples, but the present invention is not limited to these examples.
[0023]
Example 1
(1) Production of recombinant vector
In order to produce a fusion protein of a peptide containing a biological membrane passage signal sequence and Enhanced Green Fluorescence Protein (hereinafter abbreviated as EGFP), the following primers were used. The 5′-side primer for obtaining the nucleic acid comprises a restriction enzyme recognition sequence, a base sequence encoding a biological membrane passage signal sequence, and a base sequence containing the same base sequence as the 5′-side part of the EGFP gene. Become. As the 3 ′ primer, an oligomer having the base sequence of SEQ ID NO: 6 was used. In this example, the intracellular translocation domain of TAT, or continuous arginine 11 residue, 9 residue or 7 residue was used as the biological membrane passage signal sequence. Hereinafter, the fusion protein containing TAT is TAT-EGFP, the fusion protein containing 11 consecutive arginine residues is 11R-EGFP, and the fusion protein containing 9 consecutive arginine residues is 9R-EGFP. The fusion protein containing 7 arginine residues is designated as 7R-EGFP. Further, an EGFP-only fusion protein having no biological membrane passage signal sequence was used as a control. To obtain nucleic acids encoding the respective fusion proteins, SEQ ID NO: 7 for TAT-EGFP, SEQ ID NO: 8 for 11R-EGFP, SEQ ID NO: 9, 7R-EGFP for 9R-EGFP On the other hand, for the fusion protein of SEQ ID NO: 10 and the control fusion protein, the base sequence shown in SEQ ID NO: 11 was used as a 5'-side primer in the polymerase chain reaction (hereinafter abbreviated as PCR).
[0024]
In order to obtain a nucleic acid encoding the fusion protein, PCR was carried out using 10 ng of the EGFP gene (manufactured by Clontech Inc.) as a template using each primer. PCR was performed by performing 30 cycles of 94 ° C. for 30 seconds, 62 ° C. for 30 seconds, and 72 ° C. for 1 minute.
[0025]
After completion of PCR, the reaction solution was developed by electrophoresis using a 1.5% low melting point agarose (GIBCO BRL) gel, and the gel containing the desired PCR product was cut out. Next, the QIAEX II Gel Extraction Kit (manufactured by QIAGEN) was used to purify the PCR product according to the protocol of the kit. Finally, the purified PCR product was dissolved in 10 μl of pure water. Next, the PCR product was digested at 37 ° C. for 4 hours using 5 units each of BamHI and EcoRI, and then the restriction enzyme was inactivated by incubating the reaction solution at 65 ° C. for 15 minutes.
[0026]
On the other hand, 1 μg of pET-21a (+) (manufactured by Novagen) was digested with 5 units of BamHI and EcoRI for 4 hours at 37 ° C., and then the reaction solution was subjected to electrophoresis using 1% agarose gel. Expanded. After development, pET-21a (+) was purified using QIAEX II Gel Extraction Kit (Qiagen) according to the protocol of the kit.
[0027]
The PCR product prepared as described above and pET-21a (+) were mixed at a molar ratio of 2: 1, and DNA Ligation Kit Ver. Using 1 (Takara Shuzo Co., Ltd.), ligation was performed at 16 ° C. for 1 hour to obtain a recombinant vector.
[0028]
(2) Expression and purification of the fusion protein
Escherichia coli BL21 (DE3) (manufactured by GIBCO) was transformed with the recombinant vector prepared in (1). That is, 2 μl of the ligation solution containing the recombinant vector was gently mixed with BL21 (DE3) and then left on ice for 30 minutes. Subsequently, it was incubated at 42 ° C. for 60 seconds and cooled in ice for 1 minute to obtain a transformant.
[0029]
