JP3864303B2 - 麹菌のフェリクローム又はそのデフェリ体生合成に関与するオルニチンｎ５−オキシゲナーゼ遺伝子 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、麹菌のフェリクローム又はそのデフェリ体生合成に関与するオルニチンＮ５−オキシゲナーゼ蛋白質、該蛋白質をコードする遺伝子、該遺伝子を含有する組み換えベクター、該組み換えベクターを含有する形質転換体、該遺伝子を含有する組み換え麹菌、該形質転換体を用いるオルニチンＮ５−オキシゲナーゼ蛋白質を生産させることによってフェリクローム又はそのデフェリ体高生産麹菌を育種する方法、蛋白質の発現を麹菌菌体内で抑制させフェリクローム又はそのデフェリ体非生産麹菌を育種する方法に関するものである。
【０００２】
フェリクローム又はそのデフェリ体は、糸状菌が生産する鉄イオンキレート物質（シデロフォア）の１種であって、その中で麹菌はフェリクリシン又はデフェリフェリクリシンと呼ばれるフェリクローム又はそのデフェリ体を生産する。本発明によれば、このフェリクローム又はそのデフェリ体生合成に必須なオルニチンＮ５−オキシゲナーゼ蛋白質をコードする遺伝子のＤＮＡ配列が明らかにされて、本蛋白質をコードする遺伝子の発現をその抑制を含めて自由に操作することがはじめて可能となり、フェリクリシン又はデフェリフェリクリシン（麹菌等の糸状菌においてフェリクローム又はそのデフェリ体の主成分をなす）の生合成を多くしたり、少なくしたり、あるいはそれを停止したり、自由にコントロールすることをはじめて可能ならしたものである。
【０００３】
【従来の技術】
鉄イオンは一部の乳酸菌を除く、ほとんどすべての生物にとって必須の原子である。鉄は、生体内ではＦｅ（II）やＦｅ（III）の形態で利用され、主に酸化還元に関与する酵素群の補欠因子として機能する。しかしながら、一般的に鉄は自然界において鉄鉱石として存在し、可溶化されたイオン状態としてはほとんど存在しない。さらに鉄鉱石から微生物の働きにより可溶化された鉄イオンも、すぐに不溶性の酸化物や水酸化物となるため、生物が利用できる鉄イオンはきわめて微量である。細菌や放線菌、真核微生物はこのような微量な鉄イオンを効率的に獲得するために、シデロフォアと呼ばれる分子量１５００以下の低分子の鉄イオンキレート物質を生産する。このシデロフォアに鉄イオンをキレートすることにより、貴重な鉄イオンの不溶化を防ぎ、鉄イオンを優先的に利用することを図っている。また鉄イオンは生物にとって必須のイオンであるが、過剰に存在すると遊離のラジカルの発生を促し、逆に生体に危害を加える。シデロフォアは鉄イオンの獲得と同時に、このような鉄イオンの無害化にも大きく寄与している。シデロフォアは非キレート状態では無色であるが、鉄イオンをキレートすると、赤色を示し、可視光の吸収を示すことが知られている。
【０００４】
現在までに様々なシデロフォアが同定されているが、糸状菌が生産するシデロフォアはhydroxamates familyと呼ばれ、一般に構成アミノ酸誘導体としてＮ−ヒドロキシオルニチンを含む。研究用モデル糸状菌、工業用微生物、病原性糸状菌として幅広く研究が進められているアスペルギルス属糸状菌はhydroxamates familyの中でもフェリクローム類とフザリニン類と呼ばれるシデロフォアを生産する。前者は、Ｎ−ヒドロキシオルニチンのトリペプチドにグリシン、セリン、アラニンが環状ペプチドを形成している。一方、後者では一部のＮ−ヒドロキシオルニチンのＮ位が無水メバロン酸によってアシル化されている特徴を有する。糸状菌はこのような多種多様なシデロフォアを生産することにより、鉄イオンを優先的に獲得し、自然界での生存競争に活用しているものと考えられる。
【０００５】
一方、清酒醸造では、アスペルギルス・オリゼを蒸米上に生育させて「麹」を作成し、清酒醸造の原料として利用している。この麹造りにおいてアスペルギルス・オリゼが大量のフェリクローム類（中でも主成分はフェリクリシン又はデフェリフェリクリシン）を生産し、これが酒造用水の鉄イオンをキレートし、清酒が着色することが知られている。従って、清酒醸造においては、シデロフォアであるフェリクローム類が、品質劣化の原因であり、できるだけフェリクローム類を生産しない菌株の育種が進められてきた。
【０００６】
このように、麹菌（Ａ．ｏｒｙｚａｅ）はフェリクローム類を大量に生産することが古くから知られているが、その生合成系に関しては、ほとんど明らかになっていない。現在でも、フェリクローム又はそのデフェリ体低生産菌の育種は主に、スクリーニング法や変異法に頼らざるを得ない。また近年このシデロフォアの鉄キレート力は、貧血症の医薬としても利用されるようになっている。麹菌が産生するフェリクリシン又はデフェリフェリクリシンも鉄イオン結合能力については非常に優れているが、その生産性の向上が困難で工業レベルでの生産の対象とはなっていない。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明者らは、このような現状に鑑み、もしフェリクローム類の生合成遺伝子が同定されれば、麹菌（アスペルギルス・オリゼ：Aspergillus oryzae）によるフェリクローム類の生産を自由に調節する可能性がある点に着目した。
【０００８】
すなわち、清酒醸造においては、フェリクローム又はそのデフェリ体生合成に関与する遺伝子の発現が抑制できれば、全くフェリクローム又はそのデフェリ体を生産しない株が育種できる。また医薬品製造において、フェリクリシン又はデフェリフェリクリシン生合成に関与する遺伝子の発現をより活発に誘導させることにより、大量のフェリクリシン又はデフェリフェリクリシン生産が可能となる。さらに麹菌が生産するフェリクローム又はそのデフェリ体は清酒や酒粕として長年摂取されており、極めて安全性の高い物質である。麹菌によりフェリクローム又はそのデフェリ体が大量に生産できれば、医薬品から食品まで幅広い応用が可能となる点に着目した。
【０００９】
このように、麹菌のフェリクローム又はそのデフェリ体生産についてはさまざまな分野に応用が期待されるが、その生合成遺伝子が未解明なため、いまだに効率的な活用がなされていないのが現状である。
【００１０】
本発明は、このような現状に鑑みてなされたものであって、先ずはじめに麹菌について検討を行った。
【００１１】
麹菌Ａ．ｏｒｙｚａｅは清酒、醤油、味噌などの我が国の伝統的酵素産業で使用されてきた糸状菌である。本菌株の特徴は、上記発酵産業で有用な蛋白質や低分子成分を非常に大量に生産することである。本菌株が持つ高い蛋白質生産能と醸造微生物としての安全性から、異種蛋白質生産の宿主として注目されている（Biotechnology, 6, 1419 (1988)、特開昭６２−２７２９８８）。本発明者らの研究から、Ａ．ｏｒｙｚａｅを用いた異種蛋白質生産においては、アスペルギルス属などの近種の遺伝子であれば、その生産能はさらに増大することが認められた。特に、Ａ．ｏｒｙｚａｅの遺伝子を、Ａ．ｏｒｙｚａｅの高発現プロモーター制御下で発現させた場合、非常に大量の蛋白質が生産されることを見出した（特開平１１−１５４２７１，特願２０００−３６７５４）。
【００１２】
また、Ａ．ｏｒｙｚａｅは、上記のような蛋白質、酵素のみならず、産業的にも非常に貴重な低分子成分の生産も報告されている。中でも麹菌が固体培養で生産するフェリクローム又はそのデフェリ体は、近年、貧血などの鉄欠乏症用の機能性成分としても非常に注目されている物質である。
【００１３】
この麹菌のフェリクローム又はそのデフェリ体を医薬・食品に利用するためには、生産性をさらに向上させる必要があるが、変異法などの既存の菌株育種方法では、工業生産レベルにまで生産性が向上した変異株の取得はできなかった。そこで、広範な検討を行った結果、フェリクローム又はそのデフェリ体生合成に関与する遺伝子を単離し、これらの遺伝子の発現能を強化することによりフェリクローム又はそのデフェリ体の大量生産が可能であるとの着想を得、各方面から鋭意検討の結果、これらの遺伝子の中から麹菌のオルニチンＮ５−オキシゲナーゼにはじめて着目した。また、遺伝子を導入する場合、Ａ．ｏｒｙｚａｅ以外の異種ＤＮＡが混入しない方法を用いれば、セルフクローニング株となり組換え微生物の規制からも除外される点にも着目した。
【００１４】
