JP3923080B2

JP3923080B2 - Optical fine probe and spectral analysis method of material

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Description

発明の分野
本発明は試験片との電磁的放射の相互的作用の結果を分析することによって試験片からの空間的微分解析情報を得る方法および装置に関し、特にこのような装置に生ずるデータを使用して該試験片からの生物体内の診断的情報を得る新規かつ有用な装置および方法に関する。このことは探索用電磁的ビームを空間的に制限することによって小さい容積素子内に最大動力密度を達成し、検知される受領応答を実質的に同一容積素子に制限することによって達成される。
発明の背景
例えば癌、病気その他損傷した組織の迅速な診断を自動的に与えることができる装置について強い要望がある。特に、癌の成長又はその他の損傷した組織の大きさと段階とを正確に診断可能な機器について要望がある。現在、医学の分野においては目視的解析および生検法によって生物学的組織を解析して特定の病理および異常を一般的に決定している。各種の生化学的映像が使用され、各種の病理の光学的反応が生化学的組織を特定するために使用される。しかし、これら従来技術は重大な欠点を有する。
例えば、組織の生検を行って取り出した組織を研究室で解析するためには多くの時間が必要である。さらに、生検は組織から取り出された代表的な標本について特性を決定するに過ぎない。従って、完全な標本を得るためには多数の切除を日常的に行う必要がある。さらに、生検は標本採取および診断に誤りを伴うものである。磁気的同調映像は良い結果を与えるが、高価であり、重要な欠点として発生の初期段階で小さい病理症状を検出できない。
医学の分野で組織分析に使用される技術として蛍光技術がある。レーザ誘導蛍光は特定の波長に同調したレーザを使用して組織を励起して２次的波長の蛍光を発生せしめ、これが組織の特性を診断するために使用される。蛍光は通常組織内に存在する分子、または識別分子として組織内に導入された分子のいづれかから発生する。
生物学的組織のＵＶ励起による蛍光反応の機構は完全には解明されていないけれども、腫瘍形成の蛍光特性は生化学的変化および形態学的変化の両者を反映するようである。例えば自動的蛍光スペクトル監視器は生物の生化学的変化、例えばニコチンアミド・アデニン・ダイ・ヌクレオチド（ＮＡＤＨ）およびフラビンの相対的濃度の変化を反映する。粘液性濃度増加および毛細管作用の変化はスペクトル記録に変化を与える代表的なものである。
３３７ｎｍの近紫外線励起に応答する蛍光放射に寄与する生物学的組織の主要分子は、トリプトファン（３９０ｎｍ放射）、エラスチン（４１０ｎｍ）およびコラーゲン（３００ｎｍ）の発色要素、ＮＡＤＨ（４７０ｎｍ）、フラビン（５２０ｎｍ）およびメラニン（５４０ｎｍ）がある。しかし、組織内においては純粋化合物に対してピーク位置の移動および全体波形の変化が存在する。従って、試料に対するＵＶビームの放射は充分に短い波長で行い、上述列挙した波長で記録される応答から組織に対する寄与の存在を決定する。
ヘモグロビンは吸収のピークが４００ないし５４０ｎｍであり、オキシヘモグロビンもヘモグロビンも６００ｎｍ以上で強い光吸収性を有する。血液の流れもエラスチン、コラーゲン、ＮＡＤ、ＮＡＤＨの観測される放射スペクトルに影響を与える。組織内に存在し、放射光を吸収し検知される放射スペクトルの形状を変化させる別の化合物として、ミオグロビン、ポルフィリン、ダイニュークレオタイド・コエンチームがある。
別の一般的背景として、ネオプラシアはその変形経路が主として嫌気性であるから高レベルのＮＡＤＨを有する。細胞がその（ＮＡＤ＋／ＮＡＤＨ）比を集合時に高めることができないことが、その生長制御の欠点に関連する変形細胞の特性である。（ＮＡＤＨ−／ＮＡＤＨ）の比の値は細胞の代謝能力の指示値で、例えば解糖作用と糖新生作用との比の指示値となる。表面蛍光はＮＡＤＨの生物体外および生物体内の双方における相対的な値を測定するために使用されてきた。個々の筋細胞から得られた放出スペクトラムはミトコンドリアの酸化フラビン蛋白質から発生するものと考えられ、青色蛍光はミトコンドリアによるＮＡＤＨと一致する。
コラーゲン、ＮＡＤＨおよびフラビン・アデニン・ディヌクレオチッドは大腸組織の主蛍光測定法であると考えられ、蛍光スペクトラムをスペクトル分析するために使用されている。適正値と測定値との間の誤差は酸化および還元ヘモグロビンの混合物の吸収スペクトルと類似しており、残差は血液の存在による。
米国特許４，９３０，５１６号明細書には、蛍光を利用して癌と正常組織との区別を行うことを示しており、癌と正常組織とからの目視可能な発光スペクトルの形状が実質的に相違し、詳細には癌組織は強度ピークの位置が異なり、ブルー側にずれている。例えば、該明細書には既知の健全な組織と問題の組織との区別は健全な組織と問題の組織とのスペクトルを比較することによって達成されることを示している。該明細書によれば、組織のスペクトルは、組織を実質的に単色の放射で励起することによって発生せしめられ、少なくとも２つの波長について発生した蛍光を比較する。
米国特許５，０４２，４９４号明細書には、励起波長を変更して目視可能な蛍光スペクトルの形状の差を観察することによって正常組織と癌組織とを区別することを示している。米国特許５，１３１，３９８号明細書には、癌を正常な又は温和な組織から区別するために（ａ）目視可能なバンド以下の単一または実質的に単一色の約３１５ｎｍ詳細には約２１５〜３１５ｎｍ、特定的には３００ｎｍの蛍光を使用し、（ｂ）得られた蛍光を約３４０および４４０ｎｍの２つの波長で比較することを示している。重い腫瘍組織における明確な色の差は診断的に有用であるが、この方法は正常、悪性、良性、腫瘍、異形、異常増殖、炎症、感染症組織を区別できない。診断におけるこれら難解な区別ができないことは、適切な処置の選択をほとんど不可能とする。該特許明細書における簡単な比例、相違および比較解析は癌研究の有用な手段としての発展を約束し組織状態の指示装置を刺激するものであるが、正確で頑丈な診療器具が要望されている。
上述から明らかのように生物学的組織から得られるスペクトルは著しく複雑であり、標準的なピーク比較プログラム、スペクトル回旋解析または比較スペクトル分析などによって解明することは困難である。さらに、スペクトル偏位はスペクトル分析を複雑にするだけである。最後に、レーザ蛍光その他の組織からの光学的反応は通常深度解析ができないが、これはこれら光学的または電子的機器は対象組織からの信号を全体の組織容積を通して総合することによる。
米国特許４，０１７，１９２号明細書には癌を含む異常を多細胞生医学標本において決定する技術を示しており、これは生体組織の複雑なスペクトル応答に関連する問題点を克服する。該明細書には生体組織からの光学的（伝達又は反射）応答データの決定を多数標本について及び多数波長について行い、これらの光学的応答の相関関係から数個の検査波長を定め相関方程式を形成する一連の定数を選択する。相関方程式を選択された波長における光学的応答に関連して通常の組織について求め、この組織の状態を予測する。しかし、良好な堅実な相関関係を得るために、該明細書においては、組織を励起して下方組織の光学的特性を含まない均一な試料を求める。従って、該明細書の方法は本発明に対比して生物体内に適用することができない。
フォトメディスン社（Photomedicine）のウェルマン（Wellman）研究所での単一ファイバ深さプローベを使用する研究において、ショマッカー（Schomacker）は生体内の人体結腸ポリープの特徴の自動蛍光は４つの異なる状態、すなわち、正常、良性腫瘍、前癌状態および悪性新生物の指示を与えることを発見した。参照文献：ショマッカー等著，レーザ手術および薬（１２，６３−７８）；１９９２年；ガストロエントクロロジー（Gastroentcrology:102, 1155-1160（1992）がある。さらにショマッカーはデータの多数変形線形回帰分析を腫瘍が新生物か否かを区別するために使用することを示している。しかし、この技術を使用する粘膜異常の観察は実質的に粘膜下からの信号によって損なわれるが、これは正常の大腸組織において観察される蛍光の８７％は粘膜下コラーゲンによることによっている。発生源の深さを識別する装置があれば性能が向上する。
従って、試験片、特に生体試験片を試験して該試験片内の限定された容積素子からの識別された信号を得ることができる有効かつ正確な装置を得ることについて要望があり、さらに、これらデータを自動的に処理して容積素子に関する簡単な診断情報を自動的に与える方法についても要望がある。
本発明の主目的は電磁放射と限定された制御可能の局部的な容積素子との間に相互作用を誘発せしめ該小さい容積素子に観察される応答を空間的に限定して標本を分析する方法および装置を提供するにある。
本発明の目的は分析される試験片の隣接平面または表面の下方に存在する材料の容積素子、または該平面の上方に存在して干渉信号を発する材料が存在する場合などのように、弱い又は空間的に覆われた信号を発する材料の容積素子を分析する手段を得るにある。
本発明の付加的な目的は、生物学的組織の特性および又は病理学的状態を励起ビームに対する組織内の非関連性の容積素子の応答を測定し、該応答を既知の病理学の応答に関連せしめて自動的に決定し、又は病理学的応答と外部的医学データとを総合する手段を提供するにある。
本発明のさらに別の目的は直接に目視可能な、又は直接観察によりまたは腹腔鏡または内視鏡などの剛性または可撓性光学経路によって光学的に近接可能な組織の生体診断情報を得るにある。
さらに本発明の目的は癌性、病性その他損傷した組織の範囲を高い精度で低価格で分析し又は検知するにある。
さらに本発明の目的は組織を監視し、器官または組織移植片が生存可能であるか否かを決定するにある。
さらに本発明の目的は生体内の酸素潅注、血色素、その他の代謝産物、および組織または血液化学物質を測定するにある。
本発明のさらに別の目的は薬品、特に光力学的療法に使用される薬品の一時的または空間的分布を監視するにある。
本発明のさらに別の目的は、その大きさが医師にとって臨床的に重要な組織の容積素子を解析するにある。
上述およびその他の目的は以下のせつめいにより明らかとなされる。
発明の概要
広い意味において本発明は標本、例えば組織の輪郭を定めた区域からの放射に対する応答を誘出し検知する装置を提供し、該組織は直観的に言えば強力かつ純粋、すなわち希釈されない応答を与える。粒子ビームは材料（例えば化学的元素および金属化微細構造）の量的微細分析に著しく有効であることが判っているけれども、低いエネルギ放射に対して応答を引き出すことと、より透明な媒体例えば生命装置内の有機材料または流体中の化学反応などのように複雑な装置の場合とは著しく相違する。例えば音響的（例えば圧縮波）放射と光子的放射との双方は多数の騒音導入欠陥、例えば散乱、モード変換、吸収および再放射、多数の関連するまたは類似の効果、例えばこのような放射に対して集められた応答が空間的に近接する区域から又は物理的に関連する位置にあるが実質的に無関係な混信材料からの無関係な雑音によって希釈され、不純化され、濾過され、その他実質的に変化せしめられる。本発明はこの欠点を例えば組織の層、局部的な成長、又は反応容積などの容積素子を刺激し応答を集めるプローベによって解決するものであり、これは活性手順に従って詳述される。これは照明ビームなどの刺激ビームがその大部分が第１の区域外にある限定された照射分布を有し、刺激に対する応答を収集する装置の収集効率が第２の区域について同様な空間的区別を有し、第１および第２の区域が交差して試験される容積素子を限定する用にすることによって達成される。従って、容積素子は刺激および検出感度において重なる空間的分布によって限定される。
本発明の理解のための例示として、サンプルの照射およびサンプルからの光の収集を説明するが、「光」、「照射」または「放射」という用語を使用する。しかし、これら用語は明細書および請求の範囲において電磁的放射の各種の形式を含むものであり、ビーム、焦点光、その他の各種形式、各種空間分布のものを含み、視野ストッパ、絞りおよび焦点調節素子を使用するものであってよく、また音響的放射も含む。
本発明をより完全に述べるために、特定用語について述べる。本発明は範囲ストッパの使用を企図しており、これは照明および集光経路対物レンズの解像度に対比して大であるが、応答が集められる局部的容積素子を限定するように使用される。本出願人は本発明の最も有用な量的限定は囲まれた動力の大きさと対比的なスポットの寸法とである。回折が存在しないとき、映像は幾何光学的に正確に予測されるが、収差の影響はある。比較的なスポット寸法とは幾何光学的に予測される映像の大きさと回折が適切に考慮された場合の映像の大きさとの比較、または映像が回折効果と残留収差との存在下で正確に測定されたものとの比較である。囲まれた動力とは全光学的フラックスの映像表面内での分数であり、これは記述された限界、例えば幾何学的映像内に限定される。さらに、解答は光学装置の主軸に関する映像の位置によって変化し、従って正確に限定すれば、定義は解答が特定される位置を含む。これはフィールドストッパの平面内にあると定められる。本明細書および請求の範囲において用語「大きいフィールドストッパ」、「回折限定スポットより大きいフィールドストッパ」、「対物レンズの古典的解像度より大きいフィールドストッパ」はフィールドストッパの大きさが点目的物が配置されその映像がフィールドストッパの位置にあるとき、関連する充分に修正された対物レンズによって形成された点目的物の映像に対比して大であることを意味する。
「容積微小プローベ」、「容積微小プローベ形状」および「弱い共焦形状」は
１）試料を特定するために放射を使用する配置にして、
ａ）照射および集光経路に１対のフィールドストッパを使用し、該フィールドストッパは関連する対物レンズのフィールドストッパの古典的解決より大であり、
ｂ）フィールドストッパは少なくとも部分的に試料の通常の容積素子を介して結合され、
ｃ）観察された放射を使用して共通の容積素子を特定する。
２）照射および集光フィールドストッパの形状は物理的に同一である。
容積プローベとは、
１）容積が微小なプローベ、又は
２）試料を特定する放射を行う任意の形状にして、
ａ）情報が抽出される容積素子にして、照射および観察経路の部分容積に限定され、
ｂ）これにより、該容積素子の外方の放射始発部とは区別され、
ｃ）容積素子は試料の全容積より小であり、
ｄ）容積素子の予めの決定および少なくとも部分的な寸法および位置の決定が可能で、試料内の位置の効果的な識別が可能である。
同様に用語「光学的」および「放射」も電磁的、音響的、光学的および放射的を含み、「容積素子」は光学的形状によって限定される局部的容積をいう。
一般的に、本発明の器具は、限定された容積素子からの光学的応答を集めることによって作動し、この応答の収集が「記録」を形成するが、これは永久的または短命である。「記録」は光検知器または検知器処理回路からの電気的信号でよく、表示スクリーン上の目視可能な表示であってよく、数学量で示す測定値、またはメモリまたはハード記録装置の測定値でもよい。
以下の説明では理想的媒体、すなわち散乱または該媒体の屈折率が光の伝播に実質的に影響を与えないものとしている。
代表的な装置として、２つの光学的組立体のそれぞれのフィールドストッパが共役して容積素子を介して求められる光学的応答を与えるようになされる。第１の光学的組立体は光源またはその他の放射源からのビームを容積素子に選択的に伝達するフィールドストッパをイメージする。第２の光学的組立体は目標容積素子から始発する光または放射を集め、光または放射を検知器に伝達して第１の伝達されたビームと容積素子との相互作用を解析する。第１の光学的組立体は選択された容積素子の選択的照射を行うフィールドストッパを含み、第２の光学的組立体は目標容積素子から発散する放射または光の収集光学体への収集を制限する第２のフィールドストッパを含む。さらに、制御器が設けられ、これは本発明のいくつかの実施例によれば選択された容積素子の試験片の表面に相対的な深さを２つの光学的組立体のそれぞれのイメージ区域を制御しそれぞれの結合状態を保持しその標本化された容積素子を両組立体の共通結合点として調節する。これらフィールドストッパの一般的寸法は生理学的に興味のある容積素子を標本化し又は処理するために常に大であり、従って対象物の古典的解決よりも大となされている。標本化された容積素子内の２つの組立体のそれぞれの対象物によって形成されるフィールドストッパの像は、それぞれのフィールドストッパの限定された（幾何学的）非回折イメージを通る光束の実質的にすべて（例えば９５％以上）を囲んでおり、光学系および試験片の損失について適切な修正を行う。フィールドストッパの寸法は少なくとも数個の細胞というような生理学的に有意の大きさの組織を含む標本容積素子を限定するように選択される。
本発明の一実施例において照射および集光光学系は同一素子であり、フィルタ装置またはビーム分割装置が使用されて、照射および集光ビームを分離する。
照射および集光フィールドストッパの共役は通常は共焦点配置によって達成され、光学的装置（照射および集光装置）によってフィールドストッパの映像が形成され、光学的装置は対象物と重なって配置される。フィールドストッパが小さいピンホール（回折効果によって深度判定が制御される）である場合の共焦点配置は従来技術に示される。例えば米国特許第３，０１３，４６７号明細書には２重焦点、すなわち共焦点装置が示され、２つの光学的に共役のピンホールのフィールドストッパを有しており、形成されるイメージのコントラストは限定された焦点区域の外方から始発する実質的に総ての光を排除することによって改良される、すなわち横方向視野を制御しイメージ部分を囲む区域の有効深度を最小にすることによって改良される。これら単一の点から得られたデータは実用性が小であり、共焦点顕微鏡の場合、通常試料を横方向に走査することによって得る複数の点の相対的応答によって所望の高いコントラストの２次元映像が得られる。
本発明によればフィールドストッパは対象物を照射し収集する限定された回折スポットより大きい寸法を有する容積素子を限定し、単一容積素子から得られたデータが新しいスペクトル信号を含み、これが診断情報として使用される。共焦点顕微鏡は目標表面の映像を標本上の多数の密接に間隔をおかれた点から得られた光学的応答の回旋によって与えるが、本発明は非映像化マイクロプローベとして示され、標本試験片の映像を得る必要がなく、重要な分析データは標本としての別々の容積素子から得られる。すなわち、有限の容積素子から得られた絶対的光学的応答エネルギ（信号）の量を最適のものとするが、従来の共焦点顕微鏡においては多数の超顕微鏡的対象物からの応答における強化されたコントラストが所望の目的となされる。目標が全く相違しているので、共焦点顕微鏡は少なくとも１つのフィールドストッパを使用し、これは従来の対象物の解像度より小であり、複数の隣接する点からの読みが得られる。本発明のフィールドストッパは対象物の回折限定スポットの寸法より著しく大であり、単一の容積素子から有用な応答が得られる。多数のフィールドストッパの使用は著しく大きい容積限定応答を生じ、集められた光の信号／ノイズ比を根本的に変化せしめ、事象の検知と迅速な測定とをその光学的特性によって可能とするが、これは共焦顕微鏡においては観察さえされなかったことである。比較すれば、共焦顕微鏡における固有の深さ識別、すなわち視野の深度、すなわち回折によって限定される焦点容積素子の深度は照射光の波長および該光と試料との相互作用の特性によって定まり、これに反して本発明の固有の深さ識別は光学的装置の幾何学的変数のみに依存するものである。
選択された容積素子からの光学的応答は容積素子についての重要な情報、例えば化学的、形態学的および一般的に生理学的情報を有している。試料がスペクトル的に簡単であれば、その光学的反応はピーク値を調和させ、１つ以上の選択された波長について回旋除去または強度決定を行う従来のスペクトル技術によって解析される。このような装置の一例として、複数の化合物の混合物の均一度の決定がある。しかし、試料が上述したような複雑な生物学的標本である場合、従来の装置で観察されるスペクトルの複雑さは意味のある診断を与えない。このような生物学的標本が微妙な特性を知るために分析される場合に、関連出願によれば驚くべきことに、別々の容積素子から得られた光学的応答を空間的にフィルタして変換し、又は非イメージ顕微鏡的に得られたデータに関連して上述変換を行うことによって診断的に有意の結果が得られる。
この点に関する本発明の方法によれば、最初に、特定目標病理学の訓練セットまたは標本が選定され、該標本は望ましくは少なくとも１０個の試験片を含む。最初に試験片中の明確な容積素子からの光学的応答が集められ、記録される。標本と同一の容積の素子が本発明の非イメージ容積微細プローベとして使用され、生検される。すなわち、使用した容積素子の組織病理学的分析が病理学研究室で実施され、試験片は任意の目盛り（例えば１から１０）で目盛られ、これは病理Ｃ（たとえば特定の癌）の程度を示す。目盛Ｃ_j（ここにＣ_jは訓練セットの標本ｊについての目盛値を示す）はできるだけ正確である必要があり、従って病理学者の求めた多数の値（同一の容積素子について）の平均値を使用する。そこで数式Σａ（_je）・Ｆ（Ｉ_ij）＝Ｃ_jが得られ、ここに、ｉはスペクトルの窓（通常５〜５０ｎｍ）、Ｆ（Ｉ_ij）は容積素子ｊについての窓ｉにおける測定されたスペクトル応答についての応答強さその他の特性の関数である。関数Ｆは該窓における応答強度であってよく、この場合Ｆ（Ｉ_ij）＝Ｉ_ij、またはＦ（Ｉ_ij）＝（ｄＩ_ij）／（ｄλ）／（Ｉ_ij）、この場合（λ）は窓（ｉ）における媒体の波長その他の関数である。係数ａ_ieは病理目盛Ｃに対する関連変換係数であり、上述の式から周知の数学技法、例えば多変数線形回帰解析法により求めることができる。この解析において、値Ｃ_jの病理学的偏椅と光学的応答との間の忠実な関連に必要な窓ｉの数は最小となり、病理目盛Ｃに対する関連係数ａ_ieの組が求められる。光学窓ｉの空間ベクトルを形成している応答（Ｉ_ik）が前述訓練セット以外の試料からの個々の素子の限定された数に限定され、ベクトルＦ（Ｉ_ik）に変換操作（ａ_ic）を行って和Σａ（_ic）・Ｆ（Ｉ_ij）＝Ｃ_kが得られ、試料とした容積素子の目標病理目盛Ｃの量が決定される。
本発明の実施例としての器具は濁った材料、例えば生物学的組織、水、プラスチック、被覆、および化学的反応過程に有用であり、生物学的組織の生体内および生体外検査に特に有利である。内部的分析を得るためには、本発明は現存形式の剛性および可撓性内視鏡と共に作動可能である。本発明は第１および第２の光学素子を光ファイバによって内視鏡、腹腔鏡または関節鏡に連結するようにしてもよい。
【図面の簡単な説明】
本発明の性質および目的を理解するために、以下の詳細な説明と添付図面とを参照する。図面において、
図１は本発明による容積検査装置のブロック図。
図２は本発明による容積検査装置の概略図。
図３Ａ、図３Ｂ、図３Ｃは装置の光経路と、観察可能な容積素子を限定するための整合を示す図。
図４は本発明による容積検査装置の別の実施例の概略図。
図４Ａは図４の概略図を実施する実際の装置の概略図。
図４Ｂ、図４Ｃは図４Ａの装置の光経路を示す図。
図５は本発明による容積検査装置の多波長実施例の概略図。
図６Ａ、図６Ｂは膣鏡に好適な実施例を示す図。
図７は試料の３軸走査を行うに適した実施例を示す図。
図８は筋肉組織の上皮に限定される新生物を検出する実施例を示す図。
図９Ａ、図９Ｂは静止の照射光がＺ軸走査を行う装置を示す図。
図１０Ａ、図１０Ｂ、図１０Ｃ、図１０Ｄ、図１０Ｅは照射および集光装置の別の実施例を示す図。
図１１は子宮検査装置としての実施例を示す図。
発明の詳細な説明
図１は本発明の容積検査装置１０を示し、試料１８内の容積素子を照射し照射された試料１８内の容積素子から放射される放射が検出される。容積素子からの放射は衝突する放射に対して多くの点で変更せしめられ、容積素子からの「光学的応答」または単に「応答」という。これら変換は試料とされた容積素子の特異な特性を保持しており、化学的、形態学的、物理的、生理学的特性を保有する。光学的応答は反射、伝達、選択的吸収、各種形式の散乱、各種形式の発光、特に蛍光を含む電磁放射として示される。
装置１０は、放射を発生する放射部１２と、第１の光制限部１４と、指向（対物）光学系１６と（これらは集合的に照射光学系という）を含み、光制限部を通過して形成されたビームが試料１８を照射する。さらに装置１０は、収集光学系２０と、第２の光制限部２２と、検出部２４とを含み、収集光学系２０は照射された試料１８からの放射を収集し検出し、これが第２の光制限部２２を通る。さらに、装置１０は制御部２６を含み、これは照射および収集光学系またはその一部に連結されて、照射が指向される位置を調節し、選択された容積素子からの応答を収集する、例えばプローベをそれぞれの深さ区域に、又は試験される容積素子に指向させる。これは照射および収集制限部１４、２２にフィールドストッパを設けることによって達成されるが、詳細は後述する。
作動時に照射部１２と制限部１４と指向光学系１６とが試料１８内の容積素子を照射する。照射部１２は放射を発生し、制限部１４に指向させる。制限部１４は放射の一部を選択的に指向（対物）光学系１６に伝達し、これは試料１８に含まれる容積素子上の光制限フィールドストッパに焦点を合わせる。
収集光学系２０と光制限部２２と検出部２４とは照射された容積素子の少なくとも一部から収集光学系に向かう放射を共同して検知する。収集光学系２０は試料１８に含まれ照射される容積素子の像を光制限部２２のフィールドストッパに形成する。光制限部２２は収集光学系２０からの放射を選択的に検出部２４に伝達する。検出部２４は電磁放射の特性、例えば１つ以上のスペクトル線の強さ、またはスペクトラムの区域などを明確とする。
照射と応答収集との共働する制限とによって、対象容積素子以外からのすべての応答が空間的に制限され、検知される容積素子からの信号と背景との比が著しく増大する。
制御部２６は指向光学系１６と収集光学系２０との位置を空間的に調節して、試料１８に含まれる複数の容積素子を照射し検出し、または光制限フィールドストッパの位置を調節して同様な効果を得る。本発明の別の態様によれば、制御部２６は照射ビームと検出ビームとを試料１８の２次面積区域に照射する。これは装置１０のビーム軸線を試料１８に相対的に変更して、試料１８内の容積素子を放射ビームの軸線に直角の方向から変位した各種の位置に指向することによって達成される。このとき、制御部２６は装置１０の試料１８に相対的な位置を互いに直交する位置とは異なる位置とする。
図２は本発明による装置１０の素子の物理的配置を試料と共に示している。図示された装置１０は光源すなわち照射部１２と、照射連結体３２と、照射部連結光学系３４と、第１のフィールドストッパ３６を含む第１の光制限部１４と、レンズ３８、４２から成り照射対物体１６として示される映像手段とを含み、レンズ３８、４２は照射対物体１６の正面組立体を形成し、試料１８に含まれる容積素子４６を第１の光制限部からの入力放射ビーム４４により照射する開口ストッパ４０が設けられる。図２には、さらに、レンズ５２（対物組立体）、５６から成るコレクタ２０と、開口ストッパ５４と、第２の視野ストッパ５８を含む第２の光制限部２２と、検知器連結部６８と、容積素子４６から発する帰還放射４８を捕捉し分析する検知器２４とを含む。
