JP3928492B2 - 混合微生物系の監視方法および管理方法 - Google Patents
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Description
本発明は微生物の遺伝子解析によって得られた情報を統計解析によって処理し、その結果を基に、生物処理プロセスにおける混合微生物系を監視または管理する混合微生物系の監視方法および管理方法に関する。
【0002】
生物処理プロセスにおける混合微生物系において、混合微生物群集中の特定の微生物だけを検出し、その微生物の存在量などを指標として生物処理系を監視または管理に利用する方法は一般的に行われている。
しかし、混合微生物群集全体の状態の変化を検出し、生物処理の監視または管理に利用する方法はこれまで存在しなかった。このため生物処理にトラブルが生じても、その原因を把握できず、対処もできなかった。
【0003】
ところで、遺伝子を対象にして混合微生物系を解析する方法は種々の方法が提案されており、例えばDenaturing Gradient Gel Electrophoresis(DGGE)法やTerminal Restriction Length Polymorphism(T−RFLP)法などが知られている。
しかし、このような混合微生物系を解析する方法を、生物処理プロセスにおける混合微生物系全体の監視または管理に利用した例はない。
【0004】
また、上記DGGE法およびT−RFLP法を、混合微生物系全体の監視または管理に利用しようとした場合、次のような問題点がある。
1)DGGE法ではすべての検出DNAバンドがどのような微生物由来かを特定することは非常に手間がかかるため、混合微生物系の解析を短時間で行うことができない。
2)DGGE法では得られたDNAの泳動距離は絶対的な値ではなく、1枚毎に泳動距離が異なるため、1枚のゲル上で得られたデータ同士の比較はできるが、他のゲル上で得られたデータとは比較できない。このためDGGE法では、得られたデータを統計解析処理しようとする場合、全ての対象サンプルを一枚のゲル上で泳動させなければならない。
3)T−RFLP法ではすべてのピークがどのような微生物由来かを特定することは非常に手間がかかるため、混合微生物系の解析を短時間で行うことができない。
【0005】
このように、これまでは混合微生物系の解析を短時間で簡単に行う方法が存在しなかったため、混合微生物系の解析を短時間で簡単に行って、混合微生物系を簡単に監視または管理することができる方法の開発が待たれていた。
【0006】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、混合微生物系の解析を短時間で簡単に行うことができ、これにより混合微生物系のトラブルに迅速に対応することができる生物処理プロセスにおける混合微生物系の監視方法および管理方法を提案することである。
【0007】
【課題を解決するための手段】
本発明は次の混合微生物系の監視方法および管理方法である。
(1) 生物処理プロセスにおける混合微生物系から混合微生物群集試料を採取し、
この試料の遺伝子をT−RFLP法により解析し、
混合微生物群集全体のエレクトロフェログラムを検出ピーク位置とピーク面積で整理し数値化して解析データを得、
混合微生物群集全体の検出ピーク位置とピーク面積を数値化した今回の解析データおよび過去の解析データを基に多次元尺度法により解析データ間の類似度を演算し、
これらの類似度を多次元空間上のプロット間の距離により対比して、過去の解析時に調査され、類似度と関連づけられている混合微生物系の管理指標に関するデータから今回の混合微生物系の管理指標の状態を推測する
混合微生物系の監視方法。
(2) 混合微生物系が用排水の生物処理プロセスである上記(1)記載の混合微生物系の監視方法。
(3) 管理指標が処理効果、処理効率、処理条件または微生物の生育に及ぼす因子である上記(1)または(2)記載の混合微生物系の監視方法。
(4) コンピュータおよびデータベースを用いる上記(1)ないし(3)のいずれかに記載の監視方法であって、
前記データベースは、T−RFLP法により得られたエレクトロフェログラム(Electropherogram)から数値化された解析データが蓄積されており、
コンピュータに新たに解析データを入力すると、この解析データは前記データベースに蓄積されるとともに、今回の解析データおよび過去の解析データを基に多次元尺度法により解析データ間の類似度が演算され、これらの類似度が2次元または3次元空間内に布置された2次元または3次元プロット図として出力装置に出力される上記(1)ないし(3)のいずれかに記載の混合微生物系の監視方法。
