JP3890077B2

JP3890077B2 - Liquid chromatography filter, liquid chromatography column, and method for measuring hemoglobins

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Publication number: JP3890077B2
Application number: JP2006118412A
Authority: JP
Inventors: 雄二瀬戸口; 和之大石; 一彦嶋田; 政明源; 俊樹川辺
Original assignee: Sekisui Chemical Co Ltd
Current assignee: Sekisui Chemical Co Ltd
Priority date: 2006-04-21
Filing date: 2006-04-21
Publication date: 2007-03-07
Anticipated expiration: 2018-10-23
Also published as: JP2006227022A

Description

本発明は、液体クロマトグラフィー用フィルター、液体クロマトグラフィー用カラム及び該フィルター又はカラムを用いるヘモグロビン類の測定方法に関する。 The present invention relates to a filter for liquid chromatography, a column for liquid chromatography, and a method for measuring hemoglobin using the filter or column.

有機化学、生化学、医学などの分野における試料中の成分の分離や分取に液体クロマトグラフが汎用されている。この液体クロマトグラフは、通常、図７のようなシステムに構成されている。溶離液などの移動相１１が電磁弁１２を通り、送液ポンプ１３により試料導入装置１４を経由して、フィルタ−装置１５を通り分離カラム１６に入り、この分離カラム１６により試料中の各成分が分離される。分離された各成分は検出器１７によって、例えば、吸光度を測定する等によって検出され、その結果がデーター処理装置１８により処理されてクロマトグラム１９として表される。 Liquid chromatographs are widely used for separation and fractionation of components in samples in fields such as organic chemistry, biochemistry, and medicine. This liquid chromatograph is normally configured in a system as shown in FIG. A mobile phase 11 such as an eluent passes through a solenoid valve 12, passes through a sample introduction device 14 by a liquid feed pump 13, enters a separation column 16 through a filter device 15, and each component in the sample is separated by the separation column 16. Are separated. The separated components are detected by the detector 17, for example, by measuring the absorbance, and the result is processed by the data processing device 18 and expressed as a chromatogram 19.

上記、分離カラム１６の上流のフィルタ−装置１５はラインフィルタ−（例えば、後述の図４）と呼ばれ、フィルターとそれを収容するホルダーで構成されており、該フィルターによって、試料中の固形物や送液ポンプのシール部品の摩耗物などの不溶物が濾過される。また、液体クロマトグラフにおいて使用されるフィルタ−には、上記のラインフィルタ−の他に、分離カラムの試料導入側及び試料導出側に取り付けられるフィルターもある。このようなフィルターが装着された液体クロマトグラフィー用カラムを図８に示した。図８において、符号４０は分離カラム本体、符号４１はフィルター、符号４２はエンドフィッティングである。なお、図８は試料導入側のみを示したものであり、試料導出側を省略しているが、試料導出側も同様に構成される。このカラムにおいては、エンドフィッティング４２の中にフィルター４１が装着され、フィルター４１とエンドフィッティング４２との間隙はシール部材４３で密閉されている。そして、エンドフィッティング４２と分離カラム本体４０が螺合されることにより、分離カラム本体４０の端部にフィルター４１が密着されている。 The filter device 15 upstream of the separation column 16 is called a line filter (for example, FIG. 4 to be described later), and is composed of a filter and a holder for accommodating the filter. And insoluble matters such as wear of seal parts of the liquid feed pump are filtered. In addition to the line filters described above, there are filters attached to the sample introduction side and the sample derivation side of the separation column as filters used in the liquid chromatograph. A liquid chromatography column equipped with such a filter is shown in FIG. In FIG. 8, reference numeral 40 denotes a separation column body, reference numeral 41 denotes a filter, and reference numeral 42 denotes an end fitting. FIG. 8 shows only the sample introduction side, and the sample derivation side is omitted, but the sample derivation side is configured similarly. In this column, a filter 41 is mounted in an end fitting 42, and a gap between the filter 41 and the end fitting 42 is sealed with a seal member 43. The end fitting 42 and the separation column main body 40 are screwed together so that the filter 41 is in close contact with the end of the separation column main body 40.

このようなフィルタ−装置に用いられるフィルタ−は、一般に、円板状であり、材質はステンレス製焼結体などが用いられている。 A filter used in such a filter device is generally disk-shaped, and a stainless steel sintered body or the like is used as the material.

特開平７−２６０７６３号公報には、充填剤が収納されたカラム本体のエンドフィティングフィルターとして、ステンレス鋼繊維を積層し、それを焼結した繊維焼結フィルターを用いた高速液体クロマトグラフィーカラムが提案されている。このフィルターが装着された液体クロマトグラフィーカラムを、生体試料の測定に用いると、フィルターに生体試料が吸着し、圧力が上昇し、連続して多数の試料を測定できないという問題があった。 Japanese Patent Application Laid-Open No. 7-260763 discloses a high performance liquid chromatography column using a fiber sintered filter in which stainless steel fibers are laminated and sintered as an end fitting filter of a column body containing a packing material. Proposed. When a liquid chromatography column equipped with this filter is used for measurement of a biological sample, there is a problem that the biological sample is adsorbed on the filter, the pressure increases, and a large number of samples cannot be measured continuously.

また、クロマトグラフィー用カラムの製造方法の一つとして、管の内壁に、珪素化合物の溶液を通流し、ＣＬＤ（ＣｈｅｍｉｃａｌＬｉｑｕｉｄＤｅｐｏｓｉｔｉｏｎ）法により、不活性な二酸化珪素被膜を形成させ、この管内部に充填剤を充填する方法がある（特公平２−１３２６８号公報）。 In addition, as one of the methods for producing a chromatography column, a silicon compound solution is passed through the inner wall of a tube, and an inert silicon dioxide film is formed by the CLD (Chemical Liquid Deposition) method. There is a method of filling a filler (Japanese Patent Publication No. 2-13268).

液体クロマトグラフィーによる測定の一つとして、血液中の糖化ヘモグロビン、特にヘモグロビンＡ１ｃ（以下、ＨｂＡ１ｃという）が糖尿病診断の指標となるため広く測定されている。糖化ヘモグロビンとは血液中の糖がヘモグロビンと結合して生成したものである。溶血液試料中の糖化ヘモグロビンは、過去１〜２カ月間の血液中の平均的な糖濃度を反映するので溶血液中の糖化ヘモグロビンは、糖尿病の診断の指標となる。 As one of the measurements by liquid chromatography, glycated hemoglobin in blood, particularly hemoglobin A1c (hereinafter referred to as HbA1c), is widely measured because it serves as an index for diagnosis of diabetes. Glycated hemoglobin is produced by combining sugar in blood with hemoglobin. Since the glycated hemoglobin in the hemolyzed sample reflects the average sugar concentration in the blood during the past 1 to 2 months, the glycated hemoglobin in the hemolyzed blood is an indicator for the diagnosis of diabetes.

このＨｂＡ１ｃの液体クロマトグラフィー法による測定は、主にカチオン交換液体クロマトグラフィー法により行われている（特公平８−７１９８号公報など）。溶血液試料をカチオン交換液体クロマトグラフィーにより分離すると、通常、ヘモグロビンＡ１ａ（以下、ＨｂＡ１ａという）及びヘモグロビンＡ１ｂ（以下、ＨｂＡ１ｂという）、ヘモグロビンＦ（以下、ＨｂＦという）、不安定型ＨｂＡ１ｃ、安定型ＨｂＡ１ｃ並びにヘモグロビンＡ０（以下、ＨｂＡ０という）などのピークに分画できる。なお、糖尿病の診断の指標として使用されているＨｂＡ１ｃは、上記のうちの安定型ＨｂＡ１ｃであり、全ヘモグロビンピークの面積に対する安定型ＨｂＡ１ｃピークの面積の比率（％）として求められている。 The measurement of HbA1c by a liquid chromatography method is mainly performed by a cation exchange liquid chromatography method (Japanese Patent Publication No. 8-7198). When a hemolyzed sample is separated by cation exchange liquid chromatography, usually, hemoglobin A1a (hereinafter referred to as HbA1a) and hemoglobin A1b (hereinafter referred to as HbA1b), hemoglobin F (hereinafter referred to as HbF), unstable HbA1c, stable HbA1c, and It can be fractionated into peaks such as hemoglobin A0 (hereinafter referred to as HbA0). HbA1c used as an index for diagnosis of diabetes is stable HbA1c, and is determined as a ratio (%) of the area of stable HbA1c peak to the total hemoglobin peak area.

このＨｂＡ１ｃの液体クロマトグラフィー法による測定は、カラムとしてカチオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤（例えば、カルボキシル基やスルホン酸基を官能基として有する充填剤）が充填されたものを用い、ｐＨ５．０〜９．０の溶離液を用いて行われている。 Measurement of this HbA1c by the liquid chromatography method uses a column packed with a cation exchange liquid chromatography filler (for example, a filler having a carboxyl group or a sulfonic acid group as a functional group), pH 5.0 to Performed using 9.0 eluent.

この測定において、ステンレス焼結体からなるフィルターを用いると、該フィルターに生体試料が吸着し、圧力が上昇し、連続して多数の試料を測定できない、及び、分離性能に悪影響がでるという問題があった。 In this measurement, when a filter made of a stainless steel sintered body is used, a biological sample is adsorbed on the filter, the pressure increases, a large number of samples cannot be measured continuously, and the separation performance is adversely affected. there were.

特開平７−２６０７６３号公報JP-A-7-260763 特公平２−１３２６８号公報Japanese Patent Publication No.2-13268

本発明は、上記問題点に鑑みてなされたものであり、その目的は、生体試料の吸着が少なく、寿命が長く、分離性能に悪影響を与えない液体クロマトグラフィー用フィルター、該フィルターを用いることにより寿命が長く、分離性能に悪影響を与えない液体クロマトグラフィー用カラム及び該フィルター又はカラムを用いるヘモグロビン類の測定方法を提供することにある。 The present invention has been made in view of the above problems, and its purpose is to use a liquid chromatography filter that has little adsorption of a biological sample, has a long life, and does not adversely affect separation performance, and the filter. An object of the present invention is to provide a column for liquid chromatography that has a long life and does not adversely affect the separation performance, and a method for measuring hemoglobin using the filter or column.

本発明の液体クロマトグラフィー用フィルターは、シリコーン被膜でコーティングされていることを特徴とする。 The filter for liquid chromatography of the present invention is coated with a silicone film.