照射連結光学系３４に関連する照射連結部３２が電磁放射の経路を与え、電磁放射は放射部１２から制限部１４を通る。検出器連結部６８と検出器連結光学系６０とが電磁放射を第２の光制限部２２から検出部２４に導く。連結部３２および連結部６８は代表的には直径５０マイクロｍないし２００マイクロｍの光ファイバ、または光ガイドとする。通常、光ファイバまたは光ガイドは多数モードとなされ、すなわち連結部３２、６８は広い波長範囲の電磁信号を伝達可能となされる。照射連結光学系３４と検出部連結光学系６０とは代表的にはレンズまたは同等素子を含み、連結部３２、６８間およびその他の部分間を通る電磁波を整合せしめまたは合致せしめる。連結光学系３４、６０のレンズは正確に整合しており電磁放射が連結部３２、６８を通って出る、または入るときの動力損失を最小とする。
図示する第１の光制限部１４はフィールドストッパ３６を含み、これは光学系において視野を制限するために使用される各種の制限体であってよい。本明細書においてフィールドストッパとは任意の形状、例えば円形、楕円形、矩形、溝形または正方形開口であってよく、視野を制限する。さらに、一定の形状、寸法を持ってもよく、調節可能な寸法形状、例えば調節可能な虹彩などであってよく、限定された有効断面積を有する光フアイバなどのように開口部を有し通常はフィールドストッパの機能を行う素子であってよい。作動時にはフィールドストッパ３６は遮光することにより光学系１６に入る光を選択的に制限する。一実施例において、照明組立体の第１の部分の基準（平行）光線が光学系１６に指向され、これが照射目的物として作用し、光制限部１４の位置の調節を必要とせずに軸線方向に移動せしめられる。この調節は制御部２６の制御によって行われるが、ビーム４４の焦点位置を軸線方向に変更して選択された個々の容積素子を照射するようにする。
対物光学系１６は第１の開口ストッパ４０を含み、対物レンズの開口を制限すると共に、レンズ組立体３８、４２の縁部によって限定される開口が試料１８内の限定された試験容積体４６内に光ビームを指向する。設けられる場合、開口ストッパ４０はレンズ４２によって試料１８に投射される電磁放射ビームの断面積を制限し又は限定するに役立つ。レンズ４２は放射４４のビームが試料１８の焦点区域においてフィールドストッパ３６の狭いイメージ範囲に収斂するように作動する。放射４４のビームが焦点を結ぶ試料１８の容積は、検出される容積素子４６を含むが、詳細は図３について説明する。
光制限部１４と指向光学系１６の焦点能力とによって入力放射４４の強度は光学系１６の焦点区域において最大となり、制限部１４の開口は入力放射４４の強度が横方向および試料１８内の前述焦点区域から離れる方向に軸線方向に減少する。
入力放射４４が検査される容積素子４６を照射すると、この放射はフィールドストッパ３６によって限定される試料容積内の材料と影響しあう。この相互作用によって照射された試料から始発する２次光ビームが全方向（４πステラディアン）に指向される。この２次ビームは、入射放射に対する試料の応答動作であるが、試料容積内の材料の反射、散乱および吸収（スペクトルの特定部分における応答の欠如として観察される）、さらに、特異な蛍光の発散がある。試料からの光学的応答の一部として収集される放射４８があり、収集器に到達したものは検知器２４に集められる。
収集組立体２０は前方対物レンズ５２と、第２の開口ストッパ５４と、検査される容積素子４６から発する放射エネルギ４８を集めると共に、該容積素子の最大断面積をフィールドストッパ５８へのビームに直角にイメージするリレイレンズ５６を有している。１つの実施例において、レンズ５２は焦点長さが前述断面積部分からの距離に等しく、従って放射４８を収集し放射４８を平行光線として再指向することができる。開口ストッパ５４は光集光対物レンズ５２から限定された寸法の放射ビームを選択的に通過せしめ、第２のレンズ５６は容積素子４６の前述断面積を第２の光制限部２２にイメージする。
図示した第２の光制限部２２はフィールドストッパ５８を含む。フィールドストッパ５８は光学的装置に通常使用される任意の開口を代表する。作動時に収集組立体２０はフィールドストッパ５８上に容積素子４６をイメージし、正確には該収集光学系の軸線に直角な該容積素子の最大断面積が定められる。すなわち、フィールドストッパ５８、３６は容積素子４６を介して対をなしている。フィールドストッパ５８を通った光は連結光学系６０と検知器連結体６８とを通って検知器２４に到達する。容積素子４６内に最大の照射を与えるため照射ビームを空間的にフィルタすることと、容積素子４６からの光を空間的にフィルタすることとによって、容積素子４６の外側区域からの光を識別することを可能とする。
放射が始発する容積素子をフィールドストッパで制限する効果は光学系の断面図として示す図３Ａ、図３Ｂ、図３Ｃを参照して説明する。
図３Ａは照射光学系の一部を示し、照射フィールドストッパ３６を通った光は光学素子７１（図２の照射対物体１６に対応する）に到達する。図２における照射部１２からの限界光２００、２０１はフィールドストッパ３６の点Ａを通るもので、限界光２０２、２０３はフィールドストッパ３６の点Ｂを通ったものである。限界光２００、２０２は開口ストッパ４０の点Ｃを通り、限界光２０１、２０３は開口ストッパ４０の点Ｄを通る。光２００、２０１はイメージ平面２５０のＡ’点で収斂し、光２０２、２０３はイメージ平面２５０のＢ’点で収斂している。点Ａ’、Ｂ’はフィールドストッパ３６のイメージ３６’の限界点として示される。フィールドストッパ３６が円形であれば点Ａ’、Ｂ’は直径の両端を示している。限界光２００、２０１、２０２、２０３はさらに、試料１８内に伝達される。
回折がないとした幾何光学近似によれば、光２００、２０１、２０２、２０３は入力放射４４の幾何学的限界を示す。試料１８内に散乱がないとき、入力放射４４は点Ｈ、Ｂ’、Ｃ、Ｄ、Ａ’、Ｋによって囲まれる区域に限定される。フィールドストッパ３６の内側を通った放射は開口ストッパ４０を通り、次に容積素子４６を通るが、その限界は点Ａ’、Ｆ、Ｂ’、Ｅによって示される。フィールドストッパ３６が円形であれば、容積素子４６は双円錐形であり、頂点Ｆ、Ｅを有する２つの円錐が共通の底面３６’を有している。容積素子４６は図３Ｂに示すように、単に放射４４がぼかされない区域を示すものである。
位置３６’において放射は最大であって、容積素子４６の外方で急速に低下する。図３Ａにおいて、フィールドストッパ３６とその映像３６’との寸法は開口ストッパ４０の直径、照射対物体７１と仮想平面２５０との距離に対比して誇張して示している。従って、照射される容積４６１の外側では内側に対比した場合フィールドストッパ３６’の中心Ｌと容積４６１の中心Ｇとの距離の２乗に比例して減少する。放射４４は試料１８に作用して放射を始発せしめる。始発された放射は相互作用の性質によって変化し、例えば始発する放射が蛍光の場合は発生源Ｇを囲む全球面（４πステラディアン）に放射されるが、方向性を持ってもよく、部分的に吸収されたビームの場合もあり、逆方向への散乱光の場合もある。任意の発生源Ｇからの放射の強さは、その点における入射４４の強さに比例するものとなっている。
照射装置とは別に集光装置を説明する。光学法則は本質的に可逆性であるから照射装置と集光装置とは共役的である。この共役性は集光装置を示す図３Ｂに明らかである。容積体４６１’からの放射は検知器２４（図２）に集められ検出されるが、照射と集光とを同時に考えるとき図３Ａの容積体４６１に少なくとも部分的に対応する。
図３Ｂに示すように、容積体４６１’からの放射は検出部２４に到達するが、収集開口ストッパ５４と収集フィールドストッパ５８とを経由する。検出部に到達する試料１８からの放射は放射４８に含まれる。回折がない場合、光３００、３０１、３０２、３０３は集光放射４８の幾何学的限界を示す。試料１８内に散乱がない場合、集光される放射４８は点Ｈ″′、Ｂ″′、Ｃ″、Ｄ″、Ａ″′、Ｋ″′によって限定される容積４６１’内に含まれる。放射４８のすべてはフィールドストッパ５８の内部の点を通り、これらが開口ストッパ５４を通り、その断面が点Ａ″′、Ｆ″′、Ｂ″′、Ｃ″′で限定される容積素子４６’を通っている。フィールドストッパ５８が円形の場合、容積素子４６’は双円錐形であって、頂点Ｅ″′、Ｆ″′を有する２つの円錐が共通の底面５８’を有して双円錐形を形成している。
フィールドストッパ５８を通る放射４８はイメージ５８’を通るが、イメージ５８’の下方（図において）の試料１８、例えば点Ｇ″′から始発する。更に、放射４８はフィールドストッパ５８を通るから、逆にイメージ５８’の上方からの放射はイメージ５８’を通る。すなわち、収集される総ての放射は対物体７２の収集開口に収集される、すなわち、容積部４６１’の内側にあって開口ストッパ５４に向かって指向され、第２に、検知部２４に到達する放射はフィールドストッパ５８を通る。この第２の状態は収集部の収集効率が発生源からの距離、例えばＧ″′とフィールドストッパのイメージの中心Ｌ″′との距離の２乗にほぼ等しい。
図３Ｂにおいて、フィールドストッパ５８とそのイメージ５８’との相対的寸法は開口ストッパ５４の直径、又は対物体７２からイメージ平面３５０までの距離に対比して誇大に示される。実際は角度Ｃ″′Ｆ″′Ｄ″は角度Ｃ″′Ｅ″′Ｄ″とほぼ等しく、効率または放射の計算において精度に小さいロスがあるが角度Ｃ″′Ｌ″′Ｄ″で代替できる。角度「１／２｛Ｃ″′Ｌ″′Ｄ″｝」の正弦関数が対物体７２の作動数的開口（ＮＡ）を示しており、開口ストッパを通る光に対する対物体の公称の収集角度を表す。図３Ｂにおいて、光源は４６１’として示すが、これは容積素子４６’の外方で、平面３５０より著しく下方で、例えば点Ｇ″′からのフィールドストッパ５８’の張る角度はイメージ５８’の中心Ｌ″′からの角度より小である。従って点Ｇ″′から放射される光は対物体７２に集められる立体角内にあるが、フィールドストッパ５８を通って伝播しないがこれは最初にイメージ５８’を通る必要があることによる。従って、収集効率は立体角の比、すなわち例えば光源点Ｇ″′からイメージ５８’の中心までの距離の２乗の比となる。容積素子４６’の外方で面３５０と対物体７２との間の試料１８内の光源点から４８に放射される光において、イメージ５８’は開口ストッパより小さい立体角を張り、従って、この光源点について、光線が通過する開口ストッパの面積は減少し、収集効率も同様に減少する。
容積素子４６’内の光源点に関し、対物体７２の実際の収集角度内に放射される光線は検知部２４に到達する。すなわち、容積素子４６’は試料１８の唯一の容積素子であり、これから発する放射４６はぼかされない。
従って、本発明の回折のない光学装置では、ぼかしは容積素子を限定し、これから有意の信号が検知される。
図３Ｃは容積素子４６″を示し、共役する照射および集光光学系によって限定され、観察角度φ（図２の５０）は１８℃ではない。深さ識別は改良され、共通フィールドストッパと共通対物体を使用するものより信号はいくらか弱いが、これは図３Ａの容積４６と図３Ｂの４６’とが実質的にかつ不完全に対応していることによる。この場合の容積素子４６″は容積素子４６、４６’の重なる部分から成り、これを通してフィールドストッパが共役する。一般的にはフィールドストッパは図示のように中心を同一として重ねられ、共役しない双円錐体の頂点は除去されて小さい素子となり、交差した円錐類似の形状を有し、これからの光学的応答は強化される。照射および収集装置は移動せしめられ、このフィールドストッパの像は対称性の少ない、例えば細片形、楔形などをなし、観察される試料と同様または斜めに整合するものとなる。この場合、全信号は著しく減少するが、試料からの検知信号の割合は増加し、有用な情報の内容は強化される。
装置１０は共役するフィールドストッパ３６、５８を使用して試料１８内の視野を横方向および深さ方向に制限する。試料１８は装置の所望の特性に合わせた供試容積素子を限定する。当業者にはフィールドストッパ３６、５８は図３Ｃに示すように容積素子４６″を介して共役するが、同一焦点ではなく、それぞれのイメージ、すなわち図３Ｃにおける断面３６’、５８’は重なっていないで共通線を有するのみである。一般的に光学的経路、フィールドストッパの位置と形状および対物体素子は整合してよく、これらが容積素子を限定し、位置と方向とが定められる。例えば形状は細片形、楔形、半月形、円錐形などが照射および収集区域の交差によって生ずる。
当業者が理解されるように、２つのフィールドストッパは完全に共役するより本発明は非イメージ容積、微細プローベ装置を含み、検知容積は分割共役、すなわちフィールドストッパのイメージの部分的一致により限定され、従って上述の双円錐体が部分的に重なる。この装置の望ましい実施例において、照射および収集光学系は互いに平行で、対物体は僅かに変位し、または楔形をなし、イメージの共通して重なり合う区域を形成するが、両組立体の光軸は偏位している。
図３Ｃに示すように、これら形態のいづれにおいても、入射ビーム４４と容積素子４６″との相互作用、すなわちこれらの光経路に共通な容積区域は２回空間的にフィルタされ、この容積区域から検出された光は照射および収集分布の結果として低下する振幅を有する。低いレベルの光が試料１８の容積素子を焦点外で照射し、望ましくは選択されなかった素子が強く照射された焦点区域、すなわちプローベ容積体のイメージを著しく覆うことはない。さらに、選択された容積素子の内側でなく、焦点材料の外部から到達する低レベルの光は非常に小さい部分のみが収集光学系に到達する。すなわち、共通容積素子４６″の外側から始発する光が検知される信号に与える影響は前述双円錐体の共通中心からの距離の４乗に比例して減少する。この結果は本発明の装置によって選択された容積素子から収集される復帰信号を該容積素子の外部から集められる復帰信号に対して著しく強化する。
寸法に関し、例示すれば１ないし２０マイクロメータの基本的寸法の細胞から成る基本的微細構造、及び１０倍ないし数千倍大きい層または生長過程を検出する臨床的巨大構造を有する生物学的組織を検出するもので、プローベ装置は照射視野ストッパとして数十ないし数百マイクロメータの寸法を有し、収集ストッパも数十ないし数百マイクロメータの寸法となされる。代表的な実施例において、照射および収集視野ストッパは２５ないし５００マイクロメータとなされ、対象物の拡大度は１／１０と１との間である。代表的な実施例において、フィールドストッパの寸法は上述の値となされる。実際の光学系において大きいフィールドストッパが必要である。
良く修征された対物レンズによって形成される点状対象物の像は点状とはならない。これは、明るく照明された中央の点がイメージの強さの１／２以上を消費し、残りは開口ストッパの形状に従って、及び開口ストッパ上の入射光の振幅および位相分布に従ってイメージ上に分布される。マックスウエルの近似方程式によれば、寸法ｄ’＝ｋλ／ＮＡが得られ、ここにλは単色入射光の波長、ＮＡは対物レンズのイメージ側の作動数的開口、ｋは１桁の係数である。実際的の光学系における通常の場合として、平面または球面波入射光が円形対称の良く修正された対物レンズに入射したとき、イメージは当業者に周知の渦巻き模様で中央の最大部を囲む第１の空白部の直径はｄ’＝１．２λ／ＮＡとなり、像の強さの８４％はこの直径内にある。
実際の光学系に通常の別の実施例として、入射光が最低次のＴＥＭ₀₀レーザーである場合、イメージにおける放射はガウス関数によって分布し、通常限定される回折スポット直径ｄ’＝０．６４λ／ＮＡとなり、この直径においてイメージ照射は回折パターンの中心における最大照射の約１３．５％であり、その部分のエネルギは全体の約８７％である。従って、本発明による開口ストッパはその直径がｄ＞ｋλ／ＮＡであり、ここに、ｋは開口ストッパと入射光とによって定まる定数である。対物レンズ、開口ストッパおよび照射の実際的値に対して、ｄ＞２λ／ＮＡであり、通常はｄ＞＞λ／ＮＡである。
良く修正された対物レンズにより形成される大きい物体の像でも幾何光学で予測される完全な複製ではない。幾何学的イメージの縁部を注意深く調査すると回折の影響が判るが、これら影響はイメージの寸法が回折スポットの大きさと匹敵する場合以外は無視できる。これは幾何学的イメージの外方では実質的に光学的力が存在しないことによる。すなわち、イメージ平面内の光学的動力の分布は、対象物例えばフィールドストッパが小さくて回折効果が関連する対象物の光学的性能を支配するか否かを定める限界値となる。例えば対象物からの光学的動力の９５％がイメージ表面に到達するとき対象物の幾何学的イメージとなされる。
図２の実施例において、容積素子４６の光軸に沿った選択は対物体前方組立体（４２、５２）の同期的軸方向運動によって達成される。これは、対物体の前方組立体を選択された容積素子４６からそれぞれの焦点位置に等しい距離に位置せしめるようにする。しかし、新規の容積素子の場合、試料を２つの固定の光学的組立体に対して移動せしめ、または一方の光学的組立体を他方に対して移動せしめて、選択された容積素子を２つのフィールドストッパの共役点に位置せしめるようにする。
照射装置の光軸ｚに沿った容積選択を行う別の手段として、素子の別の運動があり、フィールドストッパの運動、または他の光学的素子を運動せしめて照射装置の対物体のイメージ距離を変更せしめるものがある。しかし、２つの光学的組立体の一方の運動は他方の関連する運動によって補償する必要があり、例えば、収集光学的組立体において２つのフィールドストッパの共役関係または分割した共役関係は選択された容積素子４６を介して達成される。
図４は変形した装置１０’を示し、これは非イメージ容積マイクロプローベの連結運動組立体を不要とし、共通対物組立体が試験片を照射し、同一軸線または経路に沿って光を集める。装置１０’は照射部１２と、連結光学体３４と、ビーム分割部１００と、第１の光制限部１４と、対物体１６と、検知部２４と、前方対物光学素子４２を移動せしめて異なる深さの容積素子をサンプルするための制御器２６とを含む。ビームスプリッタ１００が連結光学体３４の前方および後方素子の間に配置され、光制限部１４の方向から入る光を反射するが、照射部１２の方向から到達する光は通過させる。ビームスプリッタ１００から反射する光は検知部２４に指向される。
作動時に照射部１２は放射ビームを発生し、これが連結光学体３４とビームスプリッタ１００とを経て光制限部１４に向かう。光制限部１４は放射ビームを選択的に伝達し、光はフィールドストッパ３６を通って対象物１６に到達する。対象物１６はフィールドストッパ開口３６内の試料１８内にイメージを形成する。試料１８から反射し又は始発した光は対物光学体１６に集められ、光制限部１４内の同一のフィールドストッパ開口３６を通って戻る。従って光制限部１４は対物体に到着する試料１８からの放射の一部分のみを選択的に通過させる。通過した部分は主としてまたは本質的に容積素子４６からの応答を含む。選択的に伝達されるビームはビームスプリッタ１００に向かう。ビームスプリッタ１００は選択的に伝達されたビームの少なくとも一部を検知部２４に指向し、分析および特性を記録する。図２の実施例と同様に、照射源と光制限部とは試料内に局限された強度の回折限定より大きい照射スポットを形成する。
図４Ａは別の実施例１０″を示し、共通対物組立体が試料を照射し同一経路に沿って光を集める。装置１０″は照射部としてレーザ、例えば波長６３３ｎｍの線形に偏光した出力を有するメレグリオ社（Melles Griot）05-LHP-121-111レーザを有し、レーザ出力をパルス化し信号を強化して同期検知を可能とするビーム変調組立体９９７が設けられ、例えば４５度の入射角の６３３ｎｍ放射と共に使用されるレイナルド社（Reynard Corporation）製の極性検知２色性ビーム分割部１００が配置され、入射する偏光レーザ放射の９０％以上が反射されるようになされ、連結レンズ９１３、例えばメレグリオ社のＬＡ００１１が２０ｍｍの焦点距離を有し、これがレーザ放射を照射連結部３２に連結し、連結部３２の受入れ数値開口と適合する。連結部は光ファイバ例えば長さ２ｍのセラムオプチック社（Ceram Optic）のＵＶ２００／２２０Ａ１２とし、２００ミクロンの芯を有し、数値開口（ＮＡ）が０．１２であり、ナイロンジャケットで囲まれ、端部にはアウガット社（Augat SMC）のコネクタを有する。光学的ヘッドは連結光学組立体３４と、フィールドストッパ３６とを有し、これは例えばナショナル・アパーチャー（National Aperture）社のステンレス鋼フィールドストッパで、１００ミクロンのレーザーカット開口をＰＡ−３アダプタに有する。対物組立体１６が設けられ、これらは試料１８を照射するに共働する。試料１８は装置１０″の性能を較正するためには像であってもよく、例えば透明媒体内に分散した散乱素子を含み、その表面の下方に例えばナイルブルーなどの染料で染色された糸を配置して小さい癌を模擬し、または鶏の胸肉などの天然組織内に癌に通常使用される薬に浸した糸を挿入したものとしてこの薬によって処理された小腫瘍の吸収および発散特性を模擬するようにしてもよく、または試料をそのように処理された腫瘍としてもよい。照射されたナイルブルーは波長６７０ｎｍおよび７８０ｎｍに集中された蛍光を発する。光学的ヘッドは試料１８の容積素子４６内に発生する蛍光を感知し、照射連結部３２に連結し、これが結合レンズ９１３の受け入れ数値開口に照射し、これが集められた放射を基準化し、２色性ビーム分割部１００に送る。ビームスプリッタ１００は６７０ｎｍ以上の蛍光の９０％以上を伝達するようになされている。伝達された蛍光は光学的フィルタ９１５、例えばショット社（Schott）のＲ６８ガラスとなされ、このガラスは散乱した６３３ｎｍの放射の１０⁴分の１以下を伝達するが、蛍光の１／２以上を検知フォトマルチプライヤ９２４に伝達し、これは例えばハママツ（Hamamatsu）Ｒ９２８となされる。フォトマルチプライヤ９２４の電気的出力９３０はロックイン増幅器９２６、例えばプリンストン（Princeton Applied Rearch）社のＳＲ３５０増幅器となされる。パルス発生器９２５（ヒューレット社Hewlett Packerd 8003A）が例えば約８５０ヘルツで発振するように調節され、ビーム変調組立体を制御し、変調組立体とロックイン増幅器とを同調せしめる。ロックイン増幅器はフォトマルチプライヤ９２４の電気的出力９３０を処理して平均強度をディスプレイに表示し、例えばテクトロニクス（Tektronix）４７５となされるオシロスコープ９２６に平均強度に比例する信号を送る。表示された信号強度は測定される容積素子４６から発する蛍光に比例する。制御器２６は光学的ヘッド９１４を３つの直交する方向運動せしめ、各種の容積素子の蛍光を測定可能とする。
詳細には変調組立体は音響光学的偏向装置、例えばイソメット社（Isomet）の１２０１Ｅで、２２１Ａ−２−３９駆動部を含み、これがパルス発生機９２５のパルスを受けたとき偏向した１次及び高次のビームを発生し、パルス発生機の出力がゼロの場合にゼロ次の偏向されないビームを発生する。出力ビームはレーザ９１２から音響光学的偏向装置９９１を通り、回転ミラー９９２に送られ、ビームはモード選択器９９５に指向される。モード選択器９９５は、例えば偏向装置９９１から約８００ｍｍ離れており、モード選択器に入る偏向されたビームはゼロ次の偏向されないビームの衝突点から充分に離れている。モード選択器は充分に大きい、例えば直径約１ｍｍの開口を有し、１次のビームの通過を可能としているが、モード選択器の本体はその他のモードの伝達を妨げ、阻止する。１次のビームはレーザー照射を含み、これが第２の回転ミラー９９４に当り、調節可能の虹彩９９６を経てビーム分割器１００に指向される。虹彩９９６は一例として約３．５ｍｍの開口に調節される。調節可能の虹彩はモード選択器９９５を通って洩れる残留モードがあれば除去し、レーザー照射器９１２の出力に広く存在する最低次のＴＥＭ₀₀ガウス（Gaussian）モード以外の付帯的なレーザービームがあればそれを除去する。レーザー照射器９１２の出力のこの最終的清浄化作業によって、その後の照射用光学素子による散乱が生じてフォトマルチプライヤに向かう光学的経路内へ入ることが防止される。従って光学的ヘッド９１４に入るレーザー照射はパルス発生機９２５のパルス周波数を有する清浄化されたパルスである。
光学的ヘッド連結器は前方および後方素子３４１、３４２を含み、例えば１対のエドモンド・サイエンチック社（Edmund Scientific）製のＭ６３８７アクロマットで、焦点距離１７ｍｍとする。副組立体３４が照射連結ファイバ３２の出力の数値的開口に適合し、照射をフィールドストッパ３６に指向するが、これは例えば直径１００ミクロンの円形開口であって入力照射を約３０％の効率で選択的に通過せしめ対物組立体のバック素子３８に送る。素子３８は例えばメレス・グリオ（Melles Griot）社の01 LAO 028/078で焦点距離約３１．５ｍｍで、開口ストッパ４０を介する連結効率を最大にするように選択され、該開口ストッパ４０は代表的には直径が８ないし８．５ｍｍで前方素子４２と一体となされている。前方素子４２は１組の顕微鏡対物レンズの１つで、その拡大度は視野ストッパのイメージが所望の直径を有するように定める。前方素子４２は例えばアメリカン・オプティカル社（American Optical Corp.）の焦点長さ約４ｍｍおよび、０．６６ｍｍのＮＡの４４Ｘ対物レンズ、無限大に修正された同社の焦点長さ約８．５ｍｍ、および０．５ｍｍのＮＡの２０Ｘ平面アクロマート対物レンズ、または焦点長さ約２０．３ｍｍおよび０．２ｍｍのＮＡで約１２ｍｍの長い作動距離のオプティック社（Optics for Research）の１０倍対物レンズがある。これらの対物レンズは図４Ｂに示す測定を実施するために使用されるもので、これが装置１０″の予測された性能を実証する。
図４Ｂおよび図４Ｃは図４Ａに実施例として示す実際的な作動装置で行った測定結果を示す。
図４および図４Ａの実施例において、収集および照射装置は同等であり、図３Ａおよび図３Ｂに示すいくつかの装置は同一の素子、すなわち対物レンズ７１、７２、開口ストッパ４０、５４および視野ストッパ３６、５８は同一の装置であると物理的に認識される。これら実施例において視野ストッパ３６、５８は共通のイメージ３６′、５８′（図３Ａ、図３Ｂ）を介して自動的に共役するが、これらは図３Ａ、図３Ｂのぼかしがなく照射された光源容積素子４６、４６′と同様に通常のものである。この実施例において、照射効率および収集効率は共通のフィールドストッパ・イメージにおいて、例えば図３ＡのＧ、図３ＢのＧ″′に示す遠隔点に相対的に最高であり、容積素子４６内で高い値に留まる。同様に、容積素子４６内で収集効率は高いが、これは容積素子４６′の場合も同様となされる。図３Ａ、図３Ｂの４６１に同等な光源点４６０、例えばＧに対する照射及び収集の全効率は両（照射及び収集）効率と照射に対する発散の大きさに関する関数との積と同様に概略的に低下する、すなわち、イメージ５８′と同等なイメージ３６′の中心からの距離のほぼ４乗に比例して低下する。光軸上にない点については低下が著しいことが判る。試料内でのロス以外に、上述理由に実質的に影響を与えない要素として、収集フィールドストッパ５８によって与えられる限定によるものでなければ、球面４５０（４５０′）に沿って配置され焦点外れの容積素子から始発して収集された放射４４の全光束が、容積素子４６（４６′）と同様に検知器（２４）によって検知される放射に対する背景信号とほぼ同様に役立つが、このことは照射され放射する容積４６１（４６１′）の内側の球面４５０′の面積がイメージ３６′（５８′）からの距離の２乗になることによる。しかし、本発明の装置によれば、収集フィールドストッパ５８のために収集効率の低下が早いので容積素子４６１′からの背景状態の総合値が、焦点区域、詳細にはぼかされない容積素子およびその周辺から集められる信号を支配することはない。
非イメージ容積マイクロプローベ装置

