JP3870242B2 - Detection method, diagnostic agent and diagnostic kit for kidney disease - Google Patents

Description

技術分野
本発明は、腎疾患の検知法、診断薬及び診断用キットに関し、詳しくは、体液中のインテグリンβ₃を測定することにより腎疾患を検知する方法に関するものである。
背景技術
腎疾患の検査法として、尿沈渣、尿蛋白等により血液成分（赤血球、白血球などの細胞および血漿蛋白）の尿への漏出の検査を基に診断がなされてきた。また、尿中のβ₂-ミクログロブリン（microglobulin）とＮ−アセチルグルコサミニダーゼ（ＮＡＧ）の濃度は、尿細管の傷害の程度を示すとされている。
さらに、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）や膜性腎症においては、活性化された補体系が糸球体の上皮細胞に沈着し、糸球体を損傷すると考えられているので、尿中の補体成分の検出、あるいはその活性測定が参考とされてきた。活性化された補体系は、これを不活性化する血漿蛋白であるビトロネクチン（ＶＮ）と結合し、ＶＮ／Ｃｂ5-9複合体を形成して尿中に排出されることから、尿中のビトロネクチンを測定することも腎疾患の診断の１つの方法とされてきた。
また、ホモジナイズしたヒト正常腎組織を免疫原として作製した、尿細管内腔壁または糸球体および尿細管基底膜に特異的に反応するモノクローナル抗体を使用して、エンザイムイムノアッセイ（ＥＩＡ）用プレートに検体尿を加え、ついで該抗体を加えることで尿中の正常腎組織抗原を測定し、腎傷害を診断する方法が知られている（特開昭63-112994）。
ところで、インテグリンはαサブユニットとβサブユニットとが１対１で複合体を形成する細胞膜表面の接着分子であり、異なるαサブユニットとβサブユニットとの組み合わせから多種の分子が知られている。例えば、β₃サブユニットに対するαサブユニットとしては、α_vとα_IIbの２種類が知られている。α_IIbβ₃複合体は、血小板に存在する主要なインテグリンであることが知られ、α_vβ₃複合体はビトロネクチンの受容体であることが知られ、また免疫染色によって糸球体等の組織にα_vβ₃複合体が多く見られることが報告されている（Nephron, 68（1994）p.87-96）。なお、腎疾患患者の尿に血小板の排出や糸球体細胞など腎由来の細胞の排出がみられることは知られているが、腎疾患患者の体液、具体的には、尿にインテグリンβ₃が存在すること、および体液、具体的には、尿中のインテグリンβ₃と腎疾患との関連については検討されていない。
従来の、ビトロネクチンや補体成分のような血液成分の尿中での測定は、腎全体の傷害もしくは免疫反応の関与を示唆するものであるが、腎組織内の傷害部位を同定することは困難であった。また上記の正常腎組織抗原を測定する方法では、抗体を作製する際にヒト正常腎組織を使用するため、抗原の入手が極めて困難であること、およびＥＩＡ用プレートに固着される尿中の抗原量が一定でなく、測定結果が不正確である等の欠点を有していた。さらに従来知られる方法や臨床検査では、腎疾患を詳細に確定するには不十分で、糸球体損傷あるいは腎組織損傷の確定診断を行うには腎の生検を行う必要があり、患者に苦痛を与えるものであった。
発明の開示
本発明は、上記観点からなされたものであり、腎疾患、特に糸球体の傷害の有無あるいは腎組織損傷の程度を簡便に検知することができる方法、診断薬および診断キットを提供することを課題とする。
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究した結果、腎疾患患者の体液、具体的には尿、より具体的には尿沈渣中にインテグリンβ₃が存在することを発見し、このインテグリンβ₃を簡便かつ正確に測定する方法を見いだし、本発明に至った。
すなわち本発明は、
１）体液中、好ましくは尿中、より好ましくは尿沈渣中のインテグリンβ₃を測定することを特徴とする腎疾患の検知法、
２）インテグリンβ₃に対する抗体を含み、体液中、好ましくは尿中、より好ましくは尿沈渣中のインテグリンβ₃を測定して腎疾患を検知するための診断薬であることを特徴とする腎疾患診断薬、及び
３）インテグリンβ₃に対する抗体を固着させた固相体と、標識物質で標識された、又は標識されうる該抗体とを含む腎疾患診断用キット、
である。
前記腎疾患の検知法において、体液中のインテグリンβ₃の測定法としては、インテグリンβ₃に対する抗体（インテグリンβ₃と特異的に反応する抗体、以下、「抗インテグリンβ₃抗体」という）を用いた抗原抗体反応によって行う方法が挙げられる。
抗原抗体反応によってインテグリンβ₃を測定する具体的方法としては、例えば可溶化した尿沈渣を検体として電気泳動を行い、次いで電気泳動後の検体を膜に転写し、この膜に抗インテグリンβ₃抗体を加え、抗原抗体反応によってインテグリンβ₃を測定する方法や、可溶化した尿沈渣中のインテグリンβ₃と、抗インテグリンβ₃抗体とを反応させ、抗体−インテグリンβ₃−抗体の複合体の形成を検出することによりインテグリンβ₃を測定する方法等が挙げられるが、これに限定されるものではない。
本発明において腎疾患とは、腎炎や腎症（ネフローゼ）など、腎臓の糸球体等の傷害を伴う疾患をいう。このような腎疾患としては、免疫複合体などの結合や沈着によるものなど種々の原因による疾患が知られているが、具体的には、例えば全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、ＩｇＡ腎症、糖尿病性腎症、膜性腎症、高血圧性腎硬化症、膜性増殖性腎炎、急性糸球体腎炎、単状糸球体硬化症、紫斑病性腎炎などが挙げられる。
なお本発明におけるインテグリンβ₃という用語には、インテグリンのうちβサブユニットとしてβ₃サブユニットを有する分子（α_vβ₃複合体、α_IIbβ₃複合体等）、β₃サブユニット自体、およびこれらの断片等を包含する。インテグリンβ₃は、腎疾患患者の尿中に排出されるが、尿蛋白の如く可溶性の形態で尿中に存在するのではなく、尿中に排出される糸球体や腎由来の細胞または細胞断片等に結合した形態で存在するものと考えられる。すなわち、腎臓の糸球体等の傷害により尿中に排出されるインテグリンβ₃を、腎臓組織の傷害マーカーとして測定することにより、腎疾患を検知することができる。この腎疾患の検知には、腎疾患の有無や程度の判定の他、治療効果の評価等、予後の判定も含まれる。
本発明に使用される抗インテグリンβ₃抗体としては、β₃サブユニット、β₃サブユニットを含むインテグリン分子（α_vβ₃複合体やα_IIbβ₃複合体等）またはこれらの断片などを認識する抗体等を挙げることができる。
なお、α_vβ₃複合体（糸球体由来）のβ₃サブユニットとα_IIbβ₃複合体（血小板由来）のβ₃サブユニットとを区別して測定したい場合は次の通り行えばよい。すなわちα_IIbβ₃複合体（血小板由来）のα_IIbサブユニットに特異的に反応するモノクローナル抗体を用いた抗原抗体反応によってα_IIbサブユニット量を測定し、血小板由来のβ₃サブユニット量を求める。次いで全β₃サブユニット量から血小板由来のβ₃サブユニット量を差し引くことで、糸球体由来のインテグリンβ₃量を求めることができる。
また、同様にα_vβ₃複合体を認識する抗体を用いて糸球体由来のインテグリンβ₃量を測定し、次いで全β₃サブユニット量から糸球体由来のインテグリンβ₃量を差し引くことで、血小板由来のインテグリンβ₃量を求めることができる。
以下に、本発明を詳細に説明する。
本発明の腎疾患の検知法は、体液、好ましくは尿、より好ましくは尿沈渣または可溶化した尿沈渣（以下、特に指定しないかぎり両者を合わせて「尿沈渣」という）を検体とし、検体中のインテグリンβ₃を測定することにより行われる。尿沈渣中のインテグリンβ₃を測定する方法としては、抗インテグリンβ₃抗体を用いた抗原抗体反応によって行う方法が挙げられる。
本発明に用いる抗インテグリンβ₃抗体としては、未変性もしくは可溶化によって変性したβ₃サブユニット、α_vβ₃複合体またはα_iibβ₃複合体と反応性が高い抗体が好ましい。抗インテグリンβ₃抗体として、例えば市販のウエスタンブロッティング用の抗インテグリンβ₃抗体、例えばAnti-Human Integrin β₃（クローン番号VNR3、VNR5、宝酒造（株）製）等を用いることができるが、本発明者らの作製したモノクローナル抗体（２Ｊ４０抗体、実施例参照）は、未変性のβ₃サブユニットにも、またドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）で変性されたβ₃サブユニットにも反応性が高いので特に好ましい。２Ｊ４０抗体を産生するハイブリドーマ株RINSHOKEN-2J40は、平成７年８月２９日に通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（郵便番号３０５ 日本国茨城県つくば市東一丁目１番３号）にＦＥＲＭ Ｐ−１５１３９の受託番号で寄託され、平成８年８月７日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管されて、ＦＥＲＭ ＢＰ−５６１９の受託番号で寄託されている。
また、抗インテグリンβ₃抗体は、常法に従って例えば以下のように作製することも可能である。
