JP3876162B2 - Methods and compositions for the treatment of hepatocellular carcinoma - Google Patents

Description

【０００１】
（連邦政府委託研究又は開発に関する説明）
本発明は、助成金番号NIH/NCI ROI CA 77623でのアメリカ合衆国政府の支援下でなされた。アメリカ合衆国政府はこの発明に一定の権利を有している。
【０００２】
（関連出願とのクロスリファレンス）
本出願は、2000年2月10日に出願され、肝細胞癌を予防及び治療するための方法及び組成物と題される米国特許出願第60/181,966号の優先権を主張し；及び本出願は、2000年9月12日に出願され、置換されたαフェトプロテインを用いた肝細胞癌治療と題される米国特許出願第09/660,252号の一部継続出願であり；及び2000年9月14日に出願され、αフェトプロテインｃＤＮＡを用いた肝細胞癌治療と題される米国特許出願第09/662,505号の一部継続出願であり；出典明示により内容の全体をここに取り込む。
【０００３】
（背景）
原発性肝癌は、世界中の癌による死の主要な原因である。肝細胞癌（ＨＣＣ）は、全世界で一年に約１２０万の症例の発生数を有する、最も一般的な型の原発性肝癌である。世界のいくつかの地域、例えば、東南アジア及びサブサハラアフリカでは、肝細胞癌は、最も一般的な型の悪性疾患の１つである。この疾患の高い頻度は、これらの地域における肝炎の高い発生数に関連するようである。
肝細胞癌の治癒的治療は、現在非転移性疾患を有する個体に制限されており、肝移植を伴うか又は伴わない、腫瘍の外科的切除を含む。しかしながら、外科的切除及び移植でさえも、切除後の再発のために、大部分の腫瘍が治癒しない。治療に対する化学療法剤のアプローチは、たいてい無効であった。
従って、依然として肝細胞癌の有効な治療についての必要性がある。治療は、理想的には、この疾患の最高発生数を有する非先進国における使用に適切であるべきである。さらに、治療は、切除不可能な腫瘍及び転移性疾患を有する個体における使用に適切であるべきである。
【０００４】
（概要）
一実施態様では、本発明は、癌細胞が細胞表面でαフェトプロテイン分子の少なくとも一部を発現する、哺乳動物の癌の予防又は治療のための方法である。その方法は、αフェトプロテイン分子のアミノ酸配列の少なくとも一部に対する哺乳動物の免疫応答を引き起こす工程を含み、該免疫応答は癌細胞に対するαフェトプロテインペプチド特異的Ｔリンパ球の活性化を含む。一実施態様では、αフェトプロテインペプチド特異的Ｔリンパ球は、細胞障害性Ｔリンパ球である。好ましい実施態様では、αフェトプロテイン分子は配列番号：２である。特に好ましい実施態様では、αフェトプロテイン分子は配列番号：２の残基１３７−１４５、配列番号：２の残基１５８−１６６、配列番号：２の残基３２５−３３４及び配列番号：２の残基５４２−５５０からなる群から選択される。一実施態様では、癌は肝細胞癌である。他の実施態様では、哺乳動物はヒトである。
好ましい実施態様において、免疫応答を引き起こす工程はαフェトプロテインアミノ酸配列の少なくとも一部を含んでなるペプチドを含む一又は複数の組成物を哺乳動物に投与することを含む。特に好ましい実施態様では、ペプチドは配列番号：２の残基１３７−１４５、配列番号：２の残基１５８−１６６、配列番号：２の残基３２５−３３４及び配列番号：２の残基５４２−５５０からなる群から選択される。他の好ましい実施態様では、ペプチドは配列番号：２の残基１−９、配列番号：２の残基１７８−１８６、配列番号：２の残基２１８−２２６、配列番号：２の残基２３５−２４３、配列番号：２の残基３０６−３１５、配列番号：２の残基４８５−４９３、配列番号：２の残基４９２−５００、配列番号：２の残基５０７−５１６、配列番号：２の残基５４７−５５６及び配列番号：２の残基５５５−５６３からなる群から選択される。
【０００５】
他の好ましい実施態様では、免疫応答を引き起こす工程は、配列番号：２のアミノ酸配列の少なくとも一部を形成する一又は複数のペプチドをパルスした樹状細胞を含む一又は複数の組成物を哺乳動物に投与することを含む。更に他の好ましい実施態様では、免疫応答を引き起こす工程は、αフェトプロテインをコードする組み換えアデノウィルス性ベクターを導入した樹状細胞を含む一又は複数の組成物を哺乳動物に投与することを含む。
他の実施態様では、本発明は、癌細胞が細胞表面でαフェトプロテイン分子の少なくとも一部を発現する、ヒトの肝細胞癌を予防又は治療する方法であって、該方法は配列番号：２の残基１３７−１４５、配列番号：２の残基１５８−１６６及び配列番号：２の残基３２５−３３４からなる群から選択されるペプチドを含む一又は複数の組成物をヒトに投与することにより、配列番号：２のアミノ酸配列の少なくとも一部に対して、癌細胞に抗するαフェトプロテイン細胞障害性Ｔリンパ球を活性化する工程を含む。
他の実施態様では、本発明は、癌細胞が細胞表面でαフェトプロテイン分子の少なくとも一部を発現する、ヒトの肝細胞癌を予防又は治療するための方法であって、該方法は、配列番号：２の残基５４２−５５０からなる群から選択されるペプチドを含む一又は複数の組成物をヒトに投与することにより、配列番号：２のアミノ酸配列の少なくとも一部に対して、癌細胞に抗するαフェトプロテイン細胞障害性Ｔリンパ球を活性化する工程を含む。
【０００６】
他の実施態様では、本発明は、癌細胞が細胞表面でαフェトプロテイン分子の少なくとも一部を発現する、ヒトの肝細胞癌を予防又は治療するための方法であって、該方法は、配列番号：２の残基１−９、配列番号：２の残基１７８−１８６、配列番号：２の残基２１８−２２６、配列番号：２の残基２３５−２４３、配列番号：２の残基３０６−３１５、配列番号：２の残基４８５−４９３、配列番号：２の残基４９２−５００、配列番号：２の残基５０７−５１６、配列番号：２の残基５４７−５５６及び配列番号：２の残基５５５−５６３からなる群から選択されるペプチドを含む一又は複数の組成物をヒトに投与することにより、配列番号：２のアミノ酸配列の少なくとも一部に対して、癌細胞に抗するαフェトプロテイン細胞障害性Ｔリンパ球を活性化する工程を含む。
他の実施態様では、本発明は、癌細胞が細胞表面でαフェトプロテイン分子の少なくとも一部を発現する、ヒトの肝細胞癌を予防又は治療するための方法であって、該方法は、配列番号：２のアミノ酸配列の少なくとも一部を形成する一又は複数のペプチドをパルスした樹状細胞を含む一又は複数の組成物をヒトに投与することにより、配列番号：２のアミノ酸配列の少なくとも一部に対して、癌細胞に抗するαフェトプロテイン細胞障害性Ｔリンパ球を活性化する工程を含む。一又は複数のペプチドは、配列番号：２の残基１３７−１４５、配列番号：２の残基１５８−１６６、配列番号：２の残基３２５−３３４及び配列番号：２の残基５４２−５５０からなる群から選択される一又は複数のペプチドをパルスした樹状細胞から選択される。
【０００７】
他の実施態様では、本発明は、癌細胞が細胞表面でαフェトプロテイン分子の少なくとも一部を発現する、ヒトの肝細胞癌を予防又は治療するための方法であって、該方法は、αフェトプロテインをコードする組み換えアデノウィルスベクターを導入した樹状細胞を含む一又は複数の組成物をヒトに投与することにより、配列番号：２のアミノ酸配列の少なくとも一部に対して、癌細胞に抗するαフェトプロテイン細胞障害性Ｔリンパ球を活性化する工程を含む。
他の実施態様では、本発明は、配列番号：２の残基１３７−１４５、配列番号：２の残基１５８−１６６、及び配列番号：２の残基３２５−３３４からなる群から選択される、癌の予防又は治療に利用される単離されたペプチドである。好ましい実施態様では、本発明は、哺乳動物のαフェトプロテインに対する免疫応答を引き起こすのに十分な量の配列番号：２の残基１３７−１４５、配列番号：２の残基１５８−１６６、及び配列番号：２の残基３２５−３３４からなる群から選択される一又は複数のペプチドを含む、癌の予防又は治療のための組成物である。該組成物は更にアジュバントを含むことができる。他の実施態様では、本発明はこれらのペプチドの１つ又はこれらの組成物の１つをヒトに投与する工程を含むヒトの癌を予防又は治療する方法である。
【０００８】
本発明はまた、配列番号：２の残基１３７−１４５、配列番号：２の残基１５８−１６６、配列番号：２の残基３２５−３３４及び配列番号：２の残基５４２−５５０からなる群から選択される一又は複数のペプチドを含む、癌を予防又は治療するための手段を包含する。
他の実施態様では、本発明は配列番号：２の残基５４２−５５０に従う配列を有する、癌の予防又は治療に利用される単離されたペプチドである。好ましい実施態様では、本発明は配列番号：２の残基５４２−５５０に従う配列を有するペプチドを含む、癌の予防又は治療のための組成物である。組成物は更にアジュバントを含有することができる。他の実施態様では、本発明はこれらのペプチド又はこれらの組成物の１つをヒトに投与する工程を含む、ヒトの癌の予防又は治療方法である。
本発明はまた、配列番号：２の残基５４２−５５０に従う配列を有するペプチドを含む、癌の予防又は治療の手段を包含する。
【０００９】
（説明）
一実施態様では、本発明は、単独で又は組み合わせて肝細胞癌の治療に使用されうるペプチド群である。他の実施態様では、本発明は、本発明の一又は複数のペプチドを単独で又は組み合わせて、あるいは本発明の一又は複数のペプチドを含む組成物を投与することにより肝細胞癌を予防又は治療するための方法である。他の実施態様では、本発明は、本発明の一又は複数のペプチドをパルスした、あるいはαフェトプロテインをコードする組み換えアデノウィルス（ＡｄＶ）ベクターを導入した樹状細胞を投与することにより、肝細胞癌を予防又は治療するための方法である。
肝細胞癌の約８０％がαフェトプロテイン発現を再活性化する。マウス及びヒトの両方のＴ細胞レパートリーが、ＭＨＣクラスＩによってＡＦＰ誘導ペプチドエピトープを認識することができる。従って、胚発生の間、高い血漿レベルのこの癌胎児性タンパク質に暴露されるにもかかわらず、免疫系の個体発生の間にＡＦＰ特異的Ｔ細胞の全てが消失するわけではない。
【００１０】
本発明は、ＨＬＡ-Ａ^*０２０１で提示される場合に、ヒトＴ細胞レパートリーにより認識されるヒトαフェトプロテイン、配列番号：２から誘導されるペプチドの同一性の決定を包含する。以下の表１にまとめられているように、４つのＡＦＰ誘導ペプチドを同定し、「ドミナントな」ペプチドが示された。それらはＰＬＦＱＶＰＥＰＶ、ｈＡＦＰ_{１３７−１４５}、配列番号：２の残基１３７−１４５；ＦＭＮＫＦＩＹＥＩ、ｈＡＦＰ_{１５８−１６６}、配列番号：２の残基１５８−１６６；ＧＬＳＰＮＬＮＲＦＬ、ｈＡＦＰ_{３２５−３３４}、配列番号：２の残基３２５−３３４；及びＧＶＡＬＱＴＭＫＱ、ｈＡＦＰ_{５４２−５５０}、配列番号：２の残基５４２−５５０である。それぞれ、１つ又は２つのアンカー残基を有する。