の全幅半動力深さ識別は

で示され、ｄ″は検知器フィールドストッパのイメージ５８の直径、ＮＡは対物体７２のイメージ側作動数値開口、であり、従って光学的装置の幾何学的配置によって決定される。これに対比して同焦点鏡検方法によれば、回折が優勢な機構が照射および収集効率を制御するする場合は深度解析Δは入射光と媒体との相互作用の性質によって定まる。例えば、ウイルソン（T. Wilson）は「生物学的同焦点鏡検方法ハンドブック、Handbook of Biological Confocal Microscopy, J.B.Pawley,Ed.,Chapter 11, 113-126, Plenum Press, New York, 1990」において蛍光同焦点鏡検方法によれば、Δ＝２．８λ／ＮＡ²ここにλは単色照射光の波長、また、入射光がコヒーレントのときはΔ＝１．４λ／ＮＡ²となっている。
図４Ｃは図４Ａの装置を使用して得られた小さい高写真感光性の腫瘍類似の２つの人工物の代表的な２次元的図である。第１の試料はナイルブルーで染色した２００ミクロンの糸（Talon-American Sewing Bee mercerized cotton #50）を乾燥し、ポリマー（Duco Cement)の薄い層を被覆して染色が主組織に拡散することを防止したものである。縫合物は鶏の胸の表面下５００〜８００μに挿入された。６３３ｎｍで励磁したとき蛍光が６７０ｎｍ以上の波長で観察された。深度分析は７６μであり、横走査分析は２５μであった。縫合線は明確に観察することができた。データ処理は最少となされた。等強度曲線を得るため生データは６次有理関数で処理され背景定数は除去された。等強度曲線が５０％強度を太線として示される。図４の別の実施例では第２の試料が使用された。第２の試料は直径１３０μの市販の綿糸（コーツアンドクラーク Coats and Clark #50）で、ベンゾポルフィリン誘導体モノアシッド（ＢＤＰ−ＭＡ）で同様に処理され、腫瘍の光力学治療のための薬が使用された。鶏の胸は部分的に燐酸処理された塩水で浸漬され、プラスチックフィルム（Dow Handiwrap）でシールされた。図は生データである（相対的強度を深さｚと横方向走査ｘとで示す）。この強力な明確な信号は、染色が小腫瘍の信号を強化するために使用されたとき可能であって、外科処置に有用な最少信号処理が必要である。腫瘍組織に本質的な蛍光が観察されたときは、より複雑な処理が通常必要である。
図４Ｃにおいて「深さ」寸法は装置の光軸方向（鉛直方向）に沿っている。水平すなわち「横」方向は糸に直角である。これら２つの軸線の機能の差は「横」解像度が２５μであり、「深さ」解像度が７６μである。
直接に臨床的興味はないが、付加的な細部の信号解析がさらに測定を改善せしめる。深さ方向に輪郭線を延長せしめる。深さの解析は約５０μだけ、半径方向の解析より大であり、従って５０％の輪郭線深さは輪郭線幅より約１００μだけ大であると予測される。実際に測定された差は約１２５μである。また、糸の太さは糸の中心において深さ解像度より大でないから、観察された供試容積は蛍光目標で充填されているが、糸の縁部においては充填されていない。この関係において簡単な回旋解析計算が円筒形形状を補償すると期待される。
装置１０″の素子から検知光学的拡大器に送られる６３３ｎｍのレーザ放射の量を最少とするため、図４Ａに示す望ましい実施例１０″では薄い反射性フィールドストッパ開口担持体を例えば２度の角度で傾斜せしめ、通過しない照射が収集光学的経路に反射することがないようにする。さらに、光学的ヘッド組立体の内径部はねじ切りされ、吸収性拡散ペイントで塗装され、壁に散乱する光が最適に吸収され又は阻止される。空間フィルタをビーム分割器１００と光学的フィルタ組立体９１５との間の収集経路内に挿入され、照射連結部３２の端部における連結部からの反射は阻止されるが、帰還する蛍光は通過するようにする。
上述説明から及び以下の説明から理解されるように、本発明の容積微細検査器は生理学的影響又は状態の広い範囲を検知し又は監視することを可能とする。一例として、皮膚または組織移植片を監視する深さ識別光学系に対する要望が存在する。移植片が良好に血管化しているか否かの状態を容易に検知することは壊死状態または急速に増殖している組織（回復）状態の検知と同様に必要である。血管化状態は各種ヘモグロビンと同様にスペクトル的に測定可能であるから、血液潅注およびこれら測定は深さ解析を可能とする。
光力学的癌治療の処置中に使用される薬の消耗の測定は特に重要な応用例である。光力学的治療技術の現在の欠点の１つは癌に実際に供給された薬の量を求める信頼性のある方法がないことである。光力学的治療に使用される薬は化学製品で、これは該当する波長（通常、赤色または近赤外線）の光を受けたとき光活性化して有毒性となるものがある。また、急速に増殖する組織内に優先的に集まる場合もある。この形式の化学製品にはポルフィリン誘導体があり、ポルフィリン症を発生させ、光感知性の蛍光を生ずる。図４Ｃはこのような薬の１つとしてのベンゾポルフィリン誘導体モノアシッドの検出を示し、図４Ａの装置によって照射されたときの高選択性空間的検知の結果を示す。
別の応用例として、火傷した組織の深さおよび生存能力の決定がある。外科医にとって困難な決定は火傷の処置において火傷した組織の除去の場所と可否を決定するにある。区域が回復する見込みの場合には、瘢痕化、回復時間および感染の危険は放置したほうが低くなる。この健全状態を判定する最良の評価は健全な組織の深さを知ることである。このことは本来の光学的特性を観察し、乾燥痴皮に与えたマーカー薬品を観察すること、などで達成される。インドシアニン緑は蛍光染料でこの目的で使用されるが、安全で心臓能力の指示薬として使用されている。静脈内に注射されると、体内に急速に分布され健全な血管から漏れることはない。従って、火傷の下方の深さを決定することにより、健全な血管の深さを決定することができる。グリーン（Green）氏および彼のマサチュセツゼネラル病院（Massachusetts General Hospital）における協力者は、始めに赤色、つぎにＵＶ（紫外線）で励起された蛍光を観察する技術について特許を得ている。ＵＶ励起蛍光は赤色励起蛍光より散乱が大であり、差の測定によって火傷の深さが決定される。しかし、本発明によれば、直接かつより正確な測定が容積素子を異なる深さに配置し光学的応答を観察することにより、無傷の組織の区域を正確に決定することができる。
本発明は試料内の選択された容積素子を照射し、それからの光を検出することに関し、容積素子は部分的に比較的に大きい開口源によって限定されるが、本発明は任意公知の形式の照射を使用するものでよく、強化された信号水準によって明確な空間的Ｚ軸識別（照射の光軸）を与え、組織層の形状、寸法または生物学的特徴に対応するものであり、本発明出願人は、本発明の利用により重要なスペクトル応答情報が得られ、従来この種の解析には無益であると考えられた照射源も使用可能であることを明らかとした。さらに、本発明によれば、収集されるスペクトル情報は単に振幅または動力ではなく、収集されたスペクトル情報の全範囲を使用する。例えば図５は非イメージ容積顕微鏡を示し、照射部１２は複数の光源、詳細には窒素レーザー１０１が３３７ｎｍの光を放射し、白色光源１０２と、レーザーダイオード１０４と、光放出ダイオード１０６とを含む。さらに、図５は単色走査体１０８とスペクトログラフ１１０とを含む。照射部１２は容積素子を検査する各種多数の光源であり、検知部２４は選択された容積素子からの電磁放射の検知しまたは記録する各種装置を有している。通常、照射部１２は紫外線の下方から赤外線を越える範囲の波長の電磁放射を発生し、検知部２４と関連するデータ処理装置１１２とが、それぞれの又は連続するスペクトル情報を検知する。さらに、フィルタし加算し時間計算を行い微分し、さらに各種処理を行う信号処理装置が設けられる。詳細には、データプロセッサ１１２は訓練用試験片について分析、例えば多変数統計解析を行って関連変換マトリックスを求め、変換マトリックスを訓練用試験片以外の試験片に適用して関連する応答から多数の病理学的状態を得る手段も含む。
作動時に光放出ダイオード１０６は赤色検知または目標光を発生し、装置１０から放射される光で照射される試料１８内の一般的区域を識別する目視を助けるもので、目標または操作ビームとなり、装置１０を目標とする方向に指向することを容易とし、検査される選択された容積素子が位置する区域を限定し明確とする。適切なビーム操作装置，例えばイメージ又は特徴を狙うガルバノメータ制御の操向鏡を備え、変位に応答して１つ以上の操向鏡を制御する装置は公知となされている。白色光源１０２は広い波長範囲の光を生じ、窒素レーザー１０１とレーザーダイオード１０４とは特定波長の単色放射を発生する。例えば窒素レーザー１０１は波長３３７ｎｍの紫外線を発生し、レーザーダイオード１０４は波長７８０ｎｍの放射を行う。白色光源１０２は複数の波長の光を発生し、電磁スペクトルの広い範囲についての吸収と反射とを含む光学的応答を明確にするために有用である。
窒素レーザー１０１は容積素子４６内の材料を励起し蛍光を発生させる。目標容積素子から発生する蛍光の振幅と波長とは容積素子の重要な診断または分析特性を有しており、収集装置とデータ分析装置とが蛍光応答を使用して容積素子の病理学的情報を与える。白色光源１０２とレーザーダイオード１０４とは容積素子４６と選択的に作用し、放射に対する応答から病理学的情報が得られる。これら応答は散乱、吸収および反射特性を含む。本発明のいくつかの実施例において複数の光源に関連して図２に示した非イメージ容積マイクロプローベおよび図５に関連して説明した検知器を使用することにより、照射ビームに対する目標容積素子の応答の角度的空間分布が同様に分析目的に使用される。この応用例は、例えば流体またはゲル状の培養媒体中のバクテリアの成長過程の連続的監視、又は複雑な発酵過程の監視を含む。
図５の装置の検知部２４は目標容積素子４６から発する放射応答を分析する走査単色装置１０８とスペクトログラフ１１０とを含む。検知器２４が試料１８からの放射を最初にスペクトログラフ１１０およびモノクロメータ１０８に送る。スペクトログラフ１１０は収集した放射ビームを解析のためにスペクトルに分散し、モノクロメータ１０８は収集された分散したビームから特定区域のスペクトルを分離し、その強度その他の特性を決定する。スペクトログラフ１１０またはモノクロメータ１０８が特定の波長またはスペクトル領域を分離した後に、その後の分析が行われる。詳細には、検知部２４の系統は収集された放射に含まれる光の特定波長と該特定波長の特性とを決定する。特定波長の特性は、該波長の放射の強度、存在する場合は該波長における偏光の方向、および該波長における位相のずれ、がある。収集された放射の別の特性として、蛍光が存在する場合の蛍光の存続時間、特定の波長における放射ピークの波長のずれ、がある。
検出されたデータの制御、貯蔵および分析のため、図５には、検知器２４に連結されたデータプロセッサ１１２と、データプロセッサ１１２に連結されたメモリ装置１１４とがある。データプロセッサ１１２は例えば一般用プログラム可能のコンピュータであってよく、またメモリ装置１１４はデジタルメモリチップ、フロッピー、ハードディスク、磁気テープ、読み書きコンパクトディスクなどの電子記憶装置とする。データプロセッサ１１２は読み専用メモリを含んでよく、これが関連変換ベクトルまたはマトリックスのメモリを備えるが、前者は単純病理の自動的診断に使用され、後者は複数の病理の自動的診断に使用される。さらに、複数のコンピュータを設け、試料の組に名札をつけ、キーボード入力によって与えられるデータを付加し、関連変換を行い、記憶し、更新しまたは変換し、メモリに記憶するようにしてもよいが、これは後述する。
一般的に、本発明は収集した応答を少なくとも部分的に記録し、編集し、分析するように作用する。本発明の安価な実施例において病理の診断的予測のみが与えられる。すなわち、装置には特定診断状態の関連変換ベクトルまたはマトリックスのメモリが設けられ、単に信号Ｌ_ijを記録し、容積素子ｊに対する診断的記録Ｃ_jを得るに必要な関数Ｆ（Ｉ_ij）を計算するが、これについては以下に詳述する。
広い意味において、検知器２４の出力はデータプロセッサ１１２に供給され、データプロセッサは検知器２４の出力を処理し、又はデータをメモリ装置１１４に貯蔵して、後に処理する。データプロセッサ１１２は検知器１１２から得られた第１のデータとメモリ装置１１４からの第２のデータとを比較する。例えば、データプロセッサ１１２は検査した材料を示す第１のデータとメモリ装置１１４からの第２のデータとを比較する。本発明の望ましい実施例によれば第２のデータは工学的応答データのメモリ、または望ましくは該メモリから抽出された数学的モデルを含むが、これは「非イメージ容積マイクロプローベの方法論および作動」（Methodology and Operation of the Non Imaging Volume Microscope）と題する章に記載されている。
メモリ装置１１４は特定材料に関する大量のデータを記憶するために使用される。例えばメモリ装置１１４は生物学的組織の特定形式と作用する光の特性に関するデータを記憶し、光の波長のそれぞれの組において励起に応答する特定の形式の生物学的組織と作用する光の特性に関するデータを記憶し、または組織の深さによって索引をつけたスペクトルを記憶し、または従来の観察データから得られた複雑な多次元スペクトルデータを記憶する。
記憶装置１１４は特定の症状の生物学的組織試料から得られた光の特定の特性に関連する情報を記憶する。例えば、１つの波長において反射した光と第２の波長において反射した光との比を、既知の観察と関連する癌性組織の成長と関連して求め、または外科的に関連する状態、例えば組織の１つの層が厚くなること、前癌状態の代謝的変化、または悪性、などをスペクトルのメモリ及び以前の外科的特徴に関連して決定する。すなわち、注釈され又は記憶された数値化スペクトルとの関係は診断の判断を与えるもので、特定の個々のスペクトル特性の認識がなくても、ピークまたは吸収バンドが従来は診断に必要とされていた。
非イメージ容積マイクロプローベの方法論および作動
従来技術によれば複雑で異質の細胞間質のスペクトルおよび化学分析は、この対象物から得られる応答を高い均質性の区域に限定せきないという理由で妨げられていた。この問題を処理するために多数の微細プローベが開発され、電子顕微鏡、イオンマイクロプローベ、その他各種の装置が、形態学的およびある程度は化学的（通常は原理的）分析情報を、試料の点基準で、または面基準（例えばイオン顕微鏡）で与えるようになされている。しかし、これら方法は試料を真空中に配置する必要があり、結果として組織を破壊するものであり、さらに、これらの方法は有機材料の分析には使用できない。生物学的組織の生体微小分析は従来の古典的マイクロプローベとは相違する。詳細には、判別される組織の代表的寸法が大である必要がないが、その寸法は分析技術で特殊の訓練を受けている者、例えば外科医、プロセス制御技術者その他の専門家以外でも操作可能な分析工具を必要とすることが望ましい。本発明の非イメージ容積マイクロプローベによれば、生体の生物学的組織の微細検査、およびその他の組織の本来の環境における検査が実施可能である。この非イメージ容積マイクロプローベは各種の適用例があり、そのいくつかを以下に説明するが、本発明を限定するものではない。
本発明の一実施例において、容積素子内の材料と衝突する放射との相互作用が少なくとも特定の徴候を表す、容積素子からの応答が各種明確な波長または波長の組に対する、受取り光の強度の用語、または応答スペクトルで示される。特定の分析技術の訓練を受けた研究者はこのスペクトルを使用して容積素子に関する重要な情報を、入射する放射および放射と目標材料との相互作用に関する研究者の知識に基づいて認識しまたは演繹する。各種の分析手段、例えばスペクトルのピーク比較またはスペクトル分析を行うようになされたソフトウエアプログラムなどを直接に使用して、隠された相互作用に関する研究者の基本的理解を増加し且つ、目標容積素子に関する化学的、形態学的および生理学的性質に関する情報を与える。公知の基本的原理によれば本発明が研究者に与えるデータは、装置から直接に得られ、良く限定された容積素子から直接得られるもので、目標容積素子の外部から与えられる光の関連スペクトルを弱める応答または干渉は除去される。従って、大きい異質の試料内の特性を識別する能力を妨げるような背景ノイズが引き出されることはない。異質の試料から明確なスペクトルを得るこの能力により、本発明の非イメージ容積マイクロプローベは、収集した容積応答データを通常形式の比較的簡単な数値分析モジュールの入力として従来技術の吸収スペクトル分析、散乱分析、蛍光分析、ラーマン（Raman）分散その他の変数またはスペクトル分析を、不明確な又は不充分な信号の場合の複雑性を伴わずに、可能とする。
本発明の別の実施例において、観察された生データから意味のある結論を導く技術的能力を有しない使用者のために、装置は特定の分析作業のために本質的に予め較正されている。非イメージ容積マイクロプローベを較正する方法を以下に述べる。
説明を簡単にするために、本方法の目標を、ある状態、詳細には光学的視認が可能な組織、例えば外部皮膚、頚部内その他内視鏡または腹腔鏡によって近接可能な空所内などの組織のある状態、たとえば胃腸の経路（口から始まって、食道および胃を通り、直腸検査、大腸）、又は腹腔鏡検査によって近接可能の腹腔内の各種器官、にある状態が存在するか否かを診断する、非イメージ容積マイクロプローベを較正するものとする。これら状態において、スペクトロスコープの操作訓練を受けていない医師は疑わしい組織を見て、色彩消失その他の形態的異常が存在した場合その区域からのサンプルをとって顕微鏡検査のため病理学研究室に送り、癌が存在するか否かを決定し、癌の場合はその成長段階を決定する。本発明は目視検査のときに、疑わしい目標組織の病理学的性質を決定する光学的に得られた診断記録を提供し、必要の場合には直接活動を行うことを可能とし、いづれの場合にも生検のために組織を別に取るという必要はなくなる。さらに、本発明の非イメージ容積マイクロプローベ法は医師によって観察された組織の自動的診断を与えるもので、顕微鏡下による組織の検査を行う病理学者を必要としない診断を可能とする。
特定の病理学に対して本発明の非イメージ容積マイクロプローベを較正するため、該特定の病理学に対する試験片の訓練セットを選択する。ここで「訓練セット」とは組織試験片の一群をいい、各試験片は病理学研究室で以前に行った試験の状態を明確に示すものとなされる。さらに、生検を行うに先立って望ましくは訓練セットの各試験片と本発明の非イメージ容積マイクロプローベとを使用してスペクトル応答の記録を調査する。この場合、訓練セットの目標容積素子（この場合、組織はその後に病理学研究室で病理学状態の検査を行う）は図５に示す容積マイクロプローベで検査を行う。両者はレーザーＵＶ光源（１０１）と広バンド白色光源（１０２）との両者で照射される。ＵＶおよび白色光源に対する試験片ｊ内の目標容積素子の応答をＪ_ujおよびＪ_ijとする。ここに、ｕ及びｉはそれぞれ、ＵＶおよび白色光励起に対するスペクトル応答のスペクトル波の中央バンドの波長を示す。例えば、Ｊ_ujは蛍光で、Ｊ_ijは背景散乱応答であってよい。これらのデータはメモリ１１４に貯蔵され、後に使用される。訓練セットは非イメージ容積マイクロプローベで得た応答を記録した後に使用され、各試験片の病理学的決定は記録Ｃ_jとして記録され、ここにｊは試験片の識別であり、Ｃ_jは試験片の状態によって記録スケールとして選択された数、例えばゼロから１０までの単一軸上のスケールとし、０は正常の組織、１０は完全に根を下した重い癌の組織変化のものとする。この訓練セットは非イメージ容積マイクロプローベを較正し、訓練セットに存在するそれぞれの組織の病理学的状態が存在するか否かを将来判定することを可能とし、従って訓練セットの病理学的状態の決定には深い注意を払う必要がある。望ましくは、同一の試料を顕微鏡的に多数の病理学者によって独立的に盲検させ、各病理学者の議論において明確に識別できる試験片を訓練セット用として使用する。
試験片の記録Ｃ_jが決定されると、メモリ１１４に以前に貯蔵されたＩ_ujおよびＪ_ijが使用されて関係式が得られる。
Σａ_jＦ（Ｉ_ij）＋Σｂ_uＦ（Ｊ_uj）＝Ｃ_j （１）
白色光およびＵＶ光に対する収集された応答ｉおよびｕのそれぞれの狭いバンド幅の波長は通常５および５０ｎｍであるが、検知モノクロメータ１０８とスペクトログラフ１１０の解像度による。
関数Ｆの選択は受取る応答の性質にある程度よっている。ほとんど特徴のないスペクトル応答（すなわち、比較的平滑で、波長による変化が小である）を受けたとき応答強度、すなわち正常強度としてＦ（Ｉ_ij）＝Ｉ_ijまたは、Ｆ（Ｉ_ij）＝Ｉ_ij／Ｋが得られ、ここにＫは受取ったスペクトラム内の最大応答、または、望ましい波長（例えば、生物学的組織内で水またはヘモグロビンの存在するときの）に対する応答である。望ましいスペクトルが鋭い特性を有するとき、λを波長とし、Ｆ（Ｉ_ij）＝（ｄＩ_ij／ｄλ）Ｉ_ijとなる。
データプロセッサ１１２は次に回帰解析を行い、明確な関係式を得るため使用されたｉおよびｕの数を最小とし、関連定数のための式（１）を求める。実験的に得られたｊの式を使用し、関連定数を未知であるとして回帰解析を行うと最良の関係を有する解答がえられる。最小化は波長の最少数を与え、応答Ｉ_ij、Ｊ_ujは測定される現象に満足すべき関係式を与える。較正過程において絶対的な必要数より著しく多数のデータが集められ、これらデータの多くは互いに関連している。数学的に見れば、最少のセットはこれら組織の応答に基づいて定める。応答の最少セットが決定されると、その後の、非イメージ容積マイクロプローベの実際的の診断用の使用において応答の最少数（例えば狭い波長バンドの最少数の応答）を可能とし、処理を迅速とする。
波長および関連する係数ａ_jおよびｂ_uの最少数の組を得るための方法は従来技術で公知であり、多変数回帰解析および単変数回帰解析を含む。別の統計的方法、例えば中立ネットワーク解析も利用可能であり、この目的に使用可能となされる。この統計的手段は簡単なソフトウエアプログラムとして利用可能であり、商品名スタティスティカ（STATISTICA, Statsoft Inc.）または、プレディクト（PREDICT, Neural Ware Inc.）として入手可能である。
通常、白色光およびＵＶ光に対する応答はＩ_ij、Ｊ_ujとして示される。別の応答も容積素子４６を特徴づけるために使用される。詳細には、容積素子からのすべての応答をＲ_ijとして示すことができる。すなわち、メモリ内にＲ_ijを含むものとするが、容積素子に関する別の情報として、前述の非イメージ容積マイクロプローベでは決定されなかったが、観察された記録と診断される病理との関係の改善に役立つ別の情報もある。このような情報として、一般的な医学記録情報、例えば患者の類別、例えば非限定的に、性別、年齢、人種、体重などがある。このような情報は、回帰手法においてこれらを含むことが信頼性を高めるという点で改善するものであり、付加的な人工的応答Ｒ_ijとして記録する。ここに指数ｉは得られた応答の形式を示し、非イメージ・マイクロプローベから得られたか、他の手段、例えば外来の患者、通常人、データなどのいづれかを示す。
関連係数を与える式（１）を単純化すれば、次式が得られる。
Σａ_jＦ（Ｒ_ij）＝Ｃ_j （２）
単純化された式において、（ａ_j）は病理Ｃにに対する関連ベクトル（ａ）であり、整理した応答（Ｒ_ij）は訓練セットの容積素子ｊに対する応答ベクトル（Ｒ_j）である。機能的応答ベクトルＦ（Ｒ_ij）は応答ベクトル（Ｒ_j）内の応答素子の整理した関数として規定される。同様に、整理したスコア（Ｃ_j）は訓練セットに対する病理学的スコアベクトル（Ｃ）である。与えられた病理Ｃに対して非イメージ容積マイクロプローベを較正する方法は、従って、応答ベクトル（Ｒ_j）と対応する病理学的スコアベクトル（Ｃ）とのすべてを編集し、機能的応答ベクトルＦ（Ｒ_ij）を定めた後に、これらのデータに基づいて最小関連ベクトル（ａ）を決定し、これが非イメージ容積マイクロプローベの較正ベクトルとなる。これら数学的結果はメモリに記憶され、基本的ソフトウエアと共に新しい試料に適用される。
プローベの臨床的作動を次に述べる。較正された装置が訓練セット以外の容積素子（新しい容積素子はｋで示す）内の与えられた病理Ｃの範囲を決定するために使用され、応答ベクトル（Ｒ_k）が容積素子ｋに対して、および応答（Ｒ_ik）のいくつかは人工的応答（例えば医学的記録からの付加的データ、例えば性別、人種など）であるが、これらが装置によって決定され、データ処理装置１１２に入力され、容積素子ｋに対する病理ＣのスコアＣ_kが、関連ベクトル（ａ）と関数的応答ベクトルＦ（Ｒ_j）との積、すなわち、Ｃ_k＝Σａ_jＦ（Ｒ_ij）として得られる。従って較正された非イメージ容積マイクロプローベを病理学的状態Ｃ_kが不明の容積素子ｋに対して使用すると、容積素子ｋ内の病理学的状態Ｃの直接かつ自動的な検査と診断とが可能となり、観察された応答ベクトルに対して内蔵された数学的装置が作用する。
この技術の訓練をうけた人には、本発明の非イメージ容積マイクロプローベが複数の各種病状Ｐ_m、ここにｍは特定の病状を示す、の診断のために較正可能であることが理解されよう。このように使用するとき、複数の病状の診断のための較正は、ｉを応答または特定形式の人工的応答のバンド幅、ｊを訓練セット内の容積素子または試験片、Ｐ_mjを試験片ｊの病状ｍのスコアとしたとき、前述と同様にして、ｊの訓練セットと、応答Ｒ_ijと、スコアＰ_mjとが得られる。前述と同様に較正時に、特定の病状ｍに対して多数の関連ベクトル（ａ_m）を得る。較正された非イメージ容積マイクロプローベの作動時に上述関連ベクトル（ａ_m）は関連マトリックス｛ａ｝で置換えられ、その素子はａ_jmであり、非特性試験片ｋに対する機能的応答ベクトル｛Ｆ（Ｒ_k）｝はマトリックス｛Ｆ（Ｒ_k）｝で置換えられ、その素子はＦ（Ｒ_imk）であり、診断結果はベクトル（Ｐ）_kで示され、その素子はＰ_mkであって、関連マトリックス｛ａ｝と機能的応答マトリックス｛Ｆ（Ｒ_k）｝との積として与えられる。従って、１組の診断状態が確認されて適切な応答用訓練セットがこれらのマトリックスを作るように処理されると、各状態に対する診断結果が新しい試料に対して、容積素子応答に関して簡単なマトリックス作業によって自動的に計算される。
本発明の分析方法の実際的実施例において、つくられた相関関係は同一応答、または少なくとも部分的に重なる応答、例えば、限定された波長バンドの特定のセット内の検知された放射の大きさを、異なる病理症状のために使用する。従って、応答（Ｒ_k）（素子Ｒ_ikを有する）のベクトルが必要とされ、これは診断記録Ｐ_mkを得るために容積素子ｋからの応答の最少数のセットを含む。マトリックス｛ａ｝は関連変換マトリックスと名付けることができるが、これは１組の測定可能の値（または観測値）を別の組の数または値の組に変換するもので、これが所望の病理学的スコアとなされる。このことは、関連する変換マトリックス｛ａ｝をベクトル、すなわち機能的応答ベクトル｛Ｆ（Ｒ_k）｝に乗算して応答ベクトル（Ｒ_k）の診断スコア（Ｐ）_kベクトルへの変換を与える。
注目すべきことは、光軸方向（ｚ軸）の複数の隣接する容積素子をプローブすることによって、深さｚの関数としての病理ｍのスコアＰ_m（ｚ）をプロットして関連病理の浸透深さを求めることができる。同様に、ある区域の病理学的状態の人工的３次元イメージは、ｘｙ平面（非イメージ容積マイクロプローベの光軸に直角な平面）内の多数の隣接する容積素子について前述手順を繰り返すことによって得られ、グレイまたは色をそれぞれの容積素子に付することによって、診断されたスコアＰ_m（ｘ，ｙ，ｚ）を得ることができる。
前述のように、容積プローベが局限された区域からの応答を集めるから、試料内の「病理勾配」をプロットする本発明の方法は病気の組織内の成長過程を明確とし、この方法と各種環境組織との間の複雑な関係を明らかにする。
上述により明らかとなされた相関変換方法は未知の試験片に対して診断的または解析的情報を、訓練セットの該訓練セット内の診断的または解析的データの独立的決定についての光学的応答に関連せしめて、与えるもので、ローゼンタール（Rosenthal）によって、人工的に均質な試料内では良好に作用するが、試料は信号対ノイズ比を適切とするためには寸法が過大である。本発明によれば、類似の方法ではあるが、著しく小さい生体の容積素子に対して良好な相関関係を与える。従来のスペクトロスコープ法、例えばアルファーノ（Alfano）は病的組織のスペクトルまたは光学的応答を健全な組織の光学的応答と比較して、目標組織の診断結果を得ることを試みている。この方法は感知性が低く、装置は頑丈で生体の外科的適用に不適当であるが、これは装置と検査される組織との間に大きい寸法差があることによる。本発明は上述した相関変換方法を使用することにより、目標組織内のスペクトル応答と任意の実在の（健全なまたは病理学的）組織の応答との比較を意図的に避けるものである。単一の特定の組織は対象物に生ずるすべての変化を表すことができないものであり、複数の対象物間の変化はスペクトルを変形せしめ、このことが従来技術における病理の診断結果の信頼性を失わせる。さらに、本発明による相関変換アルゴリズムの一部としての、非光学的応答と光学的応答との組み合わせは、病理の完全に人工的なモデル（訓練セット）を設け、これは従来の技術に示されなかったものである。小さい容積素子に対する光学的応答の空間的フィルタリングと組合わされた本発明の新規な手段は、生体組織の状態の診断の予測を可能とする、著しい効果を奏する。
検知された光学的応答の強化された情報の内容はデータの組を解析するに有用であることが知られている別の処理レジメン（ｒｅｇｉｍｅｎ）によっても観察されている。すなわち、例えば特定の病状を評価する変換Ｔを求める上述した特定の関連レジメンよりも、ピーク合致、スペクトル回旋解析、スペクトル比例合致、自己標準化のいづれかによる変換を行ってよい。フーリエ変換解析、判別解析、線形単変数および多変数回帰解析、主要素解析および神経解析がある。上述実施例においてこれらの方法を適用して試料と貯蔵したデータの組とを比較し、または上述した誘導方法による貯蔵した変換Ｔを適用してもよい。
本発明によって得られた光学的応答の強化された局部情報の内容は状態の判別または識別を可能とするもので、量、例えば病状の明確なまたは確立された識別を与えるものでない。実際、僅かな相違、過渡的な代謝または循環系効果およびその他の状態が収集されたスペクトルデータに現れる。従って、検知された状態は火傷、壊死、炎症、組織の回復、移植組織片の回復、移植組織片の拒絶反応、傷害、癌、前癌状態、良性の増殖、良性の形成障害、腫瘍の１つ以上の組があって、特定の化合物の存在または集中があるとき、化合物が生ずる代謝物または代謝産物、治療用または禁止されている薬剤およびその代謝産物、およびその他の病理または病理状態がある。さらに、非生物学的材料または純粋化合物が使用されたとき、その応答は多様の物理的または物理化学的現象、例えばスペクトル変位、偏光性変化、一時的の偏位、スペクトル偏位、ゼーマン（Zeeman)分割、スターク（Stark）分割、位相の偏位、周波数のずれ、及び照射に関連して放射する光の強度の変化など、がある。
収集された光の性質も試料および光学系によって変化し、１つ以上の散乱した照射、伝達される照射、弱化された照射、反射した照射、ラーマン分散をした照射、照射によって刺激された蛍光、照射によって刺激されたマーカーおよび治療学的蛍光がある。基本的照射は広いバンド幅の光源でも、狭いバンド幅の光源でも、実質的に単色の光源でも、光放射ダイオードでも、レーザまたは周波数および／または振幅変調形式であってもよい。
例示的装置
特定の実施例についての説明として、図６Ａ、図６Ｂは膣鏡としての本発明の応用例を示す。
図６Ａにおいて、本発明の非イメージ容積マイクロプローベ２２０が通常の膣鏡２１０の患者側ダブテイル部に取付けられ、その照射および収集経路は膣鏡の対物レンズ経路に組み合わされ、従って膣鏡を見る婦人科医師は特定の組織の診断的スコアが所望される区域を目視し特定することが可能であり、区域は観察した表面およびその下方のある深さの区域を含む。この装置において膣鏡の有効作動距離は約３０ｃｍであり、光学的ヘッド２２０は膣鏡のハウジングに整合し、取り付けられて、膣鏡との安定した整合を保証し、小さい操作鏡が検査ビームを照射し受け取る。操作スティック２０１と連結された鏡とによって非イメージ容積マイクロプローベの光学的経路が操作可能となされるが、この光学的経路は通常、膣鏡の視野内にあって視野と重なっている。光学的ヘッドの設計は各側からの装着を可能として婦人科医師の利き手に適合させることができ、コロプローベ（商標名）が婦人科医師の使用する空間に侵入することがなく、生検用鉗子のように装置を使用することを妨げない。装置の残りの部分は約５ｍの長さの光ファイバで光学的ヘッドに連結される。これは装置のかさばる部分を遠く離すことを可能とする。
作動時に婦人科医師は予め較正した非イメージ容積マイクロプローベを使用する、すなわち、装置はそのメモリ内に前述した相関マトリックス｛ａ｝を有し、これが子宮頸部内の目標容積素子から集めた光応答と相関し、病理学的症状、非限定的に例えば、炎症、回復、高または低程度の鱗状上皮障害、または新生物の可能性を検査する。婦人科医師は非イメージ容積マイクロプローベを病理学的症状が疑わしい所望の区域に指向する。婦人科医師はさらに人工反応を求めてもよく、すなわち、年齢などの非光学的情報、閉経後であればその長さ、閉経前であれば月経サイクル中の期間、その他の非本質的な医学記録的な情報を入力させてよい。これら人工的な応答は別の変数に対応するもので、相関変換が作用する値となる。婦人科医師は次に、非イメージ容積セイクロプローベによる対象区域からの所望の応答の登録を開始し、これは疑わしい病理組織の深さに関するｚ方向走査を含む。装置は観察された応答をサンプルし、保持する、または局部的位置から複数のサンプルを自動的に取る。非イメージ容積マイクロプローベが手動的または自動的に必要な数の応答を取ると、相関変換が応答ベクトルに作用してこれを病理症状に対するスコアのベクトルに変換するが、これに対して装置は較正されている。これはプロセッサ１１２内で行われ、プローベでサンプルされたそれぞれの容積素子ｋに対して関数応答（Ｆ（Ｒ_k））のベクトルが計算され、これにメモリ１１４内にあって非イメージ容積マイクロプローベの較正時に求めた相関変換マトリックス｛ａ｝が乗算される。
組織の容積限定強化信号収集装置の１つの原型が子宮頸部の癌の生検および子宮頸部の異常の識別的診断のために改良された。この装置は商標名コルコプローベ（ＣorpoＰrobe^TM）として販売され、図６Ｂに装置１０″′として示されており、診断用非接触医学的スペクトロ写真測定装置となされている。装置１０″′は、健康の各種状態の組織のスペクトル的特性を、例えば自動蛍光およびスペクトル・バックスキャタ測定を行うもので、容積素子の大きさは一辺が数百ミクロンまたは大となされ、膣内鏡の作動距離は代表的には３００ｍｍとして婦人科医の使用を容易としている。測定モードおよびデータ処理は以下の図面を参照して説明する。
図６Ｂはモジュール２２０の詳細を示す。複数のファイバー２０２が各種のソースすなわち検知器素子を連結しモジュール内に位置決めし、各種の位置スイッチおよびモータつき制御部が照射および収集ファイバー組立体を所望の焦点位置に維持し、試験片内における相互の重なりを制御して、選択されたプローベ容積を図３Ａないし図３Ｃに示すように限定する。光学的ヘッド２２０内のリレイ鏡組立体２２１がこれら素子を光学的経路内に連結し、各種光源および素子を別個に維持して、１つ以上の照射源の点滅を制御し、収集された光が干渉なしに検知組立体に導かれることを可能とする。曲がった連結鏡が共通の前面対物組立体としてアナライザーおよび光学経路目視のために設けられる。注目することは、基本的光源およびリレイすなわち連結ファイバに関し、すべてのビーム形成およびビーム指向素子は反射性で、色収差および回折は防止される。光源をそれぞれのリレイレンズに連結する各種ファイバーは比較的大径で、例えば１００−３００μｍであり、大開口の光源として作用する。ファイバーの端部はステップモータで横方向運動、および前進、後退して目標組織内の焦点深さの調節も可能となされている。
図６Ｂには装置１０″′の主要構成要素として光学的ヘッド２２０以外にスペクトル光源、スペクトル測定部、制御コンピュータ２４０、および解析ソフトウエアが示される。
コルコプローベ（装置１０″′）とコルポスコープとは波長選択照準鏡２３０で光学的に連結され、鏡２３０は操作スティック２０１で操作され、視野を妨げることはない。これは装置の不作動時に婦人科医の膣内鏡の操作が妨げられることを防止する、すなわち、膣内鏡は装置が取付けてない場合と同様に操作可能であり、目視的および機械的に邪魔にならない。作動時には装置は押しボタン操作によって照準または測定モードとなる。操作スティックは操作者が膣内鏡の視野内でマーカービームを使用して標本点を選択することを可能とする。そこで、測定モードが選択される。標本点が選択されると、装置の照準が固定され、深さ走査が目標点の上２．５ｍｍから下２．５ｍｍの範囲で行われる。
照準光は点灯状態で、従って正確な生検を選択された場所に行い得る。また、多数の生検を行う場合は光学的ヘッド内にマイクロフォンを設けて、それぞれの試料を取ったときに声でその都度識別できるようにする。
装置は４つの光学的チャンネルを有し、子宮頸部の各部について実施することを可能とする。照明チャンネル２３１が内部照射源からの光を子宮頸部に送り、目視データを戻すが、目視可能な別の影響を与えることはない。白色光チャンネル２３２は広バンドの５３００°Ｋの光を使用し、スペクトル後方散乱測定を可能とする。赤色光６３５ｎｍのチャンネル２３３がマーカービームを与える。これは目視可能の明確なスポットをつくり、照準を可能とするが、自動的追跡制御フィードバックループとして使用できる。３３７ｎｍのＵＶチャンネル２３４が蛍光を励起せしめ、後方散乱測定を可能とする。図６Ｂには、７８０ｎｍの第５のチャンネルも示され、スペクトル特性が測定される容積素子の位置の測定を可能とする。望ましい実施例において、この機能は赤色チャンネル２３３が行うようになされる。
図６Ｂは装置の概略図である。いくつかの光源による広いスペクトル範囲の光が使用されるから、屈折素子は光学系に使用されず、屈折素子に関連する２次スペクトルという問題は生じない。さらに、この光学系は通常の膣内鏡の付属品収納箱内に収納可能に包装できる。以下の説明は一般的に図６Ｂの左から右へ、および上から下に向かって行う。
光学的ヘッド２２０の主要素として、ミラーＭは放射ビームを対物レンズから約３００ｍｍ離れた子宮頸部に送り、必要なビーム操作部が設けられる。ミラーＭは概略的に、間隔をおかれた短い細線を有する斜めの太線で示される。さらに光学的ヘッドは、波長選択的ビーム混合器（２色性鏡）を有し、これは細線のない斜めの太線で示される。他の素子として、励起チャンネルのための深度スキャン機構と距離検知器とがある。
トランスミッタ・ブロック２５０が励起レーザー２５１（例えばレーザー・サイエンス社、ＶＳＬ−３３７ＮＤ−Ｓ）と、５３００°Ｋの白色光源２５２（例えばウエルシュ・アリン社、Ｍ２４Ｅ００１）とを含む。励起出力エネルギ測定モニター２６１と、走査単色装置２６２（例えばスペクトログラフ社製のモデルＭ４７９のマノスペック１８）が背景散乱白色光を解析する。励起源は窒素レーザーである。これは他の形式でもよく、１つ以上の励起波長を持ってもよい。
窒素レーザーは例えば２５パルス／秒で励起してよく、その５ｎｓパルスの間に白色光の照準および整列用光源がコンピュータ制御により独立にパルス放射を行う。
レシーバ・ブロック２５０は、照準および位置監視チャンネル源２５３例えば６３５ｎｍレーザーダイオードと、位置監視レシーバ２６１と、３３７ｎｍバックスキャタ・レシーバ２６２と、蛍光スペクトル分析器２６４、例えばアクトンスペクトロ（Acton Spectro 150）および強化ＣＣＤ検知器（パッケージモデルCCD 567 MGE）を有する多チャンネル分析器（プリンストン社（Princeton Instrument）社）を含む。
制御コンピュータ２４０が、例えばナショナル・インスツルメント社製のソフトウエアを使用して、各種副組立体の作動を総合する。コンピュータはシステムの作動を制御し、数値化し、生データを将来の分析のために記憶する。さらに、制御コンピュータ２４０のプロセッサとメモリは図５のプロセッサ１１２とメモリ１１４の機能を行う。
図７は本発明による光学的プローベ・モジュール３００の別の実施例を示す。モジュール３００は前述基本的光学ビーム限定素子を収容する単一のハウジング３１０内に配置され、入力及び出力光ファイバ３１３、３１１によって装置の照射および検知部分にそれぞれ連結される。装置３１０はｘｙｚステージに取付けられ、コンピュータが入力ビーム、スペクトル選択、装置の試料上でのステップ運動、および受取った照射の分析、例えばそれぞれのプローベに対する数百の測定の分析の記録、を短い時間で行い、試料全体についてのスペクトル形状の図面を与える。
図８は本発明による、初期癌検査用の非イメージ容積プローベを示し、癌は粘膜組織に始発したもので、装置は体内空所の上皮粘膜内の新生物からの自己蛍光信号を検知し、下方の基質からの干渉信号を除去する。図８の実施例は２つの波長、３３７ｎｍと４６０ｎｍの自己蛍光を検知する。照射器８１２は３３７ｎｍのパルス窒素レーザーで、４６０ｎｍのダイ・レーザーモジュール８１３を有する。シャッター機構８１４がコンピュータ８４０で制御されて２つの励起波長を切換え、シャッタ機構８１５が、長波長光学的遮断フィルタ８２６を４６０ｎｍ励起の場合にコレクタ光学経路に入れる。光学的フィルタ８２６は、４６０ｎｍより長い波長の蛍光を通過せしめるが散乱光が収集スペクトル判別器８２７と検知器８２８に入ることを防止する。光学的フィルタ８１７は３３７ｎｍ励起放射を阻止するが、長い波長の蛍光は通過せしめる。光検知器８８２が励起レーザーの出力を監視し、収集された信号の各パルスの比較を与え、これはレーザー照射器出力の変化を示す修正信号によって行う。蛍光の強度は、照射パルスの強度によって定まり、該パルスは約５ｎｓ（ナノ秒）の存続時間を有し、電気的パルスストレチャ８３１、８３２が蛍光の短いパルスによる出力電気信号を長くして、信号プロセッサが各パルスのエネルギを正確に決定し得るようにする。この装置のスペクトル広いバンド幅は、色収差を正確に制御することを必要とし、全反射性光学素子の使用によって達成される。光を効果的に走査モノクロメータと光ファイバ８３２とに連結するために使用される鏡８２６、８３４を非軸パラボラ素子とする。光学的ヘッド８１６は長い作動距離と高い数値の開口を有するから全反射性顕微鏡対物レンズとする。光ファイバ８３２がヘッドへの励起照射と検知器光学的経路内へのヘッドからの蛍光とを連結する。照射および収集の光学的経路はビーム分割器８１０が行う。
さらに、この装置は望ましい実施例において視野ストッパとして、多数モードファイバ８３２の端部が対物体８１６に近接して配置され、第１および第２の視野ストッパとして作用する。この配置は図６Ｂの実施例と異なり、これは別の多数モードファイバが第１および第２の視野ストッパとして設けられる。
図９Ａおよび図９Ｂは照射組立体の変形例を示す。複数の入力伝達ファイバ３１３ａ、３１３・・・が半径Ｒの円筒形形状のまわりに螺旋状に配置され、各ファイバの面は先行するものから短い距離Ｌだけ偏位しており、その出力は軸線方向Ａとなされる。半径Ｒの円筒は例えば大開口の収集ファイバ、または筒、リングなどの機械的素子であってよい。その他の組合わせは当業者に容易である。多数のファイバ３１３からの出力ビームは単一の対物レンズ３０１により試料３２０のそれぞれのプローベ容積区域に合焦される。図９Ａは２つのファイバ端部３１３ａ、３１３ｂからの出力ビームを示し、その外方端（１、２として示す）はそれぞれ、試料内の別個のプローベ容積に合焦される。図９Ｂは対応するプローベ容積の区域内の試料の詳細を示す。それぞれの対応するプローベ容積３４０ａ、３４０ｂ・・・は半径Ｒ′＝｜ｍ｜Ｒで示され、｜ｍ｜は対物装置の拡大倍率である。さらに、各プローベ容積は、ｚ軸に関して偏位しており、プラグ状のプローベ容積の周りに螺旋形に側方に僅かに変位しており、ｚ軸偏位はｍ²Ｌで示され、Ｌはもとの伝達ファイバの軸方向ステップ間隔である。従って、ファイバの固定配列は試料３１２内の複数の異なる深さにサンプル採取プラグを配置する。これは固定的であり、ファイバ端部と対物レンズ３０１との間に一定の間隔を与え、組織の異なる層内のサンプル採取は正確で、装置３０１の安定性とは実質的に無関係である。この特性は組織の深さ解析スペクトル分析の再現性を著しく高める。端部鏡の実施例において照射および集光組立体は良好な焦点を達成し、プローベ端部は対象物間隔を限定し、光学系の一部を形成する。
各種光学的形態が、望ましくない上方信号の効果的な除去を伴って非イメージ容積プローベ形態を達成する。図１０Ａは一つの実施例を示し、照射および集光ビーム４４′、４８′はそれぞれ本質的に平行となされる。この場合、平行視野ストッパＦＳが集光窓の幅を限定し、交差角度が容積素子の寸法と縦横比に影響を与える。
非イメージ容積プローベ装置の別の実施例において、照射および集光ビームは交差してよく、また共通の視野ストッパＦＳを使用してもよいが、共通の対物レンズ組立体を使用する。これを図１０Ｂに示す。ここで、光源１２と検知器２４とがそれぞれ斜めに指向されてストッパＦＳと交差するが、対物組立体２１はその明瞭なアパーチャの異なる部分ａ、ａ′が照射と集光とに使用される。バッフルＢが分割された対物開口の２つの明確に区分された区域を規定する。フィールドストッパＦＳの試料１８内のイメージにおいて、２つのビームは交差して、安定的に整合する分割共役容積素子を限定する。別の通常の対物組立体の開口分割法も使用可能であり、例えば小さい鏡を使用して別個の光学的経路をつくり、２つの別個のフィールドストッパを通して対物レンズの別の位置に導くようにしてもよい。
別の実施例として対物組立体に複数の開口すなわち瞳部を設け、間隔をおかれて配置された瞳部を照射および検知に使用する。図１０Ｃ、図１０Ｄはこの実施例を示し、非対象に交差するが干渉を防止するビームを使用している。対物体の開口を単純に分割すると、分割された２つの部分の隣接する分割部が深度解析に有効でなくなるから、マスクＭを対物体１６内に設けて瞳部をＮ組の直径的に対向する副瞳部（２Ｎ個）の対（Ｐ_na、Ｐ_nb、・・・Ｐ_nn）に分割し、各対は１つの自己結合ストッパ、例えば図９Ａ、９Ｂに示すファイバ端つきストッパに連結されている。これで、散乱によって生ずる混信は最小となるが、対物体１６の直径だけ間隔をおかれたものとすると、交差ビームによる深度解析は最大となる。Ｎ組の瞳部が任意所望の配列に配置され、Ｎ個の読みが同時に得られる。図１０Ｄは瞳部のマスクＭの配置を示し、これは瞳部の組をレンズ上に限定する。マスクした瞳部を有する単一の対物体でそれぞれの対物体を代替してもよいが、これには複雑な整合作業が必要であるが、収差の影響は小とある。重要なことは、それぞれの対物小レンズをマイクロレンズとしてよく、マイクロレンズは内視鏡などの小器具に対する空間的および焦点的制約に適合する。内視鏡としての実施例を図１１に示す。
本発明のさらに別の実施例として第２の、または別のフィールドストッパが分散素子と組合わせて使用され、ホログラフ的または屈折対物レンズの残留色収差を修正する。通常、広いスペクトルバンド幅蛍光同焦点顕微鏡のための最良の対物レンズは色収差に対して良好に修正されている。これらは約３００ｎｍないし１０００ｎｍ以上の広い範囲のについて一定倍率の良好なイメージをつくる。しかし、この良好なレンズも過大な「２次スペクトラム」をスペクトル範囲の一部に含む。２次スペクトラムはレンズの位置に関係的なイメージの軸方向位置の波長依存的ずれである。大きいフィールドストッパでもイメージのずれは２つの悪影響すなわち、（１）変位したイメージから始発する焦点外れの光束は、急速にフィールドストッパより大となり、エネルギのロスがある、（２）同焦点状態のロス（ＦＳ₁およびＦＳ₂）によって背景識別の低下および深さ識別能力の低下が生ずる。部分的にこの理由により、前述装置は本発明の広スペクトルバンド幅装置の反射性対物体に依存している。しかし、ビーム分割器の一部として分散素子を使用することによって、第２のフィールドストッパＦＳ₁を第１のフィールドストッパに共役する正しい位置に配置することができる。図１０Ｅに示すように収差補正分散素子ＤＥは集められた光をそれぞれのビームλ_iに対して別々の位置に配置する。それぞれのビームλ_iは対応するファイバー端部ＦＳ_iに連結され、これが第２のフィールドストッパとして作用してそれぞれのλ_iに対する正しい共役位置に配置されている。分散素子は、例えばホログラフ的に形成された素子、プリズムまたは従来の伝達または反射格子とする。
本発明によるプローベの別の実施例として、内視鏡その他の接触または内部遠隔検知応用例がある。この実施例を図１１に示す。この場合、照射ファイバと受取ファイバとはそれぞれ長い本体５００を通り、（これは通常のカテーテルでよい）、イメージヘッド５１０に到達する。イメージヘッドは本体またはカテーテルの端部に位置する。ヘッド５１０は活性焦点合わせ光学系、例えば１つ以上のロッドレンズとし、プローベ容積の深さに合わせることができる。望ましくは、内視鏡としての例えば図９Ａに示す実施例においては、光入力は、照射ファイバ５１３ａ，・・・の別個の１つに与えられるが、これらは装置の外部であるからイメージヘッド内の光学系の運動を必要としない。この装置は堅く完全に内蔵したものとすることができ、組織表面に対して滑らかに曲がった接触面を呈する。広いスペクトル幅が必要でなければ、回折ロッド（グリンレンズ（GRIN lense））が光ファイバに有利に連結され、簡単な光学的連結が可能となり、短い焦点距離は人体内の組織に対する内視鏡操作を容易とする。図は複数の螺旋形に配置された入力光ファイバからの光を受けるレンズ５１４を示す。
上述実施例のそれぞれにおいて、プローベ容積は照射およびイメージ用ビームの交差によって限定され、大きい信号強度を与え、刺激、散乱、反射、蛍光、および組織の陰の区域からあつまる光は効果的に除去される。大きい照射ストッパがプローベ容積内に所望の強さの照射を与え、良好なスペクトル測定を行うことができる。
本発明の各種実施例において、部分的に有利なものもある。これら実施例としては、照射および収集光学系が反射性、下方二重性、スペクトル変形軽減性のものがある。さらに、照射および収集フィールドストッパが物理的に同一素子であるものもあり、収集ビームが共通のフィールドストッパを通った後に照射ビーム経路から分離されるものもある。別の実施例では多数モードの光ファイバを照射フィールドストッパとして使用する。位置の変化する対象物を検査するに有利な実施例として、フィールドストッパを照射および収集光学系のそれぞれの光軸に沿って制御された併進運動を行うようにする。対象物を光軸に沿って運動せしめてもよい。
本発明は特定の望ましい実施例に関連して、及びいくつかの例示的な使用方法を説明したが当業者には理解されるように、形状および細部に関する各種変形例は、本発明の精神および範囲内において実施可能である。本発明を理解すれば、改変例、変形例は容易であり、これら改変例、変形例は請求の範囲によって限定される本発明の範囲内である。Field of Invention
The present invention relates to a method and apparatus for obtaining spatial differential analysis information from a specimen by analyzing the results of the interaction of electromagnetic radiation with the specimen, in particular using the data generated in such an instrument. The present invention relates to a new and useful apparatus and method for obtaining diagnostic information in an organism from a test piece. This is accomplished by spatially constraining the search electromagnetic beam to achieve maximum power density in a small volume element and limiting the sensed received response to substantially the same volume element.
Background of the Invention
There is a strong need for a device that can automatically provide rapid diagnosis of, for example, cancer, disease or other damaged tissue. In particular, there is a need for a device that can accurately diagnose the size and stage of cancer growth or other damaged tissue. Currently, in the medical field, specific pathologies and abnormalities are generally determined by analyzing biological tissue by visual analysis and biopsy. Various biochemical images are used, and various pathological optical reactions are used to identify biochemical tissues. However, these prior arts have serious drawbacks.
For example, it takes a lot of time to analyze a tissue taken out by biopsy of a tissue in a laboratory. Furthermore, a biopsy only determines the characteristics of a representative specimen removed from the tissue. Therefore, a large number of excisions must be routinely performed to obtain a complete specimen. In addition, biopsy is an error in sampling and diagnosis. Magnetically tuned images give good results, but are expensive and, as an important drawback, small pathological symptoms cannot be detected at an early stage of development.
As a technique used for tissue analysis in the medical field, there is a fluorescence technique. Laser induced fluorescence uses a laser tuned to a specific wavelength to excite the tissue to generate secondary wavelength fluorescence, which is used to diagnose tissue properties. Fluorescence usually originates from either molecules present in the tissue or molecules introduced into the tissue as discriminating molecules.
Although the mechanism of the fluorescence response by UV excitation of biological tissues has not been fully elucidated, the fluorescence properties of tumor formation appear to reflect both biochemical and morphological changes. For example, automatic fluorescence spectrum monitors reflect biochemical changes in organisms, such as changes in the relative concentrations of nicotinamide adenine dinucleotide (NADH) and flavin. Increases in mucosal concentration and changes in capillary action are typical of changing spectral recordings.
The major molecules in biological tissues that contribute to fluorescence emission in response to near-UV excitation at 337 nm are tryptophan (390 nm radiation), elastin (410 nm) and collagen (300 nm) chromogenic elements, NADH (470 nm), flavin (520 nm) And melanin (540 nm). However, there is a shift in peak position and a change in the overall waveform with respect to the pure compound in the tissue. Therefore, the radiation of the UV beam to the sample is performed at a sufficiently short wavelength and the presence of a contribution to the tissue is determined from the response recorded at the wavelengths listed above.
Hemoglobin has an absorption peak of 400 to 540 nm, and both oxyhemoglobin and hemoglobin have strong light absorption at 600 nm or more. Blood flow also affects the observed emission spectrum of elastin, collagen, NAD, NADH. Other compounds that exist in the tissue that absorb the emitted light and change the shape of the detected emission spectrum include myoglobin, porphyrin, and dynecretide coenteam.