The transformant was applied to 100 μg / ml ampicillin-containing LB agar medium (peptone 10 g / l, yeast extract 5 g / l, sodium chloride 5 g / l, agar 12 g / l) and cultured at 37 ° C. overnight. One of the formed colonies was inoculated into 1 liter of an LB liquid medium (peptone 10 g / l, yeast extract 5 g / l, sodium chloride 5 g / l) containing 100 μg / ml ampicillin until the OD600 of absorbance reached 0.8. Cultured with shaking at 0 ° C. After the culture, the cells were collected with a centrifuge, and 100 ml of a lysis solution (20 mM HEPES (pH 8.0), 100 mM sodium chloride, 8M urea, 20 mM imidazole) was added to dissolve the cells. The cells treated in this manner are crushed with an ultrasonic crusher, then insoluble components are removed with a centrifuge, and then applied to a column of Ni-NTA agarose (manufactured by Invitrogen). The fusion protein was purified. The amino acid sequence of purified TAT-EGFP is SEQ ID NO: 12, the amino acid sequence of 11R-EGFP is SEQ ID NO: 13, the amino acid sequence of 9R-EGFP is SEQ ID NO: 14, and the amino acid sequence of 7R-EGFP is SEQ ID NO: 15. The amino acid sequence of the control is shown in SEQ ID NO: 16.
[0030]
(3) Introduction of fusion protein into Cos-7
Using a Dulbecco's modified Eagle medium containing 10% fetal bovine serum (hereinafter abbreviated as DMEM + 10% FBS), Cos-7 was seeded on a glass cover slip in a petri dish (2 × 10 ^Five Cells / cm ² Then, the cells were cultured in a carbon dioxide culture apparatus (set at 37 ° C. and 5% carbon dioxide concentration). TAT-EGFP, 11R-EGFP, 9R-EGFP, 7R-EGFP or 1 μM of control purified in (2) was added to the culture solution and incubated for 30 minutes in a carbon dioxide culture apparatus set to the same conditions as described above. . The medium was then changed and incubated for another 30 minutes under similar conditions. After the incubation, the cells were fixed with 4% paraformaldehyde, and the fluorescence of EGFP by 490 nM excitation was observed with a fluorescence microscope. Their micrographs are shown in FIG. In the figure, (a) is a control fusion protein, (b) is TAT-EGFP, (c) is 11R-EGFP, (d) is 9R-EGFP, and (e) is a cell cultured with 7R-EGFP added. Indicates. (B) The gray or grayish white color of (c) and (d) means that EGFP is emitting light in the cell. In (a) and (e), no strong signal of EGFP was observed.
[0031]
As a result, in (b), a signal was observed in Cos-7 cells, but it was weak compared to (c). Further, by comparing (c), (d) and (e), it was observed that the signal intensity decreased as the number of consecutive arginines decreased. No signal was observed for EGFP used as a control. The intensity of the laser at the time of comparison is constant.
[0032]
Example 2
In order to compare the amount of fusion protein introduced into Cos-7, the following operation was performed. Seeding on glass cover slip in petri dish (2 × 10 ^Five Cells / cm ² Cos-7 was cultured under the same conditions as in Example 1 (3) in a carbon dioxide culture apparatus using DMEM + 10% FBS. The medium was then changed and incubated for another 30 minutes under the same conditions. After incubation, 1 μg of the fusion protein purified in Example 1 (2) was added to the culture solution in the same manner as in Example 1 (3), and incubated for 30 minutes in a carbon dioxide culture apparatus. The medium was then changed and incubated for another 30 minutes under the same conditions.
[0033]
After incubation, the cells were collected, and proteins were extracted from the cells, and then the amounts of the respective fusion proteins were compared using an ECL western blotting detection system (manufactured by Amersham). That is, the extracted protein was developed by SDS-PAGE, and the separated protein was electrically blotted onto a nitrocellulose membrane. The nitrocellulose membrane was then added to a 0.2% Tween 20 and TBS (Tris 3 g / l, sodium chloride 8 g / l, potassium chloride 0.2 g / l, pH 7.4) solution containing 5% milk powder. And reacted with the antibody for 2 hours at room temperature. Next, a secondary antibody was bound to the antibody, and the amount of the introduced fusion protein was estimated from the amount of chemiluminescence of the label added to the secondary antibody. The measurement results are shown in FIG. The vertical axis indicates the amount of each protein as a percentage of the amount of 11R-EGFP protein. As shown in FIG. 2, it was confirmed that 11R-EGFP had about four times the introduction efficiency better than TAT-GFP (n = 3). 11R-EGFP also showed excellent introduction efficiency even when compared with 9R-EGFP and 7R-EGFP. In addition, EGFP in a figure means a control and is a fusion protein of only EGFP which does not have a biological membrane passage signal sequence.