麹菌におけるフェリクローム又はそのデフェリ体生合成経路については不明であるが、他の糸状菌のフェリクローム類の生合成経路から、その生合成の律速段階はオルニチンＮ５−オキシゲナーゼによるオルニチンの酸化であると推測される。そこでこの、オルニチンＮ５−オキシゲナーゼの遺伝子が取得できれば、フェリクロームの生産を自由に制御できる遺伝子組み換え麹菌を育種でき、フェリクロームの工業生産が可能になると考えた。以下は麹菌が生産するフェリクローム類の中でも、最も含有量の多いフェリクリシン又はデフェリフェリクリシンの生産を中心に記述するが、本発明は全てのフェリクローム類に応用が可能な技術であり、フェリクリシン又はデフェリフェリクリシンだけに限定するものではない。
【００１５】
我々は、清酒醸造において清酒の着色を起こす鉄イオンキレート低分子フェリクリシンを貧血改善用の機能性成分などとして大量生産させるために、フェリクローム又はそのデフェリ体生合成に関与するオルニチンＮ５−オキシゲナーゼ蛋白質の遺伝子クローニングを行い、フェリクリシン又はデフェリフェリクリシンの工業生産に適した遺伝子組み換え麹菌を育種することを試み、鋭意研究の結果、遂に本発明の完成に至った。
【００１６】
近年、フェリクリシン又はデフェリフェリクリシンなどシデロフォア生合成系の遺伝子については、トウモロコシの病原菌であるUstilago maydisにおいてその詳細な合成メカニズムが検討されてきた。生合成の第一反応であるオルニチンの酸化を触媒するオルニチンＮ５−オキシゲナーゼが生合成の律速となり、これをコードする遺伝子ｓｉｄ１がクローニングされた。ｓｉｄ１などのシデロフォア生合成酵素遺伝子群の発現は、鉄が存在する環境下では発現が抑制され、鉄制限下ではその発現が開始される。このようなヒドロキシオルニチンを含むシデロフォアの生合成に必須なオルニチンＮ５−オキシゲナーゼをコードする遺伝子は、Ustilago maydis, Pseudomonas sp. B10, Pseudomonas aeruginosa, Burkholderia cepacia由来のものがクローニングされている。そこでこれらのシデロフォア生合成に関与するオルニチンＮ５−オキシゲナーゼ蛋白質の相同性から、麹菌におけるオルニチンＮ５−オキシゲナーゼ活性を担う遺伝子が取得できると考えた。
【００１７】
現在までに遺伝子が単離されたUstilago maydis, Pseudomonas sp. B10, Pseudomonas aeruginosa, Burkholderia cepaciaのオルニチンＮ５−オキシゲナーゼ蛋白質のアミノ酸レベルでの相同性を比較した結果、非常に保存性の高い３つの領域を見いだした。この領域それぞれに対応する縮重合成プライマーを設計した。本プライマーを用いてＡ．ｏｒｙｚａｅの鉄制限培養条件下から構築した３′−ＲＡＣＥライブラリーに対してＰＣＲを行った結果、約８００ｂｐの遺伝子断片が増幅した。本遺伝子の塩基配列を決定した結果、Aureobasidium pullulansの推定オキシゲナーゼ、Pseudomonas aeruginosaのオルニチンＮ５−オキシゲナーゼをコードする遺伝子と相同性を示した。
【００１８】
得られた遺伝子断片の塩基配列をもとに５′方向及び３′方向のプライマーを合成し、Ａ．ｏｒｙｚａｅの鉄制限培養条件下から構築した５′，３′−ＲＡＣＥライブラリーに対してＰＣＲを行った。その結果、得られた部分遺伝子の全長ｃＤＮＡが取得できた。本クローンの全塩基配列を決定した結果、本遺伝子は５０２アミノ酸残基からなる蛋白質をコードしており、１つのイントロンを含んでいた。またAureobasidium pullulansの推定オキシゲナーゼとアミノ酸レベルで４４％の相同性、Pseudomonas aeruginosaのオルニチンＮ５−オキシゲナーゼ蛋白質とアミノ酸レベルで３４％の相同性を有していた。得られた遺伝子をａｓｂ１と命名した。ａｓｂ１の機能を同定するために、本遺伝子の大腸菌での大量発現を試みた。ａｓｂ１の全長ｃＤＮＡをｐＥＴ２３ｂベクター中のＴ７プロモーター下流に挿入した。本プラスミドを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株に形質転換した。得られた形質転換体のＩＰＴＧ誘導培養を行った結果、菌体内に著量のオルニチンＮ５−オキシゲナーゼ活性が確認された。よって、得られたａｓｂ１遺伝子には麹菌のフェリクローム又はそのデフェリ体生合成の律速となるオルニチンＮ５−オキシゲナーゼ蛋白質がコードされていることが明らかとなった。
【００１９】
単離した遺伝子は単独であるいはｍｅｌＯやｇｌａＢ遺伝子プロモーター（特願平１１−１５４２７１、特開平１１−２４３９６５）のような高発現プロモーターと共に、Ａ．ｏｒｙｚａｅにて発現させて、フェリクリシン又はデフェリフェリクリシンの生産を制御しうるものである。遺伝子導入方法は、例えば宿主としてｎｉａＤ変異株を用いる公知方法により、目的遺伝子とマーカー遺伝子であるｎｉａＤ遺伝子を同時に導入する。（Ｅ．Ｓ．Ｕｎｋｌｅら、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，２１８，ｐ．９９−１０４、１９８９）この遺伝子導入の際に、ベクター配列などの異種遺伝子を排除することにより、異種遺伝子を全く含まないセルフクローニング株の形質転換体を得ることができる。ｎｉａＤ変異株（硝酸を資化できない麹菌変異株：Ｎｉｔｒａｔｅ Ｒｅｄｕｃｔａｓｅ欠損株）としては、例えば、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ １０１３−ｎｉａＤ（ＦＥＲＭ Ｐ−１７７０７）を使用することができる。
【００２０】
すなわち、本発明は、麹菌Aspergillus oryzaeのフェリクローム又はそのデフェリ体生産を自由に制御するために、麹菌のフェリクローム又はそのデフェリ体生合成に関与するオルニチンＮ５−オキシゲナーゼ遺伝子を提供するものであり、また、本発明は本遺伝子を含有する組み換えベクターとこの組み換えベクターを含有する形質転換体を提供するものである。本発明は、上記形質転換体を用いるオルニチンＮ５−オキシゲナーゼ蛋白質の麹菌体内での発現を抑制することによって、米麹を用いた固体培養でフェリクロームを生産しない麹菌を提供するものであり、得られた麹菌は、清酒、味噌、醤油、みりんなどの我が国独自の醸造産業へ有利に利用することができる。また、本発明は、該遺伝子の発現を遺伝子工学的手法を用いて高めることによって、あらゆる培養条件下でフェリクローム又はそのデフェリ体を高生産する麹菌を提供するものである。また、こうして生産されたフェリクローム又はそのデフェリ体を鉄キレート剤としての試薬、ならびに貧血の改善効果が期待できる機能性食品への添加に提供することができる。
【００２１】
以下に本発明の詳細について述べる。
【００２２】
まず、鉄制限下でヒドロキシオルニチン類を基本構成アミノ酸とするシデロフォア生産が報告されている微生物の中で、オルニチンＮ５−オキシゲナーゼをコードする遺伝子がクローニングされているものを選択した。現在までにUstilago maydis、Pseudomonas sp. B10, Pseudomonas aeruginosa, Burkholderia cepaciaの４つの株でのクローニングが報告されている。これらの遺伝子のアミノ酸レベルでの相同性を比較した結果、少なくとも３つのアミノ酸配列保存領域を見出した。１つは、Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−（Ａｌａ ｏｒ Ｇｌｙ）−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｓｅｒ（Ｓｅｒ ｏｒ Ａｌａ）−（Ｔｈｒ ｏｒ Ａｌａ）−Ｇｌｕ、もう１つはＧｌｎ−（Ｖａｌ ｏｒ Ｉｌｅ）−Ｓｅｒ（Ｐｒｏ ｏｒ Ｐｈｅ）−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−（Ｔｈｒ ｏｒ Ｓｅｒ）−（Ｌｅｕ ｏｒ Ｍｅｔ）−Ａｒｇ−（Ａｓｐ ｏｒ Ａｓｎ）−Ｐｒｏ、最後にＡｒｇ−（Ａｌａ ｏｒ Ｇｌｙ）−（Ｓｅｒ ｏｒ Ｇｌｙ）−Ａｌａ−Ｌｅｕ−（Ｖａｌ ｏｒ Ｌｙｓ）−Ｐｒｏ−（Ｓｅｒ ｏｒ Ａｌａ）−Ａｓｐ−Ａｓｐ−（Ｔｈｒ ｏｒ Ｓｅｒ）−（Ｇｌｙ ｏｒ Ｐｒｏ）−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ａｓｎである。これら３種類の部分アミノ酸配列をもとに作製した縮重オリゴヌクレオチドプローブを用いて、Ａ．ｏｒｙｚａｅの鉄制限培養条件下から構築した３′−ＲＡＣＥライブラリーに対してＰＣＲを行った結果、約８００ｂｐの遺伝子断片が増幅した。本遺伝子の塩基配列を決定した結果、Aureobasidium pullulansの推定オキシゲナーゼ遺伝子及びPseudomonas aeruginosaのオルニチンＮ５−オキシゲナーゼをコードする遺伝子の順に相同性を示した。