As another general background, neoplasmia has a high level of NADH because its deformation pathway is primarily anaerobic. The inability of a cell to increase its (NAD + / NADH) ratio upon assembly is a characteristic of deformed cells associated with its growth control drawbacks. The value of the ratio of (NADH− / NADH) is an indication value of the metabolic capacity of the cell, for example, an indication value of the ratio between the glycolytic action and the gluconeogenic action. Surface fluorescence has been used to measure relative values of NADH both in vitro and in organisms. The emission spectrum obtained from individual myocytes is thought to originate from mitochondrial oxidized flavin protein, and the blue fluorescence is consistent with NADH from mitochondria.
Collagen, NADH and flavin adenine dinucleotide are considered to be the main fluorescence measuring methods for large intestine tissues and are used for spectral analysis of the fluorescence spectrum. The error between the appropriate value and the measured value is similar to the absorption spectrum of a mixture of oxidized and reduced hemoglobin, and the residual is due to the presence of blood.
U.S. Pat. No. 4,930,516 shows that fluorescence is used to distinguish between cancer and normal tissue, and the shape of the visible emission spectrum from cancer and normal tissue is substantially the same. Specifically, the cancer tissue has a different intensity peak position and is shifted to the blue side. For example, the specification shows that a distinction between a known healthy organization and a problematic organization is achieved by comparing the spectra of the healthy organization and the problematic organization. According to the specification, a tissue spectrum is generated by exciting the tissue with substantially monochromatic radiation and comparing the fluorescence generated for at least two wavelengths.
US Pat. No. 5,042,494 shows distinguishing between normal and cancerous tissue by changing the excitation wavelength and observing the difference in the shape of the visible fluorescence spectrum. U.S. Pat. No. 5,131,398 describes (a) a single or substantially single color about 315 nm below the visible band, specifically about about 315 nm to distinguish cancer from normal or mild tissue. It shows using fluorescence at 215-315 nm, specifically 300 nm, and (b) comparing the resulting fluorescence at two wavelengths of about 340 and 440 nm. Although distinct color differences in heavy tumor tissue are diagnostically useful, this method cannot distinguish between normal, malignant, benign, tumor, deformity, abnormal growth, inflammation, and infected tissue. The inability to make these esoteric distinctions in diagnosis makes it almost impossible to select an appropriate treatment. Although the simple proportion, difference and comparative analysis in the patent specification promises development as a useful tool in cancer research and stimulates tissue status indicators, there is a need for an accurate and robust medical instrument. .
As is apparent from the above, spectra obtained from biological tissues are extremely complex and difficult to elucidate by standard peak comparison programs, spectral convolution analysis or comparative spectrum analysis. Furthermore, spectral excursions only complicate spectral analysis. Finally, optical responses from laser fluorescence and other tissues usually cannot be depth analyzed, because these optical or electronic instruments combine signals from the target tissue through the entire tissue volume.
US Pat. No. 4,017,192 shows a technique for determining abnormalities, including cancer, in multicellular biomedical specimens, which overcomes the problems associated with the complex spectral response of living tissue. In this specification, optical (transmission or reflection) response data from living tissue is determined for a large number of specimens and a large number of wavelengths, and a correlation equation is formed by determining several examination wavelengths from the correlation of these optical responses. Select a set of constants. A correlation equation is determined for the normal tissue in relation to the optical response at the selected wavelength and the state of this tissue is predicted. However, in order to obtain a good solid correlation, the specification seeks a uniform sample that excites the tissue and does not include the optical properties of the underlying tissue. Therefore, the method of the specification cannot be applied to an organism in contrast to the present invention.
In a study using a single fiber depth probe at Photomedicine's Wellman Laboratory, Schomacker has shown that autofluorescence of in vivo human colon polyps features four different states: Found to give indications of normal, benign tumors, precancerous conditions and malignant neoplasms. Reference: authors such as SchomackerLaser surgery and medicine(12, 63-78); 1992; Gastroentcrology (102, 1155-1160 (1992)) In addition, Schomacker uses a multivariate linear regression analysis of the data to distinguish whether a tumor is a neoplasm. However, the observation of mucosal abnormalities using this technique is substantially impaired by signals from the submucosa, which accounts for 87% of the fluorescence observed in normal colon tissue Depending on the submucosal collagen, a device that identifies the depth of the source improves performance.
Accordingly, there is a need to obtain an effective and accurate device that can test specimens, particularly biological specimens, to obtain identified signals from limited volumetric elements within the specimen, and these There is also a need for a method of automatically processing data to automatically provide simple diagnostic information about the volume element.
The main object of the present invention is to induce an interaction between electromagnetic radiation and a limited controllable local volume element and to analyze the sample with spatially limited response observed in the small volume element And to provide equipment.
The object of the present invention is weak, such as when there is a volume element of material present below the adjacent plane or surface of the specimen to be analyzed, or material present above the plane and which emits an interference signal, or There is a means for analyzing a volume element of a material that emits a spatially covered signal.
An additional object of the present invention is to measure the response of an unrelated volume element in the tissue to the excitation beam to characterize and / or pathological state of the biological tissue and convert the response to a known pathological response. It is to provide a means of determining automatically in association or combining pathological responses with external medical data.
Yet another object of the present invention is to obtain biodiagnostic information of tissue that is directly visible or optically accessible by direct observation or by a rigid or flexible optical path such as a laparoscope or endoscope. .
It is a further object of the present invention to analyze or detect a range of cancerous, diseased or other damaged tissue with high accuracy and low cost.
It is a further object of the present invention to monitor tissue and determine whether an organ or tissue graft is viable.
It is a further object of the present invention to measure in vivo oxygen irrigation, hemoglobin, other metabolites, and tissue or blood chemistry.
Yet another object of the present invention is to monitor the temporal or spatial distribution of drugs, particularly those used in photodynamic therapy.
Yet another object of the present invention is to analyze tissue volume elements whose size is clinically important to the physician.
These and other objects will become apparent from the following summary.
Summary of the Invention
In a broad sense, the present invention provides an apparatus for eliciting and detecting a response to radiation from a specimen, eg, a contoured area of tissue, which intuitively provides a strong and pure, ie undiluted response. Although particle beams have been found to be significantly effective for quantitative microanalysis of materials (eg, chemical elements and metallized microstructures), they can elicit responses to lower energy emissions and more transparent media such as life This is significantly different from the case of complex devices such as organic materials in the device or chemical reactions in fluids. For example, both acoustic (eg, compression wave) radiation and photonic radiation are associated with a number of noise introduction defects such as scattering, mode conversion, absorption and re-radiation, a number of related or similar effects, such as such radiation. Collected responses are diluted, impure, filtered, and otherwise substantially from irrelevant noise from spatially adjacent areas or from physically related but substantially irrelevant interference materials. It can be changed. The present invention solves this shortcoming by a probe that stimulates and collects the response of volume elements such as tissue layers, local growth, or reaction volumes, which are detailed according to the active procedure. This is because the stimulating beam, such as an illumination beam, has a limited illumination distribution, most of which is outside the first area, and the collection efficiency of the device that collects the response to the stimulus is similar for the second area. And is used to limit the volume element to be tested across the first and second areas. Thus, the volume element is limited by overlapping spatial distributions in stimulation and detection sensitivity.
As an illustrative example of understanding the invention, the illumination of a sample and the collection of light from the sample will be described, but the terms “light”, “irradiation” or “radiation” will be used. However, these terms include various forms of electromagnetic radiation in the specification and claims, including beams, focal lights, other forms, various spatial distributions, field stops, apertures and focus adjustments. The element may be used and includes acoustic radiation.
In order to more fully describe the present invention, certain terminology is set forth. The present invention contemplates the use of a range stopper, which is large compared to the resolution of the illumination and collection path objectives, but is used to limit the local volume element where the response is collected. Applicants believe that the most useful quantitative limitation of the present invention is the enclosed power magnitude and the contrasting spot size. In the absence of diffraction, the image is accurately predicted geometrically, but there is an aberration effect. The comparative spot size is the comparison between the geometrically predicted image size and the image size when diffraction is properly taken into account, or the image is accurately measured in the presence of diffraction effects and residual aberrations It is a comparison with what was done. The enclosed power is the fraction of the total optical flux within the image surface, which is limited to the stated limits, eg, the geometric image. Furthermore, the answer varies with the position of the image with respect to the principal axis of the optical device, so if precisely defined, the definition includes the position where the answer is specified. This is defined to be in the plane of the field stopper. In this specification and claims, the terms “large field stopper”, “field stopper larger than diffraction limited spot”, and “field stopper larger than the classical resolution of the objective lens” are arranged so that the point objective has a size of the field stopper. When the image is at the position of the field stopper, it is large compared to the image of the point object formed by the associated fully modified objective lens.
“Volume microprobe”, “Volume microprobe shape” and “Weak confocal shape”
1) An arrangement that uses radiation to identify the sample,
a) using a pair of field stoppers in the illumination and collection path, which field stopper is larger than the classical solution of the field stopper of the associated objective lens;
b) the field stopper is at least partially coupled via the normal volume element of the sample;
c) Identify the common volume element using the observed radiation.
2) The shape of the illumination and collection field stopper is physically the same.
What is a volumetric probe?
1) Probe with a small volume, or
2) Use any shape that emits radiation to identify the sample,
a) the volume element from which the information is extracted, limited to the partial volume of the irradiation and observation path;
b) This distinguishes it from the first radiation part outside the volume element,
c) the volume element is smaller than the total volume of the sample;
d) Predetermined and at least partial dimensions and position determination of the volume element is possible, enabling effective identification of the position within the sample.
Similarly, the terms “optical” and “radiation” include electromagnetic, acoustic, optical and radiative, and “volume element” refers to a local volume limited by optical shape.
In general, the device of the present invention operates by collecting optical responses from limited volumetric elements, and this collection of responses forms a “record”, which is permanent or short-lived. “Record” may be an electrical signal from a light detector or detector processing circuit, may be a visible display on a display screen, and may be a mathematical value or a memory or hard recording device measurement. Good.
In the following description, it is assumed that the ideal medium, i.e. scattering or refractive index of the medium, does not substantially affect the propagation of light.
As a typical device, the field stoppers of each of the two optical assemblies are conjugated to provide the required optical response through the volume element. The first optical assembly images a field stop that selectively transmits a beam from a light source or other radiation source to a volume element. The second optical assembly collects light or radiation originating from the target volume element and transmits the light or radiation to a detector to analyze the interaction between the first transmitted beam and the volume element. The first optical assembly includes a field stop that provides selective illumination of the selected volume element, and the second optical assembly limits the collection of radiation or light emanating from the target volume element into the collection optics. A second field stopper. In addition, a controller is provided, which in accordance with some embodiments of the present invention provides a depth relative to the surface of the selected volume element test strip for each image area of the two optical assemblies. Control and maintain each coupled state and adjust the sampled volume element as a common coupling point for both assemblies. The general dimensions of these field stoppers are always large for sampling or processing volumetric elements of physiological interest and are therefore larger than the classical solution of objects. The image of the field stopper formed by the respective objects of the two assemblies in the sampled volume element is substantially equal to the luminous flux passing through the limited (geometric) non-diffracting image of each field stopper. Enclose everything (eg 95% or more) and make appropriate corrections for optical and specimen loss. The size of the field stopper is selected to limit the sample volume element containing physiologically significant tissue, such as at least a few cells.
In one embodiment of the invention, the illumination and collection optics are the same element, and a filter device or beam splitter is used to separate the illumination and collection beams.
The conjugation of the illumination and collection field stopper is usually achieved by a confocal arrangement, and an image of the field stopper is formed by an optical device (illumination and collection device), and the optical device is placed over the object. The confocal arrangement when the field stopper is a small pinhole (depth determination is controlled by the diffraction effect) is shown in the prior art. For example, U.S. Pat. No. 3,013,467 shows a bifocal, or confocal device, having two optically conjugated pinhole field stops, and the contrast of the image formed. Is improved by eliminating substantially all light originating from outside the limited focal area, i.e. by controlling the lateral field of view and minimizing the effective depth of the area surrounding the image portion Is done. The data obtained from these single points is less practical, and in the case of a confocal microscope, the desired high-contrast two-dimensionality is usually obtained by the relative response of multiple points obtained by scanning the sample laterally. Video is obtained.
According to the present invention, the field stopper defines a volume element having a size larger than the limited diffraction spot that illuminates and collects the object, and the data obtained from the single volume element includes a new spectral signal, which is diagnostic information. Used as. Although the confocal microscope provides an image of the target surface by convolution of the optical response obtained from a number of closely spaced points on the specimen, the present invention is shown as a non-imaging microprobe and the specimen specimen Important analysis data is obtained from separate volume elements as specimens. That is, the amount of absolute optical response energy (signal) obtained from a finite volume element is optimized, but in conventional confocal microscopes, the response from many ultramicroscopic objects is enhanced. Contrast is the desired purpose. Because the goals are quite different, the confocal microscope uses at least one field stop, which is smaller than the resolution of a conventional object, and readings from multiple adjacent points are obtained. The field stopper of the present invention is significantly larger than the size of the diffraction limited spot of the object, and a useful response is obtained from a single volume element. The use of multiple field stoppers results in a significantly larger volume limited response, radically changing the collected signal / noise ratio of the light, allowing for event detection and rapid measurement due to its optical properties, This was not even observed with a confocal microscope. By comparison, the intrinsic depth identification in confocal microscopes, i.e. the depth of field, i.e. the depth of the focal volume element limited by diffraction, is determined by the wavelength of the illuminating light and the properties of the interaction between the light and the On the other hand, the inherent depth identification of the present invention depends only on the geometric variables of the optical device.
The optical response from the selected volume element has important information about the volume element, such as chemical, morphological and generally physiological information. If the sample is spectrally simple, its optical response is analyzed by conventional spectral techniques that reconcile peak values and perform convolution removal or intensity determination for one or more selected wavelengths. An example of such an apparatus is determining the uniformity of a mixture of multiple compounds. However, if the sample is a complex biological specimen as described above, the spectral complexity observed with conventional devices does not give a meaningful diagnosis. When such biological specimens are analyzed for subtle characteristics, surprisingly according to the related application, the optical response obtained from the separate volumetric elements is spatially filtered and transformed. Alternatively, a diagnostically significant result can be obtained by performing the above-described transformation in relation to data obtained non-image microscopically.
According to the method of the present invention in this regard, a specific target pathology training set or specimen is first selected, which preferably includes at least 10 specimens. First, the optical response from a well-defined volume element in the specimen is collected and recorded. An element of the same volume as the specimen is used as a non-image volume fine probe of the present invention and biopsied. That is, a histopathological analysis of the used volume element is performed in the pathology laboratory, and the specimen is graduated on an arbitrary scale (eg 1 to 10), which indicates the degree of pathology C (eg specific cancer). Show. Scale C_j(Here C_j(Indicates the scale value for sample j in the training set) must be as accurate as possible, so use the average of the multiple values (for the same volume element) determined by the pathologist. Therefore, the formula Σa (_je) ・ F (I_ij) = C_jWhere i is the spectral window (usually 5-50 nm), F (I_ij) Is a function of response strength and other characteristics for the measured spectral response in window i for volume element j. The function F may be the response intensity in the window, in this case F (I_ij) = I_ijOr F (I_ij) = (DI_ij) / (Dλ) / (I_ij), Where (λ) is the wavelength of the medium in window (i) and other functions. Coefficient a_ieIs a related conversion coefficient for the pathological scale C, and can be obtained from the above equation by a well-known mathematical technique such as a multivariable linear regression analysis method. In this analysis, the value C_jThe number of windows i required for a faithful link between the pathological chair and the optical response of the path is minimized and the associated coefficient a for the path scale C_ieIs required. The response forming the space vector of optical window i (I_ik) Is limited to a limited number of individual elements from samples other than the training set described above, and the vector F (I_ik) To convert operation (a_{I c}) And sum Σa (_{I c}) ・ F (I_ij) = C_kIs obtained, and the amount of the target pathological scale C of the volume element used as the sample is determined.
Exemplary devices of the present invention are useful for turbid materials, such as biological tissues, water, plastics, coatings, and chemical reaction processes, and are particularly advantageous for in vivo and in vitro testing of biological tissues. is there. In order to obtain an internal analysis, the present invention is operable with existing types of rigid and flexible endoscopes. In the present invention, the first and second optical elements may be connected to an endoscope, a laparoscope, or an arthroscope by an optical fiber.
[Brief description of the drawings]
For an understanding of the nature and objects of the invention, reference should be made to the following detailed description and accompanying drawings. In the drawing
FIG. 1 is a block diagram of a volume inspection apparatus according to the present invention.
FIG. 2 is a schematic view of a volume inspection apparatus according to the present invention.
FIGS. 3A, 3B, and 3C show the optical path of the device and the alignment to limit the observable volume elements.
FIG. 4 is a schematic view of another embodiment of the volume inspection apparatus according to the present invention.
4A is a schematic diagram of an actual apparatus implementing the schematic diagram of FIG.
4B and 4C are diagrams showing optical paths of the apparatus shown in FIG. 4A.
FIG. 5 is a schematic view of a multi-wavelength embodiment of a volumetric inspection apparatus according to the present invention.
6A and 6B are views showing an embodiment suitable for a colposcope.
FIG. 7 is a diagram showing an embodiment suitable for performing three-axis scanning of a sample.
FIG. 8 is a diagram showing an example of detecting a neoplasm limited to the epithelium of muscle tissue.
9A and 9B are diagrams showing an apparatus in which stationary irradiation light performs Z-axis scanning.
10A, 10B, 10C, 10D, and 10E are diagrams showing another embodiment of the irradiation and focusing device.
FIG. 11 is a diagram showing an embodiment as a uterine examination apparatus.
Detailed Description of the Invention
FIG. 1 shows a volume inspection apparatus 10 according to the present invention, in which a volume element in a sample 18 is irradiated and radiation emitted from the irradiated volume element in the sample 18 is detected. The radiation from the volume element is altered in many ways with respect to the impinging radiation and is referred to as the “optical response” or simply “response” from the volume element. These transformations retain the unique characteristics of the sampled volume element and possess chemical, morphological, physical, and physiological characteristics. The optical response is shown as electromagnetic radiation including reflection, transmission, selective absorption, various types of scattering, various types of luminescence, especially fluorescence.
The apparatus 10 includes a radiation unit 12 that generates radiation, a first light limiting unit 14, a directing (objective) optical system 16 (these are collectively referred to as an irradiation optical system), and passes through the light limiting unit. The beam formed in this manner irradiates the sample 18. Further, the apparatus 10 includes a collection optical system 20, a second light limiting unit 22, and a detection unit 24. The collection optical system 20 collects and detects radiation from the irradiated sample 18, which is a second one. It passes through the light limiting unit 22. In addition, the apparatus 10 includes a controller 26 that is coupled to illumination and collection optics or a portion thereof to adjust the position where illumination is directed and collect responses from selected volumetric elements, for example The probe is directed to the respective depth area or to the volume element to be tested. This is achieved by providing field stoppers in the irradiation and