[0034]
Example 3
(1) Synthesis and purification of fusion peptide
Fluorescein isothiocyanate (hereinafter abbreviated as FITC), a fusion peptide consisting of consecutive 11 arginine residues and PKI (hereinafter abbreviated as 11R-PKI), and FITC, nuclear translocation signal sequence (hereinafter abbreviated as NLS) A fusion peptide consisting of 11 consecutive arginine residues and PKI (hereinafter abbreviated as NLS-11R-PKI) was artificially synthesized, and the peptide was purified by high performance liquid chromatography. The peptide sequence of 11R-PKI is shown in SEQ ID NO: 17, and NLS-11R-PKI is shown in SEQ ID NO: 18. FITC is added to the amino terminus of each peptide. The synthesized fusion peptide was purified to 99.8% by high performance liquid chromatography.
[0035]
(2) Preparation of nerve cells
Nerve cell culture was performed according to the document of Yan, Z. et al. (Nat. Neurosci., Vol. 2, pages 13-17, 2000). That is, an 18-week fetal rat (Japan SLC Inc.) hippocampus was surgically removed, and nerve cells were isolated using trypsin (0.25% trypsin, 10 mM EDTA). Dissociated neurons are seeded on glass coverslips coated with laminin / poly D-lysine (2 × 10 ^Five Cells / cm ² ) And carbon dioxide gas culture using a serum-free neurobasal medium (Gibco BRL) supplemented with B27 supplements (Gibco BRL). The cells were cultured in an apparatus (set at 37 ° C. and 5% carbon dioxide concentration).
[0036]
(3) Introduction of fusion peptide into neurons
1 μM of 11R-PKI or NLS-11R-PKI was added to the culture medium of nerve cells prepared in (2), and incubated for 30 minutes in the carbon dioxide culture apparatus. The medium was then changed and the cells were incubated for 30 minutes under the same conditions. After the incubation, the cells were fixed with 4% paraformaldehyde, and FITC fluorescence was observed with a fluorescence microscope. Those micrographs are shown in FIG. In the figure, (a) is a cell into which 11R-PKI has been introduced, and (b) is a cell into which NLS-11R-PKI has been introduced. Gray or grayish white indicates a portion where FITC emits light in the cell. As a result, it was observed in (a) that 11R-PKI was introduced into the entire nerve cell and NLS-11R-PKI was introduced into the nucleus of the nerve cell. 1 indicates a nerve cell stained with FITC, and 2 indicates a nucleus of the nerve cell stained with FITC.
[0037]
Example 4
Hippocampal slices were prepared from 7-week Wistar rats according to the literature of Lu YF et al. (Eur. J. Neurosci., Vol. 11, pp. 75-82, 1999). That is, the rats are decapitated under ether anesthesia, the skull is quickly removed, and the brain is removed. 95% O of the removed brain ₂ And 5% CO ₂ Artificial cerebrospinal fluid (124 mM sodium chloride, 4.4 mM potassium chloride, 2.5 mM calcium chloride, 1.3 mM magnesium sulfate, 1 mM monosodium dihydrogen phosphate, 26 mM sodium bicarbonate, (10 mM glucose) (hereinafter abbreviated as ACSF) for 1 minute. Next, 95% O ₂ And 5% CO ₂ Saturated with ACSF (95% O ₂ + 5% CO ₂ The brain is transferred to a petri dish that satisfies (abbreviated as “ACSF”), and the hippocampus is extracted using a lamina. The extracted hippocampus is sliced into 400 μm thick using a McILwain tissue chopper. The slice is 95% O ₂ + 5% CO ₂ A container filled with + ACSF was incubated for 40 minutes at room temperature with a sufficient supply of oxygen.
[0038]
