JP3847591B2

JP3847591B2 - Ligand and support for analysis of heparin-binding protein, and oligosaccharide chain immobilization method

Info

Publication number: JP3847591B2
Application number: JP2001280672A
Authority: JP
Inventors: 泰生隅田; 正一楠本; 明男荒野
Original assignee: Japan Science and Technology Agency; National Institute of Japan Science and Technology Agency
Current assignee: Japan Science and Technology Agency; National Institute of Japan Science and Technology Agency
Priority date: 2001-09-14
Filing date: 2001-09-14
Publication date: 2006-11-22
Anticipated expiration: 2021-09-14
Also published as: JP2003083969A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、オリゴ糖鎖を、表面プラズモン共鳴等のセンサチップやアフィニティークロマトグラフィの担体等の蛋白質分析用の支持体に一段階で導入し、固定することが可能なリンカー化合物および該リンカー化合物を用いたリガンド並びに該リガンドを用いたオリゴ糖鎖の固定化方法および該リガンドを表面に固定化させてなる蛋白質分析用の支持体に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
下記一般式（６）
【０００３】
【化６】

【０００４】
で表される硫酸化多糖ヘパリンは、構造や分子量が非常に不均一なものであり、多くの生物活性を有することが知られている。そのなかでも、抗血液凝固活性は有名であり、医薬として広く用いられている。
【０００５】
しかしながら、不均一な硫酸化多糖ヘパリンは、血小板やフォンビルブラント因子（ｖＷＦ）とも結合する。このため、従来、硫酸化多糖ヘパリンを医薬として用いた場合における血液中の血小板との結合に起因する副作用が指摘されている。
【０００６】
これらの結合相互作用には、硫酸化多糖ヘパリン中の、下記一般式（７）
【０００７】
【化７】

【０００８】
で表される特定の部分二糖構造（ＧｌｃＮＳ６Ｓ−ＩｄｏＡ２Ｓ）と、それに基づくクラスタリング効果が重要である。
【０００９】
本願発明者等は、以前に、この特定の部分二糖構造（ＧｌｃＮＳ６Ｓ−ＩｄｏＡ２Ｓ）が血小板細胞や血液凝固に関わるフォンビルブラント因子（ｖＷＦ）という蛋白質との結合に大きく関与することを見出した。
【００１０】
しかしながら、これらの生化学的結合実験のためには特殊な設備や多量のオリゴ糖が必要になるという問題がある。生物活性測定法としては、従来、放射標識法（ＲＩ法）とＳＰＲ法とが知られているが、ＲＩ法は、特殊な実験設備や多量のオリゴ糖を必要とする。
【００１１】
そこで、本願発明者等は、蛋白質分析用の支持体として非放射標識法である表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）のセンサチップを使用し、図１１に示すように、該センサチップの表面上に、疎水性相互作用を介して上記した部分二糖構造（ＧｌｃＮＳ６Ｓ−ＩｄｏＡ２Ｓ）を固定化し、ＳＰＲを用いて硫酸化多糖ヘパリン中の部分二糖構造（ＧｌｃＮＳ６Ｓ−ＩｄｏＡ２Ｓ）と硫酸化多糖ヘパリン結合性の蛋白質との結合挙動を解析した。ＳＰＲ法は、少量のオリゴ糖で測定が可能であり、分子間の相互作用をリアルタイムで観測することが可能である。なお、図１１中、ＮＳ６Ｓは上記した部分二糖構造（ＧｌｃＮＳ６Ｓ−ＩｄｏＡ２Ｓ）のうちＧｌｃＮＳ６Ｓを示し、Ｉ２ＳはＩｄｏＡ２Ｓを示し、Ｇはグルコース単位を示す。
【００１２】
具体的には、センサチップとしての疎水性チップ上に上記部分二糖構造（ＧｌｃＮＳ６Ｓ−ＩｄｏＡ２Ｓ）を固定化し、この疎水性チップ上に、硫酸化多糖ヘパリン結合性ドメインを有する合成ｖＷＦペプチド（ｖＷＦ中のヘパリン結合サイト；ＹＩＧＬＫＤＲＫＲＰＳＥＬＲＲＩＡＳＱＶＫＹＡ−ＮＨ）をアナライトとして添加した。
【００１３】
この結果、図１２の線ａに示すように、ｖＷＦペプチドの濃度変化に応じて結合量の変化、すなわち、ΔＲＵ1 （オリゴ糖の結合量）／ΔＲＵ2 （ｖＷＦペプチドの結合量）が観測された。
【００１４】
この線ａのカーブから求められる解離定数Ｋ_D は、以前にSobel等が生化学的手法を用いて測定(M.Sobel et al. J. Biol. Chem. (1992), vol.267, p8857 、Ｋ_D ＝ 370±100ｎＭ)した値にオーダーとして近いものであった。
【００１５】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、この場合、図１２の線ｂに示すように末端にグルコース残基を有するリガンドを用いても、合成ｖＷＦペプチドとの結合相互作用が観察されたことから、上記した値には、疎水性親和力に起因すると思われる非特異的な相互作用、つまり、上記センサチップの疎水性場と合成ｖＷＦペプチドとの非特異的な相互作用が含まれていることが判った。
【００１６】
このため、このように蛋白質分析用の支持体を用いて分析する蛋白質との疎水性相互作用に基づく非特異的な相互作用をほぼ無視できるリンカー化合物およびリガンド並びに該リガンドをチップに固定化する方法、さらには、該リガンドを固定化した、例えばＳＰＲ用のセンサチップ等の蛋白質分析用の支持体を提供することは、上記した部分二糖構造（ＧｌｃＮＳ６Ｓ−ＩｄｏＡ２Ｓ）と蛋白質との生化学的結合による結合相互作用、つまり、構造が明確な硫酸化オリゴ糖と種々の蛋白質との結合相互作用を連続的かつ定量的に評価する上で非常に重要である。
【００１７】
また、近年、オリゴ糖鎖が生体内で重要な働きを担っていることが明らかになっている。しかしながら、オリゴ糖鎖の分子レベルでの研究を行うには、上記したように構造が完全に判っているオリゴ糖鎖を用いなければならず、このようなオリゴ糖鎖を多量に天然から得ることは困難であり、また、合成も容易ではないという問題がある。
【００１８】
また、オリゴ糖鎖は、それ一分子では活性はそれほど高くないことが多く、蛋白質との相互作用を解析するにはオリゴ糖鎖を集合化させる必要がある。つまり、一般的に、天然のオリゴ糖とそれが相互作用する蛋白質との親和性は低いので、オリゴ糖の生物活性を評価するためには、オリゴ糖鎖を効率よく集合化することが重要である。
【００１９】
従来、ＳＰＲ測定装置等に用いるセンサチップの表面にオリゴ糖鎖を結合（固定化）する試みとしては、例えば、チップ表面に長鎖アルキル鎖の短分子膜を作り、疎水性相互作用を利用してオリゴ糖鎖をチップに固定化する試み(G.M.Kuziemko et al., Biochemistry, Vol. 35, p6375, 1996年)がなされている。
【００２０】
しかしながら、上記文献に記載の方法は、チップ表面に固定化することができるオリゴ糖鎖の種類が限定され、ガングリオシド等の、疎水性基を有するオリゴ糖鎖はチップに固定化することはできるものの、様々なオリゴ糖鎖をチップ表面に簡便に固定化することはできない。また、上記従来の方法によりオリゴ糖鎖が固定化されたチップは、チップ表面の疎水性が高すぎ、チップを用いて分析する蛋白質との非特異的な相互作用が大きく観測されてしまい、実用性に乏しいという問題点を有している。
【００２１】
また、上記従来の方法でオリゴ糖鎖をチップ表面に固定化するためには、合成化学を駆使し、オリゴ糖鎖の水酸基に種々の保護基をまず導入し、それを化学的に縮合した上で、さらにチップに固定化する必要がある。このため、従来は、自然界から単離、精製して得られるオリゴ糖をそのまま用いてそのオリゴ糖鎖をチップ表面に固定化することは事実上、不可能であった。
【００２２】
さらに、オリゴ糖鎖と特異的に相互作用する蛋白質を分離精製するためには、構造既知のオリゴ糖鎖をアフィニティークロマトグラフィーのリガンドとして用いる必要がある。
【００２３】
このため、オリゴ糖鎖を集合化させ、上記したＳＰＲ用のセンサチップまたはアフィニティークロマトグラフィーの担体等の蛋白質分析用の支持体上に固定化させることができると共に、多種のオリゴ糖を一段階で導入することが可能なリンカー化合物および該リンカー化合物を用いたリガンド並びに該リガンドをチップに固定化する方法、さらには、該リガンドを固定化した蛋白質分析用の支持体が求められている。
【００２４】
本発明は、上記問題点を解決するためになされたものであって、その目的は、自然界から単離、精製して得られる種々のオリゴ糖をそのまま用いて一段階で蛋白質分析用の支持体表面にオリゴ糖鎖を簡便に固定化することができると共に、蛋白質分析用の支持体を用いて分析する蛋白質との疎水性相互作用に基づく非特異的な相互作用による影響が低減され、種々の蛋白質との結合相互作用を連続的かつ定量的に評価できる蛋白質分析用の支持体を得ることができるリンカー化合物およびリガンド並びにオリゴ糖鎖の固定化方法および蛋白質分析用の支持体を提供することにある。
【００２５】
【課題を解決するための手段】
本願発明者等は、上記の目的を達成すべく鋭意検討した結果、分子内にＳ−Ｓ結合もしくはビオチンを持たせた部位をリンカー化合物に導入することで、オリゴ糖鎖を分子内に簡便に導入できる部分をリンカー化合物に組み込むと共に、オリゴ糖鎖の導入に際し、親水性部分がリンカー化合物との間に形成されるように、蛋白質分析用の支持体表面に例えばコートした金もしくは予め蛋白質分析用の支持体表面に固定化したストレプトアビジン（またはアビジン）と結合させ易く、強固に結合できるようにすることができ、自然界から単離、精製して得られる種々のオリゴ糖をそのまま用いて蛋白質分析用の支持体表面にオリゴ糖鎖を一段階で簡便に固定化することができると共に、蛋白質分析用の支持体を用いて分析する蛋白質との疎水性相互作用に基づく非特異的な相互作用による影響が低減され、種々の蛋白質との結合相互作用を連続的かつ定量的に評価できる蛋白質分析用の支持体を得ることができることを見出して本発明を完成させるに至った。
【００２６】
即ち、本発明にかかるリンカー化合物は、上記の課題を解決するために、
一般式（１）
【００２７】
【化８】