collection limiting portions

14 and 22, details of which will be described later.
During operation, the irradiation unit 12, the limiting unit 14, and the directional optical system 16 irradiate the volume element in the sample 18. The irradiation unit 12 generates radiation and directs it to the limiting unit 14. The restrictor 14 selectively transmits a portion of the radiation to the directing (objective) optical system 16, which focuses on the light restricting field stop on the volume element contained in the sample 18.
The collection optical system 20, the light limiting unit 22, and the detection unit 24 jointly detect radiation directed to the collection optical system from at least a part of the irradiated volume element. The collection optical system 20 forms an image of the volume element contained in the sample 18 and irradiated on the field stopper of the light limiting unit 22. The light limiting unit 22 selectively transmits the radiation from the collection optical system 20 to the detection unit 24. The detector 24 clarifies the characteristics of the electromagnetic radiation, such as the intensity of one or more spectral lines or the area of the spectrum.
Due to the combined limitations of illumination and response collection, all responses from other than the subject volume element are spatially limited, and the ratio of the signal from the detected volume element to the background is significantly increased.
The control unit 26 spatially adjusts the positions of the directional optical system 16 and the collection optical system 20, irradiates and detects a plurality of volume elements included in the sample 18, or adjusts the position of the light limiting field stopper. The same effect is obtained. According to another aspect of the present invention, the control unit 26 irradiates the secondary area area of the sample 18 with the irradiation beam and the detection beam. This is accomplished by changing the beam axis of the apparatus 10 relative to the sample 18 and directing the volume element in the sample 18 to various positions displaced from directions perpendicular to the axis of the radiation beam. At this time, the control unit 26 sets the position relative to the sample 18 of the apparatus 10 to a position different from the position orthogonal to each other.
FIG. 2 shows the physical arrangement of the elements of the device 10 according to the invention together with a sample. The illustrated apparatus 10 comprises a light source or irradiation unit 12, an irradiation coupling body 32, an irradiation unit coupling optical system 34, a first light limiting unit 14 including a first field stopper 36, and

lenses

38 and 42. The imaging means shown as illumination objective 16,

lenses

38, 42 form a front assembly of illumination objective 16, and volume element 46 contained in sample 18 is input radiation beam from the first light restrictor. An opening stopper 40 for irradiating with 44 is provided. FIG. 2 further shows a collector 20 composed of lenses 52 (objective assemblies) and 56, an aperture stopper 54, a second light restricting portion 22 including a second field stopper 58, and a detector connecting portion 68. A detector 24 that captures and analyzes the return radiation 48 emanating from the volume element 46.
An irradiation coupling part 32 associated with the irradiation coupling optical system 34 provides a path for electromagnetic radiation, which passes from the radiation part 12 through the restriction part 14. The detector coupling unit 68 and the detector coupling optical system 60 guide electromagnetic radiation from the second light limiting unit 22 to the detection unit 24. The connecting portion 32 and the connecting portion 68 are typically optical fibers having a diameter of 50 μm to 200 μm, or light guides. Usually, the optical fiber or the light guide is set to a multimode, that is, the

coupling portions

32 and 68 can transmit electromagnetic signals in a wide wavelength range. The irradiation coupling optical system 34 and the detection unit coupling optical system 60 typically include a lens or an equivalent element, and match or match electromagnetic waves passing between the

coupling units

32 and 68 and other parts. The lenses of the

coupling optics

34, 60 are precisely aligned to minimize power loss when electromagnetic radiation exits or enters through the

couplings

32, 68.
The illustrated first light limiting section 14 includes a field stopper 36, which may be various limiting bodies used to limit the field of view in the optical system. In this specification, the field stopper may be any shape, for example, a circle, an ellipse, a rectangle, a groove, or a square opening, which limits the field of view. Furthermore, it may have a certain shape and size, and may be an adjustable size and shape, such as an adjustable iris, usually having an aperture, such as an optical fiber having a limited effective cross-sectional area. May be an element that functions as a field stopper. In operation, the field stopper 36 selectively blocks light entering the optical system 16 by shielding light. In one embodiment, the reference (parallel) light beam of the first part of the illumination assembly is directed to the optical system 16, which acts as an illumination target and is axial without requiring adjustment of the position of the light restrictor 14. Moved to. This adjustment is performed under the control of the control unit 26, and the focal position of the beam 44 is changed in the axial direction to irradiate each selected volume element.
The objective optical system 16 includes a first aperture stopper 40 that limits the aperture of the objective lens and has an aperture defined by the edges of the

lens assemblies

38, 42 within the limited test volume 46 in the sample 18. Direct the light beam to. If provided, the aperture stopper 40 serves to limit or limit the cross-sectional area of the electromagnetic radiation beam projected onto the sample 18 by the lens 42. The lens 42 operates so that the beam of radiation 44 converges in the narrow image area of the field stop 36 in the focal area of the sample 18. The volume of the sample 18 on which the beam of radiation 44 is focused includes the volume element 46 to be detected, details of which will be described with respect to FIG.
The intensity of the input radiation 44 is maximized in the focal area of the optical system 16 due to the light limiting section 14 and the focusing ability of the directional optical system 16, and the aperture of the limiting section 14 is in the lateral direction and the intensity of the input radiation 44 in the sample 18. Decreases axially away from the focal area.
When the input radiation 44 illuminates the volume element 46 to be examined, this radiation interacts with the material in the sample volume defined by the field stopper 36. A secondary light beam originating from the sample irradiated by this interaction is directed in all directions (4π steradians). This secondary beam is the response of the sample to incident radiation, but reflects, scatters and absorbs material within the sample volume (observed as a lack of response in a particular part of the spectrum), as well as a specific fluorescence divergence. There is. There is radiation 48 collected as part of the optical response from the sample, and anything that reaches the collector is collected by the detector 24.
The collection assembly 20 collects radiant energy 48 emanating from the front objective lens 52, the second aperture stopper 54, and the volume element 46 to be examined, and the maximum cross-sectional area of the volume element is perpendicular to the beam to the field stopper 58. The relay lens 56 is imaged. In one embodiment, the lens 52 has a focal length equal to the distance from the aforementioned cross-sectional area, so that the radiation 48 can be collected and redirected as parallel rays. The aperture stopper 54 selectively allows a limited size of the radiation beam from the light focusing objective lens 52, and the second lens 56 images the cross-sectional area of the volume element 46 in the second light limiting unit 22.
The illustrated second light limiting portion 22 includes a field stopper 58. Field stopper 58 represents any aperture commonly used in optical devices. In operation, the collection assembly 20 images the volume element 46 on the field stop 58 and precisely defines the maximum cross-sectional area of the volume element perpendicular to the axis of the collection optics. That is, the

field stoppers

58 and 36 are paired via the volume element 46. The light that has passed through the field stopper 58 reaches the detector 24 through the coupling optical system 60 and the detector coupling body 68. Identifying light from the outer area of the volume element 46 by spatially filtering the illumination beam to provide maximum illumination within the volume element 46 and spatially filtering the light from the volume element 46. Make it possible.
The effect of limiting the volume element from which radiation starts is limited by a field stopper will be described with reference to FIGS. 3A, 3B, and 3C shown as sectional views of the optical system.
FIG. 3A shows a part of the irradiation optical system, and the light passing through the irradiation field stopper 36 reaches the optical element 71 (corresponding to the irradiation object 16 of FIG. 2). The limit lights 200 and 201 from the irradiation unit 12 in FIG. 2 pass through the point A of the field stopper 36, and the limit lights 202 and 203 pass through the point B of the field stopper 36. The limiting

lights

200 and 202 pass through the point C of the opening stopper 40, and the limiting

lights

201 and 203 pass through the point D of the opening stopper 40.