抗原として用いる精製されたβ₃サブユニットは、公知の方法で得ることができる。例えば、正常ヒト血小板を可溶化して、これをArg-Gly-Aspのアミノ酸配列を有するペプチドまたはGly-Arg-Gly-Asp-Ser-Pro-Lys（配列番号１）のアミノ酸配列を有するペプチド等をリガンドとするアフィニティー クロマトグラフィーによりα_IIbβ₃複合体を精製し、ついでＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行って、β₃サブユニットを分離精製する方法等が挙げられる。
ポリクローナル抗インテグリンβ₃抗体は、例えばマウス、ラット、モルモット、ウサギ、ヤギ、ヒツジ等の被免疫動物を上記の抗原で免疫し、これらの動物から血清を採取することによって得ることができる。被免疫動物を免疫する際に、補助剤（アジュバント）を併用することは抗体産生細胞を賦活するので望ましい。得られた抗血清から、常法によってイムノグロブリン分画を精製してもよい。
モノクローナル抗インテグリンβ₃抗体は、例えば次のようにして得られる。すなわち、上記抗原をマウス、ラット、モルモット、ウサギ、ヤギ、ヒツジ等の被免疫動物の腹腔内、皮下あるいは足蹠（footpad）に投与した後に脾臓又は膝窩リンパ節を摘出し、これから採取した細胞と腫瘍細胞株であるミエローマ細胞とを細胞融合させてハイブリドーマを樹立し、得られたハイブリドーマを連続増殖させ、さらに得られたハイブリドーマから上記抗原に対する特異抗体を継続的に産生する細胞株を選別する。こうして選別された株を好適な培地で培養することによって、培地中にモノクローナル抗インテグリンβ₃抗体が得られる。あるいは、マウスの腹腔などの生体内にて前記ハイブリドーマを培養することによって、モノクローナル抗インテグリンβ₃抗体を大量に製造することができる。
細胞融合に用いる細胞としては、脾細胞以外にリンパ節細胞および末梢血中のリンパ細胞等を用いることができる。また、ミエローマ細胞株は、異種細胞種由来のものに比べ同種細胞株由来のものが望ましく、安定な抗体産生ハイブリドーマを得ることができる。
得られたポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体の精製法としては、硫酸ナトリウム、硫酸アンモニウム等による塩析、低温アルコール沈澱およびポリエチレングリコールまたは等電点による選択的沈澱分別法、電気泳動法、ＤＥＡＥ（ジエチルアミノエチル）−誘導体、ＣＭ（カルボキシメチル）−誘導体等のイオン交換体を用いたイオン交換クロマトグラフィー、プロテインＡまたはプロテインＧを用いたアフィニティークロマトグラフィー、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー、抗原を固定化した免疫吸着クロマトグラフィー、ゲルろ過法および超遠心法等を挙げることができる。
なお、抗インテグリンβ₃抗体は、そのまま使用することもできるが、フラグメント化したものを使用することもできる。抗体のフラグメント化の際、抗体の抗原結合部位（Ｆａｂ）が保存されていることが抗原と抗体との結合に必須であるので、抗原結合部位を分解しないプロテアーゼ（例えばプラスミン、ペプシン、パパイン等）で抗体を処理して得られるＦａｂを含むフラグメントを使用することもできる。また、抗インテグリンβ₃抗体をコードする遺伝子の塩基配列もしくは抗体のアミノ酸配列が決定されれば、遺伝子工学的にＦａｂを含むフラグメントやキメラ抗体（例えば抗インテグリンβ₃抗体のＦａｂ部分を含むキメラ抗体等）を作製することができ、このようなフラグメントやキメラ抗体も本発明において用いることができる。
なお、これら抗インテグリンβ₃抗体のＦａｂ部分を含むフラグメントやキメラ抗体も、本発明における「抗インテグリンβ₃抗体」という用語に包含される。
上記のような抗インテグリンβ₃抗体を用いた抗原抗体反応の形態は特に制限されず、通常のイムノアッセイ（免疫測定法）に用いられる測定系は種類に関わらず本発明に適用できる。測定系として具体的には、イムノブロッティング法（例えば、ウエスタンブロッティング法等）、標識化免疫測定法（例えば、ＥＩＡ法、酵素結合イムノソルベントアッセイ法（ＥＬＩＳＡ法）、ラジオイムノアッセイ法、蛍光イムノアッセイ法等）、フローサイトメトリーによる方法などが挙げられる。これらの測定法は、公知の方法［入江 實編、「続ラジオイムノアッセイ」、（株）講談社、１９７９年５月１日発行、石川栄治ら編、「酵素免疫測定法」、第２版、（株）医学書院、１９８２年１２月１５日発行、Method in Enzymology, Vol.92（1983）, Immunochemical Techniques, Part E: Monoclonal Antibodies and General Immunoassay Methods,アカデミックプレス社発行 参照］に準じて実施することができる。
イムノブロッティング法、例えばウエスタンブロティング法は、体液、好ましくは尿、より好ましくは可溶化した尿沈渣を検体として電気泳動を行い、次いで電気泳動後の検体を膜に転写し、この膜に抗インテグリンβ₃抗体を加え、抗原抗体反応によってインテグリンβ₃を測定することによって行うことができる。電気泳動は、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により行うことが好ましい。ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動の条件および膜への転写の条件は、公知のウエスタンブロッティング法に用いられる条件に準じて当業者が適宜決定することができる。例えば、膜としてはポリビニリデンジフルオリド（polyvinylidene difluoride：ＰＶＤＦ）膜、ニトロセルロース膜あるいはナイロン膜等が挙げられる。ウエスタンブロッティング法における抗原抗体反応の測定は、抗インテグリンβ₃抗体を予め標識物質で標識しておき、膜とこの標識抗体をインキュベートし、膜上のインテグリンβ₃に結合した標識抗体の標識物質を、該標識物質に適した方法で検出することによって行うことができる。また、未標識の抗インテグリンβ₃抗体を膜とインキュベートし、インテグリンβ₃と抗インテグリンβ₃抗体の結合体を形成させた後に、抗インテグリンβ₃抗体の調製に用いた被免疫動物のイムノグロブリンに対する抗体（二次抗体）を標識物質で標識した標識化二次抗体を前記結合体に結合させ、結合体に結合した二次抗体中の標識物質を検出することによっても、抗原抗体反応を測定することができる。抗インテグリンβ₃抗体としては、変性剤（例えばＳＤＳ等）で変性されたβ₃サブユニットに対して反応性が高い抗体が好ましい。
標識化免疫測定法、例えばサンドイッチＥＩＡ法は、体液、好ましくは泥、より好ましくは可溶化した尿沈渣中のインテグリンβ₃と、抗インテグリンβ₃抗体とを反応させ、サンドイッチ状複合体、すなわち抗インテグリンβ₃抗体−インテグリンβ₃−抗インテグリンβ₃抗体の複合体の形成を検出することにより行うことができる。この複合体の形成は、複合体を形成する抗体の一方に標識抗体を用い、他方に固相体に結合もしくは結合しうる抗体を用いて、複合体中の標識物質を該標識物質に適した方法で検出することにより、検出することができる。また、複合体を形成させた後に、標識化二次抗体を複合体に結合させ、複合体に結合した標識化二次抗体の標識物質を測定することによっても、複合体の形成を検出することができる。さらに具体的にサンドイッチＥＩＡ法としては、例えば次のような方法が挙げられるが、これに限定されない。
（１）インテグリンβ₃を含む可溶化した尿沈渣、標識された抗インテグリンβ₃抗体、および固相体に結合しているかあるいは結合しうる抗インテグリンβ₃抗体を同時に混合して反応させて、インテグリンβ₃を該抗体と標識された該抗体とで挟んだサンドイッチ状複合体を形成させるか、
（２）インテグリンβ₃を含む可溶化した尿沈渣と標識された抗インテグリンβ₃抗体とを混合し、インテグリンβ₃と標識された該抗体との結合体を形成させた後、この結合体と、抗インテグリンβ₃抗体を固着した固相体とを混合して、該結合体のインテグリンβ₃をさらに該固相体に固着した該抗体に結合させて、インテグリンβ₃を、固相体に固着した該抗体と標識された該抗体とで挟んだサンドイッチ状複合体を形成させるか、または
（３）固相体に固着された抗インテグリンβ₃抗体と、インテグリンβ₃を含む可溶化した尿沈渣とを混合して、該抗体とインテグリンβ₃とを結合させ、必要に応じて固相を洗浄し、さらに予め標識物質で標識された抗インテグリンβ₃抗体と混合して、インテグリンβ₃を、該抗体と標識された該抗体とで挟み、サンドイッチ状複合体を形成させるかした後、
固相に結合したサンドイッチ状複合体と結合しなかった該標識された抗インテグリンβ₃抗体とを分離し、固相と液相のいずれかの相の標識物質を該標識物質に応じた方法（例えば酵素の場合、酵素反応による基質の変化を測定する等）で測定する方法を挙げることができる。
サンドイッチ法において抗インテグリンβ₃抗体としてモノクローナル抗体を用いる場合には、エピトープの異なる２種類のモノクローナル抗体を用いるか、あるいはサンドイッチ状複合体を形成する抗体の一方にポリクローナル抗体を用いることが好ましい。
固相体としては、マイクロタイタープレート（イムノプレート）のウェル、ポリスチレンなどのボール、ラテックス粒子、試験管壁、金属コロイドなどが挙げられる。これらの固相体に抗体を固着する方法としては、物理的吸着法、共有結合法等が挙げられ、さらには包括法など固定化酵素の調製法として一般的な方法（固定化酵素、１９７５年、講談社発行、第９〜７５頁参照）を応用することもできる。特に物理的吸着法は簡便であり、また抗体を固相体に固着する方法として広く用いられていることから好ましい。なお、抗体が結合していない部分は、血清アルブミン、ゼラチン、乳タンパクなどによってブロッキングしてもよい。