【００２８】
で表されることを特徴としている。
【００２９】
また、本発明にかかるリンカー化合物は、上記の課題を解決するために、
一般式（２）
【００３０】
【化９】

【００３１】
で表されることを特徴としている。
【００３２】
本発明にかかるリガンドは、上記の課題を解決するために、一般式（３）
【００３３】
【化１０】

【００３４】
で表されることを特徴としている。
【００３５】
本発明にかかるリガンドは、上記の課題を解決するために、一般式（４）
【００３６】
【化１１】

【００３７】
で表されることを特徴としている。
【００３８】
本発明にかかるリガンドは、上記の課題を解決するために、一般式（５）
【００３９】
【化１２】

【００４０】
で表されることを特徴としている。
【００４１】
本発明にかかるオリゴ糖鎖の固定化方法は、上記の課題を解決するために、オリゴ糖鎖を蛋白質分析用の支持体の表面に固定化するオリゴ糖鎖の固定化方法であって、上記一般式（３）または（４）で表されるリガンドを含む溶液と、表面に金を有する支持体とを接触させることを特徴としている。
【００４２】
本発明にかかるオリゴ糖鎖の固定化方法は、上記の課題を解決するために、オリゴ糖鎖を蛋白質分析用の支持体の表面に固定化するオリゴ糖鎖の固定化方法であって、上記一般式（５）で表されるリガンドを含む溶液と、表面にストレプトアビジン（またはアビジン）を固定化した支持体とを接触させることを特徴としている。
【００４３】
本発明にかかる蛋白質分析用の支持体は、上記の課題を解決するために、上記一般式（３）または（４）で表されるリガンドを、Ｓ−Ａｕ結合を介して表面に固定化させてなることを特徴としている。
【００４４】
本発明にかかる蛋白質分析用の支持体は、上記の課題を解決するために、上記一般式（５）で表されるリガンドを、ビオチン−ストレプトアビジン（またはアビジン）結合を介して表面に固定化させてなることを特徴としている。
【００４５】
【発明の実施の形態】
〔実施の形態１〕
以下、本発明について詳細に説明する。
本願発明者等は、自然界から単離、精製して得られる種々のオリゴ糖をそのまま用いて一段階で蛋白質分析用の支持体表面にオリゴ糖鎖を簡便に固定化することができると共に、蛋白質分析用の支持体を用いて分析する蛋白質との疎水性相互作用に基づく非特異的な相互作用による影響が低減され、種々の蛋白質との結合相互作用を連続的かつ定量的に評価できる蛋白質分析用の支持体を得るべく、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）法を用いて、構造が明確な硫酸化オリゴ糖を上記ＳＰＲのセンサチップに効率よく固定化し、種々の蛋白質との結合相互作用を連続的かつ定量的に評価できるシステムの開発を行った。
【００４６】
以下の説明では、蛋白質分析用の支持体としてＳＰＲのセンサチップを使用して該センサチップに、構造が明確な硫酸化オリゴ糖である硫酸化多糖ヘパリン中の下記一般式（７）
【００４７】
【化１３】

【００４８】
で表される特定の部分二糖構造（ＧｌｃＮＳ６Ｓ−ＩｄｏＡ２Ｓ）を二次元的に固定し、上記部分二糖構造（ＧｌｃＮＳ６Ｓ−ＩｄｏＡ２Ｓ）と種々の蛋白質との結合相互作用を評価するシステムについて主に説明するが、本発明は、これに限定されるものではない。
【００４９】
本発明では、オリゴ糖鎖を簡便に導入できる部位をリンカー化合物に組み込み、オリゴ糖鎖をリンカー化合物に導入した際に親水性部分がリンカー化合物との間に形成されるリガンド、すなわち、蛋白質と特異的に結合する物質を得た。これにより、本発明においては、リガンドを直接、蛋白質分析用の支持体に共有結合させ、これによりオリゴ糖を蛋白質分析用の支持体表面に固定化している。
【００５０】
本発明にかかるリンカー化合物は、分子内にジスルフィド結合を有する化合物であり、一般式（１）
【００５１】
【化１４】

【００５２】
で表される構造を有している。
【００５３】
上記一般式（１）で表されるリンカー化合物は、例えば以下の反応式
【００５４】
【化１５】

【００５５】
で示される反応により容易に得ることができる。
【００５６】
先ず、芳香族ジアミンである下記一般式（８）
【００５７】
【化１６】

【００５８】
で表されるｍ−フェニレンジアミンを、上記反応式に示すように、ＣＨ₃ ＯＨ（式中、ＭｅＯＨと記す）および（Ｃ₂ Ｈ₅ ）₃ Ｎ（式中、Ｅｔ₃ Ｎと記す）の存在下、（（ＣＨ₃)₃ ＣＯＣＯ）₂ Ｏ（式中、（Ｂｏｃ)₂Ｏと記す）と反応させることにより、上記一般式（８）で表されるｍ−フェニレンジアミンの一方のアミノ基を、ｔ−ブトキシカルボニル基（−ＣＯＣＯ（ＣＨ₃)₃基; 式中、Ｂｏｃ基と記す）で保護（Ｂｏｃ化）することにより、下記一般式（９）
【００５９】
【化１７】

【００６０】
で表される化合物が得られる。
【００６１】
次に、上記一般式（９）で表される化合物を、上記反応式に示すように、ＣＨ₂ Ｃｌ₂ 中、水溶性カルボジイミド（式中、ＥＤＣ・ＨＣｌと記す）、並びに、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（式中、ＨＯＢｔと記す）の存在下で、ジスルフィド結合を有する下記一般式（１０）
【００６２】
【化１８】

【００６３】
で表されるチオクト酸と縮合反応させることにより、下記一般式（１１）
【００６４】
【化１９】

【００６５】
で表される化合物が得られる。
【００６６】
次いで、上記一般式（１１）で表される化合物を、上記反応式に示すように、ジオキサンの存在下、例えば０℃にてトリフルオロ酢酸（式中、ＴＦＡと記す）によりＢｏｃ基を除去することにより、分子内にジスルフィド結合を有する前記一般式（１）で表されるリンカー化合物が得られる。
【００６７】
本実施の形態では、前記一般式（８）で表されるｍ−フェニレンジアミンの一方のアミノ基をＢｏｃ化して前記一般式（９）で表される化合物を７８％の収率で得た後、該一般式（９）で表される化合物をＥＤＣ・ＨＣｌおよびＨＯＢｔの存在下で前記一般式（１０）で表されるチオクト酸と縮合反応させることにより、前記一般式（１１）で表される化合物を収率８６％で調製した。その後、前記一般式（１１）で表される化合物をジオキサンの存在下、０℃にてＴＦＡでＢｏｃ基を除去することにより、前記一般式（１）で表される目的のリンカー化合物を収率８５％で得た。
【００６８】
続いて、このリンカー化合物の反応性を確認するために該リンカー化合物をグルコースと反応させたところ、下記一般式（３）
【００６９】
【化２０】