Lights

200 and 201 converge at point A ′ on the image plane 250, and

lights

202 and 203 converge at point B ′ on the image plane 250. The points A ′ and B ′ are shown as the limit points of the image 36 ′ of the field stopper 36. If the field stopper 36 is circular, points A 'and B' indicate both ends of the diameter. The limiting light 200, 201, 202, 203 is further transmitted into the sample 18.
According to the geometric optical approximation without diffraction, the light 200, 201, 202, 203 shows the geometric limit of the input radiation 44. When there is no scattering in the sample 18, the input radiation 44 is limited to the area surrounded by the points H, B ', C, D, A', K. Radiation that passes inside the field stopper 36 passes through the aperture stopper 40 and then through the volume element 46, the limits of which are indicated by points A ', F, B', E. If the field stopper 36 is circular, the volume element 46 has a biconical shape, and the two cones having vertices F, E have a common bottom surface 36 '. The volume element 46 is simply an area where the radiation 44 is not blurred, as shown in FIG. 3B.
At position 36 ′, radiation is maximal and falls off rapidly outside volume element 46. In FIG. 3A, the dimensions of the field stopper 36 and its image 36 ′ are exaggerated in comparison with the diameter of the aperture stopper 40 and the distance between the irradiation object 71 and the virtual plane 250. Accordingly, the outside of the irradiated volume 461 decreases in proportion to the square of the distance between the center L of the field stopper 36 ′ and the center G of the volume 461 when compared to the inside. The radiation 44 acts on the sample 18 to start the radiation. The emitted radiation changes depending on the nature of the interaction. For example, when the emitted radiation is fluorescence, the emitted radiation is emitted to the entire spherical surface (4π steradian) surrounding the source G. In some cases, the light is absorbed by the light, and the light is scattered in the opposite direction. The intensity of radiation from any source G is proportional to the intensity of incident 44 at that point.
A condensing device will be described separately from the irradiation device. Since the optical law is essentially reversible, the irradiation device and the light collecting device are conjugate. This conjugation is evident in FIG. Radiation from volume 461 'is collected and detected by detector 24 (FIG. 2), but corresponds at least in part to volume 461 of FIG. 3A when considering illumination and collection simultaneously.
As shown in FIG. 3B, the radiation from the volume 461 ′ reaches the detection unit 24, but passes through the collection opening stopper 54 and the collection field stopper 58. Radiation from the sample 18 that reaches the detector is included in the radiation 48. In the absence of diffraction, the light 300, 301, 302, 303 exhibits the geometric limits of the collected radiation 48. In the absence of scattering in the sample 18, the collected radiation 48 is contained within a volume 461 'defined by points H "", B "", C ", D", A "", K "". All of the radiation 48 passes through a point inside the field stopper 58, which passes through the aperture stopper 54, whose volume section 46 'is defined by points A "", F "", B "", C "". Through. When the field stopper 58 is circular, the volume element 46 'is a biconical shape, and two cones having vertices E "", F "" have a common bottom surface 58' to form a biconical shape. Yes.
Radiation 48 through the field stopper 58 passes through the image 58 ′, but starts from the sample 18, eg, point G ″ ′, below (in the figure) the image 58 ′. The radiation from above the image 58 ′ passes through the image 58 ′, ie all collected radiation is collected at the collection aperture of the object 72, ie inside the volume 461 ′ and at the aperture stop. 54, and secondly, radiation reaching the detector 24 passes through the field stopper 58. This second condition is that the collection efficiency of the collector is a distance from the source, eg, G ″ ′ and the field stopper. Is approximately equal to the square of the distance from the image center L ″ ′.
In FIG. 3B, the relative dimensions of the field stopper 58 and its image 58 'are exaggerated relative to the diameter of the aperture stopper 54 or the distance from the object 72 to the image plane 350. In practice, the angle C ″ ′ F ″ ′ D ″ is approximately equal to the angle C ″ ′ E ″ ′ D ″, and there is a small loss in accuracy in calculating efficiency or radiation, but the angle C ″ ′ L ″ ′ D ″ can be substituted. The sine function of the angle “1/2 {C ″ ′ L ″ ′ D ″}” indicates the working numerical aperture (NA) of the object 72, and the nominal collection angle of the object relative to the light passing through the aperture stopper. To express. In FIG. 3B, the light source is shown as 461 ′, which is outside the volume element 46 ′, significantly below the plane 350, for example, the angle of the field stopper 58 ′ from the point G ″ ″ is the center of the image 58 ′. It is smaller than the angle from L ″ ′. Thus, the light emitted from the point G ″ ′ is within the solid angle collected by the object 72, but does not propagate through the field stop 58, because it must first pass through the image 58 ′. The collection efficiency is a solid angle ratio, that is, a ratio of the square of the distance from the light source point G ″ ′ to the center of the image 58 ′. In the light emitted from the light source point in the sample 18 between the surface 350 and the object 72 outside the volume element 46 ′ to the image 48 ′, the image 58 ′ has a smaller solid angle than the aperture stop, so this light source For the point, the area of the aperture stopper through which the light passes is reduced and the collection efficiency is similarly reduced.
With respect to the light source point in the volume element 46 ′, the light rays emitted within the actual collection angle of the object 72 reach the detector 24. That is, the volume element 46 'is the only volume element of the sample 18, and the radiation 46 emitted therefrom is not blurred.
Thus, in the diffraction-free optical device of the present invention, blurring limits the volume element from which a significant signal is detected.
FIG. 3C shows a volume element 46 ″, limited by conjugating illumination and collection optics, and the viewing angle φ (50 in FIG. 2) is not 18 ° C. Depth discrimination is improved, common field stoppers and common pairs are shown. The signal is somewhat weaker than that using an object, because the volume 46 in Fig. 3A and 46 'in Fig. 3B correspond substantially and incompletely. It consists of the overlapping parts of the elements 46, 46 'through which the field stopper is conjugated. In general, the field stoppers are overlapped with the same center as shown, and the apex of the unconjugated bicone is removed to form a small element, which has a crossed cone-like shape, and the optical response from now on is enhanced Is done. The irradiation and collection device is moved so that the field stopper image is less symmetrical, eg, strip-shaped, wedge-shaped, etc., and is aligned with or oblique to the sample being observed. In this case, the total signal is significantly reduced, but the proportion of the detection signal from the sample is increased and the content of useful information is enhanced.
The apparatus 10 uses

conjugated field stoppers

36, 58 to limit the field of view within the sample 18 in the lateral and depth directions. Sample 18 defines a sample volume element tailored to the desired characteristics of the device. To those skilled in the art, the

field stoppers

36, 58 are conjugated via a volume element 46 ″ as shown in FIG. 3C, but are not at the same focal point, and the respective images, ie, the sections 36 ′, 58 ′ in FIG. 3C, do not overlap. In general, the optical path, the position and shape of the field stopper and the objective element may be aligned, which define the volume element and define the position and direction, for example the shape. The strips, wedges, meniscus, cones, etc. are caused by the intersection of irradiation and collection areas.
As will be appreciated by those skilled in the art, the present invention includes a non-image volume, fine probe device, rather than two field stoppers being fully conjugated, and the sensing volume is limited by split conjugate, i.e., partial matching of field stopper images. Thus, the above-mentioned bicone overlaps partially. In the preferred embodiment of this apparatus, the illumination and collection optics are parallel to each other and the object is slightly displaced or wedged to form a common overlapping area of the image, but the optical axis of both assemblies is Deviation.
As shown in FIG. 3C, in any of these configurations, the interaction between the incident beam 44 and the volume element 46 ″, ie the volume area common to these light paths, is spatially filtered twice from this volume area. The detected light has a reduced amplitude as a result of illumination and collection distribution, a low level of light illuminating the volume element of sample 18 out of focus, and preferably a focal area where the unselected elements are strongly illuminated; That is, it does not significantly cover the probe volume image, and only a very small portion of the low level light coming from outside the focal material, not inside the selected volume element, reaches the collection optics. That is, the influence of the light emitted from the outside of the common volume element 46 ″ on the detected signal is reduced in proportion to the fourth power of the distance from the common center of the biconical body. This result significantly enhances the return signal collected from the volume element selected by the apparatus of the present invention relative to the return signal collected from outside the volume element.
In terms of size, for example, a biological microstructure having a basic microstructure consisting of cells of a basic size of 1 to 20 micrometers, and a layer or growth process that is 10 to several thousand times larger. The probe device has a size of several tens to several hundreds of micrometers as an irradiation field stopper, and the collection stopper has a size of several tens to several hundreds of micrometers. In an exemplary embodiment, the illumination and collection field stops are between 25 and 500 micrometers, and the magnification of the object is between 1/10 and 1. In an exemplary embodiment, the field stopper dimensions are as described above. A large field stopper is required in an actual optical system.
An image of a pointed object formed by a well-conquered objective will not be pointed. This is because the brightly illuminated central point consumes more than half of the image intensity, and the rest is distributed on the image according to the shape of the aperture stopper and according to the amplitude and phase distribution of the incident light on the aperture stopper. The According to Maxwell's approximate equation, the dimension d ′ = kλ / NA is obtained, where λ is the wavelength of monochromatic incident light, NA is the numerical aperture on the image side of the objective lens, and k is a factor of one digit. is there. As is usual in practical optical systems, when plane or spherical wave incident light is incident on a circularly symmetric well-modified objective lens, the image is a first that surrounds the central maximum with a spiral pattern known to those skilled in the art. The diameter of the blank space is d ′ = 1.2λ / NA, and 84% of the image intensity is within this diameter.
As another example, which is usual in an actual optical system, the incident light is the lowest TEM.₀₀In the case of a laser, the radiation in the image is distributed by a Gaussian function resulting in a normally limited diffraction spot diameter d ′ = 0.64λ / NA, at which the image illumination is about 13.5 of the maximum illumination at the center of the diffraction pattern. %, And the energy of the part is about 87% of the whole. Therefore, the diameter of the aperture stopper according to the present invention is d> kλ / NA, where k is a constant determined by the aperture stopper and the incident light. For the objective lens, aperture stopper and practical values of illumination, d> 2λ / NA, usually d >> λ / NA.
Even a large object image formed by a well-modified objective lens is not a perfect replica as predicted by geometric optics. Careful examination of the edges of the geometric image reveals the effects of diffraction, which can be ignored unless the image dimensions are comparable to the size of the diffraction spot. This is due to the substantial absence of optical forces outside the geometric image. That is, the distribution of optical power in the image plane is a limit value that determines whether the object, for example the field stopper, is small and the diffraction effect dominates the optical performance of the object. For example, when 95% of the optical power from the object reaches the image surface, it becomes a geometric image of the object.
In the embodiment of FIG. 2, selection of the volume element 46 along the optical axis is accomplished by synchronous axial movement of the object front assembly (42, 52). This causes the front assembly of the object to be located at a distance equal to the respective focal position from the selected volume element 46. However, in the case of a new volume element, the sample is moved relative to the two fixed optical assemblies, or one optical assembly is moved relative to the other, and the selected volume element is moved into the two fields. Position it at the conjugate point of the stopper.
Another means of selecting the volume along the optical axis z of the illuminator is another movement of the element, such as the movement of a field stopper or other optical element to reduce the image distance of the object of the illuminator. There is something to change. However, the motion of one of the two optical assemblies must be compensated by the relative motion of the other, for example the conjugate or split conjugate relationship of the two field stoppers in the collecting optical assembly is the selected volume. This is accomplished via element 46.
FIG. 4 shows a modified apparatus 10 'that eliminates the articulation assembly of a non-image volume microprobe, where a common objective assembly illuminates the specimen and collects light along the same axis or path. The apparatus 10 ′ is different by moving the irradiation unit 12, the coupling optical body 34, the beam splitting unit 100, the first light limiting unit 14, the objective 16, the detection unit 24, and the front objective optical element 42. And a controller 26 for sampling the depth volume element. The beam splitter 100 is disposed between the front and rear elements of the coupling optical body 34 and reflects light entering from the direction of the light limiting unit 14, but allows light reaching from the direction of the irradiation unit 12 to pass. The light reflected from the beam splitter 100 is directed to the detection unit 24.
In operation, the irradiating unit 12 generates a radiation beam that travels through the coupling optical body 34 and the beam splitter 100 to the light limiting unit 14. The light limiting unit 14 selectively transmits the radiation beam, and the light reaches the object 16 through the field stopper 36. The object 16 forms an image in the sample 18 in the field stopper opening 36. The light reflected or emitted from the sample 18 is collected by the objective optical body 16 and returns through the same field stopper opening 36 in the light limiting section 14. Therefore, the light limiting part 14 selectively allows only a part of the radiation from the sample 18 arriving at the object to pass through. The portion that passed primarily or essentially contained the response from the volume element 46. The selectively transmitted beam is directed to the beam splitter 100. Beam splitter 100 directs at least a portion of the selectively transmitted beam to detector 24 to record analysis and characteristics. As in the embodiment of FIG. 2, the irradiation source and the light limiting section form an irradiation spot larger than the diffraction limited local intensity in the sample.
FIG. 4A shows another embodiment 10 ″ in which a common objective assembly illuminates the sample and collects light along the same path. The device 10 ″ has a linearly polarized output with a laser, for example a wavelength of 633 nm, as the irradiator. A beam modulation assembly 997 having a Melles Griot 05-LHP-121-111 laser and pulsed laser output to enhance the signal and enable synchronous detection is provided, for example with an incident angle of 45 degrees A polarity-sensing dichroic beam splitting unit 100 made by Reynard Corporation used with 633 nm radiation is arranged to reflect more than 90% of the incident polarized laser radiation, and a coupling lens 913, for example a meleglio The company LA0011 has a focal length of 20 mm, which couples the laser radiation to the irradiating connection 32 and matches the receiving numerical aperture of the connection 32. The connecting part is an optical fiber, for example, 2m long Ceram Optic UV200 / 220A12, with a 200 micron core, a numerical aperture (NA) of 0.12, surrounded by a nylon jacket, At the end is an Augat SMC connector. The optical head has a coupling optical assembly 34 and a field stopper 36, for example a National Aperture stainless steel field stopper with a 100 micron laser cut aperture in the PA-3 adapter. . An objective assembly 16 is provided and these cooperate to illuminate the sample 18. The sample 18 may be an image to calibrate the performance of the apparatus 10 ″, for example including scattering elements dispersed in a transparent medium, and underneath the surface a thread dyed with a dye such as Nile Blue. Place and simulate the absorption and divergence characteristics of small tumors treated with this drug as mimicking a small cancer or inserting a thread soaked in a drug commonly used for cancer into natural tissues such as chicken breast The sample may be simulated, or the sample may be a tumor so treated, the irradiated Nile Blue emits fluorescence concentrated at wavelengths 670 nm and 780 nm, and the optical head is the volume element 46 of the sample 18. Fluorescence generated within is sensed and coupled to an illumination coupling section 32, which illuminates the acceptance numerical aperture of the coupling lens 913, which standardizes the collected radiation, and a dichroic beam splitting section. The beam splitter 100 is adapted to transmit more than 90% of the fluorescence above 670 nm, the transmitted fluorescence being an optical filter 915, for example Schott R68 glass, which is 10 of the scattered 633 nm radiation^FourOne half or less is transmitted, but more than half of the fluorescence is transmitted to the detection photomultiplier 924, for example, a Hamamatsu R928. The electrical output 930 of the photomultiplier 924 is a lock-in amplifier 926, such as an SR350 amplifier from Princeton Applied Rearch. A pulse generator 925 (Hewlett Hewlett Packerd 8003A) is tuned to oscillate at, for example, about 850 Hertz to control the beam modulation assembly and tune the modulation assembly and lock-in amplifier. The lock-in amplifier processes the electrical output 930 of the photomultiplier 924 to display the average intensity on a display and sends a signal proportional to the average intensity to an oscilloscope 926, for example a Tektronix 475. The displayed signal intensity is proportional to the fluorescence emitted from the volume element 46 being measured. The controller 26 moves the optical head 914 in three orthogonal directions so that the fluorescence of various volume elements can be measured.
Specifically, the modulation assembly is an acousto-optic deflector, such as Isomet's 1201E, which includes a 221A-2-39 driver, which deflects the primary and high order deflected when it receives a pulse generator 925 pulse. A next beam is generated, and a zero-order undeflected beam is generated when the output of the pulse generator is zero. The output beam passes from the laser 912 through the acousto-optic deflector 991 to the rotating mirror 992, where the beam is directed to the mode selector 995. The mode selector 995 is, for example, about 800 mm away from the deflector 991 so that the deflected beam entering the mode selector is sufficiently away from the zero-order undeflected beam collision point. Although the mode selector has a sufficiently large aperture, for example about 1 mm in diameter, to allow the passage of the primary beam, the body of the mode selector prevents and blocks the transmission of other modes. The primary beam includes laser radiation, which strikes the second rotating mirror 994 and is directed to the beam splitter 100 via an adjustable iris 996. The iris 996 is adjusted to an aperture of about 3.5 mm as an example. The adjustable iris removes any residual modes that leak through the mode selector 995, and the lowest order TEM widely present at the output of the laser irradiator 912.₀₀Remove any ancillary laser beams that are not in Gaussian mode. This final cleaning of the output of the laser irradiator 912 prevents subsequent scattering by the irradiating optical element from entering the optical path toward the photomultiplier. Thus, the laser radiation entering the optical head 914 is a cleaned pulse having the pulse frequency of the pulse generator 925.
The optical head coupler includes front and

rear elements

341, 342, for example a pair of Edmund Scientific M6387 achromat with a focal length of 17 mm. The subassembly 34 is adapted to the numerical aperture of the output of the illumination coupling fiber 32 and directs the illumination to the field stopper 36, which is, for example, a circular aperture with a diameter of 100 microns with an input illumination of about 30% efficiency. Selectively pass to the back element 38 of the objective assembly. The element 38 is selected, for example, by Melles Griot 01 LAO 028/078 with a focal length of about 31.5 mm and maximizing the coupling efficiency through the aperture stopper 40, which is representative. Is integrated with the front element 42 with a diameter of 8 to 8.5 mm. The front element 42 is one of a set of microscope objectives, and its magnification is determined so that the image of the field stopper has a desired diameter. The forward element 42 is, for example, an American Optical Corp. focal length of about 4 mm and a 0.66 mm NA 44X objective, an infinitely modified focal length of about 8.5 mm, and There is a 20X planar achromatic objective with a 0.5 mm NA, or a 10x objective from Optics for Research with a focal length of about 20.3 mm and a long working distance of about 12 mm with a NA of 0.2 mm. These objectives are used to perform the measurements shown in FIG. 4B, which demonstrates the expected performance of the apparatus 10 ″.
FIG. 4B and FIG. 4C show the results of measurements made with a practical actuator shown as an example in FIG. 4A.
In the embodiment of FIGS. 4 and 4A, the collection and illumination devices are equivalent, and some of the devices shown in FIGS. 3A and 3B are identical elements:

objective lenses

71, 72,

aperture stoppers

40, 54 and field stoppers. 36 and 58 are physically recognized as the same device. In these embodiments, the

field stoppers

36, 58 are automatically conjugated via a common image 36 ', 58' (FIGS. 3A, 3B), which is a light source illuminated without the blur of FIGS. 3A, 3B. It is a normal one like the volume elements 46 and 46 '. In this embodiment, the illumination and collection efficiencies are highest relative to the remote point, eg, G ″ in FIG. 3A, G ″ ′ in FIG. Similarly, the collection efficiency is high in the volume element 46, but this is also the case for the volume element 46'.The light source point 460, for example G, is equivalent to 461 in FIGS. The total efficiency of the collection is roughly reduced, as is the product of both (irradiation and collection) efficiency and a function of the magnitude of divergence for the irradiation, i. Decreasing in proportion to the fourth power, it can be seen that there is a significant decrease for points that are not on the optical axis, in addition to the loss in the sample, as a factor that does not substantially affect the above reason, the collection field Unless due to the limitations given by the topper 58, the total flux of radiation 44 collected along the spherical surface 450 (450 ') starting from the defocused volume element is the volume element 46 (46'). Similarly, it serves almost the same as the background signal for the radiation detected by the detector (24), but this means that the area of the spherical surface 450 'inside the illuminated and radiating volume 461 (461') is image 36 '(58'). However, according to the apparatus of the present invention, the collection field stopper 58 causes the collection efficiency to decrease quickly, so that the total value of the background state from the volume element 461 'is the focus. It does not dominate the signal collected from the area, the volume element not specifically blurred, and its surroundings.
Non-image volume microprobe device