ドミナントなペプチドのそれぞれが、濃度依存性クラスＩ結合アッセイでＴ２細胞上にＨＬＡ-Ａ^*０２０１を安定化した。ペプチドをオフ速度論アッセイで２〜６時間安定化した。更に、各ドミナントペプチドは、いくつかの通常ＨＬＡ-Ａ^*０２０１ドナーからインビトロにおいてペプチド特異的Ｔ細胞を誘導した。重要なことには、これらのｈＡＦＰペプチド特異的Ｔ細胞はまた、細胞毒性アッセイ及びＩＦＮｇ ＥＬＩＳＰＯＴアッセイの両方でＨＬＡ-Ａ^*０２０１＋／ＡＦＰポジティブ腫瘍細胞を認識することができる。この情報をまとめた。

【００１１】
本発明で示されるように、これらのＴ細胞の活性化は、免疫賦活した状態でこれらのドミナントなペプチドを存在させることにより行うことができ、プロフェッショナル抗原提示樹状細胞による提示を含む。αフェトプロテインｃＤＮＡ、配列番号：１をコードする組み換えアデノウィルス（ＡｄＶ）ベクターを導入した樹状細胞は、ＭＨＣによって４つのドミナントなペプチドエピトープを処理及び提示し、またＡＦＰ特異的Ｔ細胞の活性化を誘導しうる。同様に免疫化したＨＬＡ-Ａ^*０２０１／Ｋ^ｂマウスもまた、サイトカイン放出アッセイでＡＦＰペプチドをパルスした細胞を認識する。更にＡＦＰペプチドで刺激したヒト及びＨＬＡ-Ａ^*０２０１／Ｋ^ｂマウスＴ細胞は、認識したｈＡＦＰ操作標的に応答し、より低い程度で天然ＡＦＰ発現ヒト肝細胞癌細胞に応答する。最後に、質量分析を用いて、ＨＬＡ-Ａ^*０２０１＋ＨＣＣ細胞から溶出したペプチドの複合混合物からの少なくとも３つのＡＦＰエピトープを同定した。従って、実証された複数のラインは、これら４つのドミナントなペプチドのそれぞれが免疫原性を有し、ＨＬＡ-Ａ^*０２０１により自然に処理及び提示されることを示す。
「サブドミナント」ペプチドと称される他の１０のペプチドは、弱い又は低い再現性のある応答を有するが、１以上のタイプのアッセイでポジティブであった。これら１０のペプチドは、ＭＫＷＶＥＳＩＦＬ、配列番号：２の残基１−９；ＩＬＬＷＡＡＲＹＤ、配列番号：２の残基１７８−１８６；ＬＬＮＱＨＡＣＡＶ、配列番号：２の残基２１８−２２６；ＦＱＡＩＴＶＴＫＬ、配列番号：２の残基２３５−２４３；ＴＴＬＥＲＧＱＣＩＩ、配列番号：２の残基３０６−３１５；ＣＩＲＨＥＭＴＰＶ、配列番号：２の残基４８５−４９３；ＰＶＮＰＧＶＧＱＣ、配列番号：２の残基４９２−５００；ＮＲＲＰＣＦＳＳＬＶ、配列番号：２の残基５０７−５１６；ＴＭＫＱＥＦＬＩＮＬ、配列番号：２の残基５４７−５５６；及びＮＬＶＫＱＫＰＱＩ、配列番号：２の残基５５５−５６３である。
【００１２】
本発明の組成物及び方法は、主に一又は複数のドミナントペプチド、ｈＡＦＰ_{１３７−１４５}、配列番号：２の残基１３７−１４５；ｈＡＦＰ_{１５８−１６６}、配列番号：２の残基１５８−１６６；ｈＡＦＰ_{３２５−３３４}、配列番号：２の残基３２５−３３４；及びｈＡＦＰ_{５４２−５５０}、配列番号：２の残基５４２−５５０の使用により開示されるが、所定位置にある、あるいは一又は複数の４つのドミナントペプチドと連結している１０のサブドミナントペプチドの一又は複数を使用することも本発明の範囲内である。
ドミナントペプチド及びサブドミナントペプチドの同定は、ここに詳細に議論されるであろう。第１に、ｈＡＦＰ由来のペプチド配列、配列番号：２（Genbank受託番号：J00077、J00076及びV01514）は、ＨＬＡ-Ａ^*０２０１に潜在的に結合するものであろうことが同定された。これらのペプチドは９又は１０のアミノ酸長の間に、２位にアミノ酸イソロイシン、ロイシン及びメチオニン有し、又はペプチドの長さによるがペプチド位置９又は１０にアミノ酸イソロイシン、ロイシン及びバリンを有することもあり、あるいはその両方を有する。７４のこのようなペプチドをWisconsin大学のGenetics Computer Groupプログラム「find patterns」を用いて同定し、ｈＡＦＰ配列、配列番号：２をスクリーニングした。７４の各ペプチドは標準的な技術を用いて合成した。
７４ペプチド候補のそれぞれを、ＨＬＡ-Ａ^*０２０１安定化アッセイのＴ２細胞に対する濃度による結合を試験した。細胞表面ＭＨＣクラスＩ分子発現を増加させるために前の晩に室温でインキュベートしておいたＴ２（ＴＡＰ欠損）細胞を、次いでペプチド濃度0.1mM-100mMの範囲にわたって各ペプチドと共に一晩インキュベートした。抗ＨＬＡ-Ａ２抗体（ＢＢ７．２）とヤギ抗マウスＦＩＴＣで細胞を染色した後に、ＨＬＡ-Ａ^*０２０１の安定性をフローサイトメトリーによってアッセイした。
【００１３】
次に、ＭＨＣ-ペプチド複合安定性をオフ速度論アッセイを用いて決定した。ＨＬＡ-Ａ^*０２０１ＬＣＬを、穏やかなｐＨ３．２のクエン酸-リン酸酸性緩衝液で剥離した。各ペプチドを、3μg/mlのｂ２ミクログロブリンの存在下、室温で１時間、200mMで細胞上に直接パルスした。過剰なペプチドを洗浄除去し、細胞を３７℃で０、２、４及び６時間インキュベートした。細胞を各時点の終わりに洗浄し、細胞表面ＨＬＡ-Ａ２発現について染色し、次いで、フローサイトメトリーで分析した。ペプチドＭＨＣクラスＩ複合体は、剥離はされたがペプチドをパルスされなかった細胞から少なくとも１．５倍増加した平均蛍光強度である場合を、安定であると判断した。４つのドミナントペプチドの全てが、オフ速度論アッセイで２〜６時間、安定であった。
次いで４つのドミナントペプチドについて、更なる免疫学的及び物理化学的研究を実施した。これらの研究は（１）ペプチドを使用して、ペプチド特異的で天然ＡＦＰ発現細胞を認識するＡＦＰペプチド特異的ヒトＴ細胞培地を作成する；（２）ＡｄＶｈＡＦＰ-導入樹状細胞を使用して、ＡＦＰポジティブ細胞、並びにドミナントペプチドをパルスしたＡＦＰネガティブ細胞を認識するＡＦＰ特異的ヒトＴ細胞を作成する；インビトロ研究、及び（１）ペプチドで免疫化したトランスジェニックマウスが、ペプチド及びＡＦＰポジティブ細胞を認識する脾細胞を有する；及び（２）ＡｄＶｈＡＦＰ／ＤＣ免疫化マウスがＡＦＰポジティブ細胞、並びにドミナントペプチドをパルスしたＡＦＰネガティブ細胞を認識する、インビボ研究を含んでいた。これらの研究は、ドミナントペプチドが免疫原性を有し、ＡＦＰ自体が免疫原性を有し、ドミナントペプチドがＡＦＰポジティブ細胞の表面上で自然に処理及び提示され、さらにＡＦＰ／ＤＣ又はドミナントペプチドの両方がサイトカインの生成及びＡＦＰポジティブ細胞の殺傷を行うＡＦＰ特異的Ｔ細胞を生成するのに利用できることを示した。更に、質量分析はＡＦＰポジティブ肝細胞癌細胞の表面由来のＡＦＰペプチドを物理的に同定するのに使用された。
【００１４】
第１に、未処置のＨＬＡ-Ａ^*０２０１ヒトＴ細胞培地の反復ペプチド刺激を行い、ヒトＴ細胞レパートリーにおけるペプチド免疫原性と、ＡＦＰトランスフェクト標的を認識するペプチド特異的Ｔ細胞の能力を提示した。バルクＴ細胞培地を、各ドミナントＡＦＰ由来ペプチドをパルスしたＰＢＭＣから生成し（ＫＬＨ、ＩＬ-７及びＩＬ-２を補った）、増殖の３〜７週、ペプチドをパルスした標的とＡＦＰを発現する標的の両方を認識する能力を試験した。これらの培地はペプチド特異的Ｔ細胞を増殖させ、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイにおいてコントロールＭＡＲＴ-１_{２７ - ３５}をパルスルＪＹは認識せず、特異的ペプチドをパルスしたＪＹ細胞を認識することによってＩＦＮｇを分泌する能力により明らかになった。ＡＦＰペプチド特異的バルクＴ細胞はまた、ＩＮＦｇ産生ＡＦＰ特異的Ｔ細胞の増加した頻度により示されるような修飾していない又は空のＡｄＶＲＲ５導入親細胞に比べ、安定にトランスフェクトしたＡＦＰネガティブ及びＡｄＶｈＡＦＰを導入したＨＬＡ-Ａ^*０２０１メラノーマ細胞（Ｍ２０２）の両方を認識した。ＨＬＡ-Ａ^*０２０１＋、天然ＡＦＰ発現肝細胞癌細胞株ＨｅｐＧ２を（ＨＬＡ-Ａ２-/ＡＦＰポジティブＨＣＣ株Ｈｅｐ３Ｂと比較して）認識する能力を評価するために、細胞障害性とＥＬＩＳＰＯＴアッセイを実施した。
【００１５】
更に、ＣＴＬをＡｄＶ導入樹状細胞から生成した。簡単に言うと、ＧＭ-ＣＳＦとＩＬ-４と共にインキュベートしたＰＢＭＣから作成した樹状細胞に、２時間１０００の感染効率（ｍｏｉ）でＡｄＶｈＡＦＰ又はＡｄＶＭＡＲＴ１を導入した。導入した樹状細胞を洗浄し、照射し、１-２×１０^５細胞/mlで撒いて、ＣＴＬ生成のための刺激剤とした。自己非接着細胞は、磁気ビーズ枯渇によって、ＣＤ４、ＣＤ１４、ＣＤ１９及びＣＤ５６＋細胞を枯渇し、ＣＤ８＋強化キラー細胞（一般に８０％ＣＤ８＋の濃度、示さない）を作成した。ＣＤ８＋細胞を、10-25ng/mlのＩＬ-７を添加した５％自己培地に２×１０^６細胞/mlで導入樹状細胞と共に撒いた。培地には、３-４日毎に10U/mlでＩＬ-２を補った。ＣＤ８＋ＣＴＬは、１０-２０のＣＤ８＋ＣＴＬに１樹状細胞の率で新しい自己ＡｄＶ導入樹状細胞により毎週再刺激された。多くの培地は、一週ベースでＣＤ４＋及びＣＤ８＋細胞表現型であった。各ドミナントペプチドは、いくつかの通常ＨＬＡ-Ａ^*０２０１ドナーからインビトロでペプチド特異的Ｔ細胞を誘導した。
【００１６】
ＡｄＶｈＡＦＰ/ＤＣインビトロ刺激ヒトＴ細胞は、ＣＴＬ及びＥＬＩＳＰＯＴアッセイの両方でｈＡＦＰトランスフェクト標的を特異的に認識したので、次に４つのドミナントペプチドは、ＡｄＶｈＡＦＰ/ＤＣ刺激Ｔ細胞により特異的に認識されるかどうかを決定するための研究がなされた。培養の７〜２１日後、ＡｄＶｈＡＦＰ/ＤＣで毎週刺激したＣＤ８強化Ｔ細胞を、細胞障害性及びｈＡＦＰペプチド特異的ＩＦＮｇサイトカイン産生細胞の頻度を試験した。ＡｄＶｈＡＦＰ/ＤＣ Ｔ細胞培地は、４つのＡＦＰペプチドのそれぞれをパルスしたＪＹ細胞に細胞障害性があり、これらのペプチドに対するＣＴＬは通常のドナーの末梢血から広がりうることが示唆される。自己ペプチドパルスＬＣＬ又はＪＹ細胞を再刺激した後、これらのバルク培地はまた、ＭＡＲＴ-１_{２７−３５}に比較して非常に高い頻度のＡＦＰペプチドに特異的なＩＦＮｇ分泌細胞を含んでおり、ｈＡＦＰ_{５４２−５５０}に加えて、３つの他のドミナントペプチドもまた、ＡｄＶｈＡＦＰ-導入樹状細胞により自然に処理及び提示されることが示唆された。
ＡｄＶｈＡＦＰ/ＤＣ刺激Ｔ細胞培地はまた、Ａ^*０２０１＋/ＡＦＰポジティブ肝細胞癌株ＨｅｐＧ２を認識するが、Ａ^*０２０１−/ＡＦＰポジティブＨＣＣ株Ｈｅｐ３Ｂは認識しない低頻度のサイトカイン産生細胞を有していた。Ｔｈ１サイトカインＩＦＮｇ及びＴＮＦａを合成するＴリンパ球は検出されたが、Ｔｈ２サイトカインＩＬ-４は検出されなかった。また、ＩＬ-１０は肝細胞癌株がＴ細胞無しに撒かれたときに検出されたが、このサイトカインの産生は腫瘍細胞を誘導することが示唆される。
【００１７】
