JP3946256B2 - Antibody to human interleukin 5 receptor α chain - Google Patents

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Abstract

The present invention provides monoclonal antibodies and humanized antibodies which react specifically with a human interleukin-5 receptor alpha chain. The invention also provides hybridomas and transformants which produce the antibodies, the monoclonal antibodies and humanized antibodies, a method for detecting an interleukin-5 receptor alpha chain immunologically by means of these antibodies, as well as a method for diagnosing and treating diseases such as chronic bronchial asthma by means of the monoclonal antibodies and humanized antibodies. The present invention is useful for diagnosis or treatment of diseases such as chronic bronchial asthma.

Description

技術分野
本発明は、慢性気管支喘息などの疾患の診断あるいは治療に有用であるヒトインターロイキン５受容体α鎖に特異的に結合するモノクローナル抗体およびヒト化抗体ならびに該抗体を生産するハイブリドーマおよび形質転換株、ならびに該モノクローナル抗体および該ヒト化抗体を用いてインターロイキン５受容体α鎖を免疫学的に検出する方法、ならびに該モノクローナル抗体およびヒト化抗体を用いる慢性気管支喘息等の診断および治療に関する。
背景技術
インターロイキン−５（以下、IL-5と称す）は、Ｔ細胞や肥満細胞などにより分泌されるリンホカインの一種である。マウスにおけるIL-5は、Ｂ細胞の分化および増殖因子、好酸球の分化および増殖因子として作用することが知られている。ヒトにおいては、主として好酸球の分化および増殖因子として作用することが知られている［アドバンシーズ・イン・イムノロジー（Advances in Immunology）,57145（1994）、ブラッド（Blood）,79,3101（1992）］。IL-5は好酸球などの細胞表面上に発現されている特異的な受容体（IL-5受容体）を介してその作用を発現する。IL-5受容体（以下、IL-5Rと称す）はヒト、マウスともに２種類の異なる蛋白質［α鎖（以下、IL-5Rαと称す）、β鎖（以下、IL-5Rβと称す）］により構成されることが明らかにされている。さらに、IL-5のIL-5Rへの結合はIL-5Rαによって担われており、IL-5Rβはそれ自体ではIL-5に対する結合能を示さないことが知られている［EMBO・ジャーナル（EMBO J.）,9,4367（1990）、同,10,2833（1991）、ジャーナル・オブ・エキスペリメンタル・メディシン（J.Exp.Med.）,177,1523（1993）、同,175,341（1992）、セル（Cell）,66,1175（1991）、プロシーディング・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Proc.Natl.Acad.Sci.）,89,7041（1992）］。また、IL-5Rβはインターロイキン-3（以下、IL-3と称す）および顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（以下、GM-CSFと称す）などの受容体の構成成分であることが知られている［プロシーディング・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Proc.Natl.Acad.Sci.）,87,9655（1990）、セル（Cell）,66,1165（1991）］。
好酸球は慢性気管支喘息をはじめとするアレルギー性疾患において増加することが知られている。慢性気管支喘息患者の気道には好酸球の著しい浸潤が認められること、好酸球自身が細胞傷害性を有する顆粒蛋白を含み、その蛋白の沈着が慢性気管支喘息患者の気道組織あるいはアトピー性皮膚炎患者の病変部位に認められることなどから好酸球は慢性気管支喘息、アトピー性皮膚炎などのアレルギー性疾患の病態形成において重要な働きをしているものと考えられ［アドバンシーズ・イン・イムノロジー（Adv.Immunol.）,39,177（1986）、イムノロジー・トゥデイ（Immunol.Today）,13,501（1992）］、その動態を把握することは臨床診断上有用である。一方、IL-5はヒトにおいては好酸球に対して特異的に作用することから、IL-5Rは好酸球に特異的に発現されているものと考えられ、IL-5Rはヒト好酸球特異的なマーカーとして利用することができる。さらに、IL-5RβはIL-3、GM-CSF等のサイトカイン受容体であることから、IL-5Rαが好酸球特異的マーカーであると考えられる。従って、抗ヒトIL-5Rα鎖抗体（以下、hIL-5Rα抗体と称す）を用いた免疫細胞染色などにより、特異的に好酸球を検出することができる。しかし、現在特異的に好酸球を検出することが可能な抗ｈIL-5Rα抗体は知られていない。
一方、実際に生体内において好酸球の増多、浸潤にIL-5が重要な働きをしていることは、IL-5遺伝子導入マウスにおいて著しい好酸球増多が認められること［ジャーナル・オブ・エキスペリメンタル・メディシン（J.Exp.Med.）,172,1425（1990）、同,173,429（1991）、インターナショナル・イムノロジー（Int.Immunol.）,2,965（1990）］、喘息モデル動物における好酸球の組織浸潤が抗IL-5抗体の投与により抑制されること［アメリカン・レビュー・オブ・レスピレイトリー・ディジーズ（Am.Rev.Resir.Dis.）,147,548（1993）、同,148,1623（1993）］などから明らかにされている。また、ヒト慢性気管支喘息患者の気道粘膜組織、アトピー性皮膚炎患者の病変部位において、IL-5の発現が認められることも報告されている［ジャーナル・オブ・クリニカル・インベスティゲーション（J.Clin.Invest.）,87,1541（1991）、ジャーナル・オブ・エキスペリメンタル・メディシン（J.Exp.Med.）,173,775（1991）］。さらに、IL-5はヒト好酸球に対して試験管内での寿命延長作用を示すこと［ジャーナル・オブ・イムノロジー（J.Immunol.）,143,2311（1989）］、好酸球選択的な活性化因子であること［ジャーナル・オブ・エキスペリメンタル・メディシン（J.Exp.Med.）,167,219（1988）］などが明らかにされている。
以上のことから、IL-5Rに結合し、IL-5の生物活性を阻害できる抗体は好酸球の活性を抑制し、慢性気管支喘息などのアレルギー性疾患の治療に有用であることが期待される。IL-5の生物活性を阻害できる抗マウスIL-5Rα抗体［特開平3-108497、インターナショナル・イムノロジー（Int.Immunol.）,2,181（1990）］は、マウスIL-5Rをその細胞表面に多数発現しているIL-5依存性細胞を抗原として用いることにより作製されている。一方、ヒトの場合、IL-5Rを多数発現している細胞は知られておらず、好酸球においてもその発現は極めて低いことが報告されている［セルラー・イムノロジー（Cell.Immunol.）,133,484（1991）］。このため、抗マウスIL-5Rα抗体の作製と同様の方法により、同等の機能を有する抗ヒトIL-5Rα抗体を得ることは困難である。EMBO・ジャーナル［EMBO J.,14,3395（1995）］には、ヒトIL-5Rαに対する抗体としてα16と称する抗体の記載があるが、これはIL-5Rαに対する中和活性がないものである。
一方、ヒトIL-5Rαの遺伝子はヒト好酸球［ジャーナル・オブ・エキスペリメンタル・メディシン（J.Exp.Med.）,175,341（1992）］、あるいはヒト前骨髄球系細胞（HL60）［セル（Cell）,66,1175（1991）、特開平6-78772］より調製したcDNAライブラリーをマウスIL-5RαのcDNAあるいはマウスIL-5Rαの部分アミノ酸配列［特開平6-54690、EMBO・ジャーナル（EMBO J.）,9,4367（1990）］を基に合成したオリゴDNAをプローブとしてスクリーニングすることにより得られている。このcDNAを宿主細胞に導入することにより、細胞表面にhIL-5Rαを発現した細胞が造成されているが、この細胞におけるhIL-5Rの発現レベルは一細胞あたり104分子以下と極めて少ない［ジャーナル・オブ・エキスペリメンタル・メディシン（J.Exp.Med.）,177,1523（1993）］。従って、この細胞を免疫原として用いて、抗hIL-5Rα抗体を作製した場合、宿主細胞由来の蛋白質に比較して、hIL-5Rαの相対的な量は極めて少なく、また、絶対的な蛋白量としても極めて少ないことは明らかである。また、マウスIL-5RαとヒトIL-5Rαの間にはアミノ酸レベルで80%近いホモロジーが認められること、マウスIL-5がヒトIL-5Rに対しても高い結合活性を示すこと［ジャーナル・オブ・エキスペリメンタル・メディシン（J.Exp.Med.）,175,341（1992）］などから、被免疫動物として一般的に利用されるマウスやラットに対して、ヒトIL-5Rαは免疫原性が低いと考えられる。実際、hIL-5Rα発現細胞を免疫原として抗hIL-5Rα抗体を作製を行ったが、困難であった。
ヒト好酸球のcDNAライブラリーからのIL-5RαcDNAのクローニングにおいて、IL-5Rαの膜貫通領域以下を欠くＮ末端アミノ酸配列1〜313番目に相当する可溶性ヒトIL-5Rα（以下、shIL-5Rαと称す）をコードするcDNAが得られている［ジャーナル・オブ・エキスペリメンタル・メディシン（J.Exp.Med.）,175,341（1992）］。shIL-5Rαを免疫原として用いて、抗hIL-5Rα抗体を作製した場合、IL-5の生物活性を阻害できる抗hIL-5Rα抗体を取得するためには、細胞表面に発現しているIL-5Rαと同様な高次構造を保持している、真核性宿主細胞より分泌生産されたshIL-5Rαを免疫原として用いることが必要である。また、同一蛋白においてもそのシグナルペプチドにより生産効率が著しく異なることが明らかにされていることから［蛋白質核酸酵素、35、2584（1990）］、分泌生産を行うにあたり、適切なシグナルペプチドを選択する必要がある。
先に述べたようにshIL-5Rαのみをコードするものと考えられているmRNAが好酸球で発現されていることが明らかにされている。マウスにおいてはIL-5Rは、好酸球のみならずＢ細胞などにおいても発現されており、かつヒトの場合と同様に、それらの細胞においてIL-5Rαの細胞外領域（以下、smIL-5Rαと称す）のみをコードするものと考えられているmRNAの発現が確認されている。また、IL-5Rを発現しているマウス慢性Ｂ細胞白血病株（BCLl）を移植されたマウス、あるいは、ヒト自己免疫疾患のモデルマウスの血液中にsmIL-5Rαが検出されることも報告されている［ジャーナル・オブ・イムノロジカル・メソッド（J.Immunol.Method）,167,289（1994）］。これらのことは、IL-5Rを発現している細胞の増多、活性化状態が血液中に分泌されているsmIL-5Rαの量に反映される可能性を示唆している。ヒトの場合、IL-5Rは好酸球に限られた発現をするものと考えられており、好酸球の増多、活性化が血液中などのshIL-5Rαの量に反映される可能性がある。従って、shIL-5Rαの定量を可能にすることは、臨床診断上有用と期待される。
以上のことから、ヒトIL-5Rαに特異的に結合するモノクローナル抗体が取得できればアレルギー性疾患の診断、治療に有用であると考えられるが、一般にヒト以外の動物由来のモノクローナル抗体をヒトに投与すると、異物として認識されることによりヒト体内にヒト以外の動物由来のモノクローナル抗体に対する抗体ができてしまう。その結果、投与されたヒト以外の動物抗体と反応し、副作用を引き起こしたり［ジャーナル・オブ・クリニカル・オンコロジー（J.Clin.Oncol.）,2,881（1984）、ブラッド（Blood）,65,1349（1985）、ジャーナル・オブ・ナショナル・キャンサー・インスティテュート（J.Natl.Cancer Inst.）,80,932（1988）、プロシーディング・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Proc.Natl.Acad.Sci.）,82,1242（1985）］、抗体がはやくクリアランスされたり［ジャーナル・オブ・ニュークレアー・メディシン（J.Nucl.Med.）,26,1011（1985）、ブラッド（Blood）,65,1349（1985）、ジャーナル・オブ・ナショナル・キャンサー・インスティテュート（J.Natl.Cancer Inst.）,80,937（1988）］、抗体の治療効果を減じてしまうことが知られている［ジャーナル・オブ・イムノロジー（J.Immunol.）,135,1530（1985）、キャンサー・リサーチ（Cancer Res.）,46,6489（1986）］。
これらの問題点を解決するため、遺伝子組換え技術を利用してヒト以外の動物由来のモノクローナル抗体をヒト型キメラ抗体あるいはヒト型CDR移植抗体（再形成ヒト抗体）のようなヒト化抗体にすることが試みられている。ヒト型キメラ抗体は、抗体可変領域（以下、Ｖ領域と称す）がヒト以外の動物抗体由来で定常領域（以下、C領域と称す）がヒト抗体由来である抗体であり［プロシーディング・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Proc.Natl.Acad.Sci.）,81,6851（1984）］、ヒトに投与した場合、ヒト以外の動物由来のモノクローナル抗体に対する抗体はほとんど惹起されず、血中半減期が6倍のびることが報告されている［プロシーディング・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Proc.Natl.Acad.Sci.）,86,4220（1989）］。ヒト型CDR移植抗体はヒト抗体のCDR［相補性決定領域；Complementarity Determining Region］をヒト以外の動物由来の抗体のCDRと置換した抗体であり［ネイチャー（Nature）,321,522（1986）］、サルを用いた実験でマウス抗体に比べ免疫原性が低下し、血中半減期が4〜5倍伸びることが報告されている［ジャーナル・オブ・イムノロジー（J.Immunol.,147,1352（1991）］。しかしながら、これまでのところhIL-5Rαに対するヒト化抗体は報告されていない。
従って、ヒトIL-5Rαに対して特異的に結合するヒト化抗体は、ヒト体内に投与したときにヒト以外の動物由来のモノクローナル抗体に対する抗体が生じないことによる、副作用の減少、および血中半減期の延長により、慢性気管支喘息、アトピー性皮膚炎などのアレルギー疾患等に対する高い治療効果が期待される。
さらに、最近の蛋白質工学、遺伝子工学の進歩により、一本鎖抗体［サイエンス（Science）,242,423（1988）］あるいはジスルフィド安定化抗体［モレキュラー・イムノロジー（Molecular Immunology）,32,249（1995）］といった、より小さな抗体分子の作製が行われている。一本鎖抗体やジスルフィド安定化抗体はモノクローナル抗体あるいはヒト化抗体に比べ、その分子量が小さいことから組織移行性、血中からのクリアランスに優れ、イメージング等への応用、さらにはトキシンとの複合体の作製も行われ、治療効果も期待されている［キャンサー・リサーチ（Cancer Research）,55,318（1995）］。ヒトIL-5Rα鎖特異的に結合する一本鎖抗体およびジスルフィド安定化抗体ができれば、アレルギー疾患等に対する高い診断、治療効果が期待される。しかしながら、ヒトIL-5Rα鎖に対する一本鎖抗体およびジスルフィド安定化抗体についてもこれまでのところ報告されていない。
発明の開示
本発明者らは、ヒトIL-5Rα鎖（以下、ヒトIL-5Rα鎖をhIL-5Rα鎖とも記す）の膜貫通領域以下を欠いた細胞外領域に相当する、Ｎ末端アミノ酸1〜313番目に存在するエピトープを認識するhIL-5Rα鎖に対する抗体が、免疫細胞染色によりヒトインターロイキン５受容体α鎖に特異的に反応すること、およびヒトインターロイキン５の生物活性を抑制することができることを見出した。これらの抗体を用いれば、前記アレルギー性疾患の診断、治療を行うことができる。
したがって、本発明は、ヒトIL-5Rα鎖に特異的に反応する抗体を提供する。本発明における抗体は、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、一本鎖抗体、ジスルフィド安定化抗体などを含む。本発明におけるモノクローナル抗体は、hIL-5Rα鎖に特異的に反応するものであればいかなるものでもよいが、以下に述べる製造法によって確立したものが好適なものとしてあげられる。すなわち、hIL-5Rαタンパクを抗原として調製し、それらをマウス、ラット、ハムスター、ラビット等、ハイブリドーマを作製することが可能な動物に免疫することにより、抗原特異性をもつ形質細胞を誘導し、さらに、それと骨髄腫細胞株とを融合させ、モノクローナル抗体産生能を有したハイブリドーマを調製し、これを培養することにより、抗IL-5Rαモノクローナル抗体を取得できる。本発明のモノクローナル抗体としては、ヒトIL-5Rα鎖のＮ末端アミノ酸から１〜313番目に存在するエピトープを認識し、かつ免疫組織染色によりヒトIL-5Rα鎖に特異的に反応するモノクローナル抗体、およびヒトIL-5Rα鎖のＮ末端アミノ酸から１〜313番目に存在するエピトープを認識し、かつIL-5の生物活性を抑制するモノクローナル抗体などをあげることができる。前者に属するモノクローナル抗体としては、ハイブリドーマ株KM1257（FERM BP-5133）が生産するモノクローナル抗体KM1257、後者に属するモノクローナル抗体としては、ハイブリドーマ株KM1259（FERM BP-5134）が生産するモノクローナル抗体KM1259およびハイブリドーマ株KM1486（FERM BP-5651）が生産するモノクローナル抗体KM1486が具体例としてあげられる。
本発明のモノクローナル抗体は、ヒトIL-5Rα鎖、ヒトIL-5Rα鎖を細胞表面に発現した細胞、ヒト好酸球などと免疫学的に反応する。また、本発明のモノクローナル抗体は、可溶性ヒトIL-5Rα鎖と免疫学的に反応する。したがって、本発明は、ヒトIL-5Rα鎖、ヒトIL-5Rα鎖を細胞表面に発現した細胞、ヒト好酸球および可溶性ヒトIL-5Rα鎖を免疫学的に検出、定量する方法も提供する。これらの検出、定量結果は、慢性気管支喘息、アトピー性皮膚炎などのアレルギー性疾患の診断および治療に利用することができる。
さらに、本発明では、モノクローナル抗体以上に、副作用が少なく、血中半滅期が延期され、より治療薬として望ましいIL-5の生物活性を阻害するヒト化抗体を提供する。本発明におけるヒト化抗体とは、ヒト型キメラ抗体およびヒト型CDR移植抗体の総称である。
ヒト型キメラ抗体とは、ヒト以外の動物の抗体可変領域重鎖（以下、VHと称す）および可変領域軽鎖（以下、VLと称す）とヒト抗体の定常領域重鎖（以下、CHと称す）およびヒト抗体の定常領域軽鎖（以下、CLと称す）とからなる抗体を意味し、ヒト型CDR移植抗体とは、ヒトの抗体のVHおよびVLのCDR配列をヒト以外の動物の抗体のVHおよびVLのCDR配列でそれぞれ置換した抗体を意味する。IL-5の生物活性を阻害する抗ｈIL-5Rα鎖ヒト型キメラ抗体は、ヒトIL-5Rα鎖に反応し、IL-5の生物活性を阻害できる抗体を生産するハイブリドーマよりVHおよびVLをコードするcDNAを取得し、ヒト抗体CHおよびヒト抗体CLをコードする遺伝子を有する動物細胞用発現ベクターにそれぞれ挿入してヒト型キメラ抗体発現ベクターを構築し、動物細胞へ導入することにより発現させ製造することができる。本発明のヒト型キメラ抗体およびヒト型CDR移植抗体はいずれのイムノグロブリン（Ig）クラスに属するものでもよいがIgG型のものが好適であり、さらにIgG型に属するIgG1、IgG2、IgG3、IgG4といったイムノグロブリンのC領域のいずれも用いることができる。
本発明のヒト型キメラ抗体の例としては、抗体のVHが配列番号94記載のアミノ酸配列を含み、CHがヒト抗体IgG1であり、抗体のVLが配列番号95記載のアミノ酸配列を含み、CLがヒト抗体κである抗体があげられ、KM1399と称するものが具体例としてあげられる。また、CHがヒト抗体IgG4であるヒト型キメラ抗体としてはKM7399と称するものが具体例としてあげられる。KM1399を生産する形質転換株としてはKM1399（FERM BP-5650）があげられる。KM7399を生産する形質転換株としてはKM7399（FERM BP-5649）があげられる。
また、IL-5の生物活性を阻害する抗hIL-5Rα鎖ヒト型CDR移植抗体は、ヒトIL-5Rα鎖に反応し、IL-5の生物活性を阻害できるヒト以外の動物の抗体のVHおよびVLのCDR配列で任意のヒト抗体のVHおよびVLのCDR配列をそれぞれ置換したV領域をコードするcDNAを構築し、ヒト抗体のCHおよびヒト抗体のCLをコードする遺伝子を有する動物細胞用発現ベクターにそれぞれ挿入してヒト型CDR移植抗体発現ベクターを構築し、動物細胞へ導入することにより発現させ製造することができる。本発明のヒト型CDR移植抗体の例としては、抗体のVHが配列番号72記載のアミノ酸配列を含み、CHがヒト抗体IgG1であり、抗体のVLが配列番号63記載のアミノ酸配列を含み、CLがヒト抗体κである抗体があげられ、KM8399と称するものが具体例としてあげられる。また、CHがヒト抗体IgG4であるヒト型CDR移植抗体としてはKM9399と称するものが具体例としてあげられる。KM8399を生産する形質転換株としてはKM8399（FERM BP-5648）があげられる。KM9399を生産する形質転換株としてはKM9399（FERM BP-5647）があげられる。
本発明のヒト化抗体は、ヒトIL-5Rα鎖、ヒトIL-5Rα鎖を細胞表面に発現した細胞、ヒト好酸球などと免疫学的に反応する。したがって、本発明は、慢性気管支喘息、アトピー性皮膚炎などのアレルギー性疾患の診断および治療に利用することができる。
さらに、本発明ではヒトIL-5Rα鎖に対して結合性を示す一本鎖抗体（single chain Fv;以下、scFvと称す）あるいはジスルフィド安定化抗体（disulfide stabilized Fv;以下、dsFvと称す）を提供する。
一本鎖抗体（scFv）とは、一本のVHと一本のVLとを適当なペプチドリンカー（以下、Ｌと称す）を用いて連結した、VH−Ｌ−VLないしはVL−Ｌ−VHポリペプチドを示す。本発明のscFvに含まれるVHおよびVLは抗ヒトIL-5Rα鎖モノクローナル抗体あるいはヒト型CDR移植抗体のいずれをも用いることができる。
ジスルフィド安定化抗体（dsFv）とはVHおよびVL中のそれぞれ１アミノ酸残基をシステイン残基に置換したポリペプチドをジスルフィド結合を介して結合させたものをいう。システイン残基に置換するアミノ酸残基はReiterらにより示された方法［プロテイン エンジニアリング（Protein Engineering）,7,697（1994）］に従って、抗体の立体構造予測に基づいて選択することができる。本発明のジスルフィド安定化抗体に含まれるVHあるいはVLはマウス型抗ヒトIL-5Rα鎖モノクローナル抗体あるいはヒト型CDR移植抗体のいずれをも用いることができる。
ヒトIL-5Rα鎖に対して結合性を示す一本鎖抗体は、ヒトIL-5Rα鎖に反応する抗体を生産するハイブリドーマよりVHおよびVLをコードするcDNAを取得し、一本鎖抗体発現ベクターを構築し、大腸菌、酵母、あるいは動物細胞へ導入することにより発現させ製造することができる。本発明のモノクローナル抗体由来の一本鎖抗体の例としては、抗体のVHが配列番号94記載のアミノ酸配列を含み、VLが配列番号95記載のアミノ酸配列を含む抗体があげられる。本発明のヒト型CDR移植抗体由来の一本鎖抗体の例としては、抗体のVHが配列番号102記載のアミノ酸配列を含み、VLが配列番号99記載のアミノ酸配列を含む抗体があげられる。
ヒトIL-5Rα鎖に対して結合性を示すジスルフィド安定化抗体は、ヒトIL-5Rα鎖に反応する抗体を生産するハイブリドーマよりVHおよびVLをコードするcDNAを取得し、適当な発現ベクターに挿入し、該発現ベクターを大腸菌、酵母、あるいは動物細胞へ導入することにより発現させ製造することができる。本発明のモノクローナル抗体由来の一本鎖抗体の例としては、抗体のVHが配列番号94記載のアミノ酸配列を含み、VLが配列番号95記載アミノ酸配列を含む抗体があげられる。
本発明のヒト型CDR移植抗体由来のジスルフィド安定化抗体の例としては、抗体のVHが配列番号102記載のアミノ酸配列を含み、VLが配列番号99記載のアミノ酸配列を含む抗体があげられる。
以下に、ヒトIL-5Rα鎖に特異的に反応する、あるいはヒトIL-5の生物活性を阻害する抗ヒトIL-5Rα鎖モノクローナル抗体、ヒトIL-5の生物活性を阻害する抗ヒトIL-5Rα鎖ヒト化抗体、抗ヒトIL-5Rα鎖一本鎖抗体および抗ヒトIL-5Rα鎖ジスルフィド安定化抗体の製造法、ならびに該抗体によるヒトインターロイキン５受容体α鎖の検出および定量法について、説明する。
１．抗hIL-5Rαモノクローナル抗体の作製
（１）抗原の調製
抗hIL-5Rαモノクローナル抗体を作製するために必要な抗原としては、hIL-5Rαを細胞表面に発現した細胞あるいはその細胞膜画分、または、hIL-5Rα発現細胞であるCTLL-2（h5 R）の細胞あるいはその細胞膜画分等を用いることができる。CTLL-2（h5 R）細胞は、既にクローニングされている完全長のhIL-5RαをコードするcDNA［ジャーナル・オブ・エクスペリメンタル・メディシン（J.Exp.Med.）,175,341（1992）］を動物細胞用発現ベクター、たとえばpCAGGS［ジーン（Gene）,108,193（1991）］に組み込み、エレクトロポレーション法［特開平2-257891、サイトテクノロジー（Cytotechnology）,3,133（1990）］により該発現ベクターをマウスT細胞株であるCTLL-2に導入することにより造成されたhIL-5Rα発現細胞である。
また、hIL-5RαをコードするcDNAの全長もしくはその部分断片は、例えば、大腸菌などの原核性宿主細胞中で発現させるために、発現ベクター、たとえば市販のpGEX［ファルマシア（Pharmacia）社］、pETシステム［ノバジェン（Novagen）社］あるいは実施例1の（11）で述べるpMKex1などに組み込み、hIL-5Rαの全長または部分断片をそのままあるいは融合蛋白として発現させることができる。大腸菌により発現された蛋白質は、菌体を破砕した後、SDS-ポリアクリルアミド電気泳動または融合蛋白質の性質に応じたアフィニティ−クロマトグラフィーなどの方法により精製することができる。
IL-5Rαの全長または部分断片をそのままあるいは融合蛋白として発現させる方法としては、昆虫細胞、哺乳動物細胞等の真核性宿主細胞も用いることができる。
哺乳動物細胞の場合、例えば、pAGE107［サイトテクノロジー（Cytotechnology）,3,133（1990）］、pAGE103［ジャーナル・オブ・バイオケミストリ（J.Biochem.）,101,1307（1987）］、実施例1の（1）で述べるpAGE210等のベクター内にhIL-5RαをコードするcDNAの全長または部分断片を公知の方法を用いて組み込み、該蛋白質の発現ベクターを構築することができる。また、該cDNAがコードするhIL-5Rαの全長または部分断片をそのままあるいは融合蛋白として効率的な発現を行うためには、該cDNA中のシグナルペプチドをコードする塩基配列と真核性宿主中で高発現させることができる蛋白質のシグナルペプチドをコードする塩基配列とを入れ換えることが好ましい。公知の蛋白質シグナルペプチドとしては、例えばヒト成長ホルモン、抗ガンダリオシドGD3キメラ抗体KM871（特開平5-304989）などを用いることが好ましい。
このようにして構築した発現ベクターは宿主細胞にエレクトロポレーション法［特開平2-257891、サイトテクノロジー（Cytotechnology）,3,133（1990）］、リポフェクチン法［プロシーディング・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Proc.Natl.Acad.Sci.）,84,7413（1987）］などの公知の方法を用いて導入することができる。これらの細胞を適当な培地中で培養することにより、細胞内あるいは培養上清中にhIL-5Rαの全長あるいは部分断片をそのままあるいは融合蛋白として生産することができる。培地としては、培養上清中に生産されたhIL-5Rαの部分断片あるいはその融合蛋白質の精製を容易にするため、血清無添加の培地を用いることが好ましい。
また、昆虫細胞の場合、ファーミンジェン社製バキュロゴールドスターターキットなどを用いて、hIL-5RαをコードするcDNAの全長または部分断片を組み込んだ組み換えバキュロウィルスを作製し、Sf9やSf21等の昆虫細胞（いずれもファーミンジェン社製）に該組み換えウィルスを感染させることにより、細胞内あるいは培養上清中にhIL-5Rαの全長あるいは部分断片をそのままあるいは融合蛋白として、生産させることができる［バイオテクノロジー（Bio/Technology）,6,47（1988）］。
動物細胞または昆虫細胞などにより生産されたhIL-5Rαの全長あるいは部分断片または融合蛋白は、既知の蛋白質精製方法、例えば塩析、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーなどの方法に従って培養上清などから精製し、抗原として供することができる。とくに免疫グロブリンの定常領域との融合蛋白質として生産された場合は、免疫グロブリンの定常領域に対して特異的な親和性を有するプロテインAなどを固定化したアフィニティーカラムを用いて精製することが好ましい。
（２）動物の免疫と抗体産生細胞の調製
免疫に用いる動物としては、マウス、ラット、ハムスター、ラビット等、ハイブリドーマを作製することが可能であれば、いかなるものでもよいが、本明細書中においては、マウスまたはラットを用いる例を説明する。3〜20週令のマウスまたはラットに、shIL-5RαあるいはhIL-5Rαを細胞表面に発現しているCTLL-2細胞［ジャーナル・オブ・エキスペリメンタル・メディシン（J.Exp.Med.）,177,1523（1993）］を抗原として免疫し、その動物の脾、リンパ節、末梢血より抗体産生細胞を採取する。免疫は、動物の皮下、静脈内または腹腔内に、適当なアジュバント［例えば、フロインドの完全アジュバント（Complete Freund's Adjuvant）または、水酸化アルミニウムゲルと百日咳菌ワクチンなど］とともに抗原を投与することにより行う。抗原の投与は、1回目の投与の後1〜2週間おきに5〜10回行う。各投与後3〜7日目に眼底静脈叢より採血し、その血清が抗原と反応することを酵素免疫測定法［酵素免疫測定法（ELISA法）：医学書院刊1976年］などで調べる。
免疫に用いたshIL-5RαまたはhIL-5Rαを細胞表面に発現している細胞に対し、その血清が十分な抗体価を示したマウスまたはラットを抗体産生細胞の供給原として供する。
脾細胞と骨髄腫細胞との融合に供するにあたって、抗原物質の最終投与後3〜7日目に、免疫したマウスより脾臓を摘出し、脾細胞を採取する。脾臓をMEM培地（日水製薬社製）中で細断し、ピンセットでほぐし、遠心分離（1,200rpm、5分）した後、上清を捨て、トリス−塩化アンモニウム緩衝液（pH7.65）で1〜2分間処理し赤血球を除去し、MEM培地で3回洗浄して融合用脾細胞として提供する。
（３）骨髄腫細胞の調製
骨髄腫細胞としては、マウスまたはラットから得られた株化細胞を使用する。たとえば、8-アザグアニン耐性マウス（BALB/c由来）骨髄腫細胞株P3-X63Ag8-U1（P3-U1）［カレント・トピックス・イン・ミクロバイオロジー・アンド・イムノロジー（Curr.Topics Microbiol.Immunol.）,81,1（1978）、ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・イムノロジー（Europ.J.Immunol.）,6,511（1976）］、SP2/0-Ag14（SP-2）［ネイチャー（Nature）,276,269（1978）］、P3-X63-Ag8653（653）［ジャーナル・オブ・イムノロジー（J.Immunol.）,123,1548（1979）］、P3-X63-Ag8（X63）［ネイチャー（Nature）,256,495（1975）］などが用いられる。これらの細胞株は、8-アザグアニン培地［RPMI-1640培地にグルタミン（1.5mM）、2-メルカプトエタノール（5×10-5M）、ジェンタマイシン（10μg/ml）および牛胎児血清（FCS）（CSL社製、10%）を加えた培地（以下、正常培地という）に、さらに8-アザグアニン（15μg/ml）を加えた培地］で継代するが、細胞融合の3〜4日前に正常培地に継代し、融合当日2×107個以上の細胞数を確保する。
（４）細胞融合
前記１（2）で免疫した抗体産生細胞と１（3）で得られた骨髄腫細胞をMEM培地またはPBS（リン酸二ナトリウム1.83g、リン酸一カリウム0.21g、食塩7.65g、蒸留水1リットル、pH7.2）でよく洗浄し、細胞数が、抗体産生細胞：骨髄腫細胞＝5〜10：1になるよう混合し、遠心分離（1,200rpm、5分）した後、上清を捨て、沈澱した細胞群をよくほぐした後、攪拌しながら、37℃で、ポリエチレングライコール−1000（PEG-1000）2g、MEM2mlおよびジメチルスルホキシド（DMSO）0.7mlの混液0.2〜1ml/108抗体産生細胞を加え、1〜2分間毎にMEM培地1〜2mlを数回加えた後、MEM培地を加えて全量が50mlになるようにする。遠心分離（900rpm、5分）後、上清を捨て、ゆるやかに細胞をほぐした後、メスピペットによる吸込み、吹出しでゆるやかに細胞をHAT培地［正常培地にヒポキサンチン（10-4M）、チミジン（1.5×10-5M）およびアミノプテリン（4×10-7）を加えた培地］100ml中に懸濁する。
この懸濁液を96ウェル培養用プレートに100μl/ウェルずつ分注し、5% CO2インキュベーター中、37℃で7〜14日間培養する。
培養後、培養上清の一部をとり１（5）に述べる酵素免疫測定法により、前記１（1）で述べたshIL-5RαまたはhIL-5Rとの融合蛋白などの組み換え蛋白質に特異的に反応するウェルを選択する。ついで、限界希釈法によりクローニングを2回繰り返し［1回目は、HT培地（HAT培地からアミノプテリンを除いた培地）、2回目は、正常培地を使用する］、安定して強い抗体価の認められたものをマウスまたはラット抗hIL-5Rαモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ株として選択する。
（５）マウスまたはラット抗ヒトIL-5Rαモノクローナル抗体の選択
マウスまたはラット抗hIL-5Rαモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマの選択は、アンチボディズ［Antibodies,A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,Chapter 14（1988）］に述べられている方法などに従い、以下に述べる測定法により行う。これらの方法により、後述する抗hIL-5Rαヒト化抗体、一本鎖抗体およびジスルフィド安定化抗体を産生する形質転換株の培養上清中に含まれる抗hIL-5Rα抗体あるいはすべての精製抗hIL-5Rα抗体の活性を測定することもできる。
前記１（1）で述べたshIL-5RαまたはhIL-5Rαとの融合蛋白などの組み換え蛋白質を適当なプレートにコートし、ハイブリドーマ培養上清もしくは１（6）で得られる精製抗体を第一抗体として反応させ、さらに第二抗体としてビオチン、酵素、化学発光物質あるいは放射線化合物等で標識した抗マウスイムノグロブリン抗体もしくは抗ラットイムノグロブリン抗体を反応させた後に標識物質に応じた反応を行ない、hIL-5Rαに特異的に反応するものをマウス抗hIL-5Rαモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマとして選択する。
抗hIL-5Rαヒト化抗体、一本鎖抗体およびジスルフィド安定化抗体を産生する形質転換株の培養上清もしくはそれらの精製抗体を第一抗体として反応させた場合には、第二抗体としてはビオチン、酵素、化学発光物質あるいは放射線化合物等で標識した抗ヒトイムノグロブリン抗体を用い、標識物質に応じた反応を行なうことにより検出を行う。
また、前記１（1）で述べたshIL-5RαまたはhIL-5Rαとの融合蛋白などの組み換え蛋白質を適当なプレートにコートし、ハイブリドーマ培養上清、抗hIL-5Rαヒト化抗体、一本鎖抗体およびジスルフィド安定化抗体を産生する形質転換株の培養上清、もしくははそれらの精製抗体のいずれかと、ビオチン、酵素、化学発光物質あるいは放射線化合物等で標識したヒトIL-5とを混合して反応させた後、標識物質に応じた反応を行うことにより、ヒトIL-5のヒトIL-5Rαへの結合阻害活性を測定することができる。この方法を用いてハイブリドーマのスクリーニングを行い、ヒトIL-5阻害活性の高いものを選択する。
（６）マウスまたはラットモノクローナル抗体の調製
プリスタン処理［2,6,10,14-テトラメチルペンタデカン（Pristane）0.5mlを腹腔内投与し、2週間飼育する］した8〜10週令のマウスまたはヌードマウスに、前記１（3）で得られたマウスまたはラット抗hIL-5Rαモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ細胞2×107〜5×106細胞/匹を腹腔内に注射する。10〜21日間でハイブリドーマは腹水癌化する。このマウスから腹水を採取し、遠心分離（3,000rpm、5分）して固形分を除去後、40〜50%飽和硫酸アンモニウムで塩析し、カプリル酸沈殿法、DEAE-セファロースカラム、プロテインＡ-カラムあるいはセルロファインGSL2000（生化学工業社製）のカラムに通塔し、IgGあるいはIgM画分を集め、精製モノクローナル抗体とする。
抗体のサブクラスの決定は、マウスモノクローナル抗体タイピングキットまたはラットモノクローナル抗体タイピングキットを用いて行う。蛋白質量は、ローリー法あるいは280nmでの吸光度より算出する。
２．抗ヒトIL-5Rαヒト化抗体の作製
（１）ヒト化抗体発現用ベクターの構築
ヒト以外の動物の抗体からヒト化抗体を作製するために必要なヒト化抗体発現用ベクターを構築する。ヒト化抗体発現用ベクターとは、ヒト抗体のC領域であるCHおよびCLをコードする遺伝子が組み込まれた動物細胞用発現ベクターであり、動物細胞用発現ベクターにヒト抗体のCHおよびCLをコードする遺伝子をそれぞれ挿入することにより構築されたものである。ヒト抗体のC領域としては、例えば、ヒト抗体H鎖ではCγ1やCγ4、ヒト抗体L鎖ではCκ等の任意のヒト抗体のC領域を用いることができる。ヒト抗体のC領域をコードする遺伝子としてはエキソンとイントロンより成る染色体DNAを用いることができ、また、cDNAを用いることもできる。動物細胞用発現ベクターとしては、ヒト抗体C領域をコードする遺伝子を組込み発現できるものであればいかなるものでも用いることができる。例えば、pAGE107［サイトテクノロジー（Cytotechnology）,3,133（1990）］、pAGE103［ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（J.Biochem.）,101,1307（1987）］、pHSG274［ジーン（Gene）,27,223（1984）］、pKCR［プロシーディング・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Proc.Natl.Acad.Sci.）,78,1527（1981）］、pSG1βd2-4［サイトテクノロジー（Cytotechnology）,4,173（1990）］等があげられる。動物細胞用発現ベクターに用いるプロモーターとエンハンサーとしては、SV40の初期プロモーターとエンハンサー［ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（J.Biochem.）101,1307（1987）］、モロニーマウス白血病ウイルスのLTRプロモーターとエンハンサー［バイオケミカル・アンド・バイオフィジカル・リサーチ・コミュニケーションズ（Biochem.Biophys.Res.Comun.）,149,960（1987）］、および免疫グロブリンH鎖のプロモーター［セル（Cell）,41,479（1985）］とエンハンサー［セル（Cell）,33,717（1983）］等があげられる。
ヒト化抗体発現用ベクターは、抗体H鎖、L鎖が別々のベクター上に存在するタイプあるいは同一のベクター上に存在するタイプ（タンデム型）のどちらでも用いることができるが、ヒト化抗体発現ベクターの構築のしやすさ、動物細胞への導入のし易さ、動物細胞内での抗体H鎖およびL鎖の発現量のバランスがとれる等の点でタンデム型のヒト化抗体発現用ベクターの方が好ましい［ジャーナル・オブ・イムノロジカル・メソッズ（J.Immunol.Methods）,167,271（1994）］。
（２）ヒト以外の動物の抗体のVHおよびVLをコードするcDNAの取得
ヒト以外の動物の抗体、例えば、マウス抗ヒトIL-5Rα鎖モノクローナル抗体のVHおよびVLをコードするcDNAは以下のようにして取得する。
抗ヒトIL-5Rα鎖モノクローナル抗体を産生する細胞、例えば、マウス抗ヒトIL-5Rα鎖抗体産生ハイブリドーマ等よりmRNAを抽出し、cDNAを合成する。合成したcDNAを、ファージあるいはプラスミドなどのベクターに挿入し、cDNAライブラリーを作製する。該ライブラリーより、ヒト以外の動物の抗体、例えば、マウス抗体のC領域部分あるいはV領域部分をプローブとして用い、VHをコードするcDNAを有する組換えファージあるいは組換えプラスミド、およびVLをコードするcDNAを有する組換えファージあるいは組換えプラスミドをそれぞれ単離する。組換えファージあるいは組換えプラスミド上の目的とする抗体のVHおよびVLの全塩基配列を決定し、塩基配列よりVHおよびVLの全アミノ酸配列を推定する。
（３）ヒト型キメラ抗体発現ベクターの構築
前記２（１）で構築したヒト化抗体発現用ベクターのヒト抗体のCHおよびCLをコードする遺伝子の上流に、ヒト以外の動物の抗体のVHおよびVLをコードするcDNAを挿入し、ヒト型キメラ抗体発現ベクターを構築することができる。例えば、キメラ抗体発現用ベクターのヒト抗体のCHおよびCLをコードする遺伝子の上流にあらかじめヒト以外の動物の抗体のVHおよびVLをコードするcDNAをクローニングするための制限酵素の認識配列を設けておき、このクローニングサイトにヒト以外の動物の抗体のV領域をコードするcDNAを下記に述べる合成ＤＮＡを介して挿入することにより、ヒト型キメラ抗体発現ベクターを製造することができる。合成ＤＮＡは、ヒト以外の動物の抗体のV領域の3'末端側の塩基配列とヒト抗体のC領域の5'末端側の塩基配列とからなるものであり、両端に適当な制限酵素部位を有するようにＤＮＡ合成機を用いて製造する。
（４）ヒト以外の動物の抗体のCDR配列の同定
抗体の抗原結合部位を形成するVH及びVLは、配列の比較的保存された4個のフレームワーク領域（以下、FR領域と称す）とそれらを連結する配列の変化に富んだ3個の相補性決定領域（CDR）から成っている［シーケンシズ・オブ・プロテインズ・オブ・イムノロジカル・インタレスト（Sequences of Proteins of Immunological Interest）,US Dept.Health and Human Services,1991］。そして各CDRアミノ酸配列（CDR配列）は、既知の抗体のV領域のアミノ酸配列［シーケンシズ・オブ・プロテインズ・オブ・イムノロジカル・インタレスト（Sequences of Proteins of Immunological Interest）,US Dept.Health and Human Services,1991］と比較することにより同定することができる。
（５）ヒト型CDR移植抗体のV領域をコードするcDNAの構築
ヒト型CDR移植抗体のVHおよびVLをコードするcDNAは以下のようにして取得することができる。
まず、目的のヒト以外の動物の抗体のV領域のCDRを移植するためのヒト抗体のV領域のFRのアミノ酸配列をVH、VLそれぞれについて選択する。ヒト抗体のV領域のFRのアミノ酸配列としては、ヒト抗体由来のV領域のFRのアミノ酸配列であればいかなるものでも用いることができる。例えば、Protein Data Bankに登録されているヒト抗体のV領域のFRのアミノ酸配列、ヒト抗体のV領域のFRの各サブグループの共通アミノ酸配列［シーケンシズ・オブ・プロテインズ・オブ・イムノロジカル・インタレスト（Sequences of Proteins of Immunological Interest）,US Dept.Health and Human Services,1991］があげられるが、充分な活性を有するヒト型CDR移植抗体を創製するためには、目的のヒト以外の動物の抗体のV領域のアミノ酸配列と高い相同性を有することが望ましい。次に、選択したヒト抗体のV領域のFRのアミノ酸配列をコードするDNA配列と目的のヒト以外の動物の抗体のV領域のCDRのアミノ酸配列をコードするDNA配列を連結させて、VH、VLそれぞれのアミノ酸配列をコードするDNA配列を設計する。CDR移植抗体可変領域遺伝子を構築するために設計したDNA配列を得るためには、全DNA配列をカバーするように各鎖について数本の合成DNAを設計し、それらを用いてポリメラーゼ・チェイン・リアクション（Polymerase Chain Reaction；以下、PCRと称す）を行う。PCRでの反応効率および合成可能なDNAの長さから各鎖について、好ましくは、6本の合成DNAを設計する。反応後、増幅断片を適当なベクターにサブクローニングし、その塩基配列を決定し、目的のヒト型CDR移植抗体の各鎖のV領域のアミノ酸配列をコードするcDNAを含むプラスミドを取得する。また、約100塩基よりなる合成DNAを用いてセンス、アンチセンスともに全配列を合成し、それらをアニーリング、連結することで、目的のヒト型CDR移植抗体の各鎖のV領域のアミノ酸配列をコードするcDNAを構築することもできる。
（６）ヒト型CDR移植抗体のV領域のアミノ酸配列の改変
ヒト型CDR移植抗体は目的のヒト以外の動物の抗体のV領域のCDRのみをヒト抗体のV領域のFR間に、単純に移植しただけでは、その活性は基のヒト以外の動物の抗体の活性に比べて低下してしまうことが知られている［バイオテクノロジー（BIO/TECHNOLOGY）,9,266（1991）］。そこでヒト抗体のV領域のFRのアミノ酸配列のうち、直接抗原との結合に関与しているアミノ酸残基、CDRのアミノ酸残基と相互作用をしているアミノ酸残基、あるいは抗体の立体構造の維持に関与している等の可能性を有するアミノ酸残基をもとのヒト以外の動物の抗体に見出されるアミノ酸残基に改変し、活性を上昇させることが行われている。そして、それらのアミノ酸残基を効率よく同定するため、X線結晶解析あるいはコンピューターモデリング等を用いた抗体の立体構造の構築および解析を行っている。しかし、いかなる抗体にも適応可能なヒト型CDR移植抗体の製造法は未だ確立されておらず、現状では個々の抗体によって種々の試行錯誤が必要である。
選択したヒト抗体のV領域のFRのアミノ酸配列の改変は各種の変異導入プライマーを用いて前記２（５）に記載のPCRを行うことにより達成できる。PCR後の増幅断片を適当なベクターにサブクローニング後、その塩基配列を決定し、目的の変異が導入されたcDNAを含むベクター（以下、アミノ酸配列改変ベクターと称す）を取得する。
また、狭い領域のアミノ酸配列の改変であれば、20〜35塩基からなる変異導入プライマーを用いたPCR変異導入法により行うことができる。具体的には、改変後のアミノ酸残基をコードするDNA配列を含む20〜35塩基からなるセンス変異プライマー及びアンチセンス変異プライマーを合成し、改変すべきV領域のアミノ酸配列をコードするcDNAを含むプラスミドを鋳型として2段階のPCRを行う。最終増幅断片を適当なベクターにサブクローニング後、その塩基配列を決定し、目的の変異が導入されたcDNAを含むアミノ酸配列改変ベクターを取得する。
（７）ヒト型CDR移植抗体発現ベクターの構築
前記２（１）のヒト化抗体発現用ベクターのヒト抗体のCH及びCLをコードする遺伝子の上流に、前記２（５）および２（６）で取得したヒト型CDR移植抗体のVH及びVLをコードするcDNAを挿入し、ヒト型CDR移植抗体発現ベクターを構築することができる。例えば、ヒト型CDR移植抗体のVH及びVLのアミノ酸配列をコードするcDNAを構築するためのPCRの際に5'-及び3'-末端の合成DNAの末端に適当な制限酵素の認識配列を導入することで、所望のヒト抗体のC領域をコードする遺伝子の上流にそれらが適切な形で発現するように挿入することができる。
（８）ヒト化抗体の一過性（トランジェント）発現および活性評価
多種類のヒト化抗体の活性を効率的に評価するために、前記２（３）のヒト型キメラ抗体発現ベクター、および前記２（７）のヒト型CDR移植抗体発現ベクターあるいはそれらの改変ベクターをCOS-7細胞（ATCC CRL1651）に導入してヒト化抗体の一過性発現［メソッズ・イン・ヌクレイック・アシッド・リサーチ（Methods in Nucleic Acids Res.）,CRC Press,p.283,1991］を行い、その活性を測定することができる。
COS-7細胞への発現ベクターの導入法としては、DEAE-デキストラン法［メソッズ・イン・ヌクレイック・アシッド・リサーチ（Methods in Nucleic Acids Res.）,CRC Press,p.283,1991］、リポフェクション法［プロシーディング・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス［Proc.Natl.Acad.Sci.,84,7413（1987）］等があげられる。
ベクターの導入後、培養上清中のヒト化抗体の活性は前記１（５）に記載の酵素免疫測定法（ELISA法）等により測定することができる。
（９）ヒト化抗体の安定（ステーブル）発現および活性評価
前記２（３）のヒト型キメラ抗体発現ベクターおよび前記２（７）のヒト型CDR移植抗体発現ベクターを適当な宿主細胞に導入することによりヒト化抗体を安定に生産する形質転換株を得ることができる。
宿主細胞への発現ベクターの導入法としては、エレクトロポレーション法〔特開平2-257891、サイトテクノロジー（Cytotechnology）,3,133,（1990）〕等があげられる。
ヒト化抗体発現ベクターを導入する宿主細胞としては、ヒト化抗体を発現させることができる宿主細胞であれば、いかなる細胞でも用いることができる。例えば、マウスSP2/0-Ag14細胞（ATCC CRL1581）、マウスP3X63-Ag8.653細胞（ATCC CRL1580）、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子（以下DHFR遺伝子と称す）が欠損したCHO細胞［プロシーディング・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Proc.Natl.Acad.Sci.）,77,4216,（1980）］、ラットYB2/3HL.P2.G11.16Ag.20細胞（ATCC CRL1662、以下、YB2/0細胞と称す）等があげられる。
ベクターの導入後、ヒト化抗体を安定に生産する形質転換株は、特開平2-257891に開示されている方法に従い、G418およびFCSを含むRPMI1640培地により選択する。得られた形質転換株を培地中で培養することで培養液中にヒト化抗体を生産蓄積させることができる。培養液中のヒト化抗体の活性は前記１（５）に記載の方法などにより測定する。また、形質転換株は、特開平2-257891に開示されている方法に従い、DHFR遺伝子増幅系等を利用してヒト化抗体の生産量を上昇させることができる。
ヒト化抗体は、形質転換株の培養上清よりプロテインAカラムを用いて精製することができる［アンチボディズ（Antibodies）,A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,Chapter 8,1988］。また、その他に、通常の蛋白質で用いられる精製方法を使用することができる。例えば、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィーおよび限外濾過等を組合せて行い、精製することができる。精製したヒト化抗体のH鎖、L鎖あるいは抗体分子全体の分子量は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）［ネイチャー（Nature）,227,680,（1970）］やウエスタンブロッティング法［アンチボディズ（Antibodies）,A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,Chapter 12,1988］等で測定する。
精製したヒト化抗体の反応性、また、ヒト化抗体のIL-5に対する阻害活性の測定は前記１（５）に記載の方法などにより測定することができる。
（１０）ヒト化抗体の使用方法
本発明のヒト化抗体はヒトIL-5Rα鎖と特異的に結合し、IL-5の生物活性を阻害することができる。このため、本発明により提供されるヒト化抗体はIL-5により分化、増殖が制御されている好酸球の機能を阻害することが期待される。従って、好酸球が病態の形成に関与している疾患においてその治療等に有用であると考えられる。また、ヒト以外の動物の抗体に比べ、ヒト抗体のアミノ酸配列に由来する部分がほとんどであるため、ヒト体内で免疫原性を示さず、その効果が長期間にわたり持続することが期待される。本発明のヒト化抗体は単独でまたは少なくとも１種以上の製剤上許容される補助剤と共に用いることができる。例えば、ヒト化抗体を、生理食塩水やグルコース、ラクトース、マンニトール等の水溶液に溶解して適当な医薬組成物とする。または、ヒト化抗体を常法に従って凍結乾燥し、これに塩化ナトリウムを加えることによって粉末注射剤を作製する。本医薬組成物は必要に応じ、製剤分野で周知の添加剤、例えば、製剤上許容される塩等を含有することができる。
本医薬組成物の投与量は、患者の年齢、症状等によって異なるが、ヒトを含む哺乳動物に対し、ヒト化抗体を0.1〜20mg/kg/日投与する。投与は、1日1回（単回投与または連日投与）または間歇的に1週間に1〜3回、2、3週間に1回静脈注射により行う。
３．抗ヒトIL-5Rα一本鎖抗体の作製
（１）一本鎖抗体発現ベクターの構築
前記２（２）、２（５）および２（６）に記載のヒト以外の動物の抗体あるいはヒト型CDR移植抗体のVHおよびVLをコードするcDNAを一本鎖抗体発現用ベクターに挿入することによりヒト以外の動物の抗体の一本鎖抗体あるいはヒト型CDR移植抗体の一本鎖抗体の発現ベクターを構築することができる。ここで用いる一本鎖抗体発現用ベクターとしてはヒト以外の動物の抗体あるいはヒト型CDR移植抗体のVHおよびVLをコードするcDNAを組込み発現できるものであれば、いかなるものでも用いることができる。例えば、pAGE107［サイトテクノロジー（Cytotechnology）,3,133（1990）］、pAGE103［ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（J.Biochem.）,101,1307（1987）］、pHSG274［ジーン（Gene）,27,223（1984）］、pKCR［プロシーディング・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.）,78,1527（1981）］、pSG1βd2-4［サイトテクノロジー（Cytotechnology）,4,173（1990）］等があげられる。一本鎖抗体を発現させるための宿主としては、大腸菌、酵母、動物細胞等の中から適切なものを選択することができるが、その場合の発現用ベクターとしては、それぞれの宿主に適切なものを選択する必要がある。また、適切なシグナルペプチドをコードするcDNAを発現用ベクターに挿入することで一本鎖抗体を細胞外に分泌させ、ペリプラズマ領域に輸送させ、あるいは細胞内に留まらせることができる。
選択された発現用ベクターに、VH-L-VLあるいはVL-L-VH（Ｌはペプチドリンカー）からなる一本鎖抗体をコードするcDNAを適切なプロモーター、シグナルペプチドの下流に挿入することにより、目的の一本鎖抗体をコードするcDNAが挿入された一本鎖抗体発現ベクターを構築することができる。
一本鎖抗体をコードするcDNAは、VHをコードするcDNAとVLをコードするcDNAとを、両端に適当な制限酵素の認識配列を有するペプチドリンカーをコードする合成ＤＮＡを用いて連結することにより得ることができる。リンカーペプチドは、その付加がVH、VLの抗原への結合に対して妨害しないように最適化することが重要で、例えばPantolianoらにより示されたもの［バイオケミストリー（Biochemistry）、30、10117（1991）］あるいはそれを改変したものを用いることができる。
（２）一本鎖抗体の発現および活性評価
前記３（１）で構築した一本鎖抗体発現ベクターをエレクトロポレーション法［特開平2-257891、サイトテクノロジー（Cytotechnology）,3.133（1990）］等の方法により適切な宿主細胞へ導入することにより、目的の一本鎖抗体を生産する形質転換株を取得することができる。発現ベクターの導入後、培養上清等に含まれる一本鎖抗体の活性は前記１（５）に記載の方法等により測定することができる。
本発明の一本鎖抗体の回収および精製は公知の技術を組み合わせることにより達成することができる。例えば、一本鎖抗体が培地中に分泌されるならば、限外濾過により濃縮することができ、次いで抗原アフィニティークロマトグラフィーもしくはイオン交換クロマトグラフィーまたはゲル濾過を実行することにより達成することができる。また、宿主細胞のペリプラズマ領域へと輸送されるならば、その細胞に浸透圧ショックを与え、限外濾過により濃縮することができ、次いで抗原アフィニティークロマトグラフィーもしくはイオン交換クロマトグラフィーまたはゲル濾過を実行することにより達成することができる。不溶性であり、かつ顆粒（インクルージョン・ボディー）として存在している一本鎖抗体は、細胞の溶解、顆粒を単離するための遠心と洗浄を繰り返し、例えばグアニジン−塩酸による可溶化、および再度一本鎖抗体の活性を有する構造へと導く操作、それに続く活性分子の精製によって達成することができる。
そして、精製された一本鎖抗体の活性は前記１（５）に記載の方法等により測定することができる。
（３）一本鎖抗体の使用方法
本発明の一本鎖抗体はヒトIL-5Rα鎖と特異的に結合し、IL-5の生物活性を阻害することができる。このため、本発明により提供される一本鎖抗体はIL-5により分化、増殖が制御されている好酸球の機能を阻害することが期待される。従って、好酸球が病態の形成に関与している疾患においてその治療等に有用であると考えられる。本発明の一本鎖抗体は単独でまたは少なくとも1種以上の製剤上許容される補助剤と共に用いることができる。例えば、一本鎖抗体を、生理食塩水やグルコース、ラクトース、マンニトール等の水溶液に溶解して適当な医薬組成物とする。または、一本鎖抗体を常法に従って凍結乾燥し、これに塩化ナトリウムを加えることによって粉末注射剤を作製する。本医薬組成物は必要に応じ、製剤分野で周知の添加剤、例えば、製剤上許容される塩等を含有することができる。
本医薬組成物の投与量は、患者の年齢、症状等によって異なるが、ヒトを含む哺乳動物に対し、一本鎖抗体を0.1〜20mg/kg/日投与する。投与は、1日1回（単回投与または連日投与）または間歇的に1週間に1〜3回、2、3週間に1回静脈注射により行う。
４．抗ヒトIL-5Rαジスルフィド安定化抗体の作製
（１）ジスルフィド安定化抗体の作製
ジスルフィド安定化抗体は、ヒト以外の動物の抗体のVHおよびVLをコードするcDNAあるいはヒト型CDR移植抗体のVHおよびVLをコードするcDNAのそれぞれの適切な位置の1アミノ酸残基に相当するDNA配列をシステイン残基に相当するDNA配列に改変し、発現および精製したのち、ジスルフィド結合を形成させることで作製することができる。アミノ酸残基のシステイン残基への改変は前記２（５）のPCRを用いた変異導入法により行うことができる。
得られた改変VHおよび改変VLをコードするcDNAを適切な発現用ベクターに挿入することによりジスルフィド安定化抗体H鎖発現ベクターおよびジスルフィド安定化抗体L鎖発現ベクターを構築することができる。ここで用いるジスルフィド安定化抗体発現用ベクターとしては改変VHおよび改変VLをコードするcDNAを組込み発現できるものであれば、いかなるものでも用いることができる。例えば、pAGE107［サイトテクノロジー（Cytotechnology）,3,133（1990）］、pAGE103［ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（J.Biochem.）,101,1307（1987）］、pHSG274［ジーン（Gene）,27,223（1984）］、pKCR［プロシーディング・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Proc.Natl.Acad.Sci.）,78,1527（1981）］、pSG1βd2-4［サイトテクノロジー（Cytotechnology）,4,173（1990）］等があげられる。ジスルフィド安定化抗体を形成させるためにジスルフィド安定化抗体L鎖発現ベクターおよびジスルフィド安定化抗体H鎖発現ベクターを発現させるための宿主としては、大腸菌、酵母、動物細胞等の中から適切なものを選択することができるが、その場合の発現用ベクターとしては、それぞれの宿主に適切なものを選択する必要がある。また、適切なシグナルペプチドをコードするcDNAを発現用ベクターに挿入することでジスルフィド安定化抗体を細胞外に分泌させ、ペリプラズマ領域に輸送させ、あるいは細胞内に留まらせることができる。
（２）ジスルフィド安定化抗体の発現、活性評価
前記４（１）で構築されたジスルフィド安定化抗体H鎖発現ベクターあるいはジスルフィド安定化抗体L鎖発現ベクターをエレクトロポレーション法［特開平2-257891、サイトテクノロジー（Cytotechnology）,3,133（1990）］等の方法により宿主細胞へ導入することにより、目的のジスルフィド安定化抗体H鎖あるいはジスルフィド安定化抗体L鎖を生産する形質転換株を取得することができる。発現ベクターの導入後、培養上清等に含まれるジスルフィド安定化抗体H鎖あるいはジスルフィド安定化抗体L鎖の発現は前記１（５）に記載の方法等により確認することができる。
ジスルフィド安定化抗体H鎖あるいはジスルフィド安定化抗体L鎖の回収および精製は公知の技術を組み合わせることにより達成することができる。例えば、ジスルフィド安定化抗体H鎖あるいはジスルフィド安定化抗体L鎖が培地中に分泌されるならば、限外濾過により濃縮することができ、次いで各種クロマトグラフィーあるいはゲル濾過を実行することにより達成することができる。また、宿主細胞のペリプラズマ領域へと輸送されるならば、その細胞に浸透圧ショックを与え、限外濾過により濃縮することができ、次いで各種クロマトグラフィーあるいはゲル濾過を実行することにより達成することができる。不溶性であり、かつ顆粒（インクルージョン・ボディー）として存在しているジスルフィド安定化抗体H鎖あるいはジスルフィド安定化抗体L鎖は、細胞の溶解、顆粒を単離するための遠心と洗浄の繰り返し、例えばグアニジン-塩酸による可溶化後、各種クロマトグラフィーあるいはゲル濾過を実行することにより達成することができる。
そして、精製されたジスルフィド安定化抗体H鎖とジスルフィド安定化抗体L鎖を混合し、活性を有する構造へと導く操作［refolding操作，モレキュラー・イムノロジー（Molecular Immunology）,32,249（1995）］によりジスルフィド結合を形成させた後、抗原アフィニティークロマトグラフィーもしくはイオン交換クロマトグラフィーまたはゲルろ過により活性を有するジスルフィド安定化抗体を精製することができる。ジスルフィド安定化抗体の活性は前記１（５）に記載の方法等により測定することができる。
（３）ジスルフィド安定化抗体の使用方法
本発明のジスルフィド安定化抗体はヒトIL-5Rα鎖と特異的に結合し、IL-5の生物活性を阻害することができる。このため、本発明により提供されるジスルフィド安定化抗体はIL-5により分化、増殖が制御されている好酸球の機能を阻害することが期待される。従って、好酸球が病態の形成に関与している疾患においてその治療等に有用であると考えられる。本発明のジスルフィド安定化抗体は単独でまたは少なくとも1種以上の製剤上許容される補助剤と共に用いることができる。例えば、一本鎖抗体またはジスルフィド安定化抗体を、生理食塩水やグルコース、ラクトース、マンニトール等の水溶液に溶解して適当な医薬組成物とする。または、ジスルフィド安定化抗体を常法に従って凍結乾燥し、これに塩化ナトリウムを加えることによって粉末注射剤を作製する。本医薬組成物は必要に応じ、製剤分野で周知の添加剤、例えば、製剤上許容される塩等を含有することができる。
本医薬組成物の投与量は、患者の年齢、症状等によって異なるが、ヒトを含む哺乳動物に対し、ジスルフィド安定化抗体を0.1〜20mg/kg/日投与する。投与は、1日1回（単回投与または連日投与）または間歇的に1週間に1〜3回、2、3週間に1回静脈注射により行う。
５．抗ヒトIL-5Rα抗体を用いたヒトインターロイキン５受容体α鎖の検出および定量法
（１）抗ヒトIL-5Rα抗体を用いた免疫細胞染色
浮遊細胞についてはそのまま、付着細胞についてはトリプシンEDTAにて細胞をはがした後、免疫細胞染色用緩衝液（1%BSA、0.02%EDTA、0.05%アジ化ナトリウムを含むPBS）などに懸濁し、1×105〜2×106個ずつに分注する。前記１（4）で得られた抗ヒトIL-5Rαモノクローナル抗体産生ハイブリドーマの培養上清、前記２（9）で得られた抗ヒトIL-5Rαヒト化抗体形質転換株の培養上清、あるいは前記１（6）もしくは２（9）で得られた精製抗体、または該精製抗体を公知の方法（酵素抗体法：学際企画刊 1985年）でビオチンなどの適当な標識物質により標識したものを0.1〜50μg/mlの濃度になるように免疫細胞染色用緩衝液あるいは10%動物血清を含む免疫細胞染色用緩衝液を用いて希釈したものを20〜500μlずつ分注し、氷冷下で30分間反応させる。前記１（4）で得られたマウス抗ヒトIL-5Rαモノクローナル抗体産生ハイブリドーマの培養上清、前記２（9）で得られた抗ヒトIL-5Rαヒト化抗体形質転換株の培養上清あるいは前記１（6）もしくは前記２（9）で得られた精製抗体を反応させた場合、反応終了後免疫細胞染色用緩衝液で細胞を洗浄し、FITCあるいはフィコエリスリンなどの蛍光色素で標識した抗マウスイムノグロブリン抗体、抗ラットイムノグロブリン抗体あるいは抗ヒトイムノグロブリン抗体を0.1〜50μg/ml程度の濃度を含む免疫細胞染色用緩衝液を50〜500μlずつ分注し、氷冷下で30分間遮光して反応させる。また、ビオチン標識した該モノクローナル抗体を反応させた場合、FITCあるいはフィコエリスリンなどの蛍光色素で標識したストレプトアビジンを50〜500μlずつ分注し、氷冷下で30分間遮光して反応させる。FITCあるいはフィコエリスリンなどの蛍光色素で標識した該モノクローナル抗体を反応させた場合、該モノクローナル抗体を0.1〜50μg/ml程度の濃度を含む免疫細胞染色用緩衝液を50〜500μlずつ分注し、水冷下で30分間遮光して反応させる。いずれの場合も、反応後はよく免疫細胞染色用緩衝液で洗浄し、セルソーターにより解析する。
（２）抗ヒトIL-5Rα抗体を用いたヒトIL-5依存性細胞の増殖抑制試験
得られた抗ヒトIL-5Ｒα抗体の生物活性阻害作用を示すために、ヒトIL-5依存性細胞を用いて、その細胞増殖に対する影響を検討することができる。評価方法としては、トリチウム標識チミジンの細胞内への取り込み、あるいは、セルカウンティングキットを用いた発色法などが挙げられる。ここでは、本発明で用いた発色法について述べる。
CTLL-2（h5R）細胞1×104個を50μlの正常培地に懸濁して96ウェル培養用プレートに分注する。ここに前記１（6）もしくは２（９）で得られた0.01〜50μg/mlの精製抗体溶液25μl、さらに0.4〜40ng/mlのヒトIL-5を含む正常培地を加えてCO2インキュベーター中、37℃、CO2 5%気流下で24〜72時間培養する。その後、セルカウンティングキット溶液を10μl／ウェルで加えてから３７℃、CO2５％気流下で４時間培養する。培養終了後、450nmの吸光度をマイクロウェルプレートリーダーEmax（モレキュラーデバイス社製）にて測定し、各抗体のCTLL-2（h5R）細胞増殖抑制活性を算出する。
（３）抗ヒトIL-5Rα抗体によるヒト好酸球の生存抑制
ポリモルフプレップ（polymorphprep、ニコメッド社製）あるいはパーコール（percoll、ファルマシア社製）などの市販の血球分離用媒体を用いてヒト末梢血中より好酸球を含むヒト多形核白血球画分を調製する。正常培地に懸濁し、96、48あるいは24ウェル細胞培養用プレートに、得られた細胞を1×106〜1×107個／ウェル分注し、ヒトIL-5を最終濃度が0.001〜10ng/mlとなるように加える。さらに前記１（4）で得られた抗ヒトIL-5Rαモノクローナル抗体産生ハイブリドーマの培養上清あるいは前記２（９）で得られた抗ヒトIL-5Rαヒト化抗体産生形質転換株の培養上清、または前記１（6）あるいは２（９）で得られた精製抗体を加えCO2インキュベーター中、37℃、CO2 5%気流下で2〜5日間培養する。培養終了後、各ウェルから細胞標本を作製し、メイ・グリュントワルト・ギムザ染色法（染色法のすべて：医歯薬出版株式会社 1988年）などの方法にて染色し、好酸球の割合を求める。抗ヒトIL-5Rα抗体非存在下での好酸球の割合と該抗体存在下での好酸球の割合とを比較することにより、該モノクローナル抗体にIL-5依存性のヒト好酸球の生存延長に対する抑制活性があるか否か確認する。