本発明で用いるシリコーン被膜でコーティングされる前のフィルターは、フィルターとしての強度と、孔を持つものであれば良く、特に限定されない。
上記フィルターの材質としては、例えば、ステンレス、アルミニウム、銅、チタン、ニッケル、鉄、クロム、スズ等の金属；ナイロン、フッ素樹脂、セルロース、ポリスルホン、ポリエーテルスルホン、ポリプロピレン、ポリエチレン、アクリル樹脂、ポリエステル、ビニロン、ポリカーボネート、ポリウレタン、ポリ塩化ビニル、ポリエーテルエーテルケトン、エポキシ樹脂、フェノール樹脂、ノリル樹脂等のプラスチック；セラミック；ガラスなどが挙げられる。 The filter before being coated with the silicone film used in the present invention is not particularly limited as long as it has strength as a filter and pores.
Examples of the material of the filter include metals such as stainless steel, aluminum, copper, titanium, nickel, iron, chromium, and tin; nylon, fluororesin, cellulose, polysulfone, polyethersulfone, polypropylene, polyethylene, acrylic resin, polyester, Plastics such as vinylon, polycarbonate, polyurethane, polyvinyl chloride, polyether ether ketone, epoxy resin, phenol resin, noryl resin; ceramics; glass and the like.

上記フィルターの材質として、好ましくは、シリコーン被膜との接着性が良い材質であり、例えば、ステンレス、アルミニウム、銅、ニッケル、鉄、クロム、スズ等の金属；ナイロン、アクリル樹脂、ポリエステル、ビニロン、ポリカーボネート、ポリウレタン、ポリ塩化ビニル、エポキシ樹脂、フェノール樹脂、ノリル樹脂等のプラスチック；セラミック；ガラスなどが挙げられる。 The material of the filter is preferably a material having good adhesion to the silicone film, such as metals such as stainless steel, aluminum, copper, nickel, iron, chromium, tin; nylon, acrylic resin, polyester, vinylon, polycarbonate. , Polyurethane, polyvinyl chloride, epoxy resin, phenol resin, noryl resin, etc .; ceramic; glass and the like.

フィルターの形態は、メンブレンフィルター、繊維を積層し焼結したもの、濾紙状のもの、不織布など特に限定されない。 The form of the filter is not particularly limited, such as a membrane filter, a fiber laminated and sintered, a filter paper-like one, and a non-woven fabric.

本発明で用いられるシリコーン被膜とは、シリコーンから得られる被膜であれば特に限定されない。上記シリコーンとしては、被膜を形成できるものであれば特に限定されず、例えば、オイル、ワニス、ゴム、シランなどの種類がある。好ましくは、硬化型シリコーンゴムである。シリコーン被膜を形成させる方法には、室温又は加熱して、図１１に示すようなベースポリマーと架橋剤（図１１におけるＸは、例えば、メトキシ基、ケトオキシム基、アセトキシ基のような加水分解性の有機基）を縮合、又は、付加反応、又は、ＵＶ硬化反応などさせる方法があり、いずれも用いることができる。好ましくは、縮合、又は、付加反応が良い。 The silicone film used in the present invention is not particularly limited as long as it is a film obtained from silicone. The silicone is not particularly limited as long as it can form a film, and examples thereof include oil, varnish, rubber, and silane. Preferably, it is curable silicone rubber. In the method for forming a silicone film, a base polymer and a crosslinking agent as shown in FIG. 11 are heated at room temperature or heated (X in FIG. 11 is a hydrolyzable group such as a methoxy group, a ketoxime group or an acetoxy group). There are methods of condensation, addition reaction, UV curing reaction, and the like, and any of them can be used. Preferably, condensation or addition reaction is good.

シリコーン被膜の厚さは、好ましくは、０．１ｎｍ〜１００μｍ、より好ましくは、０．５ｎｍ〜１０μｍ、最も好ましくは、０．７ｎｍ〜２μｍである。
シリコーン被膜でフィルターをコーティングする場合、フィルター全体をコーティングする必要はなく、少なくともフィルターの孔部分がコーティングされていればよい。
フィルターの孔部分のコーティングの割合は、孔部分の全表面積に対して、好ましくは、１０％以上、より好ましくは、３０％以上、最も好ましくは、６０％以上である。 The thickness of the silicone coating is preferably 0.1 nm to 100 μm, more preferably 0.5 nm to 10 μm, and most preferably 0.7 nm to 2 μm.
When the filter is coated with a silicone film, it is not necessary to coat the entire filter, as long as at least the pores of the filter are coated.
The ratio of the coating on the pore portion of the filter is preferably 10% or more, more preferably 30% or more, and most preferably 60% or more with respect to the total surface area of the pore portion.

本発明のフィルターは、上記の液体クロマトグラフィー用フィルターが、更に、ブロッキング試薬でブロッキング処理されていることが好ましい。上記ブロッキング試薬としては、例えば、ウシ血清アルブミン、カゼイン、ゼラチン、ヘモグロビン、ミオグロビンなどの蛋白質；例えば、リン脂質等の極性脂質；例えば、ＳＤＳ、ポリエチレングリコールモノ−４−オクチルフェニルエーテル（トリトンＸ−１００）などの界面活性剤などが挙げられる。 In the filter of the present invention, it is preferable that the liquid chromatography filter is further subjected to a blocking treatment with a blocking reagent. Examples of the blocking reagent include proteins such as bovine serum albumin, casein, gelatin, hemoglobin, and myoglobin; polar lipids such as phospholipids; and SDS, polyethylene glycol mono-4-octylphenyl ether (Triton X-100). ) And the like.

本発明のフィルターの形状は、液体の流れを乱さない構造であれば、特に限定されない。例えば、図１に示すような、（イ）円柱状、（ロ）円錐状、（ハ）円錐台状の凸部を有するもの、（ニ）円錐状の凸部と円柱部分を組み合わせた形状、（ホ）円錐台状の凸部と円柱部分を組み合わせた形状、（ヘ）２つの円錐の、底面同士を接触したような形状が挙げられる。図１において、符号１は本発明の液体クロマトグラフィー用フィルター、符号２は必要に応じて使用されるシール部材である。上記凸部の位置は、液体流入側又は液体流出側のどちらでもよく、また上記の両側でもよい。 The shape of the filter of the present invention is not particularly limited as long as it does not disturb the liquid flow. For example, as shown in FIG. 1, (a) a cylindrical shape, (b) a conical shape, (c) a shape having a truncated cone-shaped convex portion, (d) a shape combining a conical convex portion and a cylindrical portion, (E) A shape in which a truncated cone-shaped convex portion and a cylindrical portion are combined, and (f) a shape in which the bottom surfaces of two cones are in contact with each other. In FIG. 1, reference numeral 1 denotes a filter for liquid chromatography according to the present invention, and reference numeral 2 denotes a seal member used as necessary. The position of the convex portion may be on either the liquid inflow side or the liquid outflow side, or may be on both sides.

本発明のフィルターのサイズは、直径は１〜１０００ｍｍが好ましく、２〜５０ｍｍがより好ましい。厚さは０．１〜１００ｍｍが好ましく、０．２〜１０ｍｍがより好ましい。濾過孔径は、公知の孔径でよく、０．１〜２０μｍが好ましく、０．２〜１０μｍがより好ましい。 The size of the filter of the present invention is preferably from 1 to 1000 mm, more preferably from 2 to 50 mm. The thickness is preferably 0.1 to 100 mm, and more preferably 0.2 to 10 mm. The filtration pore diameter may be a known pore diameter, preferably 0.1 to 20 μm, and more preferably 0.2 to 10 μm.

本発明のフィルターを製造するには、上記記載の金属フィルター、プラスチックフィルターなどに硬化型シリコーンを塗布、又はコーティングし、室温、又は、加温して硬化させる方法が挙げられる。
金属フィルター、プラスチックフィルターなどの製造方法は、公知の方法でよく、例えば、繊維状のもの、粉体状のものを積層し、焼結処理する方法やメンブレン状、濾紙状に加工する方法などが挙げられる。
また、特開平２−２６２０５４号公報に記載あるような濾過孔径の異なるフィルターを組み合わせてもよい。すなわち、溶液の流入側に濾過孔径の大きなものを使用し、溶液の流出側に濾過孔径の小さなものを使用して組み合わせる。このように、濾過孔径の異なるフィルターを組み合わせたものを製造するには、それぞれのフィルターを製造後、貼り合わせてもよいが、直径の太い繊維を液体の流入側に用い、直径の細い繊維を液体の流出側に用いて、積層した状態で型に入れて焼結するのが好ましい。積層数は、特に限定されないが、通常、２〜３層で必要に応じて増やしてもよい。 In order to produce the filter of the present invention, a method of applying or coating a curable silicone to the above-described metal filter, plastic filter or the like, and curing at room temperature or by heating is exemplified.
The manufacturing method of a metal filter, a plastic filter, etc. may be a known method, for example, a method of laminating a fibrous or powdered material and sintering it, a method of processing into a membrane or filter paper, etc. Can be mentioned.
Moreover, you may combine the filter from which the filtration hole diameter differs as described in Unexamined-Japanese-Patent No. 2-262504. That is, a combination having a large filtration pore diameter on the solution inflow side and a small filtration pore diameter on the solution outflow side is combined. As described above, in order to manufacture a combination of filters having different filter pore diameters, each filter may be manufactured and then bonded. However, a fiber having a large diameter is used on the liquid inflow side, and a fiber having a small diameter is used. It is preferable to use on the liquid outflow side and sinter in a mold in a laminated state. The number of stacked layers is not particularly limited, but usually 2 to 3 layers may be increased as necessary.

また、本発明のブロッキング試薬でブロッキング処理されているフィルターを製造するには、シリコーン被膜でコーティングされているフィルターに、濃度０．０１〜５重量％程度のブロッキング試薬溶液を通液すればよい。 In order to produce a filter that is blocked with the blocking reagent of the present invention, a blocking reagent solution having a concentration of about 0.01 to 5% by weight may be passed through the filter coated with a silicone film.

本発明のフィルターの用途としては、液体クロマトグラフィーのラインフィルター、カラムの試料導入側及び試料導出側のフィルターなどがある。 Applications of the filter of the present invention include liquid chromatography line filters, filters on the sample introduction side and sample outlet side of the column, and the like.