【００７０】
で表される親水性のリガンドを合成することができた。
【００７１】
すなわち、本発明にかかる上記一般式（３）で表されるリガンドは、グルコースをリンカー化合物に導入することにより、前記一般式（１）で表されるリンカー化合物に由来する構造単位、特に、ジスルフィド結合をその分子内に有すると共に、グルコースの導入、ひいてはオリゴ糖鎖の導入に際し、親水性部分がリンカー化合物との間に形成される親水性のリガンドであり、下記反応式
【００７２】
【化２１】

【００７３】
で示されるように、前記一般式（１）で示されるリンカー化合物を、ＮａＢＨ₃ＣＮ、ＣＨ₃ＣＯＯＨ（式中、ＡｃＯＨと記す）およびＨ₂ Ｏの存在下、ｐＨ３、反応温度３７℃にて下記一般式（１２）
【００７４】
【化２２】

【００７５】
で表されるＤ−グルコースと還元アミノ化反応させることにより容易に調製することができる。
【００７６】
本実施の形態では、前記一般式（１）で表されるリンカー化合物を上記条件下で一般式（１２）で表されるＤ−グルコースと還元アミノ化反応させることにより、還元末端を効率良く利用して、前記一般式（３）で表される、親水性のリガンドを９２％という高収率で得た。
【００７７】
このように分子内にジスルフィド結合（Ｓ−Ｓ結合）を持たせた部位をリンカー化合物に導入することで、該リンカー化合物を例えばＳＰＲのセンサーチップ等をはじめとする蛋白質分析用の支持体表面にコートした金とイオウ−金結合（Ｓ−Ａｕ結合）させ易く、かつ、これら蛋白質分析用の支持体に、上記リンカー化合物に結合させたオリゴ糖鎖、つまり、上記したリンカー化合物を用いたリガンド中に含まれるオリゴ糖鎖を強固に結合させることができる。
【００７８】
すなわち、本発明によれば、リンカー分子内にジスルフィド結合を組み込んだ上記のリガンドを用いることで、該リガンドを例えばＳ−Ａｕ結合を介して蛋白質分析用の支持体に共有結合により直接結合させることができる。このため、上記のリガンド、すなわち、前記一般式（１）で表されるリンカー化合物に由来する構造単位を含むリガンドを用いれば、オリゴ糖鎖を蛋白質分析用の支持体表面に簡便に固定化することができると共に、蛋白質分析用の支持体を用いて分析する蛋白質との疎水性相互作用に基づく非特異的な相互作用をほぼ無視することができるシステムを構築することができる。
【００７９】
次に、上記したリンカー化合物並びにリガンドに由来する構造単位を有する本発明にかかるリガンドとして、前記一般式（７）で表される特定の部分二糖構造（ＧｌｃＮＳ６Ｓ−ＩｄｏＡ２Ｓ）を有するリガンドについて以下に説明する。
【００８０】
本発明にかかる上記リガンドは、前記一般式（１）で表されるリンカー化合物を前記一般式（７）で表される部分二糖構造（ＧｌｃＮＳ６Ｓ−ＩｄｏＡ２Ｓ）を含む化合物と反応させることにより上記部分二糖構造（ＧｌｃＮＳ６Ｓ−ＩｄｏＡ２Ｓ）を前記した本発明にかかるリンカー化合物に導入してなるリガンドであり、下記一般式（４）
【００８１】
【化２３】

【００８２】
で表される構造を有している。
【００８３】
このため、上記一般式（４）で表されるリガンドもまた、前記一般式（１）で表されるリンカー化合物に由来する構造単位、特に、ジスルフィド結合をその分子内に有している。
【００８４】
上記一般式（４）で表される構造を有するリガンド（ＧｌｃＮＳ６Ｓ−ＩｄｏＡ２Ｓ−Ｌｉｇａｎｄ）は、下記反応式
【００８５】
【化２４】

【００８６】
で示されるように、ヘパリンの部分構造である二糖、すなわち、前記一般式（７）で表される部分二糖構造（以下、ＧｌｃＮＳ６Ｓ−ＩｄｏＡ２Ｓと記す）の還元末端にグルコース単位を挿入した、下記一般式（１３）
【００８７】
【化２５】

【００８８】
で表される構造を有する三糖を公知の方法で別途合成しておき、この三糖と前記一般式（１）で表されるリンカー化合物とを、ＣＨ₃ ＣＯＯＨ（式中、ＡｃＯＨと記す）／Ｈ₂ Ｏ／ＣＨ₃ ＯＨ（式中、ＭｅＯＨと記す）の混合溶媒中にて、ＮａＢＨ₃ ＣＮの存在下、最適化した還元アミノ化反応させることによって調製することができる。上記三糖は、例えば「S.Koshida et al., Tetrahedron lett. Vol. 42, p1289, 2001年」に記載の方法により合成することができる。表１に、前記一般式（１）で表されるリンカー化合物と三糖との反応条件を示す。なお、ＮａＢＨ₃ＣＮは、１０当量（ｅｑ）ずつ複数回に分けて添加した。
【００８９】
【表１】

【００９０】
なお、表１中、ａ）は６ｍＭ、ｂ）は１３ｍＭ、ｃ）は３７ｍＭを示す。
【００９１】
前記一般式（１）で表されるリンカー化合物は、酢酸・水・メタノール溶媒系に溶解する。表１から判るように、前記一般式（１）で表されるリンカー化合物は、酢酸・水・メタノール溶媒系にてＮａＢＨ₃ ＣＮの存在下で三糖と反応し、例えば反応例５に示す条件下で前記一般式（１）で表されるリンカー化合物と三糖とを反応させることにより、本発明にかかる目的のリガンド（ＧｌｃＮＳ６Ｓ−ＩｄｏＡ２Ｓ−Ｌｉｇａｎｄ；ＥＳＩ−ＭＳ（negative) ｍ／ｚ＝１０７２．１５[ Ｍ−３Ｎａ＋２Ｈ] ^- ) を得ることができる。
【００９２】
このようにして得られた本発明にかかるリガンドは、分子内にＳ−Ｓ結合を有し、これらリガンドを含む溶液と、表面に金を有する蛋白質分析用の支持体、例えば金をコートした前記ＳＰＲのセンサーチップ等のチップとを接触させることにより、これらリガンドに含まれるオリゴ糖鎖、つまり、前記一般式（１）で表されるリンカー化合物に組み込んだオリゴ糖のオリゴ糖鎖を、例えば図１に示すようにＡｕ−Ｓ結合を介して、一段階で上記蛋白質分析用の支持体表面に固定化させることができる。これにより、図１に示すように、分子内にジスルフィド基を有するリンカー化合物を還元アミノ化反応によって一段階で糖鎖に縮合させ、これをＡｕ−Ｓ結合を介してチップ上に固定化して部分二糖構造（ＧｌｃＮＳ６Ｓ−ＩｄｏＡ２Ｓ）の二次元クラスターを形成させてなるセンサーチップが得られる。なお、図１中、ＮＳ６Ｓは上記した部分二糖構造（ＧｌｃＮＳ６Ｓ−ＩｄｏＡ２Ｓ）のうちＧｌｃＮＳ６Ｓを示し、Ｉ２ＳはＩｄｏＡ２Ｓを示し、Ｇはグルコース単位を示す。
【００９３】
本発明にかかる上記した各リガンドを用いて蛋白質分析用の支持体表面に一段階でオリゴ糖鎖を固定化する際に用いられる上記リガンドを含む溶液としては、特に限定されるものではないが、具体的には、例えば、これらリガンドのメタノール溶液等が挙げられる。
【００９４】
本実施の形態においては、前記一般式（３）または（４）で表されるリガンドのメタノール溶液（０．１ｍＭ）に、表面を金でコーティングしたガラス製のチップを２時間浸漬し、前記一般式（３）または（４）で表されるリガンド中のＳ−Ｓ結合をチップ表面の金とのＡｕ−Ｓ結合に変換させることによって、オリゴ糖をチップ表面に固定化させた。このようにして調製した２種類のチップの非特異的相互作用を、ウシ血清アルブミン（以下、ＢＳＡと記す）を試料として使用し、表面プラズモン共鳴装置（日本レーザー電子社製、ＳＰＲ６７０）を用いて測定することにより検討した。
【００９５】
なお、上記測定においては、比較のために、「G.M.Kuziemko et al, Biochemistry, Vol. 35, p6375, 1996年」に報告されているような疎水性相互作用を介してチップ表面にオリゴ糖鎖を固定化した場合におけるチップの非特異的相互作用を、０．１ｍｇ／ｍｌのＢＳＡを試料として使用し、表面プラズモン共鳴装置（日本レーザー電子社製、ＳＰＲ６７０）を用いて測定した。
【００９６】
図２は、下記一般式（１４）
【００９７】
【化２６】