また、上記のサンドイッチ状複合体を固相に固着させた後、固相と液相とを分離し、液相の標識物質を測定することによっても検体試料中のインテグリンβ₃を測定することができる。
また、標識物質で標識化したインテグリンβ₃を、検体試料とともに固相に固着した抗インテグリンβ₃抗体と混合し、固相化抗体に結合した標識物質の量を測定する、いわゆる競合法によっても、検体試料中のインテグリンβ₃を測定することができる。
本発明の腎疾患の検知法においては、抗原抗体反応は上記のような固相法に限らず、固相化抗体を使用しない、いわゆる液相法で行ってもよい。すなわち、抗インテグリンβ₃抗体と検体試料を混合し、さらに標識化二次抗体を加えてインテグリンβ₃−抗インテグリンβ₃抗体−標識化二次抗体の複合体を沈殿させ、沈殿に含まれる標識を検出する方法である。
抗体の標識に用いる標識物質としては、酵素（ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼなど）、放射性同位元素（¹²⁵Ｉ、¹³¹Ｉ、³Ｈなど）、蛍光物質（フルオレセインイソチオシアネート、ウンベリフェロン、７−アミノ−４−メチルクマリン−３−酢酸など）、化学発光物質（ルミノールなど）、または他の物質（ビオチン、アビジンなど）等が挙げられる。尚、固相体として金属コロイド等を用いた場合は、標識は必ずしも必要ではない。
抗体の標識方法は、標識物質に適した公知の方法、例えば、酵素を標識する際にはグルタルアルデヒド法、過ヨウ素酸架橋法、マレイミド架橋法、カルボジイミド法など、放射性同位元素で標識する際にはクロラミンＴ法、ラクトペルオキシダーゼ法など（続生化学実験講座５ 免疫生化学研究法、東京化学同人、１９８６年発行参照）から適宜選択できる。
さらに、本発明の別の測定法として、可溶化していない尿沈渣に緩衝液（例えばリン酸緩衝生理食塩液（ＰＢＳ））等を加え浮遊液を調製し、抗インテグリンβ₃抗体あるいは標識された該抗体を用いてフローサイトメトリーにより尿中のインテグリンβ₃を測定する方法を挙げることができる。
一方、検体試料として尿沈渣を用いる場合、尿沈渣は、尿中に含まれる不溶物であれば特に限定されず、例えば尿中の不溶性蛋白、細胞、細胞断片等を遠心分離または限外濾過膜等によって濃縮したものが挙げられる。濃縮法としては、遠心分離が簡便であるので好ましい。遠心分離の条件としては、例えば４００×ｇ以上で５分間以上遠心する条件が例示される。
ウエスタンブロッティング法においては、通常、電気泳動に先だって、尿沈渣に界面活性剤、塩酸グアニジン、尿素等の蛋白の変性を起こす変性剤（可溶化剤）を加えて可溶化する。変性剤（可溶化剤）としては、好ましくは界面活性剤であり、さらに好ましくはイオン性界面活性剤である。イオン性界面活性剤のうちドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）等のアルキル硫酸塩を使用する場合、その濃度としては尿沈渣に対して０．１〜５％程度が例示される。
また、標識化免疫測定法においても、尿沈渣に界面活性剤等を加えて可溶化したものが検体試料として通常用いられる。界面活性剤の種類や濃度は、抗原抗体反応に影響を与えない範囲で適宜選択することができる。界面活性剤としては、例えばポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル類（Triton系界面活性剤）（トライトン（Triton）Ｘ−１００等）、ポリオキシエチレンソルビタンアルキルエステル類（Tween系界面活性剤）などの非イオン性界面活性剤等が例示される。
体液、好ましくは尿、より好ましくは尿沈渣中のインテグリンβ₃量の定量は、既知量のインテグリンβ₃を標準物質として用い、標準物質濃度と検出される標識量との関係について検量線を作成しておき、この検量線と比較することにより行うことができる。また、競合法においては、抗原抗体反応系に一定量の標準物質とともに既知量の未標識インテグリンβ₃を加え、標準物質濃度と検出される標識量との関係について検量線を作成しておけばよい。
上記のようにして、抗インテグリンβ₃抗体を用いて体液中のインテグリンβ₃を測定することにより、腎疾患の検知を行うことができる。すなわち、抗インテグリンβ₃抗体は、腎疾患の診断薬として用いることができる。また、抗インテグリンβ₃抗体の他に、固相体、標識抗体、必要に応じて標識化二次抗体、標識物質を検知するための試薬、緩衝液、標識物質、インテグリンβ₃標準物質、抗原抗体反応に影響を与えない可溶化剤（変性剤）などを加えて診断用キットとしてもよい。固相体は、予め抗インテグリンβ₃抗体を固着させておいてもよく、かつ好ましい。このようなキットを用いると、インテグリンβ₃の測定を簡便に行うことができる。
【図面の簡単な説明】
図１は、調製例に記載の方法で製造した抗インテグリンβ₃抗体をコーティングしたイムノプレートを用いて、各種濃度のインテグリンβ₃標準液を測定した時の標準曲線を示す図である。
発明を実施するための最良の形態
以下に実施例を挙げるが、本発明は何等これに限定されるものではない。
調製例 抗インテグリンβ ₃ 抗体の作製
モノクローナル抗インテグリンβ₃抗体の作製を、Koehler.G.らの方法（Nature, 256（1975）p.495）に準じて行った。
使用可能期限をすぎた濃縮ヒト血小板浮遊液から白血球成分を除き、血小板をＨＥＰＥＳ−タイロード緩衝液（HEPES-Tyrode buffer）で洗浄後、２ｍＭ Ｃａ²⁺、Ｍｇ²⁺を含む５０ｍＭ β−オクチルグルコシドで可溶化した。超遠心後、２ｍＭ Ｍｎ²⁺を添加し、はじめにセファロース（Sepharose）４Ｂカラム（ファルマシア社製）でゲルろ過後、続いてアフィニティークロマトグラフィーを行なった。アフィニティーカラムには、Gly-Arg-Gly-Asp-Ser-Pro-Lys（配列番号１）ペプチドをリガンドとし、このペプチドを常法によって結合させたＣＮＢｒ活性化セファロース（CNBr activated Sepharose（ファルマシア社製））を充填したカラムを用いた。
３０ｍＭ β−オクチルグルコシドと０．５Ｍ ＮａＣｌを含む溶液で十分洗浄後、１ｍＭ Gly-Arg-Gly-Asp-Ser-Pro（配列番号２）ペプチドでα_IIbβ₃複合体画分を溶出した。さらにこのα_IIbβ₃複合体画分を、セファデックス（Sephadex）Ｇ−５０カラム（ファルマシア社製）でゲルろ過し、Gly-Arg-Gly-Asp-Ser-Pro（配列番号２）ペプチドとＭｎ²⁺を除き、精製されたα_IIbβ₃複合体を得た。なお、この複合体はＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動後の銀染色で２本のバンドとして確認された。
得られたα_IIbβ₃複合体をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動で、α_IIbサブユニットとβ₃サブユニットとに分離分画し、β₃サブユニットを単離した。
このβ₃サブユニットを精製抗原として、アジュバントと処理した後、ＢＡＬＢ／ｃマウスの両後肢の足蹠に、１足当たり１００μｌを４〜５日ごとに免疫した。免疫開始３週間後、精製抗原のみを同じ部位に注射し、その３日後に膝窩リンパ節より、リンパ球を調製し、以下常法に従って、ＰＡＩ細胞（ジャパニーズ・キャンサー・リサーチ・リソース・バンクの登録番号：ＪＣＲＢ−０１１３）とポリエチレングリコールを用いて融合し、ＨＡＴ培地（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジンを含む培地）で選択後、増殖したハイブリドーマの上清を用いてスクリーニングを行った。
ヒト血小板、およびＣ３２メラノーマ細胞（大日本製薬（株）販売；α_vβ₃を発現してα_IIbβ₃は発現していない細胞株）の浮遊液にそれぞれ最終濃度２％ＳＤＳを加えて可溶化したものを抗原するイムノブロット法によって、得られたハイブリドーマの中から、該抗原に反応性の高い抗体を産生するハイブリドーマ株を選択した。このハイブリドーマ株 RINSHOKEN-2J40は、平成７年８月２９日に通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（郵便番号３０５ 日本国茨城県つくば市東一丁目１番３号）にＦＥＲＭ Ｐ−１５１３９の受託番号で寄託され、平成８年８月７日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管されて、ＦＥＲＭ ＢＰ−５６１９の受託番号で寄託されている。この株が産生するモノクローナル抗インテグリンβ₃抗体を２Ｊ４０抗体と命名した。このハイブリドーマ株の培養液から常法に従ってモノクローナル抗体を精製した。該抗体は、変性していないβ₃サブユニットよりもＳＤＳで変性されたβ₃サブユニットに対して反応が高かった。
実施例１