本発明のフィルターをラインフィルターとして用いる場合について以下説明する。ラインフィルターは、フィルターがホルダー内に装着されて構成されている。本発明のフィルターがラインフィルター中に装着される態様は、従来の態様と同様である。 The case where the filter of the present invention is used as a line filter will be described below. The line filter is configured by mounting a filter in a holder. The mode in which the filter of the present invention is mounted in the line filter is the same as the conventional mode.

図２は、本発明のフィルターが装着されるホルダーの一例を示す断面図である。ホルダー３は半体３ａ及び３ｂからなり（図２に矢印で示したように、半体３ａ側を液体流入側とし、半体３ｂ側を液体流出側とする）、半体３ａには内面の一部に雌ねじが設けられており、半体３ｂにはその外周面に上記雌ねじに螺合する雄ねじが設けられている。各半体３ａ及び３ｂは、液体の通流方向に並設されている。半体３ａの内部には、それぞれ開口部が相互に対向するように形成された円柱状の空間部３１ａと円錐状の空間部３２ａが設けられ、更に、該空間部３２ａの先端には薄い円板状の空間部３３ａが設けられており、また、円柱状の空間部３１ａを形成している部分の半体３ａの内面には雌ねじが設けられ、この雌ねじに溶離液などの液体が通流するための配管がネジ止めされ得るようにされている。また、半体３ｂの内部にも、それぞれ開口部が相互に対向するように形成された円柱状の空間部３１ｂと円錐状の空間部３２ｂが設けられ、円柱状の空間部３１ｂを形成している部分の半体３ｂの内面には雌ねじが設けられ、この雌ねじに液体が通流するための配管がネジ止めされ得るようにされている。 FIG. 2 is a cross-sectional view showing an example of a holder to which the filter of the present invention is attached. The holder 3 is composed of half bodies 3a and 3b (as shown by arrows in FIG. 2, the half body 3a side is the liquid inflow side and the half body 3b side is the liquid outflow side). A female screw is provided in part, and a male screw that is screwed onto the female screw is provided on the outer peripheral surface of the half body 3b. The half bodies 3a and 3b are juxtaposed in the liquid flow direction. A cylindrical space 31a and a conical space 32a are formed inside the half 3a so that the openings face each other, and a thin circle is formed at the tip of the space 32a. A plate-like space portion 33a is provided, and a female screw is provided on the inner surface of the half body 3a of the portion forming the cylindrical space portion 31a, and a liquid such as an eluent flows through the female screw. The piping for doing so can be screwed. Also, a cylindrical space portion 31b and a conical space portion 32b formed so that the openings are opposed to each other are provided inside the half body 3b, thereby forming a cylindrical space portion 31b. A female screw is provided on the inner surface of the half body 3b, and a pipe through which a liquid flows can be screwed to the female screw.

上記円錐状の空間部３２ａ及び３２ｂの円錐の頂角Ａは、試料をフィルター全体に導くことによりフィルター全体で濾過されるようにし、しかも、試料の拡散を最小に抑える大きさであることが好ましい。上記頂角Ａは、９０度よりも小さくなると、空間部が大きくなり、試料の拡散が起こり易くなり、１７９度よりも大きくなると、更に、空間部が大きくなり、試料の拡散が起こり易くなるので、９０〜１７９度が好ましく、１００〜１７０度がより好ましい。 The apex angle A of the cones of the conical spaces 32a and 32b is preferably of such a size that the sample is filtered through the entire filter by guiding the sample to the entire filter, and the diffusion of the sample is minimized. . When the apex angle A is smaller than 90 degrees, the space portion becomes large and sample diffusion is likely to occur. When the vertex angle A is larger than 179 degrees, the space portion is further increased and sample diffusion is likely to occur. 90 to 179 degrees is preferable, and 100 to 170 degrees is more preferable.

ホルダー３の形状は、例えば、円柱状、立方体状など特に限定されない。 The shape of the holder 3 is not particularly limited, such as a columnar shape or a cubic shape.

また、ホルダー３は、フィルター交換時に工具を使う必要がないように、図３に示すように、半体３ａと３ｂの外周面を、それぞれ円筒形の被覆部３４ａと３４ｂで被覆することにより、ホルダーの大きさを大きくして、手で十分締められるようにしてもよい。 Further, as shown in FIG. 3, the holder 3 covers the outer peripheral surfaces of the halves 3a and 3b with cylindrical covering portions 34a and 34b, respectively, so that it is not necessary to use a tool when replacing the filter. The size of the holder may be increased so that it can be sufficiently tightened by hand.

ホルダーの材質としてはステンレス等の金属；ポリエチレン、ポリエーテルエーテルケトン、フッ素樹脂、ポリエーテルエーテルケトンとフッ素樹脂の混合物等のプラスチックなどが挙げられるが、生体試料の吸着が少ないポリエーテルエーテルケトンやフッ素樹脂が好ましい。また、生体試料の吸着が起こり易い材質のもの、例えば、ステンレスのようなものは、シリコーン被膜でコーティングしてもよい。 Examples of the material of the holder include metals such as stainless steel; polyethylene, polyetheretherketone, fluororesin, and plastic such as a mixture of polyetheretherketone and fluororesin. Resins are preferred. In addition, a material that easily absorbs a biological sample, such as stainless steel, may be coated with a silicone coating.

図４は、本発明のフィルター１がホルダー３内に装着されて構成されているラインフィルター５の断面図である。ラインフィルター５においては、ホルダー３の半体３ａの薄い円板状の空間部３３ａに本発明のフィルター１が収められている。 FIG. 4 is a cross-sectional view of a line filter 5 configured by mounting the filter 1 of the present invention in the holder 3. In the line filter 5, the filter 1 of the present invention is housed in a thin disk-shaped space 33 a of the half 3 a of the holder 3.

ホルダー３とフィルター１との間の気密性を十分保てない場合は、ホルダー３とフィルター１の間にシール部材２を設ける必要がある。具体的には、ホルダー３とフィルター１の間に隙間ができないように、図５（イ）、（ロ）に示すように、フィルター１をシール部材２で囲む方法がある。 When the airtightness between the holder 3 and the filter 1 cannot be maintained sufficiently, it is necessary to provide the seal member 2 between the holder 3 and the filter 1. Specifically, there is a method of surrounding the filter 1 with a seal member 2 as shown in FIGS. 5A and 5B so that there is no gap between the holder 3 and the filter 1.

上記シール部材の材質は、フィルターを保持できる強度を有するものであれば特に限定されず、例えば、ポリエーテルエーテルケトン、フッ素樹脂、ポリエーテルエーテルケトンとフッ素樹脂の混合物、ステンレスなどが挙げられる。シール部材の大きさ及び形状については、フィルターの形状にフィットした形状が好ましく、しかも、試料の拡散を起こさない大きさ及び形状が好ましい。 The material of the sealing member is not particularly limited as long as it has strength capable of holding the filter, and examples thereof include polyether ether ketone, fluororesin, a mixture of polyether ether ketone and fluororesin, and stainless steel. As for the size and shape of the seal member, a shape that fits the shape of the filter is preferable, and a size and shape that does not cause diffusion of the sample are preferable.

本発明の液体クロマトグラフィー用カラムは、本発明の液体クロマトグラフィー用フィルターが装着されたことを特徴とする。以下、本発明の液体クロマトグラフィー用カラムについて説明する。 The liquid chromatography column of the present invention is equipped with the liquid chromatography filter of the present invention. Hereinafter, the column for liquid chromatography of the present invention will be described.

本発明の液体クロマトグラフィー用カラムは、本発明のフィルターがカラムの試料導入側及び試料導出側のフィルターとして装着されている。すなわち、本発明の液体クロマトグラフィー用カラムは、図６に示すように、フィルター１として本発明のフィルターが装着されている他は、図８に示した従来の液体クロマトグラフィー用カラムと同様である。 In the liquid chromatography column of the present invention, the filter of the present invention is mounted as a filter on the sample introduction side and the sample outlet side of the column. That is, the liquid chromatography column of the present invention is the same as the conventional liquid chromatography column shown in FIG. 8 except that the filter of the present invention is mounted as the filter 1 as shown in FIG. .

本発明のフィルター及びカラムは、生体試料の吸着が特に少ない。従って、本発明のフィルター又はカラムを用いた液体クロマトグラフィーは、生体試料の分離に特に適している。上記生体試料とは、血液、血清、血漿、尿などの生体由来の試料を指し、その中には、蛋白質や脂質などが含まれているものである。 The filter and column of the present invention have particularly low adsorption of biological samples. Therefore, liquid chromatography using the filter or column of the present invention is particularly suitable for separating biological samples. The biological sample refers to a sample derived from a living body such as blood, serum, plasma, urine and the like, and includes protein, lipid, and the like.

本発明のフィルターを用いた液体クロマトグラフィー用カラムにおいて、カラム本体（カラムの管部分）の材質は、カラム本体としての強度を有するものであれば特に限定されず、例えば、ステンレス、チタン等の金属；ポリエーテルエーテルケトン等のプラスチック；ガラス；ステンレス等の金属の内面をフッ素樹脂又はポリエーテルエーテルケトン等で被覆したものなどが挙げられる。 In the column for liquid chromatography using the filter of the present invention, the material of the column main body (column tube portion) is not particularly limited as long as it has strength as the column main body. For example, metals such as stainless steel and titanium A plastic such as polyetheretherketone; glass; a metal such as stainless steel whose inner surface is coated with a fluororesin or polyetheretherketone.

上記カラム本体は、必要に応じて、シリコーン被膜でコーティングされてもよい。この場合に用いられるシリコーン被膜、およびシリコーン被膜の厚さは、フィルターに用いられるシリコーン被膜として前述したものと同様である。 The column body may be coated with a silicone film as necessary. The silicone coating used in this case and the thickness of the silicone coating are the same as those described above for the silicone coating used for the filter.

上記シリコーン被膜でカラム本体をコーティングする場合、カラム本体全体をコーティングする必要はなく、少なくとも分析試料が接触する部分（すなわち、カラム本体内側）がコーティングされていればよい。
カラム本体内側のコーティングの割合は、内側部の全表面積に対して、好ましくは、１０％以上、より好ましくは、３０％以上、最も好ましくは、６０％以上である。 When the column main body is coated with the silicone film, it is not necessary to coat the entire column main body, and it is sufficient that at least a portion in contact with the analysis sample (that is, the inside of the column main body) is coated.
The ratio of the coating inside the column body is preferably 10% or more, more preferably 30% or more, and most preferably 60% or more with respect to the total surface area of the inner part.