【００９８】
で表される従来のリガンドを用いて疎水性相互作用を介してオリゴ糖類（マルトース）をチップに結合させた場合（図２中、線Ａにて示す）における非特異的相互作用によるレスポンス（ＲＵ：Resonance Unit）と前記一般式（３）で表される本発明のリガンドを用いてＡｕ−Ｓ結合を介してグルコースをチップに結合させた場合（図２中、線Ｂにて示す）における非特異的相互作用によるレスポンス（ＲＵ）との比較を示している。なお、バッファにはｐＨ７．４のリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）を使用した。また、バッファの流量は５μｌ／ｍｉｎとした。
【００９９】
ＢＳＡはマルトースやグルコースには相互作用しないことが判っているが、前記一般式（１４）で表される従来のリガンドによる疎水性相互作用を利用した測定系では、疎水性チップ上にこのようなグルコース構造をもったリガンドを固定化し、その上に疎水性蛋白質であるＢＳＡを加えたところ、線Ａに示すように大きなレスポンス（ＲＵ）が観測され、１２４０もの共鳴角度変化（ΔＲＵ）が観測され、非特異的な結合が起こっていることが判る。
【０１００】
これは、ＢＳＡとチップ上の疎水性場との非特異的な相互作用によるものであり、このように大きな非特異的相互作用があると、特異的相互作用を観測するのは非常に困難になる。
【０１０１】
一方、同じ濃度のＢＳＡを、Ａｕ−Ｓ結合を介してグルコース単位を固定化したチップ、すなわち、ジスルフィド結合を有する本発明にかかる親水性リガンドを固定化したチップ上に加えたところ、線Ｂに示すように、レスポンス（ＲＵ）はほぼ直線となり、非特異的な結合は殆ど観測されなかった。このことから、前記一般式（３）で表される本発明のリガンドを用いてＡｕ−Ｓ結合を介してグルコースをチップに結合させた場合、疎水性相互作用に基づく非特異的相互作用は無視できることが判った。
【０１０２】
また、同様に、前記一般式（４）で示されるリガンドを用いて上述した方法によりヘパリンの部分二糖構造（ＧｌｃＮＳ６Ｓ−ＩｄｏＡ２Ｓ）を固定化したチップを用いて、ＢＳＡ、並びに、ヒト由来フォンビルプラント因子蛋白質中のヘパリン結合ドメインである合成ｖＷＦペプチド（ｖＷＦ中のヘパリン結合サイト：ＹＩＧＬＫＤＲＫＲＰＳＥＬＲＲＩＡＳＱＶＫＹＡ−ＮＨ）との相互作用によるレスポンス（ＲＵ）を、表面プラズモン共鳴装置（日本レーザー電子社製、ＳＰＲ６７０）を用いて測定した。
【０１０３】
図３中、線Ｃは試料として０．１ｍｇ／ｍｌのＢＳＡを使用した場合のレスポンス（ＲＵ）を示し、線Ｄは試料として２μＭの合成ｖＷＦペプチドを使用した場合のレスポンス（ＲＵ）を示す。なお、バッファにはｐＨ７．４のＰＢＳを使用した。また、バッファの流量は５μｌ／ｍｉｎとした。
【０１０４】
ＢＳＡはヘパリンと非特異的に僅かに相互作用することが知られているが、上記測定の結果、線Ｃに示すように、僅かに相互作用はみられるが、その強さはほぼ無視できる程度であることが判明した。
【０１０５】
一方、ヘパリンと結合相互作用することが確認されている、ヒト由来フォンビルプラント因子蛋白質中のヘパリン結合ドメインである、２μＭの合成ｖＷＦペプチドをＢＳＡの代わりに用いてＳＰＲを測定したところ、線Ｄに示すように明らかな結合曲線が観測され、非常に高い相互作用があることが判った。このことから、上記したチップを用いた場合には疎水性相互作用による非特異的な相互作用の影響を無視できると考え、合成ｖＷＦペプチドの解離定数Ｋ_D を求めた。
【０１０６】
図４は、合成ｖＷＦペプチドの濃度を０．０５μＭから２．０μＭまで連続的に変化させて前記一般式（４）で表されるリガンドを固定化したチップ上に加えた場合の結合曲線を示す。なお、図４中、↑は合成ｖＷＦペプチドの注入を示し、↓はバッファに切り替わったことを示す。また、合成ｖＷＦペプチドのチップへの固定化量は、ｖＷＦペプチド注入前のベースライン（図中、点線にて示す）から、バッファに切り替わった後、合成ｖＷＦペプチドが解離して平行に達したたところまでの差をそれぞれとっている。なお、上記測定においても、バッファにはｐＨ７．４のＰＢＳを使用し、バッファの流量は５μｌ／ｍｉｎとした。また、表面プラズモン共鳴装置には、日本レーザー電子社製の表面プラズモン共鳴装置「ＳＰＲ６７０」を用いた。
【０１０７】
図５の線Ｅは、このときの固定量の変化、すなわち、前記一般式（４）で表されるリガンドを固定化したチップを用いた場合における合成ｖＷＦペプチドのチップへの固定化量の変化（レスポンス（ＲＵ））を合成ｖＷＦペプチドの濃度に対してプロットした図である。
【０１０８】
図５に示すように上記合成ｖＷＦペプチドの濃度を変化させて該合成ｖＷＦペプチドのそれぞれの濃度に対するレスポンス（ＲＵ）から結合度を測定し、該結合度から解離定数Ｋ_D を算出したところ、線Ｅで示すように、前記一般式（４）で表されるリガンド（ＧｌｃＮＳ６Ｓ−ＩｄｏＡ２Ｓ−ｌｉｇａｎｄ）を用いた場合には、 Sobel等が放射標識法によって求めた値(M.Sobel et al. J. Biol. Chem. (1992), vol.267, p8857 、Ｋ_D ＝370 ±100 ｎＭ)と非常に近い値（Ｋ_D ＝２１０ｎＭ）が導かれた。
【０１０９】
一方、前記一般式（３）で表されるリガンド（親水性リガンド）を固定化したチップ上に合成ｖＷＦペプチドを上記と同様に注入したが、この場合は、図５の線Ｆに示すように、合成ｖＷＦペプチドと該チップとの結合相互作用は殆ど観測されず、非特異的な相互作用はないことが確認された。
【０１１０】
以上のように前記一般式（３）で表されるリガンドを固定化したチップを用いてｖＷＦ中のヘパリン結合ドメインを含む合成ペプチドとの結合挙動をＳＰＲで測定した結果、特異的な相互作用のみが観測され、さらに天然ヘパリンとこの合成ペプチド（合成ｖＷＦペプチド）との解離定数Ｋ_D にほぼ等しい値がＳＰＲ解析から得られたことから、このチップの有用性が明らかとなった。
【０１１１】
また、以上のことから、本発明にかかる上記各リガンド並びにこれらリガンドに用いられる前記一般式（１）で表されるリンカー化合物は、オリゴ糖鎖を、例えばＡｕ−Ｓ結合を介して、蛋白質分析用の支持体表面に固定化するために非常に優れた性質を有する化合物であることが明らかになった。
【０１１２】
以上のように、本発明によれば、還元アミノ化反応によって、硫酸化二糖、すなわち、ヘパリンの部分二糖構造（ＧｌｃＮＳ６Ｓ−ＩｄｏＡ２Ｓ）に、分子内にジスルフィド結合を有するリンカーを導入することができた。そして、このようにして合成したリガンドを用いて、硫酸化二糖をＡｕ−Ｓ結合を介してチップへ固定化することにより、チップとの非特異的な相互作用を無視できる実験系を確立することができた。さらに、このチップを用いると、硫酸化二糖と合成ｖＷＦペプチドとの特異的な相互作用を観測することができることが判った。
【０１１３】
なお、本発明においては、ヘパリン結合性蛋白質として上記した合成ｖＷＦペプチドを使用したが、本発明はこれに限定されるものではなく、上記したチップを用いることで、他のヘパリン結合性蛋白質との結合挙動も解析することが可能である。
【０１１４】
以上のように、本発明によれば、上記のリンカー化合物を用いれば、還元末端を有しているオリゴ糖鎖をチップ表面に簡便に固定化できるようになったばかりでなく、チップを用いて分析する蛋白質との疎水性相互作用に基づく非特異的な相互作用をほぼ無視することができるシステムを構築することができた。
【０１１５】
さらに、本願発明者等は、オリゴ糖の生物活性を評価するために、オリゴ糖を効率良く集合化し、多糖のオリゴ糖を一段階で蛋白質分析用の支持体表面に導入すべく鋭意検討した。この結果、本願発明者等は、図６に示すように多価の芳香族アミン部分とビオチン部分とを有するリンカー化合物（ビオチンリンカー）を用いてオリゴ糖鎖を集合化させ、該オリゴ糖鎖を、ビオチン−ストレプトアビジン（またはアビジン）の結合を利用してＳＰＲのセンサチップ等のチップやアフィニティークロマトグラフィーの担体等の蛋白質分析用の支持体表面に固定化することで、多糖のオリゴ糖を一段階で蛋白質分析用の支持体表面に導入し、オリゴ糖の集合化と固定化との両方を実現することができることを見い出した。なお、図６並びに以下に示す図において、Ｓｔはストレプトアビジン（またはアビジン）を示し、Ｂｉはビオチンを示す。
【０１１６】
以下、本発明にかかる他のリンカー化合物として、分子内にＳ−Ｓ結合を持たせた部位の代わりにビオチンをリンカー化合物に導入してなるビオチンリンカーについて説明すると共に、該ビオチンリンカーを用いたリガンド並びに該リガンドを用いたオリゴ糖鎖の固定化方法および該リガンドを固定化させた、蛋白質分析用の支持体について説明する。
【０１１７】
本発明にかかる他のリンカー化合物は、ビオチンと複数個のオリゴ糖を結合させ得る反応点を併せ持った多岐用途型リンカーであり、
一般式（２）
【０１１８】
【化２７】