(5) コンピュータおよびデータベースを用いる上記(1)ないし(4)のいずれかに記載の監視方法であって、
前記データベースは、T−RFLP法により得られたエレクトロフェログラム(Electropherogram)から数値化された解析データ、および過去の解析時に調査され、解析データの類似度と関連づけられている混合微生物系の管理指標に関するデータが蓄積されており、
コンピュータに新たに解析データを入力すると、この解析データは前記データベースに蓄積されるとともに、今回の解析データおよび過去の解析データを基に多次元尺度法により解析データ間の類似度が演算され、これらの類似度と前記データベースに蓄積されている管理指標に関するデータから今回の混合微生物系の管理指標の状態が推測され、その結果が出力装置に出力される上記(1)ないし(4)のいずれかに記載の混合微生物系の監視方法。
(6) 混合微生物系において、定期的または任意の時点で上記(1)ないし(5)のいずれかに記載の監視方法を実施し、今回の解析データに係る類似度が予め設定しておいた類似度の範囲を外れた場合、その原因究明を開始し、対策を講じる混合微生物系の管理方法。
(7) 混合微生物系において、定期的または任意の時点で上記(1)ないし(5)のいずれかに記載の監視方法を実施し、管理指標の値または状態が予め設定しておいた管理指標の値の範囲または状態から外れると推測された場合、その原因究明を開始し、対策を講じる混合微生物系の管理方法。
【0008】
本発明の方法を適用する対象となる混合微生物系は、生物処理プロセスにおける混合微生物系であり、微生物を含む試料が採取可能であれば限定されない。例えば、用排水の生物処理プロセスなどがあげられる。
【0009】
本発明では、まず上記のような生物処理プロセスにおける混合微生物系から混合微生物群集試料を採取する。例えば、混合微生物系から液、水、汚泥などを試料として採取すると、通常この試料中には複数種の微生物が存在していると考えられるので、このような試料を混合微生物群集試料として、T−RFLP法に供するすることができる。
【0010】
T−RFLP法それ自体は公知の方法であり、遺伝子の制限酵素断片多型(RFLP)解析の一方法である。本発明では、前記試料の遺伝子を公知のT−RFLP法により解析する。例えば、次のような方法で解析することができる。
【0011】
まず試料からDNAを抽出し、抽出したDNAをテンプレートにし、プライマーを用いてDNAを増幅させる。このDNAとしては16SrDNAが適しているが、他に5SrDNA、23SrDNA、gyrBなど、T−RFLP法に供することができるものであれば何でもよい。DNA増幅の際には、上流側および下流側に2種類のプライマーを使用するが、どちらか一方または両方のプライマーの5’末端または3’末端を蛍光色素などで標識したものを利用する。
【0012】
増幅されたPCR産物は、残存プライマーを取り除いた後、適当な制限酵素で切断し、DNA塩基配列を決定するプレートまたはキャピラリー電気泳動装置にかけ、標識した蛍光で検出する。この操作によって、5’末端または3’末端のDNA断片はサイズの小さいものから分離、検出される。
上記制限酵素としては公知のものが使用でき、例えばBstUI、HhaI、RsaI、HaeIII、MspI、CfoI、MrnI、TaqI、San96I、FokI、AlnI、DdeI、HinfI、MboIなどがあげられる。これらの制限酵素は1種単独で使用することもできるし、2種以上を組み合わせて使用することもできる。
【0013】
検出データは通常エレクトロフェログラム(電気泳動パターン)として得られる。このエレクトロフェログラムを、検出ピーク位置すなわちDNA断片の大きさと、そのピーク面積すなわち存在量で整理して数値化し、解析データ(以下、T−RFLP解析データという場合がある)を得る。エレクトロフェログラムは試料中の微生物相(微生物の種類および存在量)を反映した特有のパターンを示す。すなわち、試料中の微生物の種類または存在量が異なる場合、異なったエレクトロフェログラムが得られるので、T−RFLP解析データも微生物相が反映された特有のデータとして得られる。T−RFLP法では培養不可能な微生物も検出されるので混合微生物群集の微生物相を的確に把握することができる。なおT−RFLP法による解析では微生物の種類、名称などを特定する必要はないので、短時間で解析することができる。
【0014】