【００２３】
得られた遺伝子断片の塩基配列をもとに５′方向及び３′方向のプライマーを合成し、Ａ．ｏｒｙｚａｅの鉄制限培養条件下から構築した５′，３′−ＲＡＣＥライブラリーに対してＰＣＲを行った。その結果、得られた部分遺伝子の全長ｃＤＮＡが取得できた。本クローンの全塩基配列を決定した結果、本遺伝子は５０２アミノ酸残基からなる蛋白質をコードしていた。またAureobasidium pullulansの推定オキシゲナーゼとアミノ酸レベルで４４％の相同性、Pseudomonas aeruginosaのオルニチンＮ５−オキシゲナーゼ蛋白質とアミノ酸レベル３４％の相同性を有していた。プロモーター領域は配列番号２の１から２３５ｂｐ、コーディング領域は配列番号２の２３６から１８０７ｂｐ、ターミネーター領域は配列番号２の１８０８から２１６８ｂｐまでである。イントロンは、１つ含まれており、配列番号２の１１０８から１１７３ｂｐまでである。得られた遺伝子をａｓｂ１と命名した。
【００２４】
ａｓｂ１の機能を同定するために、本遺伝子の大腸菌での大量発現を試みた。ａｓｂ１の全長ｃＤＮＡをｐＥＴ２３ｂベクター中のＴ７プロモーター下流に挿入した。本プラスミドを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株に形質転換した。得られた形質転換体のＩＰＴＧ誘導培養を行った結果、菌体内に著量のオルニチンＮ５−オキシゲナーゼ活性が確認された。よって、得られたａｓｂ１遺伝子には麹菌のフェリクローム又はそのデフェリ体生合成の律速となるオルニチンＮ５−オキシゲナーゼ蛋白質がコードされていることが明らかとなった。
【００２５】
上記により決定した本発明に係るａｓｂ１遺伝子の塩基配列を配列表の配列番号２（図３、図４）に示し、この塩基配列から推定される蛋白質のアミノ酸配列を配列番号１（図１、図２）に示す。
【００２６】
本発明に係るａｓｂ１遺伝子のＤＮＡを、プラスミドｐＥＴ−２３ｂ（ノバジェン社）に連結し、組換えベクター（ｐＥＡＳ１）を得た。組換えベクターである該連結ＤＮＡを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）（ノバジェン社）に形質転換した。アンピシリン含有培地で培養し、アンピシリン耐性株を選択し、得られた形質転換体をエシェリヒア・コリ（Escherichia coli）ａｓｂ１と命名し、独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センターにＦＥＲＭ Ｐ−１８３６０として寄託した。
【００２７】
以上の結果よりクローニングした遺伝子断片ａｓｂ１には、オルニチンＮ５−オキシゲナーゼがコードされていることが確認できた。またこの遺伝子を用いて、麹菌のフェリクローム又はそのデフェリ体生合成を鉄制限下で高生産あるいは非生産させることが可能であり、用途に応じたフェリクリシン又はデフェリフェリクリシン生産の改変が分子レベルで可能となり、様々な産業分野に応用が可能であることも確認した。
以下、本発明の実施例について述べる。
【００２８】
【実施例１】
オルニチンＮ５−オキシゲナーゼの相同性を利用したａｓｂ１遺伝子クローニング
麹菌Ａ．ｏｒｙｚａｅのフェリクローム又はそのデフェリ体生合成の第１段階を触媒するオルニチンＮ５−オキシゲナーゼの遺伝子クローニングを行うために、既にクローニングが報告される他の微生物由来オルニチンＮ５−オキシゲナーゼのアミノ酸配列保存領域を比較した。現在までにUstilago maydis、Pseudomonas sp. B10, Pseudomonas aeruginosa, Burkholderia cepaciaの４つの株でのクローニングが報告されている。これらの遺伝子のアミノ酸レベルでの相同性を比較した結果、少なくとも３つのアミノ酸配列保存領域を見出した。１つは、▲１▼Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−（Ａｌａ ｏｒ Ｇｌｙ）−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｓｅｒ（Ｓｅｒ ｏｒ Ａｌａ）−（Ｔｈｒ ｏｒ Ａｌａ）−Ｇｌｕ、もう１つは▲２▼Ｇｌｎ−（Ｖａｌ ｏｒ Ｉｌｅ）−Ｓｅｒ（Ｐｒｏ ｏｒ Ｐｈｅ）−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−（Ｔｈｒ ｏｒ Ｓｅｒ）−（Ｌｅｕ ｏｒ Ｍｅｔ）−Ａｒｇ−（Ａｓｐ ｏｒ Ａｓｎ）−Ｐｒｏ、最後に▲３▼Ａｒｇ−（Ａｌａ ｏｒ Ｇｌｙ）−（Ｓｅｒ ｏｒ Ｇｌｙ）−Ａｌａ−Ｌｅｕ−（Ｖａｌ ｏｒ Ｌｙｓ）−Ｐｒｏ−（Ｓｅｒ ｏｒ Ａｌａ）−Ａｓｐ−Ａｓｐ−（Ｔｈｒ ｏｒ Ｓｅｒ）−（Ｇｌｙ ｏｒ Ｐｒｏ）−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ａｓｎである。
【００２９】
領域▲１▼のアミノ酸配列は、配列番号３（図５）に示す。同配列において、第１番目のＸａａはＡｌａ又はＧｌｙ、第２番目のＸａａはＳｅｒ又はＡｌａ、第３番目のＸａａはＴｈｒ又はＡｌａを表わす。領域▲２▼のアミノ酸配列は、配列番号４（図６）に示す。同配列において、第１番目のＸａａはＶａｌ又はＩｌｅ、第２番目のＸａａはＰｒｏ又はＰｈｅ、第３番目のＸａａはＴｈｒ又はＳｅｒ、第４番目のＸａａはＬｅｕ又はＭｅｔ、第５番目のＸａａはＡｓｐ又はＡｓｎを表わす。領域▲３▼のアミノ酸配列は、配列番号５（図７）に示す。同配列において、第１番目のＸａａはＡｌａ又はＧｌｙ、第２番目のＸａａはＳｅｒ又はＧｌｙ、第３番目のＸａａはＶａｌ又はＬｙｓ、第４番目のＸａａはＳｅｒ又はＡｌａ、第５番目のＸａａはＴｈｒ又はＳｅｒ、第６番目のＸａａはＧｌｙ又はＰｒｏを表わす。
【００３０】
上記配列▲１▼、▲２▼、▲３▼をもとに、３本の縮重オリゴヌクレオチドプライマーＰ１、Ｐ２、Ｐ３を合成した。プライマーＰ１の塩基配列を配列番号６（図８）に示し、プライマーＰ２の塩基配列を配列番号７（図９）に示し、プライマーＰ３の塩基配列を配列番号８（図１０）に示す。これらの配列において、ｎ（図中Ｉ）はデオキシイノシン残基、ｓはＧ又はＣ、ｒはＧ又はＡ、ｗはＡ又はＴ若しくはＵ、ｙはＴ若しくはＵ又はＣのＩＵＢコードによる縮重塩基を表わす。
【００３１】
また、同時に、３０℃、４日間鉄制限培地（２％グルコース、０．６％アスパラギン、０．１％リン酸１水素２カリウム、０．１％硫酸マグネシウム、０．０４％塩化カルシウム、ｐＨ６．０）で液体培養した麹菌Ａ．ｏｒｙｚａｅからニッポンジーン社ＩＳＯＧＥＮを利用して全ＲＮＡを抽出した。その全ＲＮＡから宝酒造Ｏｌｉｇｏｔｅｘ−ｄＴ３０＜Ｓｕｐｅｒ＞ｍＲＮＡ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔを用いてｍＲＮＡを抽出した。得られたｍＲＮＡ０．５μｇをもとにクローンテック社のＭａｒａｔｈｏｎ ｃＤＮＡ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔにより５′−及び３′−に対応したＲＡＣＥのライブラリーを構築した。上記縮重プライマーとＭａｒａｔｈｏｎ ｃＤＮＡ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ付属のＡＰＩプライマー（その塩基配列を配列番号９（図１１）に示す）を用いて、Ａ．ｏｒｙｚａｅのＲＡＣＥライブラリーに対して３′−ＲＡＣＥのＰＣＲ反応を行った。
【００３２】
ＰＣＲ反応条件は、次のとおりである。
ＰＣＲ条件
・９５℃（１分）、１サイクル
・９４℃（５秒）、７２℃（３分）、７サイクル
・９４℃（５秒）、６７℃（３分）、３２サイクル