【０１１９】
で表される構造を有している。
【０１２０】
上記一般式（２）で表されるリンカー化合物は、例えば以下の式
【０１２１】
【化２８】

【０１２２】
で示される反応により容易に得ることができる。
【０１２３】
先ず、上記の反応式にしたがって下記一般式（１５）
【０１２４】
【化２９】

【０１２５】
で表されるｐ−アミノ安息香酸を、ＭｅＯＨおよびトリエチルアミン（ＴＥＡ）の存在下、（Ｂｏｃ）₂ Ｏと室温にて反応させて上記一般式（１５）で表されるｐ−アミノ安息香酸のアミノ基をＢｏｃ基で保護（Ｂｏｃ化）することにより、下記一般式（１６）
【０１２６】
【化３０】

【０１２７】
で表される化合物が得られる。
【０１２８】
次に、反応温度を０℃から室温に昇温させて、上記一般式（１６）で表される化合物を、ＣＨ₂ Ｃｌ₂ 中、ＨＯＢｔ、ＥＤＣ．ＨＣｌの存在下で、下記一般式（１７）
【０１２９】
【化３１】

【０１３０】
で表されるジエチレントリアミン（０．５当量）と反応させて縮合させることにより、下記一般式（１８）
【０１３１】
【化３２】

【０１３２】
で表される化合物が得られる。
【０１３３】
次に、上記一般式（１８）で表される化合物をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）に溶解し、ＴＥＡ（２当量）の存在下で、下記一般式（１９）
【０１３４】
【化３３】

【０１３５】
で表される、ビオチンの活性エステル化合物と反応させることにより、下記一般式（２０）
【０１３６】
【化３４】

【０１３７】
で表される化合物が得られる。
【０１３８】
次いで、反応温度を０℃から室温に昇温させてトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）で上記一般式（２０）で表される化合物のＢｏｃ基、すなわち、アミノ基の保護基を外す（脱保護する）ことにより、本発明にかかるリンカー化合物として、前記一般式（２）で表される、糖鎖を二単位集合化させるためのビオチンリンカーが得られる。
【０１３９】
本実施の形態では、上記一般式（１５）で表されるｐ−アミノ安息香酸のアミノ基をＢｏｃ基で保護（Ｂｏｃ化）することにより、一般式（１６）で表される化合物を収率７５％で得た後、該一般式（１６）で表される化合物を上記した条件下で一般式（１７）で表されるジエチレントリアミン（０．５当量）と反応させることにより、収率９３％で一般式（１８）で表される化合物を調製した。その後、上記一般式（１８）で表される化合物を、上記した条件下で一般式（１９）で表されるビオチンの活性エステル化合物と反応させることにより、一般式（２０）で表される化合物（ＥＳＩ−ＭＳ（positive）ｍ／ｚ＝５２４．４ [Ｍ＋Ｈ] ⁺ ) を得た。上記ビオチンの活性エステル化合物並びに反応式中、conditionsの表記にて示す反応条件（溶媒および反応温度）を変更した場合における上記一般式（２０）で表される化合物の各収率を表２に示す。
【０１４０】
【表２】

【０１４１】
表２に示すように、ビオチン活性化エステルとして、ペンタフルオロフェニル基（Ｐｆｐ）を用いた系により、目的とする上記一般式（１８）で表される化合物を最も収率良く得ることができた。
【０１４２】
続いて、ＴＦＡで上記一般式（１８）で表される化合物のＢｏｃ基を脱保護することにより、上記ビオチンリンカー、すなわち、前記一般式（２）で表されるリンカー化合物を収率９１％で得た。
【０１４３】
続いて、このリンカー化合物を用いてオリゴ糖鎖を集合化させた。集合化させる糖鎖には、血液凝固に関わるフォンビルブラント因子ペプチド（ｖＷＦペプチド）と相互作用する、ヘパリン中の硫酸化部分二糖、すなわち、前記一般式（７）で表される部分二糖構造（ＧｌｃＮＳ６Ｓ−ＩｄｏＡ２Ｓ）を使用した。
【０１４４】
すなわち、上記ビオチンリンカーを用いた本発明にかかるリガンドは、下記一般式（５）
【０１４５】
【化３５】

【０１４６】
で表される構造を有し、前記一般式（２）で表されるリンカー化合物にヘパリン中の硫酸化部分二糖（ＧｌｃＮＳ６Ｓ−ＩｄｏＡ２Ｓ）が導入された構造を有している。
【０１４７】
これにより、上記一般式（５）で表されるリガンドは、前記一般式（２）で表されるリンカー化合物に由来する構造単位を有し、ビオチンとストレプトアビジン（またはアビジン）との高い親和性を利用してオリゴ糖鎖として上記硫酸化部分二糖（ＧｌｃＮＳ６Ｓ−ＩｄｏＡ２Ｓ）をビオチン−ストレプトアビジン（またはアビジン）結合により蛋白質分析用の支持体に固定化させることができる。
【０１４８】
上記一般式（５）で表されるリガンドは、下記反応式
【０１４９】
【化３６】

【０１５０】
で示されるように、最適化した還元アミノ化反応を用いて、上記硫酸化部分二糖を含む三糖体、すなわち、ヘパリン中の部分構造二糖（ＧｌｃＮＳ６Ｓ−ＩｄｏＡ２Ｓ）の還元末端にグルコース単位を導入した前記一般式（１３）で表される三糖を、Ｈ₂ Ｏ／ＡｃＯＨ／ＭｅＯＨの混合溶媒に溶解し、ＮａＢＨ₃ＣＮの存在下で前記一般式（２）で表される、多岐用途型のリンカー化合物であるビオチンリンカーに導入することにより調製した。
【０１５１】
表３に、前記一般式（２）で表されるリンカー化合物と三糖との反応条件を示す。
【０１５２】
【表３】

【０１５３】
表３から判るように、前記一般式（２）で表されるリンカー化合物は、酢酸・水・メタノール溶媒系にてＮａＢＨ₃ＣＮの存在下で三糖と反応し、例えば反応例３に示す条件下で前記一般式（２）で表されるリンカー化合物と三糖とを反応させることにより、糖鎖が２単位集合化した本発明にかかる目的のリガンド、すなわち、ヘパリン部分二糖構造を２単位含む、上記一般式（５）で表される多岐用途型のリガンド（オリゴ糖鎖リガンド；ＥＳＩ−ＭＳ（negative) ｍ／ｚ＝５２３．８[ Ｍ−７Ｎａ＋３Ｈ]^4- ）を得ることができた。
【０１５４】
次に、上記オリゴ糖鎖リガンドを使用し、ＳＰＲにより、該オリゴ糖鎖リガンドと合成ｖＷＦペプチドとの相互作用を確認した。まず、上記一般式（５）で表される化合物をストレプトアビジンを固定化したＳＰＲのセンサチップ表面上にビオチン−ストレプトアビジンの高い親和性を利用して配列させ、ヘパリン結合性のモデルペプチドとの相互作用を調べ、その有用性を検討した。
【０１５５】
ここで、オリゴ糖鎖リガンドをＳＰＲのセンサチップ上に固定化する操作について、図７（ａ）〜（ｄ）を参照して以下に説明する。
【０１５６】
本発明にかかる上記オリゴ糖鎖リガンドは、該オリゴ糖鎖リガンドを含む溶液と、予めストレプトアビジンを固定化したＳＰＲのセンサチップ（ストレプトアビジン固定化チップ）とを接触させることにより、該オリゴ糖鎖リガンドに含まれるオリゴ糖鎖、つまり、上記ビオチンリンカーに組み込んだオリゴ糖のオリゴ糖鎖を一段階でＳＰＲのセンサチップ表面に固定化させることができる。
【０１５７】
ストレプトアビジン固定化チップは、図７（ａ）に示すようにガラス基盤表面に金をコーティングしたＳＰＲのセンサチップに、図７（ｂ）に示すようにＡｕ−Ｓ結合を利用して下記一般式（２１）
【０１５８】
【化３７】