このようなT−RFLP解析データを複数の試料について求め、多次元尺度法による多変量解析を行う。例えば、定期的または任意の時点で同じ場所から試料を採取し、これらの試料についてT−RFLP解析を行い、これにより得られた複数のT−RFLP解析データを基に多次元尺度法による解析(統計処理)を行う。
【0015】
多次元尺度法それ自体は公知の多変量解析の一手法である。本発明ではT−RFLP解析データを公知の多次元尺度法により解析し、T−RFLP解析データ間の類似度を演算する。類似度は2次元または3次元空間内に布置された2次元または3次元プロット図として表示する。2次元プロット図の方が誰にでも判別しやすいが、場合によっては3次元以上でもかまわない。
類似度の演算および2次元もしくは3次元プロット図の作成は、市販のコンピュータ用ソフトフェア、例えばSPSS(SPSS社、商標)などを用いてパソコン上で行うのが簡単である。
【0016】
多次元尺度法では対象間の関係の強弱が空間上の距離として表示される。従って、2次元または3次元空間上にプロットされた複数の類似度間において、空間上での距離が近い点同士は、試料の混合微生物系の状態が類似しており、離れているほど混合微生物系の状態が異なっていると推測することができる。
【0017】
このような多次元尺度法の演算結果を利用して、今回採取した試料の微生物群集の状態を推測することができる。すなわち、今回採取した試料から求められた類似度と、過去の試料から求められた類似度とを対比し、今回採取した試料の微生物群集の状態は、1)プロット間の距離が近い過去の試料の混合微生物系の状態に似ている、2)プロット間の距離が離れている過去の試料の混合微生物系の状態とは異なっている(変化している)、3)プロット間の距離が近いものがない場合は、過去の混合微生物系の状態とは異なる、などと推測することができる。また2次元プロット図の位置ごとに微生物相を分類し、この位置にプロットされる場合はある特定の状態にあると、位置からの推測も可能である。前記推測される混合微生物系の状態としては、微生物相、微生物の活性または微生物の生育に及ぼす因子などがあげられる。
【0018】
例えば、好気性生物処理のような生物処理プロセスにおいて生物処理が良好に行われている場合は、混合微生物系の微生物の状態は類似している場合が多い。このため、処理が良好に行われている際に採取された試料に係る類似度のプロット同士は2次元または3次元プロット図上で近い点として表され、このような点が複数ある場合はプロットは一定の範囲に集まって表示され、グループ化される。一方、生物処理が良好に行われておらず、その原因が類似している場合も、このような試料係る類似度のプロット同士は2次元または3次元プロット図上で近い点として表され、このような点が複数ある場合はプロットは一定の範囲に集って表示され、グループ化される。処理が不良となる原因が幾つかあり、それに伴って混合微生物系の微生物の状態が異なる場合にも、その状態に応じてプロットがグループ化される。また良好な状態から不良の状態へ移行している段階、または不良の状態から良好な状態へ回復している過程では、移行の程度に応じた位置にプロットされる。またどのグループにも属さないプロットもある。
【0019】
このように、2次元または3次元プロット図上では幾つかのグループが認められる場合が多く、全てのプロットが全くランダムにプロットされる場合はほとんどない。従って、今回の試料から求められた類似度のプロットがどのグループに属するか、属さないかにより、今回の混合微生物の状態を推測することができる。
例えば、今回の類似度のプロットが、過去において処理が良好に行われていたプロットのグループに属すると認められる場合、処理は良好に行われている状態にあると推測することができる。また今回の類似度のプロットが、良好な状態から不良の状態へ移行している位置にあると認められる場合、何らかの対処を実施することにより、処理の悪化を早期の段階で対処することができる。一般に混合微生物系の状態の変化は、微生物相の変化が先に起こり、その結果遅れて処理状態の変化が生じるので、本発明の方法によれば、処理状態の変化が認められる前に微生物相の変化を検出して、早い警告や対策を打つことができる。プロットがどのグループに属するか、または属さないかという判断は2次元もしくは3次元プロット図を見るだけで行うことができ、専門知識は必要でない。
【0020】
本発明では混合微生物系の処理効果、処理効率、処理条件または微生物の生育に及ぼす因子などを、混合微生物系の管理指標として試料採取時に調査しておくことにより、今回の混合微生物系の管理指標の状態を推測することもできる。すなわち、今回採取した試料から求められた類似度と、過去の試料から求められた類似度とを対比し、今回採取した試料の管理指標の状態は、1)プロット間の距離が近い過去の試料の管理指標の状態に似ている、2)プロット間の距離が離れている過去の試料の管理指標の状態とは異なっている(変化している)、3)プロット間の距離が近いものがない場合は、過去の管理指標の状態とは異なる、などと推測することができる。なお管理指標は上記のものに限定されず、混合微生物系の微生物の変化と連動して変化する指標であれば制限はない。
