JP3863958B2

JP3863958B2 - ファージ耐性納豆菌およびその納豆

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Publication number: JP3863958B2
Application number: JP03257397A
Authority: JP
Inventors: 浩竹村; 義則塚本
Original assignee: 株式会社中埜酢店
Priority date: 1997-02-03
Filing date: 1997-02-03
Publication date: 2006-12-27
Anticipated expiration: 2017-02-03
Also published as: JPH10215861A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、納豆菌ファージ耐性を有する納豆菌およびその納豆に関する。更に詳しくは、本発明は、納豆菌ファージＫＳ１又はその同系統に属するファージ（ＫＳ系ファージ）に耐性を有し、しかも納豆生産能は維持している新規な納豆菌およびその納豆に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
納豆の生産に於いてファージ汚染は、糸切れの発生、発酵不良の原因となる。ファージ汚染の問題を解決する方法としてファージ耐性菌の分離があり、福岡女子大の藤井等は、納豆菌に感染するファージの１つであるＰＮ１についてそれに耐性を有する納豆菌の分離を報告している（藤井ら：農化、第４１巻、第１号、ｐ．３９−４３（１９６７））。
しかし、ファージには多くの種類があり、１つの菌株に対して感染するファージは通常複数存在する。また、一つのファージに対する耐性株は他のファージに対しては耐性を有しないのが一般的である。
従って、ファージ耐性菌を用いてファージ汚染の問題を解決しようとすると、実際に生産現場で発生しているファージの種類を特定し、そのファージに対する耐性菌を取得する必要がある。
しかしながら、現在納豆の生産現場で発生しているファージの種類や系統については情報がなく、どのようなファージについて耐性株を取得すればよいかを判断することは全く困難であった。そのため、現在もファージ汚染の問題は納豆生産業界では未解決のままになっている。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、上記した技術の現状に鑑み、現在納豆生産現場で発生しているファージに対して耐性を有するファージ耐性納豆菌、特にファージ耐性実用納豆菌を育種し、該菌を用いて納豆を製造する目的でなされたものである。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明は、上記の目的を達成するためになされたものであって、実際に複数の納豆生産現場で生産された納豆よりファージを新規に分離した。そして、それらの新規分離ファージについて、遺伝子レベルでの分類を行い、それらが同一の系統のファージ（ＫＳ系ファージ）であることを明らかにし、現在全国の納豆工場において単一の系統のファージが主として発生していることを明らかにした。
さらに、本発明では、上記の知見を基に新規分離ファージに耐性を有しかつ優れた納豆生産能を有するファージ耐性納豆菌を分離、育種することに成功した。また、本発明で得られたファージ耐性実用納豆菌は、同系統の他のファージにも相互に耐性を有していた。このことより、本発明で取得したファージが、現在日本国内の納豆工場に広く分布するＫＳ系の他のファージについても同様に耐性を有することが予測される。
【０００５】