健常者および腎疾患患者の随時尿１０ｍｌをそれぞれ４００×ｇ（１，５００回転／分、ＫＵＢＯＴＡ製遠心機 ＫＮ−７０）で、５分間遠心し、上澄を除いた。５００μｌのリン酸緩衝生理食塩液（ＰＢＳ）を加えて懸濁し、１５，０００×ｇ（１５，０００回転／分、トミー精工（株）製遠心機 ＭＲＸ−１５０）で、１５分間遠心し、上澄を除去した。沈渣に４％ＳＤＳを含む可溶化溶液（トリス１．３９３ｇ、２０％ ＳＤＳ ２０ｍｌ、グリセロール２０ｍｌ、ＥＤＴＡ ０．０７４ｇを水に溶解し、１００ｍｌとした後、塩酸でｐＨ６．８に調整し、ブロモフェノールブルーを加えた溶液：以下、「可溶化溶液」と略す）４００μｌを加えて溶解（可溶化）し１００℃で５分間加熱した。得られた尿沈渣試料は測定まで−２０℃で保存し、測定時に溶解して使用した。
１レーン当たり尿沈渣試料２０μｌづつをのせ、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行った。電気泳動は、Ｒｅｓｅｐ Ｇｅｌ（５−２０％グラジエント）（和科盛（株）製）を用い、３０ｍＡで約１時間、ブロモフェノールブルーがゲルの先端に達するまで行った。ついで、イモビロン^TM（ＰＶＤＦ膜、ミリポア社製）を用いて、常法に従って泳動後のゲルからタンパク質を転写した。転写後の該膜にモノクローナル抗体２Ｊ４０(１：４００希釈）を加え、室温にて１時間インキュベートした。ＰＢＳ−０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０で５分間、２回ついで１０分間、２回洗浄をおこなった。
この膜に、ＨＲＰ（ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ）標識抗マウス抗体（１：２００希釈）を加え、室温で４５分間インキュベートし、次いで上記と同じ洗浄を行った。ＥＣＬ^TM試薬（アマシャム社製）を加え、２分間インキュベートした後、Ｘ線フィルム（アマシャム社製）に２分間暴露した。デンシトメータで染色された部分の黒化度を測定した。
可溶化溶液で可溶化した洗浄された血小板１０³個を試料としたときのインテグリンβ₃量を、尿沈渣のインテグリンβ₃の１ユニットとした。既知量の、可溶化した洗浄された血小板を用いて、デンシトメータで測定される黒化度とインテグリンβ₃量との関係について調べ、０．４〜６３．０ユニットの範囲で直線に回帰された検量線を作成した。なお、インテグリンβ₃量は、尿中のクレアチニン量で補正して算出した。
上記の健常者および腎疾患患者は、健常者２３例と各種腎疾患患者４８例であり、疾患の内訳は全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）１９例（活動性（急性）６例、非活動性（慢性）１３例）、ＩｇＡ腎症１０例、糖尿病性腎症（ＤＭ）６例、微小変化腎症６例、膜性腎症（ＭＮ）４例、膜性増殖性腎炎（ＭＰＧＮ）１例、高血圧性腎硬化症（ＨＴＮ）２例であった。健常者は男性１３例、女性１０例で年齢は２２歳〜５９歳であった。また、各種腎疾患患者は、男性２０例、女性２８例で、年齢は２３〜６８歳であった。
結果を表１に示す。

測定の結果、インテグリンβ₃と、尿蛋白、血尿の程度、尿中β₂−ミクログロブリン、Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ（ＮＡＧ）との相関は認められなかった。
また本測定により、インテグリンβ₃は健常者では尿中にはほとんど排出されないことがわかった。さらにインテグリンβ₃の定量的な測定の結果では、その排出量は腎臓疾患の種類によって変動し、かつまた同一腎臓疾患群においてもその活動性によって変動が見られた。すなわち、ＳＬＥにおいて非活動性ＳＬＥに比べ活動性ＳＬＥのほうが尿中インテグリンβ₃量が極めて多かった。また組織病理的に糸球体の傷害を認めなかった微小変化腎症では、尿沈渣由来のインテグリンβ₃は検出されなかった。
以上のように、尿中インテグリンβ₃を測定することによって、糸球体の傷害の有無およびその程度を含めて腎疾患の検出ならびにその予後を簡便に判定することが可能である。
実施例２
活動性ＳＬＥ患者の２４時間畜尿１，０００ｍｌを４００×ｇで５分間遠心し上澄を除いた。沈澱をＰＢＳ ２０ｍｌで２回洗浄し、ＰＢＳ ３ｍｌを加えて浮遊液を調製した。これに２Ｊ４０抗体、ＬＭ６０９抗体（α_vβ₃複合体に対するモノクローナル抗体、ケミコン（CHEMICON）社製、商品番号［ＭＡＢ１９７６］）、比較例としてＰ２抗体（α_IIbβ₃複合体に対するモノクローナル抗体、コスモバイオ社製）を各々加え、さらにＦＩＴＣ標識二次抗体を加え、以下常法にしたがってＦＡＣＳｃａｎ（BECTON DICKINSON社製）を用いてフローサイトメトリーを行った。この結果、２Ｊ４０抗体およびＬＭ６０９抗体に対しては尿沈渣の細胞等は陽性に染色され、インテグリンβ₃が検出されたが、Ｐ２抗体には陰性であり、血小板由来のα_IIbβ₃複合体は検出されなかった。
実施例３
調製例に記載された方法で作製した抗インテグリンβ₃抗体（２Ｊ４０抗体）をリン酸緩衝生理食塩水（pH7.2〜7.5、二価イオン不含）（以下、ＰＢＳ（−）と略す）で20mg/mlに希釈し、この溶液の50μｌ（1μg／ウエル）ずつをイムノプレート（商品名マキシソープ、ヌンク社製）の各ウエルに加え、４℃で１６時間保存することにより、均一にコーティングした。
次いで、このプレートをＰＢＳ（−）で２回洗浄し、ウエルの抗インテグリンβ₃抗体が被覆されていない部分を被覆するために、ブロッキング物質として３％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（生化学工業株式会社販売）を含むＰＢＳ（−）溶液を加え、室温で２時間静置した。
次いで、このプレートを洗浄液（0.05％トゥイーン20を含むＰＢＳ（−））で３回洗浄し、抗インテグリンβ₃抗体が固着されたイムノプレートを作製した。
抗インテグリンβ₃抗体が固着されたイムノプレートに、各濃度のインテグリンβ₃標準液（0.4、0.8、1.6、3.2、6.25、12.5、25、50および100ng/ml）をそれぞれ50μlずつ添加し、３７℃で１時間静置して反応させた。なお、インテグリンβ₃標準液の溶媒としては、１％ＢＳＡを含むＰＢＳ（−）（以下、「反応希釈液」という）を用いた。
この後、このプレートを前記洗浄液にて３回洗浄し、１ウエルあたり、0.7μg/mlのビオチン標識抗インテグリンβ₃抗体25μl及び5000倍希釈したペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジン（生化学工業株式会社販売）25μlを添加し、３７℃で１時間静置して反応させた。更に、このプレートを前記洗浄液で３回洗浄し、ペルオキシダーゼの基質としてテトラメチルベンジジン溶液（モス社製、以下ＴＭＢと略す）を50μl加え、３７℃で１５分間反応させ、発色させた。
発色後、プレートに１ＭのＨＣｌを50μl加えて反応を停止させ、ＴＭＢの分解による着色液の波長４５０ｎｍの吸光度（対照波長６３０ｎｍ）をウェルリーダー（生化学工業株式会社販売）にて測定した。得られた結果を図１に示す。
この結果から、抗インテグリンβ₃抗体を固着させた固相体（ここではマイクロタイタープレートを用いているが、これに限定されるものではない）を用いたELISA法によっても尿中のインテグリンβ₃の定量が可能であることが示唆された。またこの結果から、ELISA法による尿中のインテグリンβ₃定量時の検量線の作成が可能であることが示された。
同様の方法で、体液、好ましくは尿、より好ましくは尿沈渣、極めて好ましくは可溶化剤（例えば、Ｔｒｉｔｏｎ系やＴｗｅｅｎ系界面活性剤）により可溶化した尿沈渣中のインテグリンβ₃を測定することにより、腎疾患の検知をすることができる。
産業上の利用性
本発明の診断薬、診断キットおよび測定法によれば、腎疾患、特に糸球体の傷害の有無および程度を簡便に検出することができる。
配列表
(1)一般情報
(i)出願人：
(ii)発明の名称：
(iii)配列数：
(iv)連絡先：
(A)宛名：
(B)番地：
(C)市 ：
(D)州 ：
(E)国 ：
(F)ZIP：
(v)コンピュータ読取り可能形式
(A)媒体：フロッピーディスク
(B)コンピュータ：IBM PC 互換
(C)操作システム：PC-DOS/MS-DOS
(D)ソフトウェア：FastSEQ Version 1.5
(vi)現行出現データ
(A)出願番号
(B)出願日
(C)分類
(viii)代理人／事務所情報
(A)名前：
(B)登録番号：
(C)整理番号：
(ix)通信情報
(A)電話番号：
(B)ファクシミリ番号：
(2)配列番号１の配列の情報:
(i)配列の性質:
(A)配列の長さ:７ amino acids
(B)配列の型:アミノ酸
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:ペプチド
(xi)配列: SEQ ID No:1:

(2)配列番号２の配列の情報:
(i)配列の性質:
(A)配列の長さ:６ amino acids
(B)配列の型:アミノ酸
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:ペプチド
(xi)配列: SEQ ID No:2:

Technical field
The present invention relates to a method for detecting a renal disease, a diagnostic agent, and a diagnostic kit, and more particularly to integrin β in a body fluid._ThreeThe present invention relates to a method for detecting a renal disease by measuring.