ＨＬＡ-Ａ^*０２０１/Ｋ^ｂトランスジェニックマウスを７４ペプチドのスクリーニングに使用して、これらのペプチドの何れが免疫原性が有り、次のようなＨＬＡ-Ａ^*０２０１で自然に処理及び提示されるのかを決定した。ＨＬＡ-Ａ^*０２０１/Ｋ^ｂトランスジェニックメスマウスはもともとHarlan-Sprague Dawley（Indianapolis, IN US）から購入し、現在カリフォルニア大学、ロサンゼルスの放射腺腫瘍学部の動物施設で育てられている。
ペプチドの免疫化のために、マウスに、完全フロインドアジュバント中１：１でエマルジョン化した１００μｇのＡＦＰ又はコントロールペプチドを皮下注した。完全フロインドアジュバンド中にエマルジョン化した各ペプチドで免疫化した後、流入領域リンパ節細胞は、ｈＡＦＰを安定にトランスフェクトした細胞の認識によりＩＦＮｇを産生した。更に、αフェトプロテインペプチド特異的Ｔ細胞は、ＡＦＰ発現アデノウィルス（ＡｄＶｈＡＦＰ）を導入した樹状細胞で免疫化したマウスの脾臓で同定することができた。従って、４つのドミナントペプチドはクラスＩで自然に処理及び提示され、免疫原性を有する。
【００１８】
次に、これら４つのドミナントペプチドのインビボ免疫原性を確認した。ＨＬＡ-Ａ^*０２０１/Ｋ^ｂマウスを、同系の樹状細胞上にパルスした各ドミナントペプチドで免疫化した。ＩＦＮｇ特異的ＥＬＩＳＰＯＴアッセイを、免疫化ドミナントペプチド（又はＭＡＲＴ-１ペプチド）又はジャーカット/ＡＦＰ又はジャーカット/ＭＡＲＴトランスフェクト細胞株のいずれかでインビトロで再刺激した脾細胞で実施した。各ｈＡＦＰペプチドでの免疫化とそれに続く何れかのペプチド又はジャーカット/ＡＦＰでの再刺激は、多くのＡＦＰ特異的ＩＦＮｇ産生細胞を誘導した。ＰＢＳ注入マウス由来のリンパ球は、再刺激に関係なく細胞障害性もＩＦＮｇ産生も示さなかった。ＭＡＲＴ-１_{２７−３５}ペプチドで免疫化したマウスは、ＭＡＲＴ-１特異的応答を生成したが、ＡＦＰペプチド応答は生成しなかった。
次いで、ＧＭ-ＣＳＦ及びＩＬ-４の分化により骨髄前駆体から樹状細胞を作成し、ｈＡＦＰｃＤＮＡ、配列番号：１を誘導する組み換えＡｄＶベクター（ＡｄＶｈＡＦＰ）を導入した。インビボ培養した樹状細胞を１００の感染効率でＲＰＭＩ/２％ＦＣＳに導入した。導入は、３７℃で２時間実施した。次いで樹状細胞を洗浄し、注入のための動物につき0.2mlＰＢＳ当たり樹状細胞５×１０^５で再懸濁した。全ての場合において実行可能性が９５％を超えた。免疫化の２週間後、マウスからの脾細胞をｈＡＦＰ（ジャーカット/ＡＦＰ）又はＭＡＲＴ-１（ジャーカット/ＭＡＲＴ）を安定にトランスフェクトしたジャーカット細胞で再刺激した。ＭＡＲＴ特異的に対するＡＦＰ特異的ＩＦＮｇ放出の頻度を、３つの独立した実験（ここでｐ＜０．０２）を平均化するＥＬＩＳＰＯＴにより決定した。細胞障害性を、５時間の^５１Ｃｒ放出アッセイでジャーカット/ＡＦＰ及びジャーカット/ＭＡＲＴに対してアッセイした。
【００１９】
次に、ＨＬＡ-Ａ^*０２０１ヒト肝細胞癌株から抽出したドミナントペプチドについてＨＰＬＣ及び質量分析同定を実施した。これらの分析の結果の概要は、以下の表２に示される。
ペプチドを抽出するために、ＨｅｐＧ２及びＨｅｐ３Ｂ細胞をＰＢＳで３回洗浄してから、5mlのｐＨ３．２のクエン酸-リン酸緩衝液で１分間インキュベートした。懸濁液を遠心分離（８００ｘｇで５分間）し、全体で500mlの細胞無しの上清を各細胞株から回収した。その物質を凍結乾燥して−２０℃で保存した。
凍結乾燥した物質を30mlの水/アセトニトリル/トリフルオロ酢酸（Ｗ/Ａ/ＴＦＡ、全て容量で９５/５/０．１）に再溶解した。この溶液を、Ｗ/Ａ/ＴＦＡで平衡にした分析逆相ＨＰＬＣカラム（Keystone Scientific C₁₈ Betasil、250mm x 2mm、5mm粒径、100Å孔径）に0.2ml/分の流速で投入した。カラムは、アセトニトリル中の０．１％ＴＦＡの増加直線勾配を用いて溶出させた（時間/％アセトニトリル＝０/５、５/５、５５/１００、６０/１００）。カラム溶出液の吸光度を２１５と２８０ｎｍで測定し、１分間分で回収された。免疫賦活ペプチドに相当するアミノ酸配列を有する合成ペプチドの保持時間は分離カラムの同一の分離勾配を用いて得られた。
ＡＦＰ産生肝細胞癌細胞株ＨｅｐＧ２（ＨＬＡ-Ａ２^＋）及びＨｅｐ３Ｂ（ＨＬＡ-Ａ２⁻）由来のＨＰＬＣ画分ペプチド酸溶出物を分析するために、ＭＡＬＤＩ-ＴＯＦ質量分析を実施した。ボイジャーのREACTION PRODUCTS（PerSeptive Biosystems, Framingham, MA）Matrix Assisted Laser Desorption Ionization/Time-Of-Flight（MALDI-TOF）の器具を使用して、質量スペクトルを得た。器具はサンプルが沈着乾燥したステンレススチール標的を使用する。全てのスペクトルをインシュリンで外面的に較正し、典型的な±０．１％内の質量精度となった。凍結乾燥したＨＰＬＣ分画を０．１％ＴＦＡを含む１０μｌの７０％アセトニトリルに再懸濁した。この物質の１μｌを、１μｌの基質ａ-シアノ-４-ヒドロキシケイ皮酸（Sigma、70%ACN/0.1%TFAに10mg/ml）と共にスポットした。スペクトルをｍ／ｚ５００−７０００のスキャンニングで得た。
【００２０】
ＨＰＬＣ分画のＭＡＬＤＩ分析は、殆ど全ての分画が質量範囲７００〜１５００Ｄａの２０の異なるペプチドを含むが、しばしば小数のドミナントペプチドを有することを明らかにした。この複合混合物以外に、ピークは、ｈＡＦＰ_{１５８−１６６}、配列番号：２の残基１５８−１６６；ｈＡＦＰ_{３２５−３３４}、配列番号：２の残基３２５−３３４；及びｈＡＦＰ_{５４２−５５０}、配列番号：２の残基５４２−５５０、ＨｅｐＧ２細胞から抽出したペプチドプールのｈＡＦＰ_{１５８−１６６}及びｈＡＦＰ_{３２５−３３４}の算出されるモノ等方性プロトン化分子（(Ｍ＋Ｈ)^＋）に相当するｍ／ｚ値と同一であった。ｍ／ｚ９７５．６のペプチドをＨｅｐＧ２ペプチドプール由来の１つのＨＰＬＣ分画で同定した。ｈＡＦＰ_{５４２−５５０}の算出された(Ｍ＋Ｈ)^＋は９７５．５であり、ｈＡＦＰ_{５４２−５５０}、配列番号：２の残基５４２−５５０に相当するアミノ酸を有する合成ペプチドの反応時間は２１．２分であった。更に、マトリックスのみを有するサンプル中で、及びＨｅｐ３Ｂ抽出物由来のＨＰＬＣ分画１８〜２２で９７５．５±１のｍ／ｚでのシグナルは得られなかった。同様に、ｈＡＦＰ_{１５８−１６６}、配列番号：２の残基１５８−１６６及びｈＡＦＰ_{３２５−３３４}、配列番号：２の残基３２５−３３４の算出された(Ｍ＋Ｈ)^＋に相当するｍ／ｚを有するピークはまた、標準ペプチドの作用から予測されるＨｅｐＧ２から誘導される適切な分画に見られる。これらのピークはＨｅｐ３Ｂから抽出されたペプチドプールの分画にはなかった。１１５２．２ｍ／ｚのピークは１つの分画で見られ、ｈＡＦＰ_{３２５−３３４}、配列番号：２の残基３２５−３３４のナトリウム付加物の存在を示唆する。
【００２１】
従って、ポテンシャル質量補体は、ＨＬＡ-Ａ^*０２０１ネガティブＨｅｐ３Ｂ細胞の由来以外の、ＨＬＡ-Ａ^*０２０１ポジティブＨｅｐＧ２細胞から抽出されたＨＰＬＣ分画化ペプチドプールの４つのペプチドの３つを同定した。同定された３つのペプチドでは、スポットしたサンプルの繰り返しスキャンでピークが見られた。この物理化学分析で許容される誤差の限界を超えたＨｅｐＧ２ペプチドプール由来の１つの分画において、ｍ／ｚ１０２０．９で広範なピークが見られた。従って、ＨｅｐＧ２細胞の表面上のｈＡＦＰ_{１３７−１４５}、配列番号：２の残基１３７−１４５の存在を立証することができなかった。
これらの分画のドミナントペプチドの存在を免疫学的に確認するために、ＨｅｐＧ２又はＨｅｐ３Ｂからの1mlの各ＨＰＬＣ分画を使用して、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイでＡｄＶｈＡＦＰ/ＤＣ免疫化マウス脾細胞を再刺激した。ドミナントペプチドを含む分画から２００-２５０スポット/１０^６細胞が観察され、他の分画から１００-１３０スポット/１０^６細胞が観察され、Ｈｅｐ３Ｂ分画から最大５０スポット/１０^６細胞が観察された。これは更に、ドミナントペプチドの質量分析測定を裏付けする。
【００２２】

脚注 １．ペプチド識別。２．コントロール合成ペプチドの典型的なＨＰＬＣ保持時間。３．予測される質量/電荷測定値。４．ＨｅｐＧ２由来の酸抽出ペプチドの観察された質量/電荷測定値。５．Ｈｅｐ３Ｂ由来の酸抽出ペプチドの観察された質量/電荷測定値。６．ＨｅｐＧ２由来の酸抽出ペプチドの観察されたｈＡＦＰペプチド質量の分画（分）/電荷測定値。７．ＩＦＮｇ ＥＬＩＳＰＯＴによりＡｄＶｈＡＦＰ/ＤＣで初回刺激した脾細胞を再刺激することができるペプチドを含む分画。
【００２３】
実施例１
ペプチドの投与による肝細胞癌を予防又は治療する方法
本発明の一実施態様には、肝細胞癌を有する患者を予防又は治療する方法を提供することがある。本方法は、適した患者、例えばＡＦＰポジティブ肝細胞癌を有するＨＬＡ-Ａ^*０２０１^＋患者の選択を含む。次に、患者に一又は複数の本発明のペプチドを投与する。ペプチドは十分な量で投与され、好ましくは、投与は複数回繰り返して、ＡＦＰに対する免疫応答を引き起こし、それによって肝細胞癌に対する免疫反応を引き起こす。
好ましい実施態様では、ペプチドは、ｈＡＦＰ_{１３７−１４５}、配列番号：２の残基１３７−１４５；ｈＡＦＰ_{１５８−１６６}、配列番号：２の残基１５８−１６６；ｈＡＦＰ_{３２５−３３４}、配列番号：２の残基３２５−３３４；及びｈＡＦＰ_{５４２−５５０}、配列番号：２の残基５４２−５５０の組み合わせであり、一又は複数のペプチドを２回〜５回投与する。特に好ましい実施態様では、ペプチドを３回投与する。他の好ましい実施態様では、一又は複数のペプチドを２週間間隔で３回投与する。
【００２４】
好ましい実施態様では、ペプチドは直接投与されるが、投与の他の経路もこの開示に関する分野の技術者に理解されうるように適している。
好ましい実施態様では、一又は複数のペプチドのそれぞれは、0.5mlのMontanide ISA-51にエマルジョン化して投与され、４つのペプチドの組み合わせの場合には、全体で2mlのMontanide ISA-51にエマルジョン化して投与する。エマルジョン化ペプチドは４等分され、各分量を離れた部位に投与する。好ましい実施態様では、一又は複数のペプチドをそれぞれ約50μg〜2000μgの用量で投与する。好ましい実施態様では、一又は複数のペプチドをそれぞれ約100μg〜1000μgの用量で投与する。特に好ましい実施態様では、一又は複数のペプチドを約500μｇの用量で投与する。