そして更に検討の結果、該耐性株によって納豆を工業的に製造できることを確認し、ここに、ファージ耐性実用納豆菌の育種に成功し、本発明の完成に至ったものである。
以下、本発明について詳述する。
【０００６】
先ずはじめに、糸を引かない納豆又はそれ由来のファージから既知のファージＰＮ１とは相違する新規ファージＫＳ１を分離し、納豆菌を指示菌（親株）とし、自然変異手段等の常法にしたがってファージ耐性菌を得る。
【０００７】
そしてこのようにして新たに分離したファージ耐性菌について、液体培養におけるファージ耐性を確認し、糸引き性（曳糸性）を確認し、更に、納豆生産能及び製品納豆の風味、食感を確認して、単なるファージ耐性納豆菌にとどまらず、ＫＳ系ファージに対して感受性を有するが、溶菌はしないという本発明の目的である、ファージ耐性実用納豆菌を新たに得るものである。
【０００８】
このようにして本発明にしたがって分離育種したファージ耐性実用納豆菌は、ＫＳ系ファージに対して感受性を有するが（ＫＳ系ファージ１０⁷ＰＦＵ／ｇ納豆以下、好ましくは１０⁶ＰＦＵ／ｇ納豆以下の接触によって生育がわずかに抑制される。ＰＦＵとはプラーク形成単位、即ち Plaque-Forming Units の略である。）、溶菌はしないという特質を有する点以外は、通常の納豆菌と同一の菌学的性質を有し、曳糸性はもとより納豆生産能も有し、官能的にすぐれた納豆を製造できるという特徴を有するものである。
【０００９】
したがって本発明に係るファージ耐性納豆菌を使用すれば、ファージに感染することなく正常の曳糸性を有する優れた納豆を製造することが可能となり、曳糸性の欠如を理由とする製品納豆の返品等の問題が解決され、特に工業上ないし実用上大きな貢献がなされる。
【００１０】
また、新規分離ファージ（ＫＳ系ファージ）を用いることによって、自然変異株及び／又は人工変異株の中から、常法にしたがって目的とする耐性株を自由にスクリーニングすることができるので、すぐれたファージ耐性実用納豆菌を各種分離、育種することが容易にできる。したがって、本発明は、上記したファージ耐性実用納豆菌のほか、上記した特性を有する変異株も、その対象として包含するものである。
以下、本発明の実施例について述べる。
【００１１】
【実施例１】
納豆菌ファージに耐性を有する納豆菌を次のようにして分離した。（なお本発明において、納豆菌は、その生育に特にビオチンを要求するので、Bacillus nattoに属せしめたが、枯草菌の変種としてBacillus subtilis var. nattoに分類している文献も存在する。）
【００１２】
（１）使用菌株
実施例において、納豆菌Ｏ−２を親株、指示菌として使用したほか、市販の納豆菌として既知の高橋３号菌（Ｔ₃株）を東京農業大学菌株保存室から分穰を受けて使用した。また、他に以下の菌株を使用した。
【００１３】
Bacillus natto IFO3009
Bacillus subtilis IFO3007
Bacillus subtilis IFO3215
Bacillus subtilis IFO3026
Bacillus subtilis IAM12021
Bacillus amyloliquefaciens IFO3022
Bacillus pumilus IFO3813
【００１４】
（２）培地
納豆菌の培養には、肉汁培地を用いた。尚、固体培地は、肉汁培地に１．５％の寒天を加えることにより、寒天重層法に用いる上層寒天は０．８％の寒天を加えることにより作成した。胞子形成用培地には、Sterlini-Mandelstam置換培地を使用し、納豆菌の保存には、ＳＧ固体培地を使用した。使用した肉汁培地、ＳＧ固体培地（粘質物生成培地）、胞子形成用培地（Sterlini-Mandelstam置換培地）の各組成をそれぞれ下記表１０、表１１、表１２に示す。
【００１５】
【表１０】