上記のシリコーン被膜でコーティングされたカラム本体を製造するには、上記記載のカラム本体に硬化型シリコーンを塗布、又はコーティングし、室温、又は、加温して硬化させる方法が挙げられる。 In order to manufacture the column main body coated with the above-mentioned silicone film, a method of applying or coating curable silicone to the above-described column main body and curing it by heating at room temperature or by heating is exemplified.

また、上記カラム本体は、必要に応じて、ブロッキング試薬でブロッキングされてもよい。上記ブロッキング試薬及びブロッキング方法としては、フィルターに用いられるブロッキングとして前述したものと同様である。 Moreover, the said column main body may be blocked with a blocking reagent as needed. The blocking reagent and the blocking method are the same as those described above as the blocking used for the filter.

本発明のフィルターを用いた液体クロマトグラフィーにおいて、溶離液などの移動相は、公知のものでよい。また、液体クロマトグラフ装置も公知のものでよい。 In the liquid chromatography using the filter of the present invention, a mobile phase such as an eluent may be a known one. The liquid chromatograph apparatus may also be a known one.

本発明のカラムを用いた液体クロマトグラフィーにおいて、溶離液などの移動相は、公知のものでよく、また、液体クロマトグラフ装置も公知のものでよい。 In the liquid chromatography using the column of the present invention, the mobile phase such as the eluent may be a known one, and the liquid chromatograph apparatus may also be a known one.

本発明の請求項６記載のヘモグロビン類の測定方法は、本発明の液体クロマトグラフィー用フィルターを用いることを特徴とする。 The method for measuring hemoglobin according to claim 6 of the present invention is characterized by using the filter for liquid chromatography of the present invention.

本発明の請求項７記載のヘモグロビン類の測定方法は、本発明の液体クロマトグラフィー用カラムを用いることを特徴とする。 The method for measuring hemoglobin according to claim 7 of the present invention is characterized by using the column for liquid chromatography of the present invention.

（作用）
本発明のフィルターは、シリコーン被膜でコーティングされているので、生体試料の吸着が起こりにくいため、フィルター寿命が長く、また、同様に、試料の吸着が少ないので、フィルター中で試料の拡散が起こりにくいため、分離性能に悪影響を与えない。
更に、ブロッキング試薬でブロッキング処理されているフィルターにおいては、上記の作用の全てを奏すると共に、更に、より一層、生体試料の吸着が起こりにくいため、生体試料の液体クロマトグラフ測定に使用すると、測定の最初から正確な測定値を得ることができる。 (Function)
Since the filter of the present invention is coated with a silicone film, the biological sample is hardly adsorbed, so the filter life is long. Similarly, the sample is hardly adsorbed, so that the sample is hardly diffused in the filter. Therefore, the separation performance is not adversely affected.
Furthermore, a filter that has been subjected to a blocking treatment with a blocking reagent exhibits all of the above-mentioned effects, and furthermore, the biological sample is less likely to be adsorbed. Accurate measurements can be obtained from the beginning.

本発明のカラムは、本発明のフィルターを装着しているので、寿命が長く、分離性能に悪影響を与えない。 Since the column of the present invention is equipped with the filter of the present invention, the lifetime is long and the separation performance is not adversely affected.

本発明の請求項６記載のヘモグロビン類の測定方法は、本発明の液体クロマトグラフィー用フィルターを用いているため、ヘモグロビン類がフィルターに吸着しにくいので、フィルター寿命が長い。また、同様に、ヘモグロビン類がフィルターに吸着しにくいので、フィルター中でのヘモグロビン類の拡散が少なくヘモグロビン類の分離性能に悪影響を与えない。また、ヘモグロビン類の分離に適したｐＨ範囲において、ヘモグロビン類の吸着が非常に起こりにくいので、ヘモグロビン類の分離性能に悪影響を与えない。 Since the method for measuring hemoglobin according to claim 6 of the present invention uses the filter for liquid chromatography of the present invention, it is difficult for hemoglobin to be adsorbed to the filter, so the filter life is long. Similarly, since hemoglobins are difficult to adsorb on the filter, there is little diffusion of hemoglobin in the filter, and the separation performance of hemoglobin is not adversely affected. Further, since the adsorption of hemoglobin hardly occurs in a pH range suitable for the separation of hemoglobins, the separation performance of hemoglobins is not adversely affected.

本発明の請求項７記載のヘモグロビン類の測定方法は、本発明の液体クロマトグラフィー用フィルターを用いたカラムを用いるので、ヘモグロビン類が吸着しにくいため、カラム寿命が長い。また、同様に、フィルターにヘモグロビン類が吸着しにくいので、カラム中でヘモグロビン類の拡散が少なく、ヘモグロビン類を効果的に分離できる。また、ヘモグロビン類の分離に適したｐＨ範囲において、ヘモグロビン類の吸着が非常に起こりにくいので、ヘモグロビン類が効果的に分離できる。 In the method for measuring hemoglobin according to claim 7 of the present invention, since the column using the filter for liquid chromatography of the present invention is used, hemoglobins are hardly adsorbed, and therefore the column life is long. Similarly, since hemoglobins are difficult to adsorb on the filter, hemoglobins can be effectively separated in the column with little diffusion of hemoglobins. Further, since the adsorption of hemoglobin hardly occurs in the pH range suitable for the separation of hemoglobin, the hemoglobin can be effectively separated.

本発明の液体クロマトグラフィー用フィルターの構成は、上記の通りであり、生体試料の吸着がおこりにくいシリコーン被膜でコーティングされているので、フィルター性能の寿命が長く、しかも、試料の吸着が少ないので、フィルター中で試料拡散が起こりにくいため、分離性能に悪影響を与えない。 The structure of the filter for liquid chromatography of the present invention is as described above, and is coated with a silicone film that hardly adsorbs a biological sample, so the life of the filter performance is long and the sample adsorption is small. Since sample diffusion hardly occurs in the filter, the separation performance is not adversely affected.

本発明の請求項２記載の液体クロマトグラフィー用フィルターの構成は、上記の通りであり、生体試料の吸着がおこりにくいシリコーン被膜でコーティングされており、更に、ブロッキング試薬でブロッキング処理されているので、上記の効果の全てを奏すると共に、更に、より一層、生体試料の吸着が起こりにくいため、生体試料の液体クロマトグラフ測定に使用すると、測定の最初から正確な測定値を得ることができる。 The configuration of the filter for liquid chromatography according to claim 2 of the present invention is as described above, and is coated with a silicone film that is difficult to adsorb a biological sample, and is further subjected to a blocking treatment with a blocking reagent. While exhibiting all of the above effects, the biological sample is further less likely to be adsorbed. Therefore, when used for liquid chromatographic measurement of a biological sample, an accurate measurement value can be obtained from the beginning of the measurement.

本発明の請求項３記載の液体クロマトグラフィー用カラムの構成は、上記の通りであり、生体試料の吸着がおこりにくいシリコーン被膜でコーティングされているフィルターを用いているので、寿命が長く、分離性能に悪影響を与えない。 The configuration of the column for liquid chromatography according to claim 3 of the present invention is as described above, and uses a filter coated with a silicone film that hardly adsorbs a biological sample. Will not be adversely affected.

本発明の請求項４記載の液体クロマトグラフィー用カラムの構成は、上記の通りであり、生体試料の吸着がおこりにくいシリコーン被膜でコーティングされているフィルター及びカラム本体を用いているので、より寿命が長く、より分離性能に悪影響を与えない。 The configuration of the column for liquid chromatography according to claim 4 of the present invention is as described above, and uses a filter and a column body coated with a silicone film that hardly adsorbs a biological sample. Longer and does not adversely affect the separation performance.

本発明の請求項５記載の液体クロマトグラフィー用カラムの構成は、上記の通りであり、更に、カラム本体がブロッキング試薬でブロッキング処理されているので、請求項３又は４記載のカラムの効果に加えて、測定の最初からより正確な測定値を得ることができる。 The configuration of the column for liquid chromatography according to claim 5 of the present invention is as described above, and further, since the column body is blocked with a blocking reagent, in addition to the effect of the column according to claim 3 or 4 Thus, a more accurate measurement value can be obtained from the beginning of the measurement.

本発明の液体クロマトグラフィー用フィルターを用いるヘモグロビン類の測定方法は、広いｐＨの範囲でヘモグロビン類の吸着が少ないシリコーン被膜でコーティングされたフィルターを用いているので、フィルターの寿命が長い。そのため、フィルターの交換頻度がきわめて少なくなる。また、ヘモグロビン類の吸着が少ないフィルターを用いているので、ヘモグロビン類分析の分離性能に悪影響を与えない。 The method for measuring hemoglobin using the filter for liquid chromatography of the present invention uses a filter coated with a silicone film that hardly adsorbs hemoglobin over a wide pH range, and therefore has a long filter life. Therefore, the filter replacement frequency is extremely low. In addition, since a filter with little adsorption of hemoglobin is used, the separation performance of hemoglobin analysis is not adversely affected.

本発明の液体クロマトグラフィー用カラムを用いるヘモグロビン類の測定方法は、広いｐＨの範囲でヘモグロビン類の吸着が少ないシリコーン被膜でコーティングされたフィルターを用いたカラムを用いているので、カラムーの寿命が長い。また、ヘモグロビン類の吸着が少ないフィルターを用いているので、カラム中でのヘモグロビン類の拡散が起こりにくいためヘモグロビン類分析の分離性能に悪影響を与えない。 The method for measuring hemoglobin using the column for liquid chromatography of the present invention uses a column using a filter coated with a silicone coating that has little adsorption of hemoglobin over a wide pH range, so the lifetime of the column is long. . In addition, since a filter with little adsorption of hemoglobins is used, the hemoglobins are not easily diffused in the column, so that the separation performance of hemoglobin analysis is not adversely affected.

以下、本発明の実施例及び比較例を挙げることにより、本発明を詳細に説明する。 Hereinafter, the present invention will be described in detail by giving examples and comparative examples of the present invention.