The hippocampal slice contained 1 μM NLS-11R-PKI obtained in Example 2 (1) and contained 95% O. ₂ + 5% CO ₂ Reflux with + ACSF at 30 ° C. for 1 hour. Next, 95% O ₂ + 5% CO ₂ The slices were refluxed for an additional 30 minutes using only + ACSF. After the reflux, the slice was fixed with 4% paraformaldehyde, and the slice was reacted with a MAP-2 antibody (Sigma) diluted 5000 times. MAP-2 is a specific marker for neurons and is present in dendrites. Subsequently, the slice was stained with a rhodamine secondary antibody diluted by 500 times (manufactured by CHEMICON international) and then observed with a fluorescence microscope. As a result, the red-orange light emitted by rhodamine and the yellow-green light emitted by FITC do not substantially overlap, that is, MAP-2 is present in dendrites, whereas NLS-11R-PKI is present in the nerve cell nucleus. The state of introduction was confirmed with the naked eye. FIG. 4 is a fluorescence micrograph of the slice. In the figure, 3 indicates a nerve cell. The white part indicated by 4 is the nucleus of the nerve cell stained with FITC due to the presence of the introduced NLS-11R-PKI, and the gray part indicated by 5 is the tree stained with rhodamine due to the presence of MAP-2. Shows a protrusion.
[0039]
Example 5
Hippocampal slices contain 95% O containing 100 nM or 1 μM NLS-11R-PKI or 100 nM or 1 μM 11R-PKI. ₂ And 5% CO ₂ 95% O saturated with ₂ + 5% CO ₂ Using + ACSF, the mixture was refluxed at 30 ° C. for 1 hour as in Example 3. Subsequently, only ACSF containing no peptide was used and refluxed for another 30 minutes. 95% O containing forskolin (Calbiochem) with a final concentration of 10 μM ₂ + 5% CO ₂ The slices were stimulated with + ACSF for 10 minutes. Forskolin is a drug that activates PKA. Subsequently, the reaction was stopped by adding 300 μl of 0.1% SDS solution to the slice. In this example, 95% O containing no fusion peptide was used as a negative control. ₂ + 5% CO ₂ + Slices that were perfused with only ACSF and were not stimulated with forskolin (control 1). As a positive control, 95% O containing no fusion peptide ₂ + 5% CO ₂ + Slices that were refluxed using only ACSF and subsequently stimulated with forskolin were used (Control 2).
[0040]
Next, the slices were crushed with an ultrasonic crusher, and 10 μg of each protein was separated by SDS-PAGE, and then the protein was electrically blotted onto a nitrocellulose membrane. Subsequently, Western blotting was performed using Example 1 (4) using phospho-CREB (S133) (New England Biolab) antibody and phospho-GluR1 (UPSTATE biotechnology). ). Phospho-CREB is an antibody that recognizes phosphorylated CREB, and phospho-GluR1 is an antibody that recognizes phosphorylated GluR1. GluR1 is a protein that is specifically expressed at the post-synapse and is known to be phosphorylated by PKA as in CREB.
[0041]
FIG. 5 shows the results of Western blotting. As shown in FIG. 5, NLS-11R-PKI inhibits only CREB phosphorylation and does not affect GluR1 phosphorylation. That is, it was confirmed that NLS-11R-PKI exhibits a function only in the nucleus. On the other hand, 11R-PKI was confirmed to inhibit phosphorylation of both CREB and GluR1. In addition, actin shows that each protein amount used for SDS-PAGE is an equal amount. Further, + in the figure indicates that stimulation with forskolin was performed, and − indicates that stimulation with forskolin was not performed.
[0042]
Example 6
Hippocampal slices were prepared from 7-8 week old male C57BL6 mice. 400 μm thick slices containing 95 μl of NLS-11R-PKI or NLS-11R-GFP (SEQ ID NO: 19) 1 μM ₂ + 5% CO ₂ + ACSF was used to reflux at 28.5 ± 0.5 ° C. for 45 minutes until the fusion peptide and excitatory post-synaptic potential (hereinafter abbreviated as EPSP) were stabilized. The slice is then treated with 95% O containing no fusion peptide. ₂ + 5% CO ₂ Refluxed with + ACSF. 95% O ₂ + 5% CO ₂ + Stimulation of hippocampal slices was performed 30 minutes after reflux using only ACSF. The test stimulus in this example is 0.017 Hz. The intensity of stimulation was set to 50% at which the maximum stimulation of the EPSP curve could be obtained in 100 Hz for 1 second.
[0043]