・６７℃（４分）、１サイクル
【００３３】
反応液をアガロースゲル電気泳動で解析を行った結果、Ｐ３プライマーを用いたものについてのみ約８００ｂｐのフラグメントの増幅が認められた。本遺伝子増幅産物の塩基配列を決定した結果、確かに上記Ｐ３配列と３′末端のポリＡ付加配列を含んでおり、相同性を検索した結果、Aureobasidium pullulansの推定オキシゲナーゼ及びPseudomonas aeruginosaのオルニチンＮ５−オキシゲナーゼをコードする遺伝子の順に相同性を示した。
【００３４】
【実施例２】
ａｓｂ１の全塩基配列の決定と相同性検索
上記から得られた部分遺伝子の塩基配列をもとに５′−ＲＡＣＥ用、３′−ＲＡＣＥ用にプライマーＰ４、Ｐ５を合成した。プライマーＰ４の塩基配列を配列番号１０（図１２）に示し、プライマーＰ５の塩基配列を配列番号１１（図１３）に示した。
【００３５】
上記Ｐ４、Ｐ５プライマーと、Ｍａｒａｔｈｏｎ ｃＤＮＡ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ付属のＡＰＩプライマー（配列番号９（図１１））を用いて、Ａ．ｏｒｙｚａｅのＲＡＣＥのライブラリーに対して、５′−ＲＡＣＥ、３′−ＲＡＣＥのＰＣＲ反応を行った。
【００３６】
ＰＣＲ反応条件は、次のとおりである。
ＰＣＲ条件
・９５℃（１分）、１サイクル
・９４℃（５秒）、７２℃（３分）、７サイクル
・９４℃（５秒）、６７℃（３分）、３２サイクル
・６７℃（４分）、１サイクル
【００３７】
増幅されたバンドを切り出し、ｃＤＮＡの全塩基配列をジデオキシ法を用いて決定した。その結果、本遺伝子は５０２アミノ酸残基からなることが明らかとなった。プロモーター領域は配列番号２の１から２３５ｂｐ、コーディング領域は配列番号２の２３６から１８０７ｂｐ、ターミネーター領域は配列番号２の１８０８から２１６８ｂｐまでである。イントロンは、１つ含まれており、配列番号２の１１０８から１１７３ｂｐまでである。またAureobasidium pullulansの推定オキシゲナーゼとアミノ酸レベルで４４％相同性、Pseudomonas aeruginosaのオルニチンＮ５−オキシゲナーゼ蛋白質とアミノ酸レベルで３４％の相同性を有していた。得られた遺伝子をａｓｂ１と命名した。その塩基配列を配列番号２（図３、４）に示し、対応するアミノ酸配列を配列番号１（図１、２）に示した。
【００３８】
【実施例３】
ａｓｂ１遺伝子の大腸菌での大量発現と酵素アッセイ
ａｓｂ１遺伝子の機能を同定するために、本遺伝子の大腸菌での大量発現を行った。ａｓｂ１の全長ｃＤＮＡ領域（配列番号２の２３６から１８０７ｂｐ）をＰＣＲで増幅した。その際、Ｎ末端側にＮｄｅＩ、Ｃ末端側にＸｈｏＩ部位を導入した。本断片をノパジェン社ｐＥＴ−２３ｂベクターのＮｄｅＩ−ＸｈｏＩ部位へＴ７プロモーターと正方向にサブクローニングした。本プラスミドａｓｂ１大腸菌高発現プラスミドｐＥＡＳ１（図１４）とした。本プラスミドをノパジェン社大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）へ形質転換後、アンピシリン耐性を示す形質転換体を選択した。得られた形質転換体をＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ａｓｂ１と命名し、これを特許生物寄託センターにＦＥＲＭ Ｐ−１８３６０として寄託した。
【００３９】
得られた形質転換体を３７℃でＯＤ０．６までＬＢ培地で培養後、最後１ｍＭＩＰＴＧを加えてさらに３０℃で３時間培養した。得られた大腸菌の菌体内蛋白質を１００ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ６）で抽出後、上清に１ｍＭピルビン酸ナトリウム、２ｍＭ Ｌ−オルニチンを加え、３７℃で好気的に約２時間インキュベートした。１０％トリクロロ酢酸で反応停止後、遠心上清中のヒドロキシアミンをヨード酸化法（GillamらAnal. Chem., 5:841-844, 1981)に従って定量した。比活性は１分当たりに１ｎｍｏｌのヒドロキシアミンを産生する酵素量を１ｕｎｉｔとして、菌体蛋白質ｍｇあたりの生産量を算出し、表１に結果を示した。
【００４０】
【００４１】
表１に示したように、対照株と比較して有意なオルニチンＮ５−オキシゲナーゼ活性が認められた。よって、ａｓｂ１がフェリクローム又はそのデフェリ体生合成の第１段階を触媒するオルニチンＮ５−オキシゲナーゼをコードすることが明らかとなった。
【００４２】
【発明の効果】
本発明により、クローニングした遺伝子断片ａｓｂ１には、フェリクローム又はそのデフェリ体生合成の第１段階を触媒するオルニチンＮ５−オキシゲナーゼがコードされていることが確認できた。また、この遺伝子を含有する形質転換体エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）ａｓｂ１はＦＥＲＭ Ｐ−１８３６０として特許生物寄託センターに寄託されているので、ａｓｂ１遺伝子を保持するプラスミドを抽出することにより適宜取得することができる。このように、本菌株は、Escherichia coli BL21(DE3)を宿主として、プラスミドｐＥＴ−２３ｂに麹菌Aspergillus oryzaeのオルニチンＮ５−オキシゲナーゼをコードする遺伝子ａｓｂ１を挿入したプラスミドを含有している。本プラスミドはａｓｂ１遺伝子を用いた種々の応用へ遺伝子を供給できる。
【００４３】
したがって、このプラスミドからａｓｂ１遺伝子を単離し、麹菌高発現プロモーター下流に接続した大腸菌形質転換プラスミドを用いて、麹菌をエレクトロポレーション法、プロトプラスト−ポリエチレングリコール法等常法にしたがって形質転換してフェリクリシン又はデフェリフェリクリシン高生産株を得ることができ、フェリクリシン又はデフェリフェリクリシンを大量生産することが可能となり、また、ａｓｂ１遺伝子を破壊することによってフェリクリシン又はデフェリフェリクリシンの生産を抑制ないし防止した形質転換麹菌を得ることができ、例えば、清酒醸造において着色を抑制し、品質の劣化防止に利用することができる。
【００４４】
このように、この遺伝子を用いて、麹菌のフェリクローム又はそのデフェリ体生合成を鉄制限下で高生産あるいは非生産させることが可能であり、用途に応じたフェリクローム又はそのデフェリ体生産の改変が分子レベルで可能となり、様々な産業分野に応用が可能であることも確認した。
【００４５】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】オルニチンＮ５−オキシゲナーゼ蛋白質のアミノ酸配列を示す。
【図２】同上続きを示す。
【図３】本オルニチンＮ５−オキシゲナーゼ遺伝子の塩基配列を示す。
【図４】同上続きを示す。
【図５】保存領域▲１▼のアミノ酸配列を示す。
【図６】保存領域▲２▼のアミノ酸配列を示す。
【図７】保存領域▲３▼のアミノ酸配列を示す。
【図８】プライマーＰ１を示す。配列中、Ｉはデオキシイノシン残基、ＳはＧ又はＣ、ＷはＡ又はＴ若しくはＵ、ＲはＡ又はＧを示す。
【図９】プライマーＰ２を示す。配列中、Ｉはデオキシイノシン残基、ＹはＴ若しくはＵ又はＣ、ＲはＡ又はＧ、ＷはＡ又はＴ若しくはＵ、ＳはＧ又はＣ、をそれぞれ示す。
【図１０】プライマーＰ３を示す。配列中、Ｉはデオキシイノシン残基、ＳはＧ又はＣ、ＹはＴ若しくはＵ又はＣ、ＲはＡ又はＧ、ＷはＡ又はＴ若しくはＵ、をそれぞれ示す。
【図１１】ＡＰＩプライマーを示す。
【図１２】プライマーＰ４を示す。
【図１３】プライマーＰ５を示す。
【図１４】ａｓｂ１遺伝子の大腸菌発現プラスミドｐＥＡＳ１の制限酵素地図を示す。
【発明の属する技術分野】
本発明は、麹菌のフェリクローム又はそのデフェリ体生合成に関与するオルニチンＮ５−オキシゲナーゼ蛋白質、該蛋白質をコードする遺伝子、該遺伝子を含有する組み換えベクター、該組み換えベクターを含有する形質転換体、該遺伝子を含有する組み換え麹菌、該形質転換体を用いるオルニチンＮ５−オキシゲナーゼ蛋白質を生産させることによってフェリクローム又はそのデフェリ体高生産麹菌を育種する方法、蛋白質の発現を麹菌菌体内で抑制させフェリクローム又はそのデフェリ体非生産麹菌を育種する方法に関するものである。
【０００２】