Background art
Diagnosis of renal diseases has been made based on examination of leakage of blood components (cells such as red blood cells and white blood cells and plasma proteins) into the urine due to urine sediment, urine protein, and the like. In addition, β in urine₂-The concentrations of microglobulin and N-acetylglucosaminidase (NAG) are said to indicate the extent of tubular injury.
Furthermore, in systemic lupus erythematosus (SLE) and membranous nephropathy, it is thought that the activated complement system is deposited on the glomerular epithelial cells and damages the glomeruli. Detection or measurement of its activity has been a reference. The activated complement system binds to vitronectin (VN), which is a plasma protein that inactivates the complement system, forms a VN / Cb5-9 complex, and is excreted in the urine. It has also been considered as one method of diagnosing kidney disease.
In addition, using monoclonal antibodies that react specifically with the lumen wall of the tubule or glomeruli and the tubule basement membrane prepared using homogenized human normal kidney tissue as an immunogen, the specimen is placed on an enzyme immunoassay (EIA) plate. A method of diagnosing renal injury by measuring normal kidney tissue antigen in urine by adding urine and then adding the antibody is known (Japanese Patent Laid-Open No. 63-112994).
By the way, integrin is an adhesion molecule on the cell membrane surface in which α subunit and β subunit form a one-to-one complex, and various molecules are known from combinations of different α subunits and β subunits. . For example, β_ThreeAs α subunit for subunit, α_vAnd α_IIbTwo types are known. α_IIbβ_ThreeThe complex is known to be the major integrin present in platelets_vβ_ThreeThe complex is known to be a receptor for vitronectin._vβ_ThreeMany complexes have been reported (Nephron, 68 (1994) p. 87-96). Although it is known that platelets and kidney-derived cells such as glomerular cells are discharged in the urine of patients with kidney disease, integrin β_ThreeAnd the presence of integrin β in body fluids, specifically urine_ThreeThe relationship between kidney disease and kidney disease has not been studied.
Conventional measurement of blood components such as vitronectin and complement components in urine suggests damage to the entire kidney or involvement of an immune response, but it is difficult to identify the site of injury in kidney tissue Met. Further, in the above method for measuring normal kidney tissue antigen, human normal kidney tissue is used when producing the antibody, so that it is very difficult to obtain the antigen, and the urinary antigen fixed to the EIA plate The amount was not constant and the measurement results were inaccurate. Furthermore, conventional methods and clinical tests are not sufficient to determine kidney disease in detail, and renal biopsy is necessary to make a definitive diagnosis of glomerular or renal tissue damage, which can be painful for patients. It was something that gave.
Disclosure of the invention
The present invention has been made from the above viewpoint, and it is an object of the present invention to provide a method, a diagnostic agent, and a diagnostic kit that can easily detect renal disease, particularly the presence or absence of glomerular injury or the degree of renal tissue damage. And
As a result of intensive studies to solve the above problems, the present inventors have found that integrin β is contained in body fluids of kidney disease patients, specifically urine, more specifically urine sediment._ThreeThis integrin β was found to exist_ThreeThe present inventors have found a method for measuring the pH simply and accurately, and have reached the present invention.
That is, the present invention
1) Integrin β in body fluid, preferably urine, more preferably urine sediment_ThreeA method for detecting kidney disease, characterized by measuring
2) Integrin β_ThreeIntegrin β in body fluid, preferably in urine, more preferably in urine sediment_ThreeA diagnostic agent for renal disease, characterized by being a diagnostic agent for detecting renal disease by measuring
3) Integrin β_ThreeA kit for diagnosing renal disease, comprising a solid phase body to which an antibody against the antibody is fixed, and the antibody labeled with or capable of being labeled with a labeling substance,
It is.
In the method for detecting kidney disease, integrin β in body fluid_ThreeAs a method for measuring integrin β_ThreeAntibody against integrin β_ThreeAn antibody that reacts specifically with the anti-integrin β_ThreeAnd an antigen-antibody reaction using an “antibody”).
Integrin β by antigen-antibody reaction_ThreeAs a specific method for measuring, for example, electrophoresis is performed using a solubilized urine sediment as a specimen, and then the specimen after electrophoresis is transferred to a membrane._ThreeIntegrin β is added by antigen-antibody reaction._ThreeIntegrin β in solubilized urine sediment_ThreeAnd anti-integrin β_ThreeAntibody-integrin β_Three-Integrin beta by detecting the formation of antibody complexes_ThreeHowever, the method is not limited to this.
In the present invention, kidney disease refers to a disease accompanied by injury such as kidney glomeruli, such as nephritis and nephropathy (nephrosis). As such renal diseases, diseases caused by various causes such as those caused by binding and deposition of immune complexes are known. Specifically, for example, systemic lupus erythematosus (SLE), IgA nephropathy, diabetic Examples include nephropathy, membranous nephropathy, hypertensive nephrosclerosis, membranoproliferative nephritis, acute glomerulonephritis, monoglomerular sclerosis, purpura nephritis and the like.
The integrin β in the present invention_ThreeThe term “integrin” includes β as a β subunit._ThreeMolecules with subunits (α_vβ_ThreeComplex, α_IIbβ_ThreeComplex), β_ThreeIt includes subunits themselves and fragments thereof. Integrin β_ThreeIs excreted in the urine of patients with kidney disease, but is not present in the urine in a soluble form like urine protein, but binds to glomeruli, kidney-derived cells or cell fragments that are excreted in the urine It is thought that it exists in the form. That is, integrin β excreted in the urine due to kidney glomerular injury etc._ThreeCan be detected as an injury marker for kidney tissue to detect kidney disease. This detection of renal disease includes prognostic determination such as evaluation of therapeutic effect in addition to determination of presence or absence and degree of renal disease.
Anti-integrin β used in the present invention_ThreeFor antibodies, β_ThreeSubunit, β_ThreeIntegrin molecules containing subunits (α_vβ_ThreeComplex and alpha_IIbβ_ThreeA complex, etc.) or an antibody that recognizes these fragments.
Α_vβ_ThreeΒ of the complex (from glomerulus)_ThreeSubunit and α_IIbβ_ThreeΒ of complex (from platelet)_ThreeWhen it is desired to measure separately from the subunits, the measurement may be performed as follows. Ie α_IIbβ_ThreeΑ of complex (from platelet)_IIbΑ by antigen-antibody reaction using monoclonal antibodies that react specifically with subunits_IIbThe amount of subunits was measured and β derived from platelets_ThreeDetermine the amount of subunits. Then all β_ThreeΒ derived from platelets from the amount of subunits_ThreeBy subtracting the amount of subunits, glomerular integrin β_ThreeThe amount can be determined.
Similarly, α_vβ_ThreeGlomerular integrin β using an antibody that recognizes the complex_ThreeMeasure the amount, then total β_ThreeIntegrin β derived from glomerulus from the amount of subunits_ThreeBy subtracting the amount of platelet-derived integrin β_ThreeThe amount can be determined.
The present invention is described in detail below.
The method for detecting renal disease of the present invention uses a body fluid, preferably urine, more preferably urine sediment or solubilized urine sediment (hereinafter referred to as “urine sediment” unless otherwise specified) as a sample. Integrin beta_ThreeThis is done by measuring Integrin β in urine sediment_ThreeAs a method for measuring anti-integrin β_ThreeThe method of performing by the antigen antibody reaction using an antibody is mentioned.
Anti-integrin β used in the present invention_ThreeAs an antibody, β that has not been modified or has been modified by solubilization_ThreeSubunit, α_vβ_ThreeComplex or α_iibβ_ThreeAntibodies that are highly reactive with the complex are preferred. Anti-integrin β_ThreeAs an antibody, for example, commercially available anti-integrin β for Western blotting_ThreeAntibodies such as Anti-Human Integrin β_Three(Clone numbers VNR3, VNR5, manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd.) and the like can be used, but the monoclonal antibody (2J40 antibody, see Examples) prepared by the present inventors has not been modified._ThreeThe subunits also have β-modified with sodium dodecyl sulfate (SDS)._ThreeSubunits are particularly preferred because of their high reactivity. The hybridoma strain RINSHOKEN-2J40, which produces 2J40 antibody, was established on August 29, 1995 by the Institute of Biotechnology, Institute of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry (Postal Code 305 1-3, Higashi 1-chome, Tsukuba, Ibaraki, Japan). Deposited under the deposit number of FERM P-15139, transferred to an international deposit under the Budapest Treaty on August 7, 1996, and deposited under the deposit number of FERM BP-5619.
Anti-integrin β_ThreeAn antibody can also be prepared according to a conventional method, for example, as follows.
Purified β used as antigen_ThreeThe subunit can be obtained by a known method. For example, normal human platelets are solubilized, and this is a peptide having the amino acid sequence Arg-Gly-Asp or a peptide having the amino acid sequence Gly-Arg-Gly-Asp-Ser-Pro-Lys (SEQ ID NO: 1), etc. Affinity chromatography with a ligand as α_IIbβ_ThreeThe complex was purified, then subjected to SDS-polyacrylamide gel electrophoresis, and β_ThreeExamples include a method for separating and purifying subunits.
Polyclonal anti-integrin β_ThreeThe antibody can be obtained, for example, by immunizing an immunized animal such as a mouse, rat, guinea pig, rabbit, goat or sheep with the above antigen and collecting serum from these animals. When immunizing an animal to be immunized, it is desirable to use an adjuvant (adjuvant) in combination because it activates antibody-producing cells. The immunoglobulin fraction may be purified from the obtained antiserum by a conventional method.