【0021】
このような推測を行うためには、類似度と混合微生物系の管理指標に関するデータとが関連づけられた蓄積データを作成しておき、類似度から管理指標の状態が検索できるようにしておけばよい。このような蓄積データはコンピュータにデータベースとして蓄積しておくのが検索が容易であるので好ましい。管理指標の状態はできるだけ多くの場合について調査しておくのが好ましいが、ある程度データが蓄積されてきた場合は、調査を省略することができる。
【0022】
上記のような方法によれば、微生物を培養、単離、特定することなしに、混合微生物系の状態または管理指標の状態を推測することができる。
また試料からのDNAの抽出およびT−RFLP解析は約1日で完了する。そしてT−RFLP解析データをコンピュータに入力するだけで、多次元尺度法による類似度の演算は瞬時に実行される。このため、混合微生物系の状態または管理指標の状態を迅速に推測することができる。
またT−RFLP法はDGGE法などの他の方法に比べ、得られたデータを数値化して蓄積できるため、そのままコンピュータによる演算に利用できる。したがって、測定と演算に個人差が入り込む部分がなく、微生物知識のない者でも正しく処理することができる。
さらにT−RFLP法では培養不可能な微生物も検出されるので混合微生物群集の微生物相を的確に把握することができ、このため本発明では混合微生物系の状態および管理指標の状態を的確に推測することができる。
【0023】
本発明では、PCR後の増幅DNA試料を分割し、複数個の制限酵素で処理し、同様に多次元尺度解析を行うこともできる。こうして得られた並列データを対比するとにより、操作が面倒になるものの、精度が向上するので細かい監視、管理が可能になる。
【0024】
本発明では前記種々の生物処理プロセスにおける混合微生物系に本発明の方法を適用することにより、多目的な利用が可能である。
本発明の方法を生物処理プロセスに適用する場合、生物処理プロセスではプロセスに障害が起きる前に微生物群集の状態は変化しているので、この状態の変化を検出することにより、微生物群集が悪い状態に移っているか否かを早い時期に判断することができ、これによりプロセスでトラブルが起きる前に対策を講じることが可能となる。具体的には、活性汚泥法では通常汚泥滞留時間が20日間程度であり、この間隔で微生物群集の状態が徐々に変化するため、例えば2〜7日間隔で本発明を実施することにより、完全に悪くなる前に状態の変化を検出することができ、このため迅速な対処が可能である。
【0025】
本発明の方法を用排水の生物処理プロセスに適用した場合、処理効果、処理効率、処理条件または微生物の生育に及ぼす因子などを管理指標として設定するすることができる。例えば、生物処理プロセスが好気的生物処理系の場合、管理指標の具体的なものとしてはBOD除去率、SVI、呼吸速度、DO濃度、pH、温度などがあげられる。また生物処理プロセスが浸漬膜生物処理の場合、管理指標の具体的なものとしてはBOD除去率、SVI、呼吸速度、DO濃度、pH、温度、粘度、膜の差圧、膜通水量などがあげられる。
【0026】
また本発明の方法は土壌浄化プロセスに好適に適用することができ、この場合処理効果、処理効率、処理条件または微生物の生育に及ぼす因子などを管理指標として設定するすることができる。管理指標の具体的なものとしては塩素化エチレン分解率のような特定成分の分解率、有機酸濃度、水素濃度、ORPなどがあげられる。
【0031】
本発明の監視方法はパソコンなどのコンピュータおよびデータベースを用いて行うのが好ましい。データベースにはT−RFLP解析データを蓄積しておき、コンピュータに新たにT−RFLP解析データを入力すると、今回の解析データは前記データベースに蓄積されるとともに、今回の解析データおよび上記データベースに蓄積されている過去の解析データを基に多次元尺度法により解析データ間の類似度が演算され、これらの類似度が2次元または3次元空間内に布置された2次元または3次元プロット図として出力装置に出力するように構成するのが好ましい。T−RFLP解析データはキーボードなどの入力装置から入力することができる。出力装置に出力された2次元または3次元プロット図から、前記のように混合微生物系の状態を推測することができる。
【0032】