（実施例１）
図１（イ）に示した形状のフィルターをステンレス焼結体の一体成形品として製造した。その構造の詳細は、直径５ｍｍ、厚さが１．５ｍｍの円柱体からなり、濾過孔径は２μｍとした。次に、コーティング剤として、２液型硬化型シリコーンを用い、上記ステンレス製フィルター全体をシリコーンコーティングした（濾過孔の中は、コーティング剤を通液した）。その後、１００℃で３０分間加熱して乾燥・硬化させ、均一なコーティング層を形成させ、本発明のフィルター１を得た。
次に、このフィルター１をフッ素樹脂（テフロン（登録商標））製のシール部材２に挿入した後、図４に示すように、ステンレス製ホルダー３（頂角Ａ＝９０度）に嵌め込み、半体３ａ及び３ｂ同士をネジ結合して、ラインフィルター５を作製した。 Example 1
A filter having the shape shown in FIG. 1 (a) was manufactured as an integrally molded product of a stainless sintered body. The details of the structure consisted of a cylindrical body having a diameter of 5 mm and a thickness of 1.5 mm, and the filtration pore diameter was 2 μm. Next, a two-pack curable silicone was used as a coating agent, and the entire stainless steel filter was silicone-coated (the coating agent was passed through the filtration holes). Then, it heated at 100 degreeC for 30 minute (s), and was made to dry and harden | cure, the uniform coating layer was formed, and the filter 1 of this invention was obtained.
Next, this filter 1 is inserted into a fluororesin (Teflon (registered trademark)) sealing member 2 and then fitted into a stainless steel holder 3 (vertical angle A = 90 degrees) as shown in FIG. 3a and 3b were screwed together, and the line filter 5 was produced.

（実施例２）
実施例１と同様にして得られた本発明のフィルター１をフッ素樹脂（テフロン（登録商標））製のシール部材２に挿入した後、ポリエーテルエーテルケトン製のホルダー３（頂角Ａ＝１５０度）に嵌め込み、半体３ａ及び３ｂ同士をネジ結合して、ラインフィルター５を作製した。 (Example 2)
After inserting the filter 1 of the present invention obtained in the same manner as in Example 1 into a sealing member 2 made of fluororesin (Teflon (registered trademark)), a holder 3 made of polyetheretherketone (vertical angle A = 150 degrees). ), And the half bodies 3a and 3b are screwed together to produce a line filter 5.

（比較例１）
図１（イ）に示したフィルターを、ステンレス焼結体の一体成形品として製造した。その構造の詳細は、直径５ｍｍ、厚さが１．５ｍｍの円柱体からなり、濾過孔径は２μｍとした。
次に、このフィルターをフッ素樹脂（テフロン（登録商標））製のシール部材２に挿入した後、ステンレス製ホルダー３（頂角Ａ＝９０度）に嵌め込み、半体３ａ及び３ｂ同士をネジ結合して、ラインフィルター５を作製した。 (Comparative Example 1)
The filter shown in FIG. 1 (a) was manufactured as an integrally molded product of a stainless sintered body. The details of the structure consisted of a cylindrical body having a diameter of 5 mm and a thickness of 1.5 mm, and the filtration pore diameter was 2 μm.
Next, this filter is inserted into a seal member 2 made of fluororesin (Teflon (registered trademark)) and then fitted into a stainless steel holder 3 (vertical angle A = 90 degrees), and the halves 3a and 3b are screwed together. Thus, a line filter 5 was produced.

（比較例２）
図１（イ）に示した形状のフィルターをステンレス焼結体の一体成形品として製造した。その構造の詳細は、直径５ｍｍ、厚さが１．５ｍｍの円柱体からなり、濾過孔径は２μｍとした。
次に、従来の技術の項に記載したＣＬＤ法により、二酸化珪素被膜をフィルターに形成させる処理をした。具体的には、日本曹達社製アトロンをＨＰＬＣ用ポンプ（島津製作所社製）を用いて、上記フィルターの内部まで通液した後、余剰の液をフィルター内部から除去した。その後、２００℃で３０分間乾燥し、次に、５００℃で３０分間加熱し、二酸化珪素被膜を形成させた。
次に、このフィルターをフッ素樹脂（テフロン（登録商標））製のシール部材２に挿入した後、ポリエーテルエーテルケトン製ホルダー３（頂角Ａ＝１５０度）に嵌め込み、半体３ａ及び３ｂ同士をネジ結合して、ラインフィルター５を作製した。 (Comparative Example 2)
A filter having the shape shown in FIG. 1 (a) was manufactured as an integrally molded product of a stainless sintered body. The details of the structure consisted of a cylindrical body having a diameter of 5 mm and a thickness of 1.5 mm, and the filtration pore diameter was 2 μm.
Next, the silicon dioxide film was formed on the filter by the CLD method described in the section of the prior art. Specifically, Atron manufactured by Nippon Soda Co., Ltd. was passed through the inside of the filter using an HPLC pump (manufactured by Shimadzu Corporation), and then the excess liquid was removed from the inside of the filter. Thereafter, the film was dried at 200 ° C. for 30 minutes, and then heated at 500 ° C. for 30 minutes to form a silicon dioxide film.
Next, after inserting this filter into a seal member 2 made of fluororesin (Teflon (registered trademark)), the filter 3 is fitted into a polyether ether ketone holder 3 (vertical angle A = 150 degrees), and the halves 3a and 3b are attached to each other. The line filter 5 was produced by screw connection.

実施例１、２及び比較例１、２で得られたラインフィルターを用いて以下のようにして、（１）吸着性の評価、及び（２）生体試料の吸着性とｐＨ（ｐＨ５．０、ｐＨ６．０、ｐＨ７．０）の関係の評価を行った。 Using the line filters obtained in Examples 1 and 2 and Comparative Examples 1 and 2, as follows, (1) evaluation of adsorptivity, and (2) adsorptivity and pH of biological sample (pH 5.0, The relationship between pH 6.0 and pH 7.0) was evaluated.

（１）吸着性の評価
以下に示した測定条件を用い、実施例１、２又は比較例１、２で作製したラインフィルターのみを用いて（すなわち、カラムは使用せず）、ヘモグロビン類の測定をすることにより、生体試料の吸着性について検討した。
測定条件
システム：送液ポンプ：ＬＣ−９Ａ（島津製作所社製）
オートサンプラ：ＡＳＵ−４２０（積水化学社製）
検出器：ＳＰＤ−６ＡＶ（島津製作所社製）
溶離液：溶離液Ａ：１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ５．８）
溶離液Ｂ：３００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．８）
測定開始より０〜３分の間は溶離液Ａを流し、３〜５分の間は溶離液Ｂを流し、５〜１０分の間は溶離液Ａを流した。
流速：２．０ｍｌ／分
検出波長：４１５ｎｍ
試料注入量：１０μｌ (1) Evaluation of adsorptivity Measurement of hemoglobins using only the line filters prepared in Examples 1 and 2 or Comparative Examples 1 and 2 (that is, not using a column) using the measurement conditions shown below. As a result, the adsorptivity of the biological sample was examined.
Measurement conditions System: Liquid feed pump: LC-9A (manufactured by Shimadzu Corporation)
Autosampler: ASU-420 (manufactured by Sekisui Chemical Co., Ltd.)
Detector: SPD-6AV (manufactured by Shimadzu Corporation)
Eluent: Eluent A: 100 mM phosphate buffer (pH 5.8)
Eluent B: 300 mM phosphate buffer (pH 6.8)
The eluent A was allowed to flow for 0 to 3 minutes from the start of measurement, the eluent B was allowed to flow for 3 to 5 minutes, and the eluent A was allowed to flow for 5 to 10 minutes.
Flow rate: 2.0 ml / min Detection wavelength: 415 nm
Sample injection volume: 10 μl

測定試料
以下のようにして調製した糖負荷血液を用いた。
血液抗凝固剤としてフッ化ナトリウムを用いて採血した健常人血に、５００ｍｇ／ｄｌとなるようグルコース水溶液を添加し、３７℃で３時間反応させた後、溶血希釈液Ｘ（０．１重量％トリトンＸ−１００のリン酸緩衝液溶液、ｐＨ７．０）で溶血し、１５０倍に希釈して測定試料とした。 Measurement sample Sugar-loaded blood prepared as follows was used.
A blood glucose solution was added to a healthy human blood sampled using sodium fluoride as a blood anticoagulant to give 500 mg / dl and reacted at 37 ° C. for 3 hours, followed by hemolysis dilution X (0.1 wt% The sample was hemolyzed with a phosphate buffer solution of Triton X-100 (pH 7.0) and diluted 150 times to obtain a measurement sample.

測定結果
上記測定条件により、測定試料を測定して得られた代表的なクロマトグラムを図９（イ）（ラインフィルター使用せず）、図９（ロ）（実施例１又は２のラインフィルター使用）、図９（ハ）（比較例１又は２のラインフィルター使用）に示した。ピーク６１はヘモグロビン類のピークを示す（なお、カラムで分離されていないので単一のピークとなっている）。ピーク６２は、溶離液Ａではフィルタに吸着したヘモグロビン類が溶離液Ｂによって脱着したために表れたピークと思われる。 Measurement Results Typical chromatograms obtained by measuring a measurement sample under the above measurement conditions are shown in FIG. 9 (A) (without using a line filter) and FIG. 9 (B) (using the line filter of Example 1 or 2). ) And FIG. 9C (using the line filter of Comparative Example 1 or 2). The peak 61 shows a peak of hemoglobins (note that it is a single peak because it is not separated by a column). The peak 62 seems to be a peak appearing in the eluent A because hemoglobin adsorbed on the filter is desorbed by the eluent B.

評価方法
ラインフィルターを装着せずに、測定試料を測定したときのヘモグロビン類のピーク面積を１００％として、実施例１、実施例２、比較例１、比較例２のラインフィルターを用いて測定（ｎ＝５）したときのヘモグロビン類のピーク面積（ピーク６１の面積）から、以下の式により溶離液Ａによる回収率を求め、結果を表１に示した。
回収率（％）＝（ラインフィルター装着時のヘモグロビン類のピーク面積）÷（ラインフィルター装着なし時のヘモグロビン類のピーク面積）×１００ Evaluation method Measurement was performed using the line filters of Example 1, Example 2, Comparative Example 1, and Comparative Example 2 with the peak area of hemoglobin measured when the measurement sample was measured without attaching the line filter as 100% ( From the peak area of hemoglobin when n = 5) (the area of peak 61), the recovery rate by the eluent A was determined by the following formula. The results are shown in Table 1.
Recovery rate (%) = (peak area of hemoglobin when line filter is installed) ÷ (peak area of hemoglobin without line filter) x 100

比較例１、２では、回収率の平均値がそれぞれ５６．４０％、５８．８０％であったのが、実施例１及び２では、回収率の平均値がそれぞれ９７．８４％、９８．１２％であった。以上より、実施例１及び２のラインフィルターを用いたものでは、比較例１及び２のラインフィルターを用いたものに比べてヘモグロビン類の吸着が少なかったことがわかる。 In Comparative Examples 1 and 2, the average values of the recovery rates were 56.40% and 58.80%, respectively. In Examples 1 and 2, the average values of the recovery rates were 97.84% and 98.80%, respectively. It was 12%. From the above, it can be seen that the samples using the line filters of Examples 1 and 2 had less adsorption of hemoglobin than the samples using the line filters of Comparative Examples 1 and 2.