【０１５９】
で表される４，４−ジチオジ酪酸を固定化させ、図７（ｃ）に示すように固定化させた４，４−ジチオジ酪酸を水可溶性のカルボジイミドの存在下でＮ−ヒドロキシコハク酸イミドと反応させて活性化した後、図７（ｄ）に示すようにストレプトアビジンの末端アミノ基を縮合させることにより作成、つまり、ストレプトアビジンを固定化することができる。
【０１６０】
図８はＳＰＲのセンサチップ上にストレプトアビジンを固定化した時のＳＰＲのセンサグラムの結果の一例であり、横軸はランニングバッファのフロー時間を示し、縦軸は共鳴角度変化（ＲＵ：Resonance Unit）を示す。
【０１６１】
また、図８中、矢印Ｘはストレプトアビジン溶液の注入を示し、矢印Ｙはランニングバッファに自動的に切り替わったことを示す。なお、ランニングバッファにはｐＨ７．４のＰＢＳを使用し、その流量は５μｌ／ｍｉｎとした。また、表面プラズモン共鳴装置には、日本レーザー電子社製の表面プラズモン共鳴装置「ＳＰＲ６７０」を用いた。そして、結合に関与しなかったストレプトアビジンをランニングバッファで洗い流し、チップ上に残存する活性エステルを１Ｍアミノエタノールによりキャッピングした。最終的なストレプトアビジンの固定化量はストレプトアビジン注入前のベースラインと、アミノエタノールによるキャッピングの後の共鳴角度変化の差とした。このセンサグラムでのストレプトアビジンの固定化量は２９３０ＲＵであった。
【０１６２】
本発明にかかるオリゴ糖鎖リガンドは、このようにして作成したストレプトアビジン固定化チップに、ビオチン−ストレプトアビジンの高い親和性を利用して固定化させることが可能であり、上記オリゴ糖鎖リガンドを用いれば、前記したように該オリゴ糖鎖リガンドを含む溶液と、予めストレプトアビジンを固定化したＳＰＲのセンサチップとを接触させることにより、該センサチップ表面に集合化されたオリゴ糖鎖を一段階で固定することができる。
【０１６３】
このときに用いられる上記オリゴ糖鎖リガンドを含む溶液としては、具体的には、例えば、上記オリゴ糖鎖リガンドのＰＢＳ溶液等が挙げられる。
【０１６４】
本実施の形態によれば、上記オリゴ糖鎖リガンドを含む溶液、例えば上記オリゴ糖鎖リガンドのＰＢＳ溶液に、ストレプトアビジンを固定化した上記センサチップを浸漬するかもしくは後述するようにストレプトアビジンを固定化したセンサチップにオリゴ糖鎖リガンドを含む溶液を注入して既知のビオチン−アビジン特異的結合相互作用を用いたビオチン−ストレプトアビジン結合によって上記オリゴ糖鎖リガンドを上記センサチップに固定化させることにより、表面にヘパリン部分二糖構造を有するセンサチップを作成することができた。
【０１６５】
次に、このセンサチップを用いてｖＷＦペプチドとの結合定数Ｋ_D を測定した。
図９（ａ）は、ストレプトアビジンを固定化したＳＰＲのセンサチップを示す。上記ｖＷＦペプチドとの結合定数の測定に際しては、図９（ａ）に示すセンサチップに、濃度を変えてオリゴ糖鎖リガンドを含むＰＢＳ溶液を注入して図９（ｂ）に示すように該オリゴ糖鎖リガンド固定化させ、次いで、図９（ｃ）に示すようにさらに濃度を変えてｖＷＦペプチドを注入した。このようにして得られたセンサグラムの一例を図１０に示す。
【０１６６】
図１０はセンサチップ上にオリゴ糖鎖リガンドを固定化させ、濃度を変えてｖＷＦペプチドを注入したときのＳＰＲのセンサグラムの結果の一例であり、横軸はランニングバッファのフロー時間を示し、縦軸は共鳴角度変化（ＲＵ）を示す。
【０１６７】
また、図１０中、↑はオリゴ糖鎖リガンドの注入を示し、↓は結合に関与しなかったオリゴ糖鎖リガンドの洗浄のためのランニングバッファの注入を示す。オリゴ糖鎖リガンドは、その濃度を１．３９μＭから２．２２μＭまで連続的に変化させて上記センサチップに加えた。なお、ランニングバッファにはｐＨ７．４のＰＢＳを使用し、その流量は１０μｌ／ｍｉｎとした。また、表面プラズモン共鳴装置には、日本レーザー電子社製の表面プラズモン共鳴装置「ＳＰＲ６７０」を用いた。オリゴ糖鎖リガンドの固定化量は、オリゴ糖鎖リガンドの注入前のベースラインと、余分なオリゴ糖鎖リガンドが洗い流され、共鳴角度変化（ＲＵ）が一定になった時の差が固定化量に相当する。上記のセンサグラムではオリゴ糖鎖リガンドの固定化量は１４０ＲＵであった。
【０１６８】
続いて、オリゴ糖鎖リガンドを固定化させたセンサーチップに、ｖＷＦペプチドを注入し、結合させた後、ランニングバッファにより解離させ、その時の共鳴角度変化（ＲＵ）を観測した。ｖＷＦペプチドは、その濃度を０．５μＭから１．０μＭまで連続的に変化させて上記センサチップに加えた。結合定数Ｋ_D の算出には、オリゴ糖鎖リガンドとｖＷＦペプチドとの結合による正の共鳴角度変化から求めた結合速度と、解離による負の共鳴角度変化から求めた解離速度とを用いた。
【０１６９】
上記の測定から算出された結合定数Ｋ_D は、Sobel 等が放射標識法によって求めた値(M.Sobel et al. J. Biol. Chem. (1992), vol.267, p8857 、Ｋ_D ＝370 ±100 ｎＭ）とほぼ同じ値（Ｋ_D ＝２８０ｎＭ）であった。
【０１７０】
以上のように、本実施の形態においては、糖鎖を集合化させるための新規なビオチンリンカーを提供した。そして、このビオチンリンカーを用いることにより、糖鎖を集合化させることができた。そして、この集合化させた糖鎖と蛋白質との相互作用をＳＰＲで確認することにより、ビオチンリンカーのＳＰＲへの応用が可能であることが判った。
【０１７１】
このように、上記ビオチンリンカーは、その分子内にビオチンが導入されていることで、既知の方法で前もってストレプトアビジンを固定化したチップやアフィニティークロマトグラフィーの担体に、ビオチン−アビジンの強い特異的相互作用を利用したビオチン−ストレプトアビジン結合によりオリゴ糖鎖を固定化することができる。
【０１７２】
この結果、上記ビオチンリンカーを用いることで、還元末端を有しているオリゴ糖鎖を蛋白質分析用の支持体表面に簡便に固定化できるようになった。また、従来、不可能であった、自然界から単利精製して得られるオリゴ糖をそのまま用いて蛋白質分析用の支持体表面に固定することが可能となった。
【０１７３】
【発明の効果】
以上のように、本発明によれば、分子内にＳ−Ｓ結合もしくはビオチンを持たせた部位をリンカー化合物に導入することで、自然界から単離、精製して得られる種々のオリゴ糖を一段階で、蛋白質分析用の支持体表面に固定化することができると共に、このような支持体を用いて分析する蛋白質との疎水性相互作用に基づく非特異的な相互作用による影響が低減された蛋白質分析用の支持体を得ることができるリンカー化合物およびリガンド並びにオリゴ糖鎖の固定化方法および蛋白質分析用の支持体を提供することができるという効果を奏する。
【図面の簡単な説明】
【図１】一般式（４）で表される本発明のリガンドを用いて硫酸化多糖ヘパリン中の部分二糖構造を固定化してなる蛋白質分析用の支持体を示す模式図である。
【図２】従来のリガンドを用いてマルトースをセンサチップに結合させた場合における非特異的相互作用によるレスポンスと一般式（３）で表される本発明のリガンドを用いてグルコースを蛋白質分析用の支持体に結合させた場合における非特異的相互作用によるレスポンスとを比較するグラフである。
【図３】図１に示す蛋白質分析用の支持体を用いてＢＳＡ並びに合成ｖＷＦペプチドとの非特異的相互作用によるレスポンスを測定した結果を示すグラフである。
【図４】合成ｖＷＦペプチドの濃度を連続的に変化させて図１に示す蛋白質分析用の支持体に加えた場合の結合曲線を示すグラフである。
【図５】合成ｖＷＦペプチドの濃度を連続的に変化させて図１に示す蛋白質分析用の支持体に加えた場合における合成ｖＷＦペプチドの上記蛋白質分析用の支持体への固定化量の変化を示すグラフである。
【図６】一般式（５）で表される本発明のリガンドを用いてオリゴ糖鎖を集合可能なうえ固定化してなる蛋白質分析用の支持体を示す模式図である。
【図７】（ａ）〜（ｄ）は、一般式（５）で表される本発明のリガンドを上記蛋白質分析用の支持体上に固定化する操作を示す説明図である。
【図８】ＳＰＲに用いる蛋白質分析用の支持体上にストレプトアビジンを固定化した時のＳＰＲのセンサグラムである。
【図９】（ａ）は、ストレプトアビジンを固定化したＳＰＲ用の蛋白質分析用の支持体を示す模式図であり、（ｂ）は、（ａ）に示す蛋白質分析用の支持体に一般式（５）で表される本発明のリガンドを固定化させた状態を示す模式図であり、（ｃ）は、（ｂ）に示す蛋白質分析用の支持体にさらに濃度を変えてｖＷＦペプチドを注入したときの上記蛋白質分析用の支持体とｖＷＦペプチドとの相互作用を示す模式図である。
【図１０】ＳＰＲに用いる蛋白質分析用の支持体上に一般式（５）で表されるリガンドを固定化させ、濃度を変えてｖＷＦペプチドを注入したときのＳＰＲのセンサグラムである。
【図１１】従来のリガンドを用いて疎水性相互作用により硫酸化多糖ヘパリン中の部分二糖構造を固定化してなる従来のセンサチップを示す模式図である。
【図１２】図１１に示すセンサチップを用いて硫酸化多糖ヘパリン中の部分二糖構造と硫酸化多糖ヘパリン結合性の蛋白質との結合挙動を解析した結果を示すグラフである。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a linker compound capable of introducing an oligosaccharide chain into a support for protein analysis such as a sensor chip such as surface plasmon resonance or a carrier for affinity chromatography in one step, and the linker compound. The present invention relates to a ligand, a method for immobilizing an oligosaccharide chain using the ligand, and a support for protein analysis in which the ligand is immobilized on a surface.
[0002]
[Prior art]
The following general formula (6)
[0003]
[Chemical 6]

