JP3882038B2 - A highly sensitive method for measuring the amount of double-stranded DNA - Google Patents
A highly sensitive method for measuring the amount of double-stranded DNA Download PDFInfo
- Publication number
- JP3882038B2 JP3882038B2 JP2003051895A JP2003051895A JP3882038B2 JP 3882038 B2 JP3882038 B2 JP 3882038B2 JP 2003051895 A JP2003051895 A JP 2003051895A JP 2003051895 A JP2003051895 A JP 2003051895A JP 3882038 B2 JP3882038 B2 JP 3882038B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- intercalator
- electrode
- double
- stranded dna
- measuring
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
Images
Landscapes
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Description
【0001】
【発明の属する技術分野】
本発明は、試料中に含まれる二本鎖DNA総量を高感度かつ簡便に測定するための電気化学的な測定方法およびに測定キットに関するものである。
【0002】
【従来の技術】
従来、DNAの測定のターゲットは、特定の塩基配列を有するDNAの有無の判定におかれ、試料中のDNA総量を簡便かつ高感度で測定することを可能にするための技術開発には余り大きな努力が払われてきていなかった。
一方、試料中の目的成分の定量法において、簡便かつ高感度化の目標に最適の方法としては電気化学的方法があり、この方法では、溶液中の目的成分あるいは目的成分の濃度変化に対応して濃度が変化する特定成分について、その濃度あるいは濃度変化を電極上での電流信号として変換、出力することを特徴としている。
【0003】
DNAを構成する塩基のうち、グアニンは電解酸化を受けやすいことが知られ、この性質を利用した電気化学的方法も試みられてはいるが、それでも二本鎖DNA中のグアニンの酸化には1.3 V(対銀-塩化銀電極)との高い電位を必要とし(非特許文献1)、このような高い電位を印可した場合、試料中に共存する酸化性の物質の多くが酸化され、高いバックグラウンドを与えてしまうので、高感度測定には困難が伴っていた。すなわち、このようなDNAの直接的な電解酸化に基づく測定法は実用的ではなかった。
【0004】
他方、二本鎖DNAの塩基対の結合領域に挿入され得るインターカレータのうち、メチレンブルー等、比較的穏和な条件下で酸化還元を引き起こす物質の存在は知られており、また、酸化還元しにくいインターカレータにおいても、これにフェロセン等の酸化還元機能分子を結合することにより、電気化学的に検出しやすいインターカレータとなることが知られている。しかし、これらのインターカレータの電気化学反応の分析的な利用は、電極上に一本鎖DNAオリゴマーを結合させ、試料溶液中に存在する相補的な塩基配列を持つ一本鎖DNAとの間で二本鎖を形成させ、この二本鎖中に挿入されたインターカレータ、すなわち、電極近傍に固定化されたインターカレータの酸化あるいは還元電流を測定することを介して特定の塩基配列を有するDNAの有無を判定するという目的に限定されていた。
【0005】
【非特許文献1】
B. Meric et al, Electroanalysis, vo. 14, no. 18, p. 1245 (2002)
【0006】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、このような事情のもとで、試料中の二本鎖DNA量を、簡便かつ高感度で測定使用とするものであり、より具体的には、インターカレータのDNA挿入により電気化学的な特性の変化を生ぜしめるとともに、この特性変化を、夾雑物の影響を受けずにかつ効果的に増幅して検出しうるシステムを新たに構築して、試料中の二本鎖DNA量を簡便、高感度に測定しようするものである。
【0007】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、可逆的酸化還元能を有するインターカレータあるいはその誘導体を利用して、試料中の酸化性あるいは還元性の物質の影響を余り受けずに測定が可能な方法について種々研究を重ねた結果、 インターカレータが二本鎖DNA中に挿入される前後で、その電極上での電解電流の大きさが著しく変化することに着目し、この電解電流の変化を測定する際、インターカレータの電解還元あるいは電解酸化と酵素反応による酸化あるいは還元とを共役させることにより、インターカレータの上記の電気化学活性の変化を増幅して測定することが可能となり、ひいてはその変化を引き起こす二本鎖DNA量を高感度に測定することが可能となることを見いだし、本発明を完成させるに至ったものである。
【0008】
すなわち、本発明は以下の(1)〜(4)に係るものである。
(1)試料中に含まれる二本鎖DNAの量を測定する方法において、可逆的酸化還元能を有するインターカレータを試料中の二本鎖DNAにインターカレーションし、未挿入のインターカレータの濃度変化を、酸化還元酵素を固定した作用電極上で増幅して測定することを特徴とする、二本鎖DNA量の測定方法。