本発明の方法及び組成物を使用してＡＦＰポジティブ/Ａ２．１＋肝細胞癌を有する数人の患者を治療した。各患者は、本方法に従って４つのペプチド、ｈＡＦＰ_{１３７−１４５}、配列番号：２の残基１３７−１４５；ｈＡＦＰ_{１５８−１６６}、配列番号：２の残基１５８−１６６；ｈＡＦＰ_{３２５−３３４}、配列番号：２の残基３２５−３３４；及びｈＡＦＰ_{５４２−５５０}、配列番号：２の残基５４２−５５０で免疫化した。ペプチドを0.5mlのMontanide ISA-51でエマルジョン化して、全体で2mlになるように組み合わせた。エマルジョン化したペプチドを４等分して、各分量を離れた部位に投与した。末梢Ｔ細胞応答をＥＬＩＳＰＯＴ及び４量体アッセイで測定した。これらの試験は、４つのＡＦＰ誘導ペプチドがインビボで検疫原性を有し、さらに患者の血清のＡＦＰのレベルが免疫化前に非常に高かったことを示す。
【００２５】
ＡＦＰ-Ａ１とした第１の患者は、再発性の切除不可能なＡＦＰポジティブ/Ａ２．１＋肝細胞癌を有していた。彼に、２週間隔でMontanide ISA中の４つのペプチドの各100μgを３回免疫化投与した。平行なインビトロＰＭＢＣ培地をまた、免疫化前に第１の患者の血液から確立し、各ペプチドを繰り返しパルスした。ＥＬＩＳＰＯＴにより試験した２８日目の培地の全てのペプチド、及び４量体による３つのうち２つのｈＡＦＰ_{１５８−１６６}、配列番号：２の残基１５８−１６６以外のｈＡＦＰ_{１３７−１４５}、配列番号：２の残基１３７−１４５；及びｈＡＦＰ_{３２５−３３４}、配列番号：２の残基３２５−３３４のインビトロ認識を明確化する。ＡＦＰ_５４２ペプチドテトラマーがこれらの試薬を調製する装置にホールドできなかったので、ＡＦＰ_５４２特異的Ｔ細胞の存在は、テトラマーにより評価することができなかった。インビボ反応は、第２及び第３の免疫化の後にｈＡＦＰ_{１３７−１４５}、配列番号：２の残基１３７−１４５；ｈＡＦＰ_{１５８−１６６}、配列番号：２の残基１５８−１６６；及びｈＡＦＰ_{５４２−５５０}、配列番号：２の残基５４２−５５０の明確な認識；及びｈＡＦＰ_{３２５−３３４}、配列番号：２の残基３２５−３３４の認識の傾向を示した。
【００２６】
ＡＦＰ-Ａ２とした第２の患者は、エタノール誘発性肝硬変の病歴を有し、Ｂ型及びＣ型肝炎の両方に陰性である７０歳のコーカサス人男性であった。彼は、腫れを伴っており、肝臓の左葉に8cmマス有していることが分かった。彼のＡＦＰ提示レベルは10,400ng/mlであった。肝臓バイオプシーは硬変肝臓のよく分化した肝細胞癌を示した。彼に対し、抗真菌剤ＦＶ-４６２実験を開始したが、病気の進行と聴器毒性があった。提示の数ヶ月後、次に彼は、本発明に従うプロトコールを用いた４つのペプチドｈＡＦＰ_{１３７−１４５}、配列番号：２の残基１３７−１４５；ｈＡＦＰ_{１５８−１６６}、配列番号：２の残基１５８−１６６；ｈＡＦＰ_{３２５−３３４}、配列番号：２の残基３２５−３３４；及びｈＡＦＰ_{５４２−５５０}、配列番号：２の残基５４２−５５０の組み合わせで開始した。彼は、２週間隔で２回の免疫化を受けた。２回の免疫化に続く４量体及びＥＬＩＳＰＯＴデータは４つ全てのＡＦＰペプチドエピトープを検出した。
従って、これらの結果は、本方法が進行型の肝細胞癌を有する患者のＡＦＰ特異的Ｔ細胞により検出可能な免疫応答を引き起こすことを示す。
【００２７】
実施例２
本発明のペプチドをパルスした樹状細胞の投与による肝細胞癌のための、又はその予防の方法
本発明の一実施態様には、肝細胞癌を有する患者を予防又は治療する方法を提供することがある。本方法は、適した患者、例えばＡＦＰポジティブ肝細胞癌を有するＨＬＡ-Ａ^*０２０１^＋患者の選択を含む。次に、患者に一又は複数の本発明のペプチドをパルスした樹状細胞を投与する。樹状細胞は十分な量で投与され、好ましくは、投与は複数回繰り返して、ＡＦＰに対する免疫応答を引き起こし、それによって肝細胞癌に対する免疫反応を引き起こす。
好ましい実施態様では、樹状細胞は、ｈＡＦＰ_{１３７−１４５}、配列番号：２の残基１３７−１４５；ｈＡＦＰ_{１５８−１６６}、配列番号：２の残基１５８−１６６；ｈＡＦＰ_{３２５−３３４}、配列番号：２の残基３２５−３３４；及びｈＡＦＰ_{５４２−５５０}、配列番号：２の残基５４２−５５０の組み合わせがパルスされる。他の好ましい実施態様では、樹状細胞を２回〜５回投与する。特に好ましい実施態様では、樹状細胞を３回投与する。他の好ましい実施態様では、樹状細胞を２週間隔で３回投与する。
【００２８】
好ましい実施態様では、樹状細胞は直接投与されるが、投与の他の経路もこの開示に関する分野の技術者に理解されうるように適している。一実施態様では、樹状細胞は約１×１０^５〜１×１０^８の用量で投与される。他の好ましい実施態様では、樹状細胞は約１×１０^６〜１×１０^７の用量で投与される。特に好ましい実施態様では、樹状細胞は約５×１０^６の用量で投与される。
樹状細胞は、当業者に既知の技術に従って、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ-ＣＳＦ）及びインターロイキン４（ＩＬ-４）に組織培地に１週間さらした付着性の自己末梢血単核細胞から調製される。Ficoll-Hypaqueによる単一の白血球アフェレーシス（Leukapheresis）から得られた細胞由来の単核細胞を単離し、樹状細胞の生成に使用されるまで液体窒素で凍結して保存する。解凍した単核細胞を生理食塩水で１回洗浄し、２-４×１０^７細胞/25cm²Costerフラスコで、２．５-５×１０^６生細胞/ml（ＲＰＭＩ１６４０＋５％熱失活自己血清＋ゲンタマイシン）の濃度に撒く。３７度で２時間付着させた後、付着しなかった細胞を生理食塩水で洗浄して取り除く。付着細胞をｒｈＧＭ-ＣＳＦ（800U/ml）及びｒｈＩＬ-４（500U/ml）の存在下で７日間、完全培地で培養する。臨床グレードのＧＭ-ＣＳＦはImmunexにより及びＩＬ-４はSchering-Ploughにより提供された。
【００２９】
患者に単一の白血球アフェレーシスを行い、少なくとも２×１０^９ＰＢＬを得て、７０％のＲＰＭＩ１６４０、２０％の自己血清及び１０％のＤＭＳＯ中に低温保存する。等分したものを研究の−７、７及び２１日目に解凍する。自己血清の血液（60ml）は白血球アフェレーシスの時と第１の免疫化の日に、全ての細胞培養に十分であるように採られる。本発明のＡＦＰ誘導免疫優性ペプチドを調製し、当業者に既知の技術で精製する。
続いて患者を免疫化する。免疫化の日に、樹状細胞を回収し、無菌生理食塩水溶液で１回洗浄して、適切な濃度、例えば1mLの無血清ＲＰＭＩ１６４０に１０^６及び４つの免疫優性ペプチドそれぞれについて50mg/mlで再懸濁する。インキュベーションの最低１時間後にＡＦＰペプチド/ＤＣをペレット化し、無菌生理食塩水で３回洗浄する。細胞をトリパンブルーで数え、皮内注射のために0.1mlの無菌食塩水に再懸濁する。
全量を投与する前に、被験者は0.1mlの生理食塩水中に１/１００の分量で皮膚テストを受けうる。３０分の観察期間の後、腋下、又は鼠径部下又は上付近に、0.1mlの生理食塩水中の皮内注射されるＡＦＰペプチドをパルスした樹状細胞の全量を接種されうる。免疫化後２時間、患者を監視する。好ましくは、患者は、50mgのジフェンヒドラミンと650mgのタイレノールで両方とも経口的に前処置される。
【００３０】
実施例３
ヒトＡＦＰアデノウィルス導入樹状細胞の投与による肝細胞癌のための、又はその予防の方法
本発明の一実施態様には、肝細胞癌を有する患者を予防又は治療する方法を提供することがある。本方法は、適した患者、例えばＡＦＰポジティブ肝細胞癌を有するＨＬＡ-Ａ^*０２０１^＋患者の選択を含む。次に、患者にヒトＡＦＰアデノウィルス導入樹状細胞を投与する。樹状細胞は十分な量で投与され、好ましくは、投与は複数回繰り返して、ＡＦＰに対する免疫応答を引き起こし、それによって肝細胞癌に対する免疫反応を引き起こす。
他の好ましい実施態様では、樹状細胞を２回〜５回投与する。特に好ましい実施態様では、樹状細胞を３回投与する。他の好ましい実施態様では、樹状細胞を２週間隔で３回投与する。
好ましい実施態様では、樹状細胞は腋下あるいは鼠径部付近に直接投与されるが、投与の他の経路もこの開示に関する分野の技術者に理解されうるように適している。一実施態様では、樹状細胞は約１×１０^５〜１×１０^８の用量で投与される。他の好ましい実施態様では、樹状細胞は約１×１０^６〜１×１０^７の用量で投与される。特に好ましい実施態様では、樹状細胞は約５×１０^６の用量で投与される。
【００３１】
Ficoll-Hypaqueによる単一の白血球アフェレーシスから単核細胞を単離し、１０％のＤＭＳＯ/２０％の自己血清で保存する。ＤＣワクチン接種の１週間前に細胞を解凍し、ＰＢＳで１回洗浄し、２-４×１０^７細胞/25cm²Costerフラスコで、２．５-５×１０^６生細胞/ml（ＲＰＭＩ１６４０＋５％熱欠活自己血清）の濃度に撒く。３７度で２時間付着させた後、付着しなかった細胞をＰＢＳで洗浄して穏やかに取り除く。付着細胞をｒｈＧＭ-ＣＳＦ（800U/ml）及びｒｈＩＬ-４（500U/ml）の存在下で７日間、完全培地で培養する。臨床グレードのＧＭ-ＣＳＦ及びＩＬ-４はSchering-Ploughによりの提供される。
ＡｄＶｈＡＦＰは、ヒトＡＦＰ ｃＤＮＡがＣＭＶエンハンサー/プロモーターにより制御されるＥ１-欠損非増殖型５アデノウィルスベクターである。それぞれの最終ウィルス生産ロットのウィルス価は、ゲノムＤＮＡ定量と感染価の両方に基づいて得られる。ウィルス粒子と生物活性ウィルスの生成率が１００：１未満のとき、条件を満たしていると判断する。
続いて患者を免疫化する。免疫化の日に、樹状細胞を回収し、無菌生理食塩水溶液で１回洗浄して、1mLの２％自己血清ＲＰＭＩ１６４０に１０^６-１０^７の濃度及び１０^９−１０^１０pfu/mlのＡｄＶｈＡＦＰ（感染効率＝１０００：１）で再懸濁する。３７℃でのインキュベーションの２時間後に、ＡｄＶｈＡＦＰ/ＤＣをＲＰＭＩ-１６４０＋５％自己血清に再懸濁して吸収されなかったアデノウィルスベクターを不活性化し、次いでペレット化し、無菌生理食塩水で３回洗浄する。細胞をトリパンブルーで数え、適した数（患者のグループに応じて１×１０^５〜１×１０^８）を皮内注射のために無菌食塩水に再懸濁する。
患者は腋又は鼠径部の下付近に、0.1mlの標準生理食塩水中の皮内注射されるＡｄＶｈＡＦＰ導入ＤＣを投与される。免疫化後２時間、患者を監視する。好ましくは、患者は、50mgのジフェンヒドラミンと650mgのタイレノールで両方とも経口的に前処置される。
本発明は特定の好ましい実施態様を参照してかなり詳細に議論したが、他の実施態様も可能である。従って、添付の請求の範囲の範囲は、本明細書中に含まれる好ましい実施態様の記載に制限されるべきではない。
【配列表】

[0001]
(Explanation on federal government research or development)
This invention was made with Government support under grant number NIH / NCI ROI CA 77623. The United States government has certain rights in this invention.