Monoclonal anti-integrin beta_ThreeAn antibody is obtained as follows, for example. That is, the spleen or popliteal lymph node was removed after the above antigen was administered intraperitoneally, subcutaneously or footpad of an immunized animal such as mouse, rat, guinea pig, rabbit, goat, sheep, etc. A hybridoma by fusing the tumor cell line with myeloma cells, continuously growing the resulting hybridoma, and selecting a cell line that continuously produces a specific antibody against the antigen from the resulting hybridoma . By culturing the selected strain in a suitable medium, monoclonal anti-integrin β_ThreeAn antibody is obtained. Alternatively, by culturing the hybridoma in a living body such as the abdominal cavity of a mouse, monoclonal anti-integrin β_ThreeAntibodies can be produced in large quantities.
As cells used for cell fusion, lymph node cells and lymphocytes in peripheral blood can be used in addition to spleen cells. The myeloma cell line is preferably derived from the same cell line as compared to that derived from a different cell type, and a stable antibody-producing hybridoma can be obtained.
Purification methods of the obtained polyclonal and monoclonal antibodies include salting out with sodium sulfate, ammonium sulfate, etc., low temperature alcohol precipitation, selective precipitation fractionation with polyethylene glycol or isoelectric point, electrophoresis, DEAE (diethylaminoethyl)- Derivatives, ion exchange chromatography using ion exchangers such as CM (carboxymethyl) -derivatives, affinity chromatography using protein A or protein G, hydroxyapatite chromatography, immunoadsorption chromatography with immobilized antigen, gel Examples thereof include a filtration method and an ultracentrifugation method.
Anti-integrin β_ThreeThe antibody can be used as it is, but a fragmented antibody can also be used. Proteases that do not degrade the antigen binding site (for example, plasmin, pepsin, papain, etc.) since the antigen binding site (Fab) of the antibody is essential for the binding between the antigen and the antibody when the antibody is fragmented It is also possible to use a Fab-containing fragment obtained by treating an antibody with Anti-integrin β_ThreeOnce the nucleotide sequence of the gene encoding the antibody or the amino acid sequence of the antibody is determined, fragments or chimeric antibodies (for example, anti-integrin β_ThreeA chimeric antibody containing the Fab portion of the antibody, etc.), and such fragments and chimeric antibodies can also be used in the present invention.
These anti-integrin β_ThreeFragments including antibody Fab portions and chimeric antibodies are also referred to as “anti-integrin β” in the present invention._ThreeIt is encompassed by the term “antibody”.
Anti-integrin β as above_ThreeThe form of the antigen-antibody reaction using the antibody is not particularly limited, and the measurement system used in a normal immunoassay (immunoassay) can be applied to the present invention regardless of the type. Specific measurement systems include immunoblotting methods (for example, Western blotting methods), labeled immunoassay methods (for example, EIA methods, enzyme-linked immunosorbent assay methods (ELISA methods), radioimmunoassay methods, fluorescent immunoassay methods, etc. ) And flow cytometry. These measuring methods are publicly known methods [Satoshi Irie, “Continuing Radioimmunoassay”, Kodansha Co., Ltd., issued on May 1, 1979, edited by Eiji Ishikawa et al., “Enzyme Immunoassay”, Second Edition, ( Medical Shoin Co., Ltd., published on December 15, 1982, Method in Enzymology, Vol. 92 (1983), Immunochemical Techniques, Part E: See Monoclonal Antibodies and General Immunoassay Methods, Academic Press, Inc.] it can.
In the immunoblotting method, for example, the Western blotting method, electrophoresis is performed using a body fluid, preferably urine, more preferably a solubilized urine sediment as a sample, and then the sample after electrophoresis is transferred to a membrane, and the anti-integrin is transferred to this membrane. β_ThreeIntegrin β is added by antigen-antibody reaction._ThreeThis can be done by measuring. The electrophoresis is preferably performed by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis. The conditions for SDS-polyacrylamide electrophoresis and the conditions for transfer to the membrane can be appropriately determined by those skilled in the art according to the conditions used in the known Western blotting method. For example, examples of the membrane include a polyvinylidene difluoride (PVDF) membrane, a nitrocellulose membrane, and a nylon membrane. Anti-integrin β is a measure of antigen-antibody reaction in Western blotting._ThreeThe antibody is previously labeled with a labeling substance, the membrane and this labeled antibody are incubated, and the integrin β on the membrane is incubated._ThreeThe labeling substance of the labeled antibody bound to can be detected by a method suitable for the labeling substance. In addition, unlabeled anti-integrin β_ThreeIncubate antibody with membrane and integrin β_ThreeAnd anti-integrin beta_ThreeAfter forming a conjugate of the antibody, anti-integrin β_ThreeThe labeled substance in the secondary antibody bound to the conjugate by binding the labeled secondary antibody obtained by labeling the antibody against the immunoglobulin of the immunized animal used for preparing the antibody (secondary antibody) with the labeling substance. The antigen-antibody reaction can also be measured by detecting. Anti-integrin β_ThreeAs an antibody, β modified with a denaturing agent (eg, SDS, etc.)_ThreeAntibodies that are highly reactive with subunits are preferred.
Labeled immunoassays, such as the sandwich EIA method, use integrin β in body fluids, preferably mud, more preferably solubilized urine sediment._ThreeAnd anti-integrin β_ThreeThe antibody is reacted with a sandwich complex, ie anti-integrin β_ThreeAntibody-integrin β_Three-Anti-integrin β_ThreeThis can be done by detecting the formation of antibody complexes. The complex is formed by using a labeled antibody for one of the antibodies forming the complex and using an antibody that can bind to or bind to the solid phase for the other, and the labeling substance in the complex is suitable for the labeling substance. It can detect by detecting by the method. In addition, after formation of the complex, the formation of the complex can also be detected by binding the labeled secondary antibody to the complex and measuring the labeling substance of the labeled secondary antibody bound to the complex. Can do. More specifically, the sandwich EIA method includes, for example, the following method, but is not limited thereto.
(1) Integrin β_ThreeSolubilized urinary sediment, labeled anti-integrin beta_ThreeAntibodies, and anti-integrin betas that can or can bind to a solid phase_ThreeIntegrin β_ThreeForming a sandwich-like complex sandwiching the antibody with the labeled antibody,
(2) Integrin β_ThreeSolubilized urinary sediment and labeled anti-integrin β_ThreeIntegrin β_ThreeAfter forming a conjugate with the labeled antibody and anti-integrin β_ThreeThe integrin β of the conjugate is mixed with the solid phase to which the antibody is fixed._ThreeIs further bound to the antibody fixed to the solid phase, and integrin β_ThreeForming a sandwich complex between the antibody fixed to the solid phase and the labeled antibody, or
(3) Anti-integrin β fixed to a solid phase_ThreeAntibodies and integrin beta_ThreeMixed with solubilized urinary sediment containing the antibody and integrin β_ThreeAnti-integrin β pre-labeled with a labeling substance._ThreeIntegrin β mixed with antibody_ThreeIs sandwiched between the antibody and the labeled antibody to form a sandwich complex,
The labeled anti-integrin beta that did not bind to the sandwich complex bound to the solid phase_ThreeExamples include a method of separating an antibody and measuring a labeling substance in one of a solid phase and a liquid phase by a method according to the labeling substance (for example, in the case of an enzyme, measuring a change in a substrate due to an enzyme reaction). be able to.
Anti-integrin beta in the sandwich method_ThreeWhen using a monoclonal antibody as an antibody, it is preferable to use two types of monoclonal antibodies having different epitopes, or to use a polyclonal antibody as one of the antibodies forming a sandwich complex.
Examples of the solid phase include wells of microtiter plates (immunoplates), balls such as polystyrene, latex particles, test tube walls, and metal colloids. Examples of a method for fixing an antibody to these solid phase bodies include a physical adsorption method, a covalent bonding method, and the like. Furthermore, a general method for preparing an immobilized enzyme such as a comprehensive method (immobilized enzyme, 1975). , Published by Kodansha, see pages 9 to 75). In particular, the physical adsorption method is preferable because it is simple and widely used as a method for fixing an antibody to a solid phase. The part where the antibody is not bound may be blocked with serum albumin, gelatin, milk protein or the like.
The integrin β in the specimen sample can also be obtained by fixing the sandwich complex to the solid phase, separating the solid phase from the liquid phase, and measuring the liquid phase labeling substance._ThreeCan be measured.
Integrin β labeled with a labeling substance_ThreeIs attached to the solid phase together with the sample._ThreeThe integrin β in the specimen sample can also be obtained by the so-called competition method, in which the amount of labeling substance mixed with the antibody and bound to the immobilized antibody is measured._ThreeCan be measured.
In the renal disease detection method of the present invention, the antigen-antibody reaction is not limited to the solid phase method as described above, and may be performed by a so-called liquid phase method that does not use a solid phase antibody. That is, anti-integrin β_ThreeMix the antibody and specimen sample, add a labeled secondary antibody, and add integrin β_Three-Anti-integrin β_ThreeIn this method, a complex of an antibody-labeled secondary antibody is precipitated, and a label contained in the precipitate is detected.