(2)酸化還元酵素を電極上に固定化して成る酵素電極を作用電極とし、該作用電極において、2本鎖DNA未挿入の可逆的酸化還元能を有するインターカレータを酸化還元酵素により酸化あるいは還元する反応と、電極反応により該インタカレータを還元あるいは酸化して再生する反応とからなる反応サイクルを形成せしめることにより、電極において発生する電流信号を増幅して測定することを特徴とする上記(1)に記載の二本鎖DNA量の測定方法。
(3)可逆的酸化還元能を有するインターカレータが、多環芳香族化合物である上記(1)又は(2)に記載の測定方法。
(4)多環芳香族化合物がメチレンブルーである上記(3)に記載の測定方法。
【0009】
【発明の実施の形態】
本発明における2本鎖DNA量を測定するための測定系は酸化還元酵素を固定化した作用電極と、測定試薬として可逆的酸化還元能を有するインターカレータとからなる。
ここで、インターカレータとはインターカレーションする物質のことを指す。すなわち DNA分子は相補的な塩基対をもつ2重らせん構造をとるため塩基対のスタッキング間に平面構造を有する分子(多環芳香族化合物)が挿入される。これをインターカレーションといい、このインターカレーションする物質をインターカレータという。
【0010】
本発明の2本鎖DNAの測定原理を以下に説明する。
2本鎖DNAを含む試料に一定量のインターカレータを含む溶液を添加するかあるいは一定量のインターカレータを含む溶液に当該試料を添加すると、試料中の2本鎖DNAの量に応じて、インターカレータが該DNAに挿入される。このDNAに挿入されたインターカレータと未挿入のインターカレータとは、電気化学的特性が異なり識別可能である。
したがって、未挿入のインターカレータの量を測定すれば、挿入したインターカレータの量に対応する試料中のDNAの量を知ることが可能となる。
この未挿入のインターカレータの量をより高感度で測定するために、本発明は、インターカレータとして可逆的酸化還元能を有するインターカレータを使用し、電極として酸化還元酵素を固定化した電極を用いる。この可逆的酸化還元能を有するインターカレータとは、酸化あるいは還元されて、いいかえれば、電子の授受により、可逆的に酸化型および還元型の状態をとりうるインターカレータのことであり、本発明は、基本的にはこの電子の授受により生ずる、電極に流れる電流を測定することにより未挿入のインターカレータ量を測定して、2本鎖DNAの量を把握するものであるするものであるが、この測定電流は増幅されており、高感度で測定しうる点に特徴を有する。
【0011】
すなわち、試料溶液に添加したインターカレータのうち2本鎖DNAにインターカレーションしない未挿入のインターカレータは、一定電位が印加された電極上で酸化あるいは還元され、酸化型あるいは還元型に移行するが、この電極反応に伴い電子の授受が行われることにより、電極に流れる電流は変化する。さらに、上記電極反応により酸化型あるいは還元型に移行したインターカレータは、電極に固定化した酸化還元酵素により、再びもとの状態(還元型あるいは酸化型)再生される。このインターカレータを介する酸化、還元およびその再生反応は、反応サイクルを形成し、この反応サイクルの繰り返しにより、電極に流れる電流は増幅される。 したがって、未挿入のインターカレータが微量であっても、その測定電流は増幅されており、これにより、高感度で2本鎖DNA量を測定することが可能となるものである。
このような本発明の測定原理からいえば、上記インターカレーター、あるいは酸化還元酵素は、上記のような反応サイクルを形成可能なものであればよく、特定の物質あるいは特定の酸化還元酵素に限定されるべきでないことは理解されよう。
【0012】
本発明において利用される電極の材質としては特に制限はないが、耐食性等から、白金、金等の貴金属あるいはカーボン系の材料が好都合に使用される。
本発明において使用されるインターカレータとしては、メチレンブルーのように二本鎖DNAへの挿入機能と、可逆的酸化還元能を併せ持つ化合物が使用されるが、これに限らず、エチジウムブロマイド、ベンゾピレン等のインターカレータ機能を持つが、可逆的酸化還元能を有しない物質であっても、分子の側鎖としてフェロセン、キノン等の可逆的酸化還元能を有する基を導入することにより、使用することができる。
【0013】
また、酸化還元酵素としては、上記インターカレータあるいはその誘導体を電子受容体あるいは供与体としてスムースに反応が進むものであれば特に制限はないが、安定で、安価なものが好都合に利用される。具体的には、メチレンブルーをインターカレータとする場合には、これを過酸化水素還元の電子供与体として用いるペルオキシダーゼが、また、フェロセンあるいはキノンを側鎖に持つインターカレータにおいてはこれを基質酸化時の電子受容体として用いる酸化酵素、例えばグルコース酸化酵素、乳酸酸化酵素、グルタミン酸酸化酵素、コリン酸化酵素等が好都合に利用される。
上記酵素の電極上への固定化法としては、特段限定されるものではないが、酵素を高活性に保持でき、基質及び上記インターカレータの透過を抑制しないような担体材料、固定化方法が選択、利用される。例えば、電極表面に形成した多孔性の担体に酵素を結合させる方法や、アルブミンおよびグルタルアルデヒドによる酵素固定架橋膜を電極表面に形成する方法等、透過性が良いことが知られている方法が、選択使用される。
【0014】