（４）モノクローナル抗体によるshIL-5Rα定量
前記１（６）あるいは２（９）で得られた0.1〜50μg/mlの精製抗体を一次抗体としてプレートコートし、前記１（1）で得られた0.1〜10,000ng/mlの精製shIL-5Rα、もしくはヒト血清などの検体を反応させる。プレートをよく洗浄した後、さらに第二抗体としてビオチン、酵素、化学発光物質あるいは放射線化合物等で標識した前記１（6）あるいは２（９）で得られた精製抗体のうち一次抗体として使用した抗ヒトIL-5Rα抗体とは異なるエピトープを認識する抗ヒトIL-5Rα抗体を反応させた後、標識物質に応じた反応を行なう。精製shIL-5Rに対する反応性をもとに検量線を描き、検体中のshIL-5R濃度を算出する。
（５）ウェスタンブロッティング法によるshIL-5Rαの検出
前記１（1）で得られた精製shIL-5RαをSDSポリアクリルアミド電気泳動（SDS-PAGE）により分画後、ポリビニリデンジフルオリド膜［以下、PVDF膜と称す（ミリポア社製）］に転写する。1〜10%牛血清アルブミン（BSA）を含むPBSに浸して４℃にて一晩放置してブロッキング後、0.05%Tweenを含むPBSにてよく洗浄する。該PVDF膜を前記１（5）で得られたハイブリドーマの培養上清あるいは前記１（6）で得られた精製抗体溶液に室温で２時間浸し、0.05%Tweenを含むPBSにてよく洗浄する。さらに第二抗体としてビオチン、酵素、化学発光物質、放射線化合物等で標識した抗マウスイムノグロブリン抗体または抗ラットイムノグロブリン抗体を含む溶液に該PVDF膜を室温で１時間浸し、0.05%Tweenを含むPBSにてよく洗浄する。洗浄液をよく除いた後、第二抗体の標識物質に応じた反応を行い、精製shIL-5Rαの分子量に一致する蛋白質と反応するか否かを確認する。
（６）shIL-5Rαの免疫沈降
96ウェルのELISA用プラスチックプレートに抗マウスイムノグロブリン抗体あるいは抗ラットイムノグロブリン抗体をPBSなどで10〜1000倍に希釈したものを50〜200μl／ウェルずつ分注し、４℃にて一晩あるいは室温にて２時間以上放置して吸着させる。PBSにて該プレートを洗浄後、１〜１０％のBSAなどを含むPBSなどを300μl／ウェルずつ分注して４℃にて一晩あるいは室温にて30分以上放置してブロッキングを行う。PBSにて該プレートを洗浄後、前記１（５）で得られたハイブリドーマの培養上清あるいは前記１（６）で得られた精製抗体溶液（0.01〜50μg/ml）を50〜200μl／ウェルずつ加え、４℃にて一晩放置して抗体を吸着させる。該プレートを洗浄後、前記１（１）で得られたshIL-5Rαを1%BSAを含むPBSなどで0.1〜100μg/mlの濃度に希釈したものを50〜200μl／ウェルずつ分注し、４℃で一晩反応させる。該プレートを0.05%Tweenを含むPBSなどで洗浄後、１〜５倍濃度のSDS-PAGE用サンプルバッファーを50〜200μl／ウェルずつ分注し、30分以上室温で振とうする。必要に応じPBSで希釈した後、該溶液を１レーン当たり5〜25μlずつ加えてSDS-PAGEにより分画後、定法に従いPVDF膜などに転写を行う。該PVDF膜を前記５（５）に示したような方法でウェスタンブロッティング法を行い、shIL-5Rαを検出する。
【図面の簡単な説明】
第１図は、プラスミドpAGE210の造成工程を示した図である。
第２図は、プラスミドpCAGGS-h5R.25制限地図を示した図である。
第３図は、プラスミドpAI234の造成工程を示した図である。
第４図は、プラスミドpAI230の造成工程を示した図である。
第５図は、プラスミドpAI282の造成工程を示した図である。
第６図は、プラスミドpAI283およびpAI285の造成工程を示した図である。
第７図は、プラスミドpAI284およびpAI289の造成工程を示した図である。
第８図は、プラスミドpAI294およびpAI295の造成工程を示した図である。
第９図は、プラスミドpAI299およびpAI301の造成工程を示した図である。
第10図は、プラスミドpAI292の造成工程を示した図である。
第11図は、プラスミドpAI297の造成工程を示した図である。
第12図は、プラスミドpMKex1の造成工程を示した図である。
第13図は、プラスミドpAI263の造成工程を示した図である。
第14図は、抗ヒトIL-5Rαモノクローナル抗体KM1257およびKM1259の酵素免疫測定法におけるヒトIL-5Rα−ヒト免疫グロブリン定常領域融合蛋白に対する結合反応性を示す。
第15図は、プラスミドpBSAの造成工程を示した図である。
第16図は、プラスミドpBSAEの造成工程を示した図である。
第17図は、プラスミドpBSH-Sの造成工程を示した図である。
第18図は、プラスミドpBSK-Hの造成工程を示した図である。
第19図は、プラスミドpBSH-SAおよびpBSK-HAの造成工程を示した図である。
第20図は、プラスミドpBSH-SAEおよびpBSK-HAEの造成工程を示した図である。
第21図は、プラスミドpBSH-SAEEおよびpBSK-HAEEの造成工程を示した図である。
第22図は、プラスミドpBSK-HAEESalの造成工程を示した図である。
第23図は、プラスミドpBSX-Sの造成工程を示した図である。
第24図は、プラスミドpBSX-SAの造成工程を示した図である。
第25図は、プラスミドpBSSCの造成工程を示した図である。
第26図は、プラスミドpBSMoの造成工程を示した図である。
第27図は、プラスミドpBSMoSの造成工程を示した図である。
第28図は、プラスミドpChiIgLA1Sの造成工程を示した図である。
第29図は、プラスミドpMohCκの造成工程を示した図である。
第30図は、プラスミドpBSMoSalの造成工程を示した図である。
第31図は、プラスミドpBSMoSalSの造成工程を示した図である。
第32図は、プラスミドpBShCγ1の造成工程を示した図である。
第33図は、プラスミドpMohCγ1の造成工程を示した図である。
第34図は、プラスミドpMoγ1SPの造成工程を示した図である。
第35図は、プラスミドpMoκγ1SPの造成工程を示した図である。
第36図は、プラスミドpKANTEX93の造成工程を示した図である。
第37図は、プラスミドpKANTEX1259Hの造成工程を示した図である。
第38図は、プラスミドpKANTEX1259の造成工程を示した図である。
第39図は、抗ヒトIL-5Rα鎖ヒト型キメラ抗体KM1399のSDS-PAGE（4〜15%グラジエントゲルを使用）の電気泳動パターンを示す。左側が非還元条件、右側が還元条件でそれぞれ電気泳動を行った。左側のMが高分子マーカー、1がKM1399、右側のMが低分子マーカー、1がKM1399の泳動パターンをそれぞれ示す。
第40図は、抗ヒトIL-5Rα鎖マウス抗体KM1259と抗ヒトIL-5Rα鎖ヒト型キメラ抗体KM1399のヒトIL-5とヒトIL-5Rα鎖の結合に対する阻害活性を示す。縦軸は阻害活性、横軸は抗体濃度をそれぞれ示す。●がKM1259、○がKM1399の活性をそれぞれ示す。
第41図は、プラスミドpT1259の造成工程を示した図である。
第42図は、プラスミドpT1259を用いた抗ヒトIL-5Rα鎖ヒト型キメラ抗体の一過性発現による活性評価を示す。縦軸にヒトIL-5とヒトIL-5Rα鎖の結合に対する阻害活性、横軸に一過性発現培養上清の希釈倍率をそれぞれ示す。
第43図は、プラスミドphKM1259HV0の造成工程を示した図である。
第44図は、プラスミドphKM1259LV0の造成工程を示した図である。
第45図は、プラスミドpKANTEX1259HV0の造成工程を示した図である。
第46図は、プラスミドpKANTEX1259HV0LV0の造成工程を示した図である。
第47図は、抗ヒトIL-5Rα鎖ヒト型CDR移植抗体KM8397のSDS-PAGE（4〜15%グラジエントゲルを使用）の電気泳動パターンを示す。左側が非還元条件、右側が還元条件でそれぞれ電気泳動を行った。Mが分子量マーカー、1がKM8397の泳動パターンをそれぞれ示す。
第48図は、抗ヒトIL-5Rα鎖ヒト型キメラ抗体KM1399と抗ヒトIL-5Rα鎖ヒト型CDR移植抗体KM8397のヒトIL-5Rα鎖に対する結合活性を示す。縦軸はヒトIL-5Rα鎖に対する結合活性、横軸は抗体濃度をそれぞれ示す。●がKM1399、○がKM8397の活性をそれぞれ示す。
第49図は、一過性発現培養上清中の各種改変バージョンの抗ヒトIL-5Rα鎖ヒト型CDR移植抗体のヒトIL-5とヒトIL-5Rα鎖の結合に対する阻害活性を評価した結果を示す。縦軸は阻害活性、横軸は各サンプル名をそれぞれ示す。キメラ抗体KM1399の活性を100とした時の相対活性値をそれぞれ示す。
第50図は、精製した各種改変バージョンの抗ヒトIL-5Rα鎖ヒト型CDR移植抗体のヒトIL-5Rα鎖に対する結合活性を示す。縦軸はヒトIL-5Rα鎖に対する結合活性、横軸は抗体濃度をそれぞれ示す。上段の●がKM1399、○がHV.0LV.0、■がHV.2LV.0、□がHV.0LV.3、▲がHV.3LV.3、下段の●がKM1399、○がHV.1LV.0、■がHV.3LV.0、□がHV.0LV.4、▲がHV.1LV.4、△がHV.2LV.4、×がHV.3LV.4の活性をそれぞれ示す。
第51図は、プラスミドpBShCγ4の造成工程を示した図である。
第52図は、プラスミドpKANTEX1259γ4およびpKANTEX1259HV3LV0γ4の造成工程を示した図である。
第53図は、ヒト抗体IgG4サブクラスの抗ヒトIL-5Rα鎖ヒト型キメラ抗体抗KM7399、ヒト抗体IgG4サブクラスのヒトIL-5Rα鎖ヒト型CDR移植抗体KM9399のSDS-PAGE（4〜15%グラジエントゲルを使用）の電気泳動パターンを示す。左側が非還元条件、右側が還元条件でそれぞれ電気泳動を行った。左側のMが高分子マーカー、1がKM9399、2がKM7399、右側のMが低分子マーカー、1がKM9399、2がKM7399の泳動パターンをそれぞれ示す。
第54図は、ヒト抗体IgG1サブクラスの抗ヒトIL-5Rα鎖ヒト型キメラ抗体KM1399、ヒト抗体IgG4サブクラスの抗ヒトIL-5Rα鎖ヒト型キメラ抗体KM7399、ヒト抗体IgG1サブクラスの抗ヒトIL-5Rα鎖ヒト型CDR移植抗体KM8399、ヒト抗体IgG4サブクラスの抗ヒトIL-5Rα鎖ヒト型CDR移植抗体KM9399のヒトIL-5Rα鎖に対する結合活性を示す。縦軸はヒトIL-5Rα鎖に対する結合活性、横軸は抗体濃度をそれぞれ示す。○がKM1399、●がKM7399、□がKM8399、■がKM9399の活性をそれぞれ示す。
第55図は、抗ヒトIL-5Rαモノクローナル抗体KM1257、KM1259、KM1486、KM1399、KM7399、KM8399およびKM9399のヒトIL-5R遺伝子導入CTLL-2細胞との反応性をフローサイトメーターにて解析した結果を示す。
第56図は、抗ヒトIL-5Rαモノクローナル抗体KM1257、KM1259、KM1486、KM1399、KM7399、KM8399およびKM9399のヒトIL-5R遺伝子導入CTLL-2細胞のIL-5依存性増殖に対する抑制作用を検討した結果を示す。
第57図は、抗ヒトIL-5Rαモノクローナル抗体KM1259のヒト好酸球との反応性をフローサイトメーターにて解析した結果を示す。
第58図は、抗ヒトIL-5Rαモノクローナル抗体KM1257、KM1259、KM1486、KM1399、KM7399、KM8399およびKM9399のヒト好酸球生存抑制作用を検討した結果を示す。
第59図は、抗ヒトIL-5Rαモノクローナル抗体KM1257およびビオチン標識KM1259による可溶性ヒトIL-5Rα定量系に関して検討した結果を示す。
第60図は、抗ヒトIL-5Rαモノクローナル抗体KM1257、KM1259およびKM1486を用いたウェスタンブロッティング法によるshIL-5Rαの検出を行った結果を示す。
第61図は、抗ヒトIL-5Rαモノクローナル抗体KM1257、KM1259およびKM1486を用いたshIL-5Rαの免疫沈降の結果を示す。
発明を実施するための最良の形態
実施例１
１．抗原の調製
（１）動物細胞用発現ベクターpAGE210の構築
動物細胞用発現ベクターpAGE207（特開平6-46841）とpAGE148（特開平6-205694）を用いて、動物細胞用発現ベクターpAGE210の構築を以下のように行った。
プラスミドpAGE207あるいはpAGE148の3μgを10mMトリス−塩酸（pH7.5）、10mM塩化マグネシウム、50mM塩化ナトリウムおよび1mMジチオスレイトール（以下、DTTという）からなる緩衝液30μlに溶解し、さらに10単位のClaI、およびKpnI（いずれも宝酒造社製、以下、特別な指示がない限り、制限酵素は宝酒造社製）を加えて37℃で4時間反応させた。該反応液をアガロース電気泳動にて分画後、pAGE207からはSV40の初期プロモーターとエンハンサー（以下、PSEという）、ハイグロマイシン耐性遺伝子およびアンピシリン（以下、Apという）耐性遺伝子を含む4.7kbのDNA断片を約0.5μg、pAGE148からはジヒドロ葉酸還元酵素（以下、dhfrという）遺伝子を含む4.3kbのDNA断片を約0.5μg回収した。
このようにして得られたpAGE207のClaI-KpnI断片50ngとpAGE148のKpnI-ClaI断片50ngとを20μlのT4DNAリガーゼ緩衝液［66mMトリス−塩酸（pH7.5）、6.6mM塩化マグネシウム、10mM DTTおよび0.1mMアデノシン三リン酸（以下、ATPという）からなる緩衝液、以下同様］に溶解し、T4DNAリガーゼ（宝酒造社製、以下同様）200単位を加え、12℃で16時間結合反応を行った。このようにして得られた組換えプラスミドDNAを用いて大腸菌JM109株を形質転換し、第１図に示したプラスミドpAGE210を得た。
（２）shIL-5Rα発現ベクター構築を目的としたshIL-5RαcDNAのカセット化
shIL-5Rα発現ベクター構築のためshIL-5RαcDNAの5'および3'非翻訳領域の改変、並びに制限酵素認識配列の導入を以下に示す手順に従いPCR法［マニアティス（Maniatis）ら編集、モレキュラー・クローニング（Molecular Cloning）、14.2、Cold Spring Harbor Laboratory 1989年］を用いて行った。プラスミドpCAGGS-h5R.25はshIL-5RαcDNAが公知のプラスミドpCAGGS［ジーン（Gene）,108,193（1991）］に第２図に示すように挿入されたものである［ジャーナル・オブ・エクスペリメンタル・メディシン（J.Exp.Med.）,175,341（1992）］。このpCAGGS-h5R.25の3μgを30μlの50mMトリス−塩酸（pH7.5）、10mM塩化マグネシウム、100mM塩化ナトリウムおよび1mM DTTからなる緩衝液に加え、更に10単位のEcoRIを加えて37℃で4時間反応させた。該反応液をアガロース電気泳動にて分画後、shIL-5RαcDNAを含む1.4kbのDNA断片を約0.3μg回収した。
次に上記で得られたDNA断片1ngを50μlのPCR緩衝液［50mM塩化カリウム、10mMトリス−塩酸（pH8.3）、1.5mM塩化マグネシウム、0.2mMデオキシアデノシン三リン酸（以下、dATPという）、0.2mMデオキシグアノシン三リン酸（以下、dGTPという）、0.2mMデオキシシトシン三リン酸（以下、dCTPという）、0.2mMデオキシチミジン三リン酸（以下、dTTPという）からなる緩衝液］に溶解し、50pmolの配列番号１に示した塩基配列を有する合成DNAおよび配列番号２に示した塩基配列を有する合成DNA［いずれも自動DNA合成機；380A（アプライド・バイオシステムズ社；Applied Biosystems Co.,Ltd製）を用いて合成したもの、以下同様］、さらにベントDNAポリメラーゼ［ニューイングランド・バイオラボラトリーズ社（New England BioLabs.Inc.）製、以下同様］1.6単位を加えて、94℃で1分間、55℃で2分間、72℃で3分間からなる一連の反応条件下でパーキン・エルマー社製DNAサーマルサイクラーを用いて（以下同様）30サイクルのPCR反応を行った。反応終了後、該反応液10μlに100mMトリス−塩酸（pH7.5）、100mM塩化マグネシウム、500mM塩化ナトリウムおよび10mM DTTからなる緩衝液2μl、8μlの蒸留水、10単位のHindIIIを加え37℃で4時間反応させた後、該反応液よりエタノール沈殿［マニアティス（Maniatis）ら編集、モレキュラー・クローニング（Molecular Cloning）、E.10、Cold Spring Harbor Laboratory 1989年］によりDNA断片を回収し、20μlの20mMトリス−塩酸（pH8.5）、10mM塩化マグネシウム、10mM塩化カリウムおよび1mM DTTからなる緩衝液に再溶解し、更に10単位のBamHIを加えて37℃で4時間反応させた。該反応液をアガロース電気泳動により分画後、1.0kbのDNA断片を約0.3μg回収した。
一方プラスミドpUC19（ファルマシア・バイオテク社）3μgを10mMトリス−塩酸（pH7.5）、10mM塩化マグネシウム、50mM塩化ナトリウムおよび1mM DTTからなる緩衝液30μlに溶解し、HindIII 10単位を加えて37℃で4時間反応させた後、該反応液よりエタノール沈殿によりDNA断片を回収し、20mMトリス−塩酸（pH8.5）、10mM塩化マグネシウム、10mM塩化カリウムおよび1mM DTTからなる緩衝液30μlに再溶解し、更に10単位のBamHIを加えて37℃で4時間反応させた。該反応液をアガロース電気泳動により分画後、pUC19のHindIII/BamHI断片を約0.5μg回収した。
pUC19のHindIII/BamHI断片100ngとshIL-5RαcDNA断片50ngとを20μlのT4DNAリガーゼ緩衝液に溶解し、T4DNAリガーゼ200単位を加え、12℃で16時間結合反応を行った。このようにして得られた組換えプラスミドDNAを用いて大腸菌JM109株を形質転換し、第３図に示したプラスミドpAI234を得た。
（３）ヒト可溶性IL-5Rα発現ベクターの構築
実施例１（1）で得られたpAGE210のHindIII-BamHI断片と１（2）で得られたpAI234のshIL-5RαcDNAを含むHindIII-BamHI断片とを連結することによりshIL-5Rα発現ベクターpAI230の構築を以下のように行った。
pAGE210の3μgを10mMトリス−塩酸（pH7.5）、10mM塩化マグネシウム、50mM塩化ナトリウムおよび1mM DTTからなる緩衝液30μlに加え、更に10単位のHindIIIを加えて37℃で4時間反応させた。該反応液よりエタノール沈殿によりDNA断片を回収し、20mMトリス−塩酸（pH8.5）、10mM塩化マグネシウム、10mM塩化カリウムおよび1mM DTTからなる緩衝液30μlに再溶解し、更に10単位のBamHIを加えて37℃で4時間反応させた。該反応液をアガロース電気泳動により分画後、9.0kbのDNA断片を約0.5μg回収した。
pAI234の3μgを10mMトリス−塩酸（pH7.5）、10mM塩化マグネシウム、50mM塩化ナトリウムおよび1mM DTTからなる緩衝液30μlに加え、更に10単位のHindIIIを加えて37℃で4時間反応させた。該反応液よりエタノール沈殿によりDNA断片を回収し、20mMトリス−塩酸（pH8.5）、10mM塩化マグネシウム、10mM塩化カリウムおよび1mM DTTからなる緩衝液30μlに再溶解し、更に10単位のBamHIを加えて37℃で4時間反応させた。該反応液をアガロース電気泳動により分画後、1.0kbのDNA断片を約0.3μg回収した。
次にpAGE210のHindIII-BamHI断片300ngとpAI234のHindIII-BamHI断片50ngとをT4DNAリガーゼ緩衝液20μlに溶解し、T4DNAリガーゼ200単位を加え、12℃で16時間結合反応を行った。このようにして得られた組換えプラスミドDNAを用いて大腸菌JM109株を形質転換し、第４図に示したプラスミドpAI230を得た。
（４）シグナル配列の改変
shIL-5Rαの動物細胞による効率的な生産を行うため、shIL-5RαをコードするcDNAに関してそのシグナル配列の改変をシグナル配列の3'末端側へのEcoRV認識配列の導入、続いて合成DNAを用いてヒト成長ホルモン［サイエンス（Science）,205,602（1979）］あるいは抗ガングリオシドGD3キメラ抗体KM871（特開平5-304989）のシグナルシークエンスへの改変を以下の手順に従って行った。
実施例１（2）で得られたプラスミドpAI234の3μgを10mMトリス−塩酸（pH7.5）、10mM塩化マグネシウム、50mM塩化ナトリウムおよび1mM DTTからなる緩衝液30μlに加え、更に10単位のHindIIIを加えて37℃で4時間反応させた。該反応液よりエタノール沈殿によりDNA断片を回収し、20mMトリス−塩酸（pH8.5）、10mM塩化マグネシウム、10mM塩化カリウムおよび1mM DTTからなる緩衝液30μlに再溶解し、更に10単位のBamHIを加えて37℃で4時間反応させた。該反応液をアガロース電気泳動により分画後、1.0kbのDNA断片を約0.3μg回収した。
一方プラスミドpUC19の3μgを10mMトリス−塩酸（pH7.5）、10mM塩化マグネシウム、50mM塩化ナトリウムおよび1mM DTTからなる緩衝液30μlに溶解し、10単位のHincIIを加えて37℃で4時間反応させた後、該反応液よりエタノール沈殿によりDNA断片を回収し、pUC19のHincII断片を約0.5μg回収した。
上記で得たDNA断片約1ngをPCR緩衝液50μlに溶解し、50pmolの配列番号２に示した塩基配列を有する合成DNAおよび配列番号３に示した塩基配列を有する合成DNA、さらにベントDNAポリメラーゼ1.6単位を加えて、94℃で1分間、48℃で2分間、72℃で3分間からなる一連の反応条件下で30サイクルのPCR反応を行った。該反応液をアガロースゲルにて分画後、約0.9kbのhIL-5Rαの一部をコードするcDNA断片0.5μgを回収し、そのうち50ngのDNAとpUC19のHincII断片100ngとをT4リガーゼ緩衝液20μlに溶解し、T4DNAリガーゼ200単位を加え、12℃で16時間結合反応を行った。このようにして得られた組換えプラスミドDNAを用いて大腸菌JM109株を形質転換し、第５図に示したプラスミドpAI280を得た。得られたプラスミドpAI280の3μgを30μlの10mMトリス−塩酸（pH7.5）、10mM塩化マグネシウム、50mM塩化ナトリウムおよび1mM DTTからなる緩衝液に加え、更に10単位のXbaIを加えて37℃で4時間反応させた。該反応液よりエタノール沈殿によりDNA断片を回収し、20mMトリス−塩酸（pH8.5）、10mM塩化マグネシウム、10mM塩化カリウムおよび1mM DTTからなる緩衝液30μlに再溶解し、更に10単位のBamHIを加えて37℃で4時間反応させた。該反応液をアガロース電気泳動により分画後、2.8kbのDNA断片を約0.8μg回収した。
一方、プラスミドpAI234の3μgを10mMトリス−塩酸（pH7.5）、10mM塩化マグネシウム、50mM塩化ナトリウムおよび1mM DTTからなる緩衝液30μlに加え、更に10単位のXbaIを加えて37℃で4時間反応させた。該反応液よりエタノール沈殿によりDNA断片を回収し、20mMトリス−塩酸（pH8.5）、10mM塩化マグネシウム、10mM塩化カリウムおよび1mM DTTからなる緩衝液30μlに再溶解し、更に10単位のBamHIを加えて37℃で4時間反応させた。該反応液をアガロース電気泳動により分画後、0.8kbのDNA断片を約0.2μg回収した。
次にpAI280のXbaI-BamHI断片200ngとpAI234のXbaI-BamHI断片50ngとをT4リガーゼ緩衝液20μlに溶解し、T4DNAリガーゼ200単位を加え、12℃で16時間結合反応を行った。このようにして得られた組換えプラスミドDNAを用いて大腸菌JM109株を形質転換し、第５図に示したプラスミドpAI282を得た。このpAI282の3μgを50mMトリス−塩酸（pH7.5）、10mM塩化マグネシウム、100mM塩化ナトリウムおよび1mM DTTからなる緩衝液30μlに加え、更に10単位のEcoRVを加えて37℃で4時間反応させた。該反応液よりエタノール沈殿によりDNA断片を回収し、20mMトリス−塩酸（pH8.5）、10mM塩化マグネシウム、10mM塩化カリウムおよび1mM DTTからなる緩衝液30μlに再溶解し、更に10単位のBamHIを加えて37℃で4時間反応させた。該反応液をアガロース電気泳動により分画後、0.9kbのDNA断片を約0.3μg回収した。
配列番号４、５に示した塩基配列を有する合成DNAのそれぞれ1μgを10μlの蒸留水に溶解し、95℃で5分間加熱した後30分間かけて室温まで冷却しアニーリングを行った。実施例１（2）で得られたpUC19のHindII-BamHI断片100ng、pAI282のEcoRV-BamHI断片50ng、上記の通りアニーリングを行った配列番号４および５に示した塩基配列を有する合成DNA50ngとをT4DNAリガーゼ緩衝液20μlに溶解し、さらにT4DNAリガーゼ200単位を加え、12℃で16時間結合反応を行った。このようにして得られた組換えプラスミドDNAを用いて大腸菌JM109株を形質転換し、第６図に示したプラスミドpAI283を得た。
配列番号６および９に示した塩基配列を有する合成DNAをそれぞれ1μgを10μlの蒸留水に溶解し、95℃で5分間加熱した後30分間かけて室温まで冷却しアニーリングを行った。該反応液に500mMトリス−塩酸（pH7.6）、100mM塩化マグネシウム、50mM DTT、1mM EDTAからなる緩衝液2.5μl、10mM ATP溶液2.5μl、蒸留水9μl、さらにT4ポリヌクレオチドキナーゼ（宝酒造社製）5単位を加え37℃で2時間リン酸化反応を行った。これとは別に配列番号７および８に示した塩基配列を有する合成ＤＮＡをそれぞれ1μgを10μlの蒸留水に溶解し、95℃で5分間加熱した後30分間かけて室温まで冷却しアニーリングを行った。
pUC19のHindIII-BamHI断片100ng、pAI282のEcoRV-BamHI断片50ng、上記のように調製した合成DNAをそれぞれ50ngをT4DNAリガーゼ緩衝液20μlに溶解し、T4DNAリガーゼ200単位を加え、12℃で16時間結合反応を行った。このようにして得られた組換えプラスミドDNAを用いて大腸菌JM109株を形質転換し、第６図に示したプラスミドpAI285を得た。
（５）シグナル配列を改変したshIL-5Rα発現ベクターの構築
実施例１（1）で得られたpAGE210のHindIII-BamHI断片と実施例１（4）で得られたpAI283あるいはpAI285のヒト可溶性IL-5RαcDNAを含むHindIII-BamHI断片とを連結することによりヒト可溶性IL-5Rα発現ベクターpAI284およびpAI289の構築を以下のとおり行った。
pAI283およびpAI285の3μgを10mMトリス−塩酸（pH7.5）、10mM塩化マグネシウム、50mM塩化ナトリウムおよび1mM DTTからなる緩衝液30μlに加え、更に10単位のHindIIIを加えて37℃で4時間反応させた。該反応液よりエタノール沈殿によりＤＮＡ断片を回収し、20mMトリス−塩酸（pH8.5）、10mM塩化マグネシウム、10mM塩化カリウムおよび1mM DTTからなる緩衝液30μlに再溶解し、更に10単位のBamHIを加えて37℃で4時間反応させた。該反応液をアガロース電気泳動により分画後、1.0kbのDNA断片をそれぞれ約0.3μg回収した。
pAGE210のHindIII-BamHI断片300ngとpAI283あるいはpAI285のHindIII-BamHI断片50ngとをT4DNAリガーゼ緩衝液20μlに溶解し、T4DNAリガーゼ200単位を加え、12℃で16時間結合反応を行った。このようにして得られた組換えプラスミドDNAを用いて大腸菌JM109株を形質転換し、第７図に示したプラスミドpAI284およびpAI289を得た。
（６）ヒトIL-5Rαとヒト免疫グロブリン定常領域との融合蛋白の作製
ヒトIL-5Rαの細胞外領域とヒト免疫グロブリン定常領域（以下、Fcと称す）とが（Gly-Ser-Gly）4というアミノ酸配列のリンカーを介して結合された融合蛋白（以下、hIL-5Rα-Fcと称す）の作製を以下に示す手順に従って行った。
ヒト免疫グロブリン定常領域をコードするcDNAはヒト型キメラ抗体H鎖発現用ベクターpChiIgHB2（特開平5-304989）上のヒトIgG1定常領域をコードする部分を用いた。まず、pChiIgHB2の約1ngをPCR緩衝液50μlに溶解し、50pmolの配列番号１０に示した塩基配列を有する合成DNAおよび配列番号１１に示した塩基配列を有する合成DNA、さらにベントDNAポリメラーゼ1.6単位を加えて、94℃で1分間、48℃で2分間、72℃で3分間からなる一連の反応条件下で30サイクルのPCR反応を行った。反応終了後、該反応液20μlに200mMトリス−塩酸（pH8.5）、100mM塩化マグネシウム、1000mM塩化カリウムおよび10mMからなる緩衝液2.5μl、蒸留水2.5μl、10単位のBamHIを加え37℃で4時間させた。反応終了後、該反応液をアガロース電気泳動により分画し、ヒトIgG1定常領域をコードするcDNAを含む0.7kbのDNA断片を約0.5μg回収した。
実施例１（4）で得られたpAI283の約1ngをPCR緩衝液50μlに溶解し、50pmolの配列番号１２に示した塩基配列を有する合成DNAおよび配列番号１３に示した塩基配列を有する合成DNA、さらにベントDNAポリメラーゼ1.6単位を加えて、94℃で1分間、48℃で2分間、72℃で3分間からなる一連の反応条件下で30サイクルのPCR反応を行った。反応終了後、該反応液20μlに100mMトリス−塩酸（pH7.5）、100mM塩化マグネシウム、500mM塩化ナトリウムおよび10mM DTTからなる緩衝液2.5μl、蒸留水2.5μl、10単位のHindIIIを加え37℃で4時間反応させた。反応終了後、該反応液をアガロース電気泳動により分画し、該反応液をアガロース電気泳動により分画後、hIL-5Rαの細胞外領域をコードするcDNAを含む1.0kbのDNA断片を約0.5μg回収した。
ヒトIgG1定常領域をコードするcDNAを含む0.7kbのDNA断片50ng、hIL-5Rαの細胞外領域をコードするcDNAを含むDNA断片50ng、pUC19のHindIII-BamHI断片100ngをT4DNAリガーゼ緩衝液20μlに溶解し、T4DNAリガーゼ200単位を加え、12℃で16時間結合反応を行った。このようにして得られた組換えプラスミドDNAを用いて大腸菌JM109株を形質転換し、第８図に示したプラスミドpAI294を得た。
一方、実施例１（4）で得られたpAI285をテンプレートとして配列番号１３および１４に示した塩基配列を有する合成DNAをプライマーとして用いて上記と同様の条件でPCR反応を行い、反応終了後、該反応液をアガロース電気泳動により分画し、該反応液をアガロース電気泳動により分画後、ヒトIL-5Rαの細胞外領域をコードするcDNAを含む1.0kbのDNA断片を約0.5μg回収した。得られたDNA断片50ng、ヒトIgG1定常領域をコードするcDNAを含む0.7kbのDNA断片50ng、pUC19のHindIII-BamHI断片100ngをT4DNAリガーゼ緩衝液20μlに溶解し、T4DNAリガーゼ200単位を加え、12℃で16時間結合反応を行った。このようにして得られた組換えプラスミドDNAを用いて大腸菌JM109株を形質転換し、第８図に示したプラスミドpAI295を得た。
（７）融合蛋白発現ベクターの構築
実施例１（1）で得られたpAGE210のHindIII-BamHI断片と実施例１（6）で得られたpAI294のhIL-5Rα-FcをコードするcDNAを含むHindIII-BamHI断片とを連結することによりhIL-5Rα-Fc発現ベクターpAI299の構築を以下のように行った。
プラスミドpAI294の3μgを10mMトリス−塩酸（pH7.5）、10mM塩化マグネシウム、50mM塩化ナトリウムおよび1mM DTTからなる緩衝液30μlに加え、更に10単位のHindIIIを加えて３７℃で４時間反応させた。該反応液よりエタノール沈殿によりDNA断片を回収し、20mMトリス−塩酸（pH8.5）、10mM塩化マグネシウム、100mM塩化カリウムおよび1mM DTTからなる緩衝液30μlに再溶解し、更に10単位のBamHIを加えて37℃で4時間反応させた。該反応液をアガロース電気泳動により分画後、ヒトIL-5Rαとヒト免疫グロブリン定常領域の融合蛋白をコードするcDNAを含む1.7kbのDNA断片を約0.4μg回収した。
pAGE210のHindIII-BamHI断片100ngとpAI294のHindIII-BamHI断片50ngとをT4DNAリガーゼ緩衝液20μlに溶解し、T4DNAリガーゼ200単位を加え、12℃で16時間結合反応を行った。このようにして得られた組換えプラスミドDNAを用いて大腸菌JM109株を形質転換し、第９図に示したプラスミドpAI299を得た。
また、上記と同様にしてpAGE210のHindIII-BamHI断片と実施例１（6）で得られたpAI295のhIL-5Rα-FcをコードするcDNAを含むHindIII-BamHI断片とを連結することによりhIL-5Rα-Fc発現ベクターpAI301の構築を行った。
（８）昆虫細胞によるshIL-5Rα発現を行うための組み換えウィルスの作製
昆虫細胞による蛋白質の生産には目的遺伝子を組み込んだ組み換えウィルスの作製が必要であるが、その作製にはトランスファーベクターと呼ばれる目的蛋白質をコードするcDNAを特殊なプラスミドに組み込む過程と野生型ウィルスとトランスファーベクターを昆虫細胞にコトランスフェクションし、相同組み換えにより組み換えウィルスを取得する過程を経る。以上の過程についてファーミンジェン社製バキュロゴールドスターターキット（製品番号PM-21001K）を用いてそのマニュアルに従い以下の手順で行った。
実施例１（4）で得られたpAI285あるいは実施例１（6）で得られたpAI294の3μgを10mMトリス−塩酸（pH7.5）、10mM塩化マグネシウム、50mM塩化ナトリウムおよび1mM DTTからなる緩衝液30μlに加え、更に10単位のHindIIIを加えて37℃で4時間反応させた。該反応液よりエタノール沈殿によりDNA断片を回収し、20μlのDNAポリメラーゼＩ緩衝液［5mMトリス−塩酸（pH7.5）、1mM硫酸マグネシウム、0.01mM DTT、5μg/ml牛血清アルブミン、0.08mM dATP、0.08mM dGTP、0.08mM dCTP、0.08mM dTTPからなる緩衝液、以下同様］に溶解し、5単位の大腸菌DNAポリメラーゼＩクレノー断片（宝酒造社製、以下同様）を加え、22℃で30分間反応させ、HindIII消化によって生じた5'突出末端を平滑末端に変えた。さらに該反応液をフェノール−クロロホルム抽出後、エタノール沈澱を行い、20mMトリス−塩酸（pH8.5）、10mM塩化マグネシウム、100mM塩化カリウムおよび1mM DTTからなる緩衝液30μlと10単位のBamHIを加えて37℃で4時間反応させた。該反応液をアガロースゲル電気泳動にて分画し、shIL-5RαをコードするcDNAを含む約1.0kbのDNA断片を約0.3μg、ヒトIL-5Rαとヒト免疫グロブリン定常領域の融合蛋白をコードするcDNAを含む1.7kbのDNA断片を約0.3μg回収した。
次にファーミンジェン社製バキュロゴールドスターターキットに含まれるプラスミドpVL1393の3μgを50mMトリス−塩酸（pH7.5）、10mM塩化マグネシウム、100mM塩化ナトリウムおよび1mM DTTからなる緩衝液30μlに加え、更に10単位のEcoRIを加えて37℃で4時間反応させた。該反応液よりエタノール沈殿法によりDNA断片を回収し、20μlのDNAポリメラーゼＩ緩衝液に溶解し、5単位の大腸菌DNAポリメラーゼＩクレノー断片を加え、22℃で30分間反応させ、EcoRI消化によって生じた5'突出末端を平滑末端に変えた。さらに該反応液をフェノール−クロロホルム抽出後、エタノール沈澱を行い、50mMトリス−塩酸（pH7.5）、10mM塩化マグネシウム、100mM塩化ナトリウムおよび1mM DTTからなる緩衝液30μlに加え、更に10単位のBglIIを加えて37℃で4時間反応させた。該反応液をアガロースゲル電気泳動にて分画し、約9.6kbのDNA断片を約0.9μg回収した。
次に上記で得られたpVL1393のEcoRI（平滑末端）−BglII断片200nとpAI285あるいはpAI294のHindIII（平滑末端）−BamHI断片50ngとをT4DNAリガーゼ緩衝液20μlに溶解し、T4DNAリガーゼ200単位を加え、12℃で16時間結合反応を行った。このようにして得られた組換えプラスミドDNAを用いて大腸菌JM109株を形質転換し、第10図および第11図に示したプラスミドpAI292およびpAI297を得た。
続く組み換えウィルスの作製はTMN-FHインセクトメディウム（ファーミンジェン社製）にて培養した昆虫細胞Sf9（ファーミンジェン社製より入手）に線状バキュロウィルスDNA［バキュロゴールド・バキュロウィルスDNA（BaculoGoldbaculovirus DNA）、ファーミンジェン社製］および作製したトランスファーベクターDNAをリポフェクチン法にて導入すること［蛋白質核酸酵素、37,2701（1992）］により行い組み換えバキュロウィルスを以下のように作製した。
pAI292あるいはpAI297の1μgと線状バキュロウィルスDNAの20ngとを12μlの蒸留水に溶解し、さらにリポフェクチン6μlと蒸留水6μlとを混和したものを加え室温で15分間放置した。一方Sf9細胞1×106個を2mlのSf900-II培地［ギブコ（Gibco）社製］に懸濁し、直径35mmの細胞培養用プラスチックシャーレに入れた。ここに上記のプラスミドDNA、線状バキュロウィルスDNAおよびリポフェクチン混和溶液全量を加え27℃で3日間培養後、組み換えウィルスを含む培養上清1mlを採取した。シャーレには新たにSf900-II培地1mlを加え、さらに27℃で3日間培養し組み換えウィルスを含む培養上清をさらに1.5ml得た。
次に蛋白発現に用いるために得られた組み換えウィルスを以下の手順で増殖させた。
Sf9細胞2×107個を10mlのSf900-II培地に懸濁し、175cm2フラスコ（グライナー社製）に入れて室温で1時間放置して細胞をフラスコに付着させた。放置後上清を除き新たに15mlのTMN-FHインセクトメディウムと上記の組み換えウィルスを含む培養上清のうち1mlを加え27℃で3日間培養した。培養後上清を1,500×gで10分間遠心分離して細胞を除き、蛋白発現に使用する組み換えウィルス溶液を得た。
得られた組み換えウィルス溶液についてウィルスの力価を以下の方法で算定した（ファーミンジェン社製バキュロゴールドスターターキット・マニュアル）。Sf9細胞6×106個を4mlのSf900-II培地に懸濁し、直径60mmの細胞培養用プラスチックシャーレに入れ、室温で1時間放置して細胞をシャーレに付着させた。次に上清を除き新たにSf900-II培地400μlとSf900-II培地で10,000倍に希釈した上記組み換えウィルス溶液を加え室温で1時間放置した後、培地を除き5mlの1%低融点アガロース［アガープラーク・アガロース（AgarplaqueAgarose）、ファーミンジェン社製］を含む培地［滅菌した1mlの5%アガープラークプラス・アガロース水溶液と4mlのTMN-FHインセクトメディウムを混和し、42℃に保温したもの］を該シャーレに流し込んだ。室温で15分間放置した後、乾燥を防ぐためビニルテープをシャーレにまき、密閉可能なプラスチック製容器に該シャーレを入れ、27℃で6日間培養した。該シャーレに0.01%ニュートラルレッドを含むPBS1mlを加えさらに1日間培養した後、出現したプラークの数を数えた。以上の操作より該組み換えウィルス溶液はいずれも約1×107プラークフォーミングユニット/ml（以下、PFU/mlと表記する）のウィルスを含んでいることがわかった。
（９）動物細胞におけるshIL-5RαあるいはhIL-5Rα-Fcの発現
動物細胞へのプラスミドの導入は、宮地らの方法に従い、エレクトロポレーション法［サイトテクノロジー（Cytotechnology）,3,133（1990）］を用いて行った。
実施例１（5）で得られたpAI289あるいは実施例１（7）で得られたpAI301の4μgを4×106個のdhfr遺伝子を欠損したCHO細胞［プロシーディング・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Proc.Natl.Acad.Sci.）,77,4216（1980）］へ導入後、40mlのRPMI1640-FCS（10）［FCSを10%、7.5%NaHCO3を1/40量、200mM L−グルタミン溶液（ギブコ社製）を3%、ペニシリン・ストレプトマイシン溶液（ギブコ社製、5000units/mlペニシリンおよび5000μg/mlストレプトマイシン含有）を0.5%含むRPMI1640培地（日水製薬社製）］に懸濁し、96ウェルマイクロタイタープレートに200μl／ウェルずつ分注した。CO2インキュベーターで37℃、24時間培養した後、ハイグロマイシン（ギブコ社製）を0.5mg/mlになるように添加して1〜2週間培養した。形質転換株のコロニーが出現し、コンフルエントになったウェルより細胞を回収し、0.5mg/mlハイグロマイシン、50nMメソトレキセート（以下、MTXと称す）を含むRPMI1640-FCS（10）培地に1〜2×105細胞/mlになるように懸濁し、24ウェルプレートに2ml／ウェル分注した。CO2インキュベーターで37℃で1〜2週間培養して、50nM MTX耐性クローンを誘導した。
上記で得られた50nM MTX耐性クローンについて、0.5mg/mlハイグロマイシン、200nM MTXを含むRPMI1640-FCS（10）培地に1〜2×105細胞/mlになるように懸濁し、24ウェルプレートに2ml/ウェル分注した。CO2インキュベーターで37℃で1〜2週間培養して、200nM MTX耐性クローンを誘導した。
さらに、上記で得られた200nM MTX耐性クローンについて、0.5mg/mlハイグロマイシン、500nM MTXを含むRPMI1640-FCS（10）培地に1〜2×105細胞/mlになるように懸濁し、24ウェルプレートに2ml／ウェル分注した。CO2インキュベーターで37℃で１〜２週間培養して、500nM MTX耐性クローンを誘導した。
上記形質転換株をCHO細胞用無血清培地CHO-S-SFMII培地（ギブコ社製）に1〜2×105細胞/mlになるように懸濁し、225cm2フラスコ（グライナー社製）に100mlずつ分注した。CO2インキュベーターで、37℃、5〜7日間培養し、コンフルエントになった時点で培養液を回収した。
hIL-5Rαの培養上清からの精製は以下のようにして行った。pAI289による形質転換株の培養液1リットルに塩化ナトリウム29.2g、1Mトリス−塩酸（pH7.4）20mlを加えた後、1N水酸化ナトリウム溶液を用いて該溶液のpHをpH7.4に調整した。カラムにコンカナバリンＡ−セファロース（ファルマシア社製）ゲル約10mlを充填し、20mMトリス−塩酸（pH7.4）、0.5M塩化ナトリウムからなる緩衝液50mlで0.5ml/分の流速で洗浄した。洗浄後、上記のように調製したshIL-5Rαを含む液を0.5ml/分の流速でコンカナバリンＡ−セファロースカラムに通塔した。さらに20mMトリス−塩酸（pH7.4）、0.5M塩化ナトリウムからなる緩衝液80mlで0.5ml/分の流速で洗浄した後、20mMトリス−塩酸（pH7.4）、0.5M塩化ナトリウムからなる緩衝液15ml、0.5Mα−メチルマンノサイド、20mMトリス−塩酸（pH7.4）、0.5M塩化ナトリウムからなる緩衝液15mlを用いてα−メチルマンノサイドの濃度を0〜0.5Mまで直線的に変化させることによりコンカナバリンＡ−セファロースに吸着した蛋白質の溶出を行うと共に1mlずつ溶出液を分画した（フラクション1〜30）。さらに、1Mα−メチルマンノサイド、20mMトリス−塩酸（pH7.4）、0.5M塩化ナトリウムからなる緩衝液20mlを通塔し、2mlずつ分画した（フラクション31〜40）。各フラクションに含まれる蛋白濃度を蛋白濃度測定キット（バイオラッド社製）を用いて測定し、蛋白濃度の高いフラクション10〜40までを回収した。該蛋白溶液をアミコン社製セントリコン−30を用いて約10倍に濃縮し、透析用チューブに封入してPBSに対して透析を行った。以上のようにして、精製shIL-5Rα（蛋白質濃度4mg/ml、3.5ml）を得た。
一方、hIL-5Rα-Fcは以下のようにして得た。カラムにプロテインＡ−セファロース・ゲル約5mlを充填し、50mlのPBSで洗浄を行った。洗浄後、上記のpAI301による形質転換株の培養液約1リットルを0.5ml/分の流速でプロテインＡ−セファロースカラムに通塔した。さらに50mlのPBSでカラムを洗浄後、20mlの0.1Mクエン酸緩衝液（pH3.0）を通塔しプロテインＡ−セファロースに吸着した蛋白質の溶出を行うと共に1mlずつ溶出液を分画した。各フラクションには2Mトリス−塩酸（pH9.0）0.15mlを加えてpHを調整した。各フラクションに含まれる蛋白濃度を蛋白濃度測定キット（バイオラッド社製）を用いて測定し、蛋白濃度の高いフラクションを回収した。該蛋白溶液を透析用チューブに封入してPBSに対して透析を行った。以上のようにして精製hIL-5Rα-Fc（蛋白質濃度1.8mg/ml、5.5ml）を得た。
（10）昆虫細胞によるshIL-5RαあるいはhIL-5Rα-Fcの発現
ファーミンジェン社製バキュロゴールドスターターキットに添付されているマニュアルに従い以下の手順によりshIL-5RαおよびhIL-5Rα-Fcの発現を行った。
培養液からのshIL-5RαおよびhIL-5Rα-Fcの回収はコンカナバリンＡ−セファロースとジエチルアミノエチル（DEAE）−セファロース、あるいはプロテインＡ−セファロース（いずれもファルマシア・バイオテク社製）を用いてそれぞれ行った。
shIL-5Rαは以下のようにして得た。Sf9細胞6×106個を225cm2フラスコ（グライナー社製）に10%FCSを含むグレイスズ・インセクト・メディウム（Grace's Insect Medium、ギブコ社製）45mlに懸濁し、27℃で3〜4日間培養した。培養上清を除き新たに10%FCSを含むグレイスズ・インセクト・メディウム30mlと実施例１の１（8）で得られたトランスファーベクターpAI292由来の組み換えウィルスを約1×107PFU/mlの濃度で含む溶液を1ml加えた。さらに27℃で１日間培養した後、上清を除き新たにSf900-II培地45mlを加え２〜３日間培養した。培養終了後、培養上清を回収し1,500×gで10分間遠心分離を行い上清を得た。該培養液に最終濃度0.5Ｍとなるように塩化ナトリウムを加え、さらに1/50容量の1Mトリス−塩酸（pH7.4）を加えた後、該溶液のpHを1N水酸化ナトリウム溶液を用いてpH7.4に調整した。
カラムにコンカナバリンＡ−セファロース・ゲル約10mlを充填し、20mMトリス−塩酸（pH7.4）、0.5M塩化ナトリウムからなる緩衝液50mlで0.5ml/分の流速で洗浄した。洗浄後、上記のように調整したshIL-5Rαを含む培養液500mlを0.5ml/分の流速でコンカナバリンＡ−セファロースカラムに通塔した。さらに20mMトリス−塩酸（pH7.4）、0.5M塩化ナトリウムからなる緩衝液80mlで0.5ml/分の流速で洗浄した後、1M α−メチルマンノサイド、20mMトリス−塩酸（pH7.4）、0.5M塩化ナトリウムからなる緩衝液60mlを通塔しコンカナバリンＡ−セファロースに吸着した蛋白質の溶出を行うと共に2mlずつ溶出液を分画した。各フラクションに含まれる蛋白濃度を蛋白濃度測定キット（バイオラッド社製）を用いて測定し、蛋白濃度の高いフラクションを44ml回収し、20mMトリス−塩酸（pH7.4）に対して透析した。さらに900mlの上記のように調整したshIL-5Rαを含む培養液より同様の操作により、蛋白濃度の高いフラクションを40ml回収し、20mMトリス−塩酸（pH7.4）に対して透析した。
透析後、上記の該蛋白溶液を合わせて10mlのジエチルアミノエチル（DEAE）−セファロース・ゲルを充填したカラムに通塔し、蛋白質を吸着させた。カラムからのshIL-5Rαの溶出は塩化ナトリウム濃度を0〜0.5Mまで直線的に変化させることにより行い、shIL-5Rαを高濃度に含むフラクションを4ml回収した。該蛋白溶液を透析用チューブに封入してPBSに対して透析を行った。以上のようにして、精製shIL-5Rα（蛋白質濃度400μg/ml、4.5ml）を得た。
一方、hIL-5Rα-Fcは以下のようにして得た。Sf9細胞6×106個を225cm2フラスコ（グライナー社製）に10%FCSを含むグレイスズ・インセクト・メディウム（Grace's Insect Medium、ギブコ社製）45mlに懸濁し、27℃で3〜4日間培養した。培養上清を除き新たに10%FCSを含むグレイスズ・インセクト・メディウム30mlと実施例１の１（8）で得られたトランスファーベクターpAI297由来の組み換えウィルスを約1×107PFU/mlの濃度で含む溶液を1ml加えた。さらに27℃で1日間培養した後、上清を除き新たにSf900-II培地45mlを加え2〜3日間培養した。培養終了後、培養上清を回収し1,500×gで10分間遠心分離を行い上清を得た。
カラムにプロテインＡ−セファロース・ゲル約5mlを充填し、50mlのPBSで洗浄を行った。洗浄後上記のhIL-5Rα-Fcを含む培養液450mlを0.5ml/分の流速でプロテインＡ−セファロースカラムに通塔した。さらに50mlのPBSでカラムを洗浄後、20mlの0.1Mクエン酸緩衝液（pH3.0）を通塔しプロテインＡ−セファロースに吸着した蛋白質の溶出を行うと共に1mlずつ溶出液を分画した。各フラクションには0.15mlの2Mトリス−塩酸（pH9.0）を加えてpHを調整した。各フラクションに含まれる蛋白濃度をバイオラッド社製蛋白濃度測定キットを用いて測定し、蛋白濃度の高いフラクションを回収した。該蛋白溶液をアミコン社製セントリコン−30を用いて約3倍に濃縮し、透析用チューブに封入してPBSに対して透析を行った。以上のようにして、精製hIL-5Rα-Fc（蛋白質濃度0.4mg/ml、1.8ml）を得た。
（11）大腸菌によるshIL-5Rα部分断片の発現
大腸菌によるshIL-5Rα部分断片の発現は、以下に示す大腸菌用発現ベクターpMKex1にshIL-5Rα断片をコードするcDNAを含むDNA断片を挿入してpAI263を造成し、pAI263を大腸菌に導入することにより行った。
プラスミドpGHA2（特開昭60-221091）の3μgを50mMトリス−塩酸（pH7.5）、10mM塩化マグネシウム、100mM塩化ナトリウムおよび1mM DTTからなる緩衝液30μlに加え、更に10単位のEcoRIを加えて37℃で4時間反応させた。該反応液よりエタノール沈殿によりDNA断片を回収し、10mMトリス−塩酸（pH7.5）、10mM塩化マグネシウム、50mM塩化ナトリウムおよび1mM DTTからなる緩衝液30μlと10単位のClaIを加えて37℃で4時間反応させた。該反応液をアガロースゲル電気泳動にて分画し、プロモーター領域を含むpGHA2のEcoRI/ClaI断片を約0.3μg回収した。
プラスミドpTerm2（特開平2-227075）の3μgを50mMトリス−塩酸（pH7.5）、10mM塩化マグネシウム、100mM塩化ナトリウムおよび1mM DTTからなる緩衝液30μlに加え、更に10単位のEcoRIを加えて37℃で4時間反応させた。該反応液よりエタノール沈殿によりDNA断片を回収し、10mMトリス−塩酸（pH8.4）、10mM塩化マグネシウム、100mM塩化ナトリウムおよび1mM DTTからなる緩衝液、30μlと10単位のNsiIを加えて37℃で4時間反応させた。該反応液をアガロースゲル電気泳動にて分画し、を含むpTerm2のEcoRI/NsiI断片を約0.8μg回収した。
pGHA2のEcoRI/ClaI断片の50ng、pTerm2のEcoRI/NsiI断片の100ngと配列番号15に示した合成DNAの100ngとを20μlのT4DNAリガーゼ緩衝液に溶解し、T4DNAリガーゼ200単位を加え、12℃で16時間結合反応を行った。このようにして得られた組換えプラスミドDNAを用いて大腸菌JM109株を形質転換し、第12図に示したプラスミドpMKex1を得た。
一方、第3図で得られたpAI234の3μgを50mMトリス−塩酸（pH7.5）、10mM塩化マグネシウム、100mM塩化ナトリウムおよび1mM DTTからなる緩衝液30μlに加え、更に10単位のPstIを加えて37℃で4時間反応させた。該反応液よりエタノール沈殿によりDNA断片を回収し、20μlのT4DNAポリメラーゼＩ緩衝液［33mMトリス−酢酸（pH8.0）、66mM酢酸カリウム、10mM酢酸マグネシウム、0.5mM DTT、0.01%BSAからなる緩衝液］に溶解し、5単位のT4DNAポリメラーゼＩ（宝酒造社製）を加え、12℃で15分間反応させ、PstI消化によって生じた5'突出末端を平滑末端に変えた。さらに該反応液をフェノール−クロロホルム抽出後、エタノール沈澱を行い、20mMトリス−塩酸（pH8.5）、10mM塩化マグネシウム、100mM塩化カリウムおよび1mM DTTからなる緩衝液30μlと10単位のBamHIを加えて37℃で4時間反応させた。該反応液をアガロースゲル電気泳動にて分画し、shIL-5Rα断片をコードするcDNAを含む約0.7kbのDNA断片を約0.3μg回収した。
第１２図で得られた大腸菌用発現ベクターpMKex1の3μgを20mMトリス−塩酸（pH8.5）、10mM塩化マグネシウム、100mM塩化カリウムおよび1mM DTTからなる緩衝液30μlに溶解し、10単位のBamHIを加えて37℃で4時間反応させた。該反応液よりエタノール沈殿によりDNA断片を回収し、50mMトリス−塩酸（pH7.5）、10mM塩化マグネシウム、100mM塩化ナトリウムおよび1mM DTTからなる緩衝液30μlに溶解し、更に10単位のEcoRVを加えて37℃で4時間反応させた。該反応液よりエタノール沈殿によりDNA断片を約1.5μg回収した。
以上のようにして得られたshIL-5Rα断片をコードするcDNAの50ngとpMKex1のEcoRV/BamHI断片の100ngとを20μlのT4DNAリガーゼ緩衝液に溶解し、T4DNAリガーゼ200単位を加え、12℃で16時間結合反応を行った。このようにして得られた組換えプラスミドDNAを用いて大腸菌JM109株を形質転換し、第１３図に示したプラスミドpAI263を得た。
上記のプラスミドpAI263を大腸菌に導入し（Molecular Cloning.A Laboratory Manua1,2nd Edition published by Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989）、200μg/mlのアンピシリンを含むLB培地400ml中で、37℃4時間培養後、0.5mMのIPTGを添加し、その後さらに37℃2時間培養した。培養液400mlを3,000×gで15分間遠心分離し、大腸菌を含む沈殿を100mlの緩衝液I［10mMトリス−塩酸（pH8.0）、1m MEDTA、150mM塩化ナトリウムからなる緩衝液］に懸濁した。再び遠心分離後、沈殿を7mlの緩衝液Iで懸濁し、超音波処理により菌体を破壊する。これを10,000×gで30分間遠心分離し、その沈殿を500μlSDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動用サンプルバッファー［6mMトリス−塩酸（pH6.8）、2%SDS、10%グリセロール、5% 2−メルカプトエタノールからなる緩衝液］に溶解し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分画し、分子量約27kDの精製shIL-5Rα断片を得た。
（12）ヒトIL-5Rαを発現した細胞の細胞膜画分の調製
hIL-5Rα遺伝子を導入したCTLL-2細胞［ジャーナル・オブ・エキスペリメンタル・メディシン（J.Exp.Med.）,177,1523（1993）］、あるいは対照としてのCTLL-2細胞［ATCC TIB 214］からの膜成分の調製を以下のようにして行った。
該細胞を遠心分離（1,200rpm、５分）し、PBSにて2回洗浄後、細胞破砕用緩衝液［20mM HEPES（pH7.4）、1mM EDTA、0.5mM PMSF、250mMシュークロースからなる緩衝液］に懸濁しホモゲナイザーを用いて破砕した。破砕後5,500rpmで15分間遠心分離して沈殿を除き、さらに35,000rpmで遠心分離して細胞膜画分を沈殿として回収した。
２．動物の免疫と抗体産生細胞の調製
実施例１の1（9）、1（10）、1（11）あるいは1（12）より得られた各種抗原50μgをそれぞれアルミニウムゲル2mgおよび百日咳ワクチン（千葉県血清研究所製）1×109細胞とともに5週令雌BALB/cマウスあるいは雌SDラットに投与し、2週間後より50μgの蛋白質を1週間に1回、計4回投与した。眼底静脈叢あるいは尾静脈より採血し、その血清抗体価を実施例１の３に示す酵素免疫測定法で調べ、十分な抗体価を示したマウスあるいはラットから最終免疫3日後に脾臓を摘出した。この時、実施例１の1（12）で得られた細胞膜画分を抗原としてマウス13匹、ラット5匹を免疫したが、抗体価の強い上昇は認められなかった。また、実施例１の1（9）で得られたshIL-5Rαを免疫したラット5匹あるいは実施例１の１（10）で得られたshIL-5Rαを免疫したラット１０匹においても抗体価の十分な上昇は認められなかった。
脾臓をMEM培地（日水製薬社製）中で細断し、ピンセットでほぐし、遠心分離（1,200rpm、5分）した後、上清を捨て、トリス−塩化アンモニウム緩衝液（pH7.65）で1〜2分間処理し赤血球を除去し、MEM培地で3回洗浄し、細胞融合に用いた。
３．酵素免疫測定法
実施例１の1（9）あるいは1（10）で得られたshIL-5Rαを免疫したマウスあるいはラットに由来する抗血清およびハイブリドーマの培養上清の測定は、抗原として、実施例１の1（10）の昆虫細胞培養上清より得られたhIL-5Rα-Fcを用いて以下に示す２種類の方法にしたがって行った。
（Ａ）96ウェルのEIA用プレート（グライナー社製）に、PBSで1μg/mlの濃度に希釈したhIL-5Rα-Fcおよび対照抗原として共通のヒト免疫グロブリン定常領域を有する抗GD3キメラ抗体KM871を50μl/ウェルで分注し、4℃で一晩放置して吸着させた。洗浄後、1％牛血清アルブミン（BSA）を含むPBS（1%BSA-PBS）を100μl/ウェル加え、室温1時間反応させて残っている活性基をブロックした。1%BSA-PBSを捨て、被免疫マウスあるいは被免疫ラット抗血清およびハイブリドーマの培養上清を50μl/ウェルで分注し2時間反応させた。tween-PBSで洗浄後、ペルオキシダーゼ標識ウサギ抗マウスイムノグロブリンあるいは抗ラットイムノグロブリン（DAKO社製）を50μl/ウェルで加えて室温、1時間反応させ、tween-PBSで洗浄後ABTS基質液［2,2'アジノビス（3-エチルベンゾチアゾリン-6-スルホン酸）二アンモニウムの550mgを0.1Mクエン酸緩衝液（pH4.2）1Lに溶解し、使用直前に過酸化水素1μl/mlを加えた溶液］を用いて発色させOD415nmの吸光度を測定した（NJ2001;日本インターメッド社製）。
（Ｂ）さらに、IL-5に対する中和活性を有するモノクローナル抗体をより高い確率で選択する目的で、ビオチン標識したヒトIL-5と実施例1の1（10）の昆虫細胞培養上清より得られたshIL-5Rα-Fcを利用し、IL-5の受容体への結合阻害活性を指標としてスクリーニングを以下の手順で行った。なお、ビオチン標識するのに用いた用いたヒトIL-5は、ジャーナル・オブ・イムノロジカル・メソッズ［Journal of Immunological Methods,125,233（1989）］に記載された方法により調製した。
ヒトIL-5のビオチン標識は、ピアース社のビオチン標識用試薬（Biotin-LC-Hydrazide）に添付されているプロトコールに従い以下の手順で行った。始めにPBSに溶解した1.6mg/mlのヒトIL-5を標識用緩衝液（100mM酢酸ナトリウム、0,02%NaN3、pH5.5）で平衡化したPD10カラム（ファルマシア社製）に通塔して塩交換を行い、蛋白質濃度の高い画分を1ml回収した。該ヒトIL-5溶液0.5mlに30mMメタ過ヨウ素酸を含む標識用緩衝液1mlを加え、遮光して30分間室温にて反応させた。反応終了後、標識用緩衝液で平衡化したPD10カラムに通塔して未反応のメタ過ヨウ素酸を除き、蛋白質濃度の高い画分を1.5ml回収した。ここに前述した5mMのビオチン標識用試薬を含む標識用緩衝液20μlを加え、さらに室温にて１時間反応させた。反応終了後、反応停止液（0.1Mトリス、pH7.5）を50μl加えた後、0.05%NaN3を含むPBSにて平衡化したPD10カラムに通塔して塩交換を行うとともに、未反応の試薬を取り除いた。得られたビオチン標識ヒトIL-5は4℃にて保存した。
実施例1の1（10）の昆虫細胞培養上清より得られたshIL-5Rα-FcをPBSで5μg/mlの濃度に希釈し、96ウエルのEIA用プレート（グライナー社製）に50μl/ウェルで分注し、4℃で一晩放置して吸着させた。PBSにて洗浄後、1％牛血清アルブミン（BSA）を含むPBS（1%BSA-PBS）を100μl/ウェル加え、室温で1時間反応させて残っている活性基をブロックした。さらにtween-PBSにて洗浄直後、被免疫マウスあるいは被免疫ラット抗血清およびハイブリドーマの培養上清と前述したビオチン標識ヒトIL-5をそれぞれ50μl/ウェルずつ分注し、4℃一晩反応させた。翌日tween-PBSで洗浄後、1%BSA-PBSにて4000倍に希釈したペルオキシダーゼ標識アビジンD（ニチレイ社製）を50μl/ウェルで加えて室温で1時間反応させ、tween-PBSで洗浄後、ABTS基質液を50μl/ウエル加えて発色させ、OD415nmの吸光度を測定した。
また、実施例１の1（11）で得られたhIL-5Rα断片を免疫したマウスあるいはラットに由来する抗血清およびハイブリドーマの培養上清の測定に関しては、抗原として実施例１の1（11）の大腸菌により得られたhIL-5Rα断片を用いた。上記と同様の方法により大腸菌により生産したshIL-5Rαおよび対照抗原として大腸菌の菌体蛋白を吸着させたプレートを作製し、ハイブリドーマの培養上清および被免疫マウスあるいは被免疫ラット抗血清の反応性を検討した。
さらに、実施例１の1（12）で得られたhIL-5Rαを発現した細胞の膜画分を免疫したマウスあるいはラットに由来する抗血清およびハイブリドーマの培養上清の測定に関しては、抗原として実施例１の1（12）で得られた細胞膜画分を用いた。上記と同様の方法によりIL-5Rα発現した細胞の膜画分および対照細胞の膜画分を吸着させたプレートを作製し、ハイブリドーマの培養上清および被免疫マウスあるいは被免疫ラット抗血清の反応性を検討した。
４．マウス骨髄腫細胞の調製
8-アザグアニン耐性マウス骨髄腫細胞株P3-U1を正常培地で培養し、細胞融合時に2×107以上の細胞を確保し、細胞融合に親株として供した。
５．ハイブリドーマの作製
実施例１の2で得られたマウス脾細胞あるいはラット脾細胞と実施例１の4で得られた骨髄腫細胞とを10:1になるよう混合し、遠心分離（1,200rpm、5分間）した後、上清を捨て、沈澱した細胞群をよくほぐした後、攪拌しながら、37℃で、ポリエチレングライコール−1000（PEG-1000）2g、MEM培地2mlおよびDMSO 0.7mlの混液0.2〜1ml/108マウス脾細胞を加え、1〜2分間毎にMEM培地1〜2mlを数回加えた後、MEM培地を加えて全量が50mlになるようにした。遠心分離（900rpm、5分間）後、上清を捨て、ゆるやかに細胞をほぐした後、メスピペットによる吸込み、吸出しでゆるやかに細胞をHAT培地100ml中に懸濁した。
この懸濁液を96ウェル培養用プレートに100μl/ウェルずつ分注し、5%CO2インキュベーター中、37℃で10〜14日間CO2 5%下で培養した。この培養上清を実施例１の3に記載した酵素免疫測定法で調べ、昆虫細胞培養上清より調製したhIL-5Rα-Fc、あるいは大腸菌により生産したshIL-5Rαに特異的に反応するウェルを選び、さらにHT培地と正常培地に換え、2回クローニングを繰り返して、抗ヒトIL-5Rαモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマ株を確立した。
実施例１の1（11）で得られたhIL-5Rα断片を免疫したマウス6匹、あるいはラット8匹から得られたハイブリドーマ約4000クローンをスクリーニングした結果、抗hIL-5Rαモノクローナル抗体を得、これをKM1074と名付けたが、IL-5Rα鎖に対する反応性は、後述する抗ヒトIL-5Rα鎖モノクローナル抗体KM1257、KM1259に比較して極めて弱いものであった。
一方、実施例１の１（9）で得られたshIL-5Rαあるいは実施例１の１（10）を免疫したマウス15あるいは20匹の中から高い抗体価を示した個体を１２あるいは６匹選択し、ハイブリドーマを作製した。10000クローン以上のハイブリドーマをスクリーニングし、後述する実施例３の１に示した方法においてhIL-5Rα発現細胞に対する特異的な反応性が認められる８１クローンの抗hIL-5Rαモノクローナル抗体産生ハイブリドーマを確立した。この中で後述する実施例３の１に示す免疫細胞染色法において最も強い反応性を示したモノクローナル抗体は、KM1257であった。ハイブリドーマKM1257はFERM BP-5133として、平成７年６月１３日付けで工業技術院生命工学技術研究所（日本国茨城県つくば市東１丁目１番３号、以下、所在住所は同様）に寄託された。また、この８１クローンの中で後述する実施例３の２で示したIL-5の生物活性の強い阻害作用を示したものは６クローンのみであり、その中でも最も強い阻害活性を示したモノクローナル抗体は、KM1259およびKM1486であった。ハイブリドーマKM1259はFERM BP-5134として、平成７年６月１３日付けで、ハイブリドーマKM1486はFERM BP-5651として、平成８年９月３日付けで、それぞれ工業技術院生命工学技術研究所に寄託された。
モノクローナル抗体KM1257、KM1259およびKM1486の反応性を第14図に示す。また、抗体クラスはサブクラスタイピングキットを用いた酵素免疫測定法を行った。その結果KM1257、KM1259およびKM1486の抗体クラスは、すべてIgG1であった。
６．モノクローナル抗体の精製
プリスタン処理した8週令ヌード雌マウス（Balb/c）に5で得られたハイブリドーマ株を5〜20×106細胞／匹それぞれ腹腔内に注射した。10〜21日後に、ハイブリドーマは腹水癌化した。腹水のたまったマウスから、腹水を採取（1〜8ml/匹）し、遠心分離（3,000rpm、5分間）して固形分を除去した後カプリル酸沈殿法（Antibodies-A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,1988）により精製し、精製モノクローナル抗体とした。
実施例2.抗ヒトIL-5Rα鎖ヒト化抗体の製造
1. タンデムカセット型のヒト化抗体発現用ベクターpKANTEX93の構築
ヒト化抗体のVH及びVLをコードするcDNAを、それぞれヒト抗体Cγ1をコードするcDNA及びヒト抗体CκをコードするcDNAの上流に挿入し、ヒト抗体IgG1,κ型のヒト化抗体を動物細胞で発現させるためのタンデムカセット型のヒト化抗体発現用ベクター、pKANTEX93を特開平2-257891に記載のプラスミドpSE1UK1SEd1-3を基にして以下のようにして構築した。構築したヒト化抗体発現用ベクターは、ヒト型キメラ抗体及びヒト型CDR移植抗体の動物細胞での発現に使用した。
（１）ラビットβ-グロビン遺伝子スプライシング、ポリAシグナルに存在する制限酵素ApaI及びEcoRI部位の改変
ヒト化抗体発現用ベクターにヒト型キメラ抗体あるいはヒト型CDR移植抗体のV領域を制限酵素NotI-ApaI断片（VH）及びEcoRI-SplI断片（VL）でカセット式に挿入してヒト型キメラ抗体発現ベクターあるいはヒト型CDR移植抗体ヒト化抗体発現ベクターを構築可能とするために、プラスミドpSE1UK1SEd1-3のラビットβ-グロビン遺伝子スプライシング、ポリAシグナルに存在する制限酵素ApaI及びEcoRI部位の改変を以下のようにして行なった。
プラスミドpBluescript SK（-）（ストラタジーン社製）の3μgを10mMトリス-塩酸（pH7.5）、10mM塩化マグネシウムおよび1mMDTTからなる緩衝液10μlに加え、更に10単位の制限酵素ApaI（宝酒造社製）を加えて37℃で1時間反応させた。該反応液をエタノール沈殿し、DNA Blunting Kit（宝酒造社製）を用い、ApaI消化によって生じた3'突出末端を平滑末端に変えた後、DNA Ligation Kit（宝酒造社製）を用いて連結した。このようにして得られた組換えプラスミドDNA溶液を用いて大腸菌HB101株を形質転換し、第15図に示したプラスミドpBSAを得た。
さらに得られたプラスミドpBSAの3μgを50mMトリス-塩酸（pH7.5）、10mM塩化マグネシウム、100mM塩化ナトリウムおよび1mMDTTからなる緩衝液10μlに加え、更に10単位の制限酵素EcoRI（宝酒造社製）を加えて37℃で1時間反応させた。該反応液をエタノール沈殿し、DNA Blunting Kit（宝酒造社製）を用い、EcoRI消化によって生じた5'突出末端を平滑末端に変えた後、DNA Ligation Kit（宝酒造社製）を用いて連結した。このようにして得られた組換えプラスミドDNA溶液を用いて大腸菌HB101株を形質転換し、第16図に示したプラスミドpBSAEを得た。
次に、上記で得られたプラスミドpBSAEの3μgを10mMトリス-塩酸（pH7.5）、10mM塩化マグネシウム、50mM塩化ナトリウムおよび1mMDTTからなる緩衝液10μlに加え、更に10単位の制限酵素HindIII（宝酒造社製）を加えて37℃で1時間反応させた。該反応液をエタノール沈殿し、10mMトリス-塩酸（pH7.5）、10mM塩化マグネシウムおよび1mMDTTからなる緩衝液20μlに溶解し、10μlずつに分け、一つには更に10単位の制限酵素SacII（東洋紡績社製）を加え、もう一つには更に10単位の制限酵素KpnI（宝酒造社製）を加えて各々37℃で1時間反応させた。両反応液をアガロースゲル電気泳動にて分画し、各々約2.96kbのHindIII-SacII断片と約2.96kbのKpnI-HindIII断片を約0.3μg回収した。