[0002]
(Cross-reference with related applications)
This application claims priority from US patent application Ser. No. 60 / 181,966, filed Feb. 10, 2000 and entitled Methods and Compositions for Preventing and Treating Hepatocellular Carcinoma; Is a continuation-in-part of US patent application Ser. No. 09 / 660,252 filed Sep. 12, 2000 and entitled Hepatocellular Carcinoma Treatment Using Substituted α-Fetoprotein; This is a continuation-in-part of US patent application Ser. No. 09 / 662,505, filed on the day and entitled Hepatocellular Carcinoma Treatment Using α-Fetoprotein cDNA; the entire contents of which are incorporated herein by reference.
[0003]
(background)
Primary liver cancer is the leading cause of cancer death worldwide. Hepatocellular carcinoma (HCC) is the most common type of primary liver cancer, with an incidence of approximately 1.2 million cases per year worldwide. In some parts of the world, such as Southeast Asia and Sub-Saharan Africa, hepatocellular carcinoma is one of the most common types of malignancy. The high frequency of this disease seems to be related to the high incidence of hepatitis in these areas.
Curative treatment of hepatocellular carcinoma is currently limited to individuals with non-metastatic disease and involves surgical resection of the tumor with or without liver transplantation. However, even surgical resection and transplantation does not cure most tumors due to recurrence after resection. Chemotherapeutic approaches to treatment have often been ineffective.
Thus, there remains a need for effective treatment of hepatocellular carcinoma. Treatment should ideally be appropriate for use in non-developed countries with the highest incidence of this disease. Furthermore, the treatment should be suitable for use in individuals with unresectable tumors and metastatic disease.
[0004]
(Overview)
In one embodiment, the invention is a method for the prevention or treatment of cancer in a mammal, wherein the cancer cells express at least a portion of an alpha fetoprotein molecule on the cell surface. The method includes causing a mammalian immune response against at least a portion of the amino acid sequence of the alpha fetoprotein molecule, the immune response comprising activation of alpha fetoprotein peptide-specific T lymphocytes against cancer cells. In one embodiment, the alpha fetoprotein peptide-specific T lymphocyte is a cytotoxic T lymphocyte. In a preferred embodiment, the alpha fetoprotein molecule is SEQ ID NO: 2. In a particularly preferred embodiment, the alpha fetoprotein molecule comprises residues 137-145 of SEQ ID NO: 2, residues 158-166 of SEQ ID NO: 2, residues 325-334 of SEQ ID NO: 2, and residues of SEQ ID NO: 2. Selected from the group consisting of 542-550. In one embodiment, the cancer is hepatocellular carcinoma. In other embodiments, the mammal is a human.
In a preferred embodiment, causing an immune response includes administering to the mammal one or more compositions comprising a peptide comprising at least a portion of the alpha fetoprotein amino acid sequence. In a particularly preferred embodiment, the peptide comprises residues 137-145 of SEQ ID NO: 2, residues 158-166 of SEQ ID NO: 2, residues 325-334 of SEQ ID NO: 2, and residues 542 of SEQ ID NO: 2. Selected from the group consisting of 550. In another preferred embodiment, the peptide is residues 1-9 of SEQ ID NO: 2, residues 178-186 of SEQ ID NO: 2, residues 218-226 of SEQ ID NO: 2, residues 235 of SEQ ID NO: 2. -243, residues 306-315 of SEQ ID NO: 2, residues 485-493 of SEQ ID NO: 2, residues 492-500 of SEQ ID NO: 2, residues 507-516 of SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: Selected from the group consisting of residues 547-556 of 2 and residues 555-563 of SEQ ID NO: 2.
[0005]
In another preferred embodiment, the step of eliciting an immune response comprises one or more compositions comprising dendritic cells pulsed with one or more peptides forming at least part of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2. Administration. In yet another preferred embodiment, the step of eliciting an immune response comprises administering to the mammal one or more compositions comprising dendritic cells into which a recombinant adenoviral vector encoding α-fetoprotein has been introduced.
In another embodiment, the invention provides a method for preventing or treating human hepatocellular carcinoma, wherein the cancer cell expresses at least a portion of an alpha fetoprotein molecule on the cell surface, the method comprising SEQ ID NO: 2. By administering to a human one or more compositions comprising a peptide selected from the group consisting of residues 137-145, residues 158-166 of SEQ ID NO: 2, and residues 325-334 of SEQ ID NO: 2. Activating α-fetoprotein cytotoxic T lymphocytes against cancer cells against at least part of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2.
In another embodiment, the invention provides a method for preventing or treating human hepatocellular carcinoma, wherein the cancer cell expresses at least a portion of an alpha fetoprotein molecule on the cell surface, the method comprising SEQ ID NO: : By administering to a human one or more compositions comprising a peptide selected from the group consisting of residues 542-550 of 2 to cancer cells against at least part of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 Activating the anti-alpha fetoprotein cytotoxic T lymphocytes.
[0006]
In another embodiment, the invention provides a method for preventing or treating human hepatocellular carcinoma, wherein the cancer cell expresses at least a portion of an alpha fetoprotein molecule on the cell surface, the method comprising SEQ ID NO: : Residues 1-9 of SEQ ID NO: 2, residues 178-186 of SEQ ID NO: 2, residues 218-226 of SEQ ID NO: 2, residues 235-243 of SEQ ID NO: 2, residues 306 of SEQ ID NO: 2 -315, residues 485-493 of SEQ ID NO: 2, residues 492-500 of SEQ ID NO: 2, residues 507-516 of SEQ ID NO: 2, residues 547-556 of SEQ ID NO: 2 and SEQ ID NO: By administering to a human one or more compositions comprising a peptide selected from the group consisting of 2 residues 555-563, anti-cancer cells against at least part of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 Alpha-fetoprotein cytotoxicity Activating T lymphocytes.
In another embodiment, the invention provides a method for preventing or treating human hepatocellular carcinoma, wherein the cancer cell expresses at least a portion of an alpha fetoprotein molecule on the cell surface, the method comprising SEQ ID NO: : At least part of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 by administering to a human one or more compositions comprising dendritic cells pulsed with one or more peptides forming at least part of the amino acid sequence of 2 In contrast, a step of activating α-fetoprotein cytotoxic T lymphocytes against cancer cells is included. The one or more peptides include residues 137-145 of SEQ ID NO: 2, residues 158-166 of SEQ ID NO: 2, residues 325-334 of SEQ ID NO: 2, and residues 542-550 of SEQ ID NO: 2. Selected from dendritic cells pulsed with one or more peptides selected from the group consisting of
[0007]
In another embodiment, the present invention is a method for preventing or treating human hepatocellular carcinoma, wherein the cancer cells express at least a portion of an alpha fetoprotein molecule on the cell surface, the method comprising alpha fetoprotein Α-fetoprotein that resists cancer cells against at least a part of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 by administering one or more compositions containing dendritic cells into which a recombinant adenovirus vector encoding the gene is introduced to humans Activating cytotoxic T lymphocytes.
In another embodiment, the invention is selected from the group consisting of residues 137-145 of SEQ ID NO: 2, residues 158-166 of SEQ ID NO: 2, and residues 325-334 of SEQ ID NO: 2. An isolated peptide used for the prevention or treatment of cancer. In a preferred embodiment, the invention provides residues 137-145 of SEQ ID NO: 2, residues 158-166 of SEQ ID NO: 2, and SEQ ID NO: 2 in an amount sufficient to elicit an immune response against mammalian alpha-fetoprotein. : A composition for preventing or treating cancer comprising one or more peptides selected from the group consisting of 2 residues 325-334. The composition can further comprise an adjuvant. In another embodiment, the invention is a method of preventing or treating human cancer comprising the step of administering one of these peptides or one of these compositions to a human.
[0008]
The present invention also consists of residues 137-145 of SEQ ID NO: 2, residues 158-166 of SEQ ID NO: 2, residues 325-334 of SEQ ID NO: 2, and residues 542-550 of SEQ ID NO: 2. Means for preventing or treating cancer comprising one or more peptides selected from the group are included.
In another embodiment, the invention is an isolated peptide used for the prevention or treatment of cancer having a sequence according to residues 542-550 of SEQ ID NO: 2. In a preferred embodiment, the invention is a composition for the prevention or treatment of cancer comprising a peptide having a sequence according to residues 542-550 of SEQ ID NO: 2. The composition can further contain an adjuvant. In another embodiment, the invention is a method of preventing or treating human cancer comprising the step of administering these peptides or one of these compositions to a human.
The present invention also encompasses a means for preventing or treating cancer comprising a peptide having a sequence according to residues 542-550 of SEQ ID NO: 2.