またデータベースにはT−RFLP解析データ、および過去の解析時に調査され、解析データの類似度と関連づけられている混合微生物系の管理指標に関するデータを蓄積しておき、新たにT−RFLP解析データをコンピュータに入力すると、今回の解析データは前記データベースに蓄積されるとともに、今回の解析データおよび上記データベースに蓄積されている過去の解析データを基に多次元尺度法により解析データ間の類似度が演算され、これらの類似度と前記データベースに蓄積されている管理指標に関するデータから今回の混合微生物系の管理指標の状態が推測され、その推測結果が出力装置に出力されるように構成するのが好ましい。これにより、生物の専門知識を有しない者、生物処理プロセスなどに関する専門知識を有しない者でも、現在の混合微生物系の管理指標の状態を短時間で的確に把握することができる。前記データベースは混合微生物系の管理指標に関するデータが追加、修正できるものが好ましい。
【0033】
多次元尺度法の演算に利用することができるソフトフェアである前記SPSSは、入力されたデータを蓄積する機能および2次元または3次元プロット図の出力機能を備えてるので、SPSSを使用することにより解析データの蓄積、類似度の演算および2次元もしくは3次元プロット図の表示を容易に行うことができる。またデータベースを構築するコンピューターソフトウェアとしてMicrosoft社製のMicrosoft ExelやMicrosoft Access(いずれも商標)などの市販のソフトウェアを使用し、これらのソフトフェアと多次元尺度法による類似度を演算するソフトフェアとを組み合わせて使用することもできる。ソフトフェアはこれらに限定されるものではなく、目的にそったものであればどのようなものでも使用することができる。
【0034】
本発明の管理方法は上記のような本発明の監視方法を定期的または任意の時点で実施し、今回の解析データに係る類似度が予め設定しておいた類似度の範囲を外れた場合、あるいは今回の解析データに係る類似度から推測される管理指標の値または状態が予め設定しておいた管理指標の値の範囲または状態から外れた場合、その原因究明を開始し、対策を講じる混合微生物系の管理方法である。
【0035】
本発明の管理方法によれば、混合微生物系の状態または管理指標の状態が悪化する前にその兆候を検出することができるので、早い段階での警告や対策を打つことができ、生物処理プロセスなどを安定して管理することが可能となる。
また2次元または3次元プロット図上で処理が悪化するグループに属していると判断される場合でも、過去の経験からグループ毎にその対処法が知られている場合は適切な処理を行うことができ、的確かつ効果的に生物処理プロセスを管理することができる。
【0036】
本発明の混合微生物系の監視方法または管理方法で得られる効果をまとめると次のような効果があげれる。
1)基本的に微生物の特定は不必要であり、微生物の種類を特定することなしに、混合微生物の監視または管理を行うことができる。
2)混合微生物系の解析と統計解析を組み合わせることによって、従来は管理不可能であった混合微生物系を容易に監視または管理できる。
3)混合微生物系の微生物相変化を短時間で容易に検出して、系の状態を監視、管理できる。このため、混合微生物系の状態が悪化してしまう前に状態変化を検出することができ、これによりトラブルなどを事前に予測して、迅速に対策を講じることができる。
4)経験的に行われていた微生物群集の管理を、統計的手法によって確実にできる。
5)T−RFLP法では培養不可能な菌種も検出できるので、確実性が高い。したがって、これを用いた監視、管理には確実性がある。
6)混合微生物系の状態を類似度という1個の単純な指標で把握できるため、微生物の専門的知識を持たない者にも利用し易く、熟練を要しない。
7)T−RFLP法では解析データをコンピューターに保存でき、いつでも過去のデータと比較できる。またT−RFLPと多次元尺度法の組み合わせでは、データをいつでも加えたり削除したりできる(DGGEと多次元尺度法では新しいデータを加える場合、もう一度実験データを取り直す必要がある。)。このように結果をコンピューター上に蓄積し、演算することができるので、いつでも過去のデータと比較するのが容易である。
8)従来の菌種同定法は培養、単離、専門的同定手段の利用によるので手間と時間がかかり非実用的であったが、本発明の方法は1日程度の期間で迅速に測定が完了し、多次元尺度法の演算もコンピューターにより演算することができるので、迅速に管理にまで利用することができる。このため、測定に時間がかかると系の状態がさらに変化することが多いが、そうした問題が発生しない。