次に、プラスミドpSE1UK1SEd1-3の3μgを10mMトリス-塩酸（pH7.5）、10mM塩化マグネシウムおよび1mMDTTからなる緩衝液10μlに加え、更に10単位の制限酵素SacII（東洋紡績社製）と10単位の制限酵素KpnI（宝酒造社製）を加えて37℃で1時間反応させた。該反応液をエタノール沈殿し、10μlの10mMトリス-塩酸（pH7.5）、10mM塩化マグネシウム、50mM塩化ナトリウムおよび1mMDTTからなる緩衝液10μlに溶解し、更に10単位の制限酵素HindIII（宝酒造社製）を加えて37℃で1時間反応させた。該反応液をアガロースゲル電気泳動にて分画し、約2.42kbのHindIII-SacII断片と約1.98kbのKpnI-HindIII断片を各々約0.2μg回収した。
次に、上記で得られたpSE1UK1SEd1-3のHindIII-SacII断片0.1μgとpBSAEのHindIII-SacII断片0.1μgを全量20μlの滅菌水に溶解し、Ready-To-Go T4 DNA Ligase（ファルマシア バイオテク社製）を用いて連結した。このようにして得られた組換えプラスミドDNA溶液を用いて大腸菌HB101株を形質転換し、第17図に示したプラスミドpBSH-Sを得た。また、上記で得られたpSE1UK1SEd1-3のKpnI-HindIII断片0.1μgとpBSAEのKpnI-HindIII断片0.1μgを全量20μlの滅菌水に溶解し、Ready-To-Go T4 DNA Ligase（ファルマシア バイオテク社製）を用いて連結した。このようにして得られた組換えプラスミドDNA溶液を用いて大腸菌HB101株を形質転換し、第18図に示したプラスミドpBSK-Hを得た。
次に、上記で得られたプラスミドpBSH-SおよびpBSK-Hの3μgを各々10mMトリス-塩酸（pH7.5）、10mM塩化マグネシウムおよび1mMDTTからなる緩衝液10μlに加え、更に10単位の制限酵素ApaI（宝酒造社製）を加えて37℃で1時間反応させた。両反応液をエタノール沈殿し、各々DNA Blunting Kit（宝酒造社製）を用い、ApaI消化によって生じた3'突出末端を平滑末端に変えた後、DNA Ligation Kit（宝酒造社製）を用いて連結した。このようにして得られた各々の組換えプラスミドDNA溶液を用いて大腸菌HB101株を形質転換し、第19図に示したプラスミドpBSH-SAおよびpBSK-HAを得た。
次に、上記で得られたプラスミドpBSH-SAおよびpBSK-HAの5μgを各々50mMトリス-塩酸（pH7.5）、10mM塩化マグネシウム、100mM塩化ナトリウムおよび1mMDTTからなる緩衝液10μlに加え、更に1単位の制限酵素EcoRI（宝酒造社製）を加えて37℃で10分間反応させ、部分消化した。両反応液をエタノール沈殿し、各々DNA Blunting Kit（宝酒造社製）を用い、EcoRI消化によって生じた5'突出末端を平滑末端に変えた後、アガロースゲル電気泳動にて分画し、各々約5.38kbの断片と約4.94kbの断片を約0.5μg回収した。回収した各々の断片0.1μgを全量20μlの滅菌水に溶解し、Ready-To-Go T4 DNA Ligase（ファルマシア バイオテク社製）を用いて連結した。このようにして得られた各々の組換えプラスミドDNA溶液を用いて大腸菌HB101株を形質転換し、第20図に示したプラスミドpBSH-SAEおよびpBSK-HAEを得た。
次に、上記で得られたプラスミドpBSH-SAEおよびpBSK-HAEの3μgを各々50mMトリス-塩酸（pH7.5）、10mM塩化マグネシウム、100mM塩化ナトリウムおよび1mMDTTからなる緩衝液10μlに加え、更に10単位の制限酵素EcoRI（宝酒造社製）を加えて37℃で1時間反応させた。両反応液をエタノール沈殿し、各々DNA Blunting Kit（宝酒造社製）を用い、EcoRI消化によって生じた5'突出末端を平滑末端に変えた後、DNA Ligation Kit（宝酒造社製）を用いて連結した。このようにして得られた各々の組換えプラスミドDNA溶液を用いて大腸菌HB101株を形質転換し、第21図に示したプラスミドpBSH-SAEEおよびpBSK-HAEEを得た。得られた各プラスミドの10μgを用い、AutoRead Sequencing Kit（ファルマシア バイオテク社製）に添付の処方に従って反応後、A.L.F.DNA Sequencer（ファルマシア バイオテク社製）により電気泳動し、塩基配列を決定した結果、上記改変によりApaI、EcoRI部位ともに消失したことを確認した。
（２）ラビットβ-グロビン遺伝子スプライシング、ポリAシグナルおよびSV40初期遺伝子ポリAシグナルの下流への制限酵素SalI部位の導入
ヒト化抗体発現用ベクターの抗体H鎖、L鎖の発現プロモーターを任意のプロモーターに変換可能とするために、プラスミドpSE1UK1SEd1-3のラビットβ-グロビン遺伝子スプライシング、ポリAシグナルおよびSV40初期遺伝子ポリAシグナルの下流への制限酵素SalI部位の導入を以下のようにして行った。
実施例２の1（1）で得られたプラスミドpBSK-HAEEの3μgを10mMトリス-塩酸（pH7.5）、10mM塩化マグネシウムおよび1mMDTTからなる緩衝液10μlに加え、更に10単位の制限酵素NaeI（宝酒造社製）を加えて37℃で1時間反応させた。該反応液をエタノール沈殿し、50mMトリス-塩酸（pH9.0）、1mM塩化マグネシウムからなる緩衝液20μlに溶解し、更に1単位のアルカリフォスファターゼ（E.coli C75、宝酒造社製）を加えて37℃で1時間反応させ、5'末端を脱リン酸化した。更に該反応液をフェノール-クロロホルム抽出後、エタノール沈殿を行ない、10mMトリス-塩酸（pH8.0）、1mMエチレンジアミン四酢酸二ナトリウムからなる緩衝液（以下、TE緩衝液と称す）20μlに溶解した。該反応液の1μlと0.1μgのリン酸化SalIリンカー（宝酒造社製）を全量が20μlとなるように滅菌水に加え、Ready-To-Go T4 DNA Ligase（ファルマシア バイオテク社製）を用いて連結した。このようにして得られた組換えプラスミドDNA溶液を用いて大腸菌HB101株を形質転換し、第22図に示したプラスミドpBSK-HAEESalを得た。得られたプラスミドの10μgを用い、AutoRead Sequencing Kit（ファルマシア バイオテク社製）に添付の処方に従って反応後、A.L.F.DNA Sequencer（ファルマシア バイオテク社製）により電気泳動し、塩基配列を決定した結果、ラビットβ-グロビン遺伝子スプライシング、ポリAシグナルおよびSV40初期遺伝子ポリAシグナルの下流に一箇所の制限酵素SalI部位が導入されたことを確認した。
（３）ヘルペスシンプレックスウイルスチミジンキナーゼ（以下HSVtkと表記）遺伝子のポリAシグナルに存在する制限酵素ApaI部位の改変
プラスミドpSE1UK1SEd1-3のTn5カナマイシンフォスホトランスフェラーゼ遺伝子下流のHSVtk遺伝子ポリAシグナルに存在する制限酵素ApaI部位の改変を以下のようにして行った。
実施例２の1（1）で得られたプラスミドpBSAの3μgを10mMトリス-塩酸（pH7.5）、10mM塩化マグネシウムおよび1mMDTTからなる緩衝液10μlに加え、更に10単位の制限酵素SacII（東洋紡績社製）を加えて37℃で1時間反応させた。該反応液をエタノール沈殿し、10μlの50mMトリス-塩酸（pH7.5）、100mM塩化ナトリウム、10mM塩化マグネシウムおよび1mMDTTからなる緩衝液に加え、更に10単位の制限酵素XhoI（宝酒造社製）を加えて37℃で1時間反応させた。該反応液をアガロースゲル電気泳動にて分画し、約2.96kbのSacII-XhoI断片を約1μg回収した。
次に、プラスミドpSE1UK1SEd1-3の5μgを10μlの10mMトリス-塩酸（pH7.5）、10mM塩化マグネシウムおよび1mMDTTからなる緩衝液に加え、更に10単位の制限酵素SacII（東洋紡績社製）を加えて37℃で1時間反応させた。該反応液をエタノール沈殿し、50mMトリス-塩酸（pH7.5）、100mM塩化ナトリウム、10mM塩化マグネシウムおよび1mMDTTからなる緩衝液10μlに加え、更に10単位の制限酵素XhoI（宝酒造社製）を加えて37℃で1時間反応させた。該反応液をアガロースゲル電気泳動にて分画し、約4.25kbのSacII-XhoI断片を約1μg回収した。
次に、上記で得られたpBSAのSacII-XhoI断片0.1μgとpSE1UK1SEd1-3のSacII-XhoI断片を全量20μlの滅菌水に加え、Ready-To-Go T4 DNA Ligase（ファルマシア バイオテク社製）を用いて連結した。このようにして得られた組換えプラスミドDNA溶液を用いて大腸菌HB101株を形質転換し、第23図に示したプラスミドpBSX-Sを得た。
次に、上記で得られたプラスミドpBSX-Sの3μgを10mMトリス-塩酸（pH7.5）、10mM塩化マグネシウムおよび1mMDTTからなる緩衝液10μlに加え、更に10単位の制限酵素ApaI（宝酒造社製）を加えて37℃で1時間反応させた。該反応液をエタノール沈殿し、DNA Blunting Kit（宝酒造社製）を用い、ApaI消化によって生じた3'突出末端を平滑末端に変えた後、DNA Ligation Kit（宝酒造社製）を用いて連結した。このようにして得られた組換えプラスミドDNA溶液を用いて大腸菌HB101株を形質転換し、第24図に示したプラスミドpBSX-SAを得た。得られたプラスミドの10μgを用い、AutoRead Sequencing Kit（ファルマシア バイオテク社製）に添付の処方に従って反応後、A.L.F.DNA Sequencer（ファルマシア バイオテク社製）により電気泳動し、塩基配列を決定した結果、HSVtk遺伝子ポリAシグナルの制限酵素ApaI部位が消失したことを確認した。
（４）ヒト化抗体L鎖発現ユニットの構築
モロニーマウス白血病ウイルスの末端反復配列のプロモーター/エンハンサーの下流にヒト抗体CκをコードするcDNAが存在し、かつヒト型キメラ抗体あるいはヒト型CDR移植抗体のVLをコードcDNAをカセット式に挿入可能なヒト化抗体L鎖発現ユニットを有するプラスミドpMohCκを以下のようにして構築した。
プラスミドpBluescript SK（-）（ストラタジーン社製）の3μgを10mMトリス-塩酸（pH7.5）、10mM塩化マグネシウムおよび1mMDTTからなる緩衝液10μlに加え、更に10単位の制限酵素SacI（宝酒造社製）を加えて37℃で1時間反応させた。該反応液をエタノール沈殿し、10mMトリス-塩酸（pH7.5）、50mM塩化ナトリウム、10mM塩化マグネシウムおよび1mMDTTからなる緩衝液10μlに加え、更に10単位の制限酵素ClaI（宝酒造社製）を加えて37℃で1時間反応させた。該反応液をエタノール沈殿し、DNA Blunting Kit（宝酒造社製）を用い、SacIおよびClaI消化によって生じた突出末端を平滑末端に変えた後、アガロースゲル電気泳動にて分画し、約2.96kbのDNA断片を約1μg回収した。回収したDNA断片0.1μgを全量20μlの滅菌水に加え、Ready-To-Go T4 DNA Ligase（ファルマシア バイオテク社製）を用いて連結した。このようにして得られた組換えプラスミドDNA溶液を用いて大腸菌HB101株を形質転換し、第25図に示したプラスミドpBSSCを得た。
次に、上記で得られたプラスミドpBSSCの3μgを10mMトリス-塩酸（pH7.5）、10mM塩化マグネシウムおよび1mMDTTからなる緩衝液10μlに加え、更に10単位の制限酵素KpnI（宝酒造社製）を加えて37℃で1時間反応させた。該反応液をエタノール沈殿し、50mMトリス-塩酸（pH7.5）、100mM塩化ナトリウム、10mM塩化マグネシウムおよび1mMDTTからなる緩衝液10μlに溶解し、更に10単位の制限酵素XhoI（宝酒造社製）を加えて37℃で1時間反応させた。該反応液をアガロースゲル電気泳動にて分画し、約2.96kbのKpnI-XhoI断片を約1μg回収した。
次に、特開平6-205694に記載のプラスミドpAGE147の5μgを10mMトリス-塩酸（pH7.5）、10mM塩化マグネシウムおよび1mMDTTからなる緩衝液10μlに加え、更に10単位の制限酵素KpnI（宝酒造社製）を加えて37℃で1時間反応させた。該反応液をエタノール沈殿し、50mMトリス-塩酸（pH7.5）、100mM塩化ナトリウム、10mM塩化マグネシウムおよび1mMDTTからなる緩衝液10μlに溶解し、更に10単位の制限酵素XhoI（宝酒造社製）を加えて37℃で1時間反応させた。該反応液をアガロースゲル電気泳動にて分画し、モロニーマウス白血病ウイルスの末端反復配列のプロモーター/エンハンサーを含む約0.66kbのKpnI-XhoI断片を約0.3μg回収した。
次に、上記で得られたpBSSCのKpnI-XhoI断片0.1μgとpAGE147のKpnI-XhoI断片0.1μgを全量20μlの滅菌水に溶解し、Ready-To-Go T4 DNA Ligase（ファルマシア バイオテク社製）を用いて連結した。このようにして得られた組換えプラスミドDNA溶液を用いて大腸菌HB101株を形質転換し、第26図に示したプラスミドpBSMoを得た。
次に、上記で得られたプラスミドpBSMoの3μgを10mMトリス-塩酸（pH7.5）、10mM塩化マグネシウムおよび1mMDTTからなる緩衝液10μlに加え、更に10単位の制限酵素KpnI（宝酒造社製）を加えて37℃で1時間反応させた。該反応液をエタノール沈殿し、10mMトリス-塩酸（pH7.5）、50mM塩化ナトリウム、10mM塩化マグネシウムおよび1mMDTTからなる緩衝液10μlに溶解し、更に10単位の制限酵素HindIII（宝酒造社製）を加えて37℃で1時間反応させた。該反応液をアガロースゲル電気泳動にて分画し、約3.62kbのKpnI-HindIII断片を約1μg回収した。
次に、配列番号16、17に記載の塩基配列を有する合成DNAを自動DNA合成機（380A、アプライド バイオシステムズ社製）を用いて合成した。得られた合成DNAの0.3μgずつを15μlの滅菌水に加え、65℃で5分間加熱した。該反応液を室温にて30分間放置した後、10倍緩衝液［500mMトリス-塩酸（pH7.6）、100mM塩化マグネシウム、50mMDTT］2μlと10mMATP 2μlを加え、更に10単位のT4ポリヌクレオチドキナーゼ（宝酒造社製）を加えて37℃で30分間反応させ、5'末端をリン酸化した。上記で得られたプラスミドpBSMo由来のKpnI-HindIII断片（3.66kb）0.1μgとリン酸化合成DNA0.05μgを全量20μlの滅菌水に加え、Ready-To-Go T4 DNA Ligase（ファルマシア バイオテク社製）を用いて連結した。このようにして得られた組換えプラスミドDNA溶液を用いて大腸菌HB101株を形質転換し、第27図に示したプラスミドpBSMoSを得た。得られたプラスミドの10μgを用い、AutoRead Sequencing Kit（ファルマシア バイオテク社製）に添付の処方に従って反応後、A.L.F.DNA Sequencer（ファルマシア バイオテク社製）により電気泳動し、塩基配列を決定した結果、目的の合成DNAが導入されたことを確認した。
次に、特開平5-304989に記載のプラスミドpChiIgLA1の3μgを50mMトリス-塩酸（pH7.5）、100mM塩化ナトリウム、10mM塩化マグネシウムおよび1mMDTTからなる緩衝液10μlに溶解し、更に10単位ずつの制限酵素EcoRI（宝酒造社製）およびEcoRV（宝酒造社製）を加えて37℃で1時間反応させた。該反応液をアガロースゲル電気泳動にて分画し、約9.70kbのEcoRI-EcoRV断片を約1μg回収した。次に、配列番号18、19に記載の塩基配列を有する合成DNAを自動DNA合成機（380A、アプライド バイオシステムズ社製）を用いて合成した。得られた合成DNAの0.3μgずつを15μlの滅菌水に加え、65℃で5分間加熱した。該反応液を室温にて30分間放置した後、10倍緩衝液［500mMトリス-塩酸（pH7.6）、100mM塩化マグネシウム、50mMDTT］2μlと10mMATP 2μlを加え、更に10単位のT4ポリヌクレオチドキナーゼ（宝酒造社製）を加えて37℃で30分間反応させ、5'末端をリン酸化した。上記で得られたプラスミドpChiIgLA1由来のEcoRI-EcoRV断片（9.70kb）0.1μgとリン酸化合成DNA0.05μgを全量20μlの滅菌水に加え、Ready-To-Go T4 DNA Ligase（ファルマシア バイオテク社製）を用いて連結した。このようにして得られた組換えプラスミドDNA溶液を用いて大腸菌HB101株を形質転換し、第28図に示したプラスミドpChiIgLA1Sを得た。
次に、上記で得られたプラスミドpBSMoSの3μgを20mMトリス-塩酸（pH8.5）、100mM塩化カリウム、10mM塩化マグネシウムおよび1mMDTTからなる緩衝液10μlに溶解し、更に10単位の制限酵素HpaI（宝酒造社製）を加えて37℃で1時間反応させた。該反応液をエタノール沈殿し、50mMトリス-塩酸（pH7.5）、100mM塩化ナトリウム、10mM塩化マグネシウムおよび1mMDTTからなる緩衝液10μlに溶解し、更に10単位の制限酵素EcoRI（宝酒造社製）を加えて37℃で1時間反応させた。該反応液をアガロースゲル電気泳動にて分画し、約3.66kbのHpaI-EcoRI断片を約1μg回収した。
次に、上記で得られたプラスミドpChiIgLA1Sの10μgを20mMトリス-酢酸（pH7.9）、50mM酢酸カリウム、10mM酢酸マグネシウム、1mMDTTおよび100μg/mlBSAからなる緩衝液10μlに溶解し、更に10単位の制限酵素NlaIV（ニューイングランド バイオラブズ社製）を加えて37℃で1時間反応させた。該反応液をエタノール沈殿し、50mMトリス-塩酸（pH7.5）、100mM塩化ナトリウム、10mM塩化マグネシウムおよび1mMDTTからなる緩衝液10μlに溶解し、更に10単位の制限酵素EcoRI（宝酒造社製）を加えて37℃で1時間反応させた。該反応液をアガロースゲル電気泳動にて分画し、約0.41kbのNlaIV-EcoRI断片を約0.3μg回収した。
次に、上記で得られたpBSMoSのHpaI-EcoRI断片を0.1μgとpChiIgLA1SのNlaIV-EcoRI断片0.1μgを全量20μlの滅菌水に加え、Ready-To-Go T4 DNA Ligase（ファルマシア バイオテク社製）を用いて連結した。このようにして得られた組換えプラスミドDNA溶液を用いて大腸菌HB101株を形質転換し、第29図に示したプラスミドpMohCκを得た。
（５）ヒト化抗体H鎖発現ユニットの構築
モロニーマウス白血病ウイルスの末端反復配列のプロモーター/エンハンサーの下流にヒト抗体Cγ1をコードするcDNAが存在し、かつヒト型キメラ抗体あるいはヒト型CDR移植抗体のVHをコードcDNAをカセット式に挿入可能なヒト化抗体H鎖発現ユニットを有するプラスミドpMohCγ1を以下のようにして構築した。
実施例２の1（4）で得られたプラスミドpBSMoの3μgを50mMトリス-塩酸（pH7.5）、100mM塩化ナトリウム、10mM塩化マグネシウムおよび1mMDTTからなる緩衝液10μlに加え、更に10単位の制限酵素XhoI（宝酒造社製）を加えて37℃で1時間反応させた。該反応液をエタノール沈殿し、30mM酢酸ナトリウム（pH5.0）、100mM塩化ナトリウム、1mM酢酸亜鉛および10%グリセロールからなる緩衝液10μlに溶解し、更に10単位のマングビーンヌクレアーゼ（宝酒造社製）を加えて37℃で10分間反応させた。該反応液をフェノール-クロロホルム抽出後、エタノール沈殿を行ない、DNA Blunting Kit（宝酒造社製）を用い、突出末端を平滑末端に変えた後、DNA Ligation Kit（宝酒造社製）を用いて連結した。このようにして得られた組換えプラスミドDNA溶液を用いて大腸菌HB101株を形質転換し、第30図に示したプラスミドpBSMoSalを得た。得られたプラスミドの10μgを用い、AutoRead Sequencing Kit（ファルマシア バイオテク社製）に添付の処方に従って反応後、A.L.F.DNA Sequencer（ファルマシア バイオテク社製）により電気泳動し、塩基配列を決定した結果、モロニーマウス白血病ウイルスの末端反復配列のプロモーター/エンハンサーの上流の制限酵素XhoI部位が消失したことを確認した。
次に、上記で得られたプラスミドpBSMoSalの3μgを10mMトリス-塩酸（pH7.5）、10mM塩化マグネシウムおよび1mMDTTからなる緩衝液10μlに加え、更に10単位の制限酵素KpnI（宝酒造社製）を加えて37℃で1時間反応させた。該反応液をエタノール沈殿し、10mMトリス-塩酸（pH7.5）、50mM塩化ナトリウム、10mM塩化マグネシウムおよび1mMDTTからなる緩衝液10μlに溶解し、更に10単位の制限酵素HindIII（宝酒造社製）を加えて37℃で1時間反応させた。該反応液をアガロースゲル電気泳動にて分画し、約3.66kbのKpnI-HindIII断片を約1μg回収した。
次に、配列番号20、21に記載の塩基配列を有する合成DNAを自動DNA合成機（380A、アプライド バイオシステムズ社製）を用いて合成した。得られた合成DNAの0.3μgずつを15μlの滅菌水に加え、65℃で5分間加熱した。該反応液を室温にて30分間放置した後、10倍緩衝液［500mMトリス-塩酸（pH7.6）、100mM塩化マグネシウム、50mMDTT］2μlと10mMATP 2μlを加え、更に10単位のT4ポリヌクレオチドキナーゼ（宝酒造社製）を加えて37℃で30分間反応させ、5'末端をリン酸化した。上記で得られたプラスミドpBSMoSal由来のKpnI-HindIII断片（3.66kb）0.1μgとリン酸化合成DNA0.05μgを全量20μlの滅菌水に加え、Ready-To-Go T4 DNA Ligase（ファルマシア バイオテク社製）を用いて連結した。このようにして得られた組換えプラスミドDNA溶液を用いて大腸菌HB101株を形質転換し、第31図に示したプラスミドpBSMoSalSを得た。得られたプラスミドの10μgを用い、AutoRead Sequencing Kit（ファルマシア バイオテク社製）に添付の処方に従って反応後、A.L.F.DNA Sequencer（ファルマシア バイオテク社製）により電気泳動し、塩基配列を決定した結果、目的の合成DNAが導入されたことを確認した。
次に、特開平5-304989に記載のプラスミドpChiIgHB2の10μgを50mMトリス-塩酸（pH7.5）、100mM塩化ナトリウム、10mM塩化マグネシウムおよび1mMDTTからなる緩衝液10μlに溶解し、更に10単位の制限酵素Eco52I（東洋紡績社製）を加えて37℃で1時間反応させた。該反応液をエタノール沈殿し、30mM酢酸ナトリウム（pH5.0）、100mM塩化ナトリウム、1mM酢酸亜鉛および10%グリセロールからなる緩衝液10μlに溶解し、更に10単位のマングビーンヌクレアーゼ（宝酒造社製）を加えて37℃で10分間反応させた。該反応液をフェノール-クロロホルム抽出後、エタノール沈殿を行ない、DNA Blunting Kit（宝酒造社製）を用い、突出末端を平滑末端に変えた。エタノール沈殿後、10mMトリス-塩酸（pH7.5）、10mM塩化マグネシウムおよび1mMDTTからなる緩衝液10μlに溶解し、更に10単位の制限酵素ApaI（宝酒造社製）を加えて37℃で1時間反応させた。該反応液をアガロースゲル電気泳動にて分画し、約0.99kbのApaI-平滑末端断片を約0.7μg回収した。
次に、プラスミドpBluescript SK（-）（ストラタジーン社製）の3μgを10mMトリス-塩酸（pH7.5）、10mM塩化マグネシウムおよび1mMDTTからなる緩衝液10μlに加え、更に10単位の制限酵素ApaI（宝酒造社製）を加えて37℃で1時間反応させた。該反応液をエタノール沈殿し、33mMトリス-酢酸（pH7.9）、10mM酢酸マグネシウム、66mM酢酸カリウム、0.5mMDTTおよび100μg/mlBSAからなる緩衝液10μlに加え、更に10単位の制限酵素SmaI（宝酒造社製）を加えて30℃で1時間反応させた。該反応液をアガロースゲル電気泳動にて分画し、約3.0kbのApaI-SmaI断片を約1μg回収した。
次に、上記で得られたpChiIgHB2のApaI-平滑末端断片0.1μgとpBluescript SK（-）のApaI-SmaI断片0.1μgを全量20μlの滅菌水に加え、Ready-To-Go T4 DNA Ligase（ファルマシア バイオテク社製）を用いて連結した。このようにして得られた組換えプラスミドDNA溶液を用いて大腸菌HB101株を形質転換し、第32図に示したプラスミドpBShCγ1を得た。
次に、上記で得られたプラスミドpBShCγ1の5μgを10μlの10mMトリス-塩酸（pH7.5）、10mM塩化マグネシウムおよび1mMDTTからなる緩衝液に溶解し、更に10単位の制限酵素ApaI（宝酒造社製）を加えて37℃で1時間反応させた。該反応液をエタノール沈殿し、10mMトリス-塩酸（pH7.5）、50mM塩化ナトリウム、10mM塩化マグネシウムおよび1mMDTTからなる緩衝液10μlに溶解し、更に10単位の制限酵素SpeI（宝酒造社製）を加えて37℃で1時間反応させた。該反応液をアガロースゲル電気泳動にて分画し、約1.0kbのApaI-SpeI断片を約1μg回収した。
次に、上記で得られたプラスミドpBSMoSalSの3μgを10mMトリス-塩酸（pH7.5）、10mM塩化マグネシウムおよび1mMDTTからなる緩衝液10μlに溶解し、更に10単位の制限酵素ApaI（宝酒造社製）を加えて37℃で1時間反応させた。該反応液をエタノール沈殿し、10mMトリス-塩酸（pH7.5）、50mM塩化ナトリウム、10mM塩化マグネシウムおよび1mMDTTからなる緩衝液10μlに溶解し、更に10単位の制限酵素SpeI（宝酒造社製）を加えて37℃で1時間反応させた。該反応液をアガロースゲル電気泳動にて分画し、約3.66kbのApaI-SpeI断片を約1μg回収した。
次に、上記で得られたpBShCγ1のApaI-SpeI断片0.1μgとpBSMoSalSのApaI-SpeI断片0.1μgを全量20μlの滅菌水に加え、Ready-To-Go T4 DNA Ligase（ファルマシア バイオテク社製）を用いて連結した。このようにして得られた組換えプラスミドDNA溶液を用いて大腸菌HB101株を形質転換し、第33図に示したプラスミドpMohCγ1を得た。
（６）タンデムカセット型のヒト化抗体発現用ベクターpKANTEX93の構築
実施例２の1（1）〜（5）で得られた各種プラスミドを用いてタンデムカセット型のヒト化抗体発現用ベクターpKANTEX93を以下のようにして構築した。
実施例２の1（1）で得られたプラスミドpBSH-SAEEの3μgを10mMトリス-塩酸（pH7.5）、50mM塩化ナトリウム、10mM塩化マグネシウムおよび1mMDTTからなる緩衝液10μlに加え、更に10単位の制限酵素HindIII（宝酒造社製）を加えて37℃で1時間反応させた。該反応液をエタノール沈殿し、50mMトリス-塩酸（pH7.5）、100mM塩化ナトリウム、10mM塩化マグネシウムおよび1mMDTTからなる緩衝液10μlに溶解し、更に10単位の制限酵素SalI（宝酒造社製）を加えて37℃で1時間反応させた。該反応液をアガロースゲル電気泳動にて分画し、約5.42kbのHindIII-SalI断片を約1μg回収した。
次に、実施例２の1（1）で得られたプラスミドpBSK-HAEEの5μgを10mMトリス-塩酸（pH7.5）、10mM塩化マグネシウムおよび1mMDTTからなる緩衝液10μlに加え、更に10単位の制限酵素KpnI（宝酒造社製）を加えて37℃で1時間反応させた。該反応液をエタノール沈殿し、10mMトリス-塩酸（pH7.5）、50mM塩化ナトリウム、10mM塩化マグネシウムおよび1mMDTTからなる緩衝液10μlに溶解し、更に10単位の制限酵素HindIII（宝酒造社製）を加えて37℃で1時間反応させた。該反応液をアガロースゲル電気泳動にて分画し、ラビットβ-グロビン遺伝子スプライシング、ポリAシグナル、SV40初期遺伝子ポリAシグナルおよびSV40初期遺伝子プロモーターを含む約1.98kbのKpnI-HindIII断片を約0.8μg回収した。
次に、実施例２の1（5）で得られたプラスミドpMohCγ1の5μgを10mMトリス-塩酸（pH7.5）、10mM塩化マグネシウムおよび1mMDTTからなる緩衝液10μlに加え、更に10単位の制限酵素KpnI（宝酒造社製）を加えて37℃で1時間反応させた。該反応液をエタノール沈殿し、10μlの50mMトリス-塩酸（pH7.5）、100mM塩化ナトリウム、10mM塩化マグネシウムおよび1mMDTTからなる緩衝液に溶解し、更に10単位の制限酵素SalI（宝酒造社製）を加えて37℃で1時間反応させた。該反応液をアガロースゲル電気泳動にて分画し、ヒト化抗体H鎖発現ユニットを含む約1.66kbのKpnI-SalI断片を約0.8μg回収した。
次に、上記で得られたpBSH-SAEEのHindIII-SalI断片0.1μg、pBSK-HAEEのKpnI-HindIII断片0.1μgおよびpMohCγ1のKpnI-SalI断片0.1μgを全量20μlの滅菌水に加え、Ready-To-Go T4 DNA Ligase（ファルマシア バイオテク社製）を用いて連結した。このようにして得られた組換えプラスミドDNA溶液を用いて大腸菌HB101株を形質転換し、第34図に示したプラスミドpMoγ1SPを得た。
次に、上記で得られたプラスミドpMoγ1SPの3μgを50mMトリス-塩酸（pH7.5）、100mM塩化ナトリウム、10mM塩化マグネシウムおよび1mMDTTからなる緩衝液10μlに加え、更に10単位の制限酵素SalI（宝酒造社製）および制限酵素XhoIを加えて37℃で1時間反応させた。該反応液をアガロースゲル電気泳動にて分画し、約9.06kbのSalI-XhoI断片を約1μg回収した。
次に、実施例２の1（2）で得られたプラスミドpBSK-HAEESalの5μgを10mMトリス-塩酸（pH7.5）、10mM塩化マグネシウムおよび1mMDTTからなる緩衝液10μlに加え、更に10単位の制限酵素KpnI（宝酒造社製）を加えて37℃で1時間反応させた。該反応液をエタノール沈殿し、50mMトリス-塩酸（pH7.5）、100mM塩化ナトリウム、10mM塩化マグネシウムおよび1mMDTTからなる緩衝液10μlに溶解し、更に10単位の制限酵素SalI（宝酒造社製）を加えて37℃で1時間反応させた。該反応液をアガロースゲル電気泳動にて分画し、ラビットβ-グロビン遺伝子スプライシング、ポリAシグナルおよびSV40初期遺伝子ポリAシグナルを含む約1.37kbのKpnI-SalI断片を約0.7μg回収した。
次に、実施例２の1（4）で得られたプラスミドpMohCκの5μgを10mMトリス-塩酸（pH7.5）、10mM塩化マグネシウムおよび1mMDTTからなる緩衝液10μlに加え、更に10単位の制限酵素KpnI（宝酒造社製）を加えて37℃で1時間反応させた。該反応液をエタノール沈殿し、50mMトリス-塩酸（pH7.5）、100mM塩化ナトリウム、10mM塩化マグネシウムおよび1mMDTTからなる緩衝液10μlに溶解し、更に10単位の制限酵素XhoI（宝酒造社製）を加えて37℃で1時間反応させた。該反応液をアガロースゲル電気泳動にて分画し、ヒト化抗体L鎖発現ユニットを含む約1.06kbのKpnI-XhoI断片を約0.7μg回収した。
次に、上記で得られたpMoγ1SPのSalI-XhoI断片0.1μg、pBSK-HAEESalのKpnI-SalI断片0.1μgおよびpMohCκのKpnI-XhoI断片0.1μgを全量20μlの滅菌水に加え、Ready-To-Go T4 DNA Ligase（ファルマシア バイオテク社製）を用いて連結した。このようにして得られた組換えプラスミドDNA溶液を用いて大腸菌HB101株を形質転換し、第35図に示したプラスミドpMoκγ1SPを得た。
次に、上記で得られたプラスミドpMoκγ1SPの3μgを50mMトリス-塩酸（pH7.5）、100mM塩化ナトリウム、10mM塩化マグネシウムおよび1mMDTTからなる緩衝液10μlに溶解し、更に10単位の制限酵素XhoI（宝酒造社製）を加えて37℃で1時間反応させた。該反応液をエタノール沈殿し、10mMトリス-塩酸（pH7.5）、10mM塩化マグネシウムおよび1mMDTTからなる緩衝液10μlに加え、更に10単位の制限酵素SacII（東洋紡績社製）を加えて37℃で10分間反応させ、部分消化した。該反応液をアガロースゲル電気泳動にて分画し、約8.49kbのSacII-XhoI断片を約0.2μg回収した。
次に、実施例２の1（3）で得られたプラスミドpBSX-SAの3μgを10mMトリス-塩酸（pH7.5）、10mM塩化マグネシウムおよび1mMDTTからなる緩衝液10μlに加え、更に10単位の制限酵素SacII（東洋紡績社製）を加えて37℃で1時間反応させた。該反応液をエタノール沈殿し、50mMトリス-塩酸（pH7.5）、100mM塩化ナトリウム、10mM塩化マグネシウムおよび1mMDTTからなる緩衝液10μlに溶解し、更に10単位の制限酵素XhoI（宝酒造社製）を加えて37℃で1時間反応させた。該反応液をアガロースゲル電気泳動にて分画し、約4.25kbのSacII-XhoI断片を約1μg回収した。
次に、上記で得られたpMoκγ1SPのSacII-XhoI断片0.1μgとpBSX-SAのSacII-XhoI断片0.1μgを全量20μlの滅菌水に加え、Ready-To-Go T4 DNA Ligase（ファルマシア バイオテク社製）を用いて連結した。このようにして得られた組換えプラスミドDNA溶液を用いて大腸菌HB101株を形質転換し、第36図に示したプラスミドpKANTEX93を得た。
２．抗ヒトIL-5Rα鎖モノクローナル抗体をコードするcDNAの単離、解析
（１）抗ヒトIL-5Rα鎖モノクローナル抗体生産ハイブリドーマからのmRNAの取得
インビトロジェン社製のmRNA抽出キットであるFast Trackを用い、キットに添付の使用説明書に従って、マウス抗ヒトIL-5Rα鎖モノクローナル抗体KM1257、KM1259およびKM1486生産ハイブリドーマ（それぞれFERM BP-5133、FERM BP-5134、FERM BP-5651）の各１×108細胞より、それぞれmRNAを取得した。
（２）マウス抗ヒトIL-5Rα鎖モノクローナル抗体生産ハイブリドーマのH鎖およびL鎖cDNAライブラリーの作製
実施例２の2（1）で取得したKM1257、KM1259およびKM1486のmRNAの各５μgから、cDNA Synthesis Kit（ファルマシア バイオテク社製）を用い、キットに添付の使用説明書に従って、両端にEcoRIアダプターを有するcDNAをそれぞれ合成した。作製したそれぞれのcDNAの約６μgを10μlの滅菌水に溶解後、アガロースゲル電気泳動にて分画し、IgG型抗体のH鎖に対応する約1.5kbのcDNA断片とL鎖に対応する約1.0kbのcDNA断片をそれぞれ約0.1μg回収した。次に、それぞれの約1.5kbのcDNA断片0.1μgおよび約1.0kbのcDNA断片0.1μgと、Lambda ZAPIIベクター［Lambda ZAPIIベクターをEcoR Iで切断後、ウシ腸アルカリフォスファターゼ（Calf Intestine Alkaline Phosphatase）で処理したもの：ストラタジーン社製］1μgをT4リガーゼ緩衝液11.5μlに溶解し、T4 DNAリガーゼ175単位を加えて、12℃にて24時間インキュベートし、さらに室温にて２時間インキュベートした。それぞれの反応液のうち４μlを常法［モレキュラー・クローニング（Molecular Cloning）、2.95、Cold Spring Harbor Laboratory,1989］に従い、ギガパックゴールド（ストラタジーン社製）を使用してラムダファージにパッケージングし、これらを常法［モレキュラー・クローニング（Molecular Cloning）、2.95-107、Cold Spring Harbor Laboratory,1989］に従って、ギガパックゴールドに付属の大腸菌株XL1-Blue［バイオテクニクス（Biotechniques）,5,376（1987）］に感染させて、KM1257、KM1259およびKM1486のH鎖cDNAライブラリーおよびL鎖cDNAライブラリーとしてそれぞれ約４千個のファージクローンを取得した。
（３）抗ヒトIL-5Rα鎖モノクローナル抗体生産ハイブリドーマのH鎖およびL鎖をコードするcDNAのクローニング
実施例２の2（2）で作製したそれぞれのファージを常法に従い、ニトロセルロースフィルター上に固定した［モレキュラー・クローニング（Molecular Cloning）、2.12、Cold Spring Harbor Laboratory,1989］。各ニトロセルロースフィルターを用いてECLダイレクト・ヌクレイック・アシッド・ラベリング・アンド・ディテクション・システムズ（direct nucleic acid labelling and detection systems）（アマシャム社製）に添付の使用説明書に従い、マウス免疫グロブリンのC領域をコードするcDNA｛H鎖はマウスCγ1cDNAの断片［セル（Cell）,18,559（1979）］、L鎖はマウスCκcDNAの断片［セル（Cell）,22,197（1980）］｝をプローブとしてそれと強く結合したファージクローンを取得した。次に、Lambda ZAPIIベクター（ストラタジーン社製）に添付の使用説明書に従い、ファージクローンをプラスミドpBluescriptSK（-）に変換し、最終的にKM1257のH鎖をコードするcDNAを含む組換えプラスミドpKM1257HおよびKM1257のL鎖をコードするcDNAを含む組換えプラスミドpKM1257L、KM1259のH鎖をコードするcDNA含む組換えプラスミドpKM1259HおよびKM1259のL鎖をコードするcDNAを含む組換えプラスミドpKM1259L、KM1486のH鎖をコードするcDNAを含む組換えプラスミドpKM1486HおよびKM1486のL鎖をコードするcDNAを含む組換えプラスミドpKM1486Lを取得した。
（４）抗ヒトIL-5Rα鎖モノクローナル抗体のH鎖およびL鎖をコードするcDNAのV領域の塩基配列の決定
実施例２の2（3）で得られた各マウス抗ヒトIL-5Rα鎖モノクローナル抗体のH鎖およびL鎖をコードするcDNAのV領域の塩基配列を、得られたプラスミドの10μgを用い、AutoRead Sequencing Kit（ファルマシア バイオテク社製）に添付の処方に従って反応後、A.L.F.DNA Sequencer（ファルマシア バイオテク社製）により電気泳動し、決定した。決定したそれぞれのcDNAの塩基配列より、KM1257、KM1259およびKM1486のH鎖およびL鎖のV領域のアミノ酸配列を決定した。配列番号22および配列番号92にKM1257のH鎖、配列番号23および配列番号93にKM1257のL鎖、配列番号24および配列番号94にKM1259のH鎖、配列番号25および配列番号95にKM1259のL鎖、配列番号26および配列番号96にKM1486のH鎖、配列番号27および配列番号97にKM1486のL鎖のそれぞれのV領域の塩基配列およびアミノ酸配列を示す。
（５）抗ヒトIL-5Rα鎖モノクローナル抗体のH鎖およびL鎖のCDR配列の同定
実施例２の2（4）で決定した各マウス抗ヒトIL-5Rα鎖モノクローナル抗体のH鎖およびL鎖のV領域のアミノ酸配列より、それぞれのH鎖およびL鎖のCDR配列を既知の抗体のV領域のアミノ酸配列［シーケンシズ・オブ・プロテインズ・オブ・イムノロジカル・インタレスト（Sequences of Proteins of Immunological Interest）,US Dept.Health and Human Services,1991］と比較することによって同定した。配列番号28、29および30にKM1257のH鎖のCDR1、2および3、配列番号31、32および33にKM1257のL鎖のCDR1、2および3、配列番号34、35および36にKM1259のH鎖のCDR1、2および3、配列番号37、38および39にKM1259のL鎖のCDR1、2および3、配列番号40、41および42にKM1486のH鎖のCDR1、2および3、ならびに配列番号43、44および45にKM1486のL鎖のCDR1、2および3のそれぞれのアミノ酸配列を示す。
３．抗ヒトIL-5Rα鎖ヒト型キメラ抗体の製造
ヒトIL-5の生物活性を阻害する活性を有する抗ヒトIL-5Rα鎖モノクローナル抗体KM1259に由来する抗ヒトIL-5Rα鎖ヒト型キメラ抗体を以下のようにして製造した。
（１）抗ヒトIL-5Rα鎖ヒト型キメラ抗体の発現ベクターpKANTEX1259の構築
実施例２の1で構築したヒト化抗体発現用ベクターpKANTEX93および実施例２の2で得られたプラスミドpKM1259HおよびpKM1259Lを用いた抗ヒトIL-5Rα鎖ヒト型キメラ抗体の発現ベクターpKANTEX1259を以下のようにして構築した。
ヒト化抗体発現用ベクターpKANTEX93の3μgを10mMトリス-塩酸（pH7.5）、10mM塩化マグネシウムおよび1mMDTTからなる緩衝液10μlに加え、更に10単位の制限酵素ApaI（宝酒造社製）を加えて37℃で1時間反応させた。該反応液をエタノール沈殿し、50mMトリス-塩酸（pH7.5）、100mM塩化ナトリウム、10mM塩化マグネシウム、1mMDTT、100μg/mlBSAおよび0.01%トライトンX-100からなる緩衝液10μlに加え、更に10単位の制限酵素NotI（宝酒造社製）を加えて37℃で1時間反応させた。該反応液をアガロースゲル電気泳動にて分画し、約12.75kbのApaI-NotI断片を約1μg回収した。次に、プラスミドpKM1259Hの5μgを10mMトリス-塩酸（pH7.5）、10mM塩化マグネシウムおよび1mMDTTからなる緩衝液10μlに加え、更に10単位の制限酵素BanI（東洋紡績社製）を加えて37℃で1時間反応させた。該反応液をエタノール沈殿し、50mMトリス-塩酸（pH7.5）、100mM塩化ナトリウム、10mM塩化マグネシウム、1mMDTT、100μg/mlBSAおよび0.01%トライトンX-100からなる緩衝液10μlに加え、更に10単位の制限酵素NotI（宝酒造社製）を加えて37℃で1時間反応させた。該反応液をアガロースゲル電気泳動にて分画し、約0.41kbのBanI-NotI断片を約0.5μg回収した。
次に、配列番号46、47に記載の塩基配列を有する合成DNAを自動DNA合成機（380A、アプライド バイオシステムズ社製）を用いて合成した。得られた合成DNAの0.3μgずつを15μlの滅菌水に加え、65℃で5分間加熱した。該反応液を室温にて30分間放置した後、10倍緩衝液［500mMトリス-塩酸（pH7.6）、100mM塩化マグネシウム、50mMDTT］2μlと10mM ATP 2μlを加え、更に10単位のT4ポリヌクレオチドキナーゼを加えて37℃で30分間反応させ、5'末端をリン酸化した。
上記で得られたヒト化抗体発現用ベクターpKANTEX93由来のApaI-NotI断片0.1μgとプラスミドpKM1259H由来のBanI-NotI断片0.1μgとリン酸化合成DNA0.05μgを全量20μlの滅菌水に加え、Ready-To-Go T4 DNA Ligase（ファルマシア バイオテク社製）を用いて連結した。このようにして得られた組換えプラスミドDNA溶液を用いて大腸菌HB101株を形質転換し、第37図に示したプラスミドpKANTEX1259Hを得た。
次に、得られたプラスミドpKANTEX1259Hの3μgを50mMトリス-塩酸（pH7.5）、100mM塩化ナトリウム、10mM塩化マグネシウム、1mMDTTおよび100μg/mlBSAからなる緩衝液10μlに加え、更に10単位の制限酵素EcoRI（宝酒造社製）および制限酵素SplI（宝酒造社製）を加えて37℃で1時間反応させた。該反応液をアガロースゲル電気泳動にて分画し、約13.20kbのEcoRI-SplI断片を約1μg回収した。
次に、プラスミドpKM1259Lの5μgを10mMトリス-塩酸（pH7.5）、50mM塩化ナトリウム、10mM塩化マグネシウム、1mMDTTからなる緩衝液10μlに加え、更に10単位の制限酵素AvaII（宝酒造社製）を加えて37℃で1時間反応させた。該反応液をエタノール沈殿し、50mMトリス-塩酸（pH7.5）、100mM塩化ナトリウム、10mM塩化マグネシウム、1mMDTTからなる緩衝液10μlに加え、更に10単位の制限酵素EcoRI（宝酒造社製）を加えて37℃で1時間反応させた。該反応液をアガロースゲル電気泳動にて分画し、約0.38kbのAvaII-EcoRI断片を約0.5μg回収した。
次に、配列番号48、49に記載の塩基配列を有する合成DNAを自動DNA合成機（380A、アプライド バイオシステムズ社製）を用いて合成した。得られた合成DNAの0.3μgずつを15μlの滅菌水に加え、65℃で5分間加熱した。該反応液を室温にて30分間放置した後、10倍緩衝液［500mMトリス-塩酸（pH7.6）、100mM塩化マグネシウム、50mMDTT］2μlと10mM ATP 2μlを加え、更に10単位のT4ポリヌクレオチドキナーゼを加えて37℃で30分間反応させ、5'末端をリン酸化した。
上記で得られたプラスミドpKANTEX1259H由来のEcoRI-SplI断片0.1μg、プラスミドpKM1259L由来のAvaII-EcoRI断片0.1μgおよびリン酸化合成DNA0.05μgを全量20μlの滅菌水に加え、Ready-To-Go T4 DNA Ligase（ファルマシア バイオテク社製）を用いて連結した。このようにして得られた組換えプラスミドDNA溶液を用いて大腸菌HB101株を形質転換し、第38図に示したプラスミドpKANTEX1259を得た。
（２）pKANTEX1259を用いた抗ヒトIL-5Rα鎖ヒト型キメラ抗体のラットミエローマYB2/0細胞（ATCC CRL1581）での発現
YB2/0細胞への抗ヒトIL-5Rα鎖ヒト型キメラ抗体発現ベクターpKANTEX1259の導入は宮地らの方法に従い、エレクトロポレーション法［サイトテクノロジー（Cytotechnology）,3,133,（1990）］にて行った。
実施例２の3（1）で得られたpKANTEX1259の4μgを4×106個のYB2/0細胞へ導入後、RPMI1640-FCS（10）を96ウエルマイクロタイタープレートに200μl／ウェルずつ分注した。5%CO2インキュベーター内で37℃、24時間培養後、ジェネティシン（以下、G418と称す、ギブコ社製）を0.5mg/mlになるように添加してさらに1〜2週間培養した。G418耐性を有する形質転換株のコロニーが出現し、コンフルエントになったウエルより培養上清を回収し、上清中の抗ヒトIL-5Rα鎖ヒト型キメラ抗体の活性を以下に示すELISA法1あるいはELISA法2により測定した。
ELISA法1
実施例1の1（10）の昆虫細胞培養上清より得られたshIL-5Rα-FcをPBSで5μg/mlの濃度、あるいはさらに希釈した溶液を調整し、96ウエルのEIA用プレート（グライナー社製）に50μl/ウェルで分注し、4℃で一晩放置して吸着させた。洗浄後、1％牛血清アルブミン（BSA）を含むPBS（1%BSA-PBS）を100μl/ウェル加え、室温で1時間反応させて残っている活性基をブロックした。1%BSA-PBSを捨て、形質転換株の培養上清あるいは精製した40μg/mlの各種抗ヒトIL-5Rα抗体を25μl／ウェル、さらに実施例１の３で調製した0.4μg/mlのビオチン標識ヒトIL-5を25μl／ウェル分注し、室温で4時間反応させた。0.05%Tween-PBSで洗浄後、1%BSA-PBSにて4000倍に希釈したペルオキシダーゼ標識アビジンD（ニチレイ社製）を50μl/ウェルで加えて室温で1時間反応させ、0.05%Tween-PBSで洗浄後、ABTS基質液［2,2'アジノビス（3-エチルベンゾチアゾリン-6-スルホン酸）二アンモニウムの550mgを0.1Mクエン酸緩衝液（pH4.2）1Lに溶解し、使用直前に過酸化水素1μl/mlを加えた溶液］を50μl/ウエル加えて発色させ、OD415nmの吸光度を測定した。抗体を加えない場合の吸光度の値を阻害率0％とし、抗体のビオチン化標識IL-5に対する阻害率を次式により算出し、各サンプルを評価した。

Figure 0003946256
ELISA法2
実施例1の1（10）の昆虫細胞培養上清より得られたshIL-5RαをPBSで2μg/mlの濃度、あるいはさらに希釈した溶液を調整し、96ウエルのEIA用プレート（グライナー社製）に50μl/ウェルで分注し、4℃で一晩放置して吸着させた。洗浄後、1％牛血清アルブミン（BSA）を含むPBS（1%BSA-PBS）を100μl/ウェル加え、室温で1時間反応させて残っている活性基をブロックした。1%BSA-PBSを捨て、形質転換株の培養上清、精製した各種の抗ヒトIL-5Rα抗体を50μl/ウェルで分注し、室温で2時間反応させた。0.05%Tween-PBSで洗浄後、1%BSA-PBSにて500倍に希釈したペルオキシダーゼ標識抗ヒトIgG抗体（アメリカン カレックス社製）を50μl/ウェルで加えて室温で1時間反応させ、0.05%Tween-PBSで洗浄後、ABTS基質液［2,2'アジノビス（3-エチルベンゾチアゾリン-6-スルホン酸）二アンモニウムの550mgを0.1Mクエン酸緩衝液（pH4.2）1Lに溶解し、使用直前に過酸化水素1μl/mlを加えた溶液］を50μl/ウエル加えて発色させ、OD415nmの吸光度を測定した。
培養上清中に抗ヒトIL-5Rα鎖ヒト型キメラ抗体の活性が認められた形質転換株について、0.5mg/ml G418、50nM MTX（シグマ社製）を含むRPMI1640-FCS（10）培地に懸濁し、5%CO2インキュベーター内で37℃、1〜2週間培養し、50nM MTX耐性を有する形質転換株を誘導した。形質転換株がウェルにコンフルエントになった時点で培養上清中の抗ヒトIL-5Rα鎖ヒト型キメラ抗体の活性を上記のELISA法により測定した。活性の認められた形質転換株については、上記と同様の培養方法により、さらにMTX濃度を100nM、200nMと上げて行き、0.5mg/ml G418、200nM MTX含むRPMI1640-FCS（10）培地で増殖可能でかつ、抗ヒトIL-5Rα鎖ヒト型キメラ抗体を生産する形質転換株を得た。得られた形質転換株についてはさらに2回の限界希釈法によるクローニングを経て、最終的な抗ヒトIL-5Rα鎖ヒト型キメラ抗体を生産する形質転換株とした。抗ヒトIL-5Rα鎖ヒト型キメラ抗体を生産する形質転換株の例としてはKM1399（FERM BP-5650）があげられ、それが生産する抗ヒトIL-5Rα鎖ヒト型キメラ抗体をKM1399と命名した。形質転換株KM1399はFERM BP-5650として、平成8年９月３日付で、工業技術院微生物工業技術研究所に寄託された。形質転換クローンKM1399の抗ヒトIL-5Rα鎖ヒト型キメラ抗体KM1399の生産性は約5μg/106cells/24hrであった。
（３）抗ヒトIL-5Rα鎖ヒト型キメラ抗体KM1399の培養上清からの精製
実施例２の3（2）で得られた抗ヒトIL-5Rα鎖ヒト型キメラ抗体生産株KM1399を0.5mg/ml G418、200nM MTX含むGIT培地（日本製薬社製）に1〜2×105細胞/mlとなるように懸濁し、175cm2フラスコ（グライナー社製）に200mlずつ分注した。5%CO2インキュベーター内で37℃、5〜7日間培養し、コンフルエントになった時点で培養上清を回収した。該培養上清約1.0LよりプロセップA（バイオプロセシング社製）カラムを用いて精製抗ヒトIL-5Rα鎖ヒト型キメラ抗体KM1399を約3mg取得した。精製抗ヒトIL-5Rα鎖ヒト型キメラ抗体KM1399の約4μgを、公知の方法［ネイチャー（Nature）,227,680（1970〕］に従って電気泳動し、分子量を調べた。その結果を第39図に示す。第39図に示したように、還元条件下では抗体H鎖の分子量は約50キロダルトン、抗体L鎖の分子量は約25キロダルトンであり、正しい分子量のH鎖およびL鎖の発現が確認された。また、非還元条件下では抗ヒトIL-5Rα鎖ヒト型キメラ抗体KM1399の分子量は約140キロダルトンであり、2本のH鎖および2本のL鎖からなる正しい大きさのヒト型キメラ抗体の発現が確認された。また、精製抗ヒトIL-5Rα鎖ヒト型キメラ抗体KM1399のH鎖、L鎖のN末端アミノ酸配列をプロテインシーケンサー（470A、アプライド バイオシステムズ社製）を用いて自動エドマン分解により解析した結果、予想される正しいアミノ酸配列が得られた。
（４）抗ヒトIL-5Rα鎖ヒト型キメラ抗体KM1399のヒトIL-5Rα鎖に対する反応性（ELISA法1）
抗ヒトIL-5Rα鎖マウス抗体KM1259および抗ヒトIL-5Rα鎖ヒト型キメラ抗体KM1399のヒトIL-5Rα鎖に対する反応性を実施例２の3（2）に記載のELISA法1により測定した。その結果を第40図に示す。第40図に示したように、抗ヒトIL-5Rα鎖ヒト型キメラ抗体KM1399は抗ヒトIL-5Rα鎖マウス抗体KM1259と同等の強いヒトIL-5Rα鎖に対する反応性を有していることが示された。
４．COS-7細胞（ATCC CRL1651）を用いた抗ヒトIL-5Rα鎖ヒト型キメラ抗体の一過性発現
下記で述べる抗ヒトIL-5Rα鎖ヒト型CDR移植抗体抗の各種バージョンの活性評価をより迅速に行なうために、pKANTEX1259およびその改変ベクターを用いてCOS-7細胞における抗ヒトIL-5Rα鎖ヒト型キメラ抗体の一過性発現をリポフェクトアミン法を用いて以下のようにして行なった。
（1）pKANTEX1259の改変ベクターの構築
動物細胞における一過性発現の効率は導入された発現ベクターのコピー数に依存していることから、大きさのより小さい発現ベクターの方が発現効率がよいことが考えられた。そこでpKANTEX1259の抗体発現に影響を及ぼさないと考えられる領域を欠失させ、より小さな抗ヒトIL-5Rα鎖ヒト型キメラ抗体発現ベクター、pT1259を以下のようにして構築した。
プラスミドpKANTEX1259の3μgを10mMトリス-塩酸（pH7.5）、50mM塩化ナトリウム、10mM塩化マグネシウムおよび1mMDTTからなる緩衝液10μlに加え、更に10単位の制限酵素HindIII（宝酒造社製）を加えて37℃で1時間反応させた。該反応液をエタノール沈殿し、50mMトリス-塩酸（pH7.5）、100mM塩化ナトリウム、10mM塩化マグネシウムおよび1mMDTTからなる緩衝液10μlに加え、更に10単位の制限酵素MluI（宝酒造社製）を加えて37℃で1時間反応させた。該反応液をエタノール沈殿し、DNA Blunting Kit（宝酒造社製）を用い、制限酵素消化によって生じた5'突出末端を平滑末端に変えた。該反応液をアガロースゲル電気泳動にて分画し、約9.60kbのDNA断片を約1μg回収した。回収したDNA断片0.1μgを全量20μlの滅菌水に加え、Ready-To-Go T4 DNA Ligase（ファルマシア バイオテク）を用いて連結した。このようにして得られた組換えプラスミドDNA溶液を用いて大腸菌HB101株を形質転換し、第41図に示したプラスミドpT1259を得た。
（2）pT1259を用いた抗ヒトIL-5Rα鎖ヒト型キメラ抗体の一過性発現
1×105細胞/mlのCOS-7細胞をで6ウエルプレート（ファルコン社製）に2ml/ウェルずつ分注し、37℃で一晩培養した。100μlのOPTI-MEM培地（ギブコ社製）にpT1259の2μgを加え、更に100μlのOPTI-MEM培地（ギブコ社製）に10μlのリポフェクトアミン・リエージェント（LIPOFECTAMINE Reagent,ギブコ社製）を添加した溶液を加え、室温で40分間反応させ、DNA-リポソームの複合体を形成させた。前記したCOS-7細胞を2mlのOPTI-MEM培地（ギブコ社製）で2回洗浄後、DNA-リポソームの複合体を含む溶液を添加し、37℃で7時間培養後、溶液を除去し、10%のFCSを含むDMEM培地（ギブコ社製）を2ml添加し、37℃で培養した。培養後、72時間の時点で培養上清を回収し、培養上清中の抗ヒトIL-5Rα鎖ヒト型キメラ抗体の活性評価を実施例２の3（2）に記載のELISA法1で行なった。その結果を第42図に示す。第42図に示したようにpT1259を導入したCOS-7細胞の培養上清中に濃度依存的な活性が見られ、抗ヒトIL-5Rα鎖ヒト型キメラ抗体の発現が確認された。以上の結果より、pKANTEX93の大きさを小さくしたベクターを作製し、COS-7細胞に導入することで一過性発現系で各種発現ベクター由来のヒト化抗体の活性評価を行うことが可能であることが示された。また、後述する各種抗ヒトIL-5Rα鎖ヒト型CDR移植抗体の活性を正確に比較するために、下記４（3）に記載のELISA法により一過性発現培養上清中の抗体濃度を測定した。
（3）ELISA法による一過性発現培養上清中のヒト化抗体濃度の測定
96ウエルマイクロタイタープレートにヤギ抗ヒトIgG（γ-chain）抗体（医学生物学研究所製）をPBSにて400倍希釈した溶液を50μl／ウェルずつ分注し、4℃にて一晩反応させた。抗体溶液を除去後、100μl/ウエルの1%BSA-PBSで37℃、1時間反応させ、残っている活性基をブロックした。1%BSA-PBSを捨て、これに一過性発現培養上清あるいは精製した抗ヒトIL-5Rα鎖ヒト型キメラ抗体KM1399を50μl/ウエル加え、室温で1時間反応させた。反応後、溶液を除去し、0.05%Tween-PBSで洗浄後、ペルオキシダーゼ標識マウス抗ヒトκL鎖抗体（ザイメット社製）を1%BSA-PBSにて500倍希釈した溶液を50μl/ウエル加え、室温で1時間反応させた。0.05%Tween-PBSで洗浄後、ABTS基質液［2,2'アジノビス（3-エチルベンゾチアゾリン-6-スルホン酸）二アンモニウムの550mgを0.1Mクエン酸緩衝液（pH4.2）1Lに溶解し、使用直前に過酸化水素1μl/mlを加えた溶液］を50μl/ウエル加えて発色させ、OD415nmの吸光度を測定した。
5. 抗ヒトIL-5Rα鎖ヒト型CDR移植抗体の製造
ヒトIL-5の生物活性を阻害する活性を有するマウス抗ヒトIL-5Rα鎖モノクローナル抗体KM1259および抗ヒトIL-5Rα鎖ヒト型キメラ抗体KM1399と同等の活性を有する抗ヒトIL-5Rα鎖ヒト型CDR移植抗体を以下のようにして製造した。
（１）既知のヒト抗体VHの共通配列を基礎とする抗ヒトIL-5Rα鎖ヒト型CDR移植抗体のVHをコードするcDNAの構築
カバットらは［シーケンシズ・オブ・プロテインズ・オブ・イムノロジカル・インタレスト（Sequences of Proteins of Immunological Interest）,US Dept.Health and Human Services,1991、以下同様］、既知のさまざまなヒト抗体VHをFRの配列の相同性からサブグループI〜III（HSG I〜III）に分類し、各サブグループ毎に共通配列を同定した。そこで、それら共通配列を基礎として抗ヒトIL-5Rα鎖ヒト型CDR移植抗体VHのアミノ酸配列を設計することとした。まず、基礎とする共通配列を選択するために、マウス抗ヒトIL-5Rα鎖抗体KM1259のVHのFR配列と、各サブグループのヒト抗体VHの共通配列のFR配列との間の相同性を調べた（第１表）。
Figure 0003946256
その結果、サブグループIと最も相同性が高いことが確認され、サブグループIの共通配列を基礎として抗ヒトIL-5Rα鎖ヒト型CDR移植抗体VHのアミノ酸配列を設計し、該アミノ酸配列をコードするcDNAをPCR法を用いて以下のようにして構築した。
配列番号50から55の塩基配列を有する合成DNAを自動DNA合成機（380A、アプライド バイオシステムズ社製）を用いて合成した。合成した各DNAを最終濃度が0.1μMとなるように10mMトリス−塩酸（pH8.3）、50mM塩化カリウム、1.5mM塩化マグネシウム、0.001%ゼラチン、200μM dNTP、0.5μM M13primer RV（宝酒造社製）、0.5μM M13primer M4（宝酒造社製）および2単位のTaKaRa TaqDNAポリメラーゼ（宝酒造社製）よりなる緩衝液50μlに加え、50μlの鉱油で覆い、DNAサーマルサイクラー（PJ480、パーキン エルマー社製）にセットし、94℃にて2分間、55℃にて2分間、72℃にて2分間のサイクルを30サイクル行なった。該反応液をエタノール沈殿し、20μlのTE緩衝液に溶解後、アガロースゲル電気泳動にて分画し、約0.48kbの増幅断片を約0.2μg回収した。
次に、プラスミドpBluescript SK（-）（ストラタジーン社製）の3μgを33mMトリス-酢酸（pH7.9）、10mM酢酸マグネシウム、66mM酢酸カリウム、0.5mMDTTおよび100μg/mlBSAからなる緩衝液10μlに加え、更に10単位の制限酵素SmaI（宝酒造社製）を加えて30℃で1時間反応させた。該反応液をエタノール沈殿し、50mMトリス-塩酸（pH9.0）、1mM塩化マグネシウムからなる緩衝液20μlに溶解し、更に1単位のアルカリフォスファターゼ（E.coli C75、宝酒造社製）を加えて37℃で1時間反応させ、5'末端を脱リン酸化した。更に該反応液をフェノール-クロロホルム抽出後、エタノール沈殿を行ない、20μlのTE緩衝液に溶解した。
次に、上記で得られたPCR後の増幅断片0.1μgとpBluescript SK（-）のSmaI断片0.1μg相当を全量20μlの滅菌水に加え、Ready-To-Go T4 DNA Ligase（ファルマシア バイオテク社製）を用いて連結した。このようにして得られた組換えプラスミドDNA溶液を用いて大腸菌HB101株を形質転換した。形質転換株の10個のクローンより各プラスミドDNAを調製し、塩基配列の決定を行なった結果、目的の抗ヒトIL-5Rα鎖ヒト型CDR移植抗体VHのアミノ酸配列をコードするcDNAを含む第43図に示したプラスミドphKM1259HV0を得た。phKM1259HV0に含まれる抗ヒトIL-5Rα鎖ヒト型CDR移植抗体VH（以下HV.0と表記）の塩基配列およびアミノ酸配列を配列番号98に示した。
（２）既知のヒト抗体VLの共通配列を基礎とする抗ヒトIL-5Rα鎖ヒト型CDR移植抗体のVLをコードするcDNAの構築
カバットらは、既知のさまざまなヒト抗体VLをそのFRの配列の相同性からサブグループI〜IV（HSG I〜IV）に分類し、各サブグループ毎に共通配列を同定した。そこで、それら共通配列を基礎として抗ヒトIL-5Rα鎖ヒト型CDR移植抗体VLのアミノ酸配列を設計することとした。まず、基礎とする共通配列を選択するために、マウス抗ヒトIL-5Rα鎖抗体KM1259のVLのFR配列と、各サブグループのヒト抗体VLの共通配列のFR配列との間の相同性を調べた（第２表）。
Figure 0003946256
その結果、サブグループIと最も相同性が高いことが確認され、サブグループIの共通配列を基礎として抗ヒトIL-5Rα鎖ヒト型CDR移植抗体VLのアミノ酸配列を設計し、該アミノ酸配列をコードするcDNAをPCR法を用いて以下のようにして構築した。
配列番号57から62の塩基配列を有する合成DNAを自動DNA合成機（380A、アプライド バイオシステムズ社製）を用いて合成した。合成した各DNAを最終濃度が0.1μMとなるように10mMトリス-塩酸（pH8.3）、50mM塩化カリウム、1.5mM塩化マグネシウム、0.001%ゼラチン、200μM dNTP、0.5μM M13primer RV（宝酒造社製）、0.5μM M13primer M4（宝酒造社製）および2単位のTaKaRa TaqDNAポリメラーゼ（宝酒造社製）よりなる緩衝液50μlに加え、50μlの鉱油で覆い、DNAサーマルサイクラー（PJ480、パーキン エルマー社製）にセットし、94℃にて2分間、55℃にて2分間、72℃にて2分間のサイクルを30サイクル行なった。該反応液をエタノール沈殿し、20μlのTE緩衝液に溶解後、アガロースゲル電気泳動にて分画し、約0.43kbの増幅断片を約0.2μg回収した。
次に、上記で得られたPCR後の増幅断片0.1μgと実施例２の5（1）で得られたpBluescript SK（-）のSmaI断片0.1μg相当を全量20μlの滅菌水に加え、Ready-To-Go T4 DNA Ligase（ファルマシア バイオテク社製）を用いて連結した。このようにして得られた組換えプラスミドDNA溶液を用いて大腸菌HB101株を形質転換した。形質転換株の10個のクローンより各プラスミドDNAを調製し、塩基配列の決定を行なった結果、目的の抗ヒトIL-5Rα鎖ヒト型CDR移植抗体VLのアミノ酸配列をコードするcDNAを含む第44図に示したプラスミドphKM1259LV0を得た。phKM1259LV0に含まれる抗ヒトIL-5Rα鎖ヒト型CDR移植抗体VL（以下LV.0と表記）の塩基配列およびアミノ酸配列を配列番号99に示した。
（３）既知のヒト抗体V領域の共通配列を基礎とした抗ヒトIL-5Rα鎖ヒト型CDR移植抗体の発現ベクターpKANTEX1259HV0LV0の構築
実施例２の1で構築したヒト化抗体発現用ベクターpKANTEX93、実施例２の5（1）で得られたプラスミドphKM1259HV0および実施例２の5（2）で得られたプラスミドphKM1259LV0を用いて抗ヒトIL-5Rα鎖ヒト型CDR移植抗体の発現ベクターpKANTEX1259HV0LV0を以下のようにして構築した。
プラスミドpKMh1259HV0の5μgを10mMトリス-塩酸（pH7.5）、10mM塩化マグネシウムおよび1mMDTTからなる緩衝液10μlに加え、更に10単位の制限酵素ApaI（宝酒造社製）を加えて37℃で1時間反応させた。該反応液をエタノール沈殿し、50mMトリス-塩酸（pH7.5）、100mM塩化ナトリウム、10mM塩化マグネシウム、1mMDTT、100μg/mlBSAおよび0.01%トライトンX-100からなる緩衝液10μlに加え、更に10単位の制限酵素NotI（宝酒造社製）を加えて37℃で1時間反応させた。該反応液をアガロースゲル電気泳動にて分画し、約0.44kbのApaI-NotI断片を約0.5μg回収した。
次に、実施例２の3（1）で得られたヒト化抗体発現用ベクターpKANTEX93由来のApaI-NotI断片0.1μgと上記で得られたプラスミドphKM1259HV0由来のApaI-NotI断片0.1μgを全量20μlの滅菌水に加え、Ready-To-Go T4 DNA Ligase（ファルマシア バイオテク社製）を用いて連結した。このようにして得られた組換えプラスミドDNA溶液を用いて大腸菌HB101株を形質転換し、第45図に示したプラスミドpKANTEX1259HV0を得た。
次に、得られたプラスミドpKANTEX1259HV0の3μgを50mMトリス-塩酸（pH7.5）、100mM塩化ナトリウム、10mM塩化マグネシウム、1mMDTTおよび100μg/mlBSAからなる緩衝液10μlに加え、更に10単位の制限酵素EcoRI（宝酒造社製）および制限酵素SplI（宝酒造社製）を加えて37℃で1時間反応させた。該反応液をアガロースゲル電気泳動にて分画し、約13.20kbのEcoRI-SplI断片を約1μg回収した。
次に、プラスミドphKM1259LV0の5μgを50mMトリス-塩酸（pH7.5）、100mM塩化ナトリウム、10mM塩化マグネシウム、1mMDTTおよび100μg/mlBSAからなる緩衝液10μlに加え、更に10単位の制限酵素EcoRI（宝酒造社製）および制限酵素SplI（宝酒造社製）を加えて37℃で1時間反応させた。該反応液をアガロースゲル電気泳動にて分画し、約0.39kbのEcoRI-SplI断片を約0.5μg回収した。
上記で得られたプラスミドpKANTEX1259HV0由来のEcoRI-SplI断片0.1μgとプラスミドphKM1259LV0由来のEcoRI-SplI断片0.1μgを全量20μlの滅菌水に加え、Ready-To-Go T4 DNA Ligase（ファルマシア バイオテク社製）を用いて連結した。このようにして得られた組換えプラスミドDNA溶液を用いて大腸菌HB101株を形質転換し、第46図に示したプラスミドpKANTEX1259HV0LV0を得た。
（４）pKANTEX1259HV0LV0を用いた既知のヒト抗体V領域の共通配列を基礎とした抗ヒトIL-5Rα鎖ヒト型CDR移植抗体のラットミエローマYB2/0細胞（ATCC CRL1581）での発現
pKANTEX1259HV0LV0を用いて既知のヒト抗体V領域の共通配列を基礎とした抗ヒトIL-5Rα鎖ヒト型CDR移植抗体のYB2/0細胞での発現を実施例２の3（2）に記載の方法に従って行った。
その結果、既知のヒト抗体V領域の共通配列を基礎とした抗ヒトIL-5Rα鎖ヒト型CDR移植抗体を生産する形質転換株としてはKM8397があげられ、それが生産する抗ヒトIL-5Rα鎖ヒト型CDR移植抗体をKM8397と命名した。形質転換株KM8397の抗ヒトIL-5Rα鎖ヒト型CDR移植抗体KM8397の生産性は約4μg/106cells/24hrであった。
（５）抗ヒトIL-5Rα鎖ヒト型CDR移植抗体KM8397の培養上清からの精製
実施例２の5（4）で得られた抗ヒトIL-5Rα鎖ヒト型CDR移植抗体生産クローンKM8397を実施例２の3（3）に記載の方法に従い培養、精製し、KM8397を約2mg取得した。精製抗ヒトIL-5Rα鎖ヒト型CDR移植抗体KM8397の約4μgを、実施例２の3（3）に記載の方法に従い電気泳動し、分子量を調べた。その結果を第47図に示す。第47図に示したように、還元条件下では抗体H鎖の分子量は約50キロダルトン、抗体L鎖の分子量は約25キロダルトンであり、正しい分子量のH鎖およびL鎖の発現が確認された。また、非還元条件下では抗ヒトIL-5Rα鎖ヒト型CDR移植抗体KM8397の分子量は約140キロダルトンであり、2本のH鎖および2本のL鎖からなる正しい大きさのヒト型CDR移植抗体の発現が確認された。また、精製抗ヒトIL-5Rα鎖CDR移植抗体KM8397のH鎖、L鎖のN末端アミノ酸配列をプロテインシーケンサー（470A、アプライド バイオシステムズ社製）を用いて自動エドマン分解により解析した結果、予想される正しいアミノ酸配列が得られた。
（６）抗ヒトIL-5Rα鎖ヒト型CDR移植抗体KM8397のヒトIL-5Rα鎖に対する反応性（ELISA法2）
抗ヒトIL-5Rα鎖ヒト型キメラ抗体KM1399および抗ヒトIL-5Rα鎖ヒト型CDR移植抗体KM8397のヒトIL-5Rα鎖に対する反応性を実施例２の3（2）に記載のELISA法2により測定した。その結果を第48図に示す。第48図に示したように、抗ヒトIL-5Rα鎖ヒト型CDR移植抗体KM8397は抗ヒトIL-5Rα鎖ヒト型キメラ抗体KM1399に比べ、ヒトIL-5Rα鎖に対して約1/2の反応性を有していることが示された。
６．抗ヒトIL-5Rα鎖ヒト型CDR移植抗体KM8397のV領域のアミノ酸配列の改変による活性の上昇
実施例２の5で製造した抗ヒトIL-5Rα鎖ヒト型CDR移植抗体KM8397のヒトIL-5Rα鎖に対する反応性は抗ヒトIL-5Rα鎖ヒト型キメラ抗体KM1399に比べ、約1/2に低下した。そこで、KM8397のV領域のアミノ酸配列の改変による活性の上昇を以下のような方法で行った。