【００１６】
【表１１】

【００１７】
【表１２】

【００１８】
（３）ファージの分離
以下のサンプルから寒天重層法によりファージを分離、純化した。指示菌にはＯ−２を用いた。
【００１９】
▲１▼青森県内の納豆工場で生産された納豆。
▲２▼愛知県内の納豆工場で生産された納豆。
▲３▼栃木県内の納豆工場で生産された納豆。
上記のサンプルから分離したファージをそれぞれＫＳ１、ＫＷ１、ＭＤ２と命名し、以下の実験に用いた。また、既知のファージである納豆菌ファージＰＮ１（藤井等）については、分穰を受けたものを使用した。
【００２０】
（４）ファージの分類
ｉ）宿主特異性
上記のファージの宿主特異性をスポット試験法（藤井等）で調べた。
既ち、５ｍｌ肉汁培地を含む試験管で各種枯草菌を３７℃、一夜振とう培養する。得られた培養液の内０．１ｍｌを３ｍｌの上層寒天培地（電子レンジで寒天を溶解後、５０℃まで冷却したもの）に混合し、肉汁寒天培地に重層する。室温で約１０分放置し寒天を固化させた後、１０⁵〜１０⁷ＰＦＵ／ｍｌのファージ液を一滴滴下し、２４時間培養した。
【００２１】
結果を表１に記す。尚、藤井等の文献に記載されているファージの宿主特異性に関するデータも併せて記載した。
なお表中、＋＋：完全に溶菌、＋：薄く生える又は薄い斑点になる、−：感染せず、をそれぞれ表わす。各微生物は、寄託番号のみを表示した。
【００２２】
【表１】