9)管理指標を変えることにより多目的な利用が可能である。
【0037】
【発明の効果】
本発明の混合微生物系の監視方法は、生物処理プロセスにおける混合微生物系から混合微生物群集試料を採取し、この試料の遺伝子をT−RFLP法により解析し、混合微生物群集全体のエレクトロフェログラムを検出ピーク位置とピーク面積で整理し数値化して解析データを得、混合微生物群集全体の検出ピーク位置とピーク面積を数値化した今回の解析データおよび過去の解析データを基に多次元尺度法により解析データ間の類似度を演算し、これらの類似度を多次元空間上のプロット間の距離により対比して、過去の解析時に調査され、類似度と関連づけられている混合微生物系の管理指標に関するデータから今回の混合微生物系の管理指標の状態を推測するようにしているので、混合微生物系の解析を短時間で簡単に行うことができ、これにより混合微生物系のトラブルに迅速に対応することができる。
本発明の混合微生物系の管理方法は、上記監視方法を定期的または任意の時点で実施し、混合微生物系の状態を監視しているので、混合微生物系のトラブルに迅速に対応することができる。
【0038】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の実施の形態を図面により説明する。
図1は浸漬膜を利用した活性汚泥処理装置の系統図であり、この装置により排水を好気性生物処理している生物処理プロセスに本発明の方法を適用した場合の例である。
【0039】
図1において、1は曝気槽、2、5は散気装置、3は膜浸漬槽、4は浸漬型膜分離装置である。膜浸漬槽3には分離膜6を有する浸漬型膜分離装置4が槽内液に浸漬された状態で設けられ、分離膜6を透過させて槽内液を濃縮するように構成されている。
【0040】
図1の装置では次のようにして排水が好気性処理される。すなわち、原水路11から曝気槽1に排水を導入するとともに、散気装置2から空気を散気し、槽内の活性汚泥と混合して好気的に生物処理する。槽内液は系路12から膜浸漬槽3に送り、膜分離する。
膜浸漬槽3ではポンプPを駆動し、槽内液を浸漬型膜分離装置4の分離膜6を透過させ、処理水として排出する。膜浸漬槽3では槽内を好気的に維持するとともに分離膜6表面への微生物付着防止のために散気装置5から空気を散気する。透過液は処理水として処理水路13から排出し、濃縮液は返送汚泥路14から返送汚泥として曝気槽1に返送する。
【0041】
このようにして好気性生物処理している好気性処理系に本発明を適用して好気性処理系の混合微生物系を管理するには、膜分離槽3から定期的または任意の時点で槽内液を採取する。この試料中には複数の微生物が存在している。このような試料からDNAを抽出した後、5’末端を標識したプライマーを用いてPCR(polymerase chain reaction)を行い、DNAを増幅する。
【0042】
次にPCR増幅産物を電気泳動にかけ16SrDNAを得た後、このDNAを制限酵素により切断する。切断したDNA断片をT−RFLP法により解析してエレクトロフェログラムを得、次にDNA断片の大きさと、存在量で整理し、T−RFLP解析データを得る。このような処理を定期的または任意の時点で繰り返して行い、データベースにT−RFLP解析データを蓄積する。
【0043】
一方、上記のような解析を行う際、試料を採取したとき、膜浸漬槽の管理指標に関するデータも併せて採取し、前記データベースまたは他のデータベースに蓄積する。例えば、膜浸漬槽のpH、温度、水温、膜の差圧、目視による汚泥の性状、顕微鏡による汚泥観察結果、BODおよびCOD負荷量、BODおよびCOD槽負荷量、溶存酸素濃度、粘度、溶解性COD濃度、曝気量などのデータを採取して蓄積する。管理指標に関するデータの採取は常に行う必要はなく、ある程度データが蓄積された場合には省略することもできるし、時々採取することもできる。
【0044】
今回解析したT−RFLP解析データおよびデータベースに蓄積されている過去の解析データを前記SPSSなどの多次元尺度法の演算プログラムにより類似度を演算させ、結果を2次元または3次元プロット図としてディスプレイに表示させるか、紙に印刷する。
【0045】
そして、今回の類似度のプロットが2次元または3次元プロット図のどのグループに属するかまたは属さないかを判定する。今回の類似度のプロットが、処理が良好に行われるグループに属する場合、今回の状態も良好であると判断することができる。一方、処理が良好に行われていなかったグループに属した場合は、今回の状態は悪いか、今後悪くなると判断し、対策を講じる。例えば、pHを調整したり、曝気量を調節したりする。このようにして混合微生物系のトラブルに迅速に対応することができる。