次に本発明の実施形態の一例を詳細に説明すると、まず、基板となる電極を研磨等の所定の前処理を行った後、酸化還元酵素の固定化膜を電極上に設ける。このようにして調製された酵素電極を作用極とし、適当な対極、参照極と組み合わせてインターカレータを含む電解質水溶液中に挿入する。インターカレータ濃度に特に制限はないが、低濃度で、かつ酵素電極による増幅測定により明瞭な電流応答を与え得る濃度として0.1-10マイクロモル/リットル程度が好都合である。使用する電解質溶液の濃度、種類に特に制限はないが、酵素活性を安定に保持し、かつインターカレータの酸化還元電位を一定に保つため中性付近のpH緩衝液の使用が好ましく、例えばpH7前後、濃度0.1モル/リットル前後のリン酸緩衝液等が好都合に用いられる。酵素電極にインターカレータの酸化あるいは還元に必要な電位を印加すると、酸化あるいは還元に伴う電流が流れるが、インターカレータ濃度が比較的低いことからこの電流値は小さい。
【0015】
次いで溶液に基質を 添加すると、酵素反応による基質酸化あるいは還元に伴う、電子受容体あるいは供与体としてのインターカ レータの還元あるいは酸化、電極上での再酸化あるいは再還元のサイクリックな反応が進行し、電解電流は極めて大きくなり、正確な測定が容易なレベルに到達する。
【0016】
例えば、インターカレータとしてメチレンブルー、酵素としてペルオキシダーゼを用いた場合、pH 6で-0.15 V(対銀-塩化銀電極)の電位を印加すると、 電極上で以下の反応が生ずる。
(a)メチレンブルー酸化型 + 2e → メチレンブルー還元型
また、ここに酵素基質である過酸化水素を添加すると、以下の酵素反応が生ずる。
(b)メチレンブルー還元型 + 過酸化水素 → メチレンブルー酸化型 + 水
したがって、この酵素反応によりメチレンブルー酸化型が再生し、さらに電極反応、酵素反応のサイクルを繰り返す。このサイクリックな反応により過酸化水素添加前に比べて、添加により10-1000倍程度の電流の増加が観測される。この反応サイクルにおいて、
メチレンブルーは、酸化型、還元型を繰り返すが、酸化型および還元型の合計量は変わらずメチレンブルーはメディエータとしても機能する。また、上記反応式中2eの量、つまり電極における電流は、添加する過酸化水素の量を過剰にすれば、この反応に関与するメチレンブルーの量に依存する。
【0017】
一方、試料中の二本鎖DNAは、インターカレータの一部は二本鎖DNAの塩基対の結合領域に挿入される。この2本鎖DNA挿入されたインターカレーターは、高分子のDNAに結合した状態なので溶液中での拡散速度は著しく低下する、すなわち溶液バルクから電極近傍へ到達しにくくなる、電極近傍に到達しても酵素膜に邪魔されて電極表面に接触し難い、また、たとえ電極表面に到達しても、DNA鎖にブロックされて電極との電子移動の速度は低下する。したがって、二本鎖DNAに挿入したインターカレータは、事実上、還元あるいは酸化電流を与えない。
【0018】
すなわち、未挿入のインターカレータのみが電極反応、酵素反応のサイクルを繰り返し、このときの電流は未挿入のインターカレータ濃度にほぼ比例する。したがって、試料中の2本鎖DNA濃度が増えるほど、すなわち挿入されたインターカレータ濃度が増えて、未挿入の濃度が減少するほど、電流は減少する。言い換えれば、電流の減少の度合いから、添加された二本鎖DNAの量を把握することが出来る。
また、本発明の2本鎖DNAの測定キットは、少なくとも酸化還元酵素固定化電極および可逆的酸化還元能を有するインターカレータを含む。また、さらに、電極に固定した酵素に対する基質、あるいはpH調製剤、電流測定装置等、本発明の測定系を構築するため部材あるいは試薬等を組合わせて測定キットとしてもよい。
【0019】
本発明の測定法および測定キットは、生体成分の分離、抽出、分析、利用等に係る分野において利用される。例えば、ワクチンの製造においては、細胞にウイルスを接種して得られる液のうち、生体に接種した場合に有害な作用を引き起こす可能性のある成分を除去する必要があるが、抗原抗体反応等により異物のDNAが生体に及ぼす危険性を考えると、これを除去する必要があり、除去が目的通り行われたか否かの判別のためには微量のDNAを簡便に測定するための方法が必要である。また、遺伝子組換え薬品等においても、宿主由来の異物DNAが微量混在する可能性がある。したがって、本発明においては、これらDNA を測定する上で極めて有効である。
【0020】
次に実施例により本発明をさらに詳細に説明する。
【実施例】
(ペルオキシダーゼ固定化酵素電極によるDNAの測定)
直径1mmのグラッシーカーボン電極上に ペルオキシダーゼ0.5%(w/v)水溶液(pHは7に調整)0.5マイクロリットル、牛血清アルブミン0.5%(w/v)水溶液(pHは7に調整)1マイクロリットル、グルタルアルデヒド0.1%(w/v)水溶液(pHは7に調整)0.5マイクロリットルを滴下し、室温で2時間以上放置、乾燥させることによりペルオキシダーゼ固定化電極を作製した。この酵素電極をpH6.1の0.1Mリン酸緩衝液中に挿入し、-0.15 V(対銀-塩化銀電極)の電位を印加した。ここにペルオキシダーゼ基質である過酸化水素(2 mM)及びメディエータとインターカレータとの機能を併せ持つメチレンブルー(5 マイクロモル/l)を添加し、さらに、5マイクロg/mlづつ2分毎にサケ***由来のDNAを添加した。結果を図1に示す。図1中、横軸は時間、縦軸は電解電流値であり、実線は、還元電流の測定値を示し、矢印はそれぞれ5マイクロg/mlのDNAを添加した時点を示す。図1から明らかなように、サケ***由来のDNA未添加の時点では1.1マイクロアンペアの過酸化水素還元電流が観測されたが、そこに、5マイクロg/mlづつサケ***由来のDNAを添加する毎に、明瞭な還元電流の減少が観測された。なお、この結果によれば、最初に5マイクロg/mlのDNAを添加したときの電流減少は55nAであり、S/N=3とした場合、20 pg/mlのDNAの定量が可能と見積もられた。
【0021】
【比較例】
(酵素を固定化していない電極上でのDNAの測定)