【００２３】
上記した表１（分離ファージの宿主域及び既知ファージとの比較）から明らかなように、分離ファージであるＫＳ１とＫＷ１は、全く同じ宿主特異性を示す一方、ＭＤ２はこれら２つのファージとは異なる宿主特異性を示した。
また、ＰＮ１はこれらの分離ファージとは全く異なる宿主域を示した。なお、ＰＮ１については、文献記載のもの（藤井等）と一部その宿主域が相違している。その原因は不明であるが、ＰＮ１又はＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓＩＦＯ３８１３の保存中にこれらのファージ又は菌に変異が生じたものと推定される。
【００２４】
ii）ファージの保存安定性
上記のファージについて、４℃、肉汁培地中での安定性を調べた。結果を図１に示す。
ＫＳ１では、保存中殆どファージ数の減少が見られなかった。それに対し、ＫＷ１、ＭＤ２では、ファージ数の減少が起こった。特に、ＭＤ２では減少速度が速く、ＭＤ２が非常に不安定なファージであることが分かる。
【００２５】
iii）ファージＤＮＡの制限パターンの解析
上記ファージのＤＮＡを調製し、その制限パターンを比較した。ＤＮＡの調製はラムダファージのＤＮＡ調製用のキットであるＱＩＡＧＥＮＬａｍｄａＭｉｎｉＫｉｔ（フナコシ）を用いて行った。制限パターンは、各ファージのＤＮＡを制限酵素ＨｉｎｃＩＩで切断後１％アガロースゲル電気泳動することにより調べた。マーカーとしては、λＨｉｎｄＩＩＩ分解物を使用した。
結果を図２に示した。
【００２６】
上記結果から明らかなように、ＫＳ１とＫＷ１のＤＮＡ泳動パターンは殆ど同一であった。しかし、両者で共通しないバンドも観察されることにより両者は全く同一ではないと考えられる。
また、ＭＤ２は、他の２つのファージと明らかに泳動パターンが異なった。しかし、他の２つのファージと共通するバンドも観察された。
一方、ＰＮ１は、他の３つのファージと全く異なるバンドパターンを示した。
【００２７】
iv）ファージＤＮＡ間の相同性
ｄｉｇｏｘｉｇｅｎｉｎ−ｄＵＴＰラベルしたＫＳ１のＤＮＡをプローブとして用い、ＫＳ１、ＫＷ１、ＭＤ２、ＰＮ１のＤＮＡのサザンハイブリダイゼーションを行った。
結果を図３に示した。
【００２８】
上記結果から明らかなように、ＫＳ１、ＫＷ１、ＭＤ２のいずれのＤＮＡもほぼ同じ強度でプローブとハイブリダイズした。
一方、ＰＮ１は、ほとんどハイブリダイズしなかった。
このことより、３つの分離ファージ、ＫＳ１、ＫＷ１、ＭＤ２は殆ど同じ遺伝子配列を有することが明らかになった。一方、ＰＮ１は、他の３ファージとは全く異なる遺伝子配列を有することが明らかになった。
【００２９】
ＫＳ１、ＫＷ１、ＭＤ２は、上記の結果より互いに異なるファージであることが分かった。しかし、何れのファージもＤＮＡが非常に高い相同性を有することにより同じ系統のファージであると考えられる。
一方、ＰＮ１は、他のファージと遺伝子の制限パターンが全く異なり、相同性も非常に低い。このことよりＰＮ１は他の分離ファージとは全く異なる系統のファージであると考えられる。
以上の結果より、現在日本国内の納豆工場において、ＫＳ１等と同系統のファージが広く分布していることが明らかになった。また、現在日本国内で広く分布しているファージが同系統のファージであることが明らかになったことより、ＫＳ１等の上記の新規分離ファージのいずれかについて耐性を有する納豆菌を育種すれば、日本国内に分布する他のＫＳ１と同系統のファージについても耐性を有するファージ耐性納豆菌を取得できると考えられる。
【００３０】
（５）ファージ耐性菌の分離
ｉ）分離方法の選択
ファージ耐性菌の分離は、自然変異法及びＥＭＳ等による化学変異法のほか、γ線や紫外線等を照射する方法その他既知の変異方法によって適宜行うことができる。
【００３１】
本実施例においては、ファージ耐性菌の取得は、通常行われている自然変異によって行った。自然変異法としては、ファージ耐性菌のスクリーニングを液体培養した指示菌にファージを感染させることにより溶菌させ、溶菌後さらに培養を継続し生育してきた菌をプレート上で分離することにより行ってもよいが、本実施例においては、常法により、プレート上での固体培養によりファージ耐性菌のスクリーニングを行うこととした。
すなわち、指示菌とファージの混合液を固体培地上にまき、生育してきたコロニーを取得することによって、ファージ耐性菌の分離を行った。
【００３２】
ii）ＫＳ１、ＫＷ１に対するファージ耐性菌のスクリーニング
５ｍｌ肉汁培地を含む試験管で、Ｏ−２を３７℃、一夜振とう培養した。得られた培養液の内０．１ｍｌを約１０⁶ＰＦＵのファージを含むファージ液０．１ｍｌとを試験管中で混合した。さらに３ｍｌの上層寒天培地（電子レンジで寒天を溶解後、５０℃まで冷却したもの）に混合し、肉汁寒天培地に重層した。３７℃で一夜保存すると、この条件では、指示菌は完全に溶菌した。そして、さらに培養を継続し、ファージ耐性菌コロニーの出現を観察した。
【００３３】
上記の方法でＫＳ１を１４枚のプレートに、ＫＷ１を１０枚のプレートにプレーティングし、耐性コロニーの出現の有無を観察した。その結果、ＫＳ１では、全てのプレートで、ＫＷ１では６枚のプレートで、培養開始後２４時間頃から小さな納豆菌らしきコロニーが出現した。更に２４〜７６時間培養を継続し、コロニーがはっきり確認できるようになった時点で、ＫＳ１プレートから１４株（ＫＳ１Ｒ１〜ＫＳ１Ｒ１４と命名）、ＫＷ１プレートから７株（ＫＷ１Ｒ１〜７）の計２１株を釣菌した。通常、納豆菌は肉汁寒天培地上で一夜培養（３７℃、１６時間）すると大きなコロニーを形成するが、本スクリーニングではコロニーの形成には長時間を要した。
ファージ耐性菌コロニーの検出結果を、下記表２に示す。
【００３４】
【表２】