Ultra-long-term enhancement (hereinafter abbreviated as L-LTP) was induced by performing stimulation at 100 Hz for 1 second three times at 5-minute intervals using a stimulator (Nihon Kohden Co., Ltd.). The analysis was performed with Macintosh analysis software MacLAB (manufactured by Apple Computer). The result of recording is shown in FIG. FIG. 7 shows the EPSP slope 3 hours after stimulation. The control in FIG. 7 means a slice that has been refluxed without using the fusion peptide. Moreover, * in the figure means that P <0.01 compared with the control. L-LTP is a phenomenon in which EPSP in the hippocampus is enhanced for 3 hours or more by performing stimulation at 100 Hz for 1 second 3 times at 5 minute intervals.
[0044]
As shown in FIGS. 6 and 7, NLS-11R-PKI inhibited the induction of L-LTP, and NLS-11R-GFP did not affect the induction of L-LTP. It is said that phosphorylation of CREB present in the nucleus is essential for the induction of L-LTP. That is, in this example, NLS-11R-PKI is added to the nucleus only by adding from outside the cell. It was confirmed that it was installed and worked.
[0045]
Example 7
Oligonucleotides were synthesized containing a nucleic acid sequence encoding 11 arginine residues, a nucleic acid sequence encoding a nuclear translocation signal sequence, and BamHI and NdeI recognition sequences. The oligonucleotide sequence is shown in SEQ ID NO: 20. Subsequently, the oligonucleotide was digested at 37 ° C. for 4 hours using 5 units each of BamHI and NdeI. Further, 1 μg of pET-21a (+) was prepared in the same manner as in Example 1 (1) except that BamHI and NdeI were used as restriction enzymes.
[0046]
The oligonucleotide prepared as described above and pET-21a (+) were mixed at a molar ratio of 2: 1, and DNA Ligation Kit Ver. Using 1 (Takara Shuzo Co., Ltd.), ligation was performed at 16 ° C. for 1 hour to prepare a recombinant vector. Subsequently, a transformant was obtained in the same manner as in Example 1 (2) except that 2 μl of the ligation solution was used as the ligation solution. Subsequently, except that the transformant was used as a transformant, it was cultured on an ampicillin-containing LB agar medium in the same manner as in Example 1 (2), and one of the formed colonies was 1 l of ampicillin-containing LB. A liquid medium was inoculated and cultured overnight at 37 ° C. with shaking. After the cultivation, the bacterial solution was collected by centrifugation, and plasmid DNA was prepared from the cells by a conventional method. This vector was named PET-11R-NLS. SEQ ID NO: 21 shows the base sequence of the vector, and FIG. 8 shows a schematic diagram of the vector. In the figure, T7 is a T7 promoter, MCS is a multicloning site, and NSL indicates a nuclear translocation signal sequence.
[0047]
Example 8
(1) Preparation of a vector containing a nucleic acid encoding arginine 11 residue
An oligonucleotide containing a nucleic acid sequence encoding 11 arginine residues and recognition sequences for BamHI and NdeI was synthesized. The oligonucleotide sequence is shown in SEQ ID NO: 22. Subsequently, the oligonucleotide was digested at 37 ° C. for 4 hours using 5 units each of BamHI and NdeI. Moreover, it prepared like Example 1 (1) except having used BETHI and NdeI as a restriction enzyme and pET-21a (+).
[0048]
The oligonucleotide prepared as described above and pET-21a (+) were mixed at a molar ratio of 2: 1, and DNA Ligation Kit Ver. Using 1 (Takara Shuzo Co., Ltd.), ligation was performed at 16 ° C. for 1 hour to prepare a recombinant vector. Subsequently, a transformant was obtained in the same manner as in Example 1 (2) except that 2 μl of the ligation solution was used as the ligation solution. Subsequently, except that the transformant was used as a transformant, it was cultured on an ampicillin-containing LB agar medium in the same manner as in Example 1 (2), and one of the formed colonies was 1 l of ampicillin-containing LB. A liquid medium was inoculated and cultured overnight at 37 ° C. with shaking. After culturing, the bacterial solution was centrifuged to collect bacteria, and plasmid DNA was prepared from the cells by a conventional method.
[0049]
(2) Insertion of post-synaptic signal sequence