酵素を固定していない直径1mmのグラッシーカーボン電極をpH6.1の0.1Mリン酸緩衝液中に挿入し、-0.15 V(対銀-塩化銀電極)の電位を印加した。ここにメチレンブルー(5マイクロモル/l)を添加した場合、図1中破線に示すように30 nAと、ペルオキシダーゼ固定化 電極の場合の約1/40の還元電流を与えたのみであった。ここに5マイクロg/mlづつサケ***由来のDNAを添加していった場合、図1に示したスケールでは還元電流の減少は表示できない。実際、最初に5マイクロg/ mlのDNAを添加したときの電流減少は1 nAに過ぎず、S/N=3とした場合、1マイクロg/mlのDNAの定量が可能であるのに留まった。
【0022】
【発明の効果】
上記したことから明らかなように、本発明は、酵素固定化電極を用い、可逆的酸化還元能を有するインターカレータを使用して試料中の2本鎖DNAの量、濃度を測定するものであって、試料中の2本鎖DNAに対するインターカレーションに基づく未挿入インターカレータの減少を電極を介して電流の低下として測定するもので、特に酵素固定化電極を用いることにより、従来法におけるインターカレーター濃度の変化を直接電極で測定する場合に比べて、側定電流を増幅して捉えることができ、結果的に高感度にDNAを測定する方法を提供するものである。
【0023】
すなわち、本発明のインターカレータは、電極上で酸化あるいは還元されるが、酵素反応で再生され、電極反応、酵素反応を繰り返す。このため1分子のインターカレータは何回も電子移動し、大きな電流信号を与える。このことにより酵素反応を介さない電気化学反応系のみの場合に比べて増幅した信号が与えられることになる。このような信号増幅が、酵素膜を電極上に設けるだけで可能であり、従って、本法は、簡便、高感度なDNA測定法として有用である。
【図面の簡単な説明】
【図1】過酸化水素およびメチレンブルー存在下、ペルオキシダーゼ固定化電極を使用した場合と酵素を固定していない電極を使用した場合とにおける各電解電流を測定したグラフである。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to an electrochemical measurement method and a measurement kit for measuring the total amount of double-stranded DNA contained in a sample with high sensitivity and ease.
[0002]
[Prior art]
Conventionally, the target of DNA measurement is based on the determination of the presence or absence of DNA having a specific base sequence, which is too large for technological development to enable simple and highly sensitive measurement of the total amount of DNA in a sample. Effort has not been paid.
On the other hand, in the method for quantifying the target component in the sample, there is an electrochemical method as a simple and optimum method for achieving high sensitivity, and this method can cope with changes in the concentration of the target component or target component in the solution. Thus, the specific component whose concentration changes is converted and output as a current signal on the electrode.
[0003]
Of the bases that make up DNA, guanine is known to be susceptible to electrolytic oxidation, and an electrochemical method using this property has been tried, but it is still 1.3 for the oxidation of guanine in double-stranded DNA. When a high potential with V (to silver-silver chloride electrode) is required (Non-patent Document 1), when such a high potential is applied, many of the oxidizing substances coexisting in the sample are oxidized, resulting in a high back-up. Since it gave a ground, high-sensitivity measurement was accompanied by difficulties. That is, such a measurement method based on direct electrolytic oxidation of DNA has not been practical.