[0004]
It is known that the sulfated polysaccharide heparin represented by the formula has a very heterogeneous structure and molecular weight and has many biological activities. Among them, anticoagulant activity is famous and widely used as a medicine.
[0005]
However, the heterogeneous sulfated polysaccharide heparin also binds to platelets and von Willebrand factor (vWF). For this reason, the side effect resulting from the coupling | bonding with the platelet in the blood at the time of using sulfated polysaccharide heparin as a pharmaceutical conventionally is pointed out.
[0006]
These binding interactions include the following general formula (7) in sulfated polysaccharide heparin.
[0007]
[Chemical 7]

[0008]
The specific partial disaccharide structure represented by (GlcNS6S-IdoA2S) and the clustering effect based thereon are important.
[0009]
The inventors of the present application have previously found that this specific partial disaccharide structure (GlcNS6S-IdoA2S) is greatly involved in binding to a protein called von Willebrand factor (vWF) involved in platelet cells and blood coagulation.
[0010]
However, there is a problem that special equipment and a large amount of oligosaccharide are required for these biochemical binding experiments. Conventionally, radiolabeling (RI) and SPR are known as methods for measuring biological activity, but RI requires special experimental equipment and a large amount of oligosaccharides.
[0011]
Therefore, the inventors of the present invention use a surface plasmon resonance (SPR) sensor chip, which is a non-radiolabeling method, as a support for protein analysis, and on the surface of the sensor chip, as shown in FIG. The partial disaccharide structure (GlcNS6S-IdoA2S) described above is immobilized through sex interaction, and the partial disaccharide structure (GlcNS6S-IdoA2S) in sulfated polysaccharide heparin and sulfated polysaccharide heparin-binding protein The binding behavior of was analyzed. The SPR method can be measured with a small amount of oligosaccharide, and the interaction between molecules can be observed in real time. In FIG. 11, NS6S represents GlcNS6S in the above partial disaccharide structure (GlcNS6S-IdoA2S), I2S represents IdoA2S, and G represents a glucose unit.
[0012]
Specifically, the above-mentioned partial disaccharide structure (GlcNS6S-IdoA2S) is immobilized on a hydrophobic chip as a sensor chip, and a synthetic vWF peptide having a sulfated polysaccharide heparin binding domain (in vWF) Heparin binding site; YIGLKDRKRPSELRRRIASQVKYA-NH) was added as an analyte.
[0013]
As a result, as shown by the line a in FIG. 12, a change in the binding amount according to the change in the concentration of the vWF peptide, that is, ΔRU1 (oligosaccharide binding amount) / ΔRU2 (vWF peptide binding amount) was observed.
[0014]
The dissociation constant K obtained from the curve of this line a _D Was previously measured by Sobel et al. Using biochemical techniques (M. Sobel et al. J. Biol. Chem. (1992), vol. 267, p8857, K _D = 370 ± 100 nM), which is close to the order.
[0015]
[Problems to be solved by the invention]
However, in this case, since the binding interaction with the synthetic vWF peptide was observed even when a ligand having a glucose residue at the end was used as shown by the line b in FIG. It was found that a non-specific interaction that seems to be caused by the affinity, that is, a non-specific interaction between the hydrophobic field of the sensor chip and the synthetic vWF peptide was included.
[0016]
Therefore, a linker compound and a ligand capable of almost ignoring a non-specific interaction based on a hydrophobic interaction with a protein to be analyzed using a support for protein analysis in this way, and a method for immobilizing the ligand on a chip Furthermore, providing a support for protein analysis, such as a sensor chip for SPR, on which the ligand is immobilized, provides biochemical binding between the partial disaccharide structure (GlcNS6S-IdoA2S) and the protein. It is very important to continuously and quantitatively evaluate the binding interaction by, that is, the binding interaction between a sulfated oligosaccharide having a clear structure and various proteins.
[0017]
In recent years, it has been revealed that oligosaccharide chains play an important role in vivo. However, in order to conduct research on the molecular level of oligosaccharide chains, it is necessary to use oligosaccharide chains whose structure is completely known as described above, and to obtain such oligosaccharide chains in large quantities from nature. Are difficult, and the synthesis is not easy.
[0018]
In addition, oligosaccharide chains are often not very active in a single molecule, and it is necessary to assemble oligosaccharide chains in order to analyze the interaction with proteins. In other words, since the affinity between a natural oligosaccharide and the protein with which it interacts is generally low, it is important to efficiently assemble oligosaccharide chains in order to evaluate the biological activity of the oligosaccharide. is there.
[0019]
Conventional attempts to bind (immobilize) oligosaccharide chains to the surface of a sensor chip used in SPR measurement devices, etc., for example, create a short molecular film of a long alkyl chain on the chip surface and use hydrophobic interaction. Attempts have been made to immobilize oligosaccharide chains on chips (GMKuziemko et al., Biochemistry, Vol. 35, p6375, 1996).
[0020]
However, in the method described in the above document, the types of oligosaccharide chains that can be immobilized on the chip surface are limited, and oligosaccharide chains having a hydrophobic group such as ganglioside can be immobilized on the chip. Various oligosaccharide chains cannot be easily immobilized on the chip surface. In addition, the chip on which the oligosaccharide chain is immobilized by the above-mentioned conventional method has too high hydrophobicity on the surface of the chip, and non-specific interaction with the protein to be analyzed using the chip is greatly observed. It has the problem that it is scarce.
[0021]
In addition, in order to immobilize the oligosaccharide chain on the chip surface by the above conventional method, using synthetic chemistry, various protective groups are first introduced into the hydroxyl group of the oligosaccharide chain and then chemically condensed. Therefore, it is necessary to fix it to the chip. For this reason, conventionally, it was practically impossible to immobilize the oligosaccharide chain on the chip surface using the oligosaccharide obtained by isolation and purification from nature as it is.
[0022]
Furthermore, in order to separate and purify a protein that specifically interacts with an oligosaccharide chain, it is necessary to use an oligosaccharide chain with a known structure as a ligand for affinity chromatography.
[0023]
For this reason, oligosaccharide chains can be assembled and immobilized on a support for protein analysis such as a sensor chip for SPR or a carrier for affinity chromatography as described above, and various oligosaccharides can be immobilized in one step. There is a need for a linker compound that can be introduced, a ligand using the linker compound, a method for immobilizing the ligand on a chip, and a support for protein analysis in which the ligand is immobilized.
[0024]
The present invention has been made to solve the above problems, and its object is to provide a support for protein analysis in one step using various oligosaccharides obtained by isolation and purification from nature as they are. The oligosaccharide chain can be easily immobilized on the surface, and the influence of non-specific interaction based on hydrophobic interaction with the protein to be analyzed using the support for protein analysis is reduced. PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a linker compound and a ligand, an oligosaccharide chain immobilization method and a protein analysis support capable of obtaining a support for protein analysis capable of continuously and quantitatively evaluating the binding interaction with the protein. is there.
[0025]
[Means for Solving the Problems]
As a result of intensive studies to achieve the above object, the inventors of the present application have introduced an oligosaccharide chain into the molecule simply by introducing a site having an SS bond or biotin into the molecule. Incorporate a portion that can be introduced into the linker compound, and, for example, coated gold on the surface of the support for protein analysis, or in advance for protein analysis so that a hydrophilic portion is formed between the linker compound and the oligosaccharide chain. It is easy to bind to streptavidin (or avidin) immobilized on the surface of the substrate, and it can be made to bind firmly, and protein analysis using various oligosaccharides isolated and purified from nature The oligosaccharide chain can be easily immobilized on the surface of the support for use in a single step, and the hydrophobicity with the protein to be analyzed using the support for protein analysis The present invention finds that a support for protein analysis can be obtained in which the influence of non-specific interaction based on interaction is reduced and the binding interaction with various proteins can be evaluated continuously and quantitatively. It came to complete.
[0026]
That is, the linker compound according to the present invention is provided to solve the above problems.
General formula (1)
[0027]
[Chemical 8]