[0009]
(Explanation)
In one embodiment, the invention is a group of peptides that can be used alone or in combination for the treatment of hepatocellular carcinoma. In another embodiment, the present invention prevents or treats hepatocellular carcinoma by administering one or more peptides of the present invention alone or in combination, or by administering a composition comprising one or more peptides of the present invention. It is a method to do. In another embodiment, the invention provides for hepatocellular carcinoma by administering dendritic cells pulsed with one or more peptides of the invention or introduced with a recombinant adenovirus (AdV) vector encoding alpha-fetoprotein. A method for preventing or treating.
Approximately 80% of hepatocellular carcinomas reactivate alpha fetoprotein expression. Both mouse and human T cell repertoires can recognize AFP-derived peptide epitopes by MHC class I. Thus, not all AFP-specific T cells are lost during ontogeny of the immune system, despite exposure to high plasma levels of this oncofetal protein during embryogenesis.
[0010]
The present invention relates to HLA-A^*Includes the determination of the identity of a peptide derived from human α-fetoprotein, SEQ ID NO: 2, recognized by the human T cell repertoire when presented at 0201. As summarized in Table 1 below, four AFP-derived peptides were identified and “dominant” peptides were shown. They are PLFQVPEPV, hAFP_137-145, Residues 137-145 of SEQ ID NO: 2; FMNKFIYEI, hAFP_158-166, Residues 158-166 of SEQ ID NO: 2; GLSPNLNRFL, hAFP_325-334, Residues 325-334 of SEQ ID NO: 2; and GVALQTMKQ, hAFP_542-550, Residues 542-550 of SEQ ID NO: 2. Each has one or two anchor residues.
Each of the dominant peptides is expressed in HLA-A on T2 cells in a concentration-dependent class I binding assay.^*0201 was stabilized. Peptides were stabilized for 2-6 hours in an off-kinetic assay. In addition, each dominant peptide contains several normal HLA-A^*Peptide-specific T cells were derived in vitro from 0201 donors. Importantly, these hAFP peptide-specific T cells are also expressed in HLA-A in both cytotoxicity and IFNg ELISPOT assays.^*0201 + / AFP positive tumor cells can be recognized. This information is summarized.

[0011]
As demonstrated in the present invention, activation of these T cells can be accomplished by the presence of these dominant peptides in an immunostimulated state, including presentation by professional antigen presenting dendritic cells. Dendritic cells transfected with a recombinant adenovirus (AdV) vector encoding alpha-fetoprotein cDNA, SEQ ID NO: 1, process and present four dominant peptide epitopes by MHC, and also induce activation of AFP-specific T cells Yes. Similarly immunized HLA-A^*0201 / K^bMice also recognize cells pulsed with AFP peptides in cytokine release assays. In addition, human and HLA-A stimulated with AFP peptide^*0201 / K^bMouse T cells respond to recognized hAFP engineered targets and to a lesser extent natural AFP-expressing human hepatocellular carcinoma cells. Finally, using mass spectrometry, HLA-A^*At least three AFP epitopes from a complex mixture of peptides eluted from 0201 + HCC cells were identified. Thus, the demonstrated lines show that each of these four dominant peptides is immunogenic and HLA-A^*0201 indicates that it is processed and presented naturally.
The other 10 peptides, referred to as “subdominant” peptides, had a weak or low reproducible response, but were positive in one or more types of assays. These ten peptides are MKWVESIFL, residues 1-9 of SEQ ID NO: 2; ILLWAARYD, residues 178-186 of SEQ ID NO: 2; LLNQHAVAC, SEQ ID NO: residues 218-226; FQAITVTKL, SEQ ID NO: 2 residues 235-243; TTLERGQCII, SEQ ID NO: 2 residues 306-315; CIRHEMTPV, SEQ ID NO: 2 residues 485-493; PVNPGVGQC, SEQ ID NO: 2 residues 492-500; NRRPCFSSLV, sequence Numbers: residues 507-516 of 2; TMKQEFLINL, residues 547-556 of SEQ ID NO: 2; and NLVKQKPQI, residues 555-563 of SEQ ID NO: 2.
[0012]
The compositions and methods of the present invention mainly comprise one or more dominant peptides, hAFP._137-145, Residues 137-145 of SEQ ID NO: 2; hAFP_158-166, Residues 158-166 of SEQ ID NO: 2; hAFP_325-334, Residues 325-334 of SEQ ID NO: 2; and hAFP_542-550, Disclosed by the use of residues 542-550 of SEQ ID NO: 2, but using one or more of 10 subdominant peptides in position or linked to one or more four dominant peptides This is also within the scope of the present invention.
The identification of dominant peptides and subdominant peptides will now be discussed in detail. First, the peptide sequence derived from hAFP, SEQ ID NO: 2 (Genbank accession numbers: J00077, J00076 and V01514) is HLA-A^*It was identified that it would potentially bind to 0201. These peptides may have amino acids isoleucine, leucine and methionine at position 2 between 9 or 10 amino acids in length, or may have amino acids isoleucine, leucine and valine at peptide positions 9 or 10 depending on the length of the peptide Or both. 74 such peptides were identified using the Genetics Computer Group program “find patterns” of the University of Wisconsin and screened for the hAFP sequence, SEQ ID NO: 2. Each of the 74 peptides was synthesized using standard techniques.
Each of the 74 peptide candidates is designated HLA-A^*Binding by concentration to T2 cells in the 0201 stabilization assay was tested. T2 (TAP deficient) cells that had been incubated at room temperature the previous night to increase cell surface MHC class I molecule expression were then incubated overnight with each peptide over a range of peptide concentrations of 0.1 mM-100 mM. After staining cells with anti-HLA-A2 antibody (BB7.2) and goat anti-mouse FITC, HLA-A^*The stability of 0201 was assayed by flow cytometry.
[0013]
Next, MHC-peptide complex stability was determined using an off-kinetic assay. HLA-A^*0201 LCL was stripped with a mild pH 3.2 citrate-phosphate acid buffer. Each peptide was pulsed directly onto cells at 200 mM for 1 hour at room temperature in the presence of 3 μg / ml b2 microglobulin. Excess peptide was washed away and cells were incubated at 37 ° C. for 0, 2, 4 and 6 hours. Cells were washed at the end of each time point, stained for cell surface HLA-A2 expression, and then analyzed by flow cytometry. A peptide MHC class I complex was judged to be stable if it had an average fluorescence intensity that was increased by at least 1.5 fold from cells that were detached but not pulsed with the peptide. All four dominant peptides were stable for 2-6 hours in the off-kinetic assay.
Further immunological and physicochemical studies were then performed on the four dominant peptides. These studies (1) use peptides to create an AFP peptide-specific human T cell medium that recognizes peptide-specific and native AFP-expressing cells; (2) using AdVhAFP-introduced dendritic cells; Create AFP-specific human T cells that recognize AFP positive cells and AFP negative cells pulsed with dominant peptides; in vitro studies, and (1) transgenic mice immunized with peptides recognize peptides and AFP positive cells And (2) in vivo studies in which AdVhAFP / DC immunized mice recognize AFP positive cells as well as AFP negative cells pulsed with dominant peptides. These studies show that the dominant peptide is immunogenic, the AFP itself is immunogenic, the dominant peptide is naturally processed and presented on the surface of AFP positive cells, and the AFP / DC or dominant peptide We have shown that both can be used to generate AFP-specific T cells that produce cytokines and kill AFP positive cells. In addition, mass spectrometry was used to physically identify AFP peptides derived from the surface of AFP positive hepatocellular carcinoma cells.
[0014]
First, untreated HLA-A^*Repetitive peptide stimulation of 0201 human T cell medium was performed to demonstrate peptide immunogenicity in the human T cell repertoire and the ability of peptide specific T cells to recognize AFP transfected targets. Bulk T cell medium is generated from PBMC pulsed with each dominant AFP-derived peptide (supplemented with KLH, IL-7 and IL-2) and expresses AFP with peptide-pulsed target 3-7 weeks of growth. The ability to recognize both targets was tested. These media proliferate peptide-specific T cells and control MART-1 in the ELISPOT assay._{27 - 35}Was recognized by the ability to secrete IFNg by recognizing JY cells pulsed with specific peptides. AFP peptide-specific bulk T cells also contain stably transfected AFP negative and AdVhAFP compared to unmodified or empty AdVRR5-introduced parental cells as indicated by the increased frequency of INFg-producing AFP-specific T cells. HLA-A introduced^*Both 0201 melanoma cells (M202) were recognized. HLA-A^*To evaluate the ability to recognize 0201+, the native AFP expressing hepatocellular carcinoma cell line HepG2 (compared to HLA-A2- / AFP positive HCC strain Hep3B), cytotoxicity and ELISPOT assays were performed.
[0015]
In addition, CTLs were generated from AdV-introduced dendritic cells. Briefly, AdVhAFP or AdVMART1 was introduced into dendritic cells made from PBMC incubated with GM-CSF and IL-4 with an infection efficiency (moi) of 2 hours 1000. The introduced dendritic cells were washed, irradiated, and 1-2 × 10⁵Cells / ml were used as stimulants for CTL generation. Self-adherent cells depleted CD4, CD14, CD19 and CD56 + cells by magnetic bead depletion, creating CD8 + enhanced killer cells (generally 80% CD8 + concentration, not shown). CD8 + cells were 2 × 10 2 in 5% autologous medium supplemented with 10-25 ng / ml IL-7.⁶Cells / ml were seeded with the introduced dendritic cells. The medium was supplemented with IL-2 at 10 U / ml every 3-4 days. CD8 + CTL was restimulated weekly with new autologous AdV-introduced dendritic cells at a rate of 1 dendritic cell to 10-20 CD8 + CTL. Many media had a CD4 + and CD8 + cell phenotype on a weekly basis. Each dominant peptide contains some normal HLA-A^*Peptide-specific T cells were derived in vitro from 0201 donors.
[0016]
Since AdVhAFP / DC in vitro stimulated human T cells specifically recognized hAFP transfected targets in both CTL and ELISPOT assays, then the four dominant peptides are specifically recognized by AdVhAFP / DC stimulated T cells. Research has been done to determine whether or not. After 7-21 days in culture, CD8-enhanced T cells stimulated weekly with AdVhAFP / DC were tested for cytotoxicity and frequency of hAFP peptide-specific IFNg cytokine producing cells. AdVhAFP / DC T cell medium is cytotoxic to JY cells pulsed with each of the four AFP peptides, suggesting that CTL against these peptides can spread from the peripheral blood of normal donors. After restimulating self-peptide-pulsed LCL or JY cells, these bulk media are also_27-35Contains IFNg-secreting cells specific for AFP peptides with a very high frequency compared to hAFP_542-550In addition, it was suggested that three other dominant peptides are also naturally processed and presented by AdVhAFP-introduced dendritic cells.
AdVhAFP / DC stimulated T cell medium is also^*Recognizes 0201 + / AFP positive hepatocellular carcinoma line HepG2,^*The 0201− / AFP positive HCC strain Hep3B had a low frequency of cytokine producing cells that were not recognized. T lymphocytes that synthesize the Th1 cytokines IFNg and TNFa were detected, but the Th2 cytokine IL-4 was not detected. IL-10 was detected when hepatocellular carcinoma strains were seeded without T cells, suggesting that production of this cytokine induces tumor cells.
[0017]
HLA-A^*0201 / K^bUsing transgenic mice for screening 74 peptides, any of these peptides is immunogenic and HLA-A^*It was determined at 0201 whether it was processed and presented naturally. HLA-A^*0201 / K^bTransgenic female mice were originally purchased from Harlan-Sprague Dawley (Indianapolis, IN US) and are currently raised at the University of California, Los Angeles Radiation Oncology Animal Facility.