フェリクローム又はそのデフェリ体は、糸状菌が生産する鉄イオンキレート物質（シデロフォア）の１種であって、その中で麹菌はフェリクリシン又はデフェリフェリクリシンと呼ばれるフェリクローム又はそのデフェリ体を生産する。本発明によれば、このフェリクローム又はそのデフェリ体生合成に必須なオルニチンＮ５−オキシゲナーゼ蛋白質をコードする遺伝子のＤＮＡ配列が明らかにされて、本蛋白質をコードする遺伝子の発現をその抑制を含めて自由に操作することがはじめて可能となり、フェリクリシン又はデフェリフェリクリシン（麹菌等の糸状菌においてフェリクローム又はそのデフェリ体の主成分をなす）の生合成を多くしたり、少なくしたり、あるいはそれを停止したり、自由にコントロールすることをはじめて可能ならしたものである。
【０００３】
【従来の技術】
鉄イオンは一部の乳酸菌を除く、ほとんどすべての生物にとって必須の原子である。鉄は、生体内ではＦｅ（II）やＦｅ（III）の形態で利用され、主に酸化還元に関与する酵素群の補欠因子として機能する。しかしながら、一般的に鉄は自然界において鉄鉱石として存在し、可溶化されたイオン状態としてはほとんど存在しない。さらに鉄鉱石から微生物の働きにより可溶化された鉄イオンも、すぐに不溶性の酸化物や水酸化物となるため、生物が利用できる鉄イオンはきわめて微量である。細菌や放線菌、真核微生物はこのような微量な鉄イオンを効率的に獲得するために、シデロフォアと呼ばれる分子量１５００以下の低分子の鉄イオンキレート物質を生産する。このシデロフォアに鉄イオンをキレートすることにより、貴重な鉄イオンの不溶化を防ぎ、鉄イオンを優先的に利用することを図っている。また鉄イオンは生物にとって必須のイオンであるが、過剰に存在すると遊離のラジカルの発生を促し、逆に生体に危害を加える。シデロフォアは鉄イオンの獲得と同時に、このような鉄イオンの無害化にも大きく寄与している。シデロフォアは非キレート状態では無色であるが、鉄イオンをキレートすると、赤色を示し、可視光の吸収を示すことが知られている。
【０００４】
現在までに様々なシデロフォアが同定されているが、糸状菌が生産するシデロフォアはhydroxamates familyと呼ばれ、一般に構成アミノ酸誘導体としてＮ−ヒドロキシオルニチンを含む。研究用モデル糸状菌、工業用微生物、病原性糸状菌として幅広く研究が進められているアスペルギルス属糸状菌はhydroxamates familyの中でもフェリクローム類とフザリニン類と呼ばれるシデロフォアを生産する。前者は、Ｎ−ヒドロキシオルニチンのトリペプチドにグリシン、セリン、アラニンが環状ペプチドを形成している。一方、後者では一部のＮ−ヒドロキシオルニチンのＮ位が無水メバロン酸によってアシル化されている特徴を有する。糸状菌はこのような多種多様なシデロフォアを生産することにより、鉄イオンを優先的に獲得し、自然界での生存競争に活用しているものと考えられる。
【０００５】
一方、清酒醸造では、アスペルギルス・オリゼを蒸米上に生育させて「麹」を作成し、清酒醸造の原料として利用している。この麹造りにおいてアスペルギルス・オリゼが大量のフェリクローム類（中でも主成分はフェリクリシン又はデフェリフェリクリシン）を生産し、これが酒造用水の鉄イオンをキレートし、清酒が着色することが知られている。従って、清酒醸造においては、シデロフォアであるフェリクローム類が、品質劣化の原因であり、できるだけフェリクローム類を生産しない菌株の育種が進められてきた。
【０００６】
このように、麹菌（Ａ．ｏｒｙｚａｅ）はフェリクローム類を大量に生産することが古くから知られているが、その生合成系に関しては、ほとんど明らかになっていない。現在でも、フェリクローム又はそのデフェリ体低生産菌の育種は主に、スクリーニング法や変異法に頼らざるを得ない。また近年このシデロフォアの鉄キレート力は、貧血症の医薬としても利用されるようになっている。麹菌が産生するフェリクリシン又はデフェリフェリクリシンも鉄イオン結合能力については非常に優れているが、その生産性の向上が困難で工業レベルでの生産の対象とはなっていない。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明者らは、このような現状に鑑み、もしフェリクローム類の生合成遺伝子が同定されれば、麹菌（アスペルギルス・オリゼ：Aspergillus oryzae）によるフェリクローム類の生産を自由に調節する可能性がある点に着目した。
【０００８】
すなわち、清酒醸造においては、フェリクローム又はそのデフェリ体生合成に関与する遺伝子の発現が抑制できれば、全くフェリクローム又はそのデフェリ体を生産しない株が育種できる。また医薬品製造において、フェリクリシン又はデフェリフェリクリシン生合成に関与する遺伝子の発現をより活発に誘導させることにより、大量のフェリクリシン又はデフェリフェリクリシン生産が可能となる。さらに麹菌が生産するフェリクローム又はそのデフェリ体は清酒や酒粕として長年摂取されており、極めて安全性の高い物質である。麹菌によりフェリクローム又はそのデフェリ体が大量に生産できれば、医薬品から食品まで幅広い応用が可能となる点に着目した。
【０００９】
このように、麹菌のフェリクローム又はそのデフェリ体生産についてはさまざまな分野に応用が期待されるが、その生合成遺伝子が未解明なため、いまだに効率的な活用がなされていないのが現状である。
【００１０】
本発明は、このような現状に鑑みてなされたものであって、先ずはじめに麹菌について検討を行った。
【００１１】
麹菌Ａ．ｏｒｙｚａｅは清酒、醤油、味噌などの我が国の伝統的酵素産業で使用されてきた糸状菌である。本菌株の特徴は、上記発酵産業で有用な蛋白質や低分子成分を非常に大量に生産することである。本菌株が持つ高い蛋白質生産能と醸造微生物としての安全性から、異種蛋白質生産の宿主として注目されている（Biotechnology, 6, 1419 (1988)、特開昭６２−２７２９８８）。本発明者らの研究から、Ａ．ｏｒｙｚａｅを用いた異種蛋白質生産においては、アスペルギルス属などの近種の遺伝子であれば、その生産能はさらに増大することが認められた。特に、Ａ．ｏｒｙｚａｅの遺伝子を、Ａ．ｏｒｙｚａｅの高発現プロモーター制御下で発現させた場合、非常に大量の蛋白質が生産されることを見出した（特開平１１−１５４２７１，特願２０００−３６７５４）。
【００１２】
また、Ａ．ｏｒｙｚａｅは、上記のような蛋白質、酵素のみならず、産業的にも非常に貴重な低分子成分の生産も報告されている。中でも麹菌が固体培養で生産するフェリクローム又はそのデフェリ体は、近年、貧血などの鉄欠乏症用の機能性成分としても非常に注目されている物質である。
【００１３】
この麹菌のフェリクローム又はそのデフェリ体を医薬・食品に利用するためには、生産性をさらに向上させる必要があるが、変異法などの既存の菌株育種方法では、工業生産レベルにまで生産性が向上した変異株の取得はできなかった。そこで、広範な検討を行った結果、フェリクローム又はそのデフェリ体生合成に関与する遺伝子を単離し、これらの遺伝子の発現能を強化することによりフェリクローム又はそのデフェリ体の大量生産が可能であるとの着想を得、各方面から鋭意検討の結果、これらの遺伝子の中から麹菌のオルニチンＮ５−オキシゲナーゼにはじめて着目した。また、遺伝子を導入する場合、Ａ．ｏｒｙｚａｅ以外の異種ＤＮＡが混入しない方法を用いれば、セルフクローニング株となり組換え微生物の規制からも除外される点にも着目した。
【００１４】
麹菌におけるフェリクローム又はそのデフェリ体生合成経路については不明であるが、他の糸状菌のフェリクローム類の生合成経路から、その生合成の律速段階はオルニチンＮ５−オキシゲナーゼによるオルニチンの酸化であると推測される。そこでこの、オルニチンＮ５−オキシゲナーゼの遺伝子が取得できれば、フェリクロームの生産を自由に制御できる遺伝子組み換え麹菌を育種でき、フェリクロームの工業生産が可能になると考えた。以下は麹菌が生産するフェリクローム類の中でも、最も含有量の多いフェリクリシン又はデフェリフェリクリシンの生産を中心に記述するが、本発明は全てのフェリクローム類に応用が可能な技術であり、フェリクリシン又はデフェリフェリクリシンだけに限定するものではない。
【００１５】