Full width half power depth identification is

Where d ″ is the diameter of the detector field stop image 58 and NA is the image side actuation numerical aperture of the object 72 and is therefore determined by the geometry of the optical device. According to confocal microscopy, the depth analysis Δ is determined by the nature of the interaction between the incident light and the medium when a diffraction-dominated mechanism controls the illumination and collection efficiency, for example, Wilson (T. Wilson ) According to the method of fluorescence confocal microscopy in the Handbook of Biological Confocal Microscopy, JBPawley, Ed., Chapter 11, 113-126, Plenum Press, New York, 1990. , Δ = 2.8λ / NA²Where λ is the wavelength of the monochromatic illumination light, or Δ = 1.4λ / NA when the incident light is coherent.²It has become.
FIG. 4C is a representative two-dimensional view of two small, high-photosensitive, tumor-like artifacts obtained using the apparatus of FIG. 4A. The first sample is a 200 micron yarn (Talon-American Sewing Bee mercerized cotton # 50) dyed with Nile Blue and coated with a thin layer of polymer (Duco Cement) to show that the dye diffuses into the main tissue. It has been prevented. The suture was inserted 500-800μ below the surface of the chicken breast. When excited at 633 nm, fluorescence was observed at wavelengths above 670 nm. The depth analysis was 76μ and the horizontal scan analysis was 25μ. The suture line could be clearly observed. Data processing was minimized. The raw data was processed with a sixth-order rational function to obtain isointensity curves and background constants were removed. The isointensity curve is shown as a thick line with 50% intensity. In another embodiment of FIG. 4, a second sample was used. The second sample is a commercial cotton thread (Coats and Clark # 50) with a diameter of 130μ, treated in the same way with a benzoporphyrin derivative monoacid (BDP-MA) and used for the treatment of tumor photodynamics. It was done. Chicken breasts were soaked in partially phosphatized saline and sealed with plastic film (Dow Handiwrap). The figure is raw data (relative intensity is shown by depth z and lateral scan x). This strong clear signal is possible when staining is used to enhance the signal of a small tumor and requires minimal signal processing useful for surgical procedures. When intrinsic fluorescence is observed in tumor tissue, more complex processing is usually necessary.
In FIG. 4C, the “depth” dimension is along the optical axis direction (vertical direction) of the apparatus. The horizontal or “lateral” direction is perpendicular to the yarn. The difference in function between these two axes is a “horizontal” resolution of 25 μ and a “depth” resolution of 76 μ.
Although there is no direct clinical interest, additional detail signal analysis further improves the measurement. Extend the contour line in the depth direction. The depth analysis is about 50μ greater than the radial analysis, so 50% contour depth is expected to be about 100μ greater than the contour width. The actual measured difference is about 125μ. Also, since the thickness of the yarn is not greater than the depth resolution at the center of the yarn, the observed sample volume is filled with the fluorescence target, but not at the yarn edge. In this connection, a simple convolution analysis calculation is expected to compensate for the cylindrical shape.
In order to minimize the amount of 633 nm laser radiation sent from the device 10 "element to the sensing optical magnifier, the preferred embodiment 10" shown in FIG. 4A uses a thin reflective field stopper aperture carrier, for example at an angle of 2 degrees. So that the illumination that does not pass through is not reflected back into the collection optical path. In addition, the inner diameter of the optical head assembly is threaded and painted with an absorptive diffuse paint to optimally absorb or block light scattered on the wall. A spatial filter is inserted into the collection path between the beam splitter 100 and the optical filter assembly 915 to prevent reflection from the connection at the end of the illumination connection 32 but to pass the returning fluorescence. Like that.
As will be understood from the above description and from the following description, the volumetric micro-inspector of the present invention allows to detect or monitor a wide range of physiological effects or conditions. As an example, there is a need for depth identification optics that monitor skin or tissue grafts. Easily detecting whether a graft is well vascularized is necessary as well as detecting necrotic or rapidly proliferating tissue (recovery) conditions. Since the vascularization state can be measured spectrally in the same manner as various hemoglobins, blood irrigation and these measurements allow depth analysis.
Measuring the consumption of drugs used during the treatment of photodynamic cancer therapy is a particularly important application. One of the current shortcomings of photodynamic therapy technology is that there is no reliable way to determine the amount of drug actually delivered to the cancer. Drugs used for photodynamic therapy are chemical products, some of which become photoactive and toxic when exposed to light of the appropriate wavelength (usually red or near infrared). In some cases, it preferentially gathers in rapidly proliferating tissues. This type of chemical product includes porphyrin derivatives that cause porphyria and produce light sensitive fluorescence. FIG. 4C shows the detection of a benzoporphyrin derivative monoacid as one such drug and shows the results of highly selective spatial sensing when irradiated by the apparatus of FIG. 4A.
Another application is the determination of burned tissue depth and viability. A difficult decision for the surgeon is in determining the location and availability of removal of the burned tissue in the burn procedure. If the area is expected to heal, scarring, recovery time and risk of infection are lower if left unattended. The best evaluation to determine this healthy state is to know the depth of a healthy organization. This is achieved by observing the original optical properties, observing the marker chemicals applied to the dry molt, and the like. Indocyanine green is a fluorescent dye used for this purpose, but is used as a safe and cardiac indicator. When injected intravenously, it is rapidly distributed throughout the body and does not leak from healthy blood vessels. Therefore, by determining the depth below the burn, a healthy blood vessel depth can be determined. Mr Green and his collaborators at Massachusetts General Hospital have patented technology for observing fluorescence excited first in red and then in UV. UV-excited fluorescence is more scattered than red-excited fluorescence, and the depth of the burn is determined by measuring the difference. However, according to the present invention, direct and more accurate measurements can accurately determine the area of intact tissue by placing the volume elements at different depths and observing the optical response.
The present invention relates to illuminating a selected volume element in a sample and detecting light therefrom, the volume element being limited in part by a relatively large aperture source, but the present invention may be of any known type. Irradiation may be used, which provides a clear spatial Z-axis identification (irradiation optical axis) with enhanced signal levels and corresponds to the shape, size or biological characteristics of the tissue layer, and the present invention Applicants have clarified that the use of the present invention provides important spectral response information, and it is possible to use irradiation sources that were previously considered useless for this type of analysis. Further, according to the present invention, the collected spectral information is not simply amplitude or power, but uses the entire range of collected spectral information. For example, FIG. 5 shows a non-image volume microscope, and the irradiation unit 12 includes a plurality of light sources, specifically, a nitrogen laser 101 emits light of 337 nm, and includes a white light source 102, a laser diode 104, and a light emitting diode 106. . Further, FIG. 5 includes a monochromatic scanner 108 and a spectrograph 110. The irradiating unit 12 is a large number of various light sources for inspecting the volume element, and the detecting unit 24 has various devices for detecting or recording electromagnetic radiation from the selected volume element. Typically, the irradiating unit 12 generates electromagnetic radiation having a wavelength in the range from below the ultraviolet to beyond the infrared, and the data processing device 112 associated with the detecting unit 24 detects each or successive spectral information. Further, a signal processing device is provided that performs filtering, addition, time calculation, differentiation, and various processing. Specifically, the data processor 112 performs an analysis, eg, multivariate statistical analysis, on the training specimen to determine an associated transformation matrix, and applies the transformation matrix to a specimen other than the training specimen to obtain a number of responses from the associated response. It also includes means for obtaining a pathological condition.
In operation, the light emitting diode 106 generates red detection or target light and assists in visual identification of general areas within the sample 18 that are illuminated with light emitted from the device 10, providing a target or operating beam, It is easy to point 10 in the target direction, defining and defining the area where the selected volume element to be examined is located. Appropriate beam manipulation devices, such as devices that include a galvanometer-controlled steering mirror that targets an image or feature, and that control one or more steering mirrors in response to displacement are known. The white light source 102 generates light in a wide wavelength range, and the nitrogen laser 101 and the laser diode 104 generate monochromatic radiation having a specific wavelength. For example, the nitrogen laser 101 generates ultraviolet light having a wavelength of 337 nm, and the laser diode 104 emits light having a wavelength of 780 nm. The white light source 102 generates light of multiple wavelengths and is useful for clarifying optical responses including absorption and reflection over a wide range of the electromagnetic spectrum.
The nitrogen laser 101 excites the material in the volume element 46 to generate fluorescence. The amplitude and wavelength of the fluorescence generated from the target volume element has important diagnostic or analytical characteristics of the volume element, and the collector and data analyzer use the fluorescence response to provide pathological information about the volume element. give. The white light source 102 and the laser diode 104 selectively act with the volume element 46 to obtain pathological information from the response to radiation. These responses include scattering, absorption and reflection characteristics. In some embodiments of the present invention, by using the non-image volume microprobe shown in FIG. 2 in conjunction with a plurality of light sources and the detector described in connection with FIG. The angular spatial distribution of responses is used for analytical purposes as well. Examples of this application include continuous monitoring of bacterial growth processes in fluid or gel culture media, or monitoring of complex fermentation processes.
The detector 24 of the apparatus of FIG. 5 includes a scanning monochromator 108 and a spectrograph 110 that analyze the radiation response emanating from the target volume element 46. Detector 24 first sends radiation from sample 18 to spectrograph 110 and monochromator 108. The spectrograph 110 disperses the collected radiation beam into a spectrum for analysis, and the monochromator 108 separates the spectrum of a specific area from the collected dispersed beam and determines its intensity and other characteristics. Subsequent analysis is performed after spectrograph 110 or monochromator 108 has separated a particular wavelength or spectral region. Specifically, the system of the detection unit 24 determines a specific wavelength of light included in the collected radiation and characteristics of the specific wavelength. Characteristics of a particular wavelength include the intensity of radiation at that wavelength, the direction of polarization at that wavelength, if present, and the phase shift at that wavelength. Another characteristic of the collected radiation is the lifetime of the fluorescence when fluorescence is present, the wavelength shift of the emission peak at a particular wavelength.
For control, storage and analysis of detected data, FIG. 5 includes a data processor 112 coupled to the detector 24 and a memory device 114 coupled to the data processor 112. The data processor 112 may be, for example, a general-purpose programmable computer, and the memory device 114 is an electronic storage device such as a digital memory chip, floppy, hard disk, magnetic tape, and read / write compact disk. Data processor 112 may include a read-only memory, which comprises an associated transformation vector or matrix memory, the former being used for automatic diagnosis of simple pathologies and the latter being used for automatic diagnosis of multiple pathologies. Furthermore, a plurality of computers may be provided, a name tag is attached to a set of samples, data given by keyboard input is added, related conversion is performed, stored, updated or converted, and stored in a memory. This will be described later.
In general, the present invention operates to at least partially record, edit, and analyze collected responses. Only a diagnostic prediction of the pathology is given in an inexpensive embodiment of the invention. That is, the device is provided with a memory of an associated transformation vector or matrix for a specific diagnostic state and simply a signal L_ij, And a diagnostic record C for the volume element j_jRequired to obtain the function F (I_ij), Which will be described in detail below.
In a broad sense, the output of detector 24 is provided to data processor 112, which processes the output of detector 24 or stores the data in memory device 114 for later processing. The data processor 112 compares the first data obtained from the detector 112 with the second data from the memory device 114. For example, the data processor 112 compares first data indicative of the inspected material with second data from the memory device 114. According to a preferred embodiment of the present invention, the second data includes a memory of engineering response data, or preferably a mathematical model extracted from the memory, which is a “non-image volume microprobe methodology and operation”. (Methodology and Operation of the Non Imaging Volume Microscope).
The memory device 114 is used to store a large amount of data regarding a specific material. For example, the memory device 114 stores data regarding the characteristics of light acting with a particular type of biological tissue, and the characteristics of light acting with a particular type of biological tissue responsive to excitation at each set of wavelengths of light. Or the spectrum indexed by tissue depth, or complex multidimensional spectral data obtained from conventional observation data.
The storage device 114 stores information related to specific characteristics of light obtained from a biological tissue sample of a specific condition. For example, a ratio of light reflected at one wavelength to light reflected at a second wavelength is determined in connection with the growth of cancerous tissue associated with a known observation, or a surgically relevant condition, such as tissue Thickening one layer, metabolic changes in pre-cancerous conditions, or malignancy, etc. are determined in relation to spectral memory and previous surgical characteristics. That is, the relationship with the annotated or stored digitized spectrum provides a diagnostic decision, and peaks or absorption bands were conventionally required for diagnosis without the recognition of specific individual spectral characteristics. .
Methodology and operation of non-image volume microprobes
According to the prior art, complex and heterogeneous cellular stroma spectral and chemical analysis has been hampered because the response obtained from this object cannot be limited to a highly homogenous area. Numerous microprobes have been developed to handle this problem, and electron microscopes, ion microprobes, and various other devices provide morphological and, to some extent, chemical (usually principle) analytical information, sample point references. Or on a plane basis (for example, an ion microscope). However, these methods require that the sample be placed in a vacuum, resulting in tissue destruction, and these methods cannot be used for analysis of organic materials. Biological microanalysis of biological tissue is different from traditional classical microprobes. In particular, the representative dimensions of the tissue to be identified need not be large, but the dimensions can be manipulated by anyone other than those specially trained in analytical techniques, such as surgeons, process control technicians, and other professionals. It is desirable to require a possible analytical tool. According to the non-image volume microprobe of the present invention, it is possible to carry out fine examination of biological tissues of living organisms and examination of other tissues in their original environment. The non-image volume microprobe has various application examples, some of which will be described below, but the present invention is not limited thereto.
In one embodiment of the present invention, the intensity of the received light for various wavelengths or sets of wavelengths where the response from the volume element is at least a specific indication that the interaction with radiation impinging on the material in the volume element represents at least a specific indication. Indicated in terms or response spectrum. Researchers trained in specific analytical techniques can use this spectrum to recognize or deduct important information about the volume element based on the investigator's knowledge of the incident radiation and the interaction of the radiation with the target material. To do. Directly using various analytical tools, such as software programs designed to perform spectral peak comparisons or spectral analysis, increase the researcher's basic understanding of hidden interactions and target volume elements Provides information on chemical, morphological and physiological properties. According to known basic principles, the data provided by the present invention to the researcher is obtained directly from the device, directly from a well-defined volume element, and the relevant spectrum of light given from outside the target volume element. Responses or interferences that weaken are eliminated. Thus, no background noise is drawn that interferes with the ability to distinguish characteristics within large foreign samples. This ability to obtain a clear spectrum from a heterogeneous sample allows the non-image volumetric microprobe of the present invention to input the collected volume response data into a conventional, relatively simple numerical analysis module as input to a conventional absorption spectrum analysis, scattering Analysis, fluorescence analysis, Raman dispersion and other variables or spectral analysis are possible without the complexity in the case of unclear or insufficient signals.
In another embodiment of the invention, for users who do not have the technical ability to derive meaningful conclusions from the observed raw data, the device is essentially pre-calibrated for specific analytical tasks. . A method for calibrating a non-image volume microprobe is described below.
For ease of explanation, the goal of the method is to target tissue in a certain state, in particular optically visible, eg external skin, in the neck or other endoscopic or laparoscopic accessible spaces. Whether there is a condition in the gastrointestinal tract (starting from the mouth, passing through the esophagus and stomach, rectal examination, large intestine), or various organs in the abdominal cavity accessible by laparoscopic examination The non-image volume microprobe to be diagnosed shall be calibrated. Under these conditions, doctors who have not been trained in spectroscopes looked at suspicious tissue and if color loss or other morphological abnormalities were present, samples from that area were taken and sent to the pathology laboratory for microscopic examination. Determine whether cancer is present, and in the case of cancer, determine its growth stage. The present invention provides an optically obtained diagnostic record that determines the pathological properties of a suspicious target tissue during visual inspection, allowing direct activity if necessary and in any case There is no need to take separate tissues for biopsy. Furthermore, the non-image volume microprobe method of the present invention provides an automatic diagnosis of the tissue observed by a physician, allowing a diagnosis that does not require a pathologist to examine the tissue under a microscope.
In order to calibrate the non-image volume microprobe of the present invention for a particular pathology, a training set of specimens for that particular pathology is selected. Here, the “training set” refers to a group of tissue specimens, and each specimen clearly indicates the state of a test previously performed in a pathology laboratory. In addition, prior to performing a biopsy, the recording of the spectral response is preferably examined using each specimen of the training set and the non-image volume microprobe of the present invention. In this case, the target volume element of the training set (in this case, the tissue is subsequently examined for pathological status in the pathology laboratory) is examined with a volumetric microprobe shown in FIG. Both are irradiated by both a laser UV light source (101) and a wide band white light source (102). The response of the target volume element in specimen j to UV and white light sources is_ujAnd J_ijAnd Here, u and i denote the wavelengths of the central band of the spectral wave of the spectral response to UV and white light excitation, respectively. For example, J_ujIs fluorescent, J_ijMay be a background scattering response. These data are stored in the memory 114 for later use. The training set is used after recording the responses obtained with the non-image volume microprobe, and the pathological determination of each specimen is recorded C_jWhere j is the specimen identification and C_jIs a number selected as a recording scale depending on the condition of the specimen, for example, a scale on a single axis from zero to 10, where 0 is normal tissue and 10 is a completely rooted heavy cancer tissue change . This training set calibrates the non-image volume microprobe and makes it possible to determine in the future whether there is a pathological state of each tissue present in the training set, and therefore the pathological state of the training set. It is necessary to pay close attention to the decision. Desirably, the same sample is blinded microscopically independently by multiple pathologists, and a test strip that can be clearly identified in each pathologist's discussion is used for the training set.
Test piece record C_jIs determined, I previously stored in memory 114_ujAnd J_ijIs used to obtain the relational expression.
Σa_jF (I_ij) + Σb_uF (J_uj) = C_j (1)
The narrow bandwidth wavelengths of the collected responses i and u for white light and UV light, respectively, are typically 5 and 50 nm, depending on the resolution of the sensing monochromator 108 and spectrograph 110.
The choice of function F depends to some extent on the nature of the response received. F (I as the response intensity, i.e. the normal intensity, when receiving a spectral response with little features (i.e. relatively smooth and small with wavelength)._ij) = I_ijOr F (I_ij) = I_ij/ K is obtained, where K is the maximum response in the received spectrum, or the response to the desired wavelength (eg, when water or hemoglobin is present in the biological tissue). When the desired spectrum has sharp characteristics, let λ be the wavelength and F (I_ij) = (DI_ij/ Dλ) I_ijIt becomes.
Data processor 112 then performs a regression analysis, minimizing the number of i and u used to obtain a clear relationship, and determining equation (1) for the associated constant. Using the experimentally obtained equation for j and performing a regression analysis assuming that the related constant is unknown, an answer having the best relationship can be obtained. Minimization gives the smallest number of wavelengths and the response I_ij, J_ujGives a satisfactory relationship to the phenomenon being measured. Significantly more data is collected in the calibration process than is absolutely necessary, and many of these data are related to each other. Mathematically, the minimum set is based on the response of these organizations. Once the minimum set of responses is determined, the subsequent diagnostic use of a non-image volume microprobe allows for a minimum number of responses (eg, a minimum number of responses in a narrow wavelength band) and speeds up processing. To do.
Wavelength and associated coefficient a_jAnd b_uMethods for obtaining a minimal set of are known in the prior art and include multivariate regression analysis and univariate regression analysis. Other statistical methods such as neutral network analysis are also available and can be used for this purpose. This statistical tool is available as a simple software program and is available under the trade name STATISTICA, Statsoft Inc. or Predict (PREDICT, Neural Ware Inc.).
Usually the response to white light and UV light is I_ij, J_ujAs shown. Another response is also used to characterize the volume element 46. Specifically, all responses from the volume element are R_ijCan be shown as That is, R in the memory_ijHowever, there is other information regarding the volume element that was not determined by the non-image volume microprobe described above, but helps to improve the relationship between the observed recording and the pathology to be diagnosed. Such information includes general medical record information, such as patient category, such as, but not limited to, sex, age, race, weight, and the like. Such information is improved in that inclusion of them in the regression method increases reliability and additional artificial response R_ijRecord as. Here, the index i indicates the type of response obtained, indicating whether it was obtained from a non-image microprobe or other means such as an outpatient, a normal person, data, etc.
If the equation (1) that gives the related coefficient is simplified, the following equation is obtained.
Σa_jF (R_ij) = C_j (2)
In the simplified formula, (a_j) Is the related vector (a) for pathology C, and the organized response (R_ij) Is the response vector (R) for the volume element j of the training set._j). Functional response vector F (R_ij) Is the response vector (R_j) Is defined as an ordered function of the response elements. Similarly, the organized score (C_j) Is the pathological score vector (C) for the training set. The method of calibrating a non-image volume microprobe for a given pathology C is therefore a response vector (R_j) And the corresponding pathological score vector (C), and the functional response vector F (R_ij) Is determined, based on these data, the minimum associated vector (a) is determined, which becomes the calibration vector for the non-image volume microprobe. These mathematical results are stored in memory and applied to new samples along with the basic software.
The clinical operation of the probe is described next. A calibrated device is used to determine the range of a given pathology C within a volume element other than the training set (new volume element is denoted k), and a response vector (R_k) For the volume element k and the response (R_ik) Are artificial responses (e.g., additional data from medical records, e.g., sex, race, etc.), which are determined by the device and input to the data processor 112 for pathology to the volume element k C score C_kAre related vectors (a) and functional response vectors F (R_j) Product, ie C_k= Σa_jF (R_ij). Therefore, a calibrated non-image volume microprobe is used for pathological condition C._kIs used for an unknown volume element k, the pathological state C in the volume element k can be directly and automatically examined and diagnosed, and the mathematical device built in for the observed response vector Act.
For those who have been trained in this technology, the non-image volume microprobe of the present invention can be used with a number of different medical conditions._mIt will be appreciated that m can be calibrated for diagnosis of m indicating a particular medical condition. When used in this way, the calibration for the diagnosis of multiple medical conditions is that i is the response or bandwidth of a particular type of artificial response, j is the volume element or specimen in the training set, P_mjIs the score of the disease state m of the test piece j, the training set of j and the response R in the same manner as described above._ijAnd score P_mjAnd is obtained. As before, during calibration, a number of related vectors (a_m) When the calibrated non-image volume microprobe is operated, the associated vector (a_m) Is replaced by an association matrix {a}, whose elements are a_jmAnd the functional response vector {F (R_k)} Is the matrix {F (R_k)}, And the element is F (R_imk) And the diagnostic result is a vector (P)_kAnd the element is P_mkWhere the association matrix {a} and the functional response matrix {F (R_k)}. Thus, once a set of diagnostic conditions is confirmed and the appropriate response training set is processed to create these matrices, the diagnostic results for each condition are a simple matrix task for the volumetric element response for new samples. Automatically calculated by
In a practical embodiment of the analysis method of the present invention, the correlation created is the same response, or at least partly overlapping response, e.g. the magnitude of the detected radiation within a specific set of limited wavelength bands. Use for different pathological symptoms. Therefore, the response (R_k) (Element R_ikOf the diagnostic record P)._mkIn order to obtain a minimum number of sets of responses from the volume element k. The matrix {a} can be termed an associated transformation matrix, which transforms one set of measurable values (or observations) into another set of numbers or sets of values, which is the desired pathology. Score. This means that the associated transformation matrix {a} is a vector, ie a functional response vector {F (R_k)} To multiply the response vector (R_k) Diagnostic score (P)_kGives a conversion to a vector.
It should be noted that the score P of pathology m as a function of depth z by probing a plurality of adjacent volume elements in the optical axis direction (z-axis)._m(Z) can be plotted to determine the penetration depth of the associated pathology. Similarly, an artificial 3D image of the pathological state of an area is obtained by repeating the above procedure for a number of adjacent volume elements in the xy plane (a plane perpendicular to the optical axis of the non-image volume microprobe). And the diagnosed score P by applying gray or color to each volume element_m(X, y, z) can be obtained.
As mentioned above, since the volume probe collects responses from a localized area, the method of the present invention for plotting the “pathological gradient” in the sample clarifies the growth process in the diseased tissue, and this method and various environments Identify complex relationships with organizations.
The correlation transformation method revealed above relates diagnostic or analytical information to unknown specimens and relates to the optical response of an independent determination of diagnostic or analytical data within the training set of the training set. At least, given by Rosenthal, it works well in artificially homogeneous samples, but the samples are oversized to achieve an appropriate signal-to-noise ratio. The present invention provides a good correlation for a very small biological volume element, albeit in a similar manner. Conventional spectroscopic methods, such as Alfano, attempt to compare the spectrum or optical response of diseased tissue with the optical response of healthy tissue to obtain a target tissue diagnostic result. This method is less sensitive and the device is rugged and unsuitable for in vivo surgical applications due to the large dimensional difference between the device and the tissue being examined. The present invention intentionally avoids comparing the spectral response in the target tissue with the response of any real (healthy or pathological) tissue by using the correlation transformation method described above. A single specific tissue cannot represent all the changes that occur in an object, and changes between objects change the spectrum, which increases the reliability of pathological diagnostic results in the prior art. To lose. Furthermore, the combination of non-optical and optical responses as part of the correlation transformation algorithm according to the present invention provides a completely artificial model (training set) of pathology, which is shown in the prior art. It was not. The novel means of the present invention combined with spatial filtering of the optical response to small volume elements has a significant effect that allows for the prediction of a diagnosis of the state of biological tissue.
The enhanced information content of the detected optical response has also been observed by other processing regimens known to be useful for analyzing data sets. That is, for example, conversion by any of peak matching, spectral rotation analysis, spectral proportional matching, and self-standardization may be performed rather than the above-described specific related regimen for obtaining the conversion T for evaluating a specific medical condition. There are Fourier transform analysis, discriminant analysis, linear single variable and multivariate regression analysis, principal element analysis and neural analysis. In these embodiments, these methods may be applied to compare the sample with the stored data set, or the stored transformation T from the guidance method described above may be applied.
The content of the enhanced optical response local information obtained by the present invention allows discrimination or identification of the condition and does not give a clear or established identification of the quantity, for example a medical condition. In fact, slight differences, transient metabolic or circulatory effects and other conditions appear in the collected spectral data. Therefore, the detected condition is burn, necrosis, inflammation, tissue recovery, transplant tissue recovery, transplant tissue rejection, injury, cancer, precancerous condition, benign proliferation, benign formation disorder, tumor 1 When there is more than one set and there is the presence or concentration of a particular compound, there is a metabolite or metabolite from which the compound is produced, a therapeutic or banned drug and its metabolite, and other pathologies or pathological conditions . Furthermore, when non-biological materials or pure compounds are used, the response can be a variety of physical or physicochemical phenomena such as spectral displacement, polarization change, temporal deviation, spectral deviation, Zeeman ) Division, Stark division, phase deviation, frequency shift, and change in intensity of emitted light in relation to illumination.
The nature of the collected light also varies with the sample and the optical system, and includes one or more scattered illumination, transmitted illumination, attenuated illumination, reflected illumination, Raman scattered illumination, fluorescence stimulated by illumination, There are markers and therapeutic fluorescence stimulated by irradiation. The basic illumination may be a wide bandwidth light source, a narrow bandwidth light source, a substantially monochromatic light source, a light emitting diode, a laser or frequency and / or amplitude modulated form.
Exemplary device
As an illustration of a particular embodiment, FIGS. 6A and 6B show an application of the present invention as a colposcope.
In FIG. 6A, a non-image volume microprobe 220 of the present invention is attached to the patient side dovetail of a conventional colposcope 210, and its illumination and collection path is combined with the objective lens path of the colposcope, so A physician can visually identify and identify an area where a diagnostic score for a particular tissue is desired, the area including the observed surface and an area below it at a certain depth. In this device, the effective working distance of the colposcope is about 30 cm, and the optical head 220 is aligned and attached to the colposcope housing to ensure stable alignment with the colposcope, and a small manipulator mirrors the inspection beam. Irradiate and receive. The optical path of the non-image volume microprobe can be manipulated by a mirror coupled to the operating stick 201, which is usually in the field of view of the colposcope and overlaps the field of view. The design of the optical head allows attachment from each side and can be adapted to the gynecologist's dominant hand, without the CoroProbe (trade name) entering the space used by the gynecologist, and biopsy forceps Does not prevent you from using the device. The rest of the device is connected to the optical head by an optical fiber having a length of about 5 m. This makes it possible to move away the bulky part of the device.
In operation, the gynecologist uses a pre-calibrated non-image volume microprobe, i.e., the device has the previously described correlation matrix {a} in its memory, which is the light collected from the target volume element in the cervix. Correlate with response and examine for possible pathological symptoms, including but not limited to, inflammation, recovery, high or low degree of scaly epithelial disorder, or neoplasm. The gynecologist directs the non-image volume microprobe to the desired area with suspected pathological symptoms. Gynecologists may also seek artificial reactions, i.e. non-optical information such as age, length if postmenopausal, duration during menstrual cycle before menopause, other non-essential medicine Record information may be entered. These artificial responses correspond to other variables, and are values for which correlation transformation acts. The gynecologist then initiates registration of the desired response from the area of interest by the non-image volume seicroprobe, which includes a z-direction scan for the depth of suspicious pathological tissue. The device samples and holds the observed response, or automatically takes multiple samples from a local location. When a non-image volume microprobe takes the required number of responses manually or automatically, a correlation transformation acts on the response vector to convert it into a vector of scores for pathological symptoms, against which the device is calibrated Has been. This is done in the processor 112 and a function response (F (R) for each volume element k sampled in the probe._k)) Vector is calculated and multiplied by the correlation transformation matrix {a} found in the memory 114 and determined during calibration of the non-image volume microprobe.
One prototype of a tissue volume limited enhanced signal acquisition device has been modified for cervical cancer biopsy and differential diagnosis of cervical abnormalities. This device is trade name Corco Probe (CorpoProbe).^TM) And is shown in FIG. 6B as device 10 "", which is a diagnostic non-contact medical spectrophotometer. The device 10 "'can be used to analyze the spectral characteristics of tissue in various health conditions. For example, for performing automatic fluorescence and spectral backscatter measurement, the size of the volume element is several hundred microns or larger on one side, and the working distance of the colposcope is typically 300 mm for use by gynecologists. It is easy. Measurement modes and data processing will be described with reference to the following drawings.
FIG. 6B shows details of the module 220. A plurality of fibers 202 connect various sources or detector elements and position them in the module, and various position switches and motorized controls maintain the illumination and collection fiber assembly at the desired focal position, within the specimen. The mutual overlap is controlled to limit the selected probe volume as shown in FIGS. 3A-3C. A relay mirror assembly 221 in the optical head 220 couples these elements into the optical path, maintains the various light sources and elements separately, controls the blinking of one or more illumination sources, and collects the light Can be guided to the sensing assembly without interference. A curved connecting mirror is provided as a common front objective assembly for analyzer and optical path viewing. It should be noted that with respect to the basic light source and relay or coupling fiber, all beamforming and beam directing elements are reflective and chromatic aberration and diffraction are prevented. Various fibers connecting the light source to each relay lens have a relatively large diameter, for example, 100 to 300 μm, and act as a light source with a large aperture. The end of the fiber can be moved laterally with a step motor and advanced and retracted to adjust the depth of focus in the target tissue.
FIG. 6B shows a spectral light source, a spectral measurement unit, a control computer 240, and analysis software in addition to the optical head 220 as the main components of the apparatus 10 ″ ′.
The corcoprobe (apparatus 10 "') and the colposcope are optically connected by a wavelength selective sighting mirror 230, which is operated by an operating stick 201 and does not obstruct the field of view. Prevents the doctor from interfering with the operation of the colposcope, i.e., the colposcope can be operated as if the device is not attached and does not interfere visually and mechanically. A button operation results in an aiming or measuring mode, the operating stick allowing the operator to select a sample point using the marker beam within the field of view of the colposcope, where the measurement mode is selected. Once a point is selected, the aim of the device is fixed and a depth scan is performed in the range 2.5 mm above and 2.5 mm below the target point.
The aiming light is on, so an accurate biopsy can be performed at the selected location. In addition, when a large number of biopsies are performed, a microphone is provided in the optical head so that each sample can be identified by voice when each sample is taken.
The device has four optical channels and can be implemented for each part of the cervix. Illumination channel 231 sends light from the internal illumination source to the cervix and returns visual data, but does not have another visible effect. The white light channel 232 uses a wide band of light at 5300 ° K to enable spectral backscatter measurements. A channel 233 of red light 635 nm provides a marker beam. This creates a clearly visible spot and enables aiming, but can be used as an automatic tracking control feedback loop. A 337 nm UV channel 234 excites fluorescence, allowing backscatter measurements. In FIG. 6B, a fifth channel at 780 nm is also shown, allowing measurement of the position of the volume element where the spectral characteristics are measured. In the preferred embodiment, this function is performed by the red channel 233.
FIG. 6B is a schematic diagram of the apparatus. Since light with a wide spectral range from several light sources is used, the refractive element is not used in the optical system, and the problem of the secondary spectrum associated with the refractive element does not occur. Further, the optical system can be packaged so as to be housed in an accessory storage box of a normal vaginal endoscope. The following description is generally made from left to right and from top to bottom in FIG. 6B.
As a main element of the optical head 220, the mirror M sends a radiation beam to the cervix about 300 mm away from the objective lens, and a necessary beam operation unit is provided. The mirror M is schematically shown as a thick diagonal line with short spaced fine lines. Furthermore, the optical head has a wavelength selective beam mixer (dichroic mirror), which is indicated by a thick diagonal line without a thin line. Other elements include a depth scan mechanism for the excitation channel and a distance detector.
The transmitter block 250 includes an excitation laser 251 (eg, Laser Science, VSL-337ND-S) and a white light source 252 (eg, Welsh Allin, M24E001) at 5300 ° K. An excitation output energy measurement monitor 261 and a scanning monochromator 262 (eg, spectrograph model M479 Manospec 18) analyze the background scattered white light. The excitation source is a nitrogen laser. This may be in other forms and may have one or more excitation wavelengths.
The nitrogen laser may be excited, for example, at 25 pulses / second, and during the 5 ns pulse, the white light aiming and aligning light source independently emits pulses under computer control.
The receiver block 250 includes an aiming and position monitoring channel source 253, such as a 635 nm laser diode, a position monitoring receiver 261, a 337 nm backscatter receiver 262, and a fluorescence spectrum analyzer 264, such as an Acton Spectro 150 and enhanced CCD. Includes a multi-channel analyzer (Princeton Instrument) with a detector (package model CCD 567 MGE).
A control computer 240 integrates the operation of the various subassemblies using, for example, software from National Instruments. The computer controls the operation of the system, digitizes it, and stores the raw data for future analysis. Further, the processor and memory of the control computer 240 perform the functions of the processor 112 and memory 114 of FIG.
FIG. 7 illustrates another embodiment of an optical probe module 300 according to the present invention. Module 300 is placed in a single housing 310 containing the basic optical beam limiting elements described above and is coupled to the illumination and sensing portions of the device by input and output optical fibers 313, 311 respectively. The device 310 is attached to the xyz stage, and the computer takes a short time to record the input beam, spectrum selection, step motion on the sample of the device, and analysis of the received irradiation, eg, analysis of hundreds of measurements for each probe. And give a drawing of the spectral shape for the entire sample.
FIG. 8 shows a non-image volume probe for initial cancer testing according to the present invention, where the cancer originates in mucosal tissue and the device detects autofluorescence signals from neoplasms in the epithelial mucosa in the body cavity, Remove interfering signals from the underlying substrate. The embodiment of FIG. 8 detects autofluorescence at two wavelengths, 337 nm and 460 nm. The irradiator 812 is a 337 nm pulsed nitrogen laser and has a 460 nm die laser module 813. Shutter mechanism 814 is controlled by computer 840 to switch between the two excitation wavelengths, and shutter mechanism 815 places long wavelength optical cutoff filter 826 into the collector optical path for 460 nm excitation. The optical filter 826 allows fluorescence having a wavelength longer than 460 nm to pass but prevents scattered light from entering the collected spectrum discriminator 827 and detector 828. The optical filter 817 blocks 337 nm excitation radiation but allows long wavelength fluorescence to pass. Photodetector 882 monitors the output of the excitation laser and provides a comparison of each pulse of the collected signal, with a correction signal indicating the change in laser irradiator output. The intensity of the fluorescence is determined by the intensity of the illumination pulse, which has a duration of about 5 ns (nanoseconds), and the