【0046】
【実施例】
実施例1:浸漬膜を利用した活性汚泥装置の管理
図1の膜浸漬槽から活性汚泥サンプルを定期的に採取し、本発明の方法の適用を行った。
【0047】
1)DNA抽出
活性汚泥を2mL容のチューブに入れ、8000 x gにて4℃で10分間遠心分離した。さらにそのチュープにZirconia/Silica Beads(直径0.1mm)1mLおよびExtraction Buffer(100mM Tris−HC1[pH8.0]、100mM sodium EDTA[pH8.0]、100mM sodium phosphate[pH8.0]、1.5M NaCl)1mLを加え、細胞破砕機Bead Beaterで2分間処理した。次に凍結融解を3回繰り返した後、10μLのProteinaseK(10mg/mL)を加え、37℃にて30分間保温した。この液に、250μLの10%SDS溶液を加え、65℃で2時間保温、再び上記のBead Beater処理を行った。その後8000 x gにて室温で10分間遠心分離し、上清を採取した。上清はクロロホルムで夾雑タンパク質を除去した後、上部の水相を分離し、これに等量のイソプロパノールを添加後、室温で60分間静置、8000 x gにて室温で20分間遠心分離し、DNAを沈殿させた。沈殿は70%エタノールで洗浄後、乾燥させ、100μLの滅菌蒸留水に溶解した。
【0048】
2)T−RFLP法および多次元尺度法による解析
上記で抽出したDNAをテンプレートに、PCR反応条件によりPCR反応を行った。PCR反応は、Pre−heating;94℃、2分に続き、第1段階;94℃、20秒、第2段階;55℃、30秒、第3段階;72℃、2分を30サイクル繰り返し、Post extension;72℃、7分を行った。この際、プライマーはBact0009(5’−GAGTTTGATC C/ATGGTCAG−3’)の5’末端を4,7,2’,4’,5’,7’−hexachloro−6−carboxyfluorescein(HEX)で標識したもの、およびBact1492(5’−ACGG C/T TACCTTGTTAGGACTT−3’)の5’末端を6−carboxyfluorescein(6−FAM)で標識したものを使用した。PCR増幅産物はアガロース電気泳動にかけ、目的である16SrDNA(約1.5kb)断片を含む部分を切り出し精製した。
【0049】
その後、エタノール沈殿によりDNAを回収し、少量の滅菌蒸留水に溶解させ、適量を制限酵素(BstUI)で切断した。切断した16SrDNAはABIPRISM 310 Genetic Analyzer(アプライドバイオシステムズ社)によりGene Scanモードで解析し、T−RFLP(0〜550basesの範囲)のエレクトロフェログラムを得た。図2に、20日毎のT−RFLP法によるエレクトロフェログラムを示す。T−RFLPのエレクトロフェログラムは16SrDNAの5’末端および3’末端に関して得られたが、ここでは5’末端のHEXによる解析結果のみを利用した。また、内部標準にはGeneScan500 ROX(ROX:6−carboxy−X−rodamine、Perkin−Elmer製)を利用した。
【0050】
次に、SPSS10.0J for Windows(SPSS Japan社製、商標)を利用して、多次元尺度法による類似度解析を、T−RFLP解析のエレクトロフェログラムを基に行った。17basesのBact0011より大きい18〜517basesの範囲で、エレクトロフェログラムのピークデータは1base刻み(四捨五入)でピーク面積により整理した。各々のピーク面積は合計値(全体で100%に調整)に対する割合(%)とした。この際、ピーク面積が1%以下のものに関しては解析対象外とした。比較するデータ内においてピークが全く観察されなかったサイズのカラムは削除した後、そのデータをSPSS10.0Jのデータシートにコピーし、多次元尺度法による解析を行った。これにより類似度の2次元プロットを作成した。結果を図3に示す。
【0051】
3)T−RFLP解析結果
図1による活性汚泥処理において、40日目頃に膜の差圧の上昇(25kpa:キロパスカル)が見られた(ここでの曝気量を300L/minとする)。そこで、膜浸漬槽内の曝気量を450L/minに増加させたところ60日目では差圧は正常な値14kpaに戻った。そこで、再び空気供給量を300L/minに絞ったところ、80日目には差圧が20kpaに上昇して、その後また酸素供給量を450L/minに増加させた。酸素量を増加させた後、100日目では差圧は15kpaに低下した。