我々は、清酒醸造において清酒の着色を起こす鉄イオンキレート低分子フェリクリシンを貧血改善用の機能性成分などとして大量生産させるために、フェリクローム又はそのデフェリ体生合成に関与するオルニチンＮ５−オキシゲナーゼ蛋白質の遺伝子クローニングを行い、フェリクリシン又はデフェリフェリクリシンの工業生産に適した遺伝子組み換え麹菌を育種することを試み、鋭意研究の結果、遂に本発明の完成に至った。
【００１６】
近年、フェリクリシン又はデフェリフェリクリシンなどシデロフォア生合成系の遺伝子については、トウモロコシの病原菌であるUstilago maydisにおいてその詳細な合成メカニズムが検討されてきた。生合成の第一反応であるオルニチンの酸化を触媒するオルニチンＮ５−オキシゲナーゼが生合成の律速となり、これをコードする遺伝子ｓｉｄ１がクローニングされた。ｓｉｄ１などのシデロフォア生合成酵素遺伝子群の発現は、鉄が存在する環境下では発現が抑制され、鉄制限下ではその発現が開始される。このようなヒドロキシオルニチンを含むシデロフォアの生合成に必須なオルニチンＮ５−オキシゲナーゼをコードする遺伝子は、Ustilago maydis, Pseudomonas sp. B10, Pseudomonas aeruginosa, Burkholderia cepacia由来のものがクローニングされている。そこでこれらのシデロフォア生合成に関与するオルニチンＮ５−オキシゲナーゼ蛋白質の相同性から、麹菌におけるオルニチンＮ５−オキシゲナーゼ活性を担う遺伝子が取得できると考えた。
【００１７】
現在までに遺伝子が単離されたUstilago maydis, Pseudomonas sp. B10, Pseudomonas aeruginosa, Burkholderia cepaciaのオルニチンＮ５−オキシゲナーゼ蛋白質のアミノ酸レベルでの相同性を比較した結果、非常に保存性の高い３つの領域を見いだした。この領域それぞれに対応する縮重合成プライマーを設計した。本プライマーを用いてＡ．ｏｒｙｚａｅの鉄制限培養条件下から構築した３′−ＲＡＣＥライブラリーに対してＰＣＲを行った結果、約８００ｂｐの遺伝子断片が増幅した。本遺伝子の塩基配列を決定した結果、Aureobasidium pullulansの推定オキシゲナーゼ、Pseudomonas aeruginosaのオルニチンＮ５−オキシゲナーゼをコードする遺伝子と相同性を示した。
【００１８】
得られた遺伝子断片の塩基配列をもとに５′方向及び３′方向のプライマーを合成し、Ａ．ｏｒｙｚａｅの鉄制限培養条件下から構築した５′，３′−ＲＡＣＥライブラリーに対してＰＣＲを行った。その結果、得られた部分遺伝子の全長ｃＤＮＡが取得できた。本クローンの全塩基配列を決定した結果、本遺伝子は５０２アミノ酸残基からなる蛋白質をコードしており、１つのイントロンを含んでいた。またAureobasidium pullulansの推定オキシゲナーゼとアミノ酸レベルで４４％の相同性、Pseudomonas aeruginosaのオルニチンＮ５−オキシゲナーゼ蛋白質とアミノ酸レベルで３４％の相同性を有していた。得られた遺伝子をａｓｂ１と命名した。ａｓｂ１の機能を同定するために、本遺伝子の大腸菌での大量発現を試みた。ａｓｂ１の全長ｃＤＮＡをｐＥＴ２３ｂベクター中のＴ７プロモーター下流に挿入した。本プラスミドを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株に形質転換した。得られた形質転換体のＩＰＴＧ誘導培養を行った結果、菌体内に著量のオルニチンＮ５−オキシゲナーゼ活性が確認された。よって、得られたａｓｂ１遺伝子には麹菌のフェリクローム又はそのデフェリ体生合成の律速となるオルニチンＮ５−オキシゲナーゼ蛋白質がコードされていることが明らかとなった。
【００１９】
単離した遺伝子は単独であるいはｍｅｌＯやｇｌａＢ遺伝子プロモーター（特願平１１−１５４２７１、特開平１１−２４３９６５）のような高発現プロモーターと共に、Ａ．ｏｒｙｚａｅにて発現させて、フェリクリシン又はデフェリフェリクリシンの生産を制御しうるものである。遺伝子導入方法は、例えば宿主としてｎｉａＤ変異株を用いる公知方法により、目的遺伝子とマーカー遺伝子であるｎｉａＤ遺伝子を同時に導入する。（Ｅ．Ｓ．Ｕｎｋｌｅら、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，２１８，ｐ．９９−１０４、１９８９）この遺伝子導入の際に、ベクター配列などの異種遺伝子を排除することにより、異種遺伝子を全く含まないセルフクローニング株の形質転換体を得ることができる。ｎｉａＤ変異株（硝酸を資化できない麹菌変異株：Ｎｉｔｒａｔｅ Ｒｅｄｕｃｔａｓｅ欠損株）としては、例えば、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ １０１３−ｎｉａＤ（ＦＥＲＭ Ｐ−１７７０７）を使用することができる。
【００２０】
すなわち、本発明は、麹菌Aspergillus oryzaeのフェリクローム又はそのデフェリ体生産を自由に制御するために、麹菌のフェリクローム又はそのデフェリ体生合成に関与するオルニチンＮ５−オキシゲナーゼ遺伝子を提供するものであり、また、本発明は本遺伝子を含有する組み換えベクターとこの組み換えベクターを含有する形質転換体を提供するものである。本発明は、上記形質転換体を用いるオルニチンＮ５−オキシゲナーゼ蛋白質の麹菌体内での発現を抑制することによって、米麹を用いた固体培養でフェリクロームを生産しない麹菌を提供するものであり、得られた麹菌は、清酒、味噌、醤油、みりんなどの我が国独自の醸造産業へ有利に利用することができる。また、本発明は、該遺伝子の発現を遺伝子工学的手法を用いて高めることによって、あらゆる培養条件下でフェリクローム又はそのデフェリ体を高生産する麹菌を提供するものである。また、こうして生産されたフェリクローム又はそのデフェリ体を鉄キレート剤としての試薬、ならびに貧血の改善効果が期待できる機能性食品への添加に提供することができる。
【００２１】
以下に本発明の詳細について述べる。
【００２２】
まず、鉄制限下でヒドロキシオルニチン類を基本構成アミノ酸とするシデロフォア生産が報告されている微生物の中で、オルニチンＮ５−オキシゲナーゼをコードする遺伝子がクローニングされているものを選択した。現在までにUstilago maydis、Pseudomonas sp. B10, Pseudomonas aeruginosa, Burkholderia cepaciaの４つの株でのクローニングが報告されている。これらの遺伝子のアミノ酸レベルでの相同性を比較した結果、少なくとも３つのアミノ酸配列保存領域を見出した。１つは、Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−（Ａｌａ ｏｒ Ｇｌｙ）−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｓｅｒ（Ｓｅｒ ｏｒ Ａｌａ）−（Ｔｈｒ ｏｒ Ａｌａ）−Ｇｌｕ、もう１つはＧｌｎ−（Ｖａｌ ｏｒ Ｉｌｅ）−Ｓｅｒ（Ｐｒｏ ｏｒ Ｐｈｅ）−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−（Ｔｈｒ ｏｒ Ｓｅｒ）−（Ｌｅｕ ｏｒ Ｍｅｔ）−Ａｒｇ−（Ａｓｐ ｏｒ Ａｓｎ）−Ｐｒｏ、最後にＡｒｇ−（Ａｌａ ｏｒ Ｇｌｙ）−（Ｓｅｒ ｏｒ Ｇｌｙ）−Ａｌａ−Ｌｅｕ−（Ｖａｌ ｏｒ Ｌｙｓ）−Ｐｒｏ−（Ｓｅｒ ｏｒ Ａｌａ）−Ａｓｐ−Ａｓｐ−（Ｔｈｒ ｏｒ Ｓｅｒ）−（Ｇｌｙ ｏｒ Ｐｒｏ）−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ａｓｎである。これら３種類の部分アミノ酸配列をもとに作製した縮重オリゴヌクレオチドプローブを用いて、Ａ．ｏｒｙｚａｅの鉄制限培養条件下から構築した３′−ＲＡＣＥライブラリーに対してＰＣＲを行った結果、約８００ｂｐの遺伝子断片が増幅した。本遺伝子の塩基配列を決定した結果、Aureobasidium pullulansの推定オキシゲナーゼ遺伝子及びPseudomonas aeruginosaのオルニチンＮ５−オキシゲナーゼをコードする遺伝子の順に相同性を示した。
【００２３】