Labeling substances used for antibody labeling include enzymes (peroxidase, alkaline phosphatase, β-galactosidase, etc.), radioisotopes (¹²⁵I,¹³¹I,^ThreeH), fluorescent substances (fluorescein isothiocyanate, umbelliferone, 7-amino-4-methylcoumarin-3-acetic acid, etc.), chemiluminescent substances (luminol, etc.), or other substances (biotin, avidin, etc.) Can be mentioned. When a metal colloid or the like is used as the solid phase, labeling is not always necessary.
The antibody labeling method is a known method suitable for the labeling substance, for example, when labeling an enzyme with a radioisotope such as glutaraldehyde method, periodate crosslinking method, maleimide crosslinking method, carbodiimide method, etc. Can be appropriately selected from the chloramine T method, the lactoperoxidase method, etc. (Refer to Secondary Biochemistry Experiment Course 5, Immunobiochemistry Research Method, Tokyo Chemical Dojin, published in 1986).
Furthermore, as another measurement method of the present invention, a buffer solution (for example, phosphate buffered saline (PBS)) or the like is added to unsolubilized urine sediment to prepare a suspension, and anti-integrin β_ThreeIntegrin β in urine by flow cytometry using the antibody or the labeled antibody_ThreeThe method of measuring can be mentioned.
On the other hand, when urine sediment is used as a specimen sample, the urine sediment is not particularly limited as long as it is insoluble in urine. For example, insoluble proteins, cells, cell fragments, etc. in urine are centrifuged or ultrafiltered. And the like concentrated. The concentration method is preferable because centrifugation is simple. As the conditions for the centrifugation, for example, conditions of centrifuging at 400 × g or more for 5 minutes or more are exemplified.
In the Western blotting method, usually, before electrophoresis, a urinary sediment is solubilized by adding a denaturant (solubilizer) that causes denaturation of a protein such as a surfactant, guanidine hydrochloride, or urea. The denaturing agent (solubilizing agent) is preferably a surfactant, and more preferably an ionic surfactant. In the case of using an alkyl sulfate such as sodium dodecyl sulfate (SDS) among ionic surfactants, the concentration is exemplified by about 0.1 to 5% with respect to urine sediment.
Also in the labeled immunoassay, a sample obtained by solubilizing a urine sediment by adding a surfactant or the like is usually used as a specimen sample. The type and concentration of the surfactant can be appropriately selected within a range that does not affect the antigen-antibody reaction. Non-ionic surfactants such as polyoxyethylene alkylphenyl ethers (Triton surfactants) (Triton X-100, etc.), polyoxyethylene sorbitan alkyl esters (Tween surfactants), etc. Examples thereof include a surfactant.
Integrin β in body fluids, preferably urine, more preferably urine sediment_ThreeQuantification of the amount is based on known amounts of integrin β_ThreeIs used as a standard substance, a calibration curve is prepared for the relationship between the standard substance concentration and the amount of label to be detected, and the comparison is made with this calibration curve. In the competition method, a known amount of unlabeled integrin β is added to the antigen-antibody reaction system together with a certain amount of standard substance._ThreeAnd a calibration curve should be prepared for the relationship between the standard substance concentration and the amount of label detected.
As above, anti-integrin β_ThreeIntegrin β in body fluids using antibodies_ThreeBy measuring this, it is possible to detect kidney disease. That is, anti-integrin β_ThreeThe antibody can be used as a diagnostic agent for renal diseases. Anti-integrin β_ThreeIn addition to antibodies, solid phase bodies, labeled antibodies, optionally labeled secondary antibodies, reagents for detecting labeled substances, buffers, labeled substances, integrin β_ThreeA standard substance, a solubilizing agent (denaturing agent) that does not affect the antigen-antibody reaction, and the like may be added to form a diagnostic kit. The solid phase is preliminarily anti-integrin β_ThreeThe antibody may be fixed and is preferred. With such a kit, integrin β_ThreeCan be easily measured.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 shows anti-integrin β produced by the method described in the preparation example._ThreeUsing an antibody-coated immunoplate, various concentrations of integrin β_ThreeIt is a figure which shows a standard curve when a standard solution is measured.
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
Examples will be given below, but the present invention is not limited thereto.
Preparation Example Anti-integrin β _Three Antibody production
Monoclonal anti-integrin beta_ThreeThe antibody was produced according to the method of Koehler. G. et al. (Nature, 256 (1975) p. 495).
Leukocyte components are removed from the concentrated human platelet suspension after the expiration date, and the platelets are washed with HEPES-Tyrode buffer and then 2 mM Ca.²⁺, Mg²⁺Solubilized with 50 mM β-octylglucoside. After ultracentrifugation, 2 mM Mn²⁺First, gel filtration was performed with a Sepharose 4B column (Pharmacia), followed by affinity chromatography. For the affinity column, CNBr activated Sepharose (manufactured by Pharmacia) was prepared by using a Gly-Arg-Gly-Asp-Ser-Pro-Lys (SEQ ID NO: 1) peptide as a ligand and binding this peptide by a conventional method. ) Was used.
After thorough washing with a solution containing 30 mM β-octylglucoside and 0.5 M NaCl, α was added with 1 mM Gly-Arg-Gly-Asp-Ser-Pro (SEQ ID NO: 2) peptide._IIbβ_ThreeThe complex fraction was eluted. Furthermore this α_IIbβ_ThreeThe complex fraction was subjected to gel filtration with a Sephadex G-50 column (Pharmacia), and the Gly-Arg-Gly-Asp-Ser-Pro (SEQ ID NO: 2) peptide and Mn²⁺Except for purified α_IIbβ_ThreeA complex was obtained. This complex was confirmed as two bands by silver staining after SDS-polyacrylamide gel electrophoresis.
Obtained α_IIbβ_ThreeThe complex was analyzed by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis._IIbSubunit and β_ThreeSeparated into subunits, β_ThreeThe subunit was isolated.
This β_ThreeAfter treating the subunit as a purified antigen with an adjuvant, the footpads of both hind limbs of BALB / c mice were immunized every 4-5 days with 100 μl per foot. Three weeks after the start of immunization, the purified antigen alone was injected into the same site, and three days later, lymphocytes were prepared from the popliteal lymph nodes. The PAI cells (from the Japanese Cancer Research Resource Bank) were (Registration number: JCRB-0113) and polyethylene glycol were used for fusion. After selection with HAT medium (medium containing hypoxanthine, aminopterin, and thymidine), screening was performed using the supernatant of the grown hybridoma.
Human platelets and C32 melanoma cells (Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd .; α_vβ_ThreeExpressing α_IIbβ_ThreeThe antibody is highly reactive to the antigen from the resulting hybridoma by immunoblotting, in which the solubilized solution of 2% SDS in a final concentration is added to the suspension of the non-expressing cell line). The hybridoma strain to be produced was selected. This hybridoma strain RINSHOKEN-2J40 was transferred to FERM P-15139 on August 29, 1995, from the Ministry of International Trade and Industry, Institute of Industrial Science, Biotechnology Institute of Technology (Postal Code 305 1-3-1 Higashi 1-chome, Tsukuba, Ibaraki, Japan). And was transferred to an international deposit based on the Budapest Treaty on August 7, 1996, and deposited with a deposit number of FERM BP-5619. Monoclonal anti-integrin β produced by this strain_ThreeThe antibody was named 2J40 antibody. A monoclonal antibody was purified from the culture solution of this hybridoma strain according to a conventional method. The antibody is not denatured β_ThreeΒ modified by SDS rather than subunit_ThreeResponse to subunits was high.
Example 1
10 ml of urine from time to time for healthy subjects and patients with renal disease were centrifuged at 400 × g (1,500 rpm / minute, KUBOTA centrifuge KN-70) for 5 minutes, and the supernatant was removed. 500 μl of phosphate buffered saline (PBS) is added and suspended, and the mixture is centrifuged at 15,000 × g (15,000 revolutions / minute, centrifuge MRX-150 manufactured by Tommy Seiko Co., Ltd.) for 15 minutes. Clarity was removed. Solubilized solution containing 4% SDS in the sediment (Tris 1.393 g, 20% SDS 20 ml, glycerol 20 ml, EDTA 0.074 g was dissolved in water to 100 ml, adjusted to pH 6.8 with hydrochloric acid, and bromophenol Solution added with blue: hereinafter abbreviated as “solubilized solution”) 400 μl was added to dissolve (solubilize) and heated at 100 ° C. for 5 minutes. The obtained urine sediment sample was stored at −20 ° C. until measurement, and dissolved and used at the time of measurement.
20 μl of urine sediment sample was placed on each lane and subjected to SDS-polyacrylamide gel electrophoresis. Electrophoresis was performed using Resep Gel (5-20% gradient) (manufactured by Wakashimori Co., Ltd.) at 30 mA for about 1 hour until bromophenol blue reached the tip of the gel. Next, immobilon^TM(PVDF membrane, manufactured by Millipore) was used to transfer the protein from the gel after electrophoresis according to a conventional method. Monoclonal antibody 2J40 (1: 400 dilution) was added to the transferred membrane and incubated at room temperature for 1 hour. Washing was performed twice with PBS-0.05% Tween 20 for 5 minutes, then twice for 10 minutes.
To this membrane, HRP (horseradish peroxidase) -labeled anti-mouse antibody (1: 200 dilution) was added, incubated at room temperature for 45 minutes, and then washed as described above. ECL^TMA reagent (Amersham) was added and incubated for 2 minutes, and then exposed to an X-ray film (Amersham) for 2 minutes. The degree of blackening of the portion stained with a densitometer was measured.