[0004]
On the other hand, among the intercalators that can be inserted into the base pair binding region of double-stranded DNA, the presence of substances that cause redox under relatively mild conditions, such as methylene blue, is known and is also difficult to redox It is known that an intercalator can be easily detected electrochemically by binding a redox functional molecule such as ferrocene to the intercalator. However, the analytical use of the electrochemical reaction of these intercalators is based on the fact that single-stranded DNA oligomers are bound on the electrode, and the single-stranded DNA having a complementary base sequence existing in the sample solution. A DNA having a specific base sequence is measured by measuring the oxidation or reduction current of the intercalator inserted into this duplex, that is, the intercalator immobilized in the vicinity of the electrode. It was limited to the purpose of determining the presence or absence.
[0005]
[Non-Patent Document 1]
B. Meric et al, Electroanalysis, vo. 14, no. 18, p. 1245 (2002)
[0006]
[Problems to be solved by the invention]
Under such circumstances, the object of the present invention is to measure and measure the amount of double-stranded DNA in a sample simply and with high sensitivity, and more specifically, by intercalator DNA insertion. In addition to causing changes in electrochemical properties, a new system has been constructed that can detect and amplify these property changes without being affected by contaminants. It is intended to measure the amount easily and with high sensitivity.
[0007]
[Means for Solving the Problems]
The inventors of the present invention have made various studies on a method that can be measured by using an intercalator having a reversible oxidation-reduction ability or a derivative thereof without being greatly affected by an oxidizing or reducing substance in a sample. As a result, we noticed that the magnitude of the electrolysis current on the electrode changed significantly before and after the intercalator was inserted into the double-stranded DNA. When measuring this electrolysis current change, By coupling electrolytic reduction or electrolytic oxidation with oxidation or reduction by enzymatic reaction, it is possible to amplify and measure the change in the electrochemical activity of the intercalator, and thus the amount of double-stranded DNA that causes the change. Has been found to be capable of being measured with high sensitivity, and the present invention has been completed.
[0008]
That is, the present invention relates to the following (1) to (4).
(1) In the method for measuring the amount of double-stranded DNA contained in a sample, the concentration of unintercalated intercalator is obtained by intercalating an intercalator having reversible redox ability into double-stranded DNA in the sample. change, and amplified on the working electrode fixed oxidoreductase and measuring, double-stranded DNA of measurement methods.
(2) An enzyme electrode formed by immobilizing an oxidoreductase on the electrode is used as a working electrode, and an intercalator having reversible redox ability without insertion of double-stranded DNA is oxidized or reduced by the oxidoreductase at the working electrode. A current cycle generated at the electrode is amplified and measured by forming a reaction cycle comprising a reaction that comprises a reaction to reduce and oxidize and regenerate the intercalator by an electrode reaction (1) ) For measuring the amount of double-stranded DNA.
(3) The measuring method according to (1) or (2) above, wherein the intercalator having reversible redox ability is a polycyclic aromatic compound.
(4) The measuring method according to (3) above, wherein the polycyclic aromatic compound is methylene blue.
[0009]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
The measurement system for measuring the amount of double-stranded DNA in the present invention comprises a working electrode on which an oxidoreductase is immobilized, and an intercalator having a reversible redox ability as a measurement reagent.
Here, the intercalator refers to a substance that intercalates. That is, since a DNA molecule has a double helix structure having a complementary base pair, a molecule having a planar structure (polycyclic aromatic compound) is inserted between the base pair stacking. This is called intercalation, and this intercalating substance is called intercalator.
[0010]
The measurement principle of the double-stranded DNA of the present invention will be described below.
When a solution containing a certain amount of intercalator is added to a sample containing double-stranded DNA or when the sample is added to a solution containing a certain amount of intercalator, depending on the amount of double-stranded DNA in the sample, A calator is inserted into the DNA. The intercalator inserted into this DNA and the non-inserted intercalator have different electrochemical characteristics and can be distinguished.
Therefore, by measuring the amount of uninserted intercalator, it becomes possible to know the amount of DNA in the sample corresponding to the amount of intercalator inserted.
In order to measure the amount of the uninserted intercalator with higher sensitivity, the present invention uses an intercalator having a reversible redox ability as an intercalator and uses an electrode on which an oxidoreductase is immobilized as an electrode. . The intercalator having the reversible redox ability is an intercalator that can be oxidized or reduced, in other words, can reversibly take the oxidized and reduced states by the exchange of electrons. Basically, the amount of intercalator that has not been inserted is measured by measuring the current flowing through the electrodes that is generated by the exchange of electrons, and the amount of double-stranded DNA is grasped. This measurement current is amplified and is characterized in that it can be measured with high sensitivity.
[0011]
That is, among the intercalators added to the sample solution, the non-inserted intercalator that does not intercalate with the double-stranded DNA is oxidized or reduced on the electrode to which a constant potential is applied, and shifts to the oxidized or reduced form. The current flowing through the electrode changes due to the exchange of electrons accompanying the electrode reaction. Furthermore, the intercalator that has shifted to the oxidized or reduced form by the electrode reaction is regenerated again to its original state (reduced or oxidized form) by the oxidoreductase immobilized on the electrode. The oxidation, reduction, and regeneration reaction through the intercalator form a reaction cycle, and the current flowing through the electrode is amplified by repeating the reaction cycle. Therefore, even if the amount of uninserted intercalator is very small, the measurement current is amplified, and this makes it possible to measure the amount of double-stranded DNA with high sensitivity.