得られた遺伝子断片の塩基配列をもとに５′方向及び３′方向のプライマーを合成し、Ａ．ｏｒｙｚａｅの鉄制限培養条件下から構築した５′，３′−ＲＡＣＥライブラリーに対してＰＣＲを行った。その結果、得られた部分遺伝子の全長ｃＤＮＡが取得できた。本クローンの全塩基配列を決定した結果、本遺伝子は５０２アミノ酸残基からなる蛋白質をコードしていた。またAureobasidium pullulansの推定オキシゲナーゼとアミノ酸レベルで４４％の相同性、Pseudomonas aeruginosaのオルニチンＮ５−オキシゲナーゼ蛋白質とアミノ酸レベル３４％の相同性を有していた。プロモーター領域は配列番号２の１から２３５ｂｐ、コーディング領域は配列番号２の２３６から１８０７ｂｐ、ターミネーター領域は配列番号２の１８０８から２１６８ｂｐまでである。イントロンは、１つ含まれており、配列番号２の１１０８から１１７３ｂｐまでである。得られた遺伝子をａｓｂ１と命名した。
【００２４】
ａｓｂ１の機能を同定するために、本遺伝子の大腸菌での大量発現を試みた。ａｓｂ１の全長ｃＤＮＡをｐＥＴ２３ｂベクター中のＴ７プロモーター下流に挿入した。本プラスミドを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株に形質転換した。得られた形質転換体のＩＰＴＧ誘導培養を行った結果、菌体内に著量のオルニチンＮ５−オキシゲナーゼ活性が確認された。よって、得られたａｓｂ１遺伝子には麹菌のフェリクローム又はそのデフェリ体生合成の律速となるオルニチンＮ５−オキシゲナーゼ蛋白質がコードされていることが明らかとなった。
【００２５】
上記により決定した本発明に係るａｓｂ１遺伝子の塩基配列を配列表の配列番号２（図３、図４）に示し、この塩基配列から推定される蛋白質のアミノ酸配列を配列番号１（図１、図２）に示す。
【００２６】
本発明に係るａｓｂ１遺伝子のＤＮＡを、プラスミドｐＥＴ−２３ｂ（ノバジェン社）に連結し、組換えベクター（ｐＥＡＳ１）を得た。組換えベクターである該連結ＤＮＡを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）（ノバジェン社）に形質転換した。アンピシリン含有培地で培養し、アンピシリン耐性株を選択し、得られた形質転換体をエシェリヒア・コリ（Escherichia coli）ａｓｂ１と命名し、独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センターにＦＥＲＭ Ｐ−１８３６０として寄託した。
【００２７】
以上の結果よりクローニングした遺伝子断片ａｓｂ１には、オルニチンＮ５−オキシゲナーゼがコードされていることが確認できた。またこの遺伝子を用いて、麹菌のフェリクローム又はそのデフェリ体生合成を鉄制限下で高生産あるいは非生産させることが可能であり、用途に応じたフェリクリシン又はデフェリフェリクリシン生産の改変が分子レベルで可能となり、様々な産業分野に応用が可能であることも確認した。
以下、本発明の実施例について述べる。
【００２８】
【実施例１】
オルニチンＮ５−オキシゲナーゼの相同性を利用したａｓｂ１遺伝子クローニング
麹菌Ａ．ｏｒｙｚａｅのフェリクローム又はそのデフェリ体生合成の第１段階を触媒するオルニチンＮ５−オキシゲナーゼの遺伝子クローニングを行うために、既にクローニングが報告される他の微生物由来オルニチンＮ５−オキシゲナーゼのアミノ酸配列保存領域を比較した。現在までにUstilago maydis、Pseudomonas sp. B10, Pseudomonas aeruginosa, Burkholderia cepaciaの４つの株でのクローニングが報告されている。これらの遺伝子のアミノ酸レベルでの相同性を比較した結果、少なくとも３つのアミノ酸配列保存領域を見出した。１つは、▲１▼Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−（Ａｌａ ｏｒ Ｇｌｙ）−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｓｅｒ（Ｓｅｒ ｏｒ Ａｌａ）−（Ｔｈｒ ｏｒ Ａｌａ）−Ｇｌｕ、もう１つは▲２▼Ｇｌｎ−（Ｖａｌ ｏｒ Ｉｌｅ）−Ｓｅｒ（Ｐｒｏ ｏｒ Ｐｈｅ）−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−（Ｔｈｒ ｏｒ Ｓｅｒ）−（Ｌｅｕ ｏｒ Ｍｅｔ）−Ａｒｇ−（Ａｓｐ ｏｒ Ａｓｎ）−Ｐｒｏ、最後に▲３▼Ａｒｇ−（Ａｌａ ｏｒ Ｇｌｙ）−（Ｓｅｒ ｏｒ Ｇｌｙ）−Ａｌａ−Ｌｅｕ−（Ｖａｌ ｏｒ Ｌｙｓ）−Ｐｒｏ−（Ｓｅｒ ｏｒ Ａｌａ）−Ａｓｐ−Ａｓｐ−（Ｔｈｒ ｏｒ Ｓｅｒ）−（Ｇｌｙ ｏｒ Ｐｒｏ）−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ａｓｎである。
【００２９】
領域▲１▼のアミノ酸配列は、配列番号３（図５）に示す。同配列において、第１番目のＸａａはＡｌａ又はＧｌｙ、第２番目のＸａａはＳｅｒ又はＡｌａ、第３番目のＸａａはＴｈｒ又はＡｌａを表わす。領域▲２▼のアミノ酸配列は、配列番号４（図６）に示す。同配列において、第１番目のＸａａはＶａｌ又はＩｌｅ、第２番目のＸａａはＰｒｏ又はＰｈｅ、第３番目のＸａａはＴｈｒ又はＳｅｒ、第４番目のＸａａはＬｅｕ又はＭｅｔ、第５番目のＸａａはＡｓｐ又はＡｓｎを表わす。領域▲３▼のアミノ酸配列は、配列番号５（図７）に示す。同配列において、第１番目のＸａａはＡｌａ又はＧｌｙ、第２番目のＸａａはＳｅｒ又はＧｌｙ、第３番目のＸａａはＶａｌ又はＬｙｓ、第４番目のＸａａはＳｅｒ又はＡｌａ、第５番目のＸａａはＴｈｒ又はＳｅｒ、第６番目のＸａａはＧｌｙ又はＰｒｏを表わす。
【００３０】
上記配列▲１▼、▲２▼、▲３▼をもとに、３本の縮重オリゴヌクレオチドプライマーＰ１、Ｐ２、Ｐ３を合成した。プライマーＰ１の塩基配列を配列番号６（図８）に示し、プライマーＰ２の塩基配列を配列番号７（図９）に示し、プライマーＰ３の塩基配列を配列番号８（図１０）に示す。これらの配列において、ｎ（図中Ｉ）はデオキシイノシン残基、ｓはＧ又はＣ、ｒはＧ又はＡ、ｗはＡ又はＴ若しくはＵ、ｙはＴ若しくはＵ又はＣのＩＵＢコードによる縮重塩基を表わす。
【００３１】
また、同時に、３０℃、４日間鉄制限培地（２％グルコース、０．６％アスパラギン、０．１％リン酸１水素２カリウム、０．１％硫酸マグネシウム、０．０４％塩化カルシウム、ｐＨ６．０）で液体培養した麹菌Ａ．ｏｒｙｚａｅからニッポンジーン社ＩＳＯＧＥＮを利用して全ＲＮＡを抽出した。その全ＲＮＡから宝酒造Ｏｌｉｇｏｔｅｘ−ｄＴ３０＜Ｓｕｐｅｒ＞ｍＲＮＡ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔを用いてｍＲＮＡを抽出した。得られたｍＲＮＡ０．５μｇをもとにクローンテック社のＭａｒａｔｈｏｎ ｃＤＮＡ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔにより５′−及び３′−に対応したＲＡＣＥのライブラリーを構築した。上記縮重プライマーとＭａｒａｔｈｏｎ ｃＤＮＡ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ付属のＡＰＩプライマー（その塩基配列を配列番号９（図１１）に示す）を用いて、Ａ．ｏｒｙｚａｅのＲＡＣＥライブラリーに対して３′−ＲＡＣＥのＰＣＲ反応を行った。
【００３２】
ＰＣＲ反応条件は、次のとおりである。
ＰＣＲ条件
・９５℃（１分）、１サイクル
・９４℃（５秒）、７２℃（３分）、７サイクル
・９４℃（５秒）、６７℃（３分）、３２サイクル
・６７℃（４分）、１サイクル
【００３３】
反応液をアガロースゲル電気泳動で解析を行った結果、Ｐ３プライマーを用いたものについてのみ約８００ｂｐのフラグメントの増幅が認められた。本遺伝子増幅産物の塩基配列を決定した結果、確かに上記Ｐ３配列と３′末端のポリＡ付加配列を含んでおり、相同性を検索した結果、Aureobasidium pullulansの推定オキシゲナーゼ及びPseudomonas aeruginosaのオルニチンＮ５−オキシゲナーゼをコードする遺伝子の順に相同性を示した。
【００３４】
【実施例２】
ａｓｂ１の全塩基配列の決定と相同性検索
上記から得られた部分遺伝子の塩基配列をもとに５′−ＲＡＣＥ用、３′−ＲＡＣＥ用にプライマーＰ４、Ｐ５を合成した。プライマーＰ４の塩基配列を配列番号１０（図１２）に示し、プライマーＰ５の塩基配列を配列番号１１（図１３）に示した。