Washed platelets 10 solubilized with solubilization solution^ThreeIntegrin β when individual samples are used_ThreeUrine sediment integrin beta_Three1 unit. Using a known amount of solubilized washed platelets, the degree of blackening and integrin beta measured with a densitometer_ThreeThe relationship with the amount was examined, and a calibration curve regressed to a straight line in the range of 0.4 to 63.0 units was prepared. Integrin β_ThreeThe amount was calculated by correcting with the amount of creatinine in urine.
The healthy subjects and the patients with renal diseases are 23 healthy subjects and 48 patients with various renal diseases, and the breakdown of the diseases is 19 cases of systemic lupus erythematosus (SLE) (6 cases of active (acute), inactive (chronic) ) 13 cases), IgA nephropathy 10 cases, diabetic nephropathy (DM) 6 cases, minimal change nephropathy 6 cases, membranous nephropathy (MN) 4 cases, membranous proliferative nephritis (MPGN) 1 case, hypertension There were 2 cases of atherosclerosis (HTN). The healthy subjects were 13 males and 10 females, and the ages were 22-59 years old. The patients with various renal diseases were 20 males and 28 females, and the ages were 23-68 years.
The results are shown in Table 1.

As a result of the measurement, integrin β_ThreeUrine protein, hematuria, urinary β₂-No correlation with microglobulin or N-acetylglucosaminidase (NAG).
In addition, the integrin β_ThreeWas found to be almost never excreted in urine in healthy subjects. Integrin β_ThreeAs a result of quantitative measurement, the amount of excretion varied depending on the type of kidney disease, and also varied depending on the activity in the same kidney disease group. That is, urinary integrin β is more active in SLE than inactive SLE._ThreeThe amount was extremely large. In micronephrosis where histopathologically no glomerular injury was observed, integrin β derived from urine sediment_ThreeWas not detected.
As described above, urinary integrin β_ThreeIt is possible to easily determine the detection of renal disease and its prognosis, including the presence and extent of glomerular injury.
Example 2
1,000 ml of 24-hour livestock urine from active SLE patients was centrifuged at 400 × g for 5 minutes and the supernatant was removed. The precipitate was washed twice with 20 ml of PBS, and 3 ml of PBS was added to prepare a suspension. 2J40 antibody, LM609 antibody (α_vβ_ThreeMonoclonal antibody against the complex, manufactured by Chemicon, product number [MAB1976]), P2 antibody (α_IIbβ_ThreeA monoclonal antibody against the complex (manufactured by Cosmo Bio) was added, and a FITC-labeled secondary antibody was further added, and flow cytometry was performed using FACScan (manufactured by BECTON DICKINSON) according to a conventional method. As a result, urinary sediment cells and the like were stained positive for 2J40 antibody and LM609 antibody, and integrin β_ThreeWas detected, but negative for P2 antibody and α derived from platelets._IIbβ_ThreeNo complex was detected.
Example 3
Anti-integrin β produced by the method described in the Preparation Example_ThreeThe antibody (2J40 antibody) was diluted to 20 mg / ml with phosphate buffered saline (pH 7.2 to 7.5, divalent ion-free) (hereinafter abbreviated as PBS (−)), and 50 μl (1 μg / ml) of this solution was diluted. Each well was added to each well of an immunoplate (trade name Maxisorp, manufactured by NUNK) and stored at 4 ° C. for 16 hours to uniformly coat.
The plate was then washed twice with PBS (−) and the well anti-integrin β_ThreeIn order to coat the portion not coated with the antibody, a PBS (−) solution containing 3% bovine serum albumin (BSA) (sold by Seikagaku Corporation) as a blocking substance was added and allowed to stand at room temperature for 2 hours.
Next, this plate was washed three times with a washing solution (PBS (-) containing 0.05% Tween 20) to obtain anti-integrin β._ThreeAn immunoplate to which the antibody was fixed was prepared.
Anti-integrin β_ThreeEach concentration of integrin β_Three50 μl each of standard solutions (0.4, 0.8, 1.6, 3.2, 6.25, 12.5, 25, 50, and 100 ng / ml) were added, and the mixture was allowed to stand at 37 ° C. for 1 hour for reaction. Integrin β_ThreeAs a solvent for the standard solution, PBS (−) containing 1% BSA (hereinafter referred to as “reaction diluent”) was used.
Thereafter, this plate was washed three times with the above washing solution, and 0.7 μg / ml of biotin-labeled anti-integrin β was added per well._Three25 μl of antibody and 25 μl of peroxidase-labeled streptavidin (Seikagaku Co., Ltd.) diluted 5000 times were added and allowed to react at 37 ° C. for 1 hour. Further, this plate was washed three times with the washing solution, and 50 μl of tetramethylbenzidine solution (manufactured by Moss, hereinafter abbreviated as TMB) was added as a substrate for peroxidase, and reacted at 37 ° C. for 15 minutes to develop color.
After color development, 50 μl of 1M HCl was added to the plate to stop the reaction, and the absorbance at 450 nm wavelength (control wavelength 630 nm) of the colored liquid due to decomposition of TMB was measured with a well reader (Seikagaku Corporation sales). The obtained results are shown in FIG.
From this result, anti-integrin β_ThreeUrinary integrin β can also be obtained by ELISA using a solid phase antibody-immobilized antibody (microtiter plate is used here, but is not limited thereto)._ThreeIt was suggested that it is possible to quantify. This result also shows that integrin β_ThreeIt was shown that it is possible to create a calibration curve at the time of quantification.
Integrin β in body fluid, preferably urine, more preferably urine sediment, very preferably urine sediment solubilized with a solubilizer (eg Triton or Tween surfactant) in a similar manner_ThreeIt is possible to detect kidney disease by measuring.
Industrial availability
According to the diagnostic agent, diagnostic kit and measurement method of the present invention, it is possible to easily detect the presence and extent of renal disease, particularly glomerular injury.
Sequence listing
(1) General information
(i) Applicant:
(ii) Title of invention:
(iii) Number of sequences:
(iv) Contact information:
(A) Address:
(B) Address:
(C) City:
(D) State:
(E) Country:
(F) ZIP:
(v) Computer-readable format
(A) Medium: Floppy disk
(B) Computer: IBM PC compatible
(C) Operation system: PC-DOS / MS-DOS
(D) Software: FastSEQ Version 1.5
(vi) Current appearance data
(A) Application number
(B) Application date
(C) Classification
(viii) Agent / office information
(A) Name:
(B) Registration number:
(C) Reference number:
(ix) Communication information
(A) Phone number:
(B) Facsimile number:
(2) Sequence information of sequence number 1:
(i) Sequence properties:
(A) Sequence length: 7 amino acids
(B) Sequence type: amino acid
(D) Topology: Linear
(ii) Sequence type: peptide
(xi) Sequence: SEQ ID No: 1:

(2) Information of sequence number 2:
(i) Sequence properties:
(A) Sequence length: 6 amino acids
(B) Sequence type: amino acid
(D) Topology: Linear
(ii) Sequence type: peptide
(xi) Sequence: SEQ ID No: 2:

Claims (7)

尿沈渣中のインテグリンβ₃を測定することを特徴とする腎疾患の検知法。A method for detecting renal disease, characterized by measuring integrin β ₃ in urine sediment. 尿沈渣中のインテグリンβ₃を、インテグリンβ₃に対する抗体を用いた抗原抗体反応によって測定することを特徴とする請求項１記載の腎疾患の検知法。Detection methods for renal disease of claim 1, wherein the integrin beta ₃ in urinary sediment, as measured by antigen-antibody reaction using an antibody against the integrin beta _3. 可溶化した尿沈渣を検体として電気泳動を行い、次いで電気泳動後の検体を膜に転写し、この膜にインテグリンβ₃に対する抗体を加え、抗原抗体反応によってインテグリンβ₃を測定することを特徴とする請求項２記載の腎疾患の検知法。Electrophoresis using solubilized urinary sediment as a specimen, then transferring the specimen after electrophoresis to a membrane, adding an antibody against integrin β ₃ to this membrane, and measuring integrin β ₃ by antigen-antibody reaction The method for detecting a renal disease according to claim 2. 可溶化した尿沈渣中のインテグリンβ₃と、インテグリンβ₃に対する抗体とを反応させ、抗体−インテグリンβ₃−抗体の複合体の形成を検出することによりインテグリンβ₃を測定することを特徴とする、請求項２記載の腎疾患の検知法。Integrin beta ₃ of urinary sediment was solubilized by reacting the antibodies to integrin beta _3, antibody - integrin beta ₃ - and measuring the integrin beta ₃ by detecting the formation of a complex between the antibody The method for detecting renal disease according to claim 2. インテグリンβ₃に対する抗体を含み、尿沈渣中のインテグリンβ₃を測定して腎疾患を検知するための診断薬であることを特徴とする腎疾患診断薬。Includes an antibody against integrin beta _3, renal disease diagnostic agent which is a diagnostic agent for detecting a renal disease by measuring the integrin beta ₃ in urine sediment. インテグリンβ₃に対する抗体を固着させた固相体と、標識物質で標識された、又は標識されうる該抗体とを含む腎疾患診断用キット。Solid phase body was fixed an antibody against integrin beta _3, which is labeled with a labeling substance, or labeled can kit renal disease diagnosis including the antibody. 構成試薬として尿沈渣の可溶化剤をさらに含む請求項６記載のキット。The kit according to claim 6, further comprising a urinary sediment solubilizer as a constituent reagent.

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