An oligonucleotide shown in SEQ ID NO: 23 was synthesized comprising a base sequence encoding a post-synaptic signal sequence (also referred to as PSD) and a recognition sequence for NotI and XhoI. The oligonucleotide was then digested for 4 hours at 37 ° C. using 5 units of NotI and XhoI each. The recombinant vector prepared in (1) was similarly digested with NotI and XhoI.
[0050]
The oligonucleotide and the vector prepared as described above were mixed at a molar ratio of 2: 1, and DNA Ligation Kit Ver. Using 1 (Takara Shuzo Co., Ltd.), ligation was performed at 16 ° C. for 1 hour to prepare a recombinant vector. Subsequently, a transformant was obtained in the same manner as in Example 1 (2) except that 2 μl of the ligation solution was used as the ligation solution. Subsequently, except that the transformant was used as a transformant, it was cultured on an ampicillin-containing LB agar medium in the same manner as in Example 1 (2), and one of the formed colonies was 1 l of ampicillin-containing LB. A liquid medium was inoculated and cultured overnight at 37 ° C. with shaking. After culturing, the bacterial solution was centrifuged to collect bacteria, and plasmid DNA was prepared from the cells by a conventional method. This vector was named PET-11R-PSD. SEQ ID NO: 24 shows the base sequence of the vector, and FIG. 9 shows a schematic diagram of the vector. In the figure, T7 is a T7 promoter, MCS is a multicloning site, and PSD indicates a post-synaptic translocation sequence.
[0051]
【The invention's effect】
According to the present invention, a compound comprising a biological transmembrane signal sequence, a selective introduction signal sequence to a specific site in a cell, and a biologically active substance that can be efficiently delivered from the outside of the cell to the specific site in the cell, and a method for delivering the compound Provided. If the present invention is used, even if it is a compound that does not normally pass through the cell membrane, the target compound is produced based on the present invention, and the compound is only brought into contact with the cell and localized at a specific site in the cell. It becomes possible. Therefore, for example, when it is desired to localize a peptide acting as a drug in the cell nucleus, the compound of the present invention is very effective. Furthermore, the present invention also provides a vector useful for producing the compound. By using this vector, a compound consisting of a signal transmembrane signal sequence, a signal sequence for selective introduction into a specific site in a cell, and a biologically active substance can be easily produced from the outside of the cell to a specific site in the cell. can do.
[0052]
[Sequence Listing Free Text]
SEQ ID NO: 6: 3 ′ primer for polymerase chain reaction for obtaining a nucleic acid sequence encoding a fusion protein with EGFP
SEQ ID NO: 7: 5 ′ primer for polymerase chain reaction for obtaining a nucleic acid sequence encoding TAT-EGFP
SEQ ID NO: 8: 5 ′ primer for polymerase chain reaction for obtaining a nucleic acid sequence encoding 11R-EGFP
SEQ ID NO: 9: 5 ′ primer for polymerase chain reaction for obtaining a nucleic acid sequence encoding 9R-EGFP
SEQ ID NO: 10: 5 ′ primer for polymerase chain reaction for obtaining a nucleic acid sequence encoding 7R-EGFP
SEQ ID NO: 11: 5 ′ primer for polymerase chain reaction for obtaining a nucleic acid sequence encoding EGFP
SEQ ID NO: 12: amino acid sequence of TAT-EGFP
SEQ ID NO: 13: amino acid sequence of 11R-EGFP
SEQ ID NO: 14: Amino acid sequence of 9R-EGFP
SEQ ID NO: 15: amino acid sequence of 7R-EGFP
SEQ ID NO: 16: amino acid sequence of a fusion protein containing EGFP and a histidine tag SEQ ID NO: 17: amino acid sequence of 11R-PKI
SEQ ID NO: 18: Amino acid sequence of NLS-11R-PKI
SEQ ID NO: 19: Amino acid sequence of NLS-11R-GFP
SEQ ID NO: 20: oligonucleotide linker for producing PET-11R-NLS
SEQ ID NO: 21: Base sequence of PET-11R-NLS
SEQ ID NO: 22: oligonucleotide linker encoding arginine 11 residue
SEQ ID NO: 23: oligonucleotide linker encoding PSD
SEQ ID NO: 24: Base sequence of PET-11R-PSD
[0053]
[Sequence Listing]