【００３５】
上記Ｐ４、Ｐ５プライマーと、Ｍａｒａｔｈｏｎ ｃＤＮＡ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ付属のＡＰＩプライマー（配列番号９（図１１））を用いて、Ａ．ｏｒｙｚａｅのＲＡＣＥのライブラリーに対して、５′−ＲＡＣＥ、３′−ＲＡＣＥのＰＣＲ反応を行った。
【００３６】
ＰＣＲ反応条件は、次のとおりである。
ＰＣＲ条件
・９５℃（１分）、１サイクル
・９４℃（５秒）、７２℃（３分）、７サイクル
・９４℃（５秒）、６７℃（３分）、３２サイクル
・６７℃（４分）、１サイクル
【００３７】
増幅されたバンドを切り出し、ｃＤＮＡの全塩基配列をジデオキシ法を用いて決定した。その結果、本遺伝子は５０２アミノ酸残基からなることが明らかとなった。プロモーター領域は配列番号２の１から２３５ｂｐ、コーディング領域は配列番号２の２３６から１８０７ｂｐ、ターミネーター領域は配列番号２の１８０８から２１６８ｂｐまでである。イントロンは、１つ含まれており、配列番号２の１１０８から１１７３ｂｐまでである。またAureobasidium pullulansの推定オキシゲナーゼとアミノ酸レベルで４４％相同性、Pseudomonas aeruginosaのオルニチンＮ５−オキシゲナーゼ蛋白質とアミノ酸レベルで３４％の相同性を有していた。得られた遺伝子をａｓｂ１と命名した。その塩基配列を配列番号２（図３、４）に示し、対応するアミノ酸配列を配列番号１（図１、２）に示した。
【００３８】
【実施例３】
ａｓｂ１遺伝子の大腸菌での大量発現と酵素アッセイ
ａｓｂ１遺伝子の機能を同定するために、本遺伝子の大腸菌での大量発現を行った。ａｓｂ１の全長ｃＤＮＡ領域（配列番号２の２３６から１８０７ｂｐ）をＰＣＲで増幅した。その際、Ｎ末端側にＮｄｅＩ、Ｃ末端側にＸｈｏＩ部位を導入した。本断片をノパジェン社ｐＥＴ−２３ｂベクターのＮｄｅＩ−ＸｈｏＩ部位へＴ７プロモーターと正方向にサブクローニングした。本プラスミドａｓｂ１大腸菌高発現プラスミドｐＥＡＳ１（図１４）とした。本プラスミドをノパジェン社大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）へ形質転換後、アンピシリン耐性を示す形質転換体を選択した。得られた形質転換体をＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ａｓｂ１と命名し、これを特許生物寄託センターにＦＥＲＭ Ｐ−１８３６０として寄託した。
【００３９】
得られた形質転換体を３７℃でＯＤ０．６までＬＢ培地で培養後、最後１ｍＭＩＰＴＧを加えてさらに３０℃で３時間培養した。得られた大腸菌の菌体内蛋白質を１００ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ６）で抽出後、上清に１ｍＭピルビン酸ナトリウム、２ｍＭ Ｌ−オルニチンを加え、３７℃で好気的に約２時間インキュベートした。１０％トリクロロ酢酸で反応停止後、遠心上清中のヒドロキシアミンをヨード酸化法（GillamらAnal. Chem., 5:841-844, 1981)に従って定量した。比活性は１分当たりに１ｎｍｏｌのヒドロキシアミンを産生する酵素量を１ｕｎｉｔとして、菌体蛋白質ｍｇあたりの生産量を算出し、表１に結果を示した。
【００４０】
表１に示したように、対照株と比較して有意なオルニチンＮ５−オキシゲナーゼ活性が認められた。よって、ａｓｂ１がフェリクローム又はそのデフェリ体生合成の第１段階を触媒するオルニチンＮ５−オキシゲナーゼをコードすることが明らかとなった。
【００４２】
【発明の効果】
本発明により、クローニングした遺伝子断片ａｓｂ１には、フェリクローム又はそのデフェリ体生合成の第１段階を触媒するオルニチンＮ５−オキシゲナーゼがコードされていることが確認できた。また、この遺伝子を含有する形質転換体エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）ａｓｂ１はＦＥＲＭ Ｐ−１８３６０として特許生物寄託センターに寄託されているので、ａｓｂ１遺伝子を保持するプラスミドを抽出することにより適宜取得することができる。このように、本菌株は、Escherichia coli BL21(DE3)を宿主として、プラスミドｐＥＴ−２３ｂに麹菌Aspergillus oryzaeのオルニチンＮ５−オキシゲナーゼをコードする遺伝子ａｓｂ１を挿入したプラスミドを含有している。本プラスミドはａｓｂ１遺伝子を用いた種々の応用へ遺伝子を供給できる。
【００４３】
したがって、このプラスミドからａｓｂ１遺伝子を単離し、麹菌高発現プロモーター下流に接続した大腸菌形質転換プラスミドを用いて、麹菌をエレクトロポレーション法、プロトプラスト−ポリエチレングリコール法等常法にしたがって形質転換してフェリクリシン又はデフェリフェリクリシン高生産株を得ることができ、フェリクリシン又はデフェリフェリクリシンを大量生産することが可能となり、また、ａｓｂ１遺伝子を破壊することによってフェリクリシン又はデフェリフェリクリシンの生産を抑制ないし防止した形質転換麹菌を得ることができ、例えば、清酒醸造において着色を抑制し、品質の劣化防止に利用することができる。
【００４４】
このように、この遺伝子を用いて、麹菌のフェリクローム又はそのデフェリ体生合成を鉄制限下で高生産あるいは非生産させることが可能であり、用途に応じたフェリクローム又はそのデフェリ体生産の改変が分子レベルで可能となり、様々な産業分野に応用が可能であることも確認した。
【００４５】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】オルニチンＮ５−オキシゲナーゼ蛋白質のアミノ酸配列を示す。
【図２】同上続きを示す。
【図３】本オルニチンＮ５−オキシゲナーゼ遺伝子の塩基配列を示す。
【図４】同上続きを示す。
【図５】保存領域▲１▼のアミノ酸配列を示す。
【図６】保存領域▲２▼のアミノ酸配列を示す。
【図７】保存領域▲３▼のアミノ酸配列を示す。
【図８】プライマーＰ１を示す。配列中、Ｉはデオキシイノシン残基、ＳはＧ又はＣ、ＷはＡ又はＴ若しくはＵ、ＲはＡ又はＧを示す。
【図９】プライマーＰ２を示す。配列中、Ｉはデオキシイノシン残基、ＹはＴ若しくはＵ又はＣ、ＲはＡ又はＧ、ＷはＡ又はＴ若しくはＵ、ＳはＧ又はＣ、をそれぞれ示す。
【図１０】プライマーＰ３を示す。配列中、Ｉはデオキシイノシン残基、ＳはＧ又はＣ、ＹはＴ若しくはＵ又はＣ、ＲはＡ又はＧ、ＷはＡ又はＴ若しくはＵ、をそれぞれ示す。
【図１１】ＡＰＩプライマーを示す。
【図１２】プライマーＰ４を示す。
【図１３】プライマーＰ５を示す。
【図１４】ａｓｂ１遺伝子の大腸菌発現プラスミドｐＥＡＳ１の制限酵素地図を示す。
Claims (9)
- 配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列を有する、フェリクローム又はそのデフェリ体生合成に関与するオルニチンＮ５−オキシゲナーゼ蛋白質。
- 配列番号２の塩基配列で示される、請求項１に記載の蛋白質をコードする遺伝子のＤＮＡ。
- 請求項２に記載のＤＮＡの内、少なくともコーディング領域を含んでなる組換えベクター。
- 請求項３に記載の組換えベクターが組換えベクターｐＥＡＳ１であること、を特徴とする組換えベクター。
- 請求項３又は４に記載の組換えベクターを挿入してなる形質転換体。
- 請求項５に記載の形質転換体が形質転換体、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ａｓｂ１（ＦＥＲＭ Ｐ−１８３６０）であること、を特徴とする形質転換体。
- 請求項３又は４に記載の組換えベクターを含む組換え麹菌。
- 請求項２に記載のＤＮＡを導入してなる麹菌において、フェリクローム又はそのデフェリ体生合成に関与するオルニチンＮ５−オキシゲナーゼ蛋白質を生産させることによってフェリクローム又はそのデフェリ体高生産麹菌を育種する方法。
- 請求項５〜７のいずれか１項に記載の形質転換体を培養すること、を特徴とするフェリクローム又はそのデフェリ体を大量生産させる方法。
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