（１）抗ヒトIL-5Rα鎖ヒト型CDR移植抗体KM8397のVHのアミノ酸配列の改変
配列番号98に示した抗ヒトIL-5Rα鎖ヒト型CDR移植抗体KM8397のVHのアミノ酸を変異させ、各種改変バージョンの抗ヒトIL-5Rα鎖ヒト型CDR移植抗体のVHを作製した。変異させるアミノ酸としては抗ヒトIL-5Rα鎖マウス抗体KM1259のV領域のコンピューター三次元構造モデルを参考にし、かつランダムに選択した。変異の導入方法としては変異導入プライマーを用いて実施例2の5項（1）に記載の方法を行い、目的の抗ヒトIL-5Rα鎖ヒト型CDR移植抗体の改変バージョンのVHをコードするcDNAを含むプラスミドを得た。
実際には、変異導入プライマーとして配列番号64に示した配列を用い、配列番号50、51、52、53、64、55の塩基配列を有する合成DNAを用いて実施例２の5（1）に記載の方法を行うことにより配列番号100に示した抗ヒトIL-5Rα鎖ヒト型CDR移植抗体の改変バージョン1のVH（以下HV.1と表記）をコードするcDNAを含むプラスミドphKM1259HV1を得た。HV.1のアミノ酸配列においてはマウス抗体およびヒト型キメラ抗体で認められたヒトIL-5Rα鎖に対する反応性を保持する目的で、配列番号98にFR中の95位のチロシン、97位のアラニンの各アミノ酸をマウス抗体KM1259H鎖V領域に見いだされるアミノ酸であるロイシン、グリシンにそれぞれ変えている。
また、変異導入プライマーとして配列番号64、66、67に示した配列を用い、配列番号50、51、66、67、64、55の塩基塩列を有する合成DNAを用いて実施例２の5（1）に記載の方法を行うことにより配列番号101に示した抗ヒトIL-5Rα鎖ヒト型CDR移植抗体の改変バージョン2のVH（以下HV.2と表記）をコードするcDNAを含むプラスミドphKM1259HV2を得た。HV.2のアミノ酸配列においてはモノクローナル抗体およびヒト型キメラ抗体で認められたヒトIL-5Rα鎖に対する反応性を保持する目的で、配列番号98にFR中の46位のグルタミン酸、74位のスレオニン、95位のチロシン、97位のアラニンの各アミノ酸をマウス抗体KM1259H鎖V領域に見いだされるアミノ酸であるアラニン、アルギニン、ロイシン、グリシンにそれぞれ変えている。
また、変異導入プライマーとして配列番号69、70、71に示した配列を用い、配列番号50、51、69、70、71、55の塩基配列を有する合成DNAを用いて実施例２の5（1）に記載の方法を行うことにより配列番号102に示した抗ヒトIL-5Rα鎖ヒト型CDR移植抗体の改変バージョン3のVH（以下HV.3と表記）をコードするcDNAを含むプラスミドphKM1259HV3を得た。HV.3のアミノ酸配列においてはマウス抗体およびヒト型キメラ抗体で認められたヒトIL-5Rα鎖に対する反応性を保持する目的で、配列番号98にFR中の40位のアラニン、46位のグルタミン酸、67位のアルギニン、72位のアラニン、74位のスレオニン、79位のアラニン、95位のチロシン、97位のアラニンの各アミノ酸をマウス抗体KM1259H鎖V領域に見いだされるアミノ酸であるアルギニン、アラニン、リジン、セリン、アルギニン、バリン、ロイシン、グリシンにそれぞれ変えている。
結果として、HV.0、HV.1、HV.2、HV.3とバージョンが進むにつれて改変に伴うマウス抗体由来のアミノ酸の数が増加するようになっている。
（２）抗ヒトIL-5Rα鎖ヒト型CDR移植抗体KM8397のVLのアミノ酸配列の改変
配列番号99に示した抗ヒトIL-5Rα鎖ヒト型CDR移植抗体KM8397のVLのアミノ酸を変異させ、各種改変バージョンの抗ヒトIL-5Rα鎖ヒト型CDR移植抗体のVLを作製した。変異させるアミノ酸としては抗ヒトIL-5Rα鎖抗体KM1259のV領域のコンピューター三次元構造モデルを参考にし、かつランダムに選択した。変異の導入方法としては変異導入プライマーを用いて実施例2の5（1）に記載の方法を行い、目的の抗ヒトIL-5Rα鎖ヒト型CDR移植抗体の改変バージョンのVLをコードするcDNAを含むプラスミドを得た。
実際には、変異導入プライマーとして配列番号73、74、75に示した配列を用い、配列番号57、58、73、74、61、75の塩基配列を有する合成DNAを用いて実施例２の5（1）に記載の方法を行うことにより配列番号７６の１〜１０７番目に示した抗ヒトIL-5Rα鎖ヒト型CDR移植抗体の改変バージョン1のVL（以下LV.1と表記）をコードするcDNAを含むプラスミドphKM1259LV1を得た。LV.1のアミノ酸配列においてはモノクローナル抗体およびヒト型キメラ抗体で認められたヒトIL-5Rα鎖に対する反応性を保持する目的で、配列番号99にFR中の37位のグルタミン、45位のリジン、98位のフェニルアラニンの各アミノ酸をモノクローナル抗体KM1259L鎖V領域に見いだされるアミノ酸であるアルギニン、グルタミン酸、バリンにそれぞれ変えている。
また、変異導入プライマーとして配列番号74、75、77、78に示した配列を用い、配列番号57、58、77、74、78、75の塩基配列を有する合成DNAを用いて実施例２の5（1）に記載の方法を行うことにより配列番号103に示した抗ヒトIL-5Rα鎖ヒト型CDR移植抗体の改変バージョン2のVL（以下LV.2と表記）をコードするcDNAを含むプラスミドphKM1259LV2を得た。LV.2のアミノ酸配列においてはモノクローナル抗体およびヒト型キメラ抗体で認められたヒトIL-5Rα鎖に対する反応性を保持する目的で、配列番号99にFR中の22位のスレオニン、37位のグルタミン、45位のリジン、77位のセリン、98位のフェニルアラニンの各アミノ酸をモノクローナル抗体KM1259L鎖V領域に見いだされるアミノ酸であるグリシン、アルギニン、グルタミン酸、アスパラギン酸、バリンにそれぞれ変えている。
また、変異導入プライマーとして配列番号74、80、81、82、83に示した配列を用い、配列番号57、80、81、74、82、83の塩基配列を有する合成DNAを用いて5（1）に記載の方法を行うことにより配列番号105に示した抗ヒトIL-5Rα鎖ヒト型CDR移植抗体の改変バージョン3のVL（以下LV.3と表記）をコードするcDNAを含むプラスミドphKM1259LV3を得た。LV.3のアミノ酸配列においてはモノクローナル抗体およびヒト型キメラ抗体で認められたヒトIL-5Rα鎖に対する反応性を保持する目的で、配列番号99にFR中の7位のセリン、8位のプロリン、22位のスレオニン、37位のグルタミン、38位のグルタミン、45位のリジン、77位のセリン、87位のチロシン、98位のフェニルアラニンの各アミノ酸をモノクローナル抗体KM1259L鎖V領域に見いだされるアミノ酸であるアラニン、スレオニン、グリシン、アルギニン、リジン、グルタミン酸、アスパラギン酸、フェニルアラニン、バリンにそれぞれ変えている。
また、変異導入プライマーとして配列番号80、83、85、86、87に示した配列を用い、配列番号57、80、85、86、87、83の塩基配列を有する合成DNAを用いて実施例２の5（1）に記載の方法を行うことにより配列番号106に示した抗ヒトIL-5Rα鎖ヒト型CDR移植抗体の改変バージョン4のVL（以下LV.4と表記）をコードするcDNAを含むプラスミドphKM1259LV4を得た。LV.4のアミノ酸配列においてはモノクローナル抗体抗体およびヒト型キメラ抗体で認められたヒトIL-5Rα鎖に対する反応性を保持する目的で、配列番号99にFR中の7位のセリン、8位のプロリン、22位のスレオニン、37位のグルタミン、38位のグルタミン、44位のプロリン、45位のリジン、71位のフェニルアラニン、77位のセリン、87位のチロシン、98位のフェニルアラニンの各アミノ酸をマウス抗体KM1259L鎖V領域に見いだされるアミノ酸であるアラニン、スレオニン、グリシン、アルギニン、リジン、バリン、グルタミン酸、チロシン、アスパラギン酸、フェニルアラニン、バリンにそれぞれ変えている。
結果として、LV.0、LV.1、LV.2、LV.3、LV.4とバージョンが進むにつれて改変に伴うモノクローナル抗体由来のアミノ酸の数が増加するようになっている。
（３）各種改変バージョンのV領域を有する抗ヒトIL-5Rα鎖ヒト型CDR移植抗体の製造
実施例２の1で構築したヒト化抗体発現用ベクターpKANTEX93と実施例２の5（1）および（2）で得られた抗ヒトIL-5Rα鎖ヒト型CDR移植抗体の各種改変バージョンのV領域をコードするcDNAを含む各種プラスミドを用いて実施例２の5（3）に記載の方法に従い、各種改変バージョンのV領域を有する抗ヒトIL-5Rα鎖ヒト型CDR移植抗体発現ベクターを構築した。構築した発現ベクターで用いた各種改変バージョンのV領域の組合せおよび発現ベクターの名称を第３表に示す。
Figure 0003946256
上記発現ベクターのうち、pKANTEX1259HV0LV0、pKANTEX1259HV1LV0、pKANTEX1259HV2LV0、pKANTEX1259HV0LV1、pKANTEX1259HV1LV1、pKANTEX1259HV2LV1、pKANTEX1259HV0LV2、pKANTEX1259HV1LV2、pKANTEX1259HV2LV2、pKANTEX1259HV0LV3、pKANTEX1259HV1LV3、pKANTEX1259HV2LV3およびpKANTEX1259HV3LV3の計13種類を実施例２の4（1）に記載の方法に従って一過性発現用のベクターに改変した。それら一過性発現用ベクターを用いて実施例２の4（2）に記載の方法に従い、各種改変バージョンのV領域を有する抗ヒトIL-5Rα鎖ヒト型CDR移植抗体の一過性発現を行った。コントロールとして同時に抗ヒトIL-5Rα鎖ヒト型キメラ抗体KM1399の一過性発現を行った。培養上清中のヒトIL-5Rα鎖に対する結合活性を実施例２の3（2）に記載のELISA法1により測定し、また、培養上清中の抗体濃度を実施例２の4（3）に記載のELISA法により測定し、両者の値より各種改変バージョンのV領域を有する抗ヒトIL-5Rα鎖ヒト型CDR移植抗体の活性をヒト型キメラ抗体KM1399の活性を100としたときの相対活性値で第49図に示した。なお、図中では各種改変バージョンの抗ヒトIL-5Rα鎖ヒト型CDR移植抗体はVHとVLの組合せで表示した。第49図よりVHに関してはHV.0、HV.1、HV.2、HV.3と改変が進むにつれて活性が高くなる傾向が認められ、VLに関してはLV.0、LV.3で活性が高く、LV.1、LV.2ではむしろ活性が低下する傾向が認められた。そこで、LV.0と各種改変VH、LV.3とHV.0、LV.3とHV.3、LV.3をさらに改変したLV.4と各種改変VH、の組合せの抗ヒトIL-5Rα鎖ヒト型CDR移植抗体について精製抗体を用いたより正確な活性評価を以下のような方法で行った。
上記で述べた計10種類の抗ヒトIL-5Rα鎖ヒト型CDR移植抗体の発現ベクター、すなわちpKANTEX1259HV0LV0、pKANTEX1259HV1LV0、pKANTEX1259HV2LV0、pKANTEX1259HV3LV0、pKANTEX1259HV0LV3、pKANTEX1259HV3LV3、pKANTEX1259HV0LV4、pKANTEX1259HV1LV4 pKANTEX1259HV2LV4および
pKANTEX1259HV3LV4を用いて実施例２の3（2）に記載の方法に従いYB2/0細胞での発現を行い、各種の抗ヒトIL-5Rα鎖ヒト型CDR移植抗体を2〜4μg/106cells/24hrの生産性で生産する形質転換株を得た。得られた各種の抗ヒトIL-5Rα鎖ヒト型CDR移植抗体を生産する株を実施例２の3（3）に記載の方法に従い培養、精製し、各種の抗ヒトIL-5Rα鎖ヒト型CDR移植抗体を1〜2mg取得した。各種の精製抗ヒトIL-5Rα鎖ヒト型CDR移植抗体の約4μgを、実施例２の3（3）に記載の方法に従い電気泳動し、分子量を調べた。その結果、いずれの抗ヒトIL-5Rα鎖ヒト型CDR移植抗体とも還元条件下では抗体H鎖の分子量は約50キロダルトン、抗体L鎖の分子量は約25キロダルトンであり、正しい分子量のH鎖およびL鎖の発現が確認された。また、非還元条件下ではいずれの抗ヒトIL-5Rα鎖ヒト型CDR移植抗体も分子量は約140キロダルトンであり、2本のH鎖および2本のL鎖からなる正しい大きさのヒト型CDR移植抗体の発現が確認された。また、各種の精製抗ヒトIL-5Rα鎖CDR移植抗体のH鎖、L鎖のN末端アミノ酸配列をプロテインシーケンサー（470A、アプライド バイオシステムズ社製）を用いて自動エドマン分解により解析した結果、いずれも予想される正しいアミノ酸配列が得られた。
上記で得られた各種の精製抗ヒトIL-5Rα鎖ヒト型CDR移植抗体のヒトIL-5Rα鎖に対する反応性を実施例２の3（2）に記載のELISA法2により測定した結果を第50図に示した。なお、図中では各種改変バージョンの抗ヒトIL-5Rα鎖ヒト型CDR移植抗体はVHとVLの組合せで表示した。第50図に示したように10種類の精製抗ヒトIL-5Rα鎖ヒト型CDR移植抗体のうち、HV.3LV.0およびHV.3LV.4が抗ヒトIL-5Rα鎖ヒト型キメラ抗体KM1399と同等の強さのヒトIL-5Rα鎖に対する反応性を有していることが示された。
抗ヒトIL-5Rα鎖ヒト型キメラ抗体KM1399と同等の強さのヒトIL-5Rα鎖に対する反応性を示した抗ヒトIL-5Rα鎖ヒト型CDR移植抗体HV.3LV.0およびHV.3LV.4のアミノ酸配列を比較すると、HVについてはどちらもHV.3に示すアミノ酸配列を有するが、VLはLV.0とLV.4に示すアミノ酸配列である。LV.0がCDRを単純にヒト抗体のFRに移植した配列であるのに対して、LV.4は活性を高めるためにヒト抗体のFRの11残基のアミノ酸をモノクローナル抗体に見出されるアミノ酸に改変した配列である。しかし、第50図の結果から実際はアミノ酸残基の改変が活性の上昇にはほとんど寄与していない。これらの事実から、抗ヒトIL-5Rα鎖ヒト型キメラ抗体KM1399と同等の強さのヒトIL-5Rα鎖に対する反応性を有し、かつモノクローナル抗体由来のアミノ酸が少なくヒトに対する抗原性が低下することが期待されるHV.3LV.0を抗ヒトIL-5Rα鎖ヒト型CDR移植抗体とした。HV.3LV.0はKM8399と命名し、KM8399を生産する形質転換株KM8399はFERM BP-5648として、平成8年９月３日付で、工業技術院生命工学技術研究所に寄託された。
抗ヒトIL-5Rα鎖ヒト型CDR移植抗体KM8399の製造にあたっては、他のヒト型CDR移植抗体の製造と同様に、もととなる抗ヒトIL-5Rα鎖モノクローナル抗体KM1259のCDRのみを単純にヒト抗体のFRに移植した抗ヒトIL-5Rα鎖ヒト型CDR移植抗体KM8397ではその活性がモノクローナル抗体KM1259の約1/2に低下してしまった。そこで上記のようにH鎖、L鎖のV領域のFRのいくつかのアミノ酸をモノクローナル抗体KM1259に見出されるアミノ酸に改変し、活性の上昇を検討した。改変の過程でVHに関しては改変に従い活性が上昇したが、一方、VLに関しては少数のアミノ酸残基の改変では、むしろ活性が低下し、改変残基数を増加させることにより活性は上昇するが、それは改変しないVLと同程度レベルまでしか上昇しないという結果が得られた。この原因についてはより詳細な解析（X線結晶解析等）を待たねばならないが、恐らく抗体のVHとVLの相互作用が関与しており、その結果は用いる個々の抗体で異なることが考えられる。こうした問題から現在でもすべての抗体に適応可能で効率的なヒト型CDR移植抗体の製造法は確立されておらず、本実施例のような試行錯誤が必要である。そして、こうした試行錯誤の積み重ねにより、より効率的なヒト型CDR移植抗体の製造法が確立されると考えられる。本実施例は、はじめての抗ヒトIL-5Rα鎖ヒト型CDR移植抗体の製造の例であり、効率的なヒト型CDR移植抗体の製造における示唆を与えるものである。
７．ヒト抗体IgG4サブクラスの抗ヒトIL-5Rα鎖ヒト化抗体の製造
（１）ヒト抗体IgG4サブクラスのC領域（Cγ4）をコードするcDNAの単離、解析
健常人末梢血200mlより抗CD19抗体がコーティングされたダイナビーズ（DYNABEADS M-450 Pan-B（CD19）：日本ダイナル社製）およびDETACHaBEAD（日本ダイナル社製）を用い、添付の使用説明書に従って1.1×107個のB細胞を分離した。分離した細胞よりQuickPrep mRNA Purification Kit（ファルマシア バイオテク社製）を用い、キットに添付の使用説明書に従ってmRNAを取得した。取得したmRNAの全量からTimeSaver cDNA Synthesis Kit（ファルマシア バイオテク社製）を用い、キットに添付の使用説明書に従ってcDNAを合成した。得られたcDNAの全量を用いて、配列番号89、90に示したヒト抗体Cγ４をコードするcDNAの5'側と3'側に相同性を持つ配列［ヌクレイック・アシッド・リサーチ（Nucleic Acid Research）,14,1789（1986）］の合成DNAをプライマーとして実施例２の5（1）に記載のPCRを行った。PCRに用いた5'側と3'側のプライマーはその5'端にそれぞれ制限酵素ApaIとBamHIの認識配列を有しており、得られたcDNAをヒト化抗体発現ベクターに容易に挿入できるように設計した。PCR後の反応液をQIAquick PCR Purificanon Kit（キアジェン社製）を用いて精製後、10mMトリス-塩酸（pH7.5）、10mM塩化マグネシウムおよび1mMDTTからなる緩衝液30μlに加え、更に10単位の制限酵素ApaI（宝酒造社製）を加えて37℃で1時間反応させた。該反応液をエタノール沈殿し、20mMトリス-塩酸（pH8.5）、100mM塩化カリウム、10mM塩化マグネシウム、1mMDTTからなる緩衝液10μlに加え、更に10単位の制限酵素BamHI（宝酒造社製）を加えて30℃で1時間反応させた。該反応液をアガロースゲル電気泳動にて分画し、約1.0kbのApaI-BamHI断片を約0.5μg回収した。
次に、プラスミドpBluescriptSK（-）（ストラタジーン社製）の3μgを10mMトリス-塩酸（pH7.5）、10mM塩化マグネシウムおよび1mMDTTからなる緩衝液10μlに加え、更に10単位の制限酵素ApaI（宝酒造社製）を加えて37℃で1時間反応させた。該反応液をエタノール沈殿し、20mMトリス-塩酸（pH8.5）、100mM塩化カリウム、10mM塩化マグネシウム、1mMDTTからなる緩衝液10μlに加え、更に10単位の制限酵素BamHI（宝酒造社製）を加えて30℃で1時間反応させた。該反応液をアガロースゲル電気泳動にて分画し、約3.0kbのApaI-BamHI断片を約2μg回収した。
上記で得られたPCR増幅断片のApaI-BamHI断片0.1μgとpBluescriptSK（-）のApaI-BamHI断片0.1μgを全量20μlの滅菌水に加え、Ready-To-Go T4 DNA Ligase（ファルマシア バイオテク社製）を用いて連結した。このようにして得られた組換えプラスミドDNA溶液を用いて大腸菌HB101株を形質転換した。形質転換株の10個のクローンより各プラスミドDNAを調製し、塩基配列の決定を行なった結果、目的のヒト抗体Cγ4をコードするcDNAを含む第51図に示したプラスミドpBShCγ4を得た。
（２）ヒト抗体IgG4サブクラスの抗ヒトIL-5Rα鎖ヒト化抗体の発現ベクターの構築
実施例２の７（1）で得られたヒト抗体Cγ4をコードするcDNAを含むプラスミドpBShCγ4および実施例２の3（1）で得られた抗ヒトIL-5Rα鎖ヒト型キメラ抗体KM1399の発現ベクターpKANTEX1259および実施例２の6（3）で得られた抗ヒトIL-5Rα鎖ヒト型CDR移植抗体KM8399の発現ベクターpKANTEX1259HV3LV0を用いて、ヒト抗体IgG4サブクラスの抗ヒトIL-5Rα鎖ヒト化抗体の発現ベクターを以下のようにして構築した。
ヒト抗体Cγ4をコードするcDNAを含むプラスミドpBShCγ4の4μgを10mMトリス-塩酸（pH7.5）、10mM塩化マグネシウムおよび1mMDTTからなる緩衝液10μlに加え、更に10単位の制限酵素ApaI（宝酒造社製）を加えて37℃で1時間反応させた。該反応液をエタノール沈殿し、20mMトリス-塩酸（pH8.5）、100mM塩化カリウム、10mM塩化マグネシウム、1mMDTTからなる緩衝液10μlに加え、更に10単位の制限酵素BamHI（宝酒造社製）を加えて30℃で1時間反応させた。該反応液をアガロースゲル電気泳動にて分画し、約1.0kbのApaI-BamHI断片を約1μg回収した。
次に、抗ヒトIL-5Rα鎖ヒト型キメラ抗体KM1399の発現ベクターpKANTEX1259および抗ヒトIL-5Rα鎖ヒト型CDR移植抗体KM8399の発現ベクターpKANTEX1259HV3LV0の各3μgを10mMトリス-塩酸（pH7.5）、10mM塩化マグネシウムおよび1mMDTTからなる緩衝液10μlに加え、更に10単位の制限酵素ApaI（宝酒造社製）を加えて37℃で1時間反応させた。各反応液をエタノール沈殿し、20mMトリス-塩酸（pH8.5）、100mM塩化カリウム、10mM塩化マグネシウム、1mMDTTからなる緩衝液10μlに加え、更に10単位の制限酵素BamHI（宝酒造社製）を加えて30℃で1時間反応させた。各反応液をアガロースゲル電気泳動にて分画し、それぞれ約12.59kbのApaI-BamHI断片を約2μg回収した。
上記で得られたプラスミドpBShCγ4由来のApaI-BamHI断片0.1μgとプラスミドpKANTEX1259由来のApaI-BamHI断片0.1μg、また、プラスミドpBShCγ4由来のApaI-BamHI断片0.1μgとプラスミドpKANTEX1259HV3LV0由来のApaI-BamHI断片0.1μgをそれぞれ全量20μlの滅菌水に加え、Ready-To-Go T4 DNA Ligase（ファルマシア バイオテク社製）を用いて連結した。このようにして得られた各組換えプラスミドDNA溶液を用いて大腸菌HB101株を形質転換し、第52図に示したIgG4サブクラスの抗ヒトIL-5Rα鎖ヒト型キメラ抗体の発現ベクターpKANTEX1259γ4およびIgG4サブクラスの抗ヒトIL-5Rα鎖ヒト型CDR移植抗体の発現ベクターpKANTEX1259HV3LV0γ4を得た。
（３）ヒト抗体IgG4サブクラスの抗ヒトIL-5Rα鎖ヒト化抗体のラットミエローマYB2/0細胞（ATCC CRL1581）での発現
実施例２の7（2）で得られたIgG4サブクラスの抗ヒトIL-5Rα鎖ヒト型キメラ抗体の発現ベクターpKANTEX1259γ4およびIgG4サブクラスの抗ヒトIL-5Rα鎖ヒト型CDR移植抗体の発現ベクターpKANTEX1259HV3LV0γ4を用いてヒト抗体IgG4サブクラスの抗ヒトIL-5Rα鎖ヒト化抗体のYB2/0細胞での発現を実施例２の3（2）に記載の方法に従い行った。
その結果、IgG4サブクラスの抗ヒトIL-5Rα鎖ヒト型キメラ抗体を生産する形質転換株としてはKM7399（FERM BP-5649）が得られ、それが生産するIgG4サブクラスの抗ヒトIL-5Rα鎖ヒト型キメラ抗体をKM7399と命名した。KM7399を生産する形質転換株KM7399はFERM BP-5649として平成8年９月３日付で、工業技術院微生物工業技術研究所に寄託された。形質転換株KM7399の抗ヒトIL-5Rα鎖ヒト型キメラ抗体KM7399の生産性は約3μg/106cells/24hrであった。
また、IgG4サブクラスの抗ヒトIL-5Rα鎖ヒト型CDR移植抗体を生産する形質転換株としてはKM9399（FERM BP-5647）が得られ、それが生産するIgG4サブクラスの抗ヒトIL-5Rα鎖ヒト型CDR移植抗体をKM9399と命名した。形質転換株KM9399の抗ヒトIL-5Rα鎖ヒト型CDR移植抗体KM9399の生産性は約7μg/106cells/24hrであった。KM9399を生産する形質転換株KM9399はFERM BP-5647として平成8年９月３日付で、工業技術院微生物工業技術研究所に寄託された。
（４）ヒト抗体IgG4サブクラスの抗ヒトIL-5Rα鎖ヒト化抗体の培養上清からの精製
実施例２の7（3）で得られたIgG4サブクラスの抗ヒトIL-5Rα鎖ヒト型キメラ抗体生産株KM7399およびIgG4サブクラスの抗ヒトIL-5Rα鎖ヒト型CDR移植抗体生産株KM9399を実施例２の3（3）に記載の方法に従い培養、精製し、KM7399、KM9399をそれぞれ約1mg、5mg取得した。精製したIgG4サブクラスの抗ヒトIL-5Rα鎖ヒト化抗体KM7399、KM9399の各約4μgを、実施例２の3（3）に記載の方法に従い電気泳動し、分子量を調べた。その結果を第53図に示す。第53図に示したように、還元条件下では各抗体H鎖の分子量は約50キロダルトン、抗体L鎖の分子量は約25キロダルトンであり、正しい分子量のH鎖およびL鎖の発現が確認された。また、非還元条件下では各抗ヒトIL-5Rα鎖ヒト化抗体の分子量は約140キロダルトンであり、2本のH鎖および2本のL鎖からなる正しい大きさのヒト型CDR移植抗体の発現が確認された。また、精製したIgG4サブクラスの抗ヒトIL-5Rα鎖ヒト化抗体KM7399およびKM9399のH鎖、L鎖のN末端アミノ酸配列をプロテインシーケンサー（470A、アプライド バイオシステムズ社製）を用いて自動エドマン分解により解析した結果、予想される正しいアミノ酸配列が得られた。
（５）ヒト抗体IgG4サブクラスの抗ヒトIL-5Rα鎖ヒト化抗体のヒトIL-5Rα鎖に対する反応性（ELISA法2）
ヒト抗体IgG1サブクラスの抗ヒトIL-5Rα鎖ヒト型キメラ抗体KM1399、ヒト抗体IgG1サブクラスの抗ヒトIL-5Rα鎖ヒト型CDR移植抗体KM8399、IgG4サブクラスの抗ヒトIL-5Rα鎖ヒト型キメラ抗体KM7399およびIgG4サブクラスの抗ヒトIL-5Rα鎖ヒト型CDR移植抗体KM9399のヒトIL-5Rα鎖に対する反応性を実施例２の3（2）に記載のELISA法2により測定した。その結果を第54図に示す。第54図に示したように、ヒト抗体IgG4サブクラスの抗ヒトIL-5Rα鎖ヒト化抗体はヒト抗体IgG1サブクラスの抗ヒトIL-5Rα鎖ヒト化抗体と同等の強さのヒトIL-5Rα鎖に対する反応性を有していることが示された。
実施例３．
１．抗hIL-5Rα抗体の特異性の確認
抗hIL-5Rαモノクローナル抗体および抗hIL-5Rαヒト化抗体の特異性を免疫細胞染色を用いて以下の手順に従い確認した。
CTLL-2細胞（ATCC TIB 214）にヒトIL-5R遺伝子を導入した細胞［以下、CTLL-2（h5R）細胞と称す］［ジャーナル・オブ・エキスペリメンタル・メディシン（J.Exp.Med.）,177,1523（1993）］、あるいは対照としてCTLL-2細胞5×105個を免疫細胞染色用緩衝液（1%BSA、0.02%EDTA、0.05%アジ化ナトリウムを含むPBS）に懸濁して丸底96ウェルプレートに100μl／ウェルで分注した。４℃、350×gで1分間遠心分離後、上清を除き、10μg/ml hIL-5Rα抗体を含む免疫細胞染色用緩衝液50μlを加えて4℃で30分間反応させた。反応後、免疫細胞染色用緩衝液を200μl／ウェルで加え4℃、350×gで1分間遠心分離後上清を除き細胞の洗浄を行った。この洗浄操作をさらに2回行った後、染色バッファーで30倍希釈したFITC標識抗マウスイムノグロブリン抗体あるいはFITC標識抗ヒトイムノグロブリン抗体（いずれも和光純薬社製）を含む免疫細胞染色用緩衝液50μlを加えて4℃で30分間反応させた。反応後、上記と同様の洗浄操作を3回行った後フローサイトメーター（コールター社製）を用いて解析を行った。
結果を第55図に示す。モノクローナル抗体KM1257、KM1259およびKM1486、ならびにヒト化抗体KM1399、KM7399、KM8399およびKM9399ともにCTLL-2細胞には反応せずCTLL-2（h5R）細胞に特異的に反応した。この結果、モノクローナル抗体KM1257、KM1259およびKM1486、ならびにヒト化抗体KM1399、KM7399、KM8399およびKM9399はhIL-5Rαを特異的に認識することが明らかとなった。
２．抗IL-5Rα抗体によるIL-5の生物活性の阻害作用
CTLL-2（h5R）細胞はヒトIL-5に依存して増殖応答を示す［ジャーナル・オブ・エキスペリメンタル・メディシン（J.Exp.Med.）,177,1523（1993）］ことから、得られた抗IL-5Rα抗体のCTLL-2（h5R）細胞におけるヒトIL-5依存性細胞増殖に対する影響を検討した。細胞増殖は、セルカウンティングキット（同仁化学研究所製）を用いて発色法にて評価を行った。
CTLL-2（h5R）細胞1×104個を50μlの正常培地に懸濁して96ウェル培養用プレートに分注した。これに正常培地で希釈した40μg/ml各種抗IL-5Rα抗体溶液25μl／ウェル、さらに実施例１の３の方法で調製した0.4ng/mlヒトIL-5を含む正常培地25μl／ウェルを混合し、CO2インキュベーター中、37℃で44時間培養した。さらに、セルカウンティングキット溶液を10μl／ウェルで加えてからCO2 ５％気流下、３７℃で４時間培養した。培養終了後、450nmの吸光度をマイクロウェルプレートリーダーEmax（モレキュラーデバイス社製）にて測定した。各抗体のCTLL-2（h5R）細胞増殖抑制活性を次式により算出した。
Figure 0003946256
結果を第５６図に示すが、モノクローナル抗体KM1259およびKM1486、ならびにヒト化抗体KM1399、KM7399、KM8399およびKM9399はいずれもCTLL-2（h5R）細胞のヒトIL-5依存性増殖を阻害したが、モノクローナル抗体KM1257にはこのような活性が認められなかった。
３．ヒト好酸球の免疫細胞染色
正常人血液より多形核白血球画分を調製し、3日間ヒトIL-5の存在下で培養し好酸球を濃縮した後に、フローサイトメーターを用いて抗hIL-5Rαモノクローナル抗体の反応性を検討した。
15ml容量のポリプロピレン製遠心管にポリモルフプレップ（polymorphprep、ニコメッド社製）を4mlずつ8本に分注しそれぞれにヘパリン処理をした正常人血6mlを重層した。これを500×g、室温で30分間遠心分離して多形核白血球を分離、回収した。多形核白血球が1.25×107個/10mlとなるように正常培地に懸濁し、細胞培養用ディッシュ４枚に10mlずつ分注し、最終濃度が2ng/mlとなるようにヒトIL-5を加え、CO2インキュベーター中、37℃で3日間培養した。培養終了後細胞を遠心分離（1,200rpm、5分間）し、免疫細胞染色用緩衝液で5×106個/mlになるように細胞を懸濁し、5×105個を丸底96ウェルプレートに分注した。４℃、350×gで１分間遠心分離後上清を除き、公知の方法（酵素抗体法：学際企画刊 1985年）でビオチン標識したモノクローナル抗体KM1259あるいは対照としてビオチン標識した抗ヒト顆粒球コロニー刺激因子モノクローナル抗体KM341［アグリカルチュラル・アンド・バイオロジカル・ケミストリー（Agr.Biol.Chem.）,53,1095（1989）］を10μg/mlの濃度で10%正常マウス血清を含む免疫細胞染色用緩衝液50μlを加えて4℃で30分間反応させた。反応後、免疫細胞染色用緩衝液を200μl／ウェルに加え4℃、350×gで1分間遠心分離後上清を除き細胞の洗浄を行った。この洗浄操作をさらに2回行った後、免疫細胞染色用緩衝液で10倍に希釈したフィコエリスリン標識ストレプトアビジン（ベクトン・ディッキンソン社製）を50μl／ウェル加えて4℃で30分間反応させた。反応後、上記と同様の洗浄操作を3回行った後フローサイトメーター（コールター社製）にて前方散乱、90度散乱にて多形核白血球と認められる細胞に関して解析を行った。また、同じ細胞をメイ・グリュントワルト・ギムザ染色法（染色法のすべて：医歯薬出版株式会社1988年）にて染色し多形核白血球に関して観察したところ、75%が好酸球であることを確認した。
第５７図に得られたヒストグラムを示す。抗ヒトIL-5Rα鎖モノクローナル抗体KM1259は明らかな反応性を示した。解析した細胞の75%は好酸球であることが確かめられていることから、抗ヒトIL-5Rα鎖モノクローナルKM1259はヒト好酸球に対する反応性を有していることが確認された。
４．抗IL-5Rα抗体を用いたヒト好酸球の生存抑制
正常人血液より多形核白血球画分を調製し、ヒトIL-5の存在下での好酸球生存に対する抗IL-5Rα抗体の作用を検討した。
15ml容量のポリプロピレン製遠心管にポリモルフプレップ（polymorphprep、ニコメッド社製）を4mlずつ15本に分注しそれぞれにヘパリン処理をした正常人血8mlを重層した。これを500×g、室温で30分間遠心分離して多形核白血球を分離、回収した。
9容量のパーコール溶液（Percoll、ファルマシア社製）に１容量の滅菌した1.5M食塩水を加えパーコールストック溶液を調製した。8容量のパーコールストック溶液に2容量の生理食塩水を加え80%パーコール溶液を調製し、6容量のパーコールストック溶液に4容量の生理食塩水を加え60%パーコール溶液を調製した。混在する単核球を除く目的で、15ml容量のポリプロピレン製遠心管２本に5mlの60%パーコール溶液を分注し、ここに先に得られたRPMI1640培地に懸濁した多形核白血球を重層し、500×g、室温で30分間遠心分離して沈殿した多形核白血球を分離、回収した。さらに混在する赤血球を除く目的で、5mlの80%パーコール溶液を2本の15ml容量のポリプロピレン製遠心管に分注し、ここに先に得られたRPMI1640培地に懸濁した多形核白血球を重層し、500×g、室温で30分間遠心分離してパーコール層に浮遊している多形核白血球を分離、回収した。
48ウェルの細胞培養用プレートに2×106個／ウェルの細胞を分注し、最終濃度0.1ng/mlのヒトIL-5を添加し、さらに最終濃度1μg/mlの各種抗IL-5Rα抗体をそれぞれ添加した。各抗体につき2ウェル培養し、各ウェルの液量は最終的に1mlとなるように調製した。CO2インキュベーター中、37℃で３日間培養し、培養終了後各ウェルから全量の細胞懸濁液を回収し、遠心分離（3,000rpm、１分間）して細胞を回収した。得られた細胞を100μlのPBSに懸濁し、そのうちの50μlを用いて細胞標本作製装置：サイトスピン3［Cytospin3、シャンドン（Shandon）社製］にて標本を作製した。メイ・グリュントワルト・ギムザ染色法にて染色後、各標本に関して200個の細胞を観察し、好酸球の数を求めた。
結果を第５８図に示すが、モノクローナル抗体KM1259およびKM1486、ならびにヒト化抗体KM1399、KM7399、KM8399およびKM9399はいずれもIL-5による好酸球寿命延長を抑制する活性が認められたが、モノクローナル抗体KM1257にはこのような活性が認められなかった。
５．抗hIL-5Rα抗体を用いたshIL-5Rαの検出
96ウェルのEIA用プレート（グライナー社製）に、抗ヒトIL-5Rαモノクローナル抗体KM1257を10μg/mlの濃度にPBSで希釈し、50μl/ウェルずつ分注し、4℃で一晩放置して吸着させた。洗浄後、1%牛血清アルブミン（BSA）を含むPBSを100μl/ウェル加え、室温1時間反応させて残っている活性基をブロックした。1%BSA-PBSを捨て、1000〜0.1ng/mlの濃度に1%BSA-PBSで希釈した実施例１の1（9）で得られた精製shIL-5Rαを4℃で一晩反応させた。tween-PBSで洗浄後、公知の方法（酵素抗体法：学際企画刊1985年）でビオチン標識した抗ヒトIL-5Rαモノクローナル抗体KM1259を1μg/mlの濃度に1%BSA-PBSで希釈して50μl/ウェルずつ加えて室温にて2時間反応させた。tween-PBSで洗浄後、4000倍に1%BSA-PBSで希釈したアビジン標識ペルオキシダーゼ（ニチレイ社製）50μl/ウェルを加えて室温にて1時間反応させた。tween-PBSで洗浄後ABTS基質液［2.2-アジノビス（3-エチルベンゾチアゾール-6-スルホン酸）アンモニウム］を用いて発色させOD415nmの吸光度を測定した（NJ2001;日本インターメッド社製）。
結果を第５９図に示す。この結果、抗ヒトIL-5Rαモノクローナル抗体KM1257およびビオチン標識抗ヒトIL-5Rαモノクローナル抗体KM1259を用いることによりshIL-5Rαを測定することができることが明らかとなった。
６．ウェスタンブロッティング法によるshIL-5Rαの検出
実施例１の１（９）で述べたshIL-5Rαを2-メルカプトエタノールを含むSDS-PAGE用サンプルバッファーあるいは2-メルカプトエタノールを含まないSDS-PAGE用サンプルバッファー中にて加熱変性させた。該溶液を市販のSDS-PAGE用グラジエントゲル（アトー社製）にて電気泳動した後、PVDF膜（ミリポア社製）に蛋白質を転写した。該PVDF膜を10%BSAを含むPBSに浸して４℃にて一晩放置してブロッキングを行い、ブロッキング終了後0.05%Tweenを含むPBSにてよく洗浄した。該PVDF膜を実施例１の５で得られたハイブリドーマの培養上清に室温で２時間浸し、0.05%Tweenを含むPBSにてよく洗浄した。さらにペルオキシダーゼ標識抗マウスイムノグロブリン抗体（和光純薬社製）を1%BSA-PBSで1000倍希釈した溶液に該PVDF膜を室温で1時間浸し、0.05%Tweenを含むPBSにてよく洗浄した。洗浄液をよく除いた後、ECL試薬（アマシャム社製）を該PVFD膜にかけ１分間反応させた。過剰量の試薬を除きプラスチックフィルムに該PVDF膜を挟んでX線フィルム感光用カセットに入れてECL用フィルムを感光させ、抗体の反応性を確認した。
結果を第６０図に示す。KM1257は反応性を示したが、KM1259、KM1486は反応性を示さなかった。
７．shIL-5Rαの免疫沈降
96ウェルのEIA用プラスチックプレートに抗マウスイムノグロブリン抗体（DAKO社製）をPBSで50倍希釈したものを200μl／ウェルずつ分注し、４℃にて一晩放置して吸着させた。PBSで洗浄後、1%BSAを含むPBSを300μl／ウェルずつ分注して室温で1時間放置し、ブロッキングを行った。PBSにて洗浄後、実施例で得られた抗ヒトIL-5Rαモノクローナル抗体であるKM1257、KM1259あるいはKM1486の培養上清を200μlずつ加え、４℃にて一晩放置して抗体を吸着させた。プレートを洗浄後、実施例１の１で得られたshIL-5Rαを10μg/mlの濃度に1%BSAで希釈したものを50μlずつ分注し、４℃で一晩反応させた。プレートを0.05%Tweenを含むPBSにて洗浄後、５倍濃度の2-メルカプトエタノールを含まないSDS-PAGE用サンプルバッファー［0.31Mトリス（pH6.8）、10%SDS、50%グリセロール］あるいは2-メルカプトエタノールを含むSDS-PAGE用サンプルバッファー［0.31Mトリス（pH6.8）、10%SDS、50%グリセロール、25% 2-メルカプトエタノール］を50μl／ウェルずつ分注し、振とうしながら室温で２時間放置した。200μlのPBSに該反応液を加え、ヒートブロックにて加熱した後、市販のSDS-PAGE用グラジエントゲル（アトー社製）にて25μlの該溶液を分離した。電気泳動終了後、PVDF膜（ミリポア社製）に転写を行った。該PVDF膜を実施例３の６に示した方法でKM1257を用いてウェスタンブロッティングを行い、shIL-5Rαを検出した。
結果を第６１図に示す。KM1257、KM1259、KM1486ともにshIL-5Rαを免疫沈降することが明らかとなった。
産業上の利用可能性
本発明により、ヒト好酸球上に特異的に発現されていると考えられるヒトIL-5受容体α鎖に特異的に結合するモノクローナル抗体KM1257、KM1259およびKM1486が提供される。また、ヒト好酸球上に特異的に発現されていると考えられるヒトIL-5受容体α鎖に特異的に結合し、かつヒトIL-5の生物活性を阻害できるヒト化抗体KM1399、KM8399、KM7399およびKM9399が提供される。本発明の抗体は免疫細胞染色におけるヒト好酸球の免疫学的検出、IL-5の生物活性の阻害によるアレルギー性疾患の診断、治療等に有用である。特にヒト化抗体においてはモノクローナル抗体よりも免疫原性が低く、その効果が長期にわたり持続することが期待される。
配 列 表
配列番号：1
配列の長さ：32
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ
配列：
Figure 0003946256
配列番号：2
配列の長さ：32
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ
配列：
Figure 0003946256
配列番号：3
配列の長さ：27
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ
配列：
Figure 0003946256
配列番号：4
配列の長さ：88
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ
配列：
Figure 0003946256
配列番号：5
配列の長さ：84
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成DNA
配列：
Figure 0003946256
配列番号：6
配列の長さ：51
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成DNA
配列：
Figure 0003946256
配列番号：7
配列の長さ：58
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成DNA
配列：
Figure 0003946256
配列番号：8
配列の長さ：64
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成DNA
配列：
Figure 0003946256
配列番号：9
配列の長さ：41
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成DNA
配列：
Figure 0003946256
配列番号：10
配列の長さ：39
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成DNA
配列：
Figure 0003946256
配列番号：11
配列の長さ：34
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成DNA
配列：
Figure 0003946256
配列番号：12
配列の長さ：34
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成DNA
配列：
Figure 0003946256
配列番号：13
配列の長さ：39
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成DNA
配列：
Figure 0003946256
配列番号：14
配列の長さ：34
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成DNA
配列：
Figure 0003946256
配列番号：15
配列の長さ：76
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成DNA
配列：
Figure 0003946256
配列番号：16
配列の長さ：32
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成DNA
配列：
Figure 0003946256
配列番号：17
配列の長さ：40
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成DNA
配列：
Figure 0003946256
配列番号：18
配列の長さ：21
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成DNA
配列：
Figure 0003946256
配列番号：19
配列の長さ：17
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成DNA
配列：
Figure 0003946256
配列番号：20
配列の長さ：26
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成DNA
配列：
Figure 0003946256
配列番号：21
配列の長さ：34
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成DNA
配列：
Figure 0003946256
配列番号：22
配列の長さ：421
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：cDNA
配列の特徴：
特徴を表す記号：sig peptide
存在位置：1..57
特徴を決定した方法：S
特徴を表す記号：domain
存在位置：148..162
特徴を決定した方法：S
他の情報：CDR1
特徴を表す記号：domain
存在位置：205..255
特徴を決定した方法：S
他の情報：CDR2
特徴を表す記号：domain
存在位置：352..387
特徴を決定した方法：S
他の情報：CDR3
配列：
Figure 0003946256
配列番号：23
配列の長さ：394
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：cDNA
配列の特徴：
特徴を表す記号：sig peptide
存在位置：1..60
特徴を決定した方法：S
特徴を表す記号：domain
存在位置：130..174
特徴を決定した方法：S
他の情報：CDR1
特徴を表す記号：domain
存在位置：220..240
特徴を決定した方法：S
他の情報：CDR2
特徴を表す記号：domain
存在位置：337..363
特徴を決定した方法：S
他の情報：CDR3
配列：
Figure 0003946256
配列番号：24
配列の長さ：421
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：cDNA
配列の特徴：
特徴を表す記号：sig peptide
存在位置：1..57
特徴を決定した方法：S
特徴を表す記号：domain
存在位置：148..162
特徴を決定した方法：S
他の情報：CDR1
特徴を表す記号：domain
存在位置：205..255
特徴を決定した方法：S
他の情報：CDR2
特徴を表す記号：domain
存在位置：352..387
特徴を決定した方法：S
他の情報：CDR3
配列：
Figure 0003946256
配列番号：25
配列の長さ：382
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：cDNA
配列の特徴：
特徴を表す記号：sig peptide
存在位置：1..60
特徴を決定した方法：S
特徴を表す記号：domain
存在位置：130..162
特徴を決定した方法：S
他の情報：CDR1
特徴を表す記号：domain
存在位置：208..228
特徴を決定した方法：S
他の情報：CDR2
特徴を表す記号：domain
存在位置：325..351
特徴を決定した方法：S
他の情報：CDR3
配列：
Figure 0003946256
配列番号：26
配列の長さ：412
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：cDNA
配列の特徴：
特徴を表す記号：sig peptide
存在位置：1..57
特徴を決定した方法：S
特徴を表す記号：domain
存在位置：148..162
特徴を決定した方法：S
他の情報：CDR1
特徴を表す記号：domain
存在位置：205..255
特徴を決定した方法：S
他の情報：CDR2
特徴を表す記号：domain
存在位置：352..387
特徴を決定した方法：S
他の情報：CDR3
配列：
Figure 0003946256
配列番号：27
配列の長さ：331
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：cDNA
配列の特徴：
特徴を表す記号：domain
存在位置：79..108
特徴を決定した方法：S
他の情報：CDR1
特徴を表す記号：domain
存在位置：154..174
特徴を決定した方法：S
他の情報：CDR2
特徴を表す記号：domain
存在位置：271..300
特徴を決定した方法：S
他の情報：CDR3
配列：
Figure 0003946256
配列番号：28
配列の長さ：5
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
配列：
Figure 0003946256
配列番号：29
配列の長さ：17
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
配列：
Figure 0003946256
配列番号：30
配列の長さ：12
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
配列：
Figure 0003946256
配列番号：31
配列の長さ：15
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
配列：
Figure 0003946256
配列番号：32
配列の長さ：7
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
配列：
Figure 0003946256
配列番号：33
配列の長さ：9
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
配列：
Figure 0003946256
配列番号：34
配列の長さ：5
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
配列：
Figure 0003946256
配列番号：35
配列の長さ：17
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
配列：
Figure 0003946256
配列番号：36
配列の長さ：12
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
配列：
Figure 0003946256
配列番号：37
配列の長さ：11
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
配列：
Figure 0003946256
配列番号：38
配列の長さ：7
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
配列：
Figure 0003946256
配列番号：39
配列の長さ：9
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
配列：
Figure 0003946256
配列番号：40
配列の長さ：5
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
配列：
Figure 0003946256
配列番号：41
配列の長さ：17
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
配列：
Figure 0003946256
配列番号：42
配列の長さ：9
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
配列：
Figure 0003946256
配列番号：43
配列の長さ：10
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
配列：
Figure 0003946256
配列番号：44
配列の長さ：7
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
配列：
Figure 0003946256
配列番号：45
配列の長さ：10
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
配列：
Figure 0003946256
配列番号：46
配列の長さ：39
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成DNA
配列：
Figure 0003946256
配列番号：47
配列の長さ：31
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成DNA
配列：
Figure 0003946256
配列番号：48
配列の長さ：20
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成DNA
配列：
Figure 0003946256
配列番号：49
配列の長さ：21
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成DNA
配列：
Figure 0003946256
配列番号：50
配列の長さ：97
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成DNA
配列：
Figure 0003946256
配列番号：51
配列の長さ：96
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成DNA
配列：
Figure 0003946256
配列番号：52
配列の長さ：96
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成DNA
配列：
Figure 0003946256
配列番号：53
配列の長さ：98
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成DNA
配列：
Figure 0003946256
配列番号：54
配列の長さ：96
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成DNA
配列：
Figure 0003946256
配列番号：55
配列の長さ：100
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成DNA
配列：
Figure 0003946256
配列番号：56
配列の長さ：421
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成DNA
配列の特徴：
特徴を表す記号：sig peptide
存在位置：1..57
特徴を決定した方法：S
特徴を表す記号：domain
存在位置：148..162
特徴を決定した方法：S
他の情報：CDR1
特徴を表す記号：domain
存在位置：205..255
特徴を決定した方法：S
他の情報：CDR2
特徴を表す記号：domain
存在位置：352..378
特徴を決定した方法：S
他の情報：CDR3
配列：
Figure 0003946256
配列番号：57
配列の長さ：87
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成DNA
配列：
Figure 0003946256
配列番号：58
配列の長さ：83
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成DNA
配列：
Figure 0003946256
配列番号：59
配列の長さ：92
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成DNA
配列：
Figure 0003946256
配列番号：60
配列の長さ：90
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成DNA
配列：
Figure 0003946256
配列番号：61
配列の長さ：88
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成DNA
配列：
Figure 0003946256
配列番号：62
配列の長さ：91
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成DNA
配列：
Figure 0003946256
配列番号：63
配列の長さ：382
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成DNA
配列の特徴：
特徴を表す記号：sig peptide
存在位置：1..60
特徴を決定した方法：S
特徴を表す記号：domain
存在位置：130..162
特徴を決定した方法：S
他の情報：CDR1
特徴を表す記号：domain
存在位置：208..228
特徴を決定した方法：S
他の情報：CDR2
特徴を表す記号：domain
存在位置：325..351
特徴を決定した方法：S
他の情報：CDR3
配列：
Figure 0003946256
配列番号：64
配列の長さ：96
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成DNA
配列：
Figure 0003946256
配列番号：65
配列の長さ：421
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成DNA
配列の特徴：
特徴を表す記号：sig peptide
存在位置：1..57
特徴を決定した方法：S
特徴を表す記号：domain
存在位置：148..162
特徴を決定した方法：S
他の情報：CDR1
特徴を表す記号：domain
存在位置：205..255
特徴を決定した方法：S
他の情報：CDR2
特徴を表す記号：domain
存在位置：352..378
特徴を決定した方法：S
他の情報：CDR3
配列：
Figure 0003946256
配列番号：66
配列の長さ：96
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成DNA
配列：
Figure 0003946256
配列番号：67
配列の長さ：98
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成DNA
配列：
Figure 0003946256
配列番号：68
配列の長さ：421
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成DNA
配列の特徴：
特徴を表す記号：sig peptide
存在位置：1..57
特徴を決定した方法：S
特徴を表す記号：domain
存在位置：148..162
特徴を決定した方法：S
他の情報：CDR1
特徴を表す記号：domain
存在位置：205..255
特徴を決定した方法：S
他の情報：CDR2
特徴を表す記号：domain
存在位置：352..378
特徴を決定した方法：S
他の情報：CDR3
配列：
Figure 0003946256
配列番号：69
配列の長さ：96
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成DNA
配列：
Figure 0003946256
配列番号：70
配列の長さ：98
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成DNA
配列：
Figure 0003946256
配列番号：71
配列の長さ：96
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成DNA
配列：
Figure 0003946256
配列番号：72
配列の長さ：421
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成DNA
配列の特徴：
特徴を表す記号：sig peptide
存在位置：1..57
特徴を決定した方法：S
特徴を表す記号：domain
存在位置：148..162
特徴を決定した方法：S
他の情報：CDR1
特徴を表す記号：domain
存在位置：205..255
特徴を決定した方法：S
他の情報：CDR2
特徴を表す記号：domain
存在位置：352..378
特徴を決定した方法：S
他の情報：CDR3
配列：
Figure 0003946256
配列番号：73
配列の長さ：92
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成DNA
配列：
Figure 0003946256
配列番号：74
配列の長さ：90
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成DNA
配列：
Figure 0003946256
配列番号：75
配列の長さ：91
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成DNA
配列：
Figure 0003946256
配列番号：76
配列の長さ：382
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成DNA
配列の特徴：
特徴を表す記号：sig peptide
存在位置：1..60
特徴を決定した方法：S
特徴を表す記号：domain
存在位置：130..162
特徴を決定した方法：S
他の情報：CDR1
特徴を表す記号：domain
存在位置：208..228
特徴を決定した方法：S
他の情報：CDR2
特徴を表す記号：domain
存在位置：325..351
特徴を決定した方法：S
他の情報：CDR3
配列：
Figure 0003946256
配列番号：77
配列の長さ：92
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成DNA
配列：
Figure 0003946256
配列番号：78
配列の長さ：88
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成DNA
配列：
Figure 0003946256
配列番号：79
配列の長さ：382
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成DNA
配列の特徴：
特徴を表す記号：sig peptide
存在位置：1..60
特徴を決定した方法：S
特徴を表す記号：domain
存在位置：130..162
特徴を決定した方法：S
他の情報：CDR1
特徴を表す記号：domain
存在位置：208..228
特徴を決定した方法：S
他の情報：CDR2
特徴を表す記号：domain
存在位置：325..351
特徴を決定した方法：S
他の情報：CDR3
配列：
Figure 0003946256
配列番号：80
配列の長さ：83
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成DNA
配列：
Figure 0003946256
配列番号：81
配列の長さ：92
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成DNA
配列：
Figure 0003946256
配列番号：82
配列の長さ：88
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成DNA
配列：
Figure 0003946256
配列番号：83
配列の長さ：91
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成DNA
配列：
Figure 0003946256
配列番号：84
配列の長さ：382
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成DNA
配列の特徴：
特徴を表す記号：sig peptide
存在位置：1..60
特徴を決定した方法：S
特徴を表す記号：domain
存在位置：130..162
特徴を決定した方法：S
他の情報：CDR1
特徴を表す記号：domain
存在位置：208..228
特徴を決定した方法：S
他の情報：CDR2
特徴を表す記号：domain
存在位置：325..351
特徴を決定した方法：S
他の情報：CDR3
配列：
Figure 0003946256
配列番号：85
配列の長さ：92
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成DNA
配列：
Figure 0003946256
配列番号：86
配列の長さ：90
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成DNA
配列：
Figure 0003946256
配列番号：87
配列の長さ：88
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成DNA
配列：
Figure 0003946256
配列番号：88
配列の長さ：382
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成DNA
配列の特徴：
特徴を表す記号：sig peptide
存在位置：1..60
特徴を決定した方法：S
特徴を表す記号：domain
存在位置：130..162
特徴を決定した方法：S
他の情報：CDR1
特徴を表す記号：domain
存在位置：208..228
特徴を決定した方法：S
他の情報：CDR2
特徴を表す記号：domain
存在位置：325..351
特徴を決定した方法：S
他の情報：CDR3
配列：
Figure 0003946256
配列番号：89
配列の長さ：25
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成DNA
配列：
Figure 0003946256
配列番号：90
配列の長さ：30
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成DNA
配列：
Figure 0003946256
配列番号：91
配列の長さ：313
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：蛋白質
配列：
Figure 0003946256
Figure 0003946256
Figure 0003946256
配列番号：92
配列の長さ：121
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：蛋白質
配列：
Figure 0003946256
配列番号：93
配列の長さ：111
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：蛋白質
配列：
Figure 0003946256
配列番号：94
配列の長さ：121
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：蛋白質
配列：
Figure 0003946256
配列番号：95
配列の長さ：107
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：蛋白質
配列：
Figure 0003946256
配列番号：96
配列の長さ：118
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：蛋白質
配列：
Figure 0003946256
配列番号：97
配列の長さ：107
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：蛋白質
配列：
Figure 0003946256
配列番号：98
配列の長さ：109
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：蛋白質
配列：
Figure 0003946256
配列番号：99
配列の長さ：107
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：蛋白質
配列：
Figure 0003946256
配列番号：100
配列の長さ：121
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：蛋白質
配列：
Figure 0003946256
配列番号：101
配列の長さ：121
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：蛋白質
配列：
Figure 0003946256
配列番号：102
配列の長さ：121
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：蛋白質
配列：
Figure 0003946256
配列番号：103
配列の長さ：107
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：蛋白質
配列：
Figure 0003946256
配列番号：104
配列の長さ：107
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：蛋白質
配列：
Figure 0003946256
配列番号：105
配列の長さ：107
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：蛋白質
配列：
Figure 0003946256
配列番号：106
配列の長さ：107
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：蛋白質
配列：
Figure 0003946256
Technical field
The present invention relates to monoclonal antibodies and humanized antibodies that specifically bind to human interleukin 5 receptor α chain, which are useful for diagnosis or treatment of diseases such as chronic bronchial asthma, hybridomas and transformants that produce the antibodies, Further, the present invention relates to a method for immunologically detecting an interleukin 5 receptor α chain using the monoclonal antibody and the humanized antibody, and diagnosis and treatment of chronic bronchial asthma and the like using the monoclonal antibody and the humanized antibody.