According to the measurement principle of the present invention, the intercalator or oxidoreductase may be any substance as long as it can form the reaction cycle as described above, and is limited to a specific substance or a specific oxidoreductase. It should be understood that it should not.
[0012]
The material of the electrode used in the present invention is not particularly limited, but a noble metal such as platinum or gold or a carbon-based material is advantageously used from the viewpoint of corrosion resistance.
As the intercalator used in the present invention, a compound having both an insertion function into double-stranded DNA and a reversible redox ability, such as methylene blue, is used, but not limited thereto, ethidium bromide, benzopyrene, etc. Even a substance that has an intercalator function but does not have reversible redox ability can be used by introducing a group having reversible redox ability such as ferrocene or quinone as a side chain of the molecule. .
[0013]
The oxidoreductase is not particularly limited as long as the reaction proceeds smoothly using the above intercalator or its derivative as an electron acceptor or donor, but a stable and inexpensive one is advantageously used. Specifically, when methylene blue is used as an intercalator, a peroxidase using this as an electron donor for hydrogen peroxide reduction is used. In an intercalator having ferrocene or quinone as a side chain, this is used during substrate oxidation. An oxidase used as an electron acceptor, for example, glucose oxidase, lactate oxidase, glutamate oxidase, choline oxidase and the like is conveniently used.
The method for immobilizing the enzyme on the electrode is not particularly limited, but a carrier material and an immobilization method that can maintain the enzyme highly active and do not inhibit the permeation of the substrate and the intercalator are selected. Used. For example, methods that are known to have good permeability, such as a method of binding an enzyme to a porous carrier formed on the electrode surface, a method of forming an enzyme-fixed cross-linked membrane with albumin and glutaraldehyde on the electrode surface, Select used.
[0014]
Next, an example of an embodiment of the present invention will be described in detail. First, a predetermined pretreatment such as polishing is performed on an electrode serving as a substrate, and then an oxidoreductase immobilization film is provided on the electrode. The enzyme electrode thus prepared is used as a working electrode and is inserted into an aqueous electrolyte solution containing an intercalator in combination with an appropriate counter electrode and reference electrode. The concentration of the intercalator is not particularly limited, but a concentration of about 0.1 to 10 μmol / liter is convenient as a concentration that can provide a clear current response by amplification measurement using an enzyme electrode. The concentration and type of the electrolyte solution to be used are not particularly limited, but a neutral pH buffer solution is preferably used in order to keep the enzyme activity stable and to keep the redox potential of the intercalator constant, for example, around pH 7 A phosphate buffer solution having a concentration of around 0.1 mol / liter is conveniently used. When a potential necessary for the oxidation or reduction of the intercalator is applied to the enzyme electrode, a current accompanying the oxidation or reduction flows, but this current value is small because the intercalator concentration is relatively low.
[0015]
Next, when a substrate is added to the solution, a cyclic reaction of reduction or oxidation of the intercalator as an electron acceptor or donor, reoxidation on the electrode, or re-reduction proceeds with substrate oxidation or reduction by an enzymatic reaction. The electrolysis current becomes extremely large and reaches a level at which accurate measurement is easy.
[0016]
For example, when methylene blue is used as the intercalator and peroxidase is used as the enzyme, the following reaction occurs on the electrode when a potential of -0.15 V (vs. silver-silver chloride electrode) is applied at pH 6.
(A) Methylene blue oxidized type + 2e → methylene blue reduced type Further, when hydrogen peroxide as an enzyme substrate is added thereto, the following enzyme reaction occurs.
(B) Methylene blue reduced form + hydrogen peroxide → methylene blue oxidized form + water Therefore, the methylene blue oxidized form is regenerated by this enzyme reaction, and the cycle of electrode reaction and enzyme reaction is repeated. Due to this cyclic reaction, an increase in current of about 10 to 1000 times is observed with addition of hydrogen peroxide compared to before addition of hydrogen peroxide. In this reaction cycle,
Methylene blue repeats oxidation and reduction, but the total amount of oxidation and reduction does not change, and methylene blue also functions as a mediator. Further, the amount of 2e in the above reaction formula, that is, the current at the electrode depends on the amount of methylene blue involved in this reaction if the amount of hydrogen peroxide to be added is excessive.
[0017]
On the other hand, in the double-stranded DNA in the sample, a part of the intercalator is inserted into the binding region of the base pair of the double-stranded DNA. Since this intercalator inserted with double-stranded DNA is in a state of binding to high molecular DNA, the diffusion rate in the solution is remarkably reduced, that is, it becomes difficult to reach the vicinity of the electrode from the solution bulk. However, even if it reaches the electrode surface, it is blocked by the DNA strand and the speed of electron transfer with the electrode decreases. Therefore, an intercalator inserted into double-stranded DNA effectively gives no reduction or oxidation current.