また、表１（及び後述の表２）における、ＣＶ（％）とは変動係数（すなわち、ＣＶ（％）＝標準偏差÷平均値×１００）のことであるが、比較例１、２のラインフィルターを用いたものは、実施例１又は２のラインフィルターを用いたものに比較してＣＶがはるかに大きく、ヘモグロビン類の吸着量のばらつきが大きいことが分かる。 In Table 1 (and Table 2 described later), CV (%) is a coefficient of variation (that is, CV (%) = standard deviation ÷ average value × 100). It can be seen that the filter using the filter has a much larger CV than the filter using the line filter of Example 1 or 2, and the variation in the amount of adsorption of hemoglobins is large.

（２）生体試料の吸着性とｐＨの関係の評価
以下に示した測定条件を用い、実施例１、２又は比較例１、２で作製したラインフィルターのみを用いて（すなわち、カラムは使用せず）、ヘモグロビン類の測定をすることにより、生体試料の吸着性とｐＨ（ｐＨ５．０、ｐＨ６．０、ｐＨ７．０）の関係を評価した。 (2) Evaluation of relationship between adsorptivity and pH of biological sample Using the measurement conditions shown below, using only the line filters prepared in Examples 1 and 2 or Comparative Examples 1 and 2 (that is, using the column) 1) By measuring hemoglobin, the relationship between the adsorptivity of the biological sample and pH (pH 5.0, pH 6.0, pH 7.0) was evaluated.

測定条件
システム：送液ポンプ：ＬＣ−９Ａ（島津製作所社製）
オートサンプラ：ＡＳＵ−４２０（積水化学社製）
検出器：ＳＰＤ−６ＡＶ（島津製作所社製）
溶離液：溶離液Ａ：１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ５．０、ｐＨ６．０、ｐＨ７．０）
溶離液Ｂ：３００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．８）
測定開始より０〜３分の間は溶離液Ａを流し、３〜５分の間は溶離液Ｂを流し、５〜１０分の間は溶離液Ａを流した。
流速：２．０ｍｌ／分
検出波長：４１５ｎｍ
試料注入量：１０μｌ Measurement conditions System: Liquid feed pump: LC-9A (manufactured by Shimadzu Corporation)
Autosampler: ASU-420 (manufactured by Sekisui Chemical Co., Ltd.)
Detector: SPD-6AV (manufactured by Shimadzu Corporation)
Eluent: Eluent A: 100 mM phosphate buffer (pH 5.0, pH 6.0, pH 7.0)
Eluent B: 300 mM phosphate buffer (pH 6.8)
The eluent A was allowed to flow for 0 to 3 minutes from the start of measurement, the eluent B was allowed to flow for 3 to 5 minutes, and the eluent A was allowed to flow for 5 to 10 minutes.
Flow rate: 2.0 ml / min Detection wavelength: 415 nm
Sample injection volume: 10 μl

測定試料
血液抗凝固剤としてフッ化ナトリウムを用いて採血した健常人血を、溶血希釈液Ｘ（０．１重量％トリトンＸ−１００のリン酸緩衝液溶液、ｐＨ７．０）で溶血し、１５０倍に希釈して測定試料とした。 Measurement Sample Healthy human blood collected using sodium fluoride as a blood anticoagulant was hemolyzed with hemolysis dilution X (0.1 wt% Triton X-100 phosphate buffer solution, pH 7.0), and 150 The sample was diluted twice.

評価方法
ラインフィルターを装着せずに、測定試料を測定したときのヘモグロビン類のピーク面積を１００％として、実施例１、実施例２、比較例１又は比較例２で得られたラインフィルターを用いて測定（ｎ＝５）したときのヘモグロビン類のピーク面積から、以下の式により溶離液Ａによる回収率を求め、結果を表２及び表３に示した。
回収率（％）＝（ラインフィルター装着時のヘモグロビン類のピーク面積）÷（ラインフィルター装着なし時のヘモグロビン類のピーク面積）×１００ Evaluation method Using the line filter obtained in Example 1, Example 2, Comparative Example 1 or Comparative Example 2 with the peak area of hemoglobin measured when the measurement sample is measured without attaching the line filter as 100% From the peak area of hemoglobin when measured (n = 5), the recovery rate by the eluent A was determined by the following formula, and the results are shown in Tables 2 and 3.
Recovery rate (%) = (peak area of hemoglobin when line filter is installed) ÷ (peak area of hemoglobin without line filter) x 100

比較例１では、ｐＨ５．０、ｐＨ６．０、ｐＨ７．０での回収率がそれぞれ平均１３．５６％、７６．５２％、９１．９８％であった。比較例２では、ｐＨ５．０、ｐＨ６．０、ｐＨ７．０での回収率がそれぞれ平均２４．６６％、７７．０４％、９１．７０％であった。また、ＣＶ％は、比較例１、２でｐＨが低くなるほど悪くなり、ｐＨ５．０で、それぞれ３７．２７％、１２．２１％であった。
実施例１では、ｐＨ５．０、ｐＨ６．０、ｐＨ７．０での回収率がそれぞれ平均９７．２４％、９７．８８％、９７．８４％であった。
実施例２では、ｐＨ５．０、ｐＨ６．０、ｐＨ７．０での回収率がそれぞれ平均９８．０２％、９８．４２％、９８．５６％であった。
また、実施例１及び実施例２でのＣＶ％は、いずれのｐＨにおいても、１％以下であった。 In Comparative Example 1, the average recovery rates at pH 5.0, pH 6.0, and pH 7.0 were 13.56%, 76.52%, and 91.98%, respectively. In Comparative Example 2, the recovery rates at pH 5.0, pH 6.0, and pH 7.0 averaged 24.66%, 77.04%, and 91.70%, respectively. Moreover, CV% worsened as the pH decreased in Comparative Examples 1 and 2, and was 37.27% and 12.21% at pH 5.0, respectively.
In Example 1, the recovery rates at pH 5.0, pH 6.0, and pH 7.0 averaged 97.24%, 97.88%, and 97.84%, respectively.
In Example 2, the average recoveries at pH 5.0, pH 6.0, and pH 7.0 were 98.02%, 98.42%, and 98.56%, respectively.
Moreover, CV% in Example 1 and Example 2 was 1% or less at any pH.

以上より、比較例１のシリコーンコーティングしていないステンレス製フィルターではヘモグロビン類の吸着性は、ｐＨの影響を非常に強く受けることが明らかになった。また、ヘモグロビン類の定量には、通常、ｐＨ５〜９程度の溶離液を用いるのが一般的であるので、シリコーンコーティングしていないステンレス製フィルターではヘモグロビン類の吸着が極めて大きくなり、吸着率も大きくばらつくので、シリコーンコーティングしていないステンレス製フィルターをヘモグロビン類の測定に用いるとフィルター寿命が短くなり、データーのばらつく原因になると考えられる。また、比較例２のように、ステンレス製フィルターを二酸化珪素膜で被覆してもヘモグロビン類の吸着性は改善されなかった。
実施例１及び実施例２のシリコーンコーティングしたステンレス製フィルターでのヘモグロビン類の吸着性は、ｐＨ９．０から酸性側５．０付近までのｐＨの影響を受けず、回収率もほぼ１００％であった。
以上より、ヘモグロビン類の測定に用いるフィルターとしては、広いｐＨの範囲でヘモグロビン類の吸着が殆どないシリコーンコーティングしたフィルターを用いた方がよいことが明らかである。 From the above, it has been clarified that the adsorption property of hemoglobin is very strongly influenced by pH in the stainless steel filter of Comparative Example 1 which is not coated with silicone. In addition, since it is common to use an eluent having a pH of about 5 to 9 for the quantification of hemoglobins, the adsorption of hemoglobins is extremely large and the adsorption rate is large with a stainless steel filter not coated with silicone. Since it varies, using a stainless steel filter with no silicone coating for hemoglobin measurement may shorten the filter life and cause data variation. Further, as in Comparative Example 2, even when a stainless steel filter was covered with a silicon dioxide film, the adsorptivity of hemoglobins was not improved.
The adsorptivity of hemoglobin on the silicone-coated stainless steel filters of Example 1 and Example 2 was not affected by the pH from pH 9.0 to around 5.0 on the acidic side, and the recovery rate was almost 100%. It was.
From the above, it is clear that it is better to use a silicone-coated filter that hardly adsorbs hemoglobin over a wide pH range as a filter used for measuring hemoglobin.

（実施例３）
図１（イ）に示したフィルターを、ステンレス焼結体の一体成形品として製造した。その構造の詳細は、直径４．６ｍｍ、厚さが１．５ｍｍの円柱体からなり、濾過孔径は２μｍとした。次に、コーティング剤として、２液型硬化型シリコーンを用い、上記ステンレス製フィルター全体をシリコーンコーティングした（濾過孔の中は、コーティング剤を通液した）。その後、１００℃で３０分間加熱して乾燥・硬化させ、均一なコーティング層を形成させ、本発明のフィルター１を得た。
次に、このフィルター１をフッ素樹脂（テフロン（登録商標））製のシール部材２（外径６．３ｍｍ、内径４．６ｍｍ、厚さ１．５ｍｍ）に挿入した後、これを図６に示したステンレス製カラム本体４０（内径４．６ｍｍ、長さ３５ｍｍ）のカラム両端に取り付けるためのエンドフィッティング４２に装着した。 (Example 3)
The filter shown in FIG. 1 (a) was manufactured as an integrally molded product of a stainless sintered body. The details of the structure consisted of a cylindrical body having a diameter of 4.6 mm and a thickness of 1.5 mm, and the filtration pore diameter was 2 μm. Next, a two-pack curable silicone was used as a coating agent, and the entire stainless steel filter was silicone-coated (the coating agent was passed through the filtration holes). Then, it heated at 100 degreeC for 30 minute (s), and was made to dry and harden | cure, the uniform coating layer was formed, and the filter 1 of this invention was obtained.
Next, this filter 1 is inserted into a fluororesin (Teflon (registered trademark)) sealing member 2 (outer diameter 6.3 mm, inner diameter 4.6 mm, thickness 1.5 mm), and this is shown in FIG. A stainless steel column main body 40 (inner diameter 4.6 mm, length 35 mm) was attached to end fittings 42 for attachment to both ends of the column.