For peptide immunization, mice were injected subcutaneously with 100 μg AFP or control peptide emulsified 1: 1 in complete Freund's adjuvant. After immunization with each peptide emulsified in complete Freundage band, draining lymph node cells produced IFNg by recognition of cells stably transfected with hAFP. Furthermore, α-fetoprotein peptide-specific T cells could be identified in the spleen of mice immunized with dendritic cells transfected with AFP-expressing adenovirus (AdVhAFP). Thus, the four dominant peptides are naturally processed and presented in class I and are immunogenic.
[0018]
Next, the in vivo immunogenicity of these four dominant peptides was confirmed. HLA-A^*0201 / K^bMice were immunized with each dominant peptide pulsed onto syngeneic dendritic cells. IFNg-specific ELISPOT assays were performed on splenocytes in vitro restimulated with either immunized dominant peptide (or MART-1 peptide) or Jurkat / AFP or Jurkat / MART transfected cell lines. Immunization with each hAFP peptide followed by restimulation with either peptide or Jurkat / AFP induced many AFP-specific IFNg producing cells. Lymphocytes from PBS-injected mice showed neither cytotoxicity nor IFNg production regardless of restimulation. MART-1_27-35Mice immunized with the peptide produced a MART-1 specific response but no AFP peptide response.
Next, dendritic cells were prepared from bone marrow precursors by differentiation of GM-CSF and IL-4, and a recombinant AdV vector (AdVhAFP) that induces hAFP cDNA, SEQ ID NO: 1 was introduced. Dendritic cells cultured in vivo were introduced into RPMI / 2% FCS with an infection efficiency of 100. The introduction was carried out at 37 ° C. for 2 hours. The dendritic cells were then washed and 5 × 10 dendritic cells per 0.2 ml PBS per animal for injection.⁵And resuspended. In all cases, the feasibility exceeded 95%. Two weeks after immunization, splenocytes from mice were restimulated with Jurkat cells stably transfected with hAFP (Jurkat / AFP) or MART-1 (Jurkat / MART). The frequency of AFP-specific IFNg release versus MART-specific was determined by ELISPOT averaging three independent experiments, where p <0.02. 5 hours of cytotoxicity⁵¹Assayed against Jurkat / AFP and Jurkat / MART in Cr release assay.
[0019]
Next, HLA-A^*HPLC and mass spectrometric identification was performed on dominant peptides extracted from 0201 human hepatocellular carcinoma line. A summary of the results of these analyzes is shown in Table 2 below.
To extract the peptides, HepG2 and Hep3B cells were washed 3 times with PBS and then incubated with 5 ml of pH 3.2 citrate-phosphate buffer for 1 minute. The suspension was centrifuged (800 xg for 5 minutes) and a total of 500 ml of cell-free supernatant was collected from each cell line. The material was lyophilized and stored at -20 ° C.
The lyophilized material was redissolved in 30 ml water / acetonitrile / trifluoroacetic acid (W / A / TFA, all 95/5 / 0.1 by volume). This solution was subjected to analytical reverse phase HPLC column (Keystone Scientific C) equilibrated with W / A / TFA.₁₈ Betasil, 250 mm x 2 mm, 5 mm particle size, 100 pore size) was introduced at a flow rate of 0.2 ml / min. The column was eluted using an increasing linear gradient of 0.1% TFA in acetonitrile (time /% acetonitrile = 0/5, 5/5, 55/100, 60/100). The absorbance of the column eluate was measured at 215 and 280 nm and recovered in 1 minute. The retention time of the synthetic peptide having an amino acid sequence corresponding to the immunostimulatory peptide was obtained using the same separation gradient of the separation column.
AFP-producing hepatocellular carcinoma cell line HepG2 (HLA-A2⁺) And Hep3B (HLA-A2)⁻) HPLC fraction peptide acid eluate was analyzed by MALDI-TOF mass spectrometry. Mass spectra were obtained using a Voyager REACTION PRODUCTS (PerSeptive Biosystems, Framingham, Mass.) Matrix Assisted Laser Desorption Ionization / Time-Of-Flight (MALDI-TOF) instrument. The instrument uses a stainless steel target with the sample deposited and dried. All spectra were externally calibrated with insulin, resulting in a typical mass accuracy within ± 0.1%. The lyophilized HPLC fraction was resuspended in 10 μl 70% acetonitrile containing 0.1% TFA. 1 μl of this material was spotted with 1 μl of substrate a-cyano-4-hydroxycinnamic acid (Sigma, 10 mg / ml in 70% ACN / 0.1% TFA). The spectrum was obtained by scanning from m / z 500-7000.
[0020]
MALDI analysis of HPLC fractions revealed that almost all fractions contained 20 different peptides with a mass range of 700-1500 Da, but often had a small number of dominant peptides. Besides this complex mixture, the peak is hAFP._158-166, Residues 158-166 of SEQ ID NO: 2; hAFP_325-334, Residues 325-334 of SEQ ID NO: 2; and hAFP_542-550, Residues 542-550 of SEQ ID NO: 2, hAFP of peptide pool extracted from HepG2 cells_158-166And hAFP_325-334Monoisotropic protonated molecule calculated by ((M + H)⁺) And the same m / z value. The peptide at m / z 975.6 was identified with one HPLC fraction from the HepG2 peptide pool. hAFP_542-550Calculated (M + H)⁺Is 95.5 and hAFP_542-550The reaction time of the synthetic peptide having an amino acid corresponding to residues 542 to 550 of SEQ ID NO: 2 was 21.2 minutes. Furthermore, no signal at m / z of 975.5 ± 1 was obtained in samples with matrix only and in HPLC fractions 18-22 from Hep3B extract. Similarly, hAFP_158-166, Residues 158-166 of SEQ ID NO: 2 and hAFP_325-334Calculated (M + H) of residues 325-334 of SEQ ID NO: 2.⁺A peak with m / z corresponding to is also seen in the appropriate fraction derived from HepG2 predicted from the action of the standard peptide. These peaks were not present in the peptide pool fraction extracted from Hep3B. The 1152.2 m / z peak is seen in one fraction, hAFP_325-334, Suggests the presence of a sodium adduct of residues 325-334 of SEQ ID NO: 2.
[0021]
Thus, the potential mass complement is HLA-A^*HLA-A other than 0201 negative Hep3B cell origin^*Three of the four peptides in the HPLC-fractionated peptide pool extracted from 0201 positive HepG2 cells were identified. For the three identified peptides, peaks were seen in repeated scans of spotted samples. A broad peak was seen at m / z 1020.9 in one fraction from the HepG2 peptide pool that exceeded the limits of error allowed by this physicochemical analysis. Thus, hAFP on the surface of HepG2 cells_137-145The presence of residues 137-145 of SEQ ID NO: 2 could not be verified.
To immunologically confirm the presence of dominant peptides in these fractions, 1 ml of each HPLC fraction from HepG2 or Hep3B was used to restimulate AdVhAFP / DC-immunized mouse splenocytes in an ELISPOT assay. . 200-250 spots / 10 from fractions containing dominant peptides⁶Cells are observed and 100-130 spots / 10 from other fractions⁶Cells are observed, up to 50 spots / 10 from the Hep3B fraction⁶Cells were observed. This further supports mass spectrometry measurements of dominant peptides.
[0022]

Footnotes 1. Peptide identification. 2. Typical HPLC retention time for control synthetic peptides. 3. Expected mass / charge measurements. 4). Observed mass / charge measurements of HepG2-derived acid extracted peptides. 5. Observed mass / charge measurements of acid extracted peptides from Hep3B. 6). Observed hAFP peptide mass fraction (fraction) / charge measurement of HepG2-derived acid extracted peptide. 7). Fraction containing a peptide capable of restimulating splenocytes primed with AdVhAFP / DC by IFNg ELISPOT.
[0023]
Example 1
Method for preventing or treating hepatocellular carcinoma by administration of peptide
One embodiment of the invention may provide a method for preventing or treating a patient having hepatocellular carcinoma. The method is suitable for suitable patients such as HLA-A with AFP positive hepatocellular carcinoma.^*0201⁺Includes patient selection. The patient is then administered one or more peptides of the invention. The peptide is administered in a sufficient amount, and preferably the administration is repeated multiple times to cause an immune response against AFP and thereby an immune response against hepatocellular carcinoma.
In a preferred embodiment, the peptide is hAFP._137-145, Residues 137-145 of SEQ ID NO: 2; hAFP_158-166, Residues 158-166 of SEQ ID NO: 2; hAFP_325-334, Residues 325-334 of SEQ ID NO: 2; and hAFP_542-550, SEQ ID NO: 2, residues 542-550, wherein one or more peptides are administered 2 to 5 times. In a particularly preferred embodiment, the peptide is administered three times. In another preferred embodiment, one or more peptides are administered three times at two week intervals.
[0024]
In a preferred embodiment, the peptide is administered directly, but other routes of administration are suitable as will be understood by those skilled in the art for this disclosure.
In a preferred embodiment, each of the peptide or peptides is administered as an emulsion in 0.5 ml of Montanide ISA-51, and in the case of a combination of four peptides, the total is emulsified in 2 ml of Montanide ISA-51. Administer. The emulsified peptide is divided into four equal parts and each aliquot is administered to a remote site. In a preferred embodiment, one or more peptides are each administered at a dose of about 50 μg to 2000 μg. In a preferred embodiment, one or more peptides are each administered at a dose of about 100 μg to 1000 μg. In a particularly preferred embodiment, one or more peptides are administered at a dose of about 500 μg.
Several patients with AFP positive / A2.1 + hepatocellular carcinoma were treated using the methods and compositions of the present invention. Each patient has four peptides, hAFP, according to the method._137-145, Residues 137-145 of SEQ ID NO: 2; hAFP_158-166, Residues 158-166 of SEQ ID NO: 2; hAFP_325-334, Residues 325-334 of SEQ ID NO: 2; and hAFP_542-550Immunized with residues 542-550 of SEQ ID NO: 2. The peptide was emulsified with 0.5 ml Montanide ISA-51 and combined to a total of 2 ml. The emulsified peptide was divided into four equal parts and each aliquot was administered to a remote site. Peripheral T cell responses were measured with ELISPOT and tetramer assays. These studies show that the four AFP-derived peptides were quarantigenic in vivo and that the patient serum AFP levels were very high prior to immunization.
[0025]
The first patient with AFP-A1 had recurrent unresectable AFP positive / A2.1 + hepatocellular carcinoma. He was immunized three times with 100 μg of each of the four peptides in Montanide ISA at two week intervals. Parallel in vitro PMBC medium was also established from the blood of the first patient prior to immunization and each peptide was pulsed repeatedly. All peptides in day 28 medium tested by ELISPOT, and 2 out of 3 hAFP by tetramer_158-166HAFP other than residues 158-166 of SEQ ID NO: 2._137-145, Residues 137-145 of SEQ ID NO: 2; and hAFP_325-334Clarify in vitro recognition of residues 325-334 of SEQ ID NO: 2. AFP₅₄₂Since peptide tetramers could not be held in the equipment to prepare these reagents, AFP₅₄₂The presence of specific T cells could not be assessed by tetramer. The in vivo response is hAFP after the second and third immunizations._137-145, Residues 137-145 of SEQ ID NO: 2; hAFP_158-166, Residues 158-166 of SEQ ID NO: 2; and hAFP_542-550Unambiguous recognition of residues 542-550 of SEQ ID NO: 2; and hAFP_325-334, Showed a tendency to recognize residues 325-334 of SEQ ID NO: 2.
[0026]
The second patient, designated AFP-A2, was a 70-year-old Caucasian male with a history of ethanol-induced cirrhosis and negative for both hepatitis B and C. He was found to be swollen and had an 8 cm mass in the left lobe of the liver. His AFP presentation level was 10,400 ng / ml. Liver biopsy showed well differentiated hepatocellular carcinoma of cirrhotic liver. He started an antifungal FV-462 experiment, but he was sick and ototoxic. After several months of presentation, he then added four peptides hAFP using the protocol according to the invention._137-145, Residues 137-145 of SEQ ID NO: 2; hAFP_158-166, Residues 158-166 of SEQ ID NO: 2; hAFP_325-334, Residues 325-334 of SEQ ID NO: 2; and hAFP_542-550, Starting with the combination of residues 542-550 of SEQ ID NO: 2. He received two immunizations every two weeks. Tetramer and ELISPOT data following two immunizations detected all four AFP peptide epitopes.