Background art
Interleukin-5 (hereinafter referred to as IL-5) is a kind of lymphokine secreted by T cells, mast cells and the like. IL-5 in mice is known to act as a B cell differentiation and growth factor and eosinophil differentiation and growth factor. In humans, it is known to act primarily as an eosinophil differentiation and growth factor [Advances in Immunology,57145 (1994), Blood,793101 (1992)]. IL-5 expresses its action through a specific receptor (IL-5 receptor) expressed on the cell surface such as eosinophils. IL-5 receptor (hereinafter referred to as IL-5R) is divided into two different proteins [α chain (hereinafter referred to as IL-5Rα) and β chain (hereinafter referred to as IL-5Rβ)] in both human and mouse. It has been revealed that it is composed. Furthermore, it is known that IL-5 is bound to IL-5R by IL-5Rα, and IL-5Rβ itself is known not to show the ability to bind to IL-5 [EMBO Journal (EMBO J.),9, 4367 (1990),Ten, 2833 (1991), Journal of Experimental Medicine (J. Exp. Med.),1771523 (1993),175, 341 (1992), Cell,66, 1175 (1991), Proceeding of the National Academy of Sciences (Proc. Natl. Acad. Sci.),89, 7041 (1992)]. IL-5Rβ is known to be a component of receptors such as interleukin-3 (hereinafter referred to as IL-3) and granulocyte macrophage colony stimulating factor (hereinafter referred to as GM-CSF). [Procedure of the National Academy of Sciences (Proc.Natl.Acad.Sci.),87, 9655 (1990), Cell,661165 (1991)].
Eosinophils are known to increase in allergic diseases including chronic bronchial asthma. The airways of patients with chronic bronchial asthma have significant infiltration of eosinophils, and eosinophils themselves contain granule proteins that have cytotoxic properties. Eosinophils are considered to play an important role in the pathogenesis of allergic diseases such as chronic bronchial asthma and atopic dermatitis due to the presence of lesions in patients with inflammation [advanced in immunology] (Adv.Immunol.),39, 177 (1986), Immunol.Today,13, 501 (1992)], it is useful for clinical diagnosis to grasp its dynamics. On the other hand, since IL-5 acts specifically on eosinophils in humans, it is considered that IL-5R is specifically expressed on eosinophils. It can be used as a sphere-specific marker. Furthermore, since IL-5Rβ is a cytokine receptor such as IL-3 and GM-CSF, IL-5Rα is considered to be an eosinophil-specific marker. Therefore, eosinophils can be specifically detected by immunocell staining using an anti-human IL-5Rα chain antibody (hereinafter referred to as hIL-5Rα antibody). However, there is currently no known anti-hIL-5Rα antibody that can specifically detect eosinophils.
On the other hand, the fact that IL-5 plays an important role in the increase and infiltration of eosinophils in vivo is that there is a marked increase in eosinophils in IL-5 transgenic mice [Journal ・Of experimental medicine (J.Exp.Med.),1721425 (1990),173, 429 (1991), International Immunology (Int.Immunol.),2, 965 (1990)], suppression of tissue infiltration of eosinophils in asthma model animals by administration of anti-IL-5 antibody [American Review of Respiratory Diseases (Am.Rev.Resir.Dis .),147548 (1993),148, 1623 (1993)]. It has also been reported that IL-5 is expressed in airway mucosal tissue of patients with chronic bronchial asthma and lesions of patients with atopic dermatitis [J.Clin .Invest.),87, 1541 (1991), Journal of Experimental Medicine (J.Exp.Med.),173, 775 (1991)]. Furthermore, IL-5 exhibits a life-extending effect on human eosinophils in vitro [Journal of Immunology (J. Immunol.),143, 2311 (1989)], an eosinophil-selective activator [Journal of Experimental Medicine (J. Exp. Med.),167, 219 (1988)].
Based on the above, antibodies that can bind to IL-5R and inhibit the biological activity of IL-5 are expected to suppress the activity of eosinophils and be useful for the treatment of allergic diseases such as chronic bronchial asthma. The Anti-mouse IL-5Rα antibody capable of inhibiting the biological activity of IL-5 [Japanese Patent Laid-Open No. 3-108497, International Immunology (Int. Immunol.),2, 181 (1990)] has been prepared by using IL-5-dependent cells expressing a large amount of mouse IL-5R on the cell surface as an antigen. On the other hand, in the case of humans, cells expressing many IL-5Rs are not known, and their expression in eosinophils has been reported to be extremely low [Cellular Immunology (Cell. Immunol.),133, 484 (1991)]. For this reason, it is difficult to obtain an anti-human IL-5Rα antibody having an equivalent function by a method similar to the production of an anti-mouse IL-5Rα antibody. EMBO Journal [EMBO J.,143395 (1995)], there is a description of an antibody designated α16 as an antibody against human IL-5Rα, which has no neutralizing activity against IL-5Rα.
On the other hand, the gene of human IL-5Rα is human eosinophil [Journal of Experimental Medicine (J. Exp. Med.),175, 341 (1992)], or human promyelocytic cells (HL60) [Cell,661175 (1991), Japanese Laid-Open Patent Publication No. 6-78772], a cDNA library of mouse IL-5Rα or a partial amino acid sequence of mouse IL-5Rα [Japanese Laid-open Patent Publication No. 6-54690, EMBO J.,9, 4367 (1990)], and obtained by screening using oligo DNA synthesized as a probe. By introducing this cDNA into a host cell, cells expressing hIL-5Rα on the cell surface have been constructed. The expression level of hIL-5R in this cell is 10 per cell.FourVery few molecules or less [Journal of Experimental Medicine (J.Exp.Med.),1771523 (1993)]. Therefore, when anti-hIL-5Rα antibody is produced using this cell as an immunogen, the relative amount of hIL-5Rα is extremely small compared to the protein derived from the host cell, and the absolute protein amount It is clear that there are very few. In addition, a homology of nearly 80% is observed between mouse IL-5Rα and human IL-5Rα at the amino acid level, and mouse IL-5 also exhibits high binding activity to human IL-5R [Journal of・ Experimental Medicine (J.Exp.Med.),175, 341 (1992)], etc., human IL-5Rα is considered to be less immunogenic than mice and rats generally used as immunized animals. Actually, an anti-hIL-5Rα antibody was prepared using hIL-5Rα-expressing cells as an immunogen, but it was difficult.
In cloning of IL-5Rα cDNA from a human eosinophil cDNA library, soluble human IL-5Rα (hereinafter referred to as shIL-5Rα) corresponding to the N-terminal amino acid sequence 1 to 313 lacking the transmembrane region of IL-5Rα. CDNA coding for [Journal of Experimental Medicine (J. Exp. Med.),175, 341 (1992)]. When an anti-hIL-5Rα antibody is produced using shIL-5Rα as an immunogen, in order to obtain an anti-hIL-5Rα antibody that can inhibit the biological activity of IL-5, IL-expressed on the cell surface It is necessary to use, as an immunogen, shIL-5Rα that is secreted and produced from a eukaryotic host cell that retains a higher-order structure similar to 5Rα. In addition, it has been clarified that the production efficiency varies greatly depending on the signal peptide even in the same protein [protein nucleic acid enzyme,35, 2584 (1990)], it is necessary to select an appropriate signal peptide for secretory production.
As described above, it has been clarified that mRNA thought to encode only shIL-5Rα is expressed in eosinophils. In mice, IL-5R is expressed not only in eosinophils but also in B cells and the like, and in the same way as in humans, the extracellular region of IL-5Rα (hereinafter referred to as smIL-5Rα) in these cells. The expression of mRNA that is thought to encode only the above has been confirmed. It has also been reported that smIL-5Rα is detected in the blood of mice transplanted with a mouse chronic B cell leukemia line (BCLl) expressing IL-5R or a human autoimmune disease model mouse. [Journal of Immunological Method (J.Immunol.Method),167, 289 (1994)]. These facts suggest that the increase and activation state of IL-5R-expressing cells may be reflected in the amount of smIL-5Rα secreted in the blood. In humans, IL-5R is thought to be expressed only in eosinophils, and the increase and activation of eosinophils may be reflected in the amount of shIL-5Rα in the blood There is. Therefore, it is expected to be useful for clinical diagnosis to enable quantification of shIL-5Rα.
From the above, it is thought that if a monoclonal antibody that specifically binds to human IL-5Rα can be obtained, it will be useful for diagnosis and treatment of allergic diseases, but in general, when monoclonal antibodies derived from animals other than humans are administered to humans By being recognized as a foreign substance, an antibody against a monoclonal antibody derived from a non-human animal is produced in the human body. As a result, it reacts with administered non-human animal antibodies and causes side effects [J.Clin.Oncol.],2, 881 (1984), Blood,651349 (1985), Journal of National Cancer Institute (J.Natl. Cancer Inst.),80932 (1988), Proceeding of the National Academy of Science (Proc. Natl. Acad. Sci.),82, 1242 (1985)] and antibodies are rapidly cleared [Journal of Nuclea Med. (J. Nucl. Med.),26, 1011 (1985), Blood,651349 (1985), Journal of National Cancer Institute (J.Natl. Cancer Inst.),80, 937 (1988)], known to reduce the therapeutic effect of antibodies [J.Immunol.],135, 1530 (1985), Cancer Res.,466489 (1986)].
In order to solve these problems, a humanized antibody such as a human chimeric antibody or a human CDR-grafted antibody (reshaped human antibody) is converted from a non-human animal monoclonal antibody using genetic recombination technology. It has been tried. A human chimeric antibody is an antibody in which the antibody variable region (hereinafter referred to as V region) is derived from a non-human animal antibody and the constant region (hereinafter referred to as C region) is derived from a human antibody [Proceeding of The National Academy of Science (Proc.Natl.Acad.Sci.),81, 6851 (1984)], it has been reported that when administered to humans, antibodies against monoclonal antibodies derived from animals other than humans are hardly elicited and have a half-life in blood [Procedure of the The・ National Academy of Science (Proc.Natl.Acad.Sci.),86, 4220 (1989)]. A human CDR-grafted antibody is an antibody obtained by substituting the CDR of a human antibody [Complementarity Determining Region] with the CDR of an antibody derived from a non-human animal [Nature,321, 522 (1986)], it has been reported that in monkey experiments, immunogenicity is reduced compared to mouse antibodies, and the blood half-life is increased by 4 to 5 times [Journal of Immunology (J. Immunol .,1471352 (1991)]. However, no humanized antibody against hIL-5Rα has been reported so far.
Therefore, humanized antibodies that specifically bind to human IL-5Rα have reduced side effects due to the absence of antibodies against monoclonal antibodies derived from animals other than humans when administered to the human body, and half blood levels. By extending the period, a high therapeutic effect is expected for allergic diseases such as chronic bronchial asthma and atopic dermatitis.
Furthermore, due to recent advances in protein engineering and genetic engineering, single-chain antibodies [Science,242, 423 (1988)] or disulfide stabilized antibody [Molecular Immunology,32, 249 (1995)], and smaller antibody molecules have been produced. Single-chain antibodies and disulfide-stabilized antibodies are smaller in molecular weight than monoclonal antibodies or humanized antibodies, so they are excellent in tissue migration and clearance from the blood, applied to imaging, etc., and complexed with toxins Is also produced and is expected to have therapeutic effects [Cancer Research,55, 318 (1995)]. If a single-chain antibody and a disulfide-stabilized antibody that specifically bind to human IL-5Rα chain can be produced, high diagnostic and therapeutic effects for allergic diseases and the like are expected. However, no single chain antibody or disulfide stabilized antibody against human IL-5Rα chain has been reported so far.
Disclosure of the invention
The present inventors have made N-terminal amino acids 1 to 313 corresponding to the extracellular region lacking the transmembrane region of human IL-5Rα chain (hereinafter, human IL-5Rα chain is also referred to as hIL-5Rα chain). An antibody against hIL-5Rα chain that recognizes an existing epitope is found to specifically react with human interleukin 5 receptor α chain by immunocytostaining and to suppress the biological activity of human interleukin 5 It was. If these antibodies are used, the allergic disease can be diagnosed and treated.
Accordingly, the present invention provides an antibody that specifically reacts with human IL-5Rα chain. The antibodies in the present invention include monoclonal antibodies, humanized antibodies, single chain antibodies, disulfide stabilized antibodies and the like. The monoclonal antibody in the present invention may be any antibody as long as it specifically reacts with the hIL-5Rα chain, but preferred is one established by the production method described below. That is, by preparing hIL-5Rα protein as an antigen and immunizing animals capable of producing hybridomas such as mice, rats, hamsters, rabbits, etc., to induce plasma cells having antigen specificity, The anti-IL-5Rα monoclonal antibody can be obtained by fusing it with a myeloma cell line, preparing a hybridoma having the ability to produce monoclonal antibodies, and culturing the hybridoma. As the monoclonal antibody of the present invention, a monoclonal antibody that recognizes the epitope present at positions 1 to 313 from the N-terminal amino acid of human IL-5Rα chain and specifically reacts with human IL-5Rα chain by immunohistochemical staining, and Examples thereof include a monoclonal antibody that recognizes an epitope present at positions 1 to 313 from the N-terminal amino acid of human IL-5Rα chain and suppresses the biological activity of IL-5. As the monoclonal antibody belonging to the former, the monoclonal antibody KM1257 produced by the hybridoma strain KM1257 (FERM BP-5133), and as the monoclonal antibody belonging to the latter, the monoclonal antibody KM1259 and the hybridoma strain produced by the hybridoma strain KM1259 (FERM BP-5134) A specific example is the monoclonal antibody KM1486 produced by KM1486 (FERM BP-5651).
The monoclonal antibody of the present invention reacts immunologically with human IL-5Rα chain, cells expressing human IL-5Rα chain on the cell surface, human eosinophils and the like. The monoclonal antibody of the present invention reacts immunologically with a soluble human IL-5Rα chain. Therefore, the present invention also provides a method for immunologically detecting and quantifying human IL-5Rα chain, cells expressing human IL-5Rα chain on the cell surface, human eosinophils and soluble human IL-5Rα chain. These detection and quantitative results can be used for diagnosis and treatment of allergic diseases such as chronic bronchial asthma and atopic dermatitis.
Furthermore, the present invention provides a humanized antibody that has fewer side effects than a monoclonal antibody, has a prolonged half-life in blood, and inhibits the biological activity of IL-5, which is more desirable as a therapeutic agent. The humanized antibody in the present invention is a general term for a human chimeric antibody and a human CDR-grafted antibody.
Human chimeric antibodies are non-human animal antibody variable region heavy chain (hereinafter referred to as VH) and variable region light chain (hereinafter referred to as VL) and human antibody constant region heavy chain (hereinafter referred to as CH). ) And the constant region light chain of human antibody (hereinafter referred to as CL), and human CDR-grafted antibody refers to the CDR sequences of VH and VL of human antibodies and those of non-human animals. It means an antibody substituted with CDR sequences of VH and VL, respectively. Anti-hIL-5Rα chain human chimeric antibody that inhibits IL-5 biological activity encodes VH and VL from a hybridoma that produces an antibody that reacts with human IL-5Rα chain and can inhibit the biological activity of IL-5 Obtain cDNA and insert it into animal cell expression vectors containing genes encoding human antibody CH and human antibody CL to construct human chimeric antibody expression vectors and introduce them into animal cells for expression and production. Can do. The human chimeric antibody and human CDR-grafted antibody of the present invention may belong to any immunoglobulin (Ig) class, but those of IgG type are preferred, and IgG1, IgG2, IgG3 and IgG4 belonging to IgG type are also preferred. Any of the immunoglobulin C regions can be used.
As an example of the human chimeric antibody of the present invention, VH of the antibody contains the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 94, CH is the human antibody IgG1, VL of the antibody contains the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 95, and CL is An example is an antibody that is a human antibody κ, and a specific example is KM1399. A specific example of a human chimeric antibody in which CH is a human antibody IgG4 is KM7399. An example of a transformed strain that produces KM1399 is KM1399 (FERM BP-5650). An example of a transformant producing KM7399 is KM7399 (FERM BP-5649).
Further, anti-hIL-5Rα chain human CDR-grafted antibody that inhibits the biological activity of IL-5 reacts with human IL-5Rα chain, and VH of an antibody of a non-human animal that can inhibit the biological activity of IL-5 and An expression vector for animal cells that constructs a cDNA encoding the V region in which the VH and VL CDR sequences of any human antibody are replaced with the CDR sequences of the VL, and has genes encoding the human antibody CH and the human antibody CL. The human CDR-grafted antibody expression vector can be constructed by inserting each into, and introduced into animal cells for expression and production. As an example of the human CDR-grafted antibody of the present invention, the VH of the antibody contains the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 72, the CH is the human antibody IgG1, the VL of the antibody contains the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 63, and CL Is a human antibody κ, and a specific example is KM8399. A specific example of a human CDR-grafted antibody in which CH is a human antibody IgG4 is KM9399. An example of a transformed strain that produces KM8399 is KM8399 (FERM BP-5648). An example of a transformed strain that produces KM9399 is KM9399 (FERM BP-5647).
The humanized antibody of the present invention immunologically reacts with human IL-5Rα chain, cells expressing human IL-5Rα chain on the cell surface, human eosinophils and the like. Therefore, the present invention can be used for diagnosis and treatment of allergic diseases such as chronic bronchial asthma and atopic dermatitis.
Furthermore, the present invention provides a single chain antibody (single chain Fv; hereinafter referred to as scFv) or a disulfide stabilized antibody (hereinafter referred to as dsFv) that exhibits binding to human IL-5Rα chain. To do.
A single-chain antibody (scFv) is a VH-L-VL or VL-L-VH poly- mer in which one VH and one VL are linked using an appropriate peptide linker (hereinafter referred to as L). Peptide is shown. As VH and VL contained in the scFv of the present invention, either an anti-human IL-5Rα chain monoclonal antibody or a human CDR-grafted antibody can be used.
A disulfide-stabilized antibody (dsFv) refers to an antibody in which a polypeptide in which one amino acid residue in each of VH and VL is substituted with a cysteine residue is bound via a disulfide bond. The amino acid residue to be substituted for the cysteine residue was determined by the method shown by Reiter et al. [Protein Engineering,7697 (1994)], and can be selected based on the prediction of the three-dimensional structure of the antibody. As VH or VL contained in the disulfide stabilized antibody of the present invention, either mouse anti-human IL-5Rα chain monoclonal antibody or human CDR-grafted antibody can be used.
A single-chain antibody that binds to human IL-5Rα chain is obtained by obtaining cDNA encoding VH and VL from a hybridoma producing an antibody that reacts with human IL-5Rα chain. It can be constructed and expressed by introducing it into E. coli, yeast, or animal cells. An example of a single chain antibody derived from the monoclonal antibody of the present invention is an antibody in which the VH of the antibody includes the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 94 and the VL includes the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 95. Examples of the single-chain antibody derived from the human CDR-grafted antibody of the present invention include an antibody in which the VH of the antibody contains the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 102 and the VL contains the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 99.
For disulfide stabilized antibodies that bind to human IL-5Rα chain, cDNA encoding VH and VL is obtained from a hybridoma producing an antibody that reacts with human IL-5Rα chain, and inserted into an appropriate expression vector. The expression vector can be expressed and produced by introducing it into Escherichia coli, yeast, or animal cells. Examples of the single chain antibody derived from the monoclonal antibody of the present invention include an antibody in which the VH of the antibody comprises the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 94 and the VL includes the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 95.
Examples of the disulfide stabilized antibody derived from the human CDR-grafted antibody of the present invention include an antibody in which the VH of the antibody comprises the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 102 and the VL contains the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 99.
The following are anti-human IL-5Rα chain monoclonal antibodies that specifically react with human IL-5Rα chain or inhibit the biological activity of human IL-5, anti-human IL-5Rα that inhibits the biological activity of human IL-5 Description of the production method of chain humanized antibody, anti-human IL-5Rα chain single chain antibody and anti-human IL-5Rα chain disulfide stabilized antibody, and detection and quantification of human interleukin 5 receptor α chain using the antibody To do.
1. Production of anti-hIL-5Rα monoclonal antibody
(1) Preparation of antigen
Antigens required for the production of anti-hIL-5Rα monoclonal antibodies include cells that express hIL-5Rα on the cell surface or cell membrane fractions thereof, or CTLL-2 (h5 R) that expresses hIL-5Rα. Cells or cell membrane fractions thereof can be used. CTLL-2 (h5 R) cells are cDNAs encoding full-length hIL-5Rα that has already been cloned [Journal of Experimental Medicine (J. Exp. Med.),175, 341 (1992)] for animal cell expression vectors such as pCAGGS [Gene,108, 193 (1991)], electroporation method [Japanese Patent Laid-Open No. 2-257891, Cytotechnology,Three133 (1990)], hIL-5Rα-expressing cells constructed by introducing the expression vector into CTLL-2, a mouse T cell line.
In addition, the full length of cDNA encoding hIL-5Rα or a partial fragment thereof can be expressed in, for example, an expression vector such as commercially available pGEX (Pharmacia), pET system for expression in prokaryotic host cells such as E. coli. [Novagen] or pMKex1 described in Example 1 (11) can be incorporated to express the full length or partial fragment of hIL-5Rα as it is or as a fusion protein. The protein expressed by E. coli can be purified by methods such as SDS-polyacrylamide electrophoresis or affinity chromatography according to the properties of the fusion protein after disrupting the cells.
As a method for expressing the full-length or partial fragment of IL-5Rα as it is or as a fusion protein, eukaryotic host cells such as insect cells and mammalian cells can also be used.
In the case of mammalian cells, for example, pAGE107 [Cytotechnology,Three, 133 (1990)], pAGE103 [Journal of Biochemistry (J. Biochem.),1011307 (1987)], the full-length or partial fragment of cDNA encoding hIL-5Rα is incorporated into a vector such as pAGE210 described in Example 1 (1) using a known method to construct an expression vector for the protein. can do. In addition, in order to efficiently express the full-length or partial fragment of hIL-5Rα encoded by the cDNA as it is or as a fusion protein, the nucleotide sequence encoding the signal peptide in the cDNA and a high sequence in a eukaryotic host are required. It is preferable to replace the base sequence encoding the signal peptide of the protein that can be expressed. As the known protein signal peptide, for example, human growth hormone, anti-gandalioside GD3 chimeric antibody KM871 (Japanese Patent Laid-Open No. 5-304989) and the like are preferably used.
The expression vector constructed in this manner is applied to a host cell by electroporation [Japanese Patent Laid-Open No. 2-257891, Cytotechnology,Three, 133 (1990)], Lipofectin method [Procedure of the National Academy of Sciences (Proc. Natl. Acad. Sci.),84, 7413 (1987)] and the like. By culturing these cells in an appropriate medium, the full length or partial fragment of hIL-5Rα can be produced as it is or as a fusion protein in the cells or in the culture supernatant. As the medium, it is preferable to use a serum-free medium in order to facilitate purification of a partial fragment of hIL-5Rα produced in the culture supernatant or a fusion protein thereof.
In addition, in the case of insect cells, a recombinant baculovirus incorporating the full-length or partial fragment of cDNA encoding hIL-5Rα is prepared using a Pharmingen baculo gold starter kit, and insect cells such as Sf9 and Sf21 are produced. By infecting these recombinant viruses with (all manufactured by Pharmingen), the full-length or partial fragment of hIL-5Rα can be produced as it is or as a fusion protein in cells or in the culture supernatant [Biotechnology (Bio / Technology),6, 47 (1988)].
The full-length or partial fragment or fusion protein of hIL-5Rα produced by animal cells or insect cells is extracted from the culture supernatant according to known protein purification methods such as salting out, affinity chromatography, ion exchange chromatography and the like. It can be purified and used as an antigen. In particular, when it is produced as a fusion protein with an immunoglobulin constant region, it is preferably purified using an affinity column to which protein A or the like having specific affinity for the immunoglobulin constant region is immobilized.
(2) Animal immunity and preparation of antibody-producing cells
The animal used for immunization may be any mouse, rat, hamster, rabbit or the like as long as it can produce a hybridoma. In this specification, an example using a mouse or rat will be described. CTLL-2 cells expressing shIL-5Rα or hIL-5Rα on the cell surface [Journal of Experimental Medicine (J. Exp. Med.),177, 1523 (1993)] as an antigen, and antibody-producing cells are collected from the spleen, lymph nodes, and peripheral blood of the animal. Immunization is performed by administering the antigen subcutaneously, intravenously or intraperitoneally to the animal together with an appropriate adjuvant [for example, Complete Freund's Adjuvant or aluminum hydroxide gel and pertussis vaccine, etc.]. The antigen is administered 5 to 10 times every 1 to 2 weeks after the first administration. Three to seven days after each administration, blood is collected from the fundus venous plexus, and the serum reacts with the antigen by using an enzyme immunoassay [enzyme immunoassay (ELISA): 1976, published by the medical school).
A mouse or rat whose serum shows a sufficient antibody titer against cells expressing shIL-5Rα or hIL-5Rα used for immunization as a source of antibody-producing cells.
When the spleen cells and myeloma cells are fused, the spleen is removed from the immunized mouse 3 to 7 days after the final administration of the antigen substance, and the spleen cells are collected. Shred the spleen in MEM medium (Nissui Pharmaceutical), loosen with tweezers, centrifuge (1,200 rpm, 5 minutes), discard the supernatant, and tris-ammonium chloride buffer (pH 7.65). Treated for 1-2 minutes to remove red blood cells, washed 3 times with MEM medium and provided as fusion splenocytes.
(3) Preparation of myeloma cells
As myeloma cells, cell lines obtained from mice or rats are used. For example, 8-azaguanine resistant mice (derived from BALB / c) myeloma cell line P3-X63Ag8-U1 (P3-U1) [Curr. Topics Microbiol. Immunol. ,81, 1 (1978), European Journal of Immunology (Europ.J.Immunol.),6, 511 (1976)], SP2 / 0-Ag14 (SP-2) [Nature,276, 269 (1978)], P3-X63-Ag8653 (653) [Journal of Immunology (J. Immunol.),one two Three, 1548 (1979)], P3-X63-Ag8 (X63) [Nature,256, 495 (1975)]. These cell lines consisted of 8-azaguanine medium [RPMI-1640 medium with glutamine (1.5 mM), 2-mercaptoethanol (5 × 10 5-FiveM), gentamicin (10 μg / ml) and fetal calf serum (FCS) (CSL, 10%) were added to the medium (hereinafter referred to as normal medium), and 8-azaguanine (15 μg / ml) was further added. Medium], but subculture to normal medium 3-4 days before cell fusion and 2 × 10 on the day of fusion.7Secure the number of cells.
(4) Cell fusion
The antibody-producing cells immunized in 1 (2) and the myeloma cells obtained in 1 (3) are mixed with MEM medium or PBS (1.83 g disodium phosphate, 0.21 g monopotassium phosphate, 7.65 g sodium chloride, distilled water 1 Wash well with 1 liter, pH 7.2), mix so that the number of cells is antibody-producing cells: myeloma cells = 5-10: 1, centrifuge (1,200 rpm, 5 minutes), and discard the supernatant. After thoroughly disaggregating the precipitated cells, the mixture was mixed at 37 ° C. with 2 g of polyethylene glycol-1000 (PEG-1000) 2 g, MEM 2 ml and dimethyl sulfoxide (DMSO) 0.7 ml 0.2-1 ml / 108Add antibody-producing cells, add 1-2 ml of MEM medium several times every 1-2 minutes, and then add MEM medium to a total volume of 50 ml. After centrifugation (900 rpm, 5 minutes), discard the supernatant, loosen the cells gently, suck with a pipette, and blow gently to remove the cells into the HAT medium [normal medium with hypoxanthine (10-FourM), thymidine (1.5 × 10-FiveM) and aminopterin (4 × 10-7Suspended in 100 ml of medium supplemented with
Dispense this suspension into a 96-well culture plate at 100 μl / well and add 5% CO2Incubate at 37 ° C for 7-14 days in an incubator.
After culturing, a part of the culture supernatant is removed and the enzyme immunoassay method described in 1 (5) is used to specifically bind to a recombinant protein such as a fusion protein with shIL-5Rα or hIL-5R described in 1 (1) above. Select wells to react. Next, cloning was repeated twice by the limiting dilution method (first time using HT medium (the medium obtained by removing aminopterin from HAT medium), and the second time using normal medium), and a stable and strong antibody titer was observed. Is selected as a hybridoma strain producing mouse or rat anti-hIL-5Rα monoclonal antibody.
(5) Selection of mouse or rat anti-human IL-5Rα monoclonal antibody
Selection of hybridomas producing mouse or rat anti-hIL-5Rα monoclonal antibodies is described below according to the methods described in Antibodies [Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Chapter 14 (1988)]. Perform by measurement method. By these methods, an anti-hIL-5Rα antibody or all purified anti-hIL- contained in the culture supernatant of a transformant producing an anti-hIL-5Rα humanized antibody, a single-chain antibody and a disulfide-stabilized antibody described later. The activity of 5Rα antibody can also be measured.
A recombinant protein such as shIL-5Rα or hIL-5Rα described in 1 (1) above is coated on an appropriate plate, and the hybridoma culture supernatant or the purified antibody obtained in 1 (6) is used as the first antibody. Then, after reacting with anti-mouse immunoglobulin antibody or anti-rat immunoglobulin antibody labeled with biotin, enzyme, chemiluminescent substance or radiation compound as the second antibody, the reaction is performed according to the labeled substance, and hIL-5Rα Those specifically reacting with the above are selected as hybridomas producing mouse anti-hIL-5Rα monoclonal antibodies.
When the culture supernatant of a transformant producing an anti-hIL-5Rα humanized antibody, a single chain antibody and a disulfide stabilized antibody or a purified antibody thereof is reacted as the first antibody, biotin is used as the second antibody. Detection is carried out by using an anti-human immunoglobulin antibody labeled with an enzyme, a chemiluminescent substance, a radiation compound or the like, and performing a reaction according to the labeling substance.
In addition, a recombinant protein such as shIL-5Rα or hIL-5Rα as described in 1 (1) above is coated on an appropriate plate, hybridoma culture supernatant, anti-hIL-5Rα humanized antibody, single chain antibody Then, the reaction is performed by mixing human IL-5 labeled with biotin, enzyme, chemiluminescent substance or radiation compound, etc. Then, by performing a reaction according to the labeling substance, the binding inhibitory activity of human IL-5 to human IL-5Rα can be measured. Using this method, hybridomas are screened to select those having high human IL-5 inhibitory activity.
(6) Preparation of mouse or rat monoclonal antibody
Obtained in the above 1 (3) to 8-10 week old mice or nude mice treated with pristane [0.5 ml of 2,6,10,14-tetramethylpentadecane (Pristane) intraperitoneally and bred for 2 weeks] Mouse or rat anti-hIL-5Rα monoclonal antibody-producing hybridoma cells 2 × 107~ 5 × 106Cells / animals are injected intraperitoneally. The hybridoma becomes ascites tumor in 10-21 days. Ascites was collected from this mouse, centrifuged (3,000 rpm, 5 minutes) to remove solids, salted out with 40-50% saturated ammonium sulfate, caprylic acid precipitation method, DEAE-Sepharose column, Protein A column Alternatively, it is passed through a column of Cellulofine GSL2000 (manufactured by Seikagaku Corporation), and IgG or IgM fractions are collected and used as a purified monoclonal antibody.
The subclass of the antibody is determined using a mouse monoclonal antibody typing kit or a rat monoclonal antibody typing kit. The protein mass is calculated from the Raleigh method or absorbance at 280 nm.
2. Production of anti-human IL-5Rα humanized antibody
(1) Construction of humanized antibody expression vector
A humanized antibody expression vector necessary for producing a humanized antibody from an antibody of a non-human animal is constructed. A humanized antibody expression vector is an expression vector for animal cells in which genes encoding CH and CL, which are C regions of human antibodies, are incorporated, and the expression vector for animal cells encodes CH and CL of a human antibody. It was constructed by inserting each gene. As the C region of the human antibody, for example, the C region of any human antibody such as Cγ1 and Cγ4 for the human antibody H chain and Cκ for the human antibody L chain can be used. As a gene encoding the C region of a human antibody, chromosomal DNA consisting of exons and introns can be used, and cDNA can also be used. Any expression vector for animal cells can be used as long as it can incorporate and express a gene encoding the human antibody C region. For example, pAGE107 [Cytotechnology,3,133 (1990)], pAGE103 [Journal of Biochemistry (J. Biochem.),101,1307 (1987)], pHSG274 [Gene,27, 223 (1984)], pKCR [Procedure of the National Academy of Sciences (Proc.Natl.Acad.Sci.),78, 1527 (1981)], pSG1βd2-4 [Cytotechnology],Four, 173 (1990)]. Promoters and enhancers used in animal cell expression vectors include SV40 early promoters and enhancers [J. Biochem.101,1307 (1987)], LTR promoter and enhancer of Moloney murine leukemia virus [Biochemical and Biophysical Research Communications (Biochem. Biophys. Res. Comun.),149,960 (1987)], and immunoglobulin heavy chain promoter [Cell, 41, 479 (1985)] and enhancer [Cell, 33, 717 (1983)].
The humanized antibody expression vector can be used with either the type in which the antibody H chain and L chain are on separate vectors or the type (tandem type) on the same vector, but the humanized antibody expression vector The tandem humanized antibody expression vector is easy to construct, can be easily introduced into animal cells, and can balance the expression levels of antibody H and L chains in animal cells. [Journal of Immunological Methods (J. Immunol. Methods),167, 271 (1994)].
(2) Acquisition of cDNAs encoding VH and VL of non-human animal antibodies
Non-human animal antibodies, for example, cDNAs encoding mouse anti-human IL-5Rα chain monoclonal antibody VH and VL are obtained as follows.
MRNA is extracted from a cell producing an anti-human IL-5Rα chain monoclonal antibody, such as a mouse anti-human IL-5Rα chain antibody-producing hybridoma, and cDNA is synthesized. The synthesized cDNA is inserted into a vector such as a phage or a plasmid to prepare a cDNA library. From the library, a non-human animal antibody, for example, a recombinant phage or recombinant plasmid having a cDNA encoding VH using a C region portion or V region portion of a mouse antibody as a probe, and a cDNA encoding VL Recombinant phage or recombinant plasmid having The entire base sequence of VH and VL of the target antibody on the recombinant phage or recombinant plasmid is determined, and the entire amino acid sequence of VH and VL is deduced from the base sequence.
(3) Construction of human chimeric antibody expression vector
A human-type chimera is inserted upstream of the gene encoding the human antibody CH and CL of the humanized antibody expression vector constructed in 2 (1) above, and encoding the VH and VL of the non-human animal antibody. Antibody expression vectors can be constructed. For example, restriction enzyme recognition sequences for cloning cDNAs encoding non-human animal antibodies VH and VL are provided upstream of the human antibody CH and CL encoding genes of the chimeric antibody expression vector. A human chimeric antibody expression vector can be produced by inserting a cDNA encoding the V region of an antibody of a non-human animal into this cloning site via the synthetic DNA described below. Synthetic DNA is composed of a base sequence on the 3 ′ end side of the V region of an antibody of a non-human animal and a base sequence on the 5 ′ end side of the C region of a human antibody. It is manufactured using a DNA synthesizer.
(4) Identification of CDR sequences of non-human animal antibodies
VH and VL, which form the antigen-binding site of an antibody, are four complementarity sequences that are relatively conserved in the sequence (hereinafter referred to as the FR region) and three complementarities rich in changes in the sequence connecting them. It consists of a decision region (CDR) [Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services, 1991]. And each CDR amino acid sequence (CDR sequence) is the amino acid sequence of known antibody V region [Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services , 1991] can be identified.
(5) Construction of cDNA encoding V region of human CDR-grafted antibody
CDNA encoding VH and VL of a human CDR-grafted antibody can be obtained as follows.
First, the FR amino acid sequence of the V region of the human antibody for transplanting the CDR of the V region of the antibody of the target non-human animal is selected for each of VH and VL. As the amino acid sequence of FR of the V region of a human antibody, any amino acid sequence of FR of the V region derived from a human antibody can be used. For example, the amino acid sequence of the FR region of the V region of a human antibody registered in the Protein Data Bank, the common amino acid sequence of each subgroup of the FR region of the V region of a human antibody [Sequences of Proteins of Immunological Interest (Sequences of Proteins of Immunological Interest), US Dept. Health and Human Services, 1991]. In order to create a human CDR-grafted antibody having sufficient activity, the antibody of the target non-human animal It is desirable to have high homology with the amino acid sequence of the V region. Next, the DNA sequence encoding the amino acid sequence of the FR of the V region of the selected human antibody and the DNA sequence encoding the amino acid sequence of the CDR of the V region of the antibody of the target non-human animal are ligated, and VH, VL A DNA sequence encoding each amino acid sequence is designed. In order to obtain the DNA sequence designed to construct the CDR-grafted antibody variable region gene, several synthetic DNAs are designed for each chain so as to cover the entire DNA sequence, and they are used for polymerase chain reaction. (Polymerase Chain Reaction; hereinafter referred to as PCR). Six synthetic DNAs are preferably designed for each strand based on the reaction efficiency in PCR and the length of DNA that can be synthesized. After the reaction, the amplified fragment is subcloned into an appropriate vector, its base sequence is determined, and a plasmid containing cDNA encoding the amino acid sequence of the V region of each chain of the target human CDR-grafted antibody is obtained. In addition, by synthesizing all sequences of both sense and antisense using synthetic DNA consisting of about 100 bases, and then annealing and linking them, the amino acid sequence of the V region of each chain of the target human CDR-grafted antibody is encoded. CDNA can also be constructed.
(6) Modification of amino acid sequence of V region of human CDR-grafted antibody
A human CDR-grafted antibody can be obtained by simply grafting only the CDR of the V region of the target non-human animal antibody between the FRs of the V region of the human antibody. It is known to decrease compared to activity [Biotechnology (BIO / TECHNOLOGY),9, 266 (1991)]. Therefore, among the FR amino acid sequences of the V region of human antibodies, the amino acid residues directly involved in antigen binding, the amino acid residues interacting with the CDR amino acid residues, or the three-dimensional structure of the antibody It has been practiced to increase the activity by altering amino acid residues that have the possibility of being involved in maintenance or the like to amino acid residues found in the antibody of the original non-human animal. And in order to identify those amino acid residues efficiently, the construction and analysis of the three-dimensional structure of the antibody using X-ray crystallography or computer modeling are performed. However, a method for producing a human CDR-grafted antibody that can be applied to any antibody has not yet been established, and at present, various trials and errors are required depending on individual antibodies.
Modification of the amino acid sequence of the FR of the V region of the selected human antibody can be achieved by performing the PCR described in 2 (5) above using various mutagenesis primers. After subcloning the amplified fragment after PCR into an appropriate vector, its base sequence is determined, and a vector containing the cDNA into which the target mutation has been introduced (hereinafter referred to as an amino acid sequence modified vector) is obtained.
Moreover, if the amino acid sequence of a narrow region is modified, it can be performed by PCR mutagenesis using a mutagenesis primer comprising 20 to 35 bases. Specifically, a sense mutation primer and an antisense mutation primer consisting of 20 to 35 bases including a DNA sequence encoding a modified amino acid residue are synthesized, and a cDNA encoding the amino acid sequence of the V region to be modified is included. Two-step PCR is performed using the plasmid as a template. After subcloning the final amplified fragment into an appropriate vector, its base sequence is determined, and an amino acid sequence modified vector containing cDNA into which the target mutation has been introduced is obtained.
(7) Construction of human CDR-grafted antibody expression vector
The human CDR-grafted antibody VH and VL obtained in 2 (5) and 2 (6) above the gene encoding human antibody CH and CL of the humanized antibody expression vector of 2 (1) above. The coding cDNA can be inserted to construct a human CDR-grafted antibody expression vector. For example, a recognition sequence for an appropriate restriction enzyme is introduced at the end of the 5'- and 3'-end synthetic DNA during PCR to construct cDNA encoding the VH and VL amino acid sequences of the human CDR-grafted antibody. Then, it can be inserted upstream of the gene encoding the C region of the desired human antibody so that they are expressed in an appropriate form.
(8) Transient expression of humanized antibody and evaluation of activity
In order to efficiently evaluate the activity of various types of humanized antibodies, the human chimeric antibody expression vector 2 (3) and the human CDR-grafted antibody expression vector 2 (7) or modified vectors thereof are used. Introduced into COS-7 cells (ATCC CRL1651) for transient expression of humanized antibodies [Methods in Nucleic Acids Res., CRC Press, p.283,1991] The activity can be measured.
Methods for introducing expression vectors into COS-7 cells include the DEAE-dextran method [Methods in Nucleic Acids Res., CRC Press, p.283, 1991], the lipofection method [ Proceeding of the National Academy of Science [Proc.Natl.Acad.Sci.,847413 (1987)].
After the introduction of the vector, the activity of the humanized antibody in the culture supernatant can be measured by the enzyme immunoassay (ELISA method) described in 1 (5) above.
(9) Stable (stable) expression and activity evaluation of humanized antibodies
Obtaining a transformant capable of stably producing a humanized antibody by introducing the human chimeric antibody expression vector 2 (3) and the human CDR-grafted antibody expression vector 2 (7) into an appropriate host cell. Can do.
As a method for introducing an expression vector into a host cell, an electroporation method [Japanese Patent Laid-Open No. 2-257891, Cytotechnology,Three, 133, (1990)].
As a host cell into which a humanized antibody expression vector is introduced, any cell can be used as long as it can express a humanized antibody. For example, mouse SP2 / 0-Ag14 cells (ATCC CRL1581), mouse P3X63-Ag8.653 cells (ATCC CRL1580), CHO cells deficient in dihydrofolate reductase gene (hereinafter referred to as DHFR gene) [Procedure of the・ National Academy of Science (Proc.Natl.Acad.Sci.),77, 4216, (1980)], rat YB2 / 3HL.P2.G11.16Ag.20 cells (ATCC CRL1662, hereinafter referred to as YB2 / 0 cells) and the like.
After the introduction of the vector, a transformant that stably produces a humanized antibody is selected using RPMI1640 medium containing G418 and FCS according to the method disclosed in JP-A-2-57891. By culturing the obtained transformant in a medium, the humanized antibody can be produced and accumulated in the culture solution. The activity of the humanized antibody in the culture solution is measured by the method described in 1 (5) above. Further, the transformed strain can increase the production amount of the humanized antibody using a DHFR gene amplification system or the like according to the method disclosed in JP-A-2-57891.
The humanized antibody can be purified from the culture supernatant of the transformant using a protein A column [Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Chapter 8, 1988]. In addition, purification methods used for ordinary proteins can be used. For example, it can be purified by a combination of gel filtration, ion exchange chromatography and ultrafiltration. The molecular weight of the purified humanized antibody H chain, L chain, or whole antibody molecule can be determined by polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) [Nature,227, 680, (1970)] or Western blotting [Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Chapter 12, 1988].
The reactivity of the purified humanized antibody and the inhibitory activity of the humanized antibody against IL-5 can be measured by the method described in 1 (5) above.
(10) Method for using humanized antibody
The humanized antibody of the present invention can specifically bind to human IL-5Rα chain and inhibit the biological activity of IL-5. Therefore, the humanized antibody provided by the present invention is expected to inhibit the function of eosinophils whose differentiation and proliferation are controlled by IL-5. Therefore, it is considered useful for the treatment of diseases in which eosinophils are involved in the pathogenesis. In addition, since most of the portion is derived from the amino acid sequence of a human antibody compared to an antibody of a non-human animal, it is not expected to show immunogenicity in the human body and the effect is expected to last for a long period of time. The humanized antibody of the present invention can be used alone or in combination with at least one pharmaceutically acceptable adjuvant. For example, the humanized antibody is dissolved in an aqueous solution of physiological saline, glucose, lactose, mannitol or the like to obtain a suitable pharmaceutical composition. Alternatively, a humanized antibody is lyophilized according to a conventional method, and sodium chloride is added thereto to prepare a powder injection. The pharmaceutical composition can contain additives well known in the pharmaceutical field, for example, pharmaceutically acceptable salts and the like, if necessary.
Although the dosage of this pharmaceutical composition varies depending on the age, symptoms, etc. of the patient, 0.1 to 20 mg / kg / day of humanized antibody is administered to mammals including humans. Administration is once daily (single dose or daily dose) or intermittently by intravenous injection 1 to 3 times a week, once every 2 or 3 weeks.
3. Production of anti-human IL-5Rα single chain antibody
(1) Construction of single chain antibody expression vector
Inserting cDNA encoding VH and VL of non-human animal antibody or human CDR-grafted antibody described in 2 (2), 2 (5) and 2 (6) above into a single-chain antibody expression vector Thus, an expression vector for a single-chain antibody of a non-human animal antibody or a single-chain antibody of a human CDR-grafted antibody can be constructed. As the single-chain antibody expression vector used herein, any vector can be used as long as it can incorporate and express antibodies encoding non-human animal antibodies or VH and VL of human CDR-grafted antibodies. For example, pAGE107 [Cytotechnology,Three, 133 (1990)], pAGE103 [Journal of Biochemistry (J. Biochem.),101, 1307 (1987)], pHSG274 [Gene,27, 223 (1984)], pKCR [Procedure of the National Academy of Sciences (Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.),78, 1527 (1981)], pSG1βd2-4 [Cytotechnology,Four, 173 (1990)]. As a host for expressing a single-chain antibody, an appropriate one can be selected from Escherichia coli, yeast, animal cells, etc., but in this case, an expression vector suitable for each host is used. It is necessary to select. Further, by inserting a cDNA encoding an appropriate signal peptide into an expression vector, the single-chain antibody can be secreted outside the cell, transported to the periplasmic region, or can remain in the cell.
By inserting a cDNA encoding a single chain antibody consisting of VH-L-VL or VL-L-VH (L is a peptide linker) into the selected expression vector, downstream of an appropriate promoter and signal peptide, A single-chain antibody expression vector into which a cDNA encoding the desired single-chain antibody is inserted can be constructed.
A cDNA encoding a single-chain antibody is obtained by linking a cDNA encoding VH and a cDNA encoding VL using a synthetic DNA encoding a peptide linker having an appropriate restriction enzyme recognition sequence at both ends. be able to. It is important to optimize the linker peptide so that the addition does not interfere with the binding of VH and VL to the antigen, such as that shown by Pantolano et al. [Biochemistry,30, 10117 (1991)] or a modified version thereof.
(2) Expression and activity evaluation of single chain antibody
The single-chain antibody expression vector constructed in 3 (1) above was electroporated [JP-A-2-57891, Cytotechnology,Three.133 (1990)] or the like can be used to obtain a transformant that produces the desired single-chain antibody. After the introduction of the expression vector, the activity of the single chain antibody contained in the culture supernatant or the like can be measured by the method described in 1 (5) above.
Recovery and purification of the single chain antibody of the present invention can be achieved by combining known techniques. For example, if the single chain antibody is secreted into the medium, it can be concentrated by ultrafiltration and then achieved by performing antigen affinity chromatography or ion exchange chromatography or gel filtration. Alternatively, if transported to the periplasmic region of the host cell, the cell can be osmotic shocked and concentrated by ultrafiltration, followed by antigen affinity chromatography or ion exchange chromatography or gel filtration. This can be achieved. Single chain antibodies that are insoluble and present as granules (inclusion bodies) are repeatedly lysed, centrifuged and washed to isolate the granules, eg, solubilized with guanidine-hydrochloric acid, and again This can be achieved by manipulation leading to a structure having the activity of the present chain antibody, followed by purification of the active molecule.
The activity of the purified single chain antibody can be measured by the method described in 1 (5) above.
(3) How to use single chain antibody
The single-chain antibody of the present invention specifically binds to human IL-5Rα chain and can inhibit the biological activity of IL-5. Therefore, the single-chain antibody provided by the present invention is expected to inhibit the function of eosinophils whose differentiation and proliferation are controlled by IL-5. Therefore, it is considered useful for the treatment of diseases in which eosinophils are involved in the pathogenesis. The single-chain antibody of the present invention can be used alone or in combination with at least one pharmaceutically acceptable adjuvant. For example, a single chain antibody is dissolved in an aqueous solution of physiological saline, glucose, lactose, mannitol or the like to obtain a suitable pharmaceutical composition. Alternatively, a single-chain antibody is lyophilized according to a conventional method, and sodium chloride is added thereto to prepare a powder injection. The pharmaceutical composition can contain additives well known in the pharmaceutical field, for example, pharmaceutically acceptable salts and the like, if necessary.
The dose of the pharmaceutical composition varies depending on the age, symptoms, etc. of the patient, but a single chain antibody is administered to a mammal including humans at 0.1 to 20 mg / kg / day. Administration is once daily (single dose or daily dose) or intermittently by intravenous injection 1 to 3 times a week, once every 2 or 3 weeks.
4). Preparation of anti-human IL-5Rα disulfide stabilized antibody
(1) Preparation of disulfide stabilized antibody
Disulfide-stabilized antibody is a DNA sequence corresponding to one amino acid residue at the appropriate position of cDNA encoding VH and VL of a non-human animal antibody or cDNA encoding VH and VL of a human CDR-grafted antibody. Is modified to a DNA sequence corresponding to a cysteine residue, expressed and purified, and then formed by forming a disulfide bond. Modification of an amino acid residue to a cysteine residue can be performed by the mutagenesis method using the PCR described in 2 (5) above.
A disulfide stabilized antibody H chain expression vector and a disulfide stabilized antibody L chain expression vector can be constructed by inserting the obtained cDNA encoding modified VH and modified VL into an appropriate expression vector. Any disulfide-stabilized antibody expression vector can be used as long as it can incorporate and express cDNA encoding modified VH and modified VL. For example, pAGE107 [Cytotechnology,3,133 (1990)], pAGE103 [Journal of Biochemistry (J. Biochem.),101,1307 (1987)], pHSG274 [Gene, 27, 223 (1984)], pKCR [Procedure of the National Academy of Sciences (Proc.Natl.Acad.Sci.),78, 1527 (1981)], pSG1βd2-4 [Cytotechnology],Four, 173 (1990)]. Select an appropriate host from among E. coli, yeast, animal cells, etc. to express the disulfide stabilized antibody L chain expression vector and the disulfide stabilized antibody H chain expression vector to form the disulfide stabilized antibody. In this case, it is necessary to select an expression vector suitable for each host. Further, by inserting a cDNA encoding an appropriate signal peptide into an expression vector, the disulfide-stabilized antibody can be secreted out of the cell, transported to the periplasmic region, or can remain in the cell.
(2) Expression and activity evaluation of disulfide stabilized antibodies
The disulfide stabilized antibody H chain expression vector or the disulfide stabilized antibody L chain expression vector constructed in 4 (1) above is electroporated [Japanese Patent Laid-Open No. 2-257891, Cytotechnology,Three, 133 (1990)] or the like, a transformed strain producing the target disulfide stabilized antibody H chain or disulfide stabilized antibody L chain can be obtained. After the introduction of the expression vector, the expression of the disulfide stabilized antibody H chain or disulfide stabilized antibody L chain contained in the culture supernatant or the like can be confirmed by the method described in 1 (5) above.
Recovery and purification of the disulfide stabilized antibody H chain or disulfide stabilized antibody L chain can be achieved by combining known techniques. For example, if the disulfide stabilized antibody H chain or the disulfide stabilized antibody L chain is secreted into the medium, it can be concentrated by ultrafiltration, and then achieved by performing various chromatography or gel filtration. Can do. In addition, if it is transported to the periplasmic region of the host cell, the cell can be subjected to osmotic shock, concentrated by ultrafiltration, and then performed by performing various types of chromatography or gel filtration. Can do. Disulfide-stabilized antibody H chain or disulfide-stabilized antibody L chain, which is insoluble and present as granules (inclusion body), is used for lysis of cells, repeated centrifugation and washing to isolate granules, for example, guanidine -After solubilization with hydrochloric acid, it can be achieved by performing various types of chromatography or gel filtration.
Then, the purified disulfide stabilized antibody H chain and the disulfide stabilized antibody L chain are mixed and led to an active structure [refolding operation, Molecular Immunology,32, 249 (1995)], and then the active disulfide stabilized antibody can be purified by antigen affinity chromatography, ion exchange chromatography or gel filtration. The activity of the disulfide stabilized antibody can be measured by the method described in 1 (5) above.
(3) Method of using disulfide stabilized antibody
The disulfide stabilized antibody of the present invention specifically binds to human IL-5Rα chain and can inhibit the biological activity of IL-5. Therefore, the disulfide stabilized antibody provided by the present invention is expected to inhibit the function of eosinophils whose differentiation and proliferation are controlled by IL-5. Therefore, it is considered useful for the treatment of diseases in which eosinophils are involved in the pathogenesis. The disulfide stabilized antibody of the present invention can be used alone or in combination with at least one pharmaceutically acceptable adjuvant. For example, a single chain antibody or a disulfide stabilized antibody is dissolved in an aqueous solution of physiological saline, glucose, lactose, mannitol or the like to obtain a suitable pharmaceutical composition. Alternatively, a powder injection is prepared by lyophilizing a disulfide stabilized antibody according to a conventional method and adding sodium chloride thereto. The pharmaceutical composition can contain additives well known in the pharmaceutical field, for example, pharmaceutically acceptable salts and the like, if necessary.
The dosage of the present pharmaceutical composition varies depending on the age, symptoms, etc. of the patient, but the disulfide stabilized antibody is administered to mammals including humans at 0.1 to 20 mg / kg / day. Administration is once daily (single dose or daily dose) or intermittently by intravenous injection 1 to 3 times a week, once every 2 or 3 weeks.
5. Detection and quantification of human interleukin 5 receptor α chain using anti-human IL-5Rα antibody
(1) Immune cell staining using anti-human IL-5Rα antibody
For floating cells, remove adherent cells with trypsin EDTA, and then suspend in immune cell staining buffer (PBS containing 1% BSA, 0.02% EDTA, 0.05% sodium azide). 1 × 10Five~ 2 × 106Dispense into pieces. Culture supernatant of anti-human IL-5Rα monoclonal antibody-producing hybridoma obtained in 1 (4) above, culture supernatant of anti-human IL-5Rα humanized antibody transformant obtained in 2 (9) above, or The purified antibody obtained in 1 (6) or 2 (9), or the purified antibody labeled with an appropriate labeling substance such as biotin by a known method (enzymatic antibody method: interdisciplinary project 1985), 0.1 to Dispense 20-500μl each of the cells diluted with immune cell staining buffer or immune cell staining buffer containing 10% animal serum to a concentration of 50μg / ml, and react for 30 minutes under ice-cooling. Let Culture supernatant of mouse anti-human IL-5Rα monoclonal antibody-producing hybridoma obtained in 1 (4) above, culture supernatant of anti-human IL-5Rα humanized antibody transformant obtained in 2 (9) above or the above When the purified antibody obtained in 1 (6) or 2 (9) above is reacted, the cells are washed with an immune cell staining buffer after completion of the reaction and labeled with a fluorescent dye such as FITC or phycoerythrin. Dispense mouse immunoglobulin antibody, anti-rat immunoglobulin antibody or anti-human immunoglobulin antibody at a concentration of about 0.1 to 50 μg / ml in an amount of 50 to 500 μl, and shield from light for 30 minutes under ice-cooling. To react. When the biotin-labeled monoclonal antibody is reacted, 50 to 500 μl of streptavidin labeled with a fluorescent dye such as FITC or phycoerythrin is dispensed and allowed to react for 30 minutes under ice-cooling. When reacting with the monoclonal antibody labeled with a fluorescent dye such as FITC or phycoerythrin, dispense 50 to 500 μl of an immune cell staining buffer containing a concentration of about 0.1 to 50 μg / ml of the monoclonal antibody, React with light shielded for 30 minutes under water cooling. In either case, after the reaction, it is often washed with an immune cell staining buffer and analyzed with a cell sorter.
(2) Human IL-5-dependent cell growth inhibition test using anti-human IL-5Rα antibody
In order to show the biological activity inhibitory action of the obtained anti-human IL-5Rα antibody, human IL-5-dependent cells can be used to examine the effect on cell proliferation. Examples of the evaluation method include incorporation of tritium-labeled thymidine into cells, or a coloring method using a cell counting kit. Here, the coloring method used in the present invention will be described.
CTLL-2 (h5R) cell 1 × 10FourThe cells are suspended in 50 μl of normal medium and dispensed into a 96-well culture plate. To this was added 25 μl of the purified antibody solution of 0.01-50 μg / ml obtained in 1 (6) or 2 (9) above, and a normal medium containing 0.4-40 ng / ml human IL-5.237 ° C, CO in incubator2 Incubate for 24-72 hours under 5% airflow. Thereafter, the cell counting kit solution was added at 10 μl / well, and then the temperature was changed to 37 ° C., CO 2.2Incubate for 4 hours under 5% airflow. After completion of the culture, the absorbance at 450 nm is measured with a microwell plate reader Emax (manufactured by Molecular Devices), and the CTLL-2 (h5R) cell growth inhibitory activity of each antibody is calculated.
(3) Inhibition of human eosinophil survival by anti-human IL-5Rα antibody
Prepare human polymorphonuclear leukocyte fractions containing eosinophils from human peripheral blood using commercially available blood cell separation media such as polymorphprep (Nicomed) or Percoll (Pharmacia). . Suspend in normal medium and transfer the resulting cells to a 96-, 48- or 24-well cell culture plate.6~ 1 × 107Individual / well aliquots and human IL-5 is added to a final concentration of 0.001-10 ng / ml. Furthermore, the culture supernatant of the anti-human IL-5Rα monoclonal antibody-producing hybridoma obtained in 1 (4) above or the culture supernatant of the anti-human IL-5Rα humanized antibody-producing transformant obtained in 2 (9) above, Alternatively, add the purified antibody obtained in 1 (6) or 2 (9) above to add CO237 ° C, CO in incubator2 Incubate for 2-5 days under 5% airflow. After completion of the culture, cell specimens are prepared from each well and stained by the method such as the May-Gründwald Giemsa staining method (all of the staining methods: Ishiyaku Shuppan Publishing Co., Ltd. 1988). Ask for. By comparing the proportion of eosinophils in the absence of anti-human IL-5Rα antibody and the proportion of eosinophils in the presence of the antibody, the monoclonal antibody was compared with that of IL-5-dependent human eosinophils. Check if there is an inhibitory activity on survival prolongation.
(4) shIL-5Rα quantification with monoclonal antibody
The 0.1 to 50 μg / ml purified antibody obtained in 1 (6) or 2 (9) above is plate-coated as a primary antibody, and the 0.1 to 10,000 ng / ml purified shIL-5Rα obtained in 1 (1) above. Alternatively, a sample such as human serum is reacted. After thoroughly washing the plate, the anti-antibody used as the primary antibody among the purified antibodies obtained in 1 (6) or 2 (9) labeled with biotin, enzyme, chemiluminescent substance or radiation compound as a second antibody. After reacting with an anti-human IL-5Rα antibody that recognizes an epitope different from that of the human IL-5Rα antibody, a reaction according to the labeling substance is performed. A calibration curve is drawn based on the reactivity to purified shIL-5R, and the concentration of shIL-5R in the sample is calculated.
(5) Detection of shIL-5Rα by Western blotting
The purified shIL-5Rα obtained in 1 (1) above is fractionated by SDS polyacrylamide electrophoresis (SDS-PAGE), and then transferred to a polyvinylidene difluoride membrane [hereinafter referred to as PVDF membrane (Millipore)] . Soak in PBS containing 1-10% bovine serum albumin (BSA), leave at 4 ° C. overnight, block, and then wash well with PBS containing 0.05% Tween. The PVDF membrane is immersed in the culture supernatant of the hybridoma obtained in 1 (5) above or the purified antibody solution obtained in 1 (6) above at room temperature for 2 hours and washed well with PBS containing 0.05% Tween. Furthermore, the PVDF membrane is immersed in a solution containing anti-mouse immunoglobulin antibody or anti-rat immunoglobulin antibody labeled with biotin, enzyme, chemiluminescent substance, radiation compound, etc. as a second antibody for 1 hour at room temperature, and PBS containing 0.05% Tween Wash thoroughly with After thoroughly removing the washing solution, a reaction is carried out according to the labeling substance of the second antibody, and it is confirmed whether or not it reacts with a protein corresponding to the molecular weight of purified shIL-5Rα.