【００３５】
iii）耐性コロニーの純化と耐性の確認
ii）のスクリーニングで得られたコロニーのファージ耐性の確認と純化を行うため、得られたコロニーを１０⁹ＰＦＵのファージ液を塗布した肉汁寒天培地上にストリークし、単コロニーを拾った。さらに、ファージの持ち込みを排除するため、肉汁寒天培地上に得られたコロニーをストリークし、最終的に単一コロニーを分離した。
尚、ファージを塗布した肉汁寒天培地上での菌の生育は、通常の肉汁寒天上での生育に比べ非常に悪く、ファージにより耐性菌の生育が抑制されていると考えられた。純化の過程で、ＫＷ１Ｒ１、ＫＷ１Ｒ４、ＫＷ１Ｒ５はファージ耐性を有しないことがわかったので、以後の試験から除外した。
【００３６】
次に、純化した１７株のＫＳ１、ＫＷ１に対する耐性をスポット試験法で調べた。得られた結果を、下記表３に示した。なお式中、各符号は、それぞれ次の意味を表わす。
＋＋：完全に溶菌、プラーク形成
＋：スポットした部分の生育が抑制、しかし生育する
−：スポットした部分も正常に生育、プラーク形成されず
【００３７】
【表３】

【００３８】
上記したファージ耐性菌のファージ耐性試験の結果から明らかなように、得られた１７株の耐性株は、コロニーの純化を行う過程で観察されたとおり、ファージにより生育は抑えられたが溶菌はせずファージ耐性を有していることが明らかになった。ＫＳ１Ｒ５株は、納豆の風味が良好であった。
【００３９】
また、全てのファージ耐性菌がＫＳ１、ＫＷ１の両方のファージに対して耐性になっており、調べた範囲ではＭＤ２に対しても耐性を示した。これは、これら３種のファージが同系統のファージであるためと考えられた。
尚、今回得られたファージは、ファージにより生育が抑えられるが、調べた範囲ではＫＳ１、ＫＷ１は、耐性菌を指示菌としたときプラークを形成できなかった。
【００４０】
上記のように、ＫＳ１、ＫＷ１に対する耐性菌１７株を取得できた。得られた耐性株は、現在取得されている全てのファージに対して耐性を示した。ただし、完全な耐性ではなく、高濃度のファージを感染させると生育が抑制された。
【００４１】
（６）ファージ耐性菌の特徴
ｉ）液体培養におけるファージ耐性の確認
耐性菌の一つＫＳ１Ｒ５について、ファージ耐性の確認を液体培養により行った。
５ｍｌ肉汁培地を含む試験管でＯ−２およびＫＳ１Ｒ５を３７℃、一夜振とう培養した。得られた培養液の内０．１５ｍｌをそれぞれ２本の１５０ｍｌの肉汁培地を含む坂口フラスコに植菌し、３７℃で振とう培養した。ＯＤ６６０が約０．５になったところでそれぞれの菌株のフラスコの一方にＫＳ１液（Ｏ−２をＫＳ１で溶菌させた溶菌液）を４×１０⁸ＰＦＵ／ｍｌとなるように添加した。残りの一本はコントロールとしてそのまま培養した（感染多重度 multipicity of infection，以後 m. o. i と略す。 m. o. i ＝約１に相当する。）。また、１５０ｍｌ肉汁培地にファージのみ添加したものも同時に３７℃で振とうした。
【００４２】
培養経過を図４に示した。また、培養終了後の菌濃度（ＯＤ６６０）、ファージ濃度を表６にまとめて示した。
【００４３】
【表６】

【００４４】
上記結果から明らかなように、親株であるＯ−２は、ファージ添加後約２時間で溶菌し始め、約３時間半で完全に溶菌した。溶菌後の溶菌液中のファージ数は添加量の約３０倍に増加していた。
一方、ＫＳ１Ｒ５では、ファージを添加しても溶菌はおこらなかった。しかし、ファージを添加した場合は生育の抑制がおこり、ファージ無添加の場合最終菌濃度がＯＤ６６０＝３を越えるのに対し、ファージを添加した系ではＯＤ６６０＝約２で生育が止まった。
しかし、培養終了後の培養液中のファージ濃度は６×１０⁷ＰＦＵ／ｍｌと添加時に比べむしろ減少しており、ファージの増殖はおこっていないことが確認された。ファージ濃度の減少は菌にファージが吸着したことによって遊離のファージが減少したためと考えられる。
【００４５】
ii) ファージ耐性濃度の臨界効果
煮豆１００ｇに市販納豆菌である三浦菌（宮城野納豆製造所）またはＫＳ１Ｒ５の胞子を接種し、それぞれに種々の濃度のファージ（ＫＳ１）を添加した後納豆製造を行った。尚、該菌の接種量は３ｘ１０³／ｇ煮豆であり、熱によるファージの失活を防止するため、ファージの添加は納豆菌接種後煮豆の温度が十分に低下するのを待って行った（１時間〜２時間放置、４０℃前後）。また、雑菌や空気中のファージの混入を防止するため、発酵は綿栓をしたガラスフラスコ中で無菌的に行った。結果を表４、表５に示した。
【００４６】
【表４】