[0018]
That is, only the uninserted intercalator repeats the cycle of the electrode reaction and the enzyme reaction, and the current at this time is almost proportional to the concentration of the uninserted intercalator. Therefore, the current decreases as the concentration of double-stranded DNA in the sample increases, that is, the concentration of inserted intercalator increases and the concentration of uninserted decreases. In other words, the amount of added double-stranded DNA can be determined from the degree of decrease in current.
In addition, the double-stranded DNA measurement kit of the present invention includes at least an oxidoreductase-immobilized electrode and an intercalator having reversible redox ability. Furthermore, a substrate for the enzyme immobilized on the electrode, a pH adjuster, a current measuring device, or the like, such as members or reagents for constructing the measurement system of the present invention, may be combined to form a measurement kit.
[0019]
The measurement method and measurement kit of the present invention are used in fields related to separation, extraction, analysis, use, and the like of biological components. For example, in the manufacture of vaccines, it is necessary to remove components that may cause harmful effects when inoculated into living organisms from the liquid obtained by inoculating cells with viruses. Considering the danger of foreign DNA on living organisms, it is necessary to remove this, and in order to determine whether the removal has been performed as intended, a method for simply measuring a small amount of DNA is necessary. is there. In addition, even in genetically modified drugs, a small amount of foreign DNA derived from the host may be mixed. Therefore, in the present invention, it is extremely effective in measuring these DNAs.
[0020]
Next, the present invention will be described in more detail with reference to examples.
【Example】
(Measurement of DNA with peroxidase-immobilized enzyme electrode)
Peroxidase 0.5% (w / v) aqueous solution (pH adjusted to 7) 0.5 microliters, bovine serum albumin 0.5% (w / v) aqueous solution (pH adjusted to 7) 1 microliters on 1mm diameter glassy carbon electrode A peroxidase-immobilized electrode was prepared by adding 0.5 microliters of a 0.1% (w / v) aqueous solution of glutaraldehyde (pH adjusted to 7) dropwise and allowing to stand at room temperature for 2 hours or more and drying. This enzyme electrode was inserted into a 0.1 M phosphate buffer solution at pH 6.1, and a potential of -0.15 V (vs. silver-silver chloride electrode) was applied. Hydrogen peroxide (2 mM), a peroxidase substrate, and methylene blue (5 micromol / l), which functions as a mediator and intercalator, are added, and salmon sperm is derived every 5 minutes at 5 microg / ml. Of DNA was added. The results are shown in FIG. In FIG. 1, the horizontal axis represents time, the vertical axis represents the electrolysis current value, the solid line represents the measurement value of the reduction current, and the arrows represent the time points at which 5 microg / ml DNA was added, respectively. As is clear from FIG. 1, a 1.1 microampere hydrogen peroxide reduction current was observed at the time when salmon sperm-derived DNA was not added, but 5 μg / ml of salmon sperm-derived DNA was added thereto. Every time, a clear reduction of the reduction current was observed. According to this result, the current decrease when 5 μg / ml of DNA was initially added was 55 nA, and when S / N = 3, it was estimated that 20 pg / ml of DNA could be quantified. It was lost.
[0021]
[Comparative example]
(Measurement of DNA on electrodes without immobilized enzyme)
A glassy carbon electrode with a diameter of 1 mm, to which no enzyme was immobilized, was inserted into a 0.1 M phosphate buffer solution at pH 6.1, and a potential of -0.15 V (vs. silver-silver chloride electrode) was applied. When methylene blue (5 micromol / l) was added here, as shown by the broken line in FIG. 1, a reduction current of only 30 nA and about 1/40 of that in the case of the peroxidase-immobilized electrode was given. When salmon sperm-derived DNA is added in increments of 5 microg / ml, the reduction current reduction cannot be displayed on the scale shown in FIG. In fact, when 5 microg / ml of DNA is initially added, the current decrease is only 1 nA, and if S / N = 3, 1 microg / ml of DNA can still be quantified. It was.
[0022]
【The invention's effect】
As is apparent from the above, the present invention is to measure the amount and concentration of double-stranded DNA in a sample using an enzyme-immobilized electrode and an intercalator having reversible redox ability. In this method, the decrease in the non-inserted intercalator based on the intercalation with respect to the double-stranded DNA in the sample is measured as a decrease in current through the electrode. In particular, by using an enzyme-immobilized electrode, Compared to the case where the change in concentration is directly measured by an electrode, it is possible to amplify the side constant current and to capture it, and as a result, provide a method for measuring DNA with high sensitivity.
[0023]
That is, the intercalator of the present invention is oxidized or reduced on the electrode, but is regenerated by an enzyme reaction, and the electrode reaction and the enzyme reaction are repeated. For this reason, an intercalator of one molecule moves many times and gives a large current signal. This gives an amplified signal as compared to the case of only an electrochemical reaction system that does not involve an enzyme reaction. Such signal amplification is possible only by providing an enzyme membrane on the electrode. Therefore, this method is useful as a simple and highly sensitive DNA measurement method.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a graph showing the measurement of each electrolysis current in the presence of hydrogen peroxide and methylene blue when using a peroxidase-immobilized electrode and when using an electrode without immobilized enzyme.