[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a fluorescence micrograph of Cos-7 introduced with a control fusion protein (a), TAT-EGFP (b), 11R-EGFP (c), 9R-EGFP (d) or 7R-EGFP (e). It is.
FIG. 2 is a graph showing the amount of each fusion protein relative to the amount of 11R-EGFP protein introduced into Cos-7.
FIG. 3 is a fluorescence micrograph of nerve cells into which 11R-PKI (a) or NLS-11R-PKI (b) has been introduced.
FIG. 4 is a fluorescence micrograph of hippocampal slices stained with FITC and rhodamine.
FIG. 5 shows inhibition of CREB phosphorylation by NLS-11R-PKI or 11R-PKI.
FIG. 6 shows electrophysiological changes in hippocampal slices.
FIG. 7 is a bar graph showing EPSP 3 hours after stimulation.
FIG. 8 is a schematic diagram of PET-11R-NLA.
FIG. 9 is a schematic diagram of PET-11R-PSD.
[Explanation of symbols]
1 cultured neurons
2 Nuclei of cultured neurons
3 Neurons in hippocampal slices
4 Nerve cell nuclei in hippocampal slices
5 Neuronal dendrites in hippocampal slices

Claims

生体膜通過シグナル配列および細胞内の特定部位への選択的導入シグナル配列を含有し細胞内の特定部位に局在することができる化合物であり、該生体膜通過シグナル配列がアルギニン９残基〜１３残基からなるペプチド、および該細胞内の特定部位への選択的導入シグナル配列が核移行シグナル配列である化合物。A compound containing a signal transduction signal sequence and a signal sequence for selective introduction into a specific site in a cell and capable of localizing at a specific site in the cell, the signal sequence passing through the biomembrane is 9 residues to 13 arginines compound peptides consisting of residues, and selective introduction signal sequence into a specific site in said cell is a nuclear localization signal sequence.

前記生体膜通過シグナル配列がアルギニン１１残基からなるペプチドである請求項１記載の化合物。 The compound according to claim 1, wherein the biological membrane passage signal sequence is a peptide consisting of 11 arginine residues.

前記核移行シグナル配列が配列表の配列番号１に示したペプチド配列からなる請求項１記載の化合物。 The compound according to claim 1, wherein the nuclear translocation signal sequence consists of a peptide sequence shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing.

生物活性物質を含有する請求項１、２または３記載の化合物。4. A compound according to claim 1, 2 or 3 containing a biologically active substance.

前記生物活性物質が有機化合物である請求項４記載の化合物。The compound according to claim 4 , wherein the biologically active substance is an organic compound.

前記有機化合物がペプチド核酸、ペプチドまたはタンパク質である請求項５記載の化合物。6. The compound according to claim 5 , wherein the organic compound is a peptide nucleic acid, peptide or protein.

前記有機化合物がペプチド核酸である請求項６記載の化合物からなる転写阻害剤。The transcription inhibitor comprising the compound according to claim 6 , wherein the organic compound is a peptide nucleic acid.

前記有機化合物がペプチドまたはタンパク質である請求項６記載の化合物。The compound according to claim 6 , wherein the organic compound is a peptide or a protein.

前記ペプチドがＰＫＩのＰＫＡ阻害領域のペプチドである請求項８記載の化合物からなるＰＫＡ阻害剤。The PKA inhibitor comprising the compound according to claim 8 , wherein the peptide is a peptide in a PKA inhibitory region of PKI.

請求項１、２、３、４、５、６、７、８または９記載の化合物を非ヒト細胞外部から細胞膜に接触させることからなる、該化合物を非ヒト細胞内の特定部位に局在させる方法。A compound comprising the compound according to claim 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, or 9 that is brought into contact with a cell membrane from the outside of a non-human cell, and the compound is localized at a specific site in the non-human cell. Method.

請求項１、２、３、４、５、６、７、８または９記載の化合物をインビトロにおいて細胞外部から細胞膜に接触させることからなる、該化合物を細胞内の特定部位に局在させる方法。A method for localizing a compound according to claim 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, or 9 to a specific site in a cell, comprising contacting the cell membrane from the outside of the cell in vitro.

生体膜通過シグナル配列をコードした塩基配列および細胞内の特定部位への選択的導入シグナル配列をコードした塩基配列を含有するベクターであり、請求項１記載の化合物の製造に用いるベクター。 A vector comprising a base sequence encoding a biological membrane passage signal sequence and a base sequence encoding a selective introduction signal sequence to a specific site in a cell, which is used for producing the compound according to claim 1.

前記細胞内の特定部位への選択的導入シグナル配列が核移行シグナル配列であり、配列表の配列番号２１に示した塩基配列からなる請求項１２記載のベクター。The vector according to claim 12, wherein the signal sequence for selective introduction into a specific site in the cell is a nuclear translocation signal sequence, and comprises the base sequence shown in SEQ ID NO: 21 in the sequence listing.