上記のカラム本体４０に、以下のようにして調製した充填剤を、以下に示すカラムの作製の項で述べるようにして充填して、本発明の液体クロマトグラフィー用カラムを製造した。
・充填剤の調製
テトラエチレングリコールジメタクリレート（新中村化学社製）４００ｇ及び２−アクリルアミド−２−メチルスルホン酸（和光純薬社製）１５０ｇの混合物にベンゾイルパーオキサイド（重合開始剤、和光純薬社製）１．５ｇを溶解した。これを、４重量％ポリビニルアルコール（日本合成化学社製）水溶液２５００ｍｌに分散させ、攪拌しながら窒素雰囲気下で７５℃に昇温し、８時間重合した。重合後、洗浄し、乾燥した後、分級して平均粒径６μｍの粒子を得た。
・カラムの作製
カラム１本あたり、上記充填剤１．０ｇを、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）３０ｍｌに分散し、５分間超音波処理した後、よく攪拌した。全量を上記のステンレス製カラム本体４０（内径４．６φ×３５ｍｍ）を接続したパッカー（梅谷精機社製）に注入した。パッカー（梅谷精機社製）に送液ポンプ（サヌキ工業社製）を接続し、上記充填剤を上記ステンレス製カラム本体４０に圧力３００ｋｇ／ｃｍ²で定圧充填した後、エンドフィッティング４２とカラム本体４０を螺合して本発明の液体クロマトグラフィー用カラムを製造した。 The column main body 40 was filled with the packing material prepared as described below as described in the section of column preparation below to produce the liquid chromatography column of the present invention.
-Preparation of filler A mixture of 400 g of tetraethylene glycol dimethacrylate (manufactured by Shin-Nakamura Chemical Co., Ltd.) and 150 g of 2-acrylamido-2-methylsulfonic acid (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) is mixed with benzoyl peroxide (polymerization initiator, Wako Pure Chemical Industries, Ltd.). 1.5 g) was dissolved. This was dispersed in 2500 ml of a 4% by weight polyvinyl alcohol (manufactured by Nippon Synthetic Chemical), heated to 75 ° C. in a nitrogen atmosphere with stirring, and polymerized for 8 hours. After polymerization, washing, drying, and classification, particles having an average particle diameter of 6 μm were obtained.
-Preparation of column For each column, 1.0 g of the above filler was dispersed in 30 ml of 50 mM phosphate buffer (pH 6.0), subjected to ultrasonic treatment for 5 minutes, and then well stirred. The whole amount was injected into a packer (made by Umeda Seiki Co., Ltd.) connected to the above-mentioned stainless steel column main body 40 (inner diameter 4.6φ × 35 mm). A liquid feed pump (manufactured by Sanuki Kogyo Co., Ltd.) is connected to a packer (manufactured by Umeda Seiki Co., Ltd.), and the above filler is packed into the stainless steel column main body 40 at a constant pressure of 300 kg / cm ^2. Were screwed together to produce a liquid chromatography column of the present invention.

（実施例４）
実施例３と同様にして本発明のフィルター１を得た。
一方、図６に示したステンレス製カラム本体４０（内径４．６ｍｍ、長さ３５ｍｍ）に、上記実施例３においてフィルターにコーティングした方法と同様の方法で、シリコーンコーティングした。
次に、上記のフィルター１をフッ素樹脂（テフロン（登録商標））製のシール部材２（外径６．３ｍｍ、内径４．６ｍｍ、厚さ１．５ｍｍ）に挿入した後、これを上記のシリコーンコーティングしたカラム本体４０（内径４．６ｍｍ、長さ３５ｍｍ）のカラム両端に取り付けるためのエンドフィッティング４２に装着した。 Example 4
The filter 1 of the present invention was obtained in the same manner as in Example 3.
On the other hand, the stainless steel column main body 40 (inner diameter 4.6 mm, length 35 mm) shown in FIG. 6 was silicone-coated by the same method as that applied to the filter in Example 3 above.
Next, the filter 1 is inserted into a sealing member 2 (outer diameter 6.3 mm, inner diameter 4.6 mm, thickness 1.5 mm) made of a fluororesin (Teflon (registered trademark)), and this is then inserted into the silicone described above. The coated column body 40 (inner diameter 4.6 mm, length 35 mm) was attached to end fittings 42 for attachment to both ends of the column.

上記のシリコーンコーティングしたカラム本体に、実施例３と同様にして調製した充填剤を、実施例３と同様にして充填して、本発明の液体クロマトグラフィー用カラムを製造した。 A column prepared for liquid chromatography according to the present invention was manufactured by filling the silicone-coated column main body with the filler prepared in the same manner as in Example 3 in the same manner as in Example 3.

（比較例３）
実施例３における、ステンレス焼結体の一体成形品として製造したフィルターを、シリコーンコーティングしなかったことの他は、実施例３と全く同様にして液体クロマトグラフィー用カラムを製造した。 (Comparative Example 3)
A liquid chromatography column was produced in the same manner as in Example 3, except that the filter produced as an integrally molded product of the stainless sintered body in Example 3 was not silicone-coated.

（比較例４）
図１（イ）に示したフィルターを、ステンレス焼結体の一体成形品として製造した。その構造の詳細は、直径４．６ｍｍ、厚さが１．５ｍｍの円柱体からなり、濾過孔径は２μｍとした。
次に、従来の技術の項に記載したＣＬＤ法により、二酸化珪素被膜をフィルター及びカラム本体に形成させる処理をした。具体的には、日本曹達社製アトロンをＨＰＬＣ用ポンプ（島津製作所社製）を用いて、上記フィルターの内部まで通液した後、余剰の液をフィルター内部から除去した。その後、２００℃で３０分間乾燥し、次に、５００℃で３０分間加熱し、二酸化珪素被膜を形成させた。
また、カラム本体は、上記アトロンに浸し、その後、２００℃で３０分間乾燥し、次に、５００℃で３０分間加熱し、二酸化珪素被膜を形成させた。
次に、このフィルター１をフッ素樹脂（テフロン（登録商標））製のシール部材２（外径６．３ｍｍ、内径４．６ｍｍ、厚さ１．５ｍｍ）に挿入した後、これを上記の二酸化珪素被膜を形成させたステンレス製カラム本体（内径４．６ｍｍ、長さ３５ｍｍ）のカラム両端に取り付けるためのエンドフィッティング４２に装着した。 (Comparative Example 4)
The filter shown in FIG. 1 (a) was manufactured as an integrally molded product of a stainless sintered body. The details of the structure consisted of a cylindrical body having a diameter of 4.6 mm and a thickness of 1.5 mm, and the filtration pore diameter was 2 μm.
Next, the silicon dioxide film was formed on the filter and the column body by the CLD method described in the section of the prior art. Specifically, Atron manufactured by Nippon Soda Co., Ltd. was passed through the inside of the filter using an HPLC pump (manufactured by Shimadzu Corporation), and then the excess liquid was removed from the inside of the filter. Thereafter, the film was dried at 200 ° C. for 30 minutes, and then heated at 500 ° C. for 30 minutes to form a silicon dioxide film.
Moreover, the column main body was immersed in the above-mentioned atron, then dried at 200 ° C. for 30 minutes, and then heated at 500 ° C. for 30 minutes to form a silicon dioxide film.
Next, this filter 1 was inserted into a sealing member 2 (outer diameter 6.3 mm, inner diameter 4.6 mm, thickness 1.5 mm) made of a fluororesin (Teflon (registered trademark)), and this was then inserted into the above silicon dioxide. A stainless steel column main body (inner diameter 4.6 mm, length 35 mm) on which a coating was formed was attached to end fittings 42 for attachment to both ends of the column.

上記の二酸化珪素被膜を形成させたカラム本体に、実施例３と同様にして調製した充填剤を、実施例３と同様にして充填して（フィルターは、上記の二酸化珪素被膜を形成させたフィルターを用いた）、液体クロマトグラフィー用カラムを製造した。 The column body on which the above-mentioned silicon dioxide film was formed was filled with a filler prepared in the same manner as in Example 3 in the same manner as in Example 3 (the filter was a filter in which the above-mentioned silicon dioxide film was formed) A column for liquid chromatography was produced.

実施例３、４及び比較例３、４で得られた液体クロマトグラフィー用カラムを用いて以下のようにして、ヘモグロビン類の測定を行うことにより、該カラムの分離性能に与える評価を行った（なお、ラインフィルターは用いなかった）。
測定条件
得られたカラムを以下の液体クロマトグラフに取り付けた後、以下の測定を行った。
システム：送液ポンプ：ＬＣ−９Ａ（島津製作所社製）
オートサンプラ：ＡＳＵ−４２０（積水化学社製）
検出器：ＳＰＤ−６ＡＶ（島津製作所社製）
溶離液：溶離液Ａ：１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ５．８）
溶離液Ｂ：３００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．８）
測定開始より０〜５分の間は溶離液Ａを流し、５〜６分の間は溶離液Ｂを流し、６〜１０分の間は溶離液Ａを流した。
流速：１．６ｍｌ／分
検出波長：４１５ｎｍ
試料注入量：１０μｌ Using the liquid chromatography columns obtained in Examples 3 and 4 and Comparative Examples 3 and 4, the hemoglobins were measured as follows, and the separation performance of the columns was evaluated ( Note that no line filter was used).
Measurement conditions After the obtained column was attached to the following liquid chromatograph, the following measurements were performed.
System: Liquid feed pump: LC-9A (manufactured by Shimadzu Corporation)
Autosampler: ASU-420 (manufactured by Sekisui Chemical Co., Ltd.)
Detector: SPD-6AV (manufactured by Shimadzu Corporation)
Eluent: Eluent A: 100 mM phosphate buffer (pH 5.8)
Eluent B: 300 mM phosphate buffer (pH 6.8)
The eluent A was allowed to flow for 0 to 5 minutes from the start of measurement, the eluent B was allowed to flow for 5 to 6 minutes, and the eluent A was allowed to flow for 6 to 10 minutes.
Flow rate: 1.6 ml / min Detection wavelength: 415 nm
Sample injection volume: 10 μl

測定試料
実施例１の（１）吸着性の評価の項で用いた測定試料と同様の方法で調製したもの。 Measurement sample A sample prepared by the same method as the measurement sample used in the section of (1) Evaluation of adsorptivity in Example 1.