Claims (4)
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2003051895A JP3882038B2 (en) | 2003-02-27 | 2003-02-27 | A highly sensitive method for measuring the amount of double-stranded DNA |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2003051895A JP3882038B2 (en) | 2003-02-27 | 2003-02-27 | A highly sensitive method for measuring the amount of double-stranded DNA |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2004257993A JP2004257993A (en) | 2004-09-16 |
JP3882038B2 true JP3882038B2 (en) | 2007-02-14 |
Family
ID=33116928
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2003051895A Expired - Lifetime JP3882038B2 (en) | 2003-02-27 | 2003-02-27 | A highly sensitive method for measuring the amount of double-stranded DNA |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JP3882038B2 (en) |
Families Citing this family (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN101310176B (en) * | 2005-11-16 | 2013-05-01 | 三菱瓦斯化学株式会社 | Method for determination of amount of double-stranded DNA and kit for the determination |
CN103497991A (en) | 2006-11-06 | 2014-01-08 | 科隆迪亚戈有限公司 | Device and method for analysis using binding members |
WO2019026517A1 (en) * | 2017-07-31 | 2019-02-07 | 国立大学法人大阪大学 | Method and system for detecting substance of interest in solution |
-
2003
- 2003-02-27 JP JP2003051895A patent/JP3882038B2/en not_active Expired - Lifetime
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JP2004257993A (en) | 2004-09-16 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP4018082B2 (en) | Electrochemical biosensor | |
JP3413323B2 (en) | Method and apparatus for measuring the concentration of an analyte utilizing an amperometric sensor | |
Pravda et al. | Evaluation of amperometric glucose biosensors based on co-immobilisation of glucose oxidase with an osmium redox polymer in electrochemically generated polyphenol films | |
JP5296805B2 (en) | Porous particle reagent composition, device and method for biosensor | |
Rai et al. | Electrochemical nanoporous alumina membrane-based label-free DNA biosensor for the detection of Legionella sp | |
JPWO2002093151A1 (en) | Biosensor | |
EP2761016A2 (en) | Composition of redox-reagents for electrochemical biosensor and biosensor comprising the same | |
EP2737078B1 (en) | Reagents for electrochemical test strips | |
Iveković et al. | Amperometric uric acid biosensor with improved analytical performances based on alkaline-stable H2O2 transducer | |
JP2011506969A5 (en) | ||
Brown et al. | A regenerable pseudo-reagentless glucose biosensor based on Nafion polymer and l, 1'-dimethylferricinium mediator | |
Omidinia et al. | Electrochemical nanobiosensing of phenylalanine using phenylalanine dehydrogenase incorporated on amino-functionalized mobile crystalline material-41 | |
Salimi et al. | Electrocatalytic reduction of H2O2 and oxygen on the surface of thionin incorporated onto MWCNTs modified glassy carbon electrode: application to glucose detection | |
JP2007093378A (en) | Endotoxin concentration measuring method and endotoxin concentration measuring kit | |
Razumien et al. | Improvement of screen-printed carbon electrodes by modification with ferrocene derivative | |
Reddy et al. | Ion exchanger modified PVC membranes—selectivity studies and response amplification of oxalate and lactate enzyme electrodes | |
JP3882038B2 (en) | A highly sensitive method for measuring the amount of double-stranded DNA | |
Haemmerli et al. | Amperometric determination of phosphate by use of a nucleoside phosphorylase-xanthine oxidase enzyme sensor based on a Clark-type hydrogen peroxide or oxygen electrode | |
Santos et al. | Biosensor for H2O2 response based on horseradish peroxidase: effect of different mediators adsorbed on silica gel modified with niobium oxide | |
Zahir et al. | Fabrication of directly polymerized 4-vinylpyridine onto a pencil 2B graphite paste electrode for glucose monitoring | |
Wang et al. | Critical comparison of metallized and mediator‐based carbon paste glucose biosensors | |
Dutra et al. | An Inexpensive Biosensor for Uric Acid Determination in Human Serum by Flow‐Injection Analysis | |
Arai et al. | Electrochemical characteristics of glucose oxidase immobilized in poly (quinone) redox polymers | |
Shul'ga et al. | An alternative microbiosensor for hydrogen peroxide based on an enzyme field effect transistor with a fast response | |
Amini et al. | Electrocatalytic oxidation of sulfide and electrochemical behavior of chloropromazine based on organic–inorganic hybrid nanocomposite |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20041124 |
|
A977 | Report on retrieval |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971007 Effective date: 20060720 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20060725 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20060920 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20061017 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 3882038 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
S533 | Written request for registration of change of name |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313533 |
|
R350 | Written notification of registration of transfer |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350 |
|
EXPY | Cancellation because of completion of term |