【００４７】
【表５】

【００４８】
なお表中において、糸切れの有無は納豆を混練した後、室温（２５℃）で３〜４時間放置し、糸引き性の保持の有無で判断した。糸引き性が失われれば糸切れと判断した。
【００４９】
発酵終了後の分析は以下の通りに行った。即ち発酵終了後のファージ数は、納豆を肉汁培地に懸濁しファージを培地中に遊離させ、固形物を遠心分離により除去した上清液について、Ｏ−２菌を指示菌として上層寒天法により測定した。
【００５０】
粘度の測定は、次のようにして行った。
▲１▼恒温水槽を２５℃にセットする。
▲２▼納豆１００ｇをビーカーに取り、水２００ｍｌ注入。
▲３▼恒温水槽内で９０分間抽出する。
（３０分毎ガラス棒で攪拌し、豆と粘液を分離）
▲４▼豆と粘液をナイロンシャーで分離する。
▲５▼東京計器社製・Ｂ型回転粘度計にて粘度を測定する。
（Ｎｏ．１ローター・３０ｒｐｍにて１分、内径４ｃｍの円筒形の容器中にて測定）
【００５１】
上記した無菌的な納豆製造におけるファージ耐性試験（表４、表５）の結果から明らかなように、市販菌では、ファージ添加濃度０．１ＰＦＵ／ｇ煮豆でファージが増殖し、糸切れが生じた。それに対して、耐性菌ＫＳ１Ｒ５では、１ｘ１０⁴ＰＦＵ／ｇ煮豆でもファージは増殖せず、糸切れも生じなかった。
【００５２】
iii) ファージ耐性の安定性
ファージ耐性株ＫＳ１Ｒ５をＳＧ固体培地で５回継代培養し、５代目の菌を用いて、納豆製造用の胞子を作成した。得られた胞子を肉汁寒天培地上で生育させ、コロニーを形成させ、その内１０コロニーを無作為に拾い、そのＫＳ１耐性を調べた。
その結果、調べた１０コロニー全てがＫＳ１耐性を保持しており、ファージ耐性が継代培養において安定して保持されることが分かった。
【００５３】
iv) ポリグルタミン酸分解酵素の誘導
納豆菌にファージが感染するとポリグルタミン酸分解酵素の生産が誘導されることが知られている（Motoyoshi Hongo and Akihiko Yoshimoto, Agric. Biol. Chem. Vol.34, 1047-1054, 1970）。そこで、上記の培養液のポリグルタミン酸分解酵素活性を測定した。
酵素活性の測定は、０．５％のポリグルタミン酸溶液（１／４５Ｍリン酸ナトリウムｐＨ７．２）５ｍｌに適当な濃度に希釈した酵素液０．１ｍｌを加え、Ｂ型粘度計（ＨＭ−３ロータ）で粘度の低下を経時的に測定した。なお、ファージ添加量は終濃度４．０ｘ１０⁸、ファージ添加時期はＯＤ０．５とした。
得られた結果を前記表６に示した。
【００５４】
上記したファージ耐性変異株ＫＳ１Ｒ５に対する感染試験の結果から明らかなように、Ｏ−２、ＫＳ１Ｒ５のみの培養液では酵素活性は検出されなかった。Ｏ−２にファージを添加し溶菌させた液では、培地にファージ液のみ添加した場合の３０倍の活性が認められた（ファージのみの系で酵素活性があるのは、ファージ液中に既に存在した酵素が持ち込まれたからである）。一方、ＫＳ１Ｒ５にファージを感染させた場合にも酵素活性は検出された。しかし、その活性はＯ−２の溶菌液の１／１０程度であった。この結果より、今回得られたファージ耐性株はファージが感染するとポリグルタミン酸分解酵素を合成するが、ファージが増殖できないためその合成量は親株にファージに感染した場合に比べ少なくなっていると考えられる。
【００５５】
ｖ）納豆生産能
▲１▼胞子化
今回得られたファージ耐性菌１７株を５ｍｌの胞子形成培地を含む試験管中で３７℃、２４時間振とう培養した。その結果、何れの株においても胞子形成がおこり、これらの株が胞子形成能を保持していることが確認された。
【００５６】
▲２▼胞子のファージ耐性
ＫＳ１Ｒ５の胞子を肉汁寒天培地上にプレーティングし、３７℃、２４時間培養し、コロニーを形成させた。１２個のコロニーをランダムに拾い、５ｍｌ肉汁培地で１夜試験管培養後、スポット試験によりファージ耐性を保持しているかどうか調べた。ファージはＫＳ１を使用した。その結果、１２コロニー全てが耐性を保持していた。
この結果より、ファージ耐性は胞子化した後も保持されることが確認された。
【００５７】
▲３▼▲１▼で得られたファージ耐性菌の胞子を用いて納豆生産試験を行った。試験は、極小大豆を用い、５０ｇのトレイで行った。植菌量は３ｘ１０³／ｇ煮豆、培養条件は通常の家庭用納豆の発酵条件を用いた。
その結果、全ての耐性株で納豆が生産でき、全ての耐性株が納豆生産能を有していることが確認された。前述の表３の右欄の納豆生産能の列に表記した。
【００５８】
本発明によって得られたファージ耐性菌は、ファージに感染すれば生育が抑さえられるが、ポリグルタミン酸分解酵素を生産することが分かった。しかし、耐性菌に感染したファージは増殖できず、そのため溶菌もおこらず、ポリグルタミン酸分解酵素の生産量も親株にファージがかかった場合に比べ低く抑えられることが分かった。
また、本発明によって得られたファージ耐性株は、胞子化が可能であり、耐性は胞子化によっては失われなかった。さらに、何れの耐性株も納豆生産能を保持していた。その他の性質は従来既知の納豆菌と同一であった。
【００５９】
vi）ファージ耐性菌の菌学的性質
本発明によって新たに分離されたファージ耐性納豆菌の菌学的性質は、下記表７、表８に示すとおりである。
これらの耐性菌の内、ＫＳ１Ｒ５については、これを Bacillus subtilis KS1R5と命名し、工業技術院生命工学工業技術研究所にＦＥＲＭＢＰ−５８０３として国際寄託した。したがって本発明は、これら耐性菌はもとより、それらの変異株も包含するものである。
【００６０】
【表７】