electrical pulse stretchers

831 and 832 lengthen the output electrical signal from the short pulse of fluorescence, Allows the signal processor to accurately determine the energy of each pulse. The wide spectral bandwidth of this device requires precise control of chromatic aberration and is achieved through the use of totally reflective optical elements.

Mirrors

826 and 834 used to effectively couple light to the scanning monochromator and optical fiber 832 are non-axis parabolic elements. Since the optical head 816 has a long working distance and a high numerical aperture, it is a total reflection microscope objective lens. An optical fiber 832 couples the excitation illumination to the head and the fluorescence from the head into the detector optical path. The beam splitter 810 provides the optical path for illumination and collection.
In addition, the device serves as a field stop in the preferred embodiment, with the end of the multimode fiber 832 positioned close to the object 816 and acting as a first and second field stop. This arrangement is different from the embodiment of FIG. 6B, in which separate multimode fibers are provided as first and second field stops.
9A and 9B show a variation of the illumination assembly. A plurality of input transmission fibers 313a, 313,... Are arranged in a spiral around a cylindrical shape with a radius R, and the face of each fiber is offset by a short distance L from the preceding one, and its output is an axis. The direction is A. The cylinder of radius R may be, for example, a large aperture collection fiber, or a mechanical element such as a cylinder or ring. Other combinations are easy to those skilled in the art. The output beam from multiple fibers 313 is focused on each probe volume area of sample 320 by a single objective lens 301. FIG. 9A shows the output beams from the two fiber ends 313a, 313b, each of its outer ends (shown as 1, 2) being focused on a separate probe volume in the sample. FIG. 9B shows the details of the sample in the corresponding probe volume area. Each

corresponding probe volume

340a, 340b... Is denoted by a radius R ′ = | m | R, where | m | is the magnification of the objective. Further, each probe volume is offset with respect to the z-axis, is slightly displaced laterally in a spiral around the plug-like probe volume, and the z-axis offset is m²L is the axial step spacing of the original transmission fiber. Thus, the fixed array of fibers places sampling plugs at a plurality of different depths within the sample 312. This is fixed and provides a constant spacing between the fiber end and the objective lens 301, sampling in different layers of tissue is accurate and is substantially independent of the stability of the device 301. This property significantly enhances the reproducibility of the tissue depth analysis spectral analysis. In the end mirror embodiment, the illumination and collection assembly achieves good focus, and the probe end limits the object spacing and forms part of the optical system.
Various optical configurations achieve a non-image volume probe configuration with effective removal of undesired upper signals. FIG. 10A shows one embodiment, where the illumination and collection beams 44 ', 48' are each essentially parallel. In this case, the parallel field stopper FS limits the width of the light collection window, and the crossing angle affects the size and aspect ratio of the capacitive element.
In another embodiment of the non-image volume probe apparatus, the illumination and collection beams may intersect and may use a common field stop FS, but use a common objective lens assembly. This is shown in FIG. 10B. Here, the light source 12 and the detector 24 are respectively oriented obliquely and intersect the stopper FS, but the objective assembly 21 uses different portions a and a ′ of its clear aperture for irradiation and light collection. . The baffle B defines two distinct areas of the objective aperture into which it is divided. In the image in the sample 18 of the field stopper FS, the two beams intersect to define a split conjugate volume element that is stably aligned. Other conventional objective assembly aperture splitting methods can also be used, for example using a small mirror to create a separate optical path that leads to another position on the objective lens through two separate field stops. Also good.
As another example, the objective assembly is provided with a plurality of apertures or pupils, and spaced pupils are used for illumination and detection. FIG. 10C and FIG. 10D show this embodiment, which uses beams that cross non-objects but prevent interference. If the aperture of the object is simply divided, the adjacent divided parts of the two divided parts are not effective for depth analysis. Therefore, a mask M is provided in the object 16 and the pupils are opposed to N sets of diameters. A pair of secondary pupils (2N)_na, P_nb・・・・・・ P_nn) And each pair is connected to one self-coupled stopper, for example a stopper with a fiber end as shown in FIGS. 9A and 9B. This minimizes the interference caused by the scattering, but if the object 16 is spaced by the diameter of the object 16, the depth analysis by the cross beams is maximized. N sets of pupils are arranged in any desired arrangement and N readings are obtained simultaneously. FIG. 10D shows the placement of the pupil mask M, which limits the pupil set to the lens. Each object may be replaced by a single object having a masked pupil, but this requires complex alignment work, but the effect of aberrations is small. Importantly, each objective lenslet may be a microlens, which conforms to the spatial and focal constraints for a small instrument such as an endoscope. An embodiment as an endoscope is shown in FIG.
As yet another embodiment of the present invention, a second or separate field stopper is used in combination with a dispersive element to correct residual chromatic aberration of a holographic or refractive objective. Usually, the best objective lens for a wide spectral bandwidth fluorescent confocal microscope is well corrected for chromatic aberration. These produce a good image with a constant magnification over a wide range of about 300 nm to 1000 nm or more. However, this good lens also contains an excessive “secondary spectrum” as part of the spectral range. The secondary spectrum is the wavelength dependent shift of the axial position of the image relative to the position of the lens. Even with a large field stopper, image misalignment has two adverse effects: (1) the out-of-focus light beam starting from the displaced image rapidly becomes larger than the field stopper, resulting in energy loss. (2) Loss of confocal state (FS₁And FS₂) Causes a decrease in background recognition and a reduction in depth recognition ability. For this reason, in part, the aforementioned device relies on the reflective objective of the broad spectrum bandwidth device of the present invention. However, by using a dispersive element as part of the beam splitter, the second field stopper FS₁Can be placed in the correct position conjugated to the first field stopper. As shown in FIG. 10E, the aberration correction dispersion element DE converts the collected light into the respective beams λ._iAre arranged at different positions. Each beam λ_iIs the corresponding fiber end FS_iWhich act as a second field stopper and each λ_iIs located at the correct conjugate position. The dispersive element is, for example, a holographically formed element, a prism or a conventional transmission or reflection grating.
Another example of a probe according to the present invention is an endoscope or other contact or internal remote sensing application. This embodiment is shown in FIG. In this case, the illuminating fiber and the receiving fiber each pass through the long body 500 (which may be a normal catheter) and reach the image head 510. The image head is located at the end of the body or catheter. The head 510 is an active focusing optical system, for example, one or more rod lenses, and can be adjusted to the depth of the probe volume. Desirably, in the example shown in FIG. 9A as an endoscope, the light input is provided to a separate one of the illumination fibers 513a,. The movement of the optical system is not required. The device can be rigid and fully self-contained and presents a smoothly curved contact surface with respect to the tissue surface. If a wide spectral width is not required, a diffractive rod (GRIN lense) is advantageously connected to the optical fiber, allowing simple optical coupling, and a short focal length allows endoscopic manipulation of tissue in the human body. To make it easier. The figure shows a lens 514 that receives light from a plurality of helically arranged input optical fibers.
In each of the above embodiments, the probe volume is limited by the crossing of the illumination and imaging beams, giving a large signal intensity, and effectively removing all light from stimuli, scatter, reflection, fluorescence, and shadow areas of the tissue. The A large irradiation stopper provides a desired intensity of irradiation within the probe volume, and good spectral measurements can be made.
In various embodiments of the present invention, some may be advantageous. In these examples, the illumination and collection optics are reflective, downward dual, and spectral deformation mitigating. In addition, some of the illumination and collection field stoppers are physically the same element, and others are separated from the illumination beam path after the collection beam has passed through a common field stopper. In another embodiment, a multimode optical fiber is used as the illumination field stopper. As an advantageous embodiment for inspecting an object whose position changes, the field stopper is provided with a controlled translational movement along the respective optical axis of the illumination and collection optics. The object may be moved along the optical axis.
While the present invention has been described in connection with certain preferred embodiments and described several exemplary uses, it will be appreciated by those skilled in the art that various variations in form and detail are within the spirit and scope of the invention. It can be implemented within the range. If the present invention is understood, modifications and variations are easy, and these modifications and variations are within the scope of the present invention limited by the scope of the claims.

Claims

少なくとも一部が透過性であり且つ露出面を有した材料標本を光学的に評価する分析装置において、
前記露出面に照明を指向して光で前記標本を照明する第１の手段であって、該第１の手段が第１の視野絞りを含み、該第１の視野絞りが該第１の視野絞りにおける前記第１の手段の回折限定解像度より大きなサイズにされている前記露出面に照明を指向して光が前記標本を照明する第１の手段と、
光を集光する第２の手段であって、該第２の手段が第２の視野絞りを含み、該第２の視野絞りが該第２の視野絞りにおける前記第２の手段の回析限定解像度より大きなサイズにされている光を集光する第２の手段と、
該第２の手段により集光された照明を検出し且つ検出した照明から記録を作成する手段とを備え、
前記第１の手段及び前記第２の手段が、前記第１の視野絞り及び前記第２の視野絞りが前記標本の共通領域を介して少なくとも部分的に接合し、且つ、前記記録が前記照明に反応する前記共通領域を含んだ体積要素の外側から放射する光を実質的に排除する一方で、前記体積要素から放射する光を選択的に表す光学反応に対応するような構成に配置されていることを特徴とする分析装置。In an analytical apparatus for optically evaluating a material specimen that is at least partially permeable and has an exposed surface,
First means for illuminating the specimen with light directing illumination at the exposed surface, wherein the first means includes a first field stop, and the first field stop is the first field stop. First means for directing illumination to the exposed surface that is sized to be larger than the diffraction limited resolution of the first means in the aperture, and light illuminates the specimen;
Second means for condensing light, the second means including a second field stop, wherein the second field stop is the diffraction limited of the second means in the second field stop. A second means for collecting light having a size larger than the resolution;
Means for detecting the illumination collected by the second means and creating a record from the detected illumination;
The first means and the second means are characterized in that the first field stop and the second field stop are at least partially joined via a common region of the specimen, and the recording is applied to the illumination. It is arranged in a configuration corresponding to an optical reaction that selectively represents light emitted from the volume element while substantially eliminating light emitted from the outside of the volume element containing the reacting common region. An analyzer characterized by that.

前記体積要素が１つの組織または構造の一定の領域内に載置されるサイズまたは形状にされ、且つ、前記分析装置が隣接する組織タイプまたは構造からの光を識別することを特徴とする請求項１に記載の分析装置。The volume element is sized or shaped to be placed within a region of a tissue or structure, and the analyzer identifies light from adjacent tissue types or structures. 2. The analyzer according to 1.

更に、特性Ｐを備えた光学反応情報を相関させる変換Ｔを記憶する記憶手段と、前記変換Ｔを前記検出手段により作成された光学反応記録に応用して、前記特性Ｐが前記試験される体積要素中に存在する場合には、前記分析装置が該特性Ｐを識別する手段とを備えていることを特徴とする請求項１に記載の分析装置。Further, a storage means for storing a transformation T for correlating optical reaction information having the characteristic P, and applying the transformation T to an optical reaction record created by the detection means, the characteristic P is the volume to be tested. The analyzer according to claim 1, further comprising means for identifying the characteristic P when the analyzer is present in an element.

前記光学反応がスペクトル反応であり、前記分析装置がｎ個の波長帯域における集光した光の振幅を表す記録を作成し、且つ、前記の記憶された変換Ｔが次元ｎを有し、但しｎが整数であることを特徴とする請求項３に記載の分析装置。The optical response is a spectral response, the analyzer creates a record representing the amplitude of the collected light in n wavelength bands, and the stored transformation T has dimension n, where n The analyzer according to claim 3, wherein is an integer.

前記分析装置が前記記憶した変換Ｔを応用してｍ個の特性を識別し、但しｍが整数であることを特徴とする請求項４に記載の分析装置。The analyzer according to claim 4, wherein the analyzer applies the stored transformation T to identify m characteristics, where m is an integer.

前記検出手段がｎ個の波長帯域における集光した光の振幅を表すスペクトル反応記録を作成し、且つ、前記記憶された変換Ｔが次元ｍｎを有し、但しｍが２に等しいかより大きな整数であることを特徴とする請求項３に記載の分析装置。The detection means creates a spectral response record representing the amplitude of the collected light in n wavelength bands, and the stored transformation T has dimension mn, where m is equal to or greater than 2 The analyzer according to claim 3, wherein:

前記分析装置が前記記憶した変換Ｔを応用してｍ個の特性Ｐを識別することを特徴とする請求項４に記載の分析装置。The analyzer according to claim 4, wherein the analyzer identifies the m characteristics P by applying the stored conversion T.

前記分析装置が前記記憶した変換Ｔを応用してｐ個の特性Ｐを識別し、但しｐがｍに不等の整数であることを特徴とする請求項５に記載の分析装置。6. The analyzer according to claim 5, wherein the analyzer applies p stored characteristics T to identify p characteristics P, where p is an integer unequal to m.

自然環境にある物質の条件を測定する分析装置において、
前記分析装置は、
物質試験体を照明し且つ弱共焦点光学素子で自然環境にある前記試験体からの光学反応を収集して、該光学反応が非撮像解像度で収集され且つ実質的且つ優先的に前記試験体内の局部副体積から引き出されるようにする手段を備え、該手段は、対象物の回折限定スポットのサイズより大きい二つの視野絞りを有し、
さらに前記分析装置は、
前記光学反応を検出するとともにデジタル化して該光学反応を波長の異なる複数の値として表す手段を備えていることを特徴とする自然環境にある物質の条件を測定する分析装置。In an analyzer that measures the conditions of substances in the natural environment,
The analyzer is
Illuminating the material specimen and collecting optical responses from the specimen in the natural environment with weak confocal optics, wherein the optical responses are collected at non-imaging resolution and substantially and preferentially within the specimen. Means to be drawn from the local subvolume, said means having two field stops larger than the size of the diffraction limited spot of the object;
Furthermore, the analyzer is
An analyzer for measuring a condition of a substance in a natural environment, comprising means for detecting and digitizing the optical reaction and expressing the optical reaction as a plurality of values having different wavelengths.

更に、練習用集合の自然環境光学反応と該光学反応が得られた材料において支配的な条件の独立した評価との相関から引き出された変換を記憶する手段と、前記記憶された変換を試験体からの複数の値に応用して出力を発生し、それにより前記条件を識別する処理手段とを備えていることを特徴とする請求項９に記載の分析装置。And means for storing a transformation derived from the correlation between the natural environmental optical response of the practice set and the independent evaluation of the dominant conditions in the material from which the optical response was obtained, and the stored transformation as a specimen. 10. The analysis apparatus according to claim 9, further comprising: processing means for generating an output by applying to a plurality of values from and thereby identifying the condition.

前記局部副体積が約１０マイクロメートルから３ミリメートルの範囲の交差寸法を有し、且つ、前記分析装置が、前記光学反応が収集される時に前記試験体を観察する光学医療試験器具に連結されていることを特徴とする請求項９に記載の分析装置。The local subvolume has an intersecting dimension in the range of about 10 micrometers to 3 millimeters, and the analyzer is coupled to an optical medical test instrument that observes the specimen when the optical response is collected; analyzer according to claim 9, characterized in that there.

内視鏡に具現化され且つ位置決め面を有し、前記照明及び収集する手段が前記位置決め手段に対する一定の画定された位置において副体積からの反応を収集することを特徴とする請求項９に記載の分析装置。10. An embodiment embodied in an endoscope and having a positioning surface, wherein the illumination and collection means collects responses from a subvolume at a fixed defined position relative to the positioning means. Analysis equipment.

前記副体積が一定の組織特徴に整合自在で且つ細長い小片、円錐、三日月、プラグ及び円錐曲線の交差から成る前記集合から選択された形状を有した非対称体積であることを特徴とする請求項１２に記載の分析装置。13. The subvolume is an asymmetric volume that is conformable to certain tissue features and has a shape selected from the set consisting of elongated strips, cones, crescents, plugs, and conic intersections. The analyzer described in 1.

前記自然環境が生きている組織環境であり、且つ、前記収集する手段が強力に弁別して前記生きている組織内の局部体積要素の外側から前記光学反応に対する積分寄与により生じたノイズが前記局部体積要素の内側からの前記光学反応の約半分未満に相当するようにすることを特徴とする請求項９に記載の分析装置。The natural environment is a living tissue environment, and the noise generated by the integral contribution to the optical response from outside the local volume element in the living tissue due to strong discrimination by the collecting means is the local volume. 10. The analyzer according to claim 9, wherein the analyzer corresponds to less than about half of the optical response from the inside of the element.

前記自然環境が生きている組織環境であり、且つ、前記収集する手段が強力に弁別して識別自在且つ再現自在の光学反応が前記体積要素から収集されることを特徴とする請求項９に記載の分析装置。10. The natural environment is a living tissue environment, and the means for collecting is strongly discriminating so that identifiable and reproducible optical responses are collected from the volume element. Analysis equipment.

前記照明及び収集する手段が組織深さの軸線に沿って局在する前記副体積を画定することを特徴とする請求項１５に記載の分析装置。16. The analysis device of claim 15, wherein the illumination and collection means defines the subvolume localized along the tissue depth axis.

前記照明及び収集する手段が少なくとも、（ｉ）下部または上部組織を実質的に除外した組織層及び（ii）隣接する組織を実質的に除外した極巨視的体積の組織の一方を忠実に表すサイズの局部副体積から反応を収集することを特徴とする請求項９に記載の分析装置。A size wherein said illumination and collecting means faithfully represent at least one of (i) a tissue layer substantially excluding lower or upper tissue and (ii) a macroscopic volume of tissue substantially excluding adjacent tissue The analysis device according to claim 9, wherein the reaction is collected from a local subvolume.

更に、走査を行い前記組織を横断して分布した局部体積要素を抜き取り前記組織中の光学反応のプロフィールを発達させる手段を含んでいることを特徴とする請求項１４に記載の分析装置。15. The analyzer of claim 14, further comprising means for scanning to extract local volume elements distributed across the tissue and to develop an optical response profile in the tissue.

前記照明及び収集する手段が回折効果がごくわずかである照明を指向し、且つ、前記物質中に約１０マイクロメートルから３ミリメートルの範囲の交差寸法を有した体積要素から非撮像方法で照明に対する反応を収集することを特徴とする請求項９に記載の分析装置。Response to illumination in a non-imaging manner from a volume element in which the illumination and collection means is directed to illumination with a negligible diffraction effect and has an intersecting dimension in the material ranging from about 10 micrometers to 3 millimeters The analyzer according to claim 9, wherein the analyzer is collected.

組織からスペクトルデータを検出する分析装置において、
前記分析装置は、
第１の光学路の第１の領域から実質的に単調に落下して離間する前記組織の第１の強度分布で前記組織内へ照明を指向する手段を備え、該手段は、対象物の回折限定スポットのサイズより大きい第１の視野絞りを有し、
また、前記分析装置は、
第２の光学路の第２の領域から実質的に単調に落下して離間する収集分布の効力で自身から放射する光を集光する手段を備え、該手段は、対象物の回折限定スポットのサイズより大きい第２の視野絞りを有し、
前記照明及び集光が前記第１の光学路及び前記第２の光学路が１次元において関心の組織特徴に対応する非点状の体積要素中で重畳するように整合して、周りの組織からの光を優先的に排除する一方で、前記集光された光が前記関心の組織特徴の前記照明に対する光学反応を選択的に表すようにし、
さらに前記分析装置は、
前記集光された光で作動して光学反応を生成する検出器であって、該光学反応が前記体積要素中で支配的な条件を実質的に示す検出器を備えていることを特徴とする組織からスペクトルデータを検出する分析装置。In an analyzer that detects spectral data from tissue,
The analyzer is
Means for directing illumination into the tissue with a first intensity distribution of the tissue that falls substantially monotonically away from the first region of the first optical path, the means diffracting the object Having a first field stop larger than the size of the limited spot;
In addition, the analyzer is
Means for collecting light emitted from itself with the effect of a collection distribution that falls substantially monotonically away from the second region of the second optical path, said means comprising a diffraction limited spot of the object; Having a second field stop larger than the size,
From the surrounding tissue, the illumination and collection are aligned such that the first optical path and the second optical path overlap in an astigmatic volume element corresponding to the tissue feature of interest in one dimension. The focused light selectively represents an optical response to the illumination of the tissue feature of interest,
Furthermore, the analyzer is
A detector that operates with the collected light to produce an optical response, the optical response comprising a detector that substantially exhibits conditions prevailing in the volume element. An analyzer that detects spectral data from tissues.

前記第１の光学路及び前記第２の光学路が重畳して、前記要素の収集された光学反応が識別自在且つ再現自在となることを特徴とする請求項２０に記載の分析装置。21. The analyzer according to claim 20, wherein the first optical path and the second optical path are overlapped so that the collected optical reaction of the element is distinguishable and reproducible.

前記デジタル化されたスペクトル反応が（ａ_i（λ_i））の集合として表され、但しａ_iは中心波長がλ_iのそれぞれの帯域における放射照度値であり、且つ、ｉは２に等しいかより大きいことを特徴とする請求項２０に記載の分析装置。The digitized spectral response is represented as a set of (a _i (λ _i )), where a _i is the irradiance value in each band with a center wavelength of λ _i and i equals 2 21. The analyzer according to claim 20, wherein the analyzer is larger.

材料標本を光学的に評価する分析装置において、
光を提供する光源と、
少なくとも前記光の一部を選択的に透過する第１の視野絞りと、
前記一部を指向して標本の体積を照明する光学手段と、
前記標本の前記照明された体積から放射する放射を収集する光学的収集手段と、
前記集光された光の少なくとも一部を選択的に透過するとともに、少なくとも一部が、照明され且つ観察される体積の共通体積要素を介して前記第１の視野絞りに接合されている第２の視野絞りと、
前記第２の視野絞りにより通過された光を指向して前記体積要素から集光された光を検出し且つ該検出した光を示す信号を生成する検出手段とを備え、
前記第１の視野絞りは、対象物の回折限定スポットのサイズより大きく、前記第２の視野絞りは、対象物の回折限定スポットのサイズより大きいことを特徴とする材料標本を光学的に評価する分析装置。In an analyzer that optically evaluates material specimens,
A light source that provides light;
A first field stop that selectively transmits at least a portion of the light;
Optical means for directing the portion to illuminate the volume of the specimen;
Optical collection means for collecting radiation emanating from the illuminated volume of the specimen;
A second that selectively transmits at least a portion of the collected light and at least a portion is joined to the first field stop via a common volume element of the illuminated and observed volume. Field of view,
Detecting means for detecting the light collected from the volume element by directing the light passed by the second field stop, and generating a signal indicating the detected light;
Optically evaluating a material specimen characterized in that the first field stop is larger than the size of the diffraction limited spot of the object and the second field stop is larger than the size of the diffraction limited spot of the object. Analysis equipment.

更に、前記体積要素からの記録を分析して前記体積要素の少なくとも１特性を特徴付ける手段を備えていることを特徴とする請求項１に記載の分析装置。The analyzer according to claim 1, further comprising means for analyzing a record from the volume element to characterize at least one characteristic of the volume element.

更に、前記標本に関する不純物観察結果を表すデータ（ｄ）を記憶する手段を備え、前記変換の少なくとも一部が前記訓練用の集合に関する斯かる不純物観察結果から引き出され、且つ、前記処理手段が少なくとも前記データ（ｄ）の一部に前記変換を応用することを特徴とする請求項１０に記載の分析装置。Further comprising means for storing data (d) representing impurity observation results for the specimen, wherein at least part of the transformation is derived from such impurity observation results for the training set, and the processing means is at least The analysis apparatus according to claim 10, wherein the conversion is applied to a part of the data (d).