測定結果
上記測定条件により、試料を測定して得られたクロマトグラムを図１０（イ）（実施例３又は４の液体クロマトグラフィー用カラムを用いたもの）、図１０（ロ）（比較例３又は４の液体クロマトグラフィー用カラムを用いたもの）に示した。ピーク５１はＨｂＡ１ａ及びＨｂＡ１ｂ、ピーク５２はＨｂＦ、ピーク５３は不安定型ＨｂＡ１ｃ、ピーク５４は安定型ＨｂＡ１ｃ、ピーク５５はＨｂＡ０を示す。この結果、実施例３又は４の液体クロマトグラフィー用カラムを用いたものでは、比較例３又は４の液体クロマトグラフィー用カラムを用いたものに比較して分離性能に優れていることが分かる。 Measurement Results The chromatogram obtained by measuring the sample under the above measurement conditions is shown in FIG. 10 (a) (using the liquid chromatography column of Example 3 or 4), FIG. 10 (b) (Comparative Example 3). Or 4 using a column for liquid chromatography). Peak 51 is HbA1a and HbA1b, peak 52 is HbF, peak 53 is unstable HbA1c, peak 54 is stable HbA1c, and peak 55 is HbA0. As a result, it can be seen that the liquid chromatography column of Example 3 or 4 is superior in separation performance as compared with the liquid chromatography column of Comparative Example 3 or 4.

（実施例５）
実施例３で得られたシリコーンコーティングしたフィルター１に、０．１重量％ヘモグロビン水溶液を通液し、ブロッキング処理した。このフィルターを用いたこと以外は、実施例３と同様にして本発明の液体クロマトグラフィー用カラムを製造した。 (Example 5)
A 0.1 wt% aqueous hemoglobin solution was passed through the silicone-coated filter 1 obtained in Example 3 to perform a blocking treatment. A liquid chromatography column of the present invention was produced in the same manner as in Example 3 except that this filter was used.

（実施例６）
実施例３で得られたシリコーンコーティングしたフィルター１に、０．１重量％ウシ血清アルブミン水溶液を通液し、ブロッキング処理した。
一方、図６に示したステンレス製カラム本体４０（内径４．６ｍｍ、長さ３５ｍｍ）に、上記実施例３においてフィルターにコーティングした方法と同様の方法で、シリコーンコーティングした。
このフィルター及びカラム本体を用いたこと以外は、実施例３と同様にして本発明の液体クロマトグラフィー用カラムを製造した。 (Example 6)
A 0.1 wt% bovine serum albumin aqueous solution was passed through the silicone-coated filter 1 obtained in Example 3 for blocking treatment.
On the other hand, the stainless steel column main body 40 (inner diameter 4.6 mm, length 35 mm) shown in FIG. 6 was silicone-coated by the same method as that applied to the filter in Example 3 above.
A liquid chromatography column of the present invention was produced in the same manner as in Example 3 except that this filter and column body were used.

（比較例５）
図１（イ）に示したフィルターを、ポリエーテルエーテルケトンの一体成形品として製造した。その構造の詳細は、直径４．６ｍｍ、厚さが１．５ｍｍの円柱体からなり、濾過孔径は２μｍとした。このフィルターを用いたこと以外は、実施例３と同様にして液体クロマトグラフィー用カラムを製造した。 (Comparative Example 5)
The filter shown in FIG. 1 (a) was manufactured as an integrally molded article of polyetheretherketone. The details of the structure consisted of a cylindrical body having a diameter of 4.6 mm and a thickness of 1.5 mm, and the filtration pore diameter was 2 μm. A liquid chromatography column was produced in the same manner as in Example 3 except that this filter was used.

実施例３、５、６及び比較例３、５で得られた液体クロマトグラフィー用カラムを用いて、実施例３と同様にして、ヘモグロビン類の測定を行うことにより、該カラムの分離性能に与える評価を行った。 Using the liquid chromatography columns obtained in Examples 3, 5, 6 and Comparative Examples 3, 5, the hemoglobins are measured in the same manner as in Example 3 to give the separation performance of the column. Evaluation was performed.

測定試料
健常人血液を溶血したものであって、後述の定義による安定型ＨｂＡ１ｃ濃度が４．５％であるものを用いた。 Measurement sample A blood sample obtained by hemolyzing healthy human blood and having a stable HbA1c concentration of 4.5% according to the definition described below was used.

測定結果
試料を５回連続して測定し、得られたクロマトグラムから、以下の式で定義される安定型ＨｂＡ１ｃ濃度を求め、測定回数と安定型ＨｂＡ１ｃ濃度の関係を表４に示した。
安定型ＨｂＡ１ｃ濃度（％）＝（安定型ＨｂＡ１ｃピークの面積）÷（全ヘモグロビンピークの面積の和）×１００ Measurement results The sample was measured 5 times in succession, and the stable HbA1c concentration defined by the following formula was determined from the obtained chromatogram. The relationship between the number of measurements and the stable HbA1c concentration is shown in Table 4.
Stable HbA1c concentration (%) = (Stable HbA1c peak area) ÷ (Sum of total hemoglobin peak areas) × 100

比較例３のカラムでは、安定型ＨｂＡ１ｃ濃度は、測定１回目から５回目にかけて、３．５％から３．９％に上昇した。比較例５のカラムでは、安定型ＨｂＡ１ｃ濃度は、測定１回目から５回目にかけて、３．９％から４．３％に上昇した。すなわち、これらのカラムでは、測定初期では正確な値が得られないことがわかる。
一方、実施例３のカラムでは、測定１回目〜３回目までは安定型ＨｂＡ１ｃ濃度は４．４％であったが、測定４回目と５回目では、４．５％となり、正確な値が得られた。更に、ブロッキングしたフィルターを用いた実施例５及び６のカラムでは、測定１回目から安定型ＨｂＡ１ｃ濃度は４．５％と正確な値が得られた。 In the column of Comparative Example 3, the stable HbA1c concentration increased from 3.5% to 3.9% from the first measurement to the fifth measurement. In the column of Comparative Example 5, the stable HbA1c concentration increased from 3.9% to 4.3% from the first measurement to the fifth measurement. That is, it can be seen that these columns do not provide accurate values at the beginning of measurement.
On the other hand, in the column of Example 3, the stable HbA1c concentration was 4.4% from the first to the third measurement, but it was 4.5% at the fourth and fifth measurements, and an accurate value was obtained. It was. Furthermore, in the columns of Examples 5 and 6 using a blocked filter, an accurate value of 4.5% for the stable HbA1c concentration was obtained from the first measurement.

本発明の液体クロマトグラフィー用フィルターの例を示す断面図。Sectional drawing which shows the example of the filter for liquid chromatography of this invention. 本発明のフィルターが装着されるホルダーの一例を示す断面図。Sectional drawing which shows an example of the holder with which the filter of this invention is mounted | worn. 本発明のフィルターが装着されるホルダーの他の例を示す断面図。Sectional drawing which shows the other example of the holder with which the filter of this invention is mounted | worn. 本発明のフィルターがホルダー内に装着されて構成されているラインフィルターの断面図。Sectional drawing of the line filter comprised by mounting the filter of this invention in a holder. 本発明の液体クロマトグラフィー用フィルターを示す図であり、図５（イ）はその断面図。図５（ロ）は平面図。It is a figure which shows the filter for liquid chromatography of this invention, and Fig.5 (a) is the sectional drawing. FIG. 5B is a plan view. 本発明の液体クロマトグラフィー用カラムを示す断面図。Sectional drawing which shows the column for liquid chromatography of this invention. 液体クロマトグラフのシステムの構成を示す説明図。Explanatory drawing which shows the structure of the system of a liquid chromatograph. 従来の液体クロマトグラフィー用カラムを示す断面図。Sectional drawing which shows the conventional column for liquid chromatography. 測定試料を測定して得られたクロマトグラム。A chromatogram obtained by measuring a measurement sample. 測定試料を測定して得られたクロマトグラム。A chromatogram obtained by measuring a measurement sample. シリコーン被膜を形成させるための反応の例を示す図。The figure which shows the example of reaction for forming a silicone film.

符号の説明Explanation of symbols

１液体クロマトグラフィー用フィルター
２シール部材
３ホルダー
３ａ、３ｂ半体
３１ａ、３１ｂ円柱状の空間部
３２ａ、３２ｂ円錐状の空間部
３３ａ円板状の空間部
３４ａ、３４ｂ被覆部
５ラインフィルター DESCRIPTION OF SYMBOLS 1 Filter for liquid chromatography 2 Seal member 3 Holder 3a, 3b Half body 31a, 31b Cylindrical space part 32a, 32b Conical space part 33a Disk-shaped space part 34a, 34b Covering part 5 Line filter

Claims

硬化型シリコーンゴムから得られるシリコーン被膜でコーティングされていることを特徴とする液体クロマトグラフィー用フィルター。 A filter for liquid chromatography, which is coated with a silicone film obtained from a curable silicone rubber .

請求項１記載の液体クロマトグラフィー用フィルターが、更に、ブロッキング試薬でブロッキング処理されていることを特徴とする液体クロマトグラフィー用フィルター。 2. The liquid chromatography filter according to claim 1, wherein the liquid chromatography filter is further subjected to a blocking treatment with a blocking reagent.

請求項１又は２記載の液体クロマトグラフィー用フィルターが装着されたことを特徴とする液体クロマトグラフィー用カラム。 A column for liquid chromatography, comprising the filter for liquid chromatography according to claim 1 or 2.

更に、カラム本体がシリコーン被膜でコーティングされていることを特徴とする請求項３記載の液体クロマトグラフィー用カラム。 4. The column for liquid chromatography according to claim 3, wherein the column main body is coated with a silicone film.

更に、カラム本体がブロッキング試薬でブロッキング処理されていることを特徴とする請求項４記載の液体クロマトグラフィー用カラム。 5. The liquid chromatography column according to claim 4, wherein the column body is subjected to a blocking treatment with a blocking reagent.

請求項１又は２記載の液体クロマトグラフィー用フィルターを用いることを特徴とするヘモグロビン類の測定方法。 A method for measuring hemoglobin, wherein the filter for liquid chromatography according to claim 1 or 2 is used.

請求項３〜５のいずれかに記載の液体クロマトグラフィー用カラムを用いることを特徴とするヘモグロビン類の測定方法。 A method for measuring hemoglobin, wherein the liquid chromatography column according to claim 3 is used.