(6) Immunoprecipitation of shIL-5Rα
Aliquots of anti-mouse immunoglobulin antibody or anti-rat immunoglobulin antibody diluted 10 to 1000 times with PBS etc. in 96-well ELISA plastic plates are dispensed 50-200 μl / well at 4 ° C overnight or at room temperature Let it sit for 2 hours or longer to adsorb. After washing the plate with PBS, 300 μl / well of PBS containing 1-10% BSA or the like is dispensed and allowed to stand overnight at 4 ° C. or at room temperature for 30 minutes or more to perform blocking. After washing the plate with PBS, the culture supernatant of the hybridoma obtained in 1 (5) above or the purified antibody solution obtained in 1 (6) (0.01-50 μg / ml) in 50-200 μl / well. In addition, the antibody is adsorbed by allowing to stand at 4 ° C. overnight. After washing the plate, the shIL-5Rα obtained in 1 (1) above was diluted to a concentration of 0.1 to 100 μg / ml with PBS containing 1% BSA, and dispensed at 50 to 200 μl / well. React overnight at ° C. After the plate is washed with PBS containing 0.05% Tween or the like, a sample buffer for SDS-PAGE with a concentration of 1 to 5 times is dispensed in an amount of 50 to 200 μl / well and shaken at room temperature for 30 minutes or more. After diluting with PBS as necessary, add 5 to 25 μl of the solution per lane, fractionate by SDS-PAGE, and transfer to a PVDF membrane or the like according to a conventional method. The PVDF membrane is subjected to Western blotting by the method as described in 5 (5) above to detect shIL-5Rα.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 shows the construction process of plasmid pAGE210.
FIG. 2 shows the restriction map of plasmid pCAGGS-h5R.25.
FIG. 3 shows the construction process of plasmid pAI234.
FIG. 4 shows the construction process of plasmid pAI230.
FIG. 5 shows the construction process of plasmid pAI282.
FIG. 6 shows the construction process of plasmids pAI283 and pAI285.
FIG. 7 shows the construction process of plasmids pAI284 and pAI289.
FIG. 8 shows the construction process of plasmids pAI294 and pAI295.
FIG. 9 shows the construction steps of plasmids pAI299 and pAI301.
FIG. 10 shows the construction process of plasmid pAI292.
FIG. 11 shows the construction process of plasmid pAI297.
FIG. 12 shows the construction process of plasmid pMKex1.
FIG. 13 shows the construction process of plasmid pAI263.
FIG. 14 shows the binding reactivity of anti-human IL-5Rα monoclonal antibodies KM1257 and KM1259 to human IL-5Rα-human immunoglobulin constant region fusion protein in the enzyme immunoassay.
FIG. 15 shows the construction process of plasmid pBSA.
FIG. 16 shows the construction process of plasmid pBSAE.
FIG. 17 shows the construction process of plasmid pBSH-S.
FIG. 18 is a view showing a construction process of plasmid pBSK-H.
FIG. 19 shows the construction steps of plasmids pBSH-SA and pBSK-HA.
FIG. 20 shows the construction steps of plasmids pBSH-SAE and pBSK-HAE.
FIG. 21 shows the construction steps of plasmids pBSH-SAEE and pBSK-HAEE.
FIG. 22 shows the construction process of plasmid pBSK-HAEESal.
FIG. 23 shows the construction process of plasmid pBSX-S.
FIG. 24 shows the construction process of plasmid pBSX-SA.
FIG. 25 shows the construction process of plasmid pBSSC.
FIG. 26 shows the construction process of plasmid pBSMo.
FIG. 27 shows the construction process of plasmid pBSMoS.
FIG. 28 shows the construction process of plasmid pChiIgLA1S.
FIG. 29 shows the construction process of plasmid pMohCκ.
FIG. 30 shows the construction process of plasmid pBSMoSal.
FIG. 31 shows the construction process of plasmid pBSMoSalS.
FIG. 32 shows the construction process of plasmid pBShCγ1.
FIG. 33 shows the construction process of plasmid pMohCγ1.
FIG. 34 is a view showing a construction process of plasmid pMoγ1SP.
FIG. 35 shows the construction process of plasmid pMoκγ1SP.
FIG. 36 shows the construction process of plasmid pKANTEX93.
FIG. 37 shows the construction process of plasmid pKANTEX1259H.
FIG. 38 shows the construction steps of plasmid pKANTEX1259.
FIG. 39 shows the electrophoresis pattern of SDS-PAGE (using a 4-15% gradient gel) of the anti-human IL-5Rα chain human chimeric antibody KM1399. Electrophoresis was performed under non-reducing conditions on the left and reducing conditions on the right. M on the left side is a high molecular marker, 1 is a KM1399, M on the right side is a low molecular marker, and 1 is a migration pattern of KM1399.
FIG. 40 shows the inhibitory activity of anti-human IL-5Rα chain mouse antibody KM1259 and anti-human IL-5Rα chain human chimeric antibody KM1399 on the binding of human IL-5 and human IL-5Rα chain. The vertical axis represents inhibitory activity, and the horizontal axis represents antibody concentration. ● indicates the activity of KM1259 and ○ indicates the activity of KM1399.
FIG. 41 is a diagram showing a construction process of plasmid pT1259.
FIG. 42 shows the activity evaluation by transient expression of anti-human IL-5Rα chain human chimeric antibody using plasmid pT1259. The vertical axis represents the inhibitory activity against the binding of human IL-5 and human IL-5Rα chain, and the horizontal axis represents the dilution factor of the transient expression culture supernatant.
FIG. 43 shows the construction steps of plasmid phKM1259HV0.
FIG. 44 shows the construction steps of plasmid phKM1259LV0.
FIG. 45 shows the construction process of plasmid pKANTEX1259HV0.
FIG. 46 shows the construction steps of plasmid pKANTEX1259HV0LV0.
FIG. 47 shows the electrophoresis pattern of SDS-PAGE (using a 4 to 15% gradient gel) of the anti-human IL-5Rα chain human CDR-grafted antibody KM8397. Electrophoresis was performed under non-reducing conditions on the left and reducing conditions on the right. M represents a molecular weight marker, and 1 represents a migration pattern of KM8397.
FIG. 48 shows the binding activity of anti-human IL-5Rα chain human chimeric antibody KM1399 and anti-human IL-5Rα chain human CDR-grafted antibody KM8397 to human IL-5Rα chain. The vertical axis represents the binding activity to human IL-5Rα chain, and the horizontal axis represents the antibody concentration. ● indicates the activity of KM1399, and ○ indicates the activity of KM8397.
FIG. 49 shows the results of evaluating the inhibitory activity of various modified versions of anti-human IL-5Rα chain human CDR-grafted antibodies in the transient expression culture supernatant on the binding of human IL-5 and human IL-5Rα chain. Show. The vertical axis represents inhibitory activity, and the horizontal axis represents the name of each sample. The relative activity values when the activity of the chimeric antibody KM1399 is taken as 100 are shown.
FIG. 50 shows the binding activity of purified various modified versions of anti-human IL-5Rα chain human CDR-grafted antibody to human IL-5Rα chain. The vertical axis represents the binding activity to human IL-5Rα chain, and the horizontal axis represents the antibody concentration. The top ● is KM1399, ○ is HV.0LV.0, ■ is HV.2LV.0, □ is HV.0LV.3, ▲ is HV.3LV.3, the bottom ● is KM1399, and ○ is HV.1LV. 0, ■ are HV.3LV.0, □ are HV.0LV.4, ▲ are HV.1LV.4, △ are HV.2LV.4, and x are HV.3LV.4.
FIG. 51 is a diagram showing the construction steps of plasmid pBShCγ4.
FIG. 52 shows the construction steps of plasmids pKANTEX1259γ4 and pKANTEX1259HV3LV0γ4.
FIG. 53 shows SDS-PAGE (4-15% gradient gel) of anti-human IL-5Rα chain human chimeric antibody anti-KM7399 of human antibody IgG4 subclass and human IL-5Rα chain human CDR-grafted antibody KM9399 of human antibody IgG4 subclass. Electrophoretic pattern. Electrophoresis was performed under non-reducing conditions on the left and reducing conditions on the right. M on the left side is a high molecular marker, 1 is KM9399, 2 is KM7399, M on the right side is a low molecular marker, 1 is KM9399, 2 is the migration pattern of KM7399.
FIG. 54 shows human antibody IgG1 subclass anti-human IL-5Rα chain human chimeric antibody KM1399, human antibody IgG4 subclass anti-human IL-5Rα chain human chimeric antibody KM7399, human antibody IgG1 subclass anti-human IL-5Rα chain The binding activity of human CDR-grafted antibody KM8399 and human antibody IgG4 subclass anti-human IL-5Rα chain human CDR-grafted antibody KM9399 to human IL-5Rα chain is shown. The vertical axis represents the binding activity to human IL-5Rα chain, and the horizontal axis represents the antibody concentration. ○ indicates the activity of KM1399, ● indicates the activity of KM7399, □ indicates the activity of KM8399, and ■ indicates the activity of KM9399.
FIG. 55 shows the results of analyzing the reactivity of anti-human IL-5Rα monoclonal antibodies KM1257, KM1259, KM1486, KM1399, KM7399, KM8399 and KM9399 with human IL-5R gene-introduced CTLL-2 cells using a flow cytometer. Show.
FIG. 56 shows the results of examining the inhibitory effect of anti-human IL-5Rα monoclonal antibodies KM1257, KM1259, KM1486, KM1399, KM7399, KM8399 and KM9399 on the IL-5-dependent proliferation of human IL-5R gene-introduced CTLL-2 cells. Indicates.
FIG. 57 shows the results of analyzing the reactivity of anti-human IL-5Rα monoclonal antibody KM1259 with human eosinophils using a flow cytometer.
FIG. 58 shows the results of examining the human eosinophil survival inhibitory action of anti-human IL-5Rα monoclonal antibodies KM1257, KM1259, KM1486, KM1399, KM7399, KM8399 and KM9399.
FIG. 59 shows the results of studies on a soluble human IL-5Rα quantification system using anti-human IL-5Rα monoclonal antibody KM1257 and biotin-labeled KM1259.
FIG. 60 shows the results of detection of shIL-5Rα by Western blotting using anti-human IL-5Rα monoclonal antibodies KM1257, KM1259 and KM1486.
FIG. 61 shows the results of immunoprecipitation of shIL-5Rα using anti-human IL-5Rα monoclonal antibodies KM1257, KM1259 and KM1486.
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
Example 1
1. Antigen preparation
(1) Construction of expression vector pAGE210 for animal cells
The animal cell expression vector pAGE210 was constructed as follows using the animal cell expression vector pAGE207 (JP-A-6-46841) and pAGE148 (JP-A-6-205694).
3 μg of plasmid pAGE207 or pAGE148 is dissolved in 30 μl of a buffer solution consisting of 10 mM Tris-HCl (pH 7.5), 10 mM magnesium chloride, 50 mM sodium chloride and 1 mM dithiothreitol (hereinafter referred to as DTT), and further 10 units of ClaI, And KpnI (both manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd., unless otherwise specified, restriction enzymes are manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd.) and reacted at 37 ° C. for 4 hours. The reaction solution was fractionated by agarose electrophoresis, and from pAGE207, the SV40 early promoter and enhancer (hereinafter referred to as PSE), About 0.5 μg of a 4.7 kb DNA fragment containing the hygromycin resistance gene and ampicillin (hereinafter referred to as Ap) resistance gene, and from pAGE148 a 4.3 kb DNA fragment including the dihydrofolate reductase (hereinafter referred to as dhfr) gene About 0.5 μg was recovered.
Thus obtained 50 ng of the ClaI-KpnI fragment of pAGE207 and 50 ng of the KpnI-ClaI fragment of pAGE148 were mixed with 20 μl of T4 DNA ligase buffer [66 mM Tris-HCl (pH 7.5), 6.6 mM magnesium chloride, 10 mM DTT and 0.1 It was dissolved in a buffer solution of mM adenosine triphosphate (hereinafter referred to as ATP, the same shall apply hereinafter), 200 units of T4 DNA ligase (manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd., hereinafter) were added, and a binding reaction was performed at 12 ° C. for 16 hours. Escherichia coli JM109 strain was transformed with the recombinant plasmid DNA thus obtained to obtain plasmid pAGE210 shown in FIG.
(2) ShIL-5Rα cDNA cassette for shIL-5Rα expression vector construction
To construct shIL-5Rα expression vector, modify the 5 'and 3' untranslated regions of shIL-5Rα cDNA and introduce restriction enzyme recognition sequences according to the procedure shown below. [Edited by Maniatis et al., Molecular cloning (Molecular Cloning), 14.2, Cold Spring Harbor Laboratory 1989]. The plasmid pCAGGS-h5R.25 is a plasmid pCAGGS known as shIL-5Rα cDNA [Gene,108, 193 (1991)] inserted as shown in FIG. 2 [Journal of Experimental Medicine (J. Exp. Med.),175, 341 (1992)]. 3 μg of this pCAGGS-h5R.25 was added to 30 μl of a buffer consisting of 50 mM Tris-hydrochloric acid (pH 7.5), 10 mM magnesium chloride, 100 mM sodium chloride and 1 mM DTT, and 10 units of EcoRI was further added at 37 ° C. Reacted for hours. After fractionating the reaction solution by agarose electrophoresis, about 0.3 μg of a 1.4 kb DNA fragment containing shIL-5Rα cDNA was recovered.
Next, 1 ng of the DNA fragment obtained above was 50 μl of PCR buffer [50 mM potassium chloride, 10 mM Tris-hydrochloric acid (pH 8.3), 1.5 mM magnesium chloride, 0.2 mM deoxyadenosine triphosphate (hereinafter referred to as dATP), 0.2 mM deoxyguanosine triphosphate (hereinafter referred to as dGTP), 0.2 mM deoxycytosine triphosphate (hereinafter referred to as dCTP), 0.2 mM deoxythymidine triphosphate (hereinafter referred to as dTTP)] 50 pmol of synthetic DNA having the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 and synthetic DNA having the base sequence shown in SEQ ID NO: 2 [both automatic DNA synthesizers; 380A (Applied Biosystems Co., Ltd .; Applied Biosystems Co., Ltd. ), And the same as described below], bent DNA polymerase (manufactured by New England BioLabs. Inc., the same applies hereinafter), 1.6 units, and 94 ° C. for 1 minute, 55 PCR was carried out for 30 cycles using a DNA thermal cycler manufactured by Perkin Elmer under the series of reaction conditions consisting of 2 minutes at ° C and 3 minutes at 72 ° C. After completion of the reaction, 10 μl of the reaction solution was added with 2 μl of a buffer solution consisting of 100 mM Tris-hydrochloric acid (pH 7.5), 100 mM magnesium chloride, 500 mM sodium chloride and 10 mM DTT, 8 μl of distilled water, 10 units of HindIII and added at 37 ° C. for 4 minutes. After the reaction, the DNA fragment was recovered from the reaction solution by ethanol precipitation [edited by Maniatis et al., Molecular Cloning, E.10, Cold Spring Harbor Laboratory 1989], and 20 μl of 20 mM. It was redissolved in a buffer solution consisting of tris-hydrochloric acid (pH 8.5), 10 mM magnesium chloride, 10 mM potassium chloride and 1 mM DTT, and further 10 units of BamHI was added and reacted at 37 ° C. for 4 hours. After fractionating the reaction solution by agarose electrophoresis, about 0.3 μg of a 1.0 kb DNA fragment was recovered.
On the other hand, 3 μg of plasmid pUC19 (Pharmacia Biotech) was dissolved in 30 μl of a buffer consisting of 10 mM Tris-HCl (pH 7.5), 10 mM magnesium chloride, 50 mM sodium chloride and 1 mM DTT, and 10 units of HindIII were added at 37 ° C. After reacting for a period of time, DNA fragments were recovered from the reaction solution by ethanol precipitation, redissolved in 30 μl of a buffer solution comprising 20 mM Tris-HCl (pH 8.5), 10 mM magnesium chloride, 10 mM potassium chloride and 1 mM DTT, 10 units of BamHI was added and reacted at 37 ° C. for 4 hours. The reaction solution was fractionated by agarose electrophoresis, and about 0.5 μg of pUC19 HindIII / BamHI fragment was recovered.
100 ng of HindIII / BamHI fragment of pUC19 and 50 ng of shIL-5Rα cDNA fragment were dissolved in 20 μl of T4 DNA ligase buffer, 200 units of T4 DNA ligase was added, and a binding reaction was performed at 12 ° C. for 16 hours. Escherichia coli JM109 strain was transformed with the recombinant plasmid DNA thus obtained to obtain plasmid pAI234 shown in FIG.
(3) Construction of human soluble IL-5Rα expression vector
Construction of shIL-5Rα expression vector pAI230 by ligating the HindIII-BamHI fragment of pAGE210 obtained in Example 1 (1) and the HindIII-BamHI fragment containing the shIL-5Rα cDNA of pAI234 obtained in 1 (2) Was performed as follows.
3 μg of pAGE210 was added to 30 μl of a buffer solution consisting of 10 mM Tris-hydrochloric acid (pH 7.5), 10 mM magnesium chloride, 50 mM sodium chloride and 1 mM DTT, and 10 units of HindIII were added and reacted at 37 ° C. for 4 hours. DNA fragments were recovered from the reaction solution by ethanol precipitation, redissolved in 30 μl of a buffer solution containing 20 mM Tris-HCl (pH 8.5), 10 mM magnesium chloride, 10 mM potassium chloride, and 1 mM DTT, and 10 units of BamHI was added. And reacted at 37 ° C. for 4 hours. After fractionating the reaction solution by agarose electrophoresis, about 0.5 μg of a 9.0 kb DNA fragment was recovered.
3 μg of pAI234 was added to 30 μl of a buffer solution consisting of 10 mM Tris-hydrochloric acid (pH 7.5), 10 mM magnesium chloride, 50 mM sodium chloride and 1 mM DTT, and 10 units of HindIII were further added and reacted at 37 ° C. for 4 hours. DNA fragments were recovered from the reaction solution by ethanol precipitation, redissolved in 30 μl of a buffer solution containing 20 mM Tris-HCl (pH 8.5), 10 mM magnesium chloride, 10 mM potassium chloride, and 1 mM DTT, and 10 units of BamHI was added. And reacted at 37 ° C. for 4 hours. After fractionating the reaction solution by agarose electrophoresis, about 0.3 μg of a 1.0 kb DNA fragment was recovered.
Next, 300 ng of HindIII-BamHI fragment of pAGE210 and 50 ng of HindIII-BamHI fragment of pAI234 were dissolved in 20 μl of T4 DNA ligase buffer, 200 units of T4 DNA ligase was added, and a binding reaction was performed at 12 ° C. for 16 hours. Escherichia coli JM109 was transformed with the recombinant plasmid DNA thus obtained to obtain the plasmid pAI230 shown in FIG.
(4) Modification of signal sequence
For efficient production of shIL-5Rα by animal cells, the signal sequence of the cDNA encoding shIL-5Rα is modified by introducing an EcoRV recognition sequence into the 3 ′ end of the signal sequence, followed by synthetic DNA. Human growth hormone [Science,205, 602 (1979)] or modification of the anti-ganglioside GD3 chimeric antibody KM871 (JP-A-5-304989) to a signal sequence was performed according to the following procedure.
3 μg of the plasmid pAI234 obtained in Example 1 (2) was added to 30 μl of a buffer consisting of 10 mM Tris-HCl (pH 7.5), 10 mM magnesium chloride, 50 mM sodium chloride and 1 mM DTT, and 10 units of HindIII were further added. And reacted at 37 ° C. for 4 hours. DNA fragments were recovered from the reaction solution by ethanol precipitation, redissolved in 30 μl of a buffer solution containing 20 mM Tris-HCl (pH 8.5), 10 mM magnesium chloride, 10 mM potassium chloride, and 1 mM DTT, and 10 units of BamHI was added. And reacted at 37 ° C. for 4 hours. After fractionating the reaction solution by agarose electrophoresis, about 0.3 μg of a 1.0 kb DNA fragment was recovered.
On the other hand, 3 μg of plasmid pUC19 was dissolved in 30 μl of a buffer consisting of 10 mM Tris-hydrochloric acid (pH 7.5), 10 mM magnesium chloride, 50 mM sodium chloride and 1 mM DTT, and 10 units of HincII was added and reacted at 37 ° C. for 4 hours. Thereafter, a DNA fragment was recovered from the reaction solution by ethanol precipitation, and about 0.5 μg of a pinc19 HincII fragment was recovered.
About 1 ng of the DNA fragment obtained above was dissolved in 50 μl of PCR buffer, and 50 pmol of the synthetic DNA having the base sequence shown in SEQ ID NO: 2, the synthetic DNA having the base sequence shown in SEQ ID NO: 3, and bent DNA polymerase 1.6 Units were added and 30 cycles of PCR were performed under a series of reaction conditions consisting of 94 ° C. for 1 minute, 48 ° C. for 2 minutes, and 72 ° C. for 3 minutes. After the reaction solution was fractionated on an agarose gel, 0.5 μg of a cDNA fragment encoding a part of about 0.9 kb hIL-5Rα was recovered, of which 50 ng of DNA and 100 ng of HUCII fragment of pUC19 were mixed with 20 μl of T4 ligase buffer. After dissolution, the mixture was added with 200 units of T4 DNA ligase and subjected to a binding reaction at 12 ° C. for 16 hours. Escherichia coli JM109 strain was transformed with the recombinant plasmid DNA thus obtained to obtain plasmid pAI280 shown in FIG. 3 μg of the obtained plasmid pAI280 was added to 30 μl of a buffer solution consisting of 10 mM Tris-hydrochloric acid (pH 7.5), 10 mM magnesium chloride, 50 mM sodium chloride and 1 mM DTT, and 10 units of XbaI was further added at 37 ° C. for 4 hours. Reacted. DNA fragments were recovered from the reaction solution by ethanol precipitation, redissolved in 30 μl of a buffer solution containing 20 mM Tris-HCl (pH 8.5), 10 mM magnesium chloride, 10 mM potassium chloride, and 1 mM DTT, and 10 units of BamHI was added. And reacted at 37 ° C. for 4 hours. The reaction solution was fractionated by agarose electrophoresis, and about 0.8 μg of a 2.8 kb DNA fragment was recovered.
Meanwhile, 3 μg of plasmid pAI234 was added to 30 μl of a buffer solution consisting of 10 mM Tris-HCl (pH 7.5), 10 mM magnesium chloride, 50 mM sodium chloride and 1 mM DTT, and further 10 units of XbaI were added and reacted at 37 ° C. for 4 hours. It was. DNA fragments were recovered from the reaction solution by ethanol precipitation, redissolved in 30 μl of a buffer solution containing 20 mM Tris-HCl (pH 8.5), 10 mM magnesium chloride, 10 mM potassium chloride, and 1 mM DTT, and 10 units of BamHI was added. And reacted at 37 ° C. for 4 hours. The reaction solution was fractionated by agarose electrophoresis, and about 0.2 μg of 0.8 kb DNA fragment was recovered.
Next, 200 ng of the XbaI-BamHI fragment of pAI280 and 50 ng of the XbaI-BamHI fragment of pAI234 were dissolved in 20 μl of T4 ligase buffer, 200 units of T4 DNA ligase was added, and a binding reaction was performed at 12 ° C. for 16 hours. Escherichia coli JM109 strain was transformed with the recombinant plasmid DNA thus obtained to obtain plasmid pAI282 shown in FIG. 3 μg of this pAI282 was added to 30 μl of a buffer solution consisting of 50 mM Tris-hydrochloric acid (pH 7.5), 10 mM magnesium chloride, 100 mM sodium chloride and 1 mM DTT, and 10 units of EcoRV were further added and reacted at 37 ° C. for 4 hours. DNA fragments were recovered from the reaction solution by ethanol precipitation, redissolved in 30 μl of a buffer solution containing 20 mM Tris-HCl (pH 8.5), 10 mM magnesium chloride, 10 mM potassium chloride, and 1 mM DTT, and 10 units of BamHI was added. And reacted at 37 ° C. for 4 hours. After fractionating the reaction solution by agarose electrophoresis, about 0.3 μg of a 0.9 kb DNA fragment was recovered.
1 μg of each of the synthetic DNAs having the nucleotide sequences shown in SEQ ID NOs: 4 and 5 was dissolved in 10 μl of distilled water, heated at 95 ° C. for 5 minutes, and then cooled to room temperature over 30 minutes for annealing. 100 ng of HindII-BamHI fragment of pUC19 obtained in Example 1 (2), 50 ng of EcoRV-BamHI fragment of pAI282, and 50 ng of synthetic DNA having the nucleotide sequence shown in SEQ ID NOs: 4 and 5 which were annealed as described above were T4DNA. Dissolved in 20 μl of ligase buffer, 200 units of T4 DNA ligase was further added, and a binding reaction was performed at 12 ° C. for 16 hours. Escherichia coli JM109 strain was transformed with the recombinant plasmid DNA thus obtained to obtain plasmid pAI283 shown in FIG.
1 μg each of the synthetic DNAs having the nucleotide sequences shown in SEQ ID NOs: 6 and 9 was dissolved in 10 μl of distilled water, heated at 95 ° C. for 5 minutes, and then cooled to room temperature over 30 minutes for annealing. The reaction solution was mixed with 500 mM Tris-HCl (pH 7.6), 100 mM magnesium chloride, 50 mM DTT, 1 mM EDTA buffer 2.5 μl, 10 mM ATP solution 2.5 μl, distilled water 9 μl, and T4 polynucleotide kinase (Takara Shuzo) 5 units were added and phosphorylation was performed at 37 ° C. for 2 hours. Separately, 1 μg of each of the synthetic DNAs having the nucleotide sequences shown in SEQ ID NOs: 7 and 8 was dissolved in 10 μl of distilled water, heated at 95 ° C. for 5 minutes, then cooled to room temperature over 30 minutes and annealed. .
100 ng of HindIII-BamHI fragment of pUC19, 50 ng of EcoRV-BamHI fragment of pAI282, 50 ng of each of the synthetic DNAs prepared as described above were dissolved in 20 μl of T4 DNA ligase buffer, 200 units of T4 DNA ligase was added, and the mixture was bound at 12 ° C. for 16 hours. Reaction was performed. Escherichia coli JM109 strain was transformed with the recombinant plasmid DNA thus obtained to obtain plasmid pAI285 shown in FIG.
(5) Construction of shIL-5Rα expression vector with modified signal sequence
The human soluble III-BamHI fragment of pAGE210 obtained in Example 1 (1) and the HindIII-BamHI fragment containing human soluble IL-5Rα cDNA of pAI283 or pAI285 obtained in Example 1 (4) were linked. IL-5Rα expression vectors pAI284 and pAI289 were constructed as follows.
3 μg of pAI283 and pAI285 was added to 30 μl of a buffer solution consisting of 10 mM Tris-hydrochloric acid (pH 7.5), 10 mM magnesium chloride, 50 mM sodium chloride and 1 mM DTT, and further 10 units of HindIII were added and reacted at 37 ° C. for 4 hours. . The DNA fragment was recovered from the reaction solution by ethanol precipitation, redissolved in 30 μl of a buffer solution consisting of 20 mM Tris-HCl (pH 8.5), 10 mM magnesium chloride, 10 mM potassium chloride, and 1 mM DTT, and 10 units of BamHI was added. And reacted at 37 ° C. for 4 hours. After fractionating the reaction solution by agarose electrophoresis, about 0.3 μg of each 1.0 kb DNA fragment was recovered.
300 ng of HindIII-BamHI fragment of pAGE210 and 50 ng of HindIII-BamHI fragment of pAI283 or pAI285 were dissolved in 20 μl of T4 DNA ligase buffer, 200 units of T4 DNA ligase was added, and a binding reaction was performed at 12 ° C. for 16 hours. Escherichia coli JM109 strain was transformed with the recombinant plasmid DNA thus obtained to obtain plasmids pAI284 and pAI289 shown in FIG.
(6) Preparation of fusion protein of human IL-5Rα and human immunoglobulin constant region
The extracellular region of human IL-5Rα and the human immunoglobulin constant region (hereinafter referred to as Fc) (Gly-Ser-Gly)FourA fusion protein (hereinafter referred to as hIL-5Rα-Fc) bound via a linker having the amino acid sequence was prepared according to the following procedure.
As the cDNA encoding the human immunoglobulin constant region, the portion encoding the human IgG1 constant region on the human chimeric antibody H chain expression vector pChiIgHB2 (JP-A-5-304989) was used. First, about 1 ng of pChiIgHB2 was dissolved in 50 μl of PCR buffer, and 50 pmol of the synthetic DNA having the base sequence shown in SEQ ID NO: 10, the synthetic DNA having the base sequence shown in SEQ ID NO: 11 and 1.6 units of bent DNA polymerase were further added. In addition, 30 cycles of PCR were performed under a series of reaction conditions consisting of 94 ° C. for 1 minute, 48 ° C. for 2 minutes, and 72 ° C. for 3 minutes. After completion of the reaction, 20 μl of the reaction solution was added with 200 mM Tris-HCl (pH 8.5), 100 mM magnesium chloride, 1000 mM potassium chloride and 10 mM buffer 2.5 μl, distilled water 2.5 μl, 10 units of BamHI and added at 37 ° C. for 4 minutes. Let time. After completion of the reaction, the reaction solution was fractionated by agarose electrophoresis, and about 0.5 μg of a 0.7 kb DNA fragment containing cDNA encoding the human IgG1 constant region was recovered.
About 1 ng of pAI283 obtained in Example 1 (4) is dissolved in 50 μl of PCR buffer, and 50 pmol of the synthetic DNA having the base sequence shown in SEQ ID NO: 12 and the synthetic DNA having the base sequence shown in SEQ ID NO: 13 Further, 1.6 units of bent DNA polymerase was added, and PCR was performed for 30 cycles under a series of reaction conditions consisting of 94 ° C. for 1 minute, 48 ° C. for 2 minutes, and 72 ° C. for 3 minutes. After completion of the reaction, add 20 μl of the reaction solution to 2.5 μl of a buffer solution consisting of 100 mM Tris-hydrochloric acid (pH 7.5), 100 mM magnesium chloride, 500 mM sodium chloride and 10 mM DTT, 2.5 μl of distilled water and 10 units of HindIII at 37 ° C. The reaction was performed for 4 hours. After completion of the reaction, the reaction solution was fractionated by agarose electrophoresis. After the reaction solution was fractionated by agarose electrophoresis, about 0.5 μg of a 1.0 kb DNA fragment containing cDNA encoding the extracellular region of hIL-5Rα was obtained. It was collected.
Dissolve 50 ng of a 0.7 kb DNA fragment containing cDNA encoding human IgG1 constant region, 50 ng of DNA fragment containing cDNA encoding the extracellular region of hIL-5Rα, and 100 ng of HindIII-BamHI fragment of pUC19 in 20 μl of T4 DNA ligase buffer. Then, 200 units of T4 DNA ligase was added, and a binding reaction was performed at 12 ° C. for 16 hours. Escherichia coli JM109 strain was transformed with the recombinant plasmid DNA thus obtained to obtain plasmid pAI294 shown in FIG.
On the other hand, using pAI285 obtained in Example 1 (4) as a template, a synthetic DNA having the nucleotide sequences shown in SEQ ID NOs: 13 and 14 was used as a primer under the same conditions as described above, and after completion of the reaction, The reaction solution was fractionated by agarose electrophoresis, and the reaction solution was fractionated by agarose electrophoresis. Then, about 0.5 μg of a 1.0 kb DNA fragment containing cDNA encoding the extracellular region of human IL-5Rα was recovered. 50 ng of the obtained DNA fragment, 50 ng of a 0.7 kb DNA fragment containing cDNA encoding the human IgG1 constant region, 100 ng of HindIII-BamHI fragment of pUC19 were dissolved in 20 μl of T4 DNA ligase buffer, 200 units of T4 DNA ligase was added, and 12 ° C The binding reaction was carried out for 16 hours. Escherichia coli JM109 strain was transformed with the recombinant plasmid DNA thus obtained to obtain plasmid pAI295 shown in FIG.
(7) Construction of fusion protein expression vector
By ligating the HindIII-BamHI fragment of pAGE210 obtained in Example 1 (1) and the HindIII-BamHI fragment containing cDNA encoding hIL-5Rα-Fc of pAI294 obtained in Example 1 (6) The hIL-5Rα-Fc expression vector pAI299 was constructed as follows.
3 μg of plasmid pAI294 was added to 30 μl of a buffer solution consisting of 10 mM Tris-hydrochloric acid (pH 7.5), 10 mM magnesium chloride, 50 mM sodium chloride and 1 mM DTT, and 10 units of HindIII were added and reacted at 37 ° C. for 4 hours. The DNA fragment was recovered from the reaction solution by ethanol precipitation, redissolved in 30 μl of a buffer consisting of 20 mM Tris-HCl (pH 8.5), 10 mM magnesium chloride, 100 mM potassium chloride and 1 mM DTT, and 10 units of BamHI was added. And reacted at 37 ° C. for 4 hours. The reaction solution was fractionated by agarose electrophoresis, and about 0.4 μg of a 1.7 kb DNA fragment containing cDNA encoding a fusion protein of human IL-5Rα and a human immunoglobulin constant region was recovered.
100 ng of HindIII-BamHI fragment of pAGE210 and 50 ng of HindIII-BamHI fragment of pAI294 were dissolved in 20 μl of T4 DNA ligase buffer, 200 units of T4 DNA ligase was added, and a binding reaction was performed at 12 ° C. for 16 hours. Escherichia coli JM109 strain was transformed with the recombinant plasmid DNA thus obtained to obtain plasmid pAI299 shown in FIG.
In addition, by ligating the HindIII-BamHI fragment of pAGE210 and the HindIII-BamHI fragment containing cDNA encoding hIL-5Rα-Fc of pAI295 obtained in Example 1 (6) in the same manner as described above, hIL-5Rα -An Fc expression vector pAI301 was constructed.
(8) Production of recombinant virus for shIL-5Rα expression by insect cells
Protein production by insect cells requires the production of a recombinant virus that incorporates the gene of interest. For this production, the process of incorporating a cDNA encoding the protein of interest called a transfer vector into a special plasmid, wild-type virus, and transfer The vector is co-transfected into insect cells and undergoes the process of obtaining a recombinant virus by homologous recombination. About the above process, it carried out in the following procedures according to the manual using the Baculo Gold starter kit (product number PM-21001K) made from Farming Gen.
Buffer containing 3 μg of pAI285 obtained in Example 1 (4) or pAI294 obtained in Example 1 (6), 10 mM Tris-HCl (pH 7.5), 10 mM magnesium chloride, 50 mM sodium chloride and 1 mM DTT In addition to 30 μl, 10 units of HindIII was further added and reacted at 37 ° C. for 4 hours. DNA fragments were recovered from the reaction solution by ethanol precipitation, and 20 μl of DNA polymerase I buffer [5 mM Tris-HCl (pH 7.5), 1 mM magnesium sulfate, 0.01 mM DTT, 5 μg / ml bovine serum albumin, 0.08 mM dATP, Dissolve in a buffer consisting of 0.08mM dGTP, 0.08mM dCTP, 0.08mM dTTP, and so on], add 5 units of E. coli DNA polymerase I Klenow fragment (Takara Shuzo Co., Ltd., and so on), and react at 22 ° C for 30 minutes. The 5 ′ overhang generated by HindIII digestion was changed to a blunt end. Further, the reaction solution was extracted with phenol-chloroform and ethanol precipitated, and 30 μl of a buffer solution containing 20 mM Tris-hydrochloric acid (pH 8.5), 10 mM magnesium chloride, 100 mM potassium chloride, and 1 mM DTT and 10 units of BamHI were added. The reaction was carried out at 4 ° C. for 4 hours. The reaction mixture is fractionated by agarose gel electrophoresis, about 0.3 μg of a DNA fragment of about 1.0 kb containing cDNA encoding shIL-5Rα, and encoding a fusion protein of human IL-5Rα and a human immunoglobulin constant region About 0.3 μg of a 1.7 kb DNA fragment containing cDNA was recovered.
Next, 3 μg of plasmid pVL1393 contained in the Pharmingen Baculo Gold Starter Kit is added to 30 μl of a buffer solution consisting of 50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 10 mM magnesium chloride, 100 mM sodium chloride and 1 mM DTT, and 10 units. Of EcoRI was added and reacted at 37 ° C. for 4 hours. A DNA fragment was recovered from the reaction solution by ethanol precipitation, dissolved in 20 μl of DNA polymerase I buffer, 5 units of E. coli DNA polymerase I Klenow fragment was added, reacted at 22 ° C. for 30 minutes, and produced by EcoRI digestion. The 5 'protruding end was changed to a blunt end. Further, the reaction solution was extracted with phenol-chloroform, ethanol precipitated, added to 30 μl of a buffer solution containing 50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 10 mM magnesium chloride, 100 mM sodium chloride and 1 mM DTT, and further 10 units of BglII was added. In addition, the mixture was reacted at 37 ° C. for 4 hours. The reaction solution was fractionated by agarose gel electrophoresis, and about 0.9 μg of an about 9.6 kb DNA fragment was recovered.
Next, pVL1393 EcoRI (blunt end) -BglII fragment 200n and pAI285 or pAI294 HindIII (blunt end) -BamHI fragment 50ng obtained above were dissolved in 20 μl of T4 DNA ligase buffer, and 200 units of T4 DNA ligase was added. The binding reaction was performed at 12 ° C. for 16 hours. Escherichia coli JM109 strain was transformed with the recombinant plasmid DNA thus obtained, and plasmids pAI292 and pAI297 shown in FIGS. 10 and 11 were obtained.
In the subsequent production of recombinant virus, linear baculovirus DNA [BaculoGoldbaculovirus DNA (BaculoGoldbaculovirus DNA) was applied to insect cells Sf9 (manufactured by Farmingen) cultured in TMN-FH insect medium (manufactured by Farmingen). ), Manufactured by Pharmingen Co.] and introducing the produced transfer vector DNA by the lipofectin method [protein nucleic acid enzyme,37, 2701 (1992)], a recombinant baculovirus was prepared as follows.
1 μg of pAI292 or pAI297 and 20 ng of linear baculovirus DNA were dissolved in 12 μl of distilled water, and a mixture of 6 μl of lipofectin and 6 μl of distilled water was added and left at room temperature for 15 minutes. Meanwhile, Sf9 cells 1 × 106The cells were suspended in 2 ml of Sf900-II medium (Gibco) and placed in a plastic petri dish for cell culture having a diameter of 35 mm. The above plasmid DNA, linear baculovirus DNA, and lipofectin mixed solution were added in total, and the mixture was cultured at 27 ° C. for 3 days. Then, 1 ml of the culture supernatant containing the recombinant virus was collected. 1 ml of Sf900-II medium was newly added to the petri dish, and further cultured at 27 ° C. for 3 days to obtain an additional 1.5 ml of a culture supernatant containing the recombinant virus.
Next, the recombinant virus obtained for use in protein expression was propagated by the following procedure.
Sf9 cell 2 × 107Suspended in 10 ml Sf900-II medium, 175 cm2The cells were placed in a flask (manufactured by Greiner) and left at room temperature for 1 hour to allow cells to adhere to the flask. After standing, the supernatant was removed, and 1 ml of a culture supernatant containing 15 ml of TMN-FH insect medium and the above recombinant virus was newly added and cultured at 27 ° C. for 3 days. After culture, the supernatant was centrifuged at 1,500 × g for 10 minutes to remove cells, and a recombinant virus solution used for protein expression was obtained.
The virus titer of the obtained recombinant virus solution was calculated by the following method (Baculo Gold Starter Kit Manual manufactured by Farmingen). Sf9 cell 6 × 106The cells were suspended in 4 ml of Sf900-II medium, placed in a plastic petri dish for cell culture having a diameter of 60 mm, and left at room temperature for 1 hour to allow the cells to adhere to the petri dish. Next, after removing the supernatant, 400 μl of Sf900-II medium and the above-mentioned recombinant virus solution diluted 10,000-fold with Sf900-II medium were added and allowed to stand at room temperature for 1 hour. After removing the medium, 5 ml of 1% low melting point agarose [Agar Medium containing plaque agarose (manufactured by Farmingen) [sterilized 1 ml of 5% agar plaque plus agarose aqueous solution and 4 ml of TMN-FH insect medium mixed and kept at 42 ° C.] I poured it into the petri dish. After leaving at room temperature for 15 minutes, vinyl tape was spread on a petri dish to prevent drying, and the petri dish was placed in a sealable plastic container and cultured at 27 ° C. for 6 days. After adding 1 ml of PBS containing 0.01% neutral red to the petri dish and further culturing for 1 day, the number of plaques that appeared was counted. From the above operations, the recombinant virus solutions are all about 1 × 107It was found that the virus contained plaque forming unit / ml (hereinafter referred to as PFU / ml).
(9) Expression of shIL-5Rα or hIL-5Rα-Fc in animal cells
The introduction of the plasmid into the animal cell was carried out according to the method of Miyaji et al., Electroporation method [Cytotechnology,Three, 133 (1990)].
4 μg of 4 μg of pAI289 obtained in Example 1 (5) or pAI301 obtained in Example 1 (7)6CHO cells deficient in dhfr genes [Procedure of the National Academy of Sciences (Proc.Natl.Acad.Sci.),77, 4216 (1980)] and then 40 ml of RPMI1640-FCS (10) [10% FCS, 7.5% NaHCOThree1/40 volume, 200 mM L-glutamine solution (manufactured by Gibco) 3%, penicillin / streptomycin solution (manufactured by Gibco, containing 5000 units / ml penicillin and 5000 μg / ml streptomycin) RPMI1640 medium (Nissui Pharmaceutical) The product was suspended in a 96-well microtiter plate and dispensed at 200 μl / well. CO2After culturing at 37 ° C. for 24 hours in an incubator, hygromycin (manufactured by Gibco) was added to a concentration of 0.5 mg / ml and cultured for 1 to 2 weeks. Transformant colonies appear and cells are collected from confluent wells. 1-2 × in RPMI1640-FCS (10) medium containing 0.5 mg / ml hygromycin and 50 nM methotrexate (hereinafter referred to as MTX) TenFiveThe cells were suspended at a cell / ml and dispensed at 2 ml / well into a 24-well plate. CO2Culturing at 37 ° C. for 1-2 weeks in an incubator induced 50 nM MTX resistant clones.
About 50 nM MTX resistant clones obtained above, 1-2 × 10 5 in RPMI1640-FCS (10) medium containing 0.5 mg / ml hygromycin, 200 nM MTXFiveThe cells were suspended to a cell / ml and dispensed at 2 ml / well into a 24-well plate. CO2Culturing at 37 ° C. for 1-2 weeks in an incubator induced 200 nM MTX resistant clones.
Further, for the 200 nM MTX resistant clone obtained above, 1-2 × 10 6 in RPMI1640-FCS (10) medium containing 0.5 mg / ml hygromycin, 500 nM MTX.FiveThe cells were suspended at a cell / ml and dispensed at 2 ml / well into a 24-well plate. CO2Culturing at 37 ° C. for 1-2 weeks in an incubator induced 500 nM MTX resistant clones.
The transformed strain is added to a serum-free medium for CHO cells, CHO-S-SFMII medium (manufactured by Gibco), 1-2 × 10FiveSuspend to be cells / ml, 225cm2100 ml each was dispensed into a flask (made by Greiner). CO2The cells were cultured in an incubator at 37 ° C. for 5 to 7 days, and the culture solution was collected when it became confluent.
Purification of hIL-5Rα from the culture supernatant was performed as follows. After adding 29.2 g of sodium chloride and 20 ml of 1M Tris-hydrochloric acid (pH 7.4) to 1 liter of the culture solution of the transformed strain by pAI289, the pH of the solution was adjusted to pH 7.4 using 1N sodium hydroxide solution. . The column was packed with about 10 ml of Concanavalin A-Sepharose (Pharmacia) gel, and washed with 50 ml of a buffer consisting of 20 mM Tris-HCl (pH 7.4) and 0.5 M sodium chloride at a flow rate of 0.5 ml / min. After washing, the solution containing shIL-5Rα prepared as described above was passed through a concanavalin A-Sepharose column at a flow rate of 0.5 ml / min. Further, after washing with 80 ml of a buffer solution composed of 20 mM Tris-HCl (pH 7.4) and 0.5 M sodium chloride at a flow rate of 0.5 ml / min, a buffer solution composed of 20 mM Tris-HCl (pH 7.4) and 0.5 M sodium chloride. Using 15 ml of a buffer solution consisting of 15 ml, 0.5 M α-methyl mannoside, 20 mM Tris-HCl (pH 7.4) and 0.5 M sodium chloride, the concentration of α-methyl mannoside is linearly changed from 0 to 0.5 M. Thus, the protein adsorbed on concanavalin A-Sepharose was eluted, and the eluate was fractionated by 1 ml (fractions 1 to 30). Furthermore, 20 ml of a buffer solution consisting of 1M α-methyl mannoside, 20 mM Tris-hydrochloric acid (pH 7.4) and 0.5 M sodium chloride was passed through, and fractionated in 2 ml portions (fractions 31 to 40). The protein concentration contained in each fraction was measured using a protein concentration measurement kit (manufactured by Bio-Rad), and fractions 10 to 40 having a high protein concentration were recovered. The protein solution was concentrated about 10 times using Centricon-30 manufactured by Amicon, sealed in a dialysis tube, and dialyzed against PBS. As described above, purified shIL-5Rα (protein concentration: 4 mg / ml, 3.5 ml) was obtained.
On the other hand, hIL-5Rα-Fc was obtained as follows. The column was packed with about 5 ml of protein A-Sepharose gel and washed with 50 ml of PBS. After washing, about 1 liter of the culture solution of the transformant by pAI301 was passed through a protein A-Sepharose column at a flow rate of 0.5 ml / min. The column was further washed with 50 ml of PBS, and then 20 ml of 0.1 M citrate buffer (pH 3.0) was passed through to elute the protein adsorbed on protein A-Sepharose and fractionate 1 ml at a time. To each fraction, 0.15 ml of 2M Tris-hydrochloric acid (pH 9.0) was added to adjust the pH. The protein concentration contained in each fraction was measured using a protein concentration measurement kit (manufactured by Bio-Rad), and the fraction having a high protein concentration was recovered. The protein solution was sealed in a dialysis tube and dialyzed against PBS. Purified hIL-5Rα-Fc (protein concentration 1.8 mg / ml, 5.5 ml) was obtained as described above.
(10) Expression of shIL-5Rα or hIL-5Rα-Fc by insect cells
ShIL-5Rα and hIL-5Rα-Fc were expressed by the following procedure according to the manual attached to the Pharmingen Baculo Gold Starter Kit.
The recovery of shIL-5Rα and hIL-5Rα-Fc from the culture broth was performed using concanavalin A-Sepharose and diethylaminoethyl (DEAE) -Sepharose, or protein A-Sepharose (both manufactured by Pharmacia Biotech).
shIL-5Rα was obtained as follows. Sf9 cell 6 × 106225cm2The flask (manufactured by Greiner) was suspended in 45 ml of Grace's Insect Medium (manufactured by Gibco) containing 10% FCS and cultured at 27 ° C. for 3 to 4 days. About 1 × 10 6 of the recombinant virus derived from transfer vector pAI292 obtained in Example 1 (8) and 30 ml of Grain's Insect Medium newly containing 10% FCS except for the culture supernatant71 ml of a solution containing a concentration of PFU / ml was added. After further culturing at 27 ° C. for 1 day, the supernatant was removed and 45 ml of Sf900-II medium was newly added, followed by culturing for 2 to 3 days. After completion of the culture, the culture supernatant was collected and centrifuged at 1,500 × g for 10 minutes to obtain a supernatant. Sodium chloride was added to the culture solution to a final concentration of 0.5 M, and 1/50 volume of 1 M Tris-hydrochloric acid (pH 7.4) was added, and then the pH of the solution was adjusted with 1N sodium hydroxide solution. The pH was adjusted to 7.4.
The column was packed with about 10 ml of concanavalin A-Sepharose gel, and washed with 50 ml of a buffer consisting of 20 mM Tris-HCl (pH 7.4) and 0.5 M sodium chloride at a flow rate of 0.5 ml / min. After washing, 500 ml of the culture solution containing shIL-5Rα prepared as described above was passed through a concanavalin A-Sepharose column at a flow rate of 0.5 ml / min. Further, after washing with 80 ml of a buffer solution consisting of 20 mM Tris-hydrochloric acid (pH 7.4) and 0.5 M sodium chloride at a flow rate of 0.5 ml / min, 1M α-methyl mannoside, 20 mM Tris-hydrochloric acid (pH 7.4), 60 ml of a buffer solution consisting of 0.5 M sodium chloride was passed through to elute the protein adsorbed on concanavalin A-Sepharose and fractionate the eluate by 2 ml. The protein concentration contained in each fraction was measured using a protein concentration measurement kit (manufactured by Bio-Rad), and 44 ml of a fraction having a high protein concentration was recovered and dialyzed against 20 mM Tris-HCl (pH 7.4). Further, 40 ml of a fraction with a high protein concentration was recovered from 900 ml of the culture solution containing shIL-5Rα prepared as described above, and dialyzed against 20 mM Tris-HCl (pH 7.4).
After dialysis, the protein solutions were combined and passed through a column packed with 10 ml of diethylaminoethyl (DEAE) -Sepharose gel to adsorb the protein. The elution of shIL-5Rα from the column was performed by linearly changing the sodium chloride concentration from 0 to 0.5 M, and 4 ml of a fraction containing shIL-5Rα at a high concentration was recovered. The protein solution was sealed in a dialysis tube and dialyzed against PBS. As described above, purified shIL-5Rα (protein concentration 400 μg / ml, 4.5 ml) was obtained.
On the other hand, hIL-5Rα-Fc was obtained as follows. Sf9 cell 6 × 106225cm2The flask (manufactured by Greiner) was suspended in 45 ml of Grace's Insect Medium (manufactured by Gibco) containing 10% FCS and cultured at 27 ° C. for 3 to 4 days. About 1 × 10 6 of the recombinant virus derived from transfer vector pAI297 obtained in Example 1 (8) and 30 ml of Grain's Insect Medium newly containing 10% FCS except for the culture supernatant71 ml of a solution containing a concentration of PFU / ml was added. After further culturing at 27 ° C. for 1 day, the supernatant was removed and 45 ml of Sf900-II medium was newly added, followed by culturing for 2 to 3 days. After completion of the culture, the culture supernatant was collected and centrifuged at 1,500 × g for 10 minutes to obtain a supernatant.
The column was packed with about 5 ml of protein A-Sepharose gel and washed with 50 ml of PBS. After washing, 450 ml of the culture solution containing hIL-5Rα-Fc was passed through a protein A-Sepharose column at a flow rate of 0.5 ml / min. The column was further washed with 50 ml of PBS, and then 20 ml of 0.1 M citrate buffer (pH 3.0) was passed through to elute the protein adsorbed on protein A-Sepharose and fractionate 1 ml at a time. To each fraction, 0.15 ml of 2M Tris-hydrochloric acid (pH 9.0) was added to adjust the pH. The protein concentration contained in each fraction was measured using a protein concentration measurement kit manufactured by Bio-Rad, and the fraction with a high protein concentration was recovered. The protein solution was concentrated about 3 times using Centricon-30 manufactured by Amicon, sealed in a dialysis tube, and dialyzed against PBS. As described above, purified hIL-5Rα-Fc (protein concentration 0.4 mg / ml, 1.8 ml) was obtained.
(11) Expression of shIL-5Rα partial fragment by E. coli
Expression of the shIL-5Rα partial fragment by E. coli is carried out by inserting pDNA263 containing the cDNA encoding shIL-5Rα fragment into the expression vector pMKex1 for E. coli shown below, and introducing pAI263 into E. coli. It was.
3 μg of plasmid pGHA2 (Japanese Patent Laid-Open No. 60-221091) was added to 30 μl of a buffer solution consisting of 50 mM Tris-hydrochloric acid (pH 7.5), 10 mM magnesium chloride, 100 mM sodium chloride and 1 mM DTT, and 10 units of EcoRI were further added. The reaction was carried out at 4 ° C. for 4 hours. DNA fragments were recovered from the reaction solution by ethanol precipitation, and 30 μl of a buffer solution consisting of 10 mM Tris-HCl (pH 7.5), 10 mM magnesium chloride, 50 mM sodium chloride and 1 mM DTT and 10 units of ClaI were added at 37 ° C. Reacted for hours. The reaction solution was fractionated by agarose gel electrophoresis, and about 0.3 μg of EcoRI / ClaI fragment of pGHA2 containing the promoter region was recovered.
3 μg of plasmid pTerm2 (Japanese Patent Laid-Open No. 2-227075) was added to 30 μl of a buffer solution consisting of 50 mM Tris-hydrochloric acid (pH 7.5), 10 mM magnesium chloride, 100 mM sodium chloride and 1 mM DTT, and 10 units of EcoRI was added at 37 ° C. For 4 hours. A DNA fragment was recovered from the reaction solution by ethanol precipitation, and a buffer solution consisting of 10 mM Tris-HCl (pH 8.4), 10 mM magnesium chloride, 100 mM sodium chloride and 1 mM DTT, 30 μl and 10 units of NsiI were added at 37 ° C. The reaction was performed for 4 hours. The reaction solution was fractionated by agarose gel electrophoresis, and about 0.8 μg of EcoRI / NsiI fragment of pTerm2 containing was recovered.
Dissolve 50 ng of EcoRI / ClaI fragment of pGHA2, 100 ng of EcoRI / NsiI fragment of pTerm2 and 100 ng of the synthetic DNA shown in SEQ ID NO: 15 in 20 μl of T4 DNA ligase buffer, add 200 units of T4 DNA ligase at 12 ° C The binding reaction was performed for 16 hours. Escherichia coli JM109 strain was transformed with the recombinant plasmid DNA thus obtained to obtain plasmid pMKex1 shown in FIG.
On the other hand, 3 μg of pAI234 obtained in FIG. 3 was added to 30 μl of a buffer solution consisting of 50 mM Tris-hydrochloric acid (pH 7.5), 10 mM magnesium chloride, 100 mM sodium chloride and 1 mM DTT, and further 10 units of PstI were added. The reaction was carried out at 4 ° C. for 4 hours. DNA fragments were recovered from the reaction solution by ethanol precipitation, and 20 μl of T4 DNA polymerase I buffer [33 mM Tris-acetic acid (pH 8.0), 66 mM potassium acetate, 10 mM magnesium acetate, 0.5 mM DTT, 0.01% BSA buffer solution] 5 units of T4 DNA polymerase I (Takara Shuzo) was added, and the mixture was reacted at 12 ° C. for 15 minutes to change the 5 ′ protruding end generated by PstI digestion to a blunt end. Further, the reaction solution was extracted with phenol-chloroform and ethanol precipitated, and 30 μl of a buffer solution containing 20 mM Tris-hydrochloric acid (pH 8.5), 10 mM magnesium chloride, 100 mM potassium chloride, and 1 mM DTT and 10 units of BamHI were added. The reaction was carried out at 4 ° C. for 4 hours. The reaction solution was fractionated by agarose gel electrophoresis, and about 0.7 μg of a DNA fragment of about 0.7 kb containing a cDNA encoding shIL-5Rα fragment was recovered.
3 μg of the expression vector pMKex1 for E. coli obtained in FIG. 12 was dissolved in 30 μl of a buffer consisting of 20 mM Tris-HCl (pH 8.5), 10 mM magnesium chloride, 100 mM potassium chloride and 1 mM DTT, and 10 units of BamHI was added. And reacted at 37 ° C. for 4 hours. The DNA fragment was recovered from the reaction solution by ethanol precipitation, dissolved in 30 μl of a buffer solution consisting of 50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 10 mM magnesium chloride, 100 mM sodium chloride and 1 mM DTT, and 10 units of EcoRV were added. The reaction was performed at 37 ° C. for 4 hours. About 1.5 μg of DNA fragment was recovered from the reaction solution by ethanol precipitation.
50 ng of the cDNA encoding the shIL-5Rα fragment obtained as described above and 100 ng of the EcoRV / BamHI fragment of pMKex1 were dissolved in 20 μl of T4 DNA ligase buffer, and 200 units of T4 DNA ligase was added. A time binding reaction was performed. Escherichia coli JM109 strain was transformed with the recombinant plasmid DNA thus obtained to obtain plasmid pAI263 shown in FIG.
The above plasmid pAI263 was introduced into Escherichia coli (Molecular Cloning. A Laboratory Manua1, 2nd Edition published by Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989), and cultured in 400 ml of LB medium containing 200 μg / ml ampicillin at 37 ° C. for 4 hours. 0.5 mM IPTG was added, followed by further incubation at 37 ° C. for 2 hours. 400 ml of the culture solution was centrifuged at 3,000 × g for 15 minutes, and the precipitate containing E. coli was suspended in 100 ml of buffer I [buffer consisting of 10 mM Tris-HCl (pH 8.0), 1 mM MEDTA, 150 mM sodium chloride]. . After centrifugation again, the precipitate is suspended in 7 ml of buffer I, and the cells are destroyed by sonication. This was centrifuged at 10,000 × g for 30 minutes, and the precipitate was added to 500 μl SDS-polyacrylamide gel electrophoresis sample buffer [6 mM Tris-HCl (pH 6.8), 2% SDS, 10% glycerol, 5% 2-mercaptoethanol. And was fractionated by polyacrylamide gel electrophoresis to obtain a purified shIL-5Rα fragment having a molecular weight of about 27 kD.
(12) Preparation of cell membrane fraction of cells expressing human IL-5Rα
CTLL-2 cells transfected with hIL-5Rα gene [Journal of Experimental Medicine (J. Exp. Med.),177, 1523 (1993)], or membrane components from CTLL-2 cells [ATCC TIB 214] as a control were prepared as follows.
The cells are centrifuged (1,200 rpm, 5 minutes), washed twice with PBS, and then a cell disruption buffer [buffer solution comprising 20 mM HEPES (pH 7.4), 1 mM EDTA, 0.5 mM PMSF, 250 mM sucrose. ] And then crushed using a homogenizer. After disruption, the precipitate was removed by centrifugation at 5,500 rpm for 15 minutes, and further centrifuged at 35,000 rpm to collect the cell membrane fraction as a precipitate.
2. Animal immunity and preparation of antibody-producing cells
50 μg of various antigens obtained from 1 (9), 1 (10), 1 (11) or 1 (12) of Example 1 were each 2 mg of aluminum gel and pertussis vaccine (manufactured by Chiba Prefectural Serum Research Institute) 1 × 109The cells were administered to 5-week-old female BALB / c mice or female SD rats together with the cells, and 50 μg of protein was administered once a week for a total of 4 times from 2 weeks later. Blood was collected from the fundus venous plexus or tail vein, the serum antibody titer was examined by the enzyme immunoassay shown in 3 of Example 1, and the spleen was removed 3 days after the final immunization from a mouse or rat that showed a sufficient antibody titer. At this time, 13 mice and 5 rats were immunized using the cell membrane fraction obtained in 1 (12) of Example 1 as an antigen, but no strong increase in antibody titer was observed. The antibody titer of 5 rats immunized with shIL-5Rα obtained in 1 (9) of Example 1 or 10 rats immunized with shIL-5Rα obtained in 1 (10) of Example 1 A sufficient increase was not observed.
Shred the spleen in MEM medium (Nissui Pharmaceutical), loosen with tweezers, centrifuge (1,200 rpm, 5 minutes), discard the supernatant, and tris-ammonium chloride buffer (pH 7.65). The cells were treated for 1-2 minutes to remove erythrocytes, washed 3 times with MEM medium, and used for cell fusion.
3. Enzyme immunoassay
Antiserum and hybridoma culture supernatants derived from mice or rats immunized with shIL-5Rα obtained in 1 (9) or 1 (10) of Example 1 were used as antigens. The hIL-5Rα-Fc obtained from the insect cell culture supernatant of 10) was used according to the following two methods.
(A) hIL-5Rα-Fc diluted to a concentration of 1 μg / ml with PBS and anti-GD3 chimeric antibody KM871 having a common human immunoglobulin constant region as a control antigen on a 96-well EIA plate (Greiner) The solution was dispensed at 50 μl / well and allowed to stand overnight at 4 ° C. for adsorption. After washing, 100 μl / well of PBS containing 1% bovine serum albumin (BSA) (1% BSA-PBS) was added and reacted for 1 hour at room temperature to block remaining active groups. 1% BSA-PBS was discarded, and the culture supernatant of immunized mouse or immunized rat antiserum and hybridoma was dispensed at 50 μl / well and allowed to react for 2 hours. After washing with tween-PBS, peroxidase-labeled rabbit anti-mouse immunoglobulin or anti-rat immunoglobulin (DAKO) was added at 50 μl / well and allowed to react at room temperature for 1 hour. After washing with tween-PBS, ABTS substrate solution [2, 550mg of 2'azinobis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) diammonium was dissolved in 1L of 0.1M citrate buffer (pH 4.2), and 1μl / ml of hydrogen peroxide was added just before use. The color was developed using the OD, and the absorbance at OD 415 nm was measured (NJ2001; manufactured by Nihon Intermed).
(B) Further, for the purpose of selecting a monoclonal antibody having neutralizing activity against IL-5 with a higher probability, it was obtained from biotin-labeled human IL-5 and the insect cell culture supernatant of Example 1 (10). Using the obtained shIL-5Rα-Fc, screening was performed by the following procedure using the binding inhibitory activity of IL-5 to the receptor as an index. The human IL-5 used for biotin labeling is a journal of immunological methods [Journal of Immunological Methods,125, 233 (1989)].
The biotin labeling of human IL-5 was performed according to the following procedure according to the protocol attached to the biotin labeling reagent (Biotin-LC-Hydrazide) manufactured by Pierce. First, 1.6 mg / ml human IL-5 dissolved in PBS was added to the labeling buffer (100 mM sodium acetate, 0.02% NaN).ThreeAnd passed through a PD10 column (manufactured by Pharmacia) equilibrated with pH 5.5) to perform salt exchange, and 1 ml of a fraction having a high protein concentration was recovered. 1 ml of a labeling buffer containing 30 mM metaperiodic acid was added to 0.5 ml of the human IL-5 solution, and the mixture was allowed to react at room temperature for 30 minutes while being protected from light. After completion of the reaction, the mixture was passed through a PD10 column equilibrated with a labeling buffer to remove unreacted metaperiodic acid, and 1.5 ml of a fraction with a high protein concentration was recovered. Here, 20 μl of a labeling buffer containing 5 mM of the biotin labeling reagent described above was added and further reacted at room temperature for 1 hour. After completion of the reaction, add 50 μl of reaction stop solution (0.1 M Tris, pH 7.5), then add 0.05% NaNThreeSalt was exchanged by passing through a PD10 column equilibrated with PBS containing and unreacted reagents were removed. The obtained biotin-labeled human IL-5 was stored at 4 ° C.
ShIL-5Rα-Fc obtained from the insect cell culture supernatant of 1 (10) of Example 1 was diluted with PBS to a concentration of 5 μg / ml, and 50 μl / well was added to a 96-well EIA plate (Greiner). And left to stand at 4 ° C. overnight for adsorption. After washing with PBS, PBS containing 1% bovine serum albumin (BSA) (1% BSA-PBS) was added at 100 μl / well and reacted at room temperature for 1 hour to block remaining active groups. Further, immediately after washing with tween-PBS, the culture supernatant of the immunized mouse or immunized rat antiserum and hybridoma and the above-mentioned biotin-labeled human IL-5 were dispensed at 50 μl / well, and reacted at 4 ° C. overnight. . The next day, after washing with tween-PBS, peroxidase-labeled avidin D (manufactured by Nichirei) diluted 4000 times with 1% BSA-PBS was added at 50 μl / well, reacted at room temperature for 1 hour, washed with tween-PBS, ABTS substrate solution was added at 50 μl / well for color development, and the absorbance at OD 415 nm was measured.
In addition, regarding the measurement of the antiserum and hybridoma culture supernatant derived from mice or rats immunized with the hIL-5Rα fragment obtained in Example 1 1 (11), 1 (11) of Example 1 was used as an antigen. The hIL-5Rα fragment obtained from Escherichia coli was used. Prepare a plate adsorbing shIL-5Rα produced by Escherichia coli and Escherichia coli bacterial protein as a control antigen in the same manner as above, and reactivate the culture supernatant of the hybridoma and the antiserum of the immunized mouse or immunized rat. investigated.
Furthermore, the measurement of the culture supernatant of antiserum and hybridoma derived from mice or rats immunized with the membrane fraction of cells expressing hIL-5Rα obtained in Example 1, 1 (12) was performed as an antigen. The cell membrane fraction obtained in 1 (12) of Example 1 was used. A plate adsorbing the membrane fraction of IL-5Rα-expressing cells and the membrane fraction of control cells was prepared in the same manner as described above, and the reactivity of the hybridoma culture supernatant and the immunized mouse or immunized rat antiserum was measured. It was investigated.
4). Preparation of mouse myeloma cells
8-Azaguanine resistant mouse myeloma cell line P3-U1 is cultured in normal medium and 2 × 10 at the time of cell fusion7The above cells were secured and used as a parent strain for cell fusion.
5. Hybridoma production
Mouse splenocytes or rat splenocytes obtained in 2 of Example 1 and myeloma cells obtained in 4 of Example 1 were mixed at 10: 1 and centrifuged (1,200 rpm, 5 minutes). Thereafter, the supernatant was discarded, and the precipitated cells were thoroughly loosened. Then, while stirring, at 37 ° C., 2 g of polyethylene glycol-1000 (PEG-1000), 2 ml of MEM medium and 0.7 ml of DMSO 0.2 to 1 ml / Ten8Mouse spleen cells were added, and 1-2 ml of MEM medium was added several times every 1-2 minutes, and then the MEM medium was added so that the total volume became 50 ml. After centrifugation (900 rpm, 5 minutes), the supernatant was discarded, the cells were loosened gently, and the cells were gently suspended in 100 ml of HAT medium by suction and suction with a pipette.
Dispense 100 μl / well of this suspension into a 96-well culture plate and add 5% CO2.2CO for 10-14 days at 37 ° C in incubator2 Cultured under 5%. The culture supernatant was examined by the enzyme immunoassay described in 3 of Example 1, and wells specifically reacting with hIL-5Rα-Fc prepared from insect cell culture supernatant or shIL-5Rα produced by E. coli were prepared. The hybridoma strain producing the anti-human IL-5Rα monoclonal antibody was established by selecting and further switching to HT medium and normal medium and repeating cloning twice.