【0052】
図3からわかるように、活性汚泥処理において差圧が低く抑えられたときは、円の範囲に納まることが示されている。
その後は、1週間おきにT−RFLP法によるエレクトロフェログラムを求め、図3にプロットを追加した。得られたプロットが円周の外側になった場合は酸素の供給量(約50%)を増やし、円周の内側に入った場合は、通常の酸素量に戻した。常に酸素量を増やすとランニングコストが大きくなるため、このような操作で、必要な場合のみ酸素量を増やすことが可能となり、ランニングコストを最小限に抑えて、安定した処理性能(差圧の正常化も含め)を得ることが可能となった。
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図1】本発明の方法を適用した浸漬膜を利用した活性汚泥装置の系統図である。
【図2】実施例1で得られたTRFLP法によるエレクトロフェログラムである。全てのグラフにおいて、縦軸は蛍光強度、横軸はTRF(Terminal Restriction Fragment)の長さ(bases)である。
【図3】図2のエレクトロフェログラムから得られたTRFLP解析データを基に多次元尺度法により類似度を演算した結果をプロットした2次元プロット図である。
【符号の説明】
1 曝気槽
2、5 散気装置
3 膜浸漬槽
4 浸漬型膜分離装置
6 分離膜
11 原水路
12 系路
13 処理水路
14 返送汚泥路
Claims (7)
- 生物処理プロセスにおける混合微生物系から混合微生物群集試料を採取し、
この試料の遺伝子をT−RFLP法により解析し、
混合微生物群集全体のエレクトロフェログラムを検出ピーク位置とピーク面積で整理し数値化して解析データを得、
混合微生物群集全体の検出ピーク位置とピーク面積を数値化した今回の解析データおよび過去の解析データを基に多次元尺度法により解析データ間の類似度を演算し、
これらの類似度を多次元空間上のプロット間の距離により対比して、過去の解析時に調査され、類似度と関連づけられている混合微生物系の管理指標に関するデータから今回の混合微生物系の管理指標の状態を推測する
混合微生物系の監視方法。 - 混合微生物系が用排水の生物処理プロセスである請求項1記載の混合微生物系の監視方法。
- 管理指標が処理効果、処理効率、処理条件または微生物の生育に及ぼす因子である請求項1または2記載の混合微生物系の監視方法。
- コンピュータおよびデータベースを用いる請求項1ないし3のいずれかに記載の監視方法であって、
前記データベースは、T−RFLP法により得られたエレクトロフェログラム(Electropherogram)から数値化された解析データが蓄積されており、
コンピュータに新たに解析データを入力すると、この解析データは前記データベースに蓄積されるとともに、今回の解析データおよび過去の解析データを基に多次元尺度法により解析データ間の類似度が演算され、これらの類似度が2次元または3次元空間内に布置された2次元または3次元プロット図として出力装置に出力される請求項1ないし3のいずれかに記載の混合微生物系の監視方法。 - コンピュータおよびデータベースを用いる請求項1ないし4のいずれかに記載の監視方法であって、
前記データベースは、T−RFLP法により得られたエレクトロフェログラム(Electropherogram)から数値化された解析データ、および過去の解析時に調査され、解析データの類似度と関連づけられている混合微生物系の管理指標に関するデータが蓄積されており、
コンピュータに新たに解析データを入力すると、この解析データは前記データベースに蓄積されるとともに、今回の解析データおよび過去の解析データを基に多次元尺度法により解析データ間の類似度が演算され、これらの類似度と前記データベースに蓄積されている管理指標に関するデータから今回の混合微生物系の管理指標の状態が推測され、その結果が出力装置に出力される請求項1ないし4のいずれかに記載の混合微生物系の監視方法。 - 混合微生物系において、定期的または任意の時点で請求項1ないし5のいずれかに記載の監視方法を実施し、今回の解析データに係る類似度が予め設定しておいた類似度の範囲を外れた場合、その原因究明を開始し、対策を講じる混合微生物系の管理方法。
- 混合微生物系において、定期的または任意の時点で請求項1ないし5のいずれかに記載の監視方法を実施し、管理指標の値または状態が予め設定しておいた管理指標の値の範囲または状態から外れると推測された場合、その原因究明を開始し、対策を講じる混合微生物系の管理方法。
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