Thus, these results indicate that the method elicits an immune response detectable by AFP-specific T cells in patients with advanced hepatocellular carcinoma.
[0027]
Example 2
Method for or prevention of hepatocellular carcinoma by administration of dendritic cells pulsed with the peptides of the present invention
One embodiment of the invention may provide a method for preventing or treating a patient having hepatocellular carcinoma. The method is suitable for suitable patients such as HLA-A with AFP positive hepatocellular carcinoma.^*0201⁺Includes patient selection. The patient is then administered dendritic cells pulsed with one or more peptides of the invention. Dendritic cells are administered in sufficient amounts, and preferably the administration is repeated multiple times to cause an immune response against AFP and thereby an immune response against hepatocellular carcinoma.
In a preferred embodiment, the dendritic cell is hAFP._137-145, Residues 137-145 of SEQ ID NO: 2; hAFP_158-166, Residues 158-166 of SEQ ID NO: 2; hAFP_325-334, Residues 325-334 of SEQ ID NO: 2; and hAFP_542-550The combination of residues 542-550 of SEQ ID NO: 2 is pulsed. In another preferred embodiment, the dendritic cells are administered 2-5 times. In a particularly preferred embodiment, dendritic cells are administered three times. In another preferred embodiment, dendritic cells are administered 3 times at 2 week intervals.
[0028]
In a preferred embodiment, dendritic cells are administered directly, but other routes of administration are suitable as will be understood by those skilled in the art with respect to this disclosure. In one embodiment, the dendritic cells are about 1 × 10⁵~ 1x10⁸Is administered at a dose of In another preferred embodiment, the dendritic cells are about 1 × 10⁶~ 1x10⁷Is administered at a dose of In a particularly preferred embodiment, the dendritic cells are about 5 × 10⁶Is administered at a dose of
Dendritic cells are adherent autologous peripheral blood mononuclear cells exposed to granulocyte macrophage colony stimulating factor (GM-CSF) and interleukin 4 (IL-4) for 1 week in tissue culture according to techniques known to those skilled in the art. Prepared from Mononuclear cells from cells obtained from a single leukapheresis by Ficoll-Hypaque are isolated and stored frozen in liquid nitrogen until used for generation of dendritic cells. Thawed mononuclear cells are washed once with physiological saline and 2-4 × 10⁷Cell / 25cm²Coster flask, 2.5-5 × 10⁶Increase the concentration of viable cells / ml (RPMI 1640 + 5% heat-inactivated autoserum + gentamicin). After attaching at 37 ° C. for 2 hours, the non-attached cells are removed by washing with physiological saline. Adherent cells are cultured in complete medium for 7 days in the presence of rhGM-CSF (800 U / ml) and rhIL-4 (500 U / ml). Clinical grade GM-CSF was provided by Immunex and IL-4 was provided by Schering-Plough.
[0029]
The patient is subjected to a single leukapheresis and at least 2 × 10⁹PBLs are obtained and cryopreserved in 70% RPMI 1640, 20% autologous serum and 10% DMSO. Aliquots are thawed on days -7, 7 and 21 of the study. Autoserum blood (60 ml) is taken to be sufficient for all cell cultures at the time of leukapheresis and on the day of the first immunization. The AFP-derived immunodominant peptides of the invention are prepared and purified by techniques known to those skilled in the art.
The patient is then immunized. On the day of immunization, dendritic cells are harvested and washed once with sterile saline solution and 10% in an appropriate concentration, eg, 1 mL serum-free RPMI 1640.⁶And resuspend at 50 mg / ml for each of the four immunodominant peptides. Pellet AFP peptide / DC after at least 1 hour of incubation and wash 3 times with sterile saline. Cells are counted in trypan blue and resuspended in 0.1 ml sterile saline for intradermal injection.
Prior to administration of the full volume, the subject may take a skin test in 1/100 aliquots in 0.1 ml saline. After a 30 minute observation period, the entire amount of dendritic cells pulsed with AFP peptide injected intradermally in 0.1 ml saline can be inoculated under or near or above the groin. Patients are monitored 2 hours after immunization. Preferably, the patient is pre-treated orally with both 50 mg diphenhydramine and 650 mg Tylenol.
[0030]
Example 3
Method for or for prevention of hepatocellular carcinoma by administration of human AFP adenovirus-introduced dendritic cells
One embodiment of the invention may provide a method for preventing or treating a patient having hepatocellular carcinoma. The method is suitable for suitable patients such as HLA-A with AFP positive hepatocellular carcinoma.^*0201⁺Includes patient selection. Next, human AFP adenovirus-introduced dendritic cells are administered to the patient. Dendritic cells are administered in sufficient amounts, and preferably the administration is repeated multiple times to cause an immune response against AFP and thereby an immune response against hepatocellular carcinoma.
In another preferred embodiment, the dendritic cells are administered 2-5 times. In a particularly preferred embodiment, dendritic cells are administered three times. In another preferred embodiment, dendritic cells are administered 3 times at 2 week intervals.
In a preferred embodiment, dendritic cells are administered directly under the armpit or near the groin, although other routes of administration are suitable as will be understood by those skilled in the art for this disclosure. In one embodiment, the dendritic cells are about 1 × 10⁵~ 1x10⁸Is administered at a dose of In another preferred embodiment, the dendritic cells are about 1 × 10⁶~ 1x10⁷Is administered at a dose of In a particularly preferred embodiment, the dendritic cells are about 5 × 10⁶Is administered at a dose of
[0031]
Mononuclear cells are isolated from a single leukocyte apheresis by Ficoll-Hypaque and stored with 10% DMSO / 20% autoserum. Cells were thawed one week prior to DC vaccination, washed once with PBS, 2-4 × 10⁷Cell / 25cm²Coster flask, 2.5-5 × 10⁶Rinse to a concentration of viable cells / ml (RPMI 1640 + 5% heat-inactivated autoserum). After 2 hours of attachment at 37 degrees, the non-attached cells are gently removed by washing with PBS. Adherent cells are cultured in complete medium for 7 days in the presence of rhGM-CSF (800 U / ml) and rhIL-4 (500 U / ml). Clinical grade GM-CSF and IL-4 are provided by Schering-Plough.
AdVhAFP is an E1-deficient non-propagating 5 adenovirus vector in which human AFP cDNA is controlled by a CMV enhancer / promoter. The virus titer for each final virus production lot is obtained based on both genomic DNA quantification and infectivity titer. When the production rate of virus particles and bioactive virus is less than 100: 1, it is determined that the condition is satisfied.
The patient is then immunized. On the day of immunization, dendritic cells are collected, washed once with sterile saline solution, and 10% in 1 mL of 2% autologous serum RPMI 1640.⁶-10⁷Concentration of 10 and⁹-10¹⁰Resuspend with pfu / ml AdVhAFP (Infectivity efficiency = 1000: 1). After 2 hours of incubation at 37 ° C., AdVhAFP / DC is resuspended in RPMI-1640 + 5% autologous serum to inactivate unabsorbed adenoviral vectors, then pelleted and washed three times with sterile saline. Cells are counted in trypan blue and the appropriate number (1 x 10 depending on patient group)⁵~ 1x10⁸Is resuspended in sterile saline for intradermal injection.
Patients are administered AdVhAFP-introduced DCs injected intradermally in 0.1 ml of normal saline near the groin or inguinal region. Patients are monitored 2 hours after immunization. Preferably, the patient is pre-treated orally with both 50 mg diphenhydramine and 650 mg Tylenol.
Although the present invention has been discussed in considerable detail with reference to certain preferred embodiments, other embodiments are possible. Accordingly, the scope of the appended claims should not be limited to the description of the preferred embodiments contained herein.
[Sequence Listing]

Claims (10)

αフェトプロテイン分子のアミノ酸配列の少なくとも一部に対する哺乳動物の免疫応答を引き起こすことにより、癌細胞が細胞表面でαフェトプロテイン分子の少なくとも一部を発現する哺乳動物の癌を予防又は治療するための医薬であって；該免疫応答が癌細胞に対するαフェトプロテインペプチド特異的Ｔリンパ球の活性化を含み；αフェトプロテイン分子の一部が、配列番号：２の残基１３７−１４５、配列番号：２の残基３２５−３３４及び前記の組み合わせからなる群から選択される医薬。A medicament for preventing or treating cancer in a mammal in which cancer cells express at least part of the alpha-fetoprotein molecule on the cell surface by causing an immune response of the mammal against at least part of the amino acid sequence of the alpha-fetoprotein molecule The immune response includes activation of α-fetoprotein peptide-specific T lymphocytes against cancer cells; a portion of the α-fetoprotein molecule is residues 137-145 of SEQ ID NO: 2, residues of SEQ ID NO: 2 A medicament selected from the group consisting of 325-334 and combinations thereof. αフェトプロテインペプチド特異的Ｔリンパ球が細胞障害性Ｔリンパ球である請求項１の医薬。The medicament according to claim 1, wherein the α-fetoprotein peptide-specific T lymphocyte is a cytotoxic T lymphocyte. αフェトプロテイン分子が配列番号：２である請求項１又は２の医薬。The medicament according to claim 1 or 2, wherein the α-fetoprotein molecule is SEQ ID NO: 2. 哺乳動物の癌の予防又は治療のための医薬であって、配列番号：２の残基１３７−１４５、及び配列番号：２の残基３２５−３３４及び前記の組み合わせからなる群から選択されるペプチドを、哺乳動物のαフェトプロテインに対する免疫応答を引き起こすのに十分な量で含む医薬。A medicament for the prevention or treatment of mammalian cancer, wherein the peptide is selected from the group consisting of residues 137-145 of SEQ ID NO: 2, residues 325-334 of SEQ ID NO: 2, and combinations thereof In an amount sufficient to cause an immune response to mammalian alpha-fetoprotein. 更にアジュバントを含む請求項４の医薬。The medicament according to claim 4, further comprising an adjuvant. 哺乳動物の癌の予防又は治療のための医薬であって、配列番号：２の残基１３７−１４５、及び配列番号：２の残基３２５−３３４からなる群から選択される一又は複数のペプチドをパルスした樹状細胞を含む医薬。One or more peptides selected from the group consisting of residues 137 to 145 of SEQ ID NO: 2 and residues 325 to 334 of SEQ ID NO: 2 for preventing or treating cancer in mammals A medicament containing dendritic cells pulsed. 哺乳動物の癌の予防又は治療のための医薬であって、配列番号：２の残基１３７−１４５、及び配列番号：２の残基３２５−３３４からなる群から選択されるαフェトプロテインの一部をコードする組み換えアデノウィルス性ベクターを導入した樹状細胞を含む医薬。A part of α-fetoprotein selected from the group consisting of residues 137-145 of SEQ ID NO: 2 and residues 325-334 of SEQ ID NO: 2 for preventing or treating cancer in mammals A medicament comprising a dendritic cell into which a recombinant adenoviral vector encoding the gene is introduced. 癌が肝細胞癌である請求項１ないし７の何れか１項に記載の医薬。The medicament according to any one of claims 1 to 7, wherein the cancer is hepatocellular carcinoma. 哺乳動物がヒトである請求項１ないし８の何れか１項に記載の医薬。The pharmaceutical according to any one of claims 1 to 8, wherein the mammal is a human. 配列番号：２の残基１３７−１４５、及び配列番号：２の残基３２５−３３４からなる群から選択される、癌の予防又は治療に利用される単離されたペプチド。An isolated peptide used for the prevention or treatment of cancer, selected from the group consisting of residues 137-145 of SEQ ID NO: 2 and residues 325-334 of SEQ ID NO: 2.