As a result of screening about 4000 clones of hybridomas obtained from 6 mice immunized with the hIL-5Rα fragment obtained in 1 (11) of Example 1 or 8 rats, an anti-hIL-5Rα monoclonal antibody was obtained. Was named KM1074, but its reactivity with IL-5Rα chain was extremely weak compared to anti-human IL-5Rα chain monoclonal antibodies KM1257 and KM1259 described later.
On the other hand, 12 or 6 individuals showing high antibody titers were selected from 15 or 20 mice immunized with shIL-5Rα obtained in 1 (9) of Example 1 or 1 (10) of Example 1. Thus, a hybridoma was prepared. More than 10000 clones of hybridomas were screened, and 81 clones of anti-hIL-5Rα monoclonal antibody-producing hybridomas that showed specific reactivity against hIL-5Rα-expressing cells were established by the method shown in 1 of Example 3 described later. Among these, KM1257 was the monoclonal antibody that showed the strongest reactivity in the immunocytostaining method shown in 1 of Example 3 described later. Hybridoma KM1257 was deposited as FERM BP-5133 on June 13, 1995 at the Institute of Biotechnology, Institute of Industrial Technology (1-3 Higashi 1-chome, Tsukuba, Ibaraki, Japan, the same address below) It was. Of these 81 clones, only 6 clones showed a strong inhibitory action on the biological activity of IL-5 shown in Example 3-2, which will be described later. Monoclonal antibody showing the strongest inhibitory activity among them. Were KM1259 and KM1486. Hybridoma KM1259 was deposited as FERM BP-5134 on June 13, 1995, and Hybridoma KM1486 was deposited as FERM BP-5651 on September 3, 1996, respectively, at the Institute of Biotechnology, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology. It was.
The reactivity of monoclonal antibodies KM1257, KM1259 and KM1486 is shown in FIG. For the antibody class, enzyme immunoassay using a sub-clustering kit was performed. As a result, the antibody classes of KM1257, KM1259 and KM1486 were all IgG1.
6). Purification of monoclonal antibodies
Hybridoma strain obtained in 5 to 5 to 20 × 10 5 in 8 weeks old nude female mice (Balb / c) treated with pristane6Each cell / animal was injected intraperitoneally. After 10 to 21 days, the hybridoma developed ascites tumor. Ascites collected from ascitic fluid (1-8ml / animal), centrifuged (3,000rpm, 5min) to remove solids, and then caprylic acid precipitation (Antibodies-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory) , 1988) to obtain a purified monoclonal antibody.
Example 2 Production of anti-human IL-5Rα chain humanized antibody
1. Construction of tandem cassette type humanized antibody expression vector pKANTEX93
The humanized antibody VH and VL-encoding cDNAs are inserted upstream of the cDNA encoding human antibody Cγ1 and cDNA encoding human antibody Cκ, respectively, and humanized antibodies IgG1 and κ are expressed in animal cells. A tandem cassette type humanized antibody expression vector, pKANTEX93, was constructed based on the plasmid pSE1UK1SEd1-3 described in JP-A-2-57891 as follows. The constructed humanized antibody expression vector was used for expression of human chimeric antibody and human CDR-grafted antibody in animal cells.
(1) Rabbit β-globin gene splicing, modification of restriction enzyme ApaI and EcoRI sites present in poly A signal
Human chimeric antibody expression by inserting V region of human chimeric antibody or human CDR grafted antibody into cassette form with restriction enzyme NotI-ApaI fragment (VH) and EcoRI-SplI fragment (VL) in humanized antibody expression vector In order to construct a vector or human CDR-grafted antibody humanized antibody expression vector, rabbit β-globin gene splicing of plasmid pSE1UK1SEd1-3, restriction enzyme ApaI and EcoRI sites present in poly A signal are modified as follows: It was done.
Add 3 μg of plasmid pBluescript SK (-) (Stratagene) to 10 μl of a buffer solution consisting of 10 mM Tris-HCl (pH 7.5), 10 mM magnesium chloride and 1 mM DTT, and 10 units of restriction enzyme ApaI (Takara Shuzo) And reacted at 37 ° C. for 1 hour. The reaction solution was precipitated with ethanol, and 3 ′ protruding ends generated by ApaI digestion were changed to blunt ends using DNA Blunting Kit (Takara Shuzo), followed by ligation using DNA Ligation Kit (Takara Shuzo). Escherichia coli HB101 was transformed with the recombinant plasmid DNA solution thus obtained to obtain the plasmid pBSA shown in FIG.
Further, 3 μg of the obtained plasmid pBSA was added to 10 μl of a buffer solution consisting of 50 mM Tris-hydrochloric acid (pH 7.5), 10 mM magnesium chloride, 100 mM sodium chloride and 1 mM DTT, and 10 units of restriction enzyme EcoRI (manufactured by Takara Shuzo) was added. And allowed to react at 37 ° C. for 1 hour. The reaction solution was ethanol precipitated, and the DNA Blunting Kit (Takara Shuzo) was used to change the 5 ′ protruding end generated by EcoRI digestion to a blunt end, followed by ligation using the DNA Ligation Kit (Takara Shuzo). Escherichia coli HB101 was transformed with the recombinant plasmid DNA solution thus obtained to obtain the plasmid pBSAE shown in FIG.
Next, 3 μg of the plasmid pBSAE obtained above was added to 10 μl of a buffer solution consisting of 10 mM Tris-HCl (pH 7.5), 10 mM magnesium chloride, 50 mM sodium chloride and 1 mM DTT, and 10 units of restriction enzyme HindIII (Takara Shuzo) Made) and reacted at 37 ° C. for 1 hour. The reaction solution was ethanol-precipitated and dissolved in 20 μl of a buffer solution consisting of 10 mM Tris-HCl (pH 7.5), 10 mM magnesium chloride and 1 mM DTT, divided into 10 μl aliquots, one of which contained 10 units of restriction enzyme SacII (Toyo Spindle) and another 10 units of restriction enzyme KpnI (Takara Shuzo) were added and reacted at 37 ° C. for 1 hour. Both reaction solutions were fractionated by agarose gel electrophoresis, and about 0.3 μg of about 2.96 kb HindIII-SacII fragment and about 2.96 kb KpnI-HindIII fragment were recovered.
Next, 3 μg of plasmid pSE1UK1SEd1-3 was added to 10 μl of a buffer solution consisting of 10 mM Tris-HCl (pH 7.5), 10 mM magnesium chloride and 1 mM DTT, and 10 units of restriction enzyme SacII (manufactured by Toyobo Co., Ltd.) and 10 units of Restriction enzyme KpnI (Takara Shuzo Co., Ltd.) was added and reacted at 37 ° C. for 1 hour. The reaction solution was ethanol precipitated, dissolved in 10 μl of a buffer solution consisting of 10 mM Tris-HCl (pH 7.5), 10 mM magnesium chloride, 50 mM sodium chloride and 1 mM DTT, and further 10 units of restriction enzyme HindIII (Takara Shuzo) And reacted at 37 ° C. for 1 hour. The reaction mixture was fractionated by agarose gel electrophoresis, and about 0.2 μg of about 2.42 kb HindIII-SacII fragment and about 1.98 kb KpnI-HindIII fragment were recovered.
Next, 0.1 μg of the HindIII-SacII fragment of pSE1UK1SEd1-3 obtained above and 0.1 μg of the HindIII-SacII fragment of pBSAE were dissolved in 20 μl of sterilized water, and Ready-To-Go T4 DNA Ligase (manufactured by Pharmacia Biotech) was dissolved. ). Escherichia coli HB101 strain was transformed with the recombinant plasmid DNA solution thus obtained to obtain plasmid pBSH-S shown in FIG. In addition, 0.1 μg of the KpnI-HindIII fragment of pSE1UK1SEd1-3 and 0.1 μg of the KpnI-HindIII fragment of pBSAE obtained above were dissolved in 20 μl of sterilized water to prepare Ready-To-Go T4 DNA Ligase (Pharmacia Biotech) Were connected using Escherichia coli HB101 strain was transformed with the recombinant plasmid DNA solution thus obtained to obtain plasmid pBSK-H shown in FIG.
Next, 3 μg of the plasmids pBSH-S and pBSK-H obtained above were added to 10 μl of a buffer consisting of 10 mM Tris-hydrochloric acid (pH 7.5), 10 mM magnesium chloride and 1 mM DTT, respectively, and further 10 units of restriction enzyme ApaI. (Takara Shuzo Co., Ltd.) was added and reacted at 37 ° C for 1 hour. Both reaction solutions were precipitated with ethanol, and each DNA Blunting Kit (Takara Shuzo) was used to change the 3 ′ protruding ends generated by ApaI digestion to blunt ends, followed by ligation using DNA Ligation Kit (Takara Shuzo). . Escherichia coli HB101 strain was transformed with each of the thus obtained recombinant plasmid DNA solutions to obtain plasmids pBSH-SA and pBSK-HA shown in FIG.
Next, 5 μg of the plasmids pBSH-SA and pBSK-HA obtained above were added to 10 μl of a buffer solution consisting of 50 mM Tris-hydrochloric acid (pH 7.5), 10 mM magnesium chloride, 100 mM sodium chloride and 1 mM DTT, respectively, and 1 unit. Restriction enzyme EcoRI (Takara Shuzo) was added and reacted at 37 ° C. for 10 minutes to partially digest. Both reaction solutions were ethanol precipitated, and each DNA Blunting Kit (Takara Shuzo) was used to change the 5 ′ overhangs generated by EcoRI digestion to blunt ends, and then fractionated by agarose gel electrophoresis, each of about 5.38. About 0.5 μg of kb fragment and about 4.94 kb fragment were recovered. 0.1 μg of each recovered fragment was dissolved in a total amount of 20 μl of sterilized water, and ligated using Ready-To-Go T4 DNA Ligase (Pharmacia Biotech). Escherichia coli HB101 strain was transformed with each of the recombinant plasmid DNA solutions thus obtained to obtain plasmids pBSH-SAE and pBSK-HAE shown in FIG.
Next, 3 μg of the plasmids pBSH-SAE and pBSK-HAE obtained above were added to 10 μl of a buffer solution consisting of 50 mM Tris-hydrochloric acid (pH 7.5), 10 mM magnesium chloride, 100 mM sodium chloride and 1 mM DTT, respectively, and further 10 units. Restriction enzyme EcoRI (Takara Shuzo Co., Ltd.) was added and reacted at 37 ° C. for 1 hour. Both reaction solutions were ethanol precipitated, and each DNA Blunting Kit (Takara Shuzo) was used to change the 5 ′ protruding end generated by EcoRI digestion to a blunt end, followed by ligation using DNA Ligation Kit (Takara Shuzo). . Escherichia coli HB101 strain was transformed with each of the recombinant plasmid DNA solutions thus obtained to obtain plasmids pBSH-SAEE and pBSK-HAEE shown in FIG. 10 μg of each of the obtained plasmids was reacted according to the prescription attached to AutoRead Sequencing Kit (Pharmacia Biotech), then electrophoresed with ALFDNA Sequencer (Pharmacia Biotech), and the nucleotide sequence was determined. As a result, it was confirmed that both ApaI and EcoRI sites disappeared.
(2) Rabbit β-globin gene splicing, poly A signal, and introduction of restriction enzyme SalI site downstream of SV40 early gene poly A signal
Rabbit β-globin gene splicing, poly A signal and SV40 early gene poly A signal of plasmid pSE1UK1SEd1-3 to enable conversion of the expression promoter of antibody H chain and L chain of humanized antibody expression vector to any promoter The restriction enzyme SalI site was introduced into the downstream of as follows.
3 μg of the plasmid pBSK-HAEE obtained in 1 (1) of Example 2 was added to 10 μl of a buffer solution consisting of 10 mM Tris-HCl (pH 7.5), 10 mM magnesium chloride and 1 mM DTT, and 10 units of restriction enzyme NaeI ( Takara Shuzo Co., Ltd.) was added and reacted at 37 ° C. for 1 hour. The reaction solution was ethanol precipitated, dissolved in 20 μl of a buffer solution consisting of 50 mM Tris-HCl (pH 9.0) and 1 mM magnesium chloride, and 1 unit of alkaline phosphatase (E. coli C75, manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd.) was added. The reaction was carried out at 0 ° C. for 1 hour to dephosphorylate the 5 ′ end. Further, the reaction solution was extracted with phenol-chloroform and precipitated with ethanol, and dissolved in 20 μl of a buffer solution (hereinafter referred to as TE buffer solution) composed of 10 mM Tris-hydrochloric acid (pH 8.0) and 1 mM disodium ethylenediaminetetraacetate. 1 μl of the reaction solution and 0.1 μg of phosphorylated SalI linker (Takara Shuzo) were added to sterilized water to a total volume of 20 μl, and ligated using Ready-To-Go T4 DNA Ligase (Pharmacia Biotech). . Escherichia coli HB101 strain was transformed with the recombinant plasmid DNA solution thus obtained to obtain the plasmid pBSK-HAEESal shown in FIG. 10 μg of the obtained plasmid was reacted according to the prescription attached to AutoRead Sequencing Kit (Pharmacia Biotech), then electrophoresed with ALFDNA Sequencer (Pharmacia Biotech), and the nucleotide sequence was determined. It was confirmed that one restriction enzyme SalI site was introduced downstream of globin gene splicing, poly A signal and SV40 early gene poly A signal.
(3) Modification of the restriction enzyme ApaI site present in the poly A signal of the herpes simplex virus thymidine kinase (hereinafter referred to as HSVtk) gene
Modification of the restriction enzyme ApaI site present in the HSVtk gene polyA signal downstream of the Tn5 kanamycin phosphotransferase gene of the plasmid pSE1UK1SEd1-3 was performed as follows.
3 μg of the plasmid pBSA obtained in 1 (1) of Example 2 was added to 10 μl of a buffer solution consisting of 10 mM Tris-HCl (pH 7.5), 10 mM magnesium chloride and 1 mM DTT, and 10 units of restriction enzyme SacII (Toyobo Co., Ltd.). And the mixture was allowed to react at 37 ° C. for 1 hour. The reaction solution was ethanol precipitated and added to 10 μl of a buffer solution consisting of 50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 100 mM sodium chloride, 10 mM magnesium chloride and 1 mM DTT, and 10 units of restriction enzyme XhoI (Takara Shuzo) was added. And allowed to react at 37 ° C. for 1 hour. The reaction solution was fractionated by agarose gel electrophoresis, and about 1 μg of an about 2.96 kb SacII-XhoI fragment was recovered.
Next, 5 μg of plasmid pSE1UK1SEd1-3 was added to 10 μl of a buffer solution consisting of 10 mM Tris-HCl (pH 7.5), 10 mM magnesium chloride and 1 mM DTT, and 10 units of restriction enzyme SacII (manufactured by Toyobo Co., Ltd.) was added. The reaction was allowed to proceed at 37 ° C for 1 hour. The reaction solution was precipitated with ethanol, added to 10 μl of a buffer solution consisting of 50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 100 mM sodium chloride, 10 mM magnesium chloride and 1 mM DTT, and further 10 units of restriction enzyme XhoI (Takara Shuzo) was added. The reaction was allowed to proceed at 37 ° C for 1 hour. The reaction solution was fractionated by agarose gel electrophoresis, and about 1 μg of an about 4.25 kb SacII-XhoI fragment was recovered.
Next, 0.1 μg of pBSA SacII-XhoI fragment obtained above and SacII-XhoI fragment of pSE1UK1SEd1-3 were added to a total amount of 20 μl of sterilized water, and Ready-To-Go T4 DNA Ligase (Pharmacia Biotech) was used. Connected. Escherichia coli HB101 strain was transformed with the recombinant plasmid DNA solution thus obtained to obtain plasmid pBSX-S shown in FIG.
Next, 3 μg of the plasmid pBSX-S obtained above was added to 10 μl of a buffer solution consisting of 10 mM Tris-HCl (pH 7.5), 10 mM magnesium chloride and 1 mM DTT, and 10 units of restriction enzyme ApaI (Takara Shuzo) And reacted at 37 ° C. for 1 hour. The reaction solution was precipitated with ethanol, and 3 ′ protruding ends generated by ApaI digestion were changed to blunt ends using DNA Blunting Kit (Takara Shuzo), followed by ligation using DNA Ligation Kit (Takara Shuzo). Escherichia coli HB101 was transformed with the recombinant plasmid DNA solution thus obtained to obtain the plasmid pBSX-SA shown in FIG. 10 μg of the obtained plasmid was reacted according to the prescription attached to AutoRead Sequencing Kit (Pharmacia Biotech), then electrophoresed with ALFDNA Sequencer (Pharmacia Biotech), and the nucleotide sequence was determined. It was confirmed that the restriction enzyme ApaI site of A signal disappeared.
(4) Construction of humanized antibody light chain expression unit
Humans that have cDNA encoding human antibody Cκ downstream of the promoter / enhancer of the terminal repeat sequence of Moloney murine leukemia virus, and that can insert cDNA encoding human chimeric antibody or human CDR-grafted antibody VL in a cassette format A plasmid pMohCκ having a modified antibody L chain expression unit was constructed as follows.
Add 3 μg of plasmid pBluescript SK (-) (Stratagene) to 10 μl of a buffer solution consisting of 10 mM Tris-HCl (pH 7.5), 10 mM magnesium chloride and 1 mM DTT, and further 10 units of restriction enzyme SacI (Takara Shuzo) And reacted at 37 ° C. for 1 hour. The reaction solution was precipitated with ethanol, added to 10 μl of a buffer solution consisting of 10 mM Tris-hydrochloric acid (pH 7.5), 50 mM sodium chloride, 10 mM magnesium chloride and 1 mM DTT, and further 10 units of restriction enzyme ClaI (Takara Shuzo) was added. The reaction was allowed to proceed at 37 ° C for 1 hour. The reaction solution was precipitated with ethanol, and using a DNA Blunting Kit (Takara Shuzo Co., Ltd.), the protruding ends generated by SacI and ClaI digestion were changed to blunt ends, and fractionated by agarose gel electrophoresis. About 1 μg of DNA fragment was recovered. The recovered DNA fragment (0.1 μg) was added to a total amount of 20 μl of sterilized water and ligated using Ready-To-Go T4 DNA Ligase (Pharmacia Biotech). Escherichia coli HB101 strain was transformed with the recombinant plasmid DNA solution thus obtained to obtain the plasmid pBSSC shown in FIG.
Next, 3 μg of the plasmid pBSSC obtained above was added to 10 μl of a buffer solution consisting of 10 mM Tris-HCl (pH 7.5), 10 mM magnesium chloride and 1 mM DTT, and 10 units of restriction enzyme KpnI (Takara Shuzo) was added. And allowed to react at 37 ° C. for 1 hour. The reaction solution was ethanol precipitated, dissolved in 10 μl of a buffer solution consisting of 50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 100 mM sodium chloride, 10 mM magnesium chloride, and 1 mM DTT, and further 10 units of restriction enzyme XhoI (Takara Shuzo) was added. And allowed to react at 37 ° C. for 1 hour. The reaction solution was fractionated by agarose gel electrophoresis, and about 1 μg of an about 2.96 kb KpnI-XhoI fragment was recovered.
Next, 5 μg of plasmid pAGE147 described in JP-A-6-205694 is added to 10 μl of a buffer solution consisting of 10 mM Tris-HCl (pH 7.5), 10 mM magnesium chloride and 1 mM DTT, and further 10 units of restriction enzyme KpnI (Takara Shuzo Co., Ltd.). ) Was added and reacted at 37 ° C. for 1 hour. The reaction solution was ethanol precipitated, dissolved in 10 μl of a buffer solution consisting of 50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 100 mM sodium chloride, 10 mM magnesium chloride, and 1 mM DTT, and further 10 units of restriction enzyme XhoI (Takara Shuzo) was added. And allowed to react at 37 ° C. for 1 hour. The reaction solution was fractionated by agarose gel electrophoresis, and about 0.3 μg of an about 0.66 kb KpnI-XhoI fragment containing the promoter / enhancer of the terminal repeat sequence of Moloney murine leukemia virus was recovered.
Next, 0.1 μg of the KpnI-XhoI fragment of pBSSC obtained above and 0.1 μg of the KpnI-XhoI fragment of pAGE147 were dissolved in 20 μl of sterilized water, and Ready-To-Go T4 DNA Ligase (Pharmacia Biotech) was prepared. Connected. Escherichia coli HB101 strain was transformed with the recombinant plasmid DNA solution thus obtained to obtain the plasmid pBSMo shown in FIG.
Next, 3 μg of the plasmid pBSMo obtained above was added to 10 μl of a buffer solution consisting of 10 mM Tris-HCl (pH 7.5), 10 mM magnesium chloride and 1 mM DTT, and 10 units of restriction enzyme KpnI (Takara Shuzo) was added. And allowed to react at 37 ° C. for 1 hour. The reaction solution was ethanol precipitated, dissolved in 10 μl of a buffer solution consisting of 10 mM Tris-HCl (pH 7.5), 50 mM sodium chloride, 10 mM magnesium chloride and 1 mM DTT, and further 10 units of restriction enzyme HindIII (Takara Shuzo) was added. And allowed to react at 37 ° C. for 1 hour. The reaction solution was fractionated by agarose gel electrophoresis, and about 1 μg of an about 3.62 kb KpnI-HindIII fragment was recovered.
Next, synthetic DNAs having the base sequences described in SEQ ID NOs: 16 and 17 were synthesized using an automatic DNA synthesizer (380A, manufactured by Applied Biosystems). 0.3 μg of the obtained synthetic DNA was added to 15 μl of sterilized water and heated at 65 ° C. for 5 minutes. The reaction solution was allowed to stand at room temperature for 30 minutes, 10 μl buffer solution [500 mM Tris-hydrochloric acid (pH 7.6), 100 mM magnesium chloride, 50 mM DTT] 2 μl and 10 mM ATP 2 μl were added, and 10 units of T4 polynucleotide kinase ( Takara Shuzo Co., Ltd.) was added and reacted at 37 ° C. for 30 minutes to phosphorylate the 5 ′ end. Add 0.1 μg of the KpnI-HindIII fragment (3.66 kb) derived from the plasmid pBSMo obtained above and 0.05 μg of phosphorylated synthetic DNA to 20 μl of total sterilized water, and then add Ready-To-Go T4 DNA Ligase (Pharmacia Biotech). Connected. Escherichia coli HB101 strain was transformed with the recombinant plasmid DNA solution thus obtained to obtain the plasmid pBSMoS shown in FIG. Using 10 μg of the resulting plasmid, react according to the prescription attached to AutoRead Sequencing Kit (Pharmacia Biotech), then perform electrophoresis using ALFDNA Sequencer (Pharmacia Biotech) and determine the base sequence. It was confirmed that DNA was introduced.
Next, 3 μg of the plasmid pChiIgLA1 described in JP-A-5-304989 is dissolved in 10 μl of a buffer solution consisting of 50 mM Tris-hydrochloric acid (pH 7.5), 100 mM sodium chloride, 10 mM magnesium chloride and 1 mM DTT, and further restricted by 10 units. Enzymes EcoRI (Takara Shuzo) and EcoRV (Takara Shuzo) were added and reacted at 37 ° C. for 1 hour. The reaction solution was fractionated by agarose gel electrophoresis, and about 1 μg of an about 9.70 kb EcoRI-EcoRV fragment was recovered. Next, synthetic DNAs having the base sequences described in SEQ ID NOs: 18 and 19 were synthesized using an automatic DNA synthesizer (380A, manufactured by Applied Biosystems). 0.3 μg of the obtained synthetic DNA was added to 15 μl of sterilized water and heated at 65 ° C. for 5 minutes. The reaction solution was allowed to stand at room temperature for 30 minutes, 10 μl buffer solution [500 mM Tris-hydrochloric acid (pH 7.6), 100 mM magnesium chloride, 50 mM DTT] 2 μl and 10 mM ATP 2 μl were added, and 10 units of T4 polynucleotide kinase ( Takara Shuzo Co., Ltd.) was added and reacted at 37 ° C. for 30 minutes to phosphorylate the 5 ′ end. Add 0.1 μg of EcoRI-EcoRV fragment (9.70 kb) derived from the plasmid pChiIgLA1 obtained above and 0.05 μg of phosphorylated synthetic DNA to 20 μl of total sterilized water, and then add Ready-To-Go T4 DNA Ligase (Pharmacia Biotech). Connected. Escherichia coli HB101 strain was transformed with the recombinant plasmid DNA solution thus obtained to obtain plasmid pChiIgLA1S shown in FIG.
Next, 3 μg of the plasmid pBSMoS obtained above was dissolved in 10 μl of a buffer consisting of 20 mM Tris-hydrochloric acid (pH 8.5), 100 mM potassium chloride, 10 mM magnesium chloride and 1 mM DTT, and further 10 units of restriction enzyme HpaI (Takara Shuzo). And the mixture was allowed to react at 37 ° C. for 1 hour. The reaction solution was ethanol precipitated, dissolved in 10 μl of a buffer solution consisting of 50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 100 mM sodium chloride, 10 mM magnesium chloride, and 1 mM DTT, and 10 units of restriction enzyme EcoRI (Takara Shuzo) was added. And allowed to react at 37 ° C. for 1 hour. The reaction solution was fractionated by agarose gel electrophoresis, and about 1 μg of an about 3.66 kb HpaI-EcoRI fragment was recovered.
Next, 10 μg of the plasmid pChiIgLA1S obtained above was dissolved in 10 μl of a buffer solution consisting of 20 mM Tris-acetic acid (pH 7.9), 50 mM potassium acetate, 10 mM magnesium acetate, 1 mM DTT and 100 μg / ml BSA, and further limited to 10 units. Enzyme NlaIV (New England Biolabs) was added and reacted at 37 ° C. for 1 hour. The reaction solution was ethanol precipitated, dissolved in 10 μl of a buffer solution consisting of 50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 100 mM sodium chloride, 10 mM magnesium chloride, and 1 mM DTT, and 10 units of restriction enzyme EcoRI (Takara Shuzo) was added. And allowed to react at 37 ° C. for 1 hour. The reaction solution was fractionated by agarose gel electrophoresis, and about 0.3 μg of an about 0.41 kb NlaIV-EcoRI fragment was recovered.
Next, 0.1 μg of the pBSMoS HpaI-EcoRI fragment obtained above and 0.1 μg of the pChiIgLA1S NlaIV-EcoRI fragment were added to a total amount of 20 μl of sterilized water, and Ready-To-Go T4 DNA Ligase (Pharmacia Biotech) was added. Connected. Escherichia coli HB101 strain was transformed with the recombinant plasmid DNA solution thus obtained to obtain the plasmid pMohCκ shown in FIG.
(5) Construction of humanized antibody heavy chain expression unit
Human cDNA that encodes human antibody Cγ1 exists downstream of the promoter / enhancer of the terminal repeat sequence of Moloney murine leukemia virus, and that can insert human chimeric antibody or human CDR-grafted antibody VH-encoding cDNA in cassette form Plasmid pMohCγ1 having a conjugated antibody heavy chain expression unit was constructed as follows.
3 μg of the plasmid pBSMo obtained in 1 (4) of Example 2 was added to 10 μl of a buffer solution consisting of 50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 100 mM sodium chloride, 10 mM magnesium chloride and 1 mM DTT, and 10 units of restriction enzyme. XhoI (Takara Shuzo) was added and reacted at 37 ° C. for 1 hour. The reaction solution was ethanol precipitated, dissolved in 10 μl of a buffer solution consisting of 30 mM sodium acetate (pH 5.0), 100 mM sodium chloride, 1 mM zinc acetate and 10% glycerol, and further 10 units of Mung Bean Nuclease (Takara Shuzo) were added. In addition, the mixture was reacted at 37 ° C. for 10 minutes. The reaction solution was extracted with phenol-chloroform, ethanol precipitated, DNA Blunting Kit (manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd.) was used, the protruding ends were changed to blunt ends, and then ligated using DNA Ligation Kit (Takara Shuzo Co., Ltd.). Escherichia coli HB101 was transformed with the recombinant plasmid DNA solution thus obtained to obtain the plasmid pBSMoSal shown in FIG. Using 10 μg of the obtained plasmid, after reacting according to the prescription attached to AutoRead Sequencing Kit (Pharmacia Biotech), electrophoresis was performed with ALFDNA Sequencer (Pharmacia Biotech), and the nucleotide sequence was determined. It was confirmed that the restriction enzyme XhoI site upstream of the promoter / enhancer of the viral terminal repeat was lost.
Next, 3 μg of the plasmid pBSMoSal obtained above was added to 10 μl of a buffer solution consisting of 10 mM Tris-HCl (pH 7.5), 10 mM magnesium chloride and 1 mM DTT, and 10 units of restriction enzyme KpnI (Takara Shuzo) was added. And allowed to react at 37 ° C. for 1 hour. The reaction solution was ethanol precipitated, dissolved in 10 μl of a buffer solution consisting of 10 mM Tris-HCl (pH 7.5), 50 mM sodium chloride, 10 mM magnesium chloride and 1 mM DTT, and further 10 units of restriction enzyme HindIII (Takara Shuzo) was added. And allowed to react at 37 ° C. for 1 hour. The reaction solution was fractionated by agarose gel electrophoresis, and about 1 μg of an about 3.66 kb KpnI-HindIII fragment was recovered.
Next, synthetic DNAs having the base sequences described in SEQ ID NOs: 20 and 21 were synthesized using an automatic DNA synthesizer (380A, manufactured by Applied Biosystems). 0.3 μg of the obtained synthetic DNA was added to 15 μl of sterilized water and heated at 65 ° C. for 5 minutes. The reaction solution was allowed to stand at room temperature for 30 minutes, 10 μl buffer solution [500 mM Tris-hydrochloric acid (pH 7.6), 100 mM magnesium chloride, 50 mM DTT] 2 μl and 10 mM ATP 2 μl were added, and 10 units of T4 polynucleotide kinase ( Takara Shuzo Co., Ltd.) was added and reacted at 37 ° C. for 30 minutes to phosphorylate the 5 ′ end. Add 0.1 μg of the KpnI-HindIII fragment (3.66 kb) derived from the plasmid pBSMoSal obtained above and 0.05 μg of phosphorylated synthetic DNA to 20 μl of total sterilized water, and then add Ready-To-Go T4 DNA Ligase (Pharmacia Biotech). Connected. Escherichia coli HB101 was transformed with the recombinant plasmid DNA solution thus obtained to obtain the plasmid pBSMoSalS shown in FIG. Using 10 μg of the resulting plasmid, react according to the prescription attached to AutoRead Sequencing Kit (Pharmacia Biotech), then perform electrophoresis using ALFDNA Sequencer (Pharmacia Biotech) and determine the base sequence. It was confirmed that DNA was introduced.
Next, 10 μg of the plasmid pChiIgHB2 described in JP-A-5-304989 is dissolved in 10 μl of a buffer solution consisting of 50 mM Tris-hydrochloric acid (pH 7.5), 100 mM sodium chloride, 10 mM magnesium chloride and 1 mM DTT, and further 10 units of restriction enzyme Eco52I (Toyobo Co., Ltd.) was added and reacted at 37 ° C for 1 hour. The reaction solution was ethanol precipitated, dissolved in 10 μl of a buffer solution consisting of 30 mM sodium acetate (pH 5.0), 100 mM sodium chloride, 1 mM zinc acetate and 10% glycerol, and further 10 units of Mung Bean Nuclease (Takara Shuzo) were added. In addition, the mixture was reacted at 37 ° C. for 10 minutes. The reaction solution was extracted with phenol-chloroform, ethanol precipitated, and the protruding end was changed to a blunt end using DNA Blunting Kit (Takara Shuzo). After ethanol precipitation, dissolve in 10 μl of a buffer solution consisting of 10 mM Tris-HCl (pH 7.5), 10 mM magnesium chloride and 1 mM DTT, add 10 units of restriction enzyme ApaI (Takara Shuzo), and react at 37 ° C. for 1 hour. It was. The reaction solution was fractionated by agarose gel electrophoresis, and about 0.7 μg of an about 0.99 kb ApaI-blunt end fragment was recovered.
Next, 3 μg of plasmid pBluescript SK (-) (Stratagene) was added to 10 μl of a buffer solution consisting of 10 mM Tris-HCl (pH 7.5), 10 mM magnesium chloride and 1 mM DTT, and 10 units of restriction enzyme ApaI (Takara Shuzo). And the mixture was allowed to react at 37 ° C. for 1 hour. The reaction solution was ethanol precipitated and added to 10 μl of a buffer solution consisting of 33 mM Tris-acetic acid (pH 7.9), 10 mM magnesium acetate, 66 mM potassium acetate, 0.5 mM DTT and 100 μg / ml BSA, and 10 units of restriction enzyme SmaI (Takara Shuzo). Made) and reacted at 30 ° C. for 1 hour. The reaction solution was fractionated by agarose gel electrophoresis, and about 1 μg of an about 3.0 kb ApaI-SmaI fragment was recovered.
Next, 0.1 μg of the ApaI-blunt end fragment of pChiIgHB2 obtained above and 0.1 μg of the ApaI-SmaI fragment of pBluescript SK (−) were added to a total volume of 20 μl of sterile water, and Ready-To-Go T4 DNA Ligase (Pharmacia Biotech) was added. The product was connected using a Escherichia coli HB101 strain was transformed with the recombinant plasmid DNA solution thus obtained to obtain the plasmid pBShCγ1 shown in FIG.
Next, 5 μg of the plasmid pBShCγ1 obtained above was dissolved in 10 μl of a buffer solution consisting of 10 mM Tris-HCl (pH 7.5), 10 mM magnesium chloride and 1 mM DTT, and further 10 units of restriction enzyme ApaI (Takara Shuzo) And reacted at 37 ° C. for 1 hour. The reaction solution was ethanol precipitated and dissolved in 10 μl of a buffer solution consisting of 10 mM Tris-HCl (pH 7.5), 50 mM sodium chloride, 10 mM magnesium chloride and 1 mM DTT, and 10 units of restriction enzyme SpeI (Takara Shuzo) was added. And allowed to react at 37 ° C. for 1 hour. The reaction solution was fractionated by agarose gel electrophoresis, and about 1 μg of an about 1.0 kb ApaI-SpeI fragment was recovered.
Next, 3 μg of the plasmid pBSMoSalS obtained above was dissolved in 10 μl of a buffer solution consisting of 10 mM Tris-HCl (pH 7.5), 10 mM magnesium chloride and 1 mM DTT, and 10 units of restriction enzyme ApaI (Takara Shuzo) was further added. In addition, the mixture was reacted at 37 ° C. for 1 hour. The reaction solution was ethanol precipitated and dissolved in 10 μl of a buffer solution consisting of 10 mM Tris-HCl (pH 7.5), 50 mM sodium chloride, 10 mM magnesium chloride and 1 mM DTT, and 10 units of restriction enzyme SpeI (Takara Shuzo) was added. And allowed to react at 37 ° C. for 1 hour. The reaction solution was fractionated by agarose gel electrophoresis, and about 1 μg of an about 3.66 kb ApaI-SpeI fragment was recovered.
Next, 0.1 μg of the ApaI-SpeI fragment of pBShCγ1 obtained above and 0.1 μg of the ApaI-SpeI fragment of pBSMoSalS were added to a total amount of 20 μl of sterilized water, and Ready-To-Go T4 DNA Ligase (Pharmacia Biotech) was used. Connected. Escherichia coli HB101 strain was transformed with the recombinant plasmid DNA solution thus obtained to obtain the plasmid pMohCγ1 shown in FIG.
(6) Construction of tandem cassette type humanized antibody expression vector pKANTEX93
A tandem cassette type humanized antibody expression vector pKANTEX93 was constructed as follows using the various plasmids obtained in 1 (1) to (5) of Example 2.
3 μg of the plasmid pBSH-SAEE obtained in 1 (1) of Example 2 was added to 10 μl of a buffer solution consisting of 10 mM Tris-hydrochloric acid (pH 7.5), 50 mM sodium chloride, 10 mM magnesium chloride and 1 mM TTT, and 10 units of 10 μl. Restriction enzyme HindIII (Takara Shuzo) was added and reacted at 37 ° C. for 1 hour. The reaction solution was ethanol precipitated, dissolved in 10 μl of a buffer solution consisting of 50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 100 mM sodium chloride, 10 mM magnesium chloride and 1 mM DTT, and further 10 units of restriction enzyme SalI (Takara Shuzo) was added. And allowed to react at 37 ° C. for 1 hour. The reaction solution was fractionated by agarose gel electrophoresis, and about 1 μg of a HindIII-SalI fragment of about 5.42 kb was recovered.
Next, 5 μg of the plasmid pBSK-HAEE obtained in 1 (1) of Example 2 was added to 10 μl of a buffer solution consisting of 10 mM Tris-hydrochloric acid (pH 7.5), 10 mM magnesium chloride, and 1 mM DTT. Enzyme KpnI (Takara Shuzo) was added and reacted at 37 ° C. for 1 hour. The reaction solution was ethanol precipitated, dissolved in 10 μl of a buffer solution consisting of 10 mM Tris-HCl (pH 7.5), 50 mM sodium chloride, 10 mM magnesium chloride and 1 mM DTT, and further 10 units of restriction enzyme HindIII (Takara Shuzo) was added. And allowed to react at 37 ° C. for 1 hour. The reaction solution was fractionated by agarose gel electrophoresis, and about 0.8 μg of about 1.98 kb KpnI-HindIII fragment containing rabbit β-globin gene splicing, poly A signal, SV40 early gene poly A signal and SV40 early gene promoter was obtained. It was collected.
Next, 5 μg of the plasmid pMohCγ1 obtained in 1 (5) of Example 2 was added to 10 μl of a buffer solution consisting of 10 mM Tris-HCl (pH 7.5), 10 mM magnesium chloride and 1 mM DTT, and 10 units of restriction enzyme KpnI. (Takara Shuzo Co., Ltd.) was added and reacted at 37 ° C for 1 hour. The reaction solution was ethanol precipitated and dissolved in a buffer solution consisting of 10 μl of 50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 100 mM sodium chloride, 10 mM magnesium chloride and 1 mM DTT, and further 10 units of restriction enzyme SalI (Takara Shuzo) was added. In addition, the mixture was reacted at 37 ° C. for 1 hour. The reaction solution was fractionated by agarose gel electrophoresis, and about 0.8 μg of an about 1.66 kb KpnI-SalI fragment containing a humanized antibody H chain expression unit was recovered.
Next, 0.1 μg of the HindIII-SalI fragment of pBSH-SAEE obtained above, 0.1 μg of the KpnI-HindIII fragment of pBSK-HAEE and 0.1 μg of the KpnI-SalI fragment of pMohCγ1 were added to a total amount of 20 μl of sterile water. -Ligated using Go T4 DNA Ligase (Pharmacia Biotech). Escherichia coli HB101 strain was transformed with the recombinant plasmid DNA solution thus obtained to obtain the plasmid pMoγ1SP shown in FIG.
Next, 3 μg of the plasmid pMoγ1SP obtained above was added to 10 μl of a buffer solution consisting of 50 mM Tris-hydrochloric acid (pH 7.5), 100 mM sodium chloride, 10 mM magnesium chloride and 1 mM DTT, and further 10 units of restriction enzyme SalI (Takara Shuzo) And restriction enzyme XhoI were added and reacted at 37 ° C. for 1 hour. The reaction solution was fractionated by agarose gel electrophoresis, and about 1 μg of about 9.06 kb SalI-XhoI fragment was recovered.
Next, 5 μg of the plasmid pBSK-HAEESal obtained in 1 (2) of Example 2 was added to 10 μl of a buffer solution consisting of 10 mM Tris-hydrochloric acid (pH 7.5), 10 mM magnesium chloride and 1 mM DTT, and further 10 units of restriction were added. Enzyme KpnI (Takara Shuzo) was added and reacted at 37 ° C. for 1 hour. The reaction solution was ethanol precipitated, dissolved in 10 μl of a buffer solution consisting of 50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 100 mM sodium chloride, 10 mM magnesium chloride and 1 mM DTT, and further 10 units of restriction enzyme SalI (Takara Shuzo) was added. And allowed to react at 37 ° C. for 1 hour. The reaction solution was fractionated by agarose gel electrophoresis, and about 0.7 μg of an about 1.37 kb KpnI-SalI fragment containing rabbit β-globin gene splicing, poly A signal and SV40 early gene poly A signal was recovered.
Next, 5 μg of the plasmid pMohCκ obtained in 1 (4) of Example 2 was added to 10 μl of a buffer solution consisting of 10 mM Tris-HCl (pH 7.5), 10 mM magnesium chloride and 1 mM DTT, and 10 units of restriction enzyme KpnI. (Takara Shuzo Co., Ltd.) was added and reacted at 37 ° C for 1 hour. The reaction solution was ethanol precipitated, dissolved in 10 μl of a buffer solution consisting of 50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 100 mM sodium chloride, 10 mM magnesium chloride, and 1 mM DTT, and further 10 units of restriction enzyme XhoI (Takara Shuzo) was added. And allowed to react at 37 ° C. for 1 hour. The reaction solution was fractionated by agarose gel electrophoresis, and about 0.7 μg of an about 1.06 kb KpnI-XhoI fragment containing a humanized antibody L chain expression unit was recovered.
Next, 0.1 μg of SalI-XhoI fragment of pMoγ1SP obtained above, 0.1 μg of KpnI-SalI fragment of pBSK-HAEESal and 0.1 μg of KpnI-XhoI fragment of pMohCκ were added to a total amount of 20 μl of sterilized water, and Ready-To-Go Ligation was performed using T4 DNA Ligase (Pharmacia Biotech). Escherichia coli HB101 strain was transformed with the recombinant plasmid DNA solution thus obtained to obtain the plasmid pMoκγ1SP shown in FIG.
Next, 3 μg of the plasmid pMoκγ1SP obtained above was dissolved in 10 μl of a buffer solution consisting of 50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 100 mM sodium chloride, 10 mM magnesium chloride and 1 mM DTT, and further 10 units of restriction enzyme XhoI (Takara Shuzo). And the mixture was allowed to react at 37 ° C. for 1 hour. The reaction solution was ethanol precipitated, added to 10 μl of a buffer solution consisting of 10 mM Tris-hydrochloric acid (pH 7.5), 10 mM magnesium chloride and 1 mM DTT, and further 10 units of restriction enzyme SacII (manufactured by Toyobo Co., Ltd.) was added at 37 ° C. Reacted for 10 minutes and partially digested. The reaction solution was fractionated by agarose gel electrophoresis, and about 0.2 μg of an about 8.49 kb SacII-XhoI fragment was recovered.
Next, 3 μg of the plasmid pBSX-SA obtained in 1 (3) of Example 2 was added to 10 μl of a buffer solution consisting of 10 mM Tris-hydrochloric acid (pH 7.5), 10 mM magnesium chloride and 1 mM DTT, and further 10 units of restriction were added. Enzyme SacII (Toyobo Co., Ltd.) was added and reacted at 37 ° C. for 1 hour. The reaction solution was ethanol precipitated, dissolved in 10 μl of a buffer solution consisting of 50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 100 mM sodium chloride, 10 mM magnesium chloride, and 1 mM DTT, and further 10 units of restriction enzyme XhoI (Takara Shuzo) was added. And allowed to react at 37 ° C. for 1 hour. The reaction solution was fractionated by agarose gel electrophoresis, and about 1 μg of an about 4.25 kb SacII-XhoI fragment was recovered.
Next, 0.1 μg of SacII-XhoI fragment of pMoκγ1SP obtained above and 0.1 μg of SacII-XhoI fragment of pBSX-SA were added to a total amount of 20 μl of sterilized water, and Ready-To-Go T4 DNA Ligase (Pharmacia Biotech) Were connected using Escherichia coli HB101 strain was transformed with the recombinant plasmid DNA solution thus obtained to obtain plasmid pKANTEX93 shown in FIG.
2. Isolation and analysis of cDNA encoding anti-human IL-5Rα chain monoclonal antibody
(1) Acquisition of mRNA from hybridoma producing anti-human IL-5Rα chain monoclonal antibody
Using Fast Track, an mRNA extraction kit manufactured by Invitrogen, according to the instructions attached to the kit, mouse anti-human IL-5Rα chain monoclonal antibodies KM1257, KM1259 and KM1486 producing hybridomas (FERM BP-5133 and FERM BP-5134, respectively) , FERM BP-5651) each 1 × 108MRNA was obtained from each cell.
(2) Production of mouse anti-human IL-5Rα chain monoclonal antibody-producing hybridoma H and L chain cDNA libraries
Using cDNA Synthesis Kit (Pharmacia Biotech) from 5 μg each of KM1257, KM1259 and KM1486 mRNA obtained in 2 (1) of Example 2, and having EcoRI adapters at both ends according to the instruction manual attached to the kit Each cDNA was synthesized. About 6 μg of each prepared cDNA was dissolved in 10 μl of sterilized water, fractionated by agarose gel electrophoresis, and about 1.0 kb of cDNA fragment corresponding to H chain of IgG antibody and about 1.0 corresponding to L chain. About 0.1 μg of each kb cDNA fragment was recovered. Next, 0.1 μg of each about 1.5 kb cDNA fragment and 0.1 μg of about 1.0 kb cDNA fragment, and Lambda ZAPII vector [Lambda ZAPII vector was digested with EcoRI and then treated with Calf Intestine Alkaline Phosphatase] 1 μg was dissolved in 11.5 μl of T4 ligase buffer, 175 units of T4 DNA ligase was added, incubated at 12 ° C. for 24 hours, and further incubated at room temperature for 2 hours. 4 μl of each reaction solution is packaged in lambda phage using Gigapack Gold (Stratagene) according to a conventional method [Molecular Cloning, 2.95, Cold Spring Harbor Laboratory, 1989]. In accordance with conventional methods [Molecular Cloning, 2.95-107, Cold Spring Harbor Laboratory, 1989], E. coli strain XL1-Blue [Biotechniques,Five, 376 (1987)], and about 4,000 phage clones were obtained as H-chain cDNA libraries and L-chain cDNA libraries of KM1257, KM1259 and KM1486, respectively.
(3) Cloning of cDNAs encoding heavy and light chains of hybridomas producing anti-human IL-5Rα chain monoclonal antibodies
Each phage prepared in 2 (2) of Example 2 was immobilized on a nitrocellulose filter according to a conventional method [Molecular Cloning, 2.12, Cold Spring Harbor Laboratory, 1989]. Using each nitrocellulose filter, follow the instructions attached to ECL Direct Nucleic Acid Labeling and Detection Systems (manufactured by Amersham) for the mouse immunoglobulin C region. CDNA coding for {H chain is a fragment of mouse Cγ1 cDNA [Cell,18, 559 (1979)], the light chain is a fragment of mouse Cκ cDNA [Cell,twenty two, 197 (1980)]} was used as a probe to obtain a phage clone strongly bound to it. Next, according to the instructions attached to the Lambda ZAPII vector (manufactured by Stratagene), the phage clone is converted into the plasmid pBluescriptSK (-), and finally the recombinant plasmid pKM1257H containing cDNA encoding the H chain of KM1257 and Recombinant plasmid pKM1257L containing cDNA encoding L chain of KM1257, recombinant plasmid pKM1259H containing cDNA encoding H chain of KM1259 and recombinant plasmid pKM1259L containing cDNA encoding L chain of KM1259, coding for H chain of KM1486 Recombinant plasmid pKM1486H containing cDNA to be obtained and recombinant plasmid pKM1486L containing cDNA encoding the light chain of KM1486 were obtained.
(4) Determination of nucleotide sequence of V region of cDNA encoding H chain and L chain of anti-human IL-5Rα chain monoclonal antibody
The nucleotide sequence of the V region of the cDNA encoding the H chain and the L chain of each mouse anti-human IL-5Rα chain monoclonal antibody obtained in 2 (3) of Example 2 was determined using 10 μg of the obtained plasmid. After the reaction according to the prescription attached to Sequencing Kit (Pharmacia Biotech), it was determined by electrophoresis with ALFDNA Sequencer (Pharmacia Biotech). The amino acid sequences of the V regions of the H chain and L chain of KM1257, KM1259 and KM1486 were determined from the determined nucleotide sequences of the respective cDNAs. SEQ ID NO: 22 and SEQ ID NO: 92 are KM1257 H chain, SEQ ID NO: 23 and SEQ ID NO: 93 are KM1257 L chain, SEQ ID NO: 24 and SEQ ID NO: 94 are KM1259 H chain, SEQ ID NO: 25 and SEQ ID NO: 95 are KM1259 L chain SEQ ID NO: 26 and SEQ ID NO: 96 show the nucleotide sequence and amino acid sequence of the V region of the KM1486 H chain, and SEQ ID NO: 27 and SEQ ID NO: 97 show the KM1486 L chain.
(5) Identification of CDR sequences of H and L chains of anti-human IL-5Rα chain monoclonal antibody
Based on the amino acid sequences of the V region of the H chain and L chain of each mouse anti-human IL-5Rα chain monoclonal antibody determined in 2 (4) of Example 2, the CDR sequences of the respective H chains and L chains of known antibodies It was identified by comparison with the amino acid sequence of the V region [Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services, 1991]. SEQ ID NOs: 28, 29 and 30 include CDR1, 2 and 3 of KM1257 H chain, SEQ ID NOS: 31, 32 and 33 include CDR1, 2 and 3 of KM1257 L chain, and KM1259 H chain to SEQ ID NOS: 34, 35 and 36 CDR1, 2 and 3 of SEQ ID NOs: 37, 38 and 39, CDR1, 2 and 3 of L chain of KM1259, CDR1, 2 and 3 of H chain of KM1486 in SEQ ID NOs: 40, 41 and 42, and SEQ ID NO: 43, 44 and 45 show the amino acid sequences of CDR1, 2 and 3 of the L chain of KM1486, respectively.
3. Production of anti-human IL-5Rα chain human chimeric antibody
An anti-human IL-5Rα chain human chimeric antibody derived from the anti-human IL-5Rα chain monoclonal antibody KM1259 having the activity of inhibiting the biological activity of human IL-5 was produced as follows.
(1) Construction of expression vector pKANTEX1259 of anti-human IL-5Rα chain human chimeric antibody
The expression vector pKANTEX1259 of the anti-human IL-5Rα chain human chimeric antibody using the vector pKANTEX93 for humanized antibody expression constructed in 1 of Example 2 and the plasmids pKM1259H and pKM1259L obtained in 2 of Example 2 is as follows. And built.
Add 3 μg of humanized antibody expression vector pKANTEX93 to 10 μl of 10 mM Tris-HCl (pH 7.5), 10 mM magnesium chloride and 1 mM DTT buffer, and add 10 units of restriction enzyme ApaI (Takara Shuzo) at 37 ° C. For 1 hour. The reaction solution was ethanol precipitated and added to 10 μl of a buffer solution consisting of 50 mM Tris-hydrochloric acid (pH 7.5), 100 mM sodium chloride, 10 mM magnesium chloride, 1 mM DTT, 100 μg / ml BSA and 0.01% Triton X-100. Restriction enzyme NotI (Takara Shuzo) was added and reacted at 37 ° C. for 1 hour. The reaction solution was fractionated by agarose gel electrophoresis, and about 1 μg of an about 12.75 kb ApaI-NotI fragment was recovered. Next, 5 μg of plasmid pKM1259H was added to 10 μl of a buffer solution consisting of 10 mM Tris-HCl (pH 7.5), 10 mM magnesium chloride and 1 mM DTT, and 10 units of restriction enzyme BanI (manufactured by Toyobo Co., Ltd.) was added at 37 ° C. Reacted for 1 hour. The reaction solution was ethanol precipitated and added to 10 μl of a buffer solution consisting of 50 mM Tris-hydrochloric acid (pH 7.5), 100 mM sodium chloride, 10 mM magnesium chloride, 1 mM DTT, 100 μg / ml BSA and 0.01% Triton X-100. Restriction enzyme NotI (Takara Shuzo) was added and reacted at 37 ° C. for 1 hour. The reaction solution was fractionated by agarose gel electrophoresis, and about 0.5 μg of about 0.41 kb BanI-NotI fragment was recovered.
Next, a synthetic DNA having the base sequences described in SEQ ID NOs: 46 and 47 was synthesized using an automatic DNA synthesizer (380A, manufactured by Applied Biosystems). 0.3 μg of the obtained synthetic DNA was added to 15 μl of sterilized water and heated at 65 ° C. for 5 minutes. The reaction solution was allowed to stand at room temperature for 30 minutes, and then 10 μl buffer solution [500 mM Tris-HCl (pH 7.6), 100 mM magnesium chloride, 50 mM DTT] (2 μl) and 10 mM ATP (2 μl) were added, and 10 units of T4 polynucleotide kinase was added. And reacted at 37 ° C. for 30 minutes to phosphorylate the 5 ′ end.
The humanized antibody expression vector pKANTEX93-derived ApaI-NotI fragment 0.1 μg, the plasmid pKM1259H-derived BanI-NotI fragment 0.1 μg and phosphorylated synthetic DNA 0.05 μg obtained above were added to a total amount of 20 μl of sterile water, and Ready-To -Ligated using Go T4 DNA Ligase (Pharmacia Biotech). Escherichia coli HB101 strain was transformed with the recombinant plasmid DNA solution thus obtained to obtain the plasmid pKANTEX1259H shown in FIG.
Next, 3 μg of the obtained plasmid pKANTEX1259H was added to 10 μl of a buffer solution consisting of 50 mM Tris-hydrochloric acid (pH 7.5), 100 mM sodium chloride, 10 mM magnesium chloride, 1 mM DTT and 100 μg / ml BSA, and 10 units of restriction enzyme EcoRI ( Takara Shuzo) and restriction enzyme SplI (Takara Shuzo) were added and reacted at 37 ° C. for 1 hour. The reaction solution was fractionated by agarose gel electrophoresis, and about 1 μg of an about 13.20 kb EcoRI-SplI fragment was recovered.
Next, 5 μg of plasmid pKM1259L was added to 10 μl of a buffer solution consisting of 10 mM Tris-hydrochloric acid (pH 7.5), 50 mM sodium chloride, 10 mM magnesium chloride, and 1 mM DTT, and 10 units of restriction enzyme AvaII (Takara Shuzo) was added. The reaction was allowed to proceed at 37 ° C for 1 hour. The reaction solution was ethanol precipitated and added to 10 μl of a buffer solution consisting of 50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 100 mM sodium chloride, 10 mM magnesium chloride, and 1 mM DTT, and 10 units of restriction enzyme EcoRI (Takara Shuzo) was added. The reaction was allowed to proceed at 37 ° C for 1 hour. The reaction solution was fractionated by agarose gel electrophoresis, and about 0.5 μg of an about 0.38 kb AvaII-EcoRI fragment was recovered.
Next, a synthetic DNA having the base sequences described in SEQ ID NOs: 48 and 49 was synthesized using an automatic DNA synthesizer (380A, manufactured by Applied Biosystems). 0.3 μg of the obtained synthetic DNA was added to 15 μl of sterilized water and heated at 65 ° C. for 5 minutes. The reaction solution was allowed to stand at room temperature for 30 minutes, and then 10 μl buffer solution [500 mM Tris-HCl (pH 7.6), 100 mM magnesium chloride, 50 mM DTT] (2 μl) and 10 mM ATP (2 μl) were added, and 10 units of T4 polynucleotide kinase was added. And reacted at 37 ° C. for 30 minutes to phosphorylate the 5 ′ end.
0.1 μg of EcoRI-SplI fragment derived from the plasmid pKANTEX1259H obtained above, 0.1 μg of AvaII-EcoRI fragment derived from the plasmid pKM1259L and 0.05 μg of phosphorylated synthetic DNA were added to a total amount of 20 μl of sterile water, Ready-To-Go T4 DNA Ligase They were linked using (Pharmacia Biotech). Escherichia coli HB101 strain was transformed with the recombinant plasmid DNA solution thus obtained to obtain plasmid pKANTEX1259 shown in FIG.
(2) Expression of anti-human IL-5Rα chain human chimeric antibody using pKANTEX1259 in rat myeloma YB2 / 0 cells (ATCC CRL1581)
The introduction of the anti-human IL-5Rα chain human chimeric antibody expression vector pKANTEX1259 into YB2 / 0 cells was carried out according to the method of Miyachi et al. According to the electroporation method [Cytotechnology,Three, 133, (1990)].
4 × g of pKANTEX1259 obtained in 3 (1) of Example 2 was 4 × 106After introduction into YB2 / 0 cells, 200 μl / well of RPMI1640-FCS (10) was dispensed into a 96-well microtiter plate. 5% CO2After culturing at 37 ° C. for 24 hours in an incubator, geneticin (hereinafter referred to as G418, manufactured by Gibco) was added to a concentration of 0.5 mg / ml and further cultured for 1 to 2 weeks. A colony of a transformant having G418 resistance appears and the culture supernatant is collected from the confluent well, and the activity of the anti-human IL-5Rα chain human chimeric antibody in the supernatant is shown in ELISA method 1 or It was measured by ELISA method 2.
ELISA method 1
Prepare a 96-well EIA plate (Gleiner) by preparing a solution of shIL-5Rα-Fc obtained from the insect cell culture supernatant of Example 1 (10) in Example 1 at a concentration of 5 μg / ml or further diluted with PBS. 50 μl / well, and allowed to stand overnight at 4 ° C. for adsorption. After washing, 100 μl / well of PBS containing 1% bovine serum albumin (BSA) (1% BSA-PBS) was added and reacted at room temperature for 1 hour to block remaining active groups. Discard 1% BSA-PBS, culture supernatant of the transformant or purified 40 μg / ml of various anti-human IL-5Rα antibodies at 25 μl / well, and 0.4 μg / ml biotin labeled as prepared in Example 1-3. Human IL-5 was dispensed at 25 μl / well and reacted at room temperature for 4 hours. After washing with 0.05% Tween-PBS, peroxidase-labeled avidin D (manufactured by Nichirei) diluted 4000 times with 1% BSA-PBS was added at 50 μl / well and reacted at room temperature for 1 hour, and 0.05% Tween-PBS After washing, 550mg of ABTS substrate solution [2,2'azinobis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) diammonium is dissolved in 1L of 0.1M citrate buffer (pH 4.2) and peroxidized immediately before use. A solution containing 1 μl / ml of hydrogen] was added at 50 μl / well for color development, and the absorbance at OD 415 nm was measured. The absorbance value when no antibody was added was defined as an inhibition rate of 0%, and the inhibition rate of the antibody against biotinylated labeled IL-5 was calculated by the following formula, and each sample was evaluated.
Figure 0003946256
ELISA method 2
A 96-well plate for EIA (manufactured by Greiner) was prepared by preparing a solution of shIL-5Rα obtained from the insect cell culture supernatant of Example 1 (10) of Example 1 at a concentration of 2 μg / ml or further diluted with PBS. The solution was dispensed at 50 μl / well and allowed to stand overnight at 4 ° C. for adsorption. After washing, 100 μl / well of PBS containing 1% bovine serum albumin (BSA) (1% BSA-PBS) was added and reacted at room temperature for 1 hour to block remaining active groups. 1% BSA-PBS was discarded, the culture supernatant of the transformant, and various purified anti-human IL-5Rα antibodies were dispensed at 50 μl / well and reacted at room temperature for 2 hours. After washing with 0.05% Tween-PBS, peroxidase-labeled anti-human IgG antibody (American Calex) diluted 500-fold with 1% BSA-PBS was added at 50 μl / well and reacted at room temperature for 1 hour. 0.05% Tween -After washing with PBS, 550 mg of ABTS substrate solution [2,2′azinobis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) diammonium is dissolved in 1 L of 0.1 M citrate buffer (pH 4.2) and immediately before use. A solution obtained by adding 1 μl / ml of hydrogen peroxide to 50 μl / well was allowed to develop color, and the absorbance at OD 415 nm was measured.
For the transformant in which the activity of the anti-human IL-5Rα chain human chimeric antibody was observed in the culture supernatant, it was suspended in RPMI1640-FCS (10) medium containing 0.5 mg / ml G418, 50 nM MTX (manufactured by Sigma). Turbid, 5% CO2By culturing at 37 ° C. for 1 to 2 weeks in an incubator, a transformant having 50 nM MTX resistance was induced. When the transformant became confluent in the well, the activity of the anti-human IL-5Rα chain human chimeric antibody in the culture supernatant was measured by the ELISA method described above. Transformants with active activity can be grown in RPMI1640-FCS (10) medium containing 0.5mg / ml G418 and 200nM MTX by increasing the MTX concentration to 100nM and 200nM by the same culture method as above. In addition, a transformed strain producing an anti-human IL-5Rα chain human chimeric antibody was obtained. The obtained transformant was further cloned twice by limiting dilution to obtain a transformant producing the final anti-human IL-5Rα chain human chimeric antibody. An example of a transformant that produces an anti-human IL-5Rα chain human chimeric antibody is KM1399 (FERM BP-5650), and the anti-human IL-5Rα chain human chimeric antibody produced by it is named KM1399. . The transformed strain KM1399 was deposited as FERM BP-5650 on September 3, 1996 at the Institute for Microbial Industrial Technology. The productivity of the anti-human IL-5Rα chain human chimeric antibody KM1399 of the transformed clone KM1399 is about 5 μg / 106cells / 24hr.
(3) Purification of anti-human IL-5Rα chain human chimeric antibody KM1399 from the culture supernatant
The anti-human IL-5Rα chain human chimeric antibody production strain KM1399 obtained in 3 (2) of Example 2 was added to GIT medium (manufactured by Nippon Pharmaceutical Co., Ltd.) containing 0.5 mg / ml G418 and 200 nM MTX in an amount of 1-2 × 10FiveSuspend to be cells / ml, 175cm2200 ml each was dispensed into a flask (made by Greiner). 5% CO2The cells were cultured in an incubator at 37 ° C. for 5 to 7 days, and the culture supernatant was collected when it became confluent. About 3 mg of purified anti-human IL-5Rα chain human chimeric antibody KM1399 was obtained from about 1.0 L of the culture supernatant using a process A (Bioprocessing) column. About 4 μg of purified anti-human IL-5Rα chain human chimeric antibody KM1399 was added to a known method [Nature,227, 680 (1970)], and the molecular weight was examined, and the results are shown in Fig. 39. As shown in Fig. 39, the antibody H chain has a molecular weight of approximately 50 kilodaltons under reducing conditions. The molecular weight of the L chain was about 25 kilodaltons, and the expression of the correct molecular weight of H chain and L chain was confirmed, and the molecular weight of the anti-human IL-5Rα chain human chimeric antibody KM1399 was about 140 under non-reducing conditions. The expression of a human chimeric antibody of kilodalton with the correct size consisting of two H chains and two L chains was confirmed, and the purified anti-human IL-5Rα chain human chimeric antibody KM1399 H chain As a result of analyzing the N-terminal amino acid sequence of the L chain by automatic Edman degradation using a protein sequencer (470A, manufactured by Applied Biosystems), the expected correct amino acid sequence was obtained.
(4) Reactivity of anti-human IL-5Rα chain human chimeric antibody KM1399 to human IL-5Rα chain (ELISA method 1)
The reactivity of anti-human IL-5Rα chain mouse antibody KM1259 and anti-human IL-5Rα chain human chimeric antibody KM1399 to human IL-5Rα chain was measured by ELISA method 1 described in 3 (2) of Example 2. The results are shown in FIG. As shown in FIG. 40, it is shown that the anti-human IL-5Rα chain human chimeric antibody KM1399 has the same reactivity against the strong human IL-5Rα chain as the anti-human IL-5Rα chain mouse antibody KM1259. It was done.
4). Transient expression of anti-human IL-5Rα chain human chimeric antibody using COS-7 cells (ATCC CRL1651)
In order to more quickly evaluate the activity of various versions of anti-human IL-5Rα chain human CDR-grafted antibody antibodies described below, using pKANTEX1259 and its modified vector, anti-human IL-5Rα chain human type in COS-7 cells Transient expression of the chimeric antibody was performed using the lipofectamine method as follows.
(1) Construction of modified vector of pKANTEX1259
Since the efficiency of transient expression in animal cells depends on the copy number of the introduced expression vector, it was considered that the expression vector having a smaller size has better expression efficiency. Therefore, a region thought not to affect the antibody expression of pKANTEX1259 was deleted, and a smaller anti-human IL-5Rα chain human chimeric antibody expression vector, pT1259, was constructed as follows.
3 μg of plasmid pKANTEX1259 was added to 10 μl of a buffer solution consisting of 10 mM Tris-HCl (pH 7.5), 50 mM sodium chloride, 10 mM magnesium chloride and 1 mM DTT, and 10 units of restriction enzyme HindIII (Takara Shuzo) was added at 37 ° C. Reacted for 1 hour. The reaction solution was precipitated with ethanol, added to 10 μl of a buffer solution consisting of 50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 100 mM sodium chloride, 10 mM magnesium chloride and 1 mM DTT, and further 10 units of restriction enzyme MluI (Takara Shuzo) was added. The reaction was allowed to proceed at 37 ° C for 1 hour. The reaction solution was ethanol precipitated, and the 5 ′ protruding end generated by restriction enzyme digestion was changed to a blunt end using DNA Blunting Kit (Takara Shuzo). The reaction solution was fractionated by agarose gel electrophoresis, and about 1 μg of a DNA fragment of about 9.60 kb was recovered. The recovered DNA fragment (0.1 μg) was added to a total amount of 20 μl of sterilized water, and ligated using Ready-To-Go T4 DNA Ligase (Pharmacia Biotech). Escherichia coli HB101 was transformed with the recombinant plasmid DNA solution thus obtained to obtain the plasmid pT1259 shown in FIG.
(2) Transient expression of anti-human IL-5Rα chain human chimeric antibody using pT1259
1 × 10FiveCells / ml COS-7 cells were dispensed at 2 ml / well into 6-well plates (Falcon) and cultured at 37 ° C. overnight. 2 μg of pT1259 was added to 100 μl of OPTI-MEM medium (Gibco), and 10 μl of Lipofectamine Reagent (LIPOFECTAMINE Reagent, Gibco) was added to 100 μl of OPTI-MEM medium (Gibco). The solution was added and allowed to react at room temperature for 40 minutes to form a DNA-liposome complex. After washing the COS-7 cells with 2 ml of OPTI-MEM medium (manufactured by Gibco) twice, adding a solution containing the complex of DNA-liposomes, culturing at 37 ° C. for 7 hours, removing the solution, 2 ml of DMEM medium (Gibco) containing 10% FCS was added and cultured at 37 ° C. After culture, the culture supernatant was collected at 72 hours, and the activity of the anti-human IL-5Rα chain human chimeric antibody in the culture supernatant was evaluated by ELISA method 1 described in 3 (2) of Example 2. It was. The results are shown in FIG. As shown in FIG. 42, concentration-dependent activity was observed in the culture supernatant of COS-7 cells introduced with pT1259, confirming the expression of anti-human IL-5Rα chain human chimeric antibody. Based on the above results, it is possible to evaluate the activity of humanized antibodies derived from various expression vectors in a transient expression system by preparing a vector with reduced pKANTEX93 size and introducing it into COS-7 cells. It was shown that. In addition, in order to accurately compare the activities of various anti-human IL-5Rα chain human CDR-grafted antibodies described later, the antibody concentration in the transient expression culture supernatant was measured by the ELISA method described in 4 (3) below. did.