【００６１】
【表８】

【００６２】
【実施例２】
米国産小粒大豆５ｋｇを水道水で洗浄後、４℃、１７時間水道水に浸漬した。浸漬終了後大豆を１．５ｋｇ／ｃｍ²で約３０分蒸煮した。得られた煮豆５００ｇにファージＫＳ１が１０²ＰＦＵ／ｇ煮豆、納豆菌の種菌（胞子液）が３ｘ１０³／ｇ煮豆、となるようにくわえ、ファージＫＳ１と種菌を同時に混合し、工業生産と同様にポリスチレントレイ中で４０℃、２４時間発酵させた。
尚、ファージ耐性納豆菌として、ＫＳ１Ｒ５（ＦＥＲＭＢＰ−５８０３）を、対照菌には市販の種菌である三浦菌を用いた。
また、対照として、ファージを加えないで上記の試験と同じ試験を行った。
【００６３】
発酵終了後、ファージ数及び粘度の測定を、先に述べた方法によって行った。但し、粘度は、５０ｇの納豆を２００ｍｌの水で抽出したものについて、２０℃で測定した。得られた結果を下記表９に示した。
【００６４】
【表９】

【００６５】
上記した納豆製造過程におけるファージ耐性結果からも明らかなように、対照菌、耐性菌ともにファージ無添加の系では、通常通り納豆ができた。ファージ添加系では、対照菌においては、煮豆１ｇあたり１ｘ１０⁵ＰＦＵ以上のファージが検出され、ファージの増殖が確認された。また、発酵終了後には煮豆は納豆様に変化しているものの、ファージにより誘導されるポリグルタミン酸分解酵素による糸切れが生じ、納豆ネバの粘度はコントロールに比べ１／４以下に低下していた。一方、ファージ耐性菌においては、ファージ添加系においてもファージは検出されず、糸切れ、粘度低下も生じずファージ無添加の系と同様の納豆が生産された。
【００６６】
【発明の効果】
本発明によれば、ファージに感染することなく良好な曳系性を有する食感、風味ともにすぐれた糸引き納豆を製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】ファージの保存安定性を示す。
【図２】ファージＤＮＡの制限酵素切断パターンを示す電気泳動写真である。
【図３】ＫＳ１のＤＮＡをプローブとしたファージＤＮＡのサザンハイブリダイゼーションの結果を示す写真である。
【図４】ファージ耐性菌ＫＳ１Ｒ５のファージ耐性を示す。

Claims

ファージ耐性実用納豆菌ＫＳ１Ｒ５（ＦＥＲＭＢＰ−５８０３）。
請求項１に記載の納豆菌を用いて発酵させた納豆。