(3) Measurement of humanized antibody concentration in transient expression culture supernatant by ELISA
A solution of 400-fold diluted goat anti-human IgG (γ-chain) antibody (Medical and Biological Laboratories) diluted 400 times with PBS in a 96-well microtiter plate was dispensed at 50 µl / well and allowed to react overnight at 4 ° C. It was. After removing the antibody solution, the reaction was performed with 100 μl / well of 1% BSA-PBS at 37 ° C. for 1 hour to block the remaining active groups. After discarding 1% BSA-PBS, 50 μl / well of transient expression culture supernatant or purified anti-human IL-5Rα chain human chimeric antibody KM1399 was added and allowed to react at room temperature for 1 hour. After the reaction, the solution was removed, washed with 0.05% Tween-PBS, and a solution obtained by diluting a peroxidase-labeled mouse anti-human κ L chain antibody (Zaimet) 500-fold with 1% BSA-PBS was added at 50 μl / well, and room temperature was added. For 1 hour. After washing with 0.05% Tween-PBS, 550 mg of ABTS substrate solution [2,2′azinobis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) diammonium is dissolved in 1 L of 0.1 M citrate buffer (pH 4.2). The solution was added with 1 μl / ml of hydrogen peroxide immediately before use] to add 50 μl / well for color development, and the absorbance at OD 415 nm was measured.
5. Production of anti-human IL-5Rα human CDR-grafted antibody
Anti-human IL-5Rα chain human CDR having activity equivalent to that of mouse anti-human IL-5Rα chain monoclonal antibody KM1259 and anti-human IL-5Rα chain human chimeric antibody KM1399 having the activity of inhibiting the biological activity of human IL-5 The transplanted antibody was produced as follows.
(1) Construction of cDNA encoding anti-human IL-5Rα chain human CDR-grafted antibody VH based on the consensus sequence of known human antibody VH
Kabat et al. [Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services, 1991, and so on] It classify | categorized into subgroup I-III (HSG I-III) from the sequence homology, and the common sequence was identified for every subgroup. Therefore, the amino acid sequence of anti-human IL-5Rα chain human CDR-grafted antibody VH was designed based on these common sequences. First, in order to select the basic consensus sequence, the homology between the FR sequence of the VH of the mouse anti-human IL-5Rα chain antibody KM1259 and the FR sequence of the consensus sequence of the human antibody VH of each subgroup was examined. (Table 1).
Figure 0003946256
As a result, it was confirmed that it had the highest homology with subgroup I. Based on the common sequence of subgroup I, the amino acid sequence of anti-human IL-5Rα chain human CDR-grafted antibody VH was designed and encoded. The cDNA to be constructed was constructed as follows using the PCR method.
Synthetic DNA having the base sequences of SEQ ID NOs: 50 to 55 was synthesized using an automatic DNA synthesizer (380A, manufactured by Applied Biosystems). 10 mM Tris-hydrochloric acid (pH 8.3), 50 mM potassium chloride, 1.5 mM magnesium chloride, 0.001% gelatin, 200 μM dNTP, 0.5 μM M13primer RV (manufactured by Takara Shuzo), so that each synthesized DNA has a final concentration of 0.1 μM, In addition to 50 μl of a buffer solution consisting of 0.5 μM M13primer M4 (Takara Shuzo) and 2 units of TaKaRa TaqDNA polymerase (Takara Shuzo), cover with 50 μl of mineral oil and set in a DNA thermal cycler (PJ480, Perkin Elmer) 30 cycles of 94 ° C. for 2 minutes, 55 ° C. for 2 minutes, and 72 ° C. for 2 minutes were performed. The reaction solution was precipitated with ethanol, dissolved in 20 μl of TE buffer, and fractionated by agarose gel electrophoresis to recover about 0.2 μg of an amplified fragment of about 0.48 kb.
Next, 3 μg of plasmid pBluescript SK (−) (Stratagene) was added to 10 μl of a buffer solution consisting of 33 mM Tris-acetic acid (pH 7.9), 10 mM magnesium acetate, 66 mM potassium acetate, 0.5 mM TTT and 100 μg / ml BSA. Furthermore, 10 units of restriction enzyme SmaI (Takara Shuzo Co., Ltd.) was added and reacted at 30 ° C. for 1 hour. The reaction solution was ethanol precipitated, dissolved in 20 μl of a buffer solution consisting of 50 mM Tris-HCl (pH 9.0) and 1 mM magnesium chloride, and 1 unit of alkaline phosphatase (E. coli C75, manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd.) was added. The reaction was carried out at 0 ° C. for 1 hour to dephosphorylate the 5 ′ end. Further, the reaction solution was extracted with phenol-chloroform, precipitated with ethanol, and dissolved in 20 μl of TE buffer.
Next, 0.1 μg of the amplified fragment obtained above after PCR and 0.1 μg of pBluescript SK (−) SmaI fragment were added to a total amount of 20 μl of sterilized water, and Ready-To-Go T4 DNA Ligase (Pharmacia Biotech) Were connected using Escherichia coli HB101 strain was transformed with the recombinant plasmid DNA solution thus obtained. As a result of preparing each plasmid DNA from 10 clones of the transformant and determining the base sequence, it was found that the 43rd DNA containing the cDNA encoding the amino acid sequence of the desired anti-human IL-5Rα chain human CDR-grafted antibody VH was obtained. The plasmid phKM1259HV0 shown in the figure was obtained. SEQ ID NO: 98 shows the nucleotide sequence and amino acid sequence of anti-human IL-5Rα chain human CDR-grafted antibody VH (hereinafter referred to as HV.0) contained in phKM1259HV0.
(2) Construction of cDNA encoding VL of anti-human IL-5Rα chain human CDR-grafted antibody based on the consensus sequence of known human antibody VL
Kabat et al. Classified various known human antibody VL into subgroups I to IV (HSG I to IV) based on their FR sequence homology, and identified a common sequence for each subgroup. Therefore, the amino acid sequence of the anti-human IL-5Rα chain human CDR-grafted antibody VL was designed based on these common sequences. First, in order to select a basic consensus sequence, the homology between the FR sequence of the VL of the mouse anti-human IL-5Rα chain antibody KM1259 and the FR sequence of the consensus sequence of the human antibody VL of each subgroup was examined. (Table 2).
Figure 0003946256
As a result, it was confirmed that it had the highest homology with subgroup I. Based on the common sequence of subgroup I, the amino acid sequence of anti-human IL-5Rα chain human CDR-grafted antibody VL was designed and encoded. The cDNA to be constructed was constructed as follows using the PCR method.
Synthetic DNA having the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 57 to 62 was synthesized using an automatic DNA synthesizer (380A, manufactured by Applied Biosystems). 10 mM Tris-hydrochloric acid (pH 8.3), 50 mM potassium chloride, 1.5 mM magnesium chloride, 0.001% gelatin, 200 μM dNTP, 0.5 μM M13primer RV (manufactured by Takara Shuzo), so that each synthesized DNA has a final concentration of 0.1 μM, In addition to 50 μl of a buffer solution consisting of 0.5 μM M13primer M4 (Takara Shuzo) and 2 units of TaKaRa TaqDNA polymerase (Takara Shuzo), cover with 50 μl of mineral oil and set in a DNA thermal cycler (PJ480, Perkin Elmer) 30 cycles of 94 ° C. for 2 minutes, 55 ° C. for 2 minutes, and 72 ° C. for 2 minutes were performed. The reaction solution was ethanol precipitated, dissolved in 20 μl of TE buffer, and fractionated by agarose gel electrophoresis to recover about 0.2 μg of an amplified fragment of about 0.43 kb.
Next, 0.1 μg of the amplified fragment obtained after PCR and 0.1 μg of pBluescript SK (−) SmaI fragment obtained in 5 (1) of Example 2 were added to a total amount of 20 μl of sterilized water. Ligation was performed using To-Go T4 DNA Ligase (Pharmacia Biotech). Escherichia coli HB101 strain was transformed with the recombinant plasmid DNA solution thus obtained. As a result of preparing each plasmid DNA from 10 clones of the transformant and determining the nucleotide sequence, it was found that the 44th DNA containing the cDNA encoding the amino acid sequence of the desired anti-human IL-5Rα chain human CDR-grafted antibody VL was obtained. The plasmid phKM1259LV0 shown in the figure was obtained. SEQ ID NO: 99 shows the nucleotide sequence and amino acid sequence of the anti-human IL-5Rα chain human CDR-grafted antibody VL (hereinafter referred to as LV.0) contained in phKM1259LV0.
(3) Construction of expression vector pKANTEX1259HV0LV0 for anti-human IL-5Rα chain human CDR-grafted antibody based on the consensus sequence of known human antibody V region
Anti-human using the humanized antibody expression vector pKANTEX93 constructed in 1 of Example 2, the plasmid phKM1259HV0 obtained in 5 (1) of Example 2 and the plasmid phKM1259LV0 obtained in 5 (2) of Example 2 An expression vector pKANTEX1259HV0LV0 for IL-5Rα chain human CDR-grafted antibody was constructed as follows.
5 μg of plasmid pKMh1259HV0 is added to 10 μl of a buffer solution consisting of 10 mM Tris-HCl (pH 7.5), 10 mM magnesium chloride and 1 mM DTT, and 10 units of restriction enzyme ApaI (Takara Shuzo) is added and reacted at 37 ° C. for 1 hour. It was. The reaction solution was ethanol precipitated and added to 10 μl of a buffer solution consisting of 50 mM Tris-hydrochloric acid (pH 7.5), 100 mM sodium chloride, 10 mM magnesium chloride, 1 mM DTT, 100 μg / ml BSA and 0.01% Triton X-100. Restriction enzyme NotI (Takara Shuzo) was added and reacted at 37 ° C. for 1 hour. The reaction solution was fractionated by agarose gel electrophoresis, and about 0.5 μg of an about 0.44 kb ApaI-NotI fragment was recovered.
Next, 0.1 μg of the ApaI-NotI fragment derived from the humanized antibody expression vector pKANTEX93 obtained in 3 (1) of Example 2 and 0.1 μg of the ApaI-NotI fragment derived from the plasmid phKM1259HV0 obtained above were added in a total amount of 20 μl. In addition to sterilized water, the cells were linked using Ready-To-Go T4 DNA Ligase (Pharmacia Biotech). Escherichia coli HB101 strain was transformed with the recombinant plasmid DNA solution thus obtained to obtain plasmid pKANTEX1259HV0 shown in FIG.
Next, 3 μg of the obtained plasmid pKANTEX1259HV0 was added to 10 μl of a buffer solution consisting of 50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 100 mM sodium chloride, 10 mM magnesium chloride, 1 mM DTT and 100 μg / ml BSA, and 10 units of restriction enzyme EcoRI ( Takara Shuzo) and restriction enzyme SplI (Takara Shuzo) were added and reacted at 37 ° C. for 1 hour. The reaction solution was fractionated by agarose gel electrophoresis, and about 1 μg of an about 13.20 kb EcoRI-SplI fragment was recovered.
Next, 5 μg of plasmid phKM1259LV0 was added to 10 μl of a buffer solution consisting of 50 mM Tris-hydrochloric acid (pH 7.5), 100 mM sodium chloride, 10 mM magnesium chloride, 1 mM DTT and 100 μg / ml BSA, and 10 units of restriction enzyme EcoRI (Takara Shuzo) ) And restriction enzyme SplI (Takara Shuzo) were added and reacted at 37 ° C. for 1 hour. The reaction solution was fractionated by agarose gel electrophoresis, and about 0.5 μg of an about 0.39 kb EcoRI-SplI fragment was recovered.
Add 0.1 μg of the EcoRI-SplI fragment derived from the plasmid pKANTEX1259HV0 and 0.1 μg of the EcoRI-SplI fragment derived from the plasmid phKM1259LV0 obtained above to a total amount of 20 μl of sterilized water, and then add Ready-To-Go T4 DNA Ligase (Pharmacia Biotech). Connected. Escherichia coli HB101 strain was transformed with the recombinant plasmid DNA solution thus obtained to obtain the plasmid pKANTEX1259HV0LV0 shown in FIG.
(4) Expression in rat myeloma YB2 / 0 cells (ATCC CRL1581) of anti-human IL-5Rα chain human CDR-grafted antibody based on the consensus sequence of a known human antibody V region using pKANTEX1259HV0LV0
Using pKANTEX1259HV0LV0, expression of anti-human IL-5Rα chain human CDR-grafted antibody based on the consensus sequence of known human antibody V region in YB2 / 0 cells was performed according to the method described in Example 2, 3 (2). went.
As a result, KM8397 is a transformant that produces an anti-human IL-5Rα chain human CDR-grafted antibody based on a common sequence of known human antibody V regions, and the anti-human IL-5Rα chain that it produces The human CDR-grafted antibody was named KM8397. The productivity of the anti-human IL-5Rα chain human CDR-grafted antibody KM8397 of the transformed strain KM8397 is about 4 μg / 106cells / 24hr.
(5) Purification of anti-human IL-5Rα chain human CDR-grafted antibody KM8397 from the culture supernatant
The anti-human IL-5Rα chain human CDR-grafted antibody-producing clone KM8397 obtained in 5 (4) of Example 2 was cultured and purified according to the method described in 3 (3) of Example 2 to obtain about 2 mg of KM8397. did. About 4 μg of the purified anti-human IL-5Rα chain human CDR-grafted antibody KM8397 was electrophoresed according to the method described in 3 (3) of Example 2 to examine the molecular weight. The results are shown in FIG. As shown in Figure 47, the molecular weight of the antibody H chain is approximately 50 kilodaltons and the molecular weight of the antibody L chain is approximately 25 kilodaltons under reducing conditions, confirming the expression of the correct molecular weight of the H and L chains. It was. Under non-reducing conditions, the molecular weight of anti-human IL-5Rα chain human CDR-grafted antibody KM8397 is approximately 140 kilodaltons, and a human CDR graft of the correct size consisting of two H chains and two L chains. The expression of the antibody was confirmed. In addition, it is expected that the N-terminal amino acid sequences of the H chain and L chain of purified anti-human IL-5Rα chain CDR-grafted antibody KM8397 were analyzed by automated Edman degradation using a protein sequencer (470A, Applied Biosystems). The correct amino acid sequence was obtained.
(6) Reactivity of anti-human IL-5Rα chain human CDR-grafted antibody KM8397 to human IL-5Rα chain (ELISA method 2)
Reactivity of anti-human IL-5Rα chain human chimeric antibody KM1399 and anti-human IL-5Rα chain human CDR-grafted antibody KM8397 to human IL-5Rα chain was measured by ELISA method 2 described in Example 2, 3 (2). did. The results are shown in FIG. As shown in FIG. 48, the anti-human IL-5Rα chain human CDR-grafted antibody KM8397 has about half the response to the human IL-5Rα chain compared to the anti-human IL-5Rα chain human chimeric antibody KM1399. It was shown to have sex.
6). Increased activity by modifying amino acid sequence of V region of anti-human IL-5Rα chain human CDR-grafted antibody KM8397
The reactivity of the anti-human IL-5Rα chain human CDR-grafted antibody KM8397 prepared in 5 of Example 2 with respect to human IL-5Rα chain is reduced to about 1/2 compared to the anti-human IL-5Rα chain human chimeric antibody KM1399. did. Therefore, the activity was increased by modifying the amino acid sequence of the V region of KM8397 by the following method.
(1) Modification of VH amino acid sequence of anti-human IL-5Rα chain human CDR-grafted antibody KM8397
VH amino acids of the anti-human IL-5Rα chain human CDR-grafted antibody KM8397 shown in SEQ ID NO: 98 were mutated to prepare various modified versions of anti-human IL-5Rα chain human CDR-grafted antibody VH. The amino acid to be mutated was randomly selected with reference to the computer three-dimensional structural model of the V region of the anti-human IL-5Rα chain mouse antibody KM1259. As a method for introducing a mutation, the method described in Section 5 (1) of Example 2 using a mutation-introducing primer, a cDNA encoding a modified version of VH of the target anti-human IL-5Rα chain human CDR-grafted antibody is used. A plasmid containing was obtained.
In practice, the sequence shown in SEQ ID NO: 64 was used as a mutagenesis primer, and synthetic DNAs having the base sequences of SEQ ID NOs: 50, 51, 52, 53, 64, 55 were used in 5 (1) of Example 2. By carrying out the described method, a plasmid phKM1259HV1 containing cDNA encoding a modified version 1 VH (hereinafter referred to as HV.1) of the anti-human IL-5Rα chain human CDR-grafted antibody shown in SEQ ID NO: 100 was obtained. In order to maintain the reactivity to the human IL-5Rα chain observed in mouse antibodies and human chimeric antibodies in the amino acid sequence of HV.1, SEQ ID NO: 98 contains 95th tyrosine and 97th alanine in FR. Each amino acid is changed to leucine and glycine, which are amino acids found in the mouse antibody KM1259 H chain V region.
In addition, using the sequences shown in SEQ ID NOs: 64, 66, and 67 as mutagenesis primers and using synthetic DNAs having the base salt sequences of SEQ ID NOs: 50, 51, 66, 67, 64 and 55, By carrying out the method described in 1), a plasmid phKM1259HV2 containing cDNA encoding a modified version 2 of VH (hereinafter referred to as HV.2) of the anti-human IL-5Rα chain human CDR-grafted antibody shown in SEQ ID NO: 101 is obtained. Obtained. In order to maintain the reactivity to the human IL-5Rα chain found in the monoclonal antibody and the human chimeric antibody in the amino acid sequence of HV.2, SEQ ID NO: 98 contains glutamic acid at position 46 in FR, threonine at position 74, The amino acids 95th tyrosine and 97th alanine are changed to alanine, arginine, leucine and glycine, which are amino acids found in the V region of the mouse antibody KM1259H chain.
In addition, using the sequences shown in SEQ ID NOs: 69, 70, 71 as mutagenesis primers, and using synthetic DNAs having the base sequences of SEQ ID NOs: 50, 51, 69, 70, 71, 55, 5 (1 ) To obtain a plasmid phKM1259HV3 containing cDNA encoding a modified version 3 VH (hereinafter referred to as HV.3) of the anti-human IL-5Rα chain human CDR-grafted antibody shown in SEQ ID NO: 102. It was. In the amino acid sequence of HV.3, in order to maintain the reactivity to the human IL-5Rα chain found in the mouse antibody and the human chimeric antibody, SEQ ID NO: 98 contains alanine at position 40 in FR, glutamic acid at position 46, Arginine at position 67, Alanine at position 72, Threonine at position 74, Alanine at position 79, Tyrosine at position 95, Alanine at position 97 are the amino acids found in mouse antibody KM1259H chain V region arginine, alanine, lysine , Serine, arginine, valine, leucine and glycine.
As a result, the number of amino acids derived from mouse antibodies accompanying modification increases with the progress of HV.0, HV.1, HV.2, and HV.3 versions.
(2) Modification of VL amino acid sequence of anti-human IL-5Rα chain human CDR-grafted antibody KM8397
The VL amino acids of the anti-human IL-5Rα chain human CDR-grafted antibody KM8397 shown in SEQ ID NO: 99 were mutated to prepare various modified versions of the anti-human IL-5Rα chain human CDR-grafted antibody VL. The amino acid to be mutated was randomly selected with reference to a computer three-dimensional structural model of the V region of the anti-human IL-5Rα chain antibody KM1259. As a method for introducing a mutation, the method described in 5 (1) of Example 2 was used using a mutagenesis primer, and a cDNA encoding a modified version of VL of the target anti-human IL-5Rα chain human CDR-grafted antibody was obtained. A plasmid containing was obtained.
Actually, the sequences shown in SEQ ID NOs: 73, 74, and 75 were used as mutagenesis primers, and synthetic DNAs having the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 57, 58, 73, 74, 61, and 75 were used. By performing the method described in (1), the VL (hereinafter referred to as LV.1) of the modified version 1 of the anti-human IL-5Rα chain human CDR-grafted antibody shown at positions 1 to 107 of SEQ ID NO: 76 is encoded. Plasmid phKM1259LV1 containing cDNA was obtained. In order to maintain the reactivity to the human IL-5Rα chain found in monoclonal antibodies and human chimeric antibodies in the amino acid sequence of LV.1, SEQ ID NO: 99 contains glutamine at position 37 in FR, lysine at position 45, Each amino acid of phenylalanine at position 98 is changed to arginine, glutamic acid, and valine, which are amino acids found in the monoclonal antibody KM1259L chain V region.
In addition, using the sequences shown in SEQ ID NOs: 74, 75, 77, and 78 as mutagenesis primers, and using synthetic DNAs having the base sequences of SEQ ID NOs: 57, 58, 77, 74, 78, and 75, Example 5-5 Plasmid phKM1259LV2 containing cDNA encoding VL (hereinafter referred to as LV.2) of modified version 2 of the anti-human IL-5Rα chain human CDR-grafted antibody shown in SEQ ID NO: 103 by carrying out the method described in (1) Got. In the amino acid sequence of LV.2, in order to maintain the reactivity to the human IL-5Rα chain observed in the monoclonal antibody and the human chimeric antibody, SEQ ID NO: 99 contains threonine at position 22 in FR, glutamine at position 37, The amino acids of lysine at position 45, serine at position 77, and phenylalanine at position 98 are changed to glycine, arginine, glutamic acid, aspartic acid, and valine, which are amino acids found in the V region of the monoclonal antibody KM1259L chain.
Further, using the sequences shown in SEQ ID NOs: 74, 80, 81, 82, 83 as mutagenesis primers, and using synthetic DNAs having the base sequences of SEQ ID NOs: 57, 80, 81, 74, 82, 83, 5 (1 ) To obtain plasmid phKM1259LV3 containing cDNA encoding VL (hereinafter referred to as LV.3) of modified version 3 of the anti-human IL-5Rα chain human CDR-grafted antibody shown in SEQ ID NO: 105 It was. In the amino acid sequence of LV.3, in order to retain the reactivity to the human IL-5Rα chain found in the monoclonal antibody and the human chimeric antibody, SEQ ID NO: 99 contains 7th serine in FR, 8th proline, Amino acids found in the monoclonal antibody KM1259 L chain V region are threonine at position 22, glutamine at position 37, glutamine at position 38, lysine at position 45, serine at position 77, tyrosine at position 87, and phenylalanine at position 98. They are changed to alanine, threonine, glycine, arginine, lysine, glutamic acid, aspartic acid, phenylalanine, and valine, respectively.
Further, Example 2 using the sequence shown in SEQ ID NOs: 80, 83, 85, 86, and 87 as the mutagenesis primer and using a synthetic DNA having the base sequences of SEQ ID NOs: 57, 80, 85, 86, 87, and 83. The cDNA encoding the modified version 4 VL (hereinafter referred to as LV.4) of the anti-human IL-5Rα chain human CDR-grafted antibody shown in SEQ ID NO: 106 is obtained by performing the method described in 5 (1) Plasmid phKM1259LV4 was obtained. In order to maintain the reactivity to the human IL-5Rα chain found in monoclonal antibody and human chimeric antibody in the amino acid sequence of LV.4, SEQ ID NO: 99 contains serine at position 7 and proline at position 8 in FR. , Threonine at position 22, glutamine at position 37, glutamine at position 38, proline at position 44, lysine at position 45, phenylalanine at position 71, serine at position 77, tyrosine at position 87, and phenylalanine at position 98 The amino acids found in the antibody KM1259 L chain V region are alanine, threonine, glycine, arginine, lysine, valine, glutamic acid, tyrosine, aspartic acid, phenylalanine, and valine, respectively.
As a result, the number of amino acids derived from monoclonal antibodies accompanying modification increases as the version progresses to LV.0, LV.1, LV.2, LV.3, and LV.4.
(3) Production of anti-human IL-5Rα chain human CDR-grafted antibody having various modified versions of the V region
V region of various modified versions of the humanized antibody expression vector pKANTEX93 constructed in 1 of Example 2 and the anti-human IL-5Rα chain human CDR-grafted antibody obtained in 5 (1) and (2) of Example 2 An anti-human IL-5Rα chain human CDR-grafted antibody expression vector having various modified versions of the V region was constructed according to the method described in Example 2, 5 (3) using various plasmids containing cDNA encoding. Table 3 shows the combinations of V regions of various modified versions used in the constructed expression vectors and the names of the expression vectors.
Figure 0003946256
Of the above expression vector, pKANTEX1259HV0LV0, pKANTEX1259HV1LV0, pKANTEX1259HV2LV0, pKANTEX1259HV0LV1, pKANTEX1259HV1LV1, pKANTEX1259HV2LV1, pKANTEX1259HV0LV2, pKANTEX1259HV1LV2, pKANTEX1259HV2LV2, pKANTEX1259HV0LV3, pKANTEX1259HV1LV3, one according to the method described pKANTEX1259HV2LV3 and pKANTEX1259HV3LV3 total 13 kinds 4 (1) of Example 2 Modified to a vector for transient expression. Using these transient expression vectors, according to the method described in Example 2, 4 (2), transient expression of anti-human IL-5Rα chain human CDR-grafted antibody having V regions of various modified versions was performed. It was. As a control, the anti-human IL-5Rα chain human chimeric antibody KM1399 was transiently expressed simultaneously. The binding activity to human IL-5Rα chain in the culture supernatant was measured by ELISA method 1 described in 3 (2) of Example 2, and the antibody concentration in the culture supernatant was determined as 4 (3) of Example 2. Relative activity of the anti-human IL-5Rα chain human CDR-grafted antibody having various modified versions of the V region, with the activity of the human chimeric antibody KM1399 as 100, measured by the ELISA method described in 2. The values are shown in FIG. 49. In the figure, various modified versions of anti-human IL-5Rα chain human CDR-grafted antibodies are shown as combinations of VH and VL. From Fig. 49, VH has a tendency to increase in activity as HV.0, HV.1, HV.2, and HV.3 progress, and VL has high activity in LV.0 and LV.3. , LV.1 and LV.2 tended to decrease the activity. Therefore, the anti-human IL-5Rα chain is a combination of LV.0 and various modified VH, LV.3 and HV.0, LV.3 and HV.3, and LV.4 further modified from LV.3 and various modified VH. A more accurate evaluation of the activity of the human CDR-grafted antibody using the purified antibody was performed by the following method.
The above 10 types of anti-human IL-5Rα chain human CDR-grafted antibody expression vectors, i.e.
Using pKANTEX1259HV3LV4, expression in YB2 / 0 cells was carried out according to the method described in 3 (2) of Example 2, and 2-4 μg / 10 of various anti-human IL-5Rα chain human CDR-grafted antibodies were obtained.6A transformant producing with a productivity of cells / 24hr was obtained. The resulting strains producing various anti-human IL-5Rα chain human CDR-grafted antibodies were cultured and purified according to the method described in Example 2, 3 (3), and various anti-human IL-5Rα chain human CDRs were obtained. 1-2 mg of transplanted antibody was obtained. About 4 μg of various purified anti-human IL-5Rα chain human CDR-grafted antibodies were electrophoresed according to the method described in 3 (3) of Example 2 to examine the molecular weight. As a result, with any anti-human IL-5Rα chain human CDR-grafted antibody, the molecular weight of the antibody H chain is about 50 kilodaltons and the molecular weight of the antibody L chain is about 25 kilodaltons under the reducing conditions. And the expression of light chain was confirmed. Also, under non-reducing conditions, all anti-human IL-5Rα chain human CDR-grafted antibodies have a molecular weight of about 140 kilodaltons, and have the correct size human CDRs consisting of two H chains and two L chains. Expression of the transplanted antibody was confirmed. In addition, as a result of analyzing the N-terminal amino acid sequences of the H chain and L chain of various purified anti-human IL-5Rα chain CDR-grafted antibodies by automatic Edman degradation using a protein sequencer (470A, Applied Biosystems) The expected correct amino acid sequence was obtained.
The reactivity of the various purified anti-human IL-5Rα chain human CDR-grafted antibodies obtained above to human IL-5Rα chain was measured by ELISA method 2 described in Example 2, 3 (2). Shown in the figure. In the figure, various modified versions of anti-human IL-5Rα chain human CDR-grafted antibodies are shown as combinations of VH and VL. As shown in FIG. 50, among the 10 types of purified anti-human IL-5Rα chain human CDR-grafted antibodies, HV.3LV.0 and HV.3LV.4 are anti-human IL-5Rα chain human chimeric antibody KM1399. It was shown to have reactivity to human IL-5Rα chains of comparable strength.
Anti-human IL-5Rα chain human CDR-grafted antibodies HV.3LV.0 and HV.3LV.4 showed reactivity to human IL-5Rα chain with the same strength as anti-human IL-5Rα chain human chimeric antibody KM1399 When HV is compared, both HV have the amino acid sequence shown in HV.3, but VL is the amino acid sequence shown in LV.0 and LV.4. LV.0 is a sequence in which CDR is simply grafted to the FR of a human antibody, whereas LV.4 converts 11 amino acids of the FR of a human antibody to amino acids found in a monoclonal antibody in order to increase activity. It is a modified sequence. However, from the results shown in FIG. 50, the modification of amino acid residues actually contributes little to the increase in activity. From these facts, it has reactivity to human IL-5Rα chain with the same strength as anti-human IL-5Rα chain human chimeric antibody KM1399, and there are few amino acids derived from monoclonal antibodies, resulting in decreased antigenicity to humans. HV.3LV.0 was expected to be an anti-human IL-5Rα chain human CDR-grafted antibody. HV.3LV.0 was named KM8399, and the transformed strain KM8399 producing KM8399 was deposited as FERM BP-5648 on September 3, 1996 at the Institute of Biotechnology, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology.
In the production of the anti-human IL-5Rα chain human CDR-grafted antibody KM8399, as with the production of other human CDR-grafted antibodies, only the CDR of the original anti-human IL-5Rα chain monoclonal antibody KM1259 is simply human. The activity of the anti-human IL-5Rα chain human CDR-grafted antibody KM8397 grafted to the FR of the antibody was reduced to about half that of the monoclonal antibody KM1259. Thus, as described above, several amino acids of FR in the V region of the H chain and L chain were modified to amino acids found in the monoclonal antibody KM1259, and the increase in activity was examined. In the process of modification, the activity of VH increased according to the modification, whereas the modification of a small number of amino acid residues for VL decreased the activity and increased the activity by increasing the number of modified residues. The result was that it only increased to the same level as the unmodified VL. For this cause, more detailed analysis (such as X-ray crystallography) must be awaited, but the interaction between antibody VH and VL is probably involved, and the results may differ depending on the individual antibody used. Because of these problems, an efficient method for producing a human CDR-grafted antibody that can be applied to all antibodies has not yet been established, and trial and error as in this example is necessary. And, it is considered that a more efficient method for producing a human CDR-grafted antibody is established by the accumulation of such trial and error. This Example is an example of the production of the first anti-human IL-5Rα chain human CDR-grafted antibody and provides suggestions for the efficient production of human CDR-grafted antibody.
7. Production of anti-human IL-5Rα chain humanized antibody of human antibody IgG4 subclass
(1) Isolation and analysis of cDNA encoding C region (Cγ4) of human antibody IgG4 subclass
Using Dynabeads (DYNABEADS M-450 Pan-B (CD19): Nippon Dynal Co., Ltd.) and DETACHaBEAD (Nihon Dynal Co., Ltd.) coated with anti-CD19 antibody from 200 ml of healthy human peripheral blood, 1.1. × 107B cells were isolated. From the separated cells, mRNA was obtained using QuickPrep mRNA Purification Kit (Pharmacia Biotech) according to the instructions attached to the kit. CDNA was synthesized from the total amount of mRNA using TimeSaver cDNA Synthesis Kit (Pharmacia Biotech) according to the instruction manual attached to the kit. Using the total amount of the obtained cDNA, sequences having homology on the 5 ′ side and 3 ′ side of the cDNA encoding human antibody Cγ4 shown in SEQ ID NOs: 89 and 90 [Nucleic Acid Research] ,14, 1789 (1986)] PCR was performed as described in 5 (1) of Example 2 using as a primer. The 5 'and 3' primers used for PCR have recognition sequences for restriction enzymes ApaI and BamHI at their 5 'ends, respectively, so that the resulting cDNA can be easily inserted into humanized antibody expression vectors. Designed. The reaction solution after PCR is purified using QIAquick PCR Purificanon Kit (Qiagen), then added to 30 μl of a buffer solution consisting of 10 mM Tris-hydrochloric acid (pH 7.5), 10 mM magnesium chloride and 1 mM DTT, and 10 units of restriction enzyme. ApaI (Takara Shuzo) was added and reacted at 37 ° C. for 1 hour. The reaction solution was ethanol precipitated, added to 10 μl of a buffer solution consisting of 20 mM Tris-hydrochloric acid (pH 8.5), 100 mM potassium chloride, 10 mM magnesium chloride, and 1 mM DTT, and further 10 units of restriction enzyme BamHI (Takara Shuzo) was added. The reaction was carried out at 30 ° C. for 1 hour. The reaction solution was fractionated by agarose gel electrophoresis, and about 0.5 μg of an about 1.0 kb ApaI-BamHI fragment was recovered.
Next, 3 μg of the plasmid pBluescriptSK (-) (Stratagene) was added to 10 μl of a buffer solution consisting of 10 mM Tris-HCl (pH 7.5), 10 mM magnesium chloride and 1 mM DTT, and 10 units of restriction enzyme ApaI (Takara Shuzo). Made) and reacted at 37 ° C. for 1 hour. The reaction solution was ethanol precipitated, added to 10 μl of a buffer solution consisting of 20 mM Tris-hydrochloric acid (pH 8.5), 100 mM potassium chloride, 10 mM magnesium chloride, and 1 mM DTT, and further 10 units of restriction enzyme BamHI (Takara Shuzo) was added. The reaction was carried out at 30 ° C. for 1 hour. The reaction solution was fractionated by agarose gel electrophoresis, and about 2 μg of an about 3.0 kb ApaI-BamHI fragment was recovered.
Ready-To-Go T4 DNA Ligase (manufactured by Pharmacia Biotech) was added 0.1 μg of ApaI-BamHI fragment of the PCR amplified fragment obtained above and 0.1 μg of ApaI-BamHI fragment of pBluescriptSK (-) to 20 μl of sterilized water. Were connected using Escherichia coli HB101 strain was transformed with the recombinant plasmid DNA solution thus obtained. As a result of preparing each plasmid DNA from 10 clones of the transformant and determining the base sequence, the plasmid pBShCγ4 shown in FIG. 51 containing the cDNA encoding the target human antibody Cγ4 was obtained.
(2) Construction of humanized antibody IgG4 subclass anti-human IL-5Rα chain humanized antibody expression vector
Expression vector of plasmid pBShCγ4 containing cDNA encoding human antibody Cγ4 obtained in 7 (1) of Example 2 and anti-human IL-5Rα chain human chimeric antibody KM1399 obtained in 3 (1) of Example 2 Expression of anti-human IL-5Rα chain humanized antibody of human antibody IgG4 subclass using pKANTEX1259 and expression vector pKANTEX1259HV3LV0 of anti-human IL-5Rα chain human CDR-grafted antibody KM8399 obtained in 6 (3) of Example 2 The vector was constructed as follows.
4 μg of plasmid pBShCγ4 containing cDNA encoding human antibody Cγ4 is added to 10 μl of a buffer solution consisting of 10 mM Tris-HCl (pH 7.5), 10 mM magnesium chloride and 1 mM DTT, and 10 units of restriction enzyme ApaI (Takara Shuzo) is added. In addition, the mixture was reacted at 37 ° C. for 1 hour. The reaction solution was ethanol precipitated, added to 10 μl of a buffer solution consisting of 20 mM Tris-hydrochloric acid (pH 8.5), 100 mM potassium chloride, 10 mM magnesium chloride, and 1 mM DTT, and further 10 units of restriction enzyme BamHI (Takara Shuzo) was added. The reaction was carried out at 30 ° C. for 1 hour. The reaction solution was fractionated by agarose gel electrophoresis, and about 1 μg of an about 1.0 kb ApaI-BamHI fragment was recovered.
Next, 3 μg each of the expression vector pKANTEX1259 of the anti-human IL-5Rα chain human chimeric antibody KM1399 and the expression vector pKANTEX1259HV3LV0 of the anti-human IL-5Rα chain human CDR-grafted antibody KM8399 was added to 10 mM Tris-hydrochloric acid (pH 7.5), 10 mM. In addition to 10 μl of a buffer solution composed of magnesium chloride and 1 mM DTT, 10 units of restriction enzyme ApaI (manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd.) was added and reacted at 37 ° C. for 1 hour. Precipitate each reaction solution with ethanol, add 10 μl of a buffer solution consisting of 20 mM Tris-HCl (pH 8.5), 100 mM potassium chloride, 10 mM magnesium chloride, and 1 mM DTT, and then add 10 units of restriction enzyme BamHI (Takara Shuzo). The reaction was carried out at 30 ° C. for 1 hour. Each reaction solution was fractionated by agarose gel electrophoresis, and about 2 μg of an about 12.59 kb ApaI-BamHI fragment was recovered.
0.1 μg of ApaI-BamHI fragment derived from plasmid pBShCγ4 and 0.1 μg of ApaI-BamHI fragment derived from plasmid pKANTEX1259 obtained above, 0.1 μg of ApaI-BamHI fragment derived from plasmid pBShCγ4 and 0.1 μg of ApaI-BamHI fragment derived from plasmid pKANTEX1259HV3LV0 Were each added to 20 μl of sterilized water and ligated using Ready-To-Go T4 DNA Ligase (Pharmacia Biotech). Each recombinant plasmid DNA solution thus obtained was used to transform E. coli strain HB101, and the IgG4 subclass anti-human IL-5Rα chain human chimeric antibody expression vectors pKANTEX1259γ4 and IgG4 subclass shown in FIG. The expression vector pKANTEX1259HV3LV0γ4 of the anti-human IL-5Rα chain human CDR-grafted antibody was obtained.
(3) Expression of anti-human IL-5Rα chain humanized antibody of human antibody IgG4 subclass in rat myeloma YB2 / 0 cells (ATCC CRL1581)
Using the expression vector pKANTEX1259γ4 of the anti-human IL-5Rα chain human chimeric antibody of IgG4 subclass obtained in 7 (2) of Example 2 and the expression vector pKANTEX1259HV3LV0γ4 of the anti-human IL-5Rα chain human CDR grafted antibody of IgG4 subclass Then, expression of human antibody IgG4 subclass anti-human IL-5Rα chain humanized antibody in YB2 / 0 cells was performed according to the method described in Example 2, 3 (2).
As a result, KM7399 (FERM BP-5649) was obtained as a transformant producing an anti-human IL-5Rα chain human chimeric antibody of IgG4 subclass, and the antihuman IL-5Rα human type of IgG4 subclass produced by it. The chimeric antibody was named KM7399. The transformed strain KM7399 producing KM7399 was deposited with the Institute of Microbial Industrial Technology, National Institute of Industrial Science, on September 3, 1996 as FERM BP-5649. The productivity of the anti-human IL-5Rα chain human chimeric antibody KM7399 of the transformed strain KM7399 is about 3 μg / 106cells / 24hr.
In addition, KM9399 (FERM BP-5647) is obtained as a transformant producing an IgG4 subclass anti-human IL-5Rα chain human CDR-grafted antibody, and the IgG4 subclass anti-human IL-5Rα chain human type produced by it is obtained. The CDR-grafted antibody was named KM9399. The productivity of the anti-human IL-5Rα chain human CDR-grafted antibody KM9399 of the transformed strain KM9399 is about 7 μg / 106cells / 24hr. The transformed strain KM9399 producing KM9399 was deposited as FERM BP-5647 on September 3, 1996 at the Institute for Microbial Industrial Technology.
(4) Purification of human antibody IgG4 subclass anti-human IL-5Rα chain humanized antibody from culture supernatant
Example 2 The IgG4 subclass anti-human IL-5Rα chain human chimeric antibody production strain KM7399 and the IgG4 subclass anti-human IL-5Rα chain human CDR-grafted antibody production strain KM9399 obtained in 7 (3) of Example 2 were used. According to the method described in 3 (3) of the above, the cells were cultured and purified to obtain about 1 mg and 5 mg of KM7399 and KM9399, respectively. About 4 μg of each of the purified IgG4 subclass anti-human IL-5Rα chain humanized antibodies KM7399 and KM9399 were electrophoresed according to the method described in Example 2, 3 (3), and the molecular weight was examined. The results are shown in FIG. As shown in Fig. 53, under the reducing conditions, the molecular weight of each antibody H chain is approximately 50 kilodaltons, and the antibody L chain molecular weight is approximately 25 kilodaltons, confirming the expression of the correct molecular weight of H and L chains. It was done. Under non-reducing conditions, the molecular weight of each anti-human IL-5Rα chain humanized antibody is about 140 kilodaltons, and the correct size human CDR-grafted antibody consisting of two H chains and two L chains. Expression was confirmed. In addition, the H- and L-chain amino acid sequences of the purified IgG4 subclass anti-human IL-5Rα chain humanized antibodies KM7399 and KM9399 were analyzed by automated Edman degradation using a protein sequencer (470A, Applied Biosystems). As a result, the expected correct amino acid sequence was obtained.
(5) Reactivity of human antibody IgG4 subclass anti-human IL-5Rα chain humanized antibody to human IL-5Rα chain (ELISA method 2)
Anti-human IL-5Rα chain human chimeric antibody KM1399 of human antibody IgG1 subclass, anti-human IL-5Rα chain human CDR-grafted antibody KM8399 of human antibody IgG1 subclass, anti-human IL-5Rα chain human chimeric antibody KM7399 of IgG4 subclass and The reactivity of the IgG4 subclass anti-human IL-5Rα chain human CDR-grafted antibody KM9399 to human IL-5Rα chain was measured by ELISA method 2 described in Example 2, 3 (2). The results are shown in FIG. As shown in FIG. 54, human antibody IgG4 subclass anti-human IL-5Rα chain humanized antibody is directed against human IL-5Rα chain of the same strength as human antibody IgG1 subclass anti-human IL-5Rα chain humanized antibody. It was shown to have reactivity.
Example 3
1. Confirmation of specificity of anti-hIL-5Rα antibody
Specificity of the anti-hIL-5Rα monoclonal antibody and the anti-hIL-5Rα humanized antibody was confirmed by using immunocytostaining according to the following procedure.
CTLL-2 cells (ATCC TIB 214) introduced with human IL-5R gene [hereinafter referred to as CTLL-2 (h5R) cells] [Journal of Experimental Medicine (J. Exp. Med.) ,1771523 (1993)], or CTLL-2 cells 5 × 10 as a controlFiveThe cells were suspended in an immune cell staining buffer (PBS containing 1% BSA, 0.02% EDTA, 0.05% sodium azide) and dispensed at 100 μl / well into a round bottom 96-well plate. After centrifugation at 4 ° C. and 350 × g for 1 minute, the supernatant was removed, 50 μl of an immune cell staining buffer containing 10 μg / ml hIL-5Rα antibody was added, and the mixture was reacted at 4 ° C. for 30 minutes. After the reaction, an immune cell staining buffer was added at 200 μl / well, centrifuged at 4 ° C. and 350 × g for 1 minute, the supernatant was removed, and the cells were washed. After performing this washing operation two more times, a buffer solution for immune cell staining containing FITC-labeled anti-mouse immunoglobulin antibody or FITC-labeled anti-human immunoglobulin antibody (both manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) diluted 30-fold with a staining buffer 50 μl was added and reacted at 4 ° C. for 30 minutes. After the reaction, the same washing operation as described above was performed three times, and then analysis was performed using a flow cytometer (manufactured by Coulter).
The results are shown in FIG. The monoclonal antibodies KM1257, KM1259 and KM1486, and humanized antibodies KM1399, KM7399, KM8399 and KM9399 did not react with CTLL-2 cells but reacted specifically with CTLL-2 (h5R) cells. As a result, it was revealed that monoclonal antibodies KM1257, KM1259 and KM1486, and humanized antibodies KM1399, KM7399, KM8399 and KM9399 specifically recognize hIL-5Rα.
2. Inhibition of biological activity of IL-5 by anti-IL-5Rα antibody
CTLL-2 (h5R) cells show a proliferative response depending on human IL-5 [Journal of Experimental Medicine (J. Exp. Med.),177, 1523 (1993)], the effect of the obtained anti-IL-5Rα antibody on human IL-5-dependent cell proliferation in CTLL-2 (h5R) cells was examined. Cell proliferation was evaluated by a color development method using a cell counting kit (manufactured by Dojindo Laboratories).
CTLL-2 (h5R) cell 1 × 10FourThe cells were suspended in 50 μl of normal medium and dispensed into a 96-well culture plate. This was mixed with 25 μl / well of various anti-IL-5Rα antibody solutions diluted with normal medium at 25 μl / well, and 25 μl / well of normal medium containing 0.4 ng / ml human IL-5 prepared by the method of Example 1-3. , CO2The cells were cultured for 44 hours at 37 ° C. in an incubator. Furthermore, add the cell counting kit solution at 10 μl / well and then add CO.2 The cells were cultured at 37 ° C. for 4 hours under a 5% air flow. After completion of the culture, the absorbance at 450 nm was measured with a microwell plate reader Emax (manufactured by Molecular Devices). The CTLL-2 (h5R) cell growth inhibitory activity of each antibody was calculated by the following formula.
Figure 0003946256
The results are shown in FIG. 56. Monoclonal antibodies KM1259 and KM1486 and humanized antibodies KM1399, KM7399, KM8399 and KM9399 all inhibited human IL-5-dependent proliferation of CTLL-2 (h5R) cells. Such activity was not observed with antibody KM1257.
3. Immune cell staining of human eosinophils
After preparing a polymorphonuclear leukocyte fraction from normal human blood and culturing in the presence of human IL-5 for 3 days to concentrate eosinophils, the reactivity of the anti-hIL-5Rα monoclonal antibody is measured using a flow cytometer. investigated.
Polymorphprep (manufactured by Nicomed) was dispensed into 8 ml each of 15 ml polypropylene centrifuge tubes, and 6 ml of normal human blood treated with heparin was layered on each. This was centrifuged at 500 × g for 30 minutes at room temperature to separate and collect polymorphonuclear leukocytes. Polymorphonuclear leukocytes are 1.25 x 107Suspend in normal medium to make 10 / 10ml, dispense 10ml to 4 cell culture dishes, add human IL-5 to a final concentration of 2ng / ml, add CO22The cells were cultured at 37 ° C. for 3 days in an incubator. After completion of the culture, the cells are centrifuged (1,200 rpm, 5 minutes), and 5 × 10 5 with an immune cell staining buffer.6Suspend cells to 5 cells / ml, 5 x 10FiveThe aliquots were dispensed into round bottom 96 well plates. After centrifugation at 4 ° C and 350 xg for 1 minute, the supernatant was removed, and biotin-labeled monoclonal antibody KM1259 by a known method (enzyme antibody method: interdisciplinary plan 1985) or biotin-labeled anti-human granulocyte colony stimulation Factor monoclonal antibody KM341 [Agricultural and Biological Chemistry (Agr. Biol. Chem.),53, 1095 (1989)] was added at 50 μl of an immune cell staining buffer containing 10% normal mouse serum at a concentration of 10 μg / ml and reacted at 4 ° C. for 30 minutes. After the reaction, an immune cell staining buffer was added to 200 μl / well, centrifuged at 4 ° C. and 350 × g for 1 minute, the supernatant was removed, and the cells were washed. After this washing operation was further performed twice, 50 μl / well of phycoerythrin-labeled streptavidin (Becton Dickinson) diluted 10-fold with an immune cell staining buffer was added and reacted at 4 ° C. for 30 minutes. . After the reaction, the same washing operation as described above was performed three times, and then analysis was performed on cells recognized as polymorphonuclear leukocytes by forward scatter and 90 degree scatter using a flow cytometer (manufactured by Coulter). In addition, when the same cells were stained with May-Gründwald Giemsa staining method (all of the staining methods: Ishiyaku Shuppan Co., Ltd. 1988) and observed for polymorphonuclear leukocytes, 75% were eosinophils It was confirmed.
FIG. 57 shows the obtained histogram. The anti-human IL-5Rα chain monoclonal antibody KM1259 showed clear reactivity. Since 75% of the analyzed cells were confirmed to be eosinophils, it was confirmed that the anti-human IL-5Rα chain monoclonal KM1259 has reactivity with human eosinophils.
4). Inhibition of human eosinophil survival using anti-IL-5Rα antibody
Polymorphonuclear leukocyte fraction was prepared from normal human blood, and the effect of anti-IL-5Rα antibody on eosinophil survival in the presence of human IL-5 was examined.
Polymorphprep (manufactured by Nicomed) was dispensed into 15 ml polypropylene centrifuge tubes each having a capacity of 15 ml, and 8 ml of normal human blood treated with heparin was layered on each. This was centrifuged at 500 × g for 30 minutes at room temperature to separate and collect polymorphonuclear leukocytes.
A Percoll stock solution was prepared by adding 1 volume of sterile 1.5M saline to 9 volumes of Percoll solution (Percoll, Pharmacia). An 80% percoll solution was prepared by adding 2 volumes of physiological saline to an 8 volume percoll stock solution, and a 60% percoll solution was prepared by adding 4 volumes of physiological saline to a 6 volume percoll stock solution. In order to remove the mixed mononuclear cells, 5 ml of 60% percoll solution is dispensed into two 15 ml polypropylene centrifuge tubes, and the polymorphonuclear leukocytes suspended in the RPMI1640 medium obtained above are overlaid. The precipitated polymorphonuclear leukocytes were separated and collected by centrifugation at 500 × g for 30 minutes at room temperature. In order to remove further mixed red blood cells, 5 ml of 80% percoll solution was dispensed into two 15 ml polypropylene centrifuge tubes, and the polymorphonuclear leukocytes suspended in RPMI1640 medium obtained earlier were overlaid. The polymorphonuclear leukocytes floating in the percoll layer were separated and collected by centrifugation at 500 × g for 30 minutes at room temperature.
2 x 10 in 48-well cell culture plate6Cells / well were dispensed, human IL-5 having a final concentration of 0.1 ng / ml was added, and various anti-IL-5Rα antibodies having a final concentration of 1 μg / ml were further added. Two wells were cultured for each antibody, and the volume of each well was adjusted to 1 ml. CO2After culturing at 37 ° C. for 3 days in an incubator, the entire amount of the cell suspension was recovered from each well and centrifuged (3,000 rpm, 1 minute) to recover the cells. The obtained cells were suspended in 100 μl of PBS, and 50 μl of the suspension was used to prepare a sample with a cell sample preparation device: Cytospin 3 (Cytospin 3, manufactured by Shandon). After staining with the Mei Grundtwald Giemsa staining method, 200 cells were observed for each specimen, and the number of eosinophils was determined.
The results are shown in FIG. 58. Monoclonal antibodies KM1259 and KM1486 and humanized antibodies KM1399, KM7399, KM8399 and KM9399 all showed activity to suppress eosinophil life extension by IL-5. KM1257 did not show such activity.
5. Detection of shIL-5Rα using anti-hIL-5Rα antibody
Anti-human IL-5Rα monoclonal antibody KM1257 was diluted with PBS to a concentration of 10 μg / ml in a 96-well EIA plate (Greiner), dispensed at 50 μl / well, and allowed to stand overnight at 4 ° C. I let you. After washing, 100 μl / well of PBS containing 1% bovine serum albumin (BSA) was added and reacted for 1 hour at room temperature to block remaining active groups. 1% BSA-PBS was discarded, and the purified shIL-5Rα obtained in 1 (9) of Example 1 diluted with 1% BSA-PBS to a concentration of 1000 to 0.1 ng / ml was reacted at 4 ° C. overnight. . After washing with tween-PBS, biotin-labeled anti-human IL-5Rα monoclonal antibody KM1259 was diluted with 1% BSA-PBS to a concentration of 1 μg / ml by a known method (enzyme antibody method: 1985, interdisciplinary plan). 50 μl Per well, and allowed to react for 2 hours at room temperature. After washing with tween-PBS, 50 μl / well of avidin-labeled peroxidase (manufactured by Nichirei) diluted 4000 times with 1% BSA-PBS was added and allowed to react at room temperature for 1 hour. After washing with tween-PBS, color was developed using ABTS substrate solution [2.2-azinobis (3-ethylbenzothiazole-6-sulfonic acid) ammonium], and the absorbance at OD 415 nm was measured (NJ2001; manufactured by Nihon Intermed).
The results are shown in FIG. As a result, it was revealed that shIL-5Rα can be measured by using anti-human IL-5Rα monoclonal antibody KM1257 and biotin-labeled anti-human IL-5Rα monoclonal antibody KM1259.
6). Detection of shIL-5Rα by Western blotting
The shIL-5Rα described in 1 (9) of Example 1 was heat-denatured in a sample buffer for SDS-PAGE containing 2-mercaptoethanol or a sample buffer for SDS-PAGE not containing 2-mercaptoethanol. The solution was electrophoresed on a commercially available gradient gel for SDS-PAGE (manufactured by Atto), and then the protein was transferred to a PVDF membrane (manufactured by Millipore). The PVDF membrane was soaked in PBS containing 10% BSA and allowed to stand overnight at 4 ° C. for blocking. After blocking, the PVDF membrane was thoroughly washed with PBS containing 0.05% Tween. The PVDF membrane was immersed in the culture supernatant of the hybridoma obtained in 5 of Example 1 at room temperature for 2 hours and washed thoroughly with PBS containing 0.05% Tween. Furthermore, the PVDF membrane was immersed in a solution obtained by diluting a peroxidase-labeled anti-mouse immunoglobulin antibody (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) 1000 times with 1% BSA-PBS for 1 hour at room temperature, and washed thoroughly with PBS containing 0.05% Tween. After thoroughly removing the washing solution, ECL reagent (Amersham) was applied to the PVFD membrane and allowed to react for 1 minute. Excess reagent was removed, the PVDF membrane was sandwiched between plastic films and placed in an X-ray film photosensitive cassette, and the ECL film was exposed to confirm antibody reactivity.
The results are shown in FIG. KM1257 showed reactivity, but KM1259 and KM1486 did not show reactivity.
7. immunoprecipitation of shIL-5Rα
An anti-mouse immunoglobulin antibody (DAKO) diluted 50-fold with PBS on a 96-well plastic plate for EIA was dispensed at 200 μl / well and allowed to stand overnight at 4 ° C. for adsorption. After washing with PBS, PBS containing 1% BSA was dispensed at 300 μl / well and allowed to stand at room temperature for 1 hour for blocking. After washing with PBS, 200 μl each of the culture supernatant of anti-human IL-5Rα monoclonal antibody KM1257, KM1259 or KM1486 obtained in Example was added and allowed to stand overnight at 4 ° C. to adsorb the antibody. After washing the plate, 50 μl of shIL-5Rα obtained in 1 of Example 1 diluted with 1% BSA to a concentration of 10 μg / ml was dispensed and reacted at 4 ° C. overnight. After washing the plate with PBS containing 0.05% Tween, sample buffer for SDS-PAGE [0.31M Tris (pH 6.8), 10% SDS, 50% glycerol] without 5-fold 2-mercaptoethanol or 2 -Sample buffer for SDS-PAGE containing mercaptoethanol [0.31M Tris (pH 6.8), 10% SDS, 50% glycerol, 25% 2-mercaptoethanol] was dispensed at 50 μl / well, and shaken at room temperature. And left for 2 hours. The reaction solution was added to 200 μl of PBS, heated with a heat block, and then 25 μl of the solution was separated with a commercially available gradient gel for SDS-PAGE (manufactured by ATTO). After completion of electrophoresis, transfer was performed on a PVDF membrane (Millipore). The PVDF membrane was subjected to Western blotting using KM1257 by the method shown in 6 of Example 3 to detect shIL-5Rα.
The results are shown in FIG. It was revealed that KM1257, KM1259, and KM1486 all immunoprecipitate shIL-5Rα.
Industrial applicability
The present invention provides monoclonal antibodies KM1257, KM1259 and KM1486 that specifically bind to the human IL-5 receptor α chain, which is thought to be specifically expressed on human eosinophils. In addition, humanized antibodies KM1399 and KM8399 that specifically bind to the human IL-5 receptor α chain thought to be specifically expressed on human eosinophils and can inhibit the biological activity of human IL-5. KM7399 and KM9399 are provided. The antibody of the present invention is useful for immunological detection of human eosinophils in immune cell staining, diagnosis and treatment of allergic diseases by inhibiting the biological activity of IL-5. In particular, humanized antibodies have lower immunogenicity than monoclonal antibodies, and the effects are expected to last for a long time.
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Claims (31)

ヒトインターロイキン５受容体α鎖のＮ末端アミノ酸から１〜３１３番目に存在するエピトープを認識し、かつインターロイキン５のヒトインターロイキン５受容体α鎖への結合を阻害する抗体。An antibody that recognizes an epitope present at positions 1 to 313 from the N-terminal amino acid of the human interleukin 5 receptor α chain and inhibits the binding of interleukin 5 to the human interleukin 5 receptor α chain . 抗体の抗体重鎖（Ｈ鎖）可変領域（Ｖ領域）のCDR1、CDR2およびCDR3のアミノ酸配列がそれぞれ配列番号３４、配列番号３５および配列番号３６であり、抗体軽鎖（Ｌ鎖）可変領域（Ｖ領域）のCDR1、CDR2およびCDR3のアミノ酸配列がそれぞれ配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９である請求項１記載の抗体。The amino acid sequences of CDR1, CDR2, and CDR3 of the antibody heavy chain (H chain) variable region (V region) of the antibody are SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, and SEQ ID NO: 36, respectively, and the antibody light chain (L chain) variable region ( The antibody according to claim 1 , wherein the amino acid sequences of CDR1, CDR2, and CDR3 in the V region are SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, and SEQ ID NO: 39, respectively. 抗体の抗体重鎖（Ｈ鎖）可変領域（Ｖ領域）のCDR1、CDR2およびCDR3のアミノ酸配列がそれぞれ配列番号４０、配列番号４１および配列番号４２であり、抗体軽鎖（Ｌ鎖）可変領域（Ｖ領域）のCDR1、CDR2およびCDR3のアミノ酸配列がそれぞれ配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５である請求項１記載の抗体。The amino acid sequences of CDR1, CDR2, and CDR3 of the antibody heavy chain (H chain) variable region (V region) of the antibody are SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, and SEQ ID NO: 42, respectively, and the antibody light chain (L chain) variable region ( The antibody according to claim 1 , wherein the amino acid sequences of CDR1, CDR2, and CDR3 of V region) are SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, and SEQ ID NO: 45, respectively. 抗体のＨ鎖Ｖ領域が配列番号９４記載のアミノ酸配列を含み、Ｌ鎖Ｖ領域が配列番号９５記載のアミノ酸配列を含む請求項１記載の抗体。Comprises the amino acid sequence of the H chain V region SEQ ID NO: 94, wherein the antibody of claim 1, wherein the antibody comprising the amino acid sequence of the L chain V region SEQ ID NO: 95, wherein. 抗体のＨ鎖Ｖ領域が配列番号９６記載のアミノ酸配列を含み、Ｌ鎖Ｖ領域が配列番号９７記載のアミノ酸配列を含む請求項１記載の抗体。Comprises the amino acid sequence of the H chain V region SEQ ID NO: 96, wherein the antibody of claim 1, wherein the antibody comprising the amino acid sequence of the L chain V region SEQ ID NO: 97, wherein. 抗体がモノクローナル抗体である請求項１〜５のいずれか１項に記載の抗体。The antibody according to any one of claims 1 to 5 , wherein the antibody is a monoclonal antibody. 請求項６記載のモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマ。A hybridoma producing the monoclonal antibody according to claim 6 . ハイブリドーマKM1259（FERM BP-5134）またはハイブリドーマKM1486（FERM BP-5651）である請求項７記載のハイブリドーマ。The hybridoma according to claim 7, which is a hybridoma KM1259 (FERM BP-5134) or a hybridoma KM1486 (FERM BP-5651). ハイブリドーマKM1259（FERM BP-5134）またはハイブリドーマKM1486（FERM BP-5651）が生産する請求項６記載のモノクローナル抗体。The monoclonal antibody according to claim 6, which is produced by hybridoma KM1259 (FERM BP-5134) or hybridoma KM1486 (FERM BP-5651). ハイブリドーマKM1259（FERM BP-5134）またはハイブリドーマKM1486（FERM BP-5651）が生産するモノクローナル抗体が認識するエピトープを認識する、請求項６記載のモノクローナル抗体。The monoclonal antibody according to claim 6, which recognizes an epitope recognized by a monoclonal antibody produced by hybridoma KM1259 (FERM BP-5134) or hybridoma KM1486 (FERM BP-5651). 抗体がヒト型キメラ抗体である請求項１〜６のいずれか１項に記載の抗体。The antibody according to any one of claims 1 to 6 , wherein the antibody is a human chimeric antibody. 抗体Ｈ鎖Ｃ領域がヒト抗体IgGクラスである請求項１１記載のヒト型キメラ抗体。The human chimeric antibody according to claim 11 , wherein the antibody H chain C region is a human antibody IgG class. 抗体Ｈ鎖Ｃ領域がヒト抗体IgG1サブクラスである請求項２または４記載のヒト型キメラ抗体KM１３９９。The human chimeric antibody KM1399 according to claim 2 or 4 , wherein the antibody H chain C region is a human antibody IgG1 subclass. 抗体Ｈ鎖Ｃ領域がヒト抗体IgG4サブクラスである請求項２または４記載のヒト型キメラ抗体KM７３９９。The human chimeric antibody KM7399 according to claim 2 or 4 , wherein the antibody H chain C region is a human antibody IgG4 subclass. 請求項１３記載の抗体を生産する形質転換体KM1399（FERM BP-5650）。A transformant KM1399 (FERM BP-5650) which produces the antibody according to claim 13 . 請求項１４記載の抗体を生産する形質転換体KM7399（FERM BP-5649）。The transformant KM7399 (FERM BP-5649) which produces the antibody according to claim 14 . 抗体がヒト型CDR移植抗体である請求項１〜３のいずれか１項に記載の抗体。The antibody according to any one of claims 1 to 3 , wherein the antibody is a human CDR-grafted antibody. 抗体のＨ鎖Ｖ領域が配列番号１０２記載のアミノ酸配列を含み、Ｌ鎖Ｖ領域が配列番号９９記載のアミノ酸配列を含む請求項１７記載の抗体。The antibody according to claim 17, wherein the H chain V region of the antibody comprises the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 102, and the L chain V region includes the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 99. 抗体Ｈ鎖Ｃ領域がヒト抗体IgGクラスである請求項１７または１８記載のヒト型CDR移植抗体。The human CDR-grafted antibody according to claim 17 or 18 , wherein the antibody H chain C region is a human antibody IgG class. 抗体Ｈ鎖Ｃ領域がヒト抗体IgG1サブクラスである請求項２、１７〜１９のいずれか１項に記載のヒト型CDR移植抗体KM８３９９。The human CDR-grafted antibody KM8399 according to any one of claims 2 and 17 to 19 , wherein the antibody H chain C region is a human antibody IgG1 subclass. 抗体Ｈ鎖Ｃ領域がヒト抗体IgG4サブクラスである請求項２、１７〜１９のいずれか１項に記載のヒト型CDR移植抗体KM９３９９。The human CDR-grafted antibody KM9399 according to any one of claims 2 and 17 to 19 , wherein the antibody H chain C region is a human antibody IgG4 subclass. 請求項２０記載の抗体を生産する形質転換体KM8399（FERM BP-5648）。The transformant KM8399 (FERM BP-5648) which produces the antibody of Claim 20 . 請求項２１記載の抗体を生産する形質転換体KM9399（FERM BP-5647）。A transformant KM9399 (FERM BP-5647) which produces the antibody according to claim 21 . 抗体が、一本鎖抗体またはジスルフィド安定化抗体である請求項１〜６、９〜１４および１７〜２１のいずれか１項に記載の抗体。The antibody according to any one of claims 1 to 6 , 9 to 14, and 17 to 21 , wherein the antibody is a single chain antibody or a disulfide stabilized antibody. 請求項１〜６、９〜１４、１７〜２１および２４のいずれか１項の抗体を用いてヒトインターロイキン５受容体α鎖を免疫学的に検出または定量する方法。Claim 1-6, 9-14, a method of immunologically detecting or quantifying human interleukin 5 receptor α-chain with 17 to 21 and 24 any one of the antibodies. 請求項１〜６、９〜１４、１７〜２１および２４のいずれか１項の抗体を用いてヒトインターロイキン５受容体α鎖を細胞表面に発現した細胞を免疫学的に検出または定量する方法。A method for immunologically detecting or quantifying cells expressing human interleukin-5 receptor α chain on the cell surface using the antibody according to any one of claims 1 to 6 , 9 to 14 , 17 to 21 and 24. . 請求項１〜６、９〜１４、１７〜２１および２４のいずれか１項の抗体を用いてヒト好酸球を免疫学的に検出または定量する方法。Claim 1-6, 9-14, a method of immunologically detecting or quantifying human eosinophils with any one of the antibodies 17 to 21 and 24. 請求項１〜６、９〜１４、１７〜２１および２４のいずれか１項の抗体を用いて可溶性ヒトインターロイキン５受容体α鎖を免疫学的に検出または定量する方法。A method for immunologically detecting or quantifying a soluble human interleukin-5 receptor α chain using the antibody according to any one of claims 1 to 6 , 9 to 14 , 17 to 21 and 24 . 請求項１〜６、９〜１４、１７〜２１および２４のいずれか１項の抗体を有効成分として含有する医薬。The pharmaceutical which contains the antibody of any one of Claims 1-6 , 9-14 , 17-21 and 24 as an active ingredient. 請求項１〜６、９〜１４、１７〜２１および２４のいずれか１項の抗体を有効成分として含有する好酸球増多抑制剤。The eosinophilia increase inhibitor which contains the antibody of any one of Claims 1-6 , 9-14 , 17-21 and 24 as an active ingredient. 請求項１〜６、９〜１４、１７〜２１および２４のいずれか１項の抗体を有効成分として含有するアレルギー性疾患治療剤。The therapeutic agent for allergic diseases which contains the antibody of any one of Claims 1-6 , 9-14 , 17-21 and 24 as an active ingredient.
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