[0028]
It is characterized by being expressed.
[0029]
Moreover, in order to solve the above problems, the linker compound according to the present invention provides
General formula (2)
[0030]
[Chemical 9]

[0031]
It is characterized by being expressed.
[0032]
In order to solve the above problems, the ligand according to the present invention is represented by the general formula (3)
[0033]
[Chemical Formula 10]

[0034]
It is characterized by being expressed.
[0035]
In order to solve the above problems, the ligand according to the present invention is represented by the general formula (4).
[0036]
Embedded image

[0037]
It is characterized by being expressed.
[0038]
In order to solve the above-described problems, the ligand according to the present invention has the general formula (5)
[0039]
Embedded image

[0040]
It is characterized by being expressed.
[0041]
An oligosaccharide chain immobilization method according to the present invention is an oligosaccharide chain immobilization method for immobilizing an oligosaccharide chain on the surface of a support for protein analysis in order to solve the above-described problems, It is characterized in that a solution containing a ligand represented by the general formula (3) or (4) is brought into contact with a support having gold on the surface.
[0042]
An oligosaccharide chain immobilization method according to the present invention is an oligosaccharide chain immobilization method for immobilizing an oligosaccharide chain on the surface of a support for protein analysis in order to solve the above-described problems, It is characterized in that a solution containing a ligand represented by the general formula (5) is brought into contact with a support having streptavidin (or avidin) immobilized on the surface thereof.
[0043]
In order to solve the above problems, a support for protein analysis according to the present invention immobilizes a ligand represented by the general formula (3) or (4) on the surface via an S-Au bond. It is characterized by.
[0044]
In order to solve the above-mentioned problems, the support for protein analysis according to the present invention immobilizes the ligand represented by the general formula (5) on the surface via a biotin-streptavidin (or avidin) bond. It is characterized by being allowed to.
[0045]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
[Embodiment 1]
Hereinafter, the present invention will be described in detail.
The present inventors can easily immobilize oligosaccharide chains on the surface of a support for protein analysis in one step using various oligosaccharides isolated and purified from the natural world as they are, Protein analysis that can reduce the influence of non-specific interaction based on hydrophobic interaction with the protein to be analyzed using the support for analysis and can evaluate the binding interaction with various proteins continuously and quantitatively In order to obtain a support for use, the surface plasmon resonance (SPR) method is used to efficiently immobilize a well-defined sulfated oligosaccharide on the SPR sensor chip, and to continuously bind and interact with various proteins. And we developed a system that can evaluate quantitatively.
[0046]
In the following description, an SPR sensor chip is used as a support for protein analysis, and the following general formula (7) in sulfated polysaccharide heparin, which is a sulfated oligosaccharide having a clear structure, is used on the sensor chip.
[0047]
Embedded image

[0048]
A system for two-dimensionally fixing a specific partial disaccharide structure (GlcNS6S-IdoA2S) represented by the formula and evaluating the binding interaction between the partial disaccharide structure (GlcNS6S-IdoA2S) and various proteins is mainly described. However, the present invention is not limited to this.
[0049]
In the present invention, a site where an oligosaccharide chain can be easily introduced is incorporated into a linker compound, and when an oligosaccharide chain is introduced into the linker compound, a hydrophilic moiety is formed between the linker compound, that is, a protein and a specific substance. Material was obtained. Thus, in the present invention, the ligand is directly covalently bonded to the support for protein analysis, and thereby the oligosaccharide is immobilized on the surface of the support for protein analysis.
[0050]
The linker compound concerning this invention is a compound which has a disulfide bond in a molecule | numerator, General formula (1)
[0051]
Embedded image

[0052]
It has the structure represented by these.
[0053]
The linker compound represented by the general formula (1) is, for example, the following reaction formula:
[0054]
Embedded image

[0055]
It can be easily obtained by the reaction shown by.
[0056]
First, the following general formula (8) which is an aromatic diamine
[0057]
Embedded image

[0058]
As shown in the above reaction formula, m-phenylenediamine represented by _Three OH (denoted MeOH) and (C ₂ H _Five ) _Three N (where Et _Three In the presence of N) ((CH _Three ) _Three COCO) ₂ O (where, (Boc) ₂ By reacting with O), one amino group of m-phenylenediamine represented by the general formula (8) is converted to a t-butoxycarbonyl group (—COCO (CH _Three ) _Three Group (in the formula, expressed as Boc group) and protected (Boc), the following general formula (9)
[0059]
Embedded image

[0060]
Is obtained.
[0061]
Next, the compound represented by the general formula (9) is converted into CH as shown in the above reaction formula. ₂ Cl ₂ In the presence of water-soluble carbodiimide (in the formula, EDC · HCl) and 1-hydroxybenzotriazole (in the formula, indicated as HOBt), the following general formula (10) having a disulfide bond
[0062]
Embedded image

[0063]
By the condensation reaction with thioctic acid represented by the following general formula (11)
[0064]
Embedded image

[0065]
Is obtained.
[0066]
Next, as shown in the above reaction formula, the Boc group is removed from the compound represented by the general formula (11) with trifluoroacetic acid (in the formula, indicated as TFA) in the presence of dioxane, for example, at 0 ° C. Thus, the linker compound represented by the general formula (1) having a disulfide bond in the molecule is obtained.
[0067]
In the present embodiment, after one amino group of the m-phenylenediamine represented by the general formula (8) is converted to Boc, the compound represented by the general formula (9) is obtained in a yield of 78%. The compound represented by the general formula (9) is represented by the general formula (11) by subjecting the compound represented by the general formula (9) to a condensation reaction with the thioctic acid represented by the general formula (10) in the presence of EDC · HCl and HOBt. Was prepared in 86% yield. Thereafter, by removing the Boc group from the compound represented by the general formula (11) with TFA at 0 ° C. in the presence of dioxane, the target linker compound represented by the general formula (1) is obtained in a yield. Obtained at 85%.
[0068]
Subsequently, when the linker compound was reacted with glucose in order to confirm the reactivity of the linker compound, the following general formula (3)
[0069]
Embedded image

[0070]
It was possible to synthesize a hydrophilic ligand represented by
[0071]
That is, the ligand represented by the general formula (3) according to the present invention is a structural unit derived from the linker compound represented by the general formula (1) by introducing glucose into the linker compound, particularly a disulfide. It has a bond in the molecule and is a hydrophilic ligand in which a hydrophilic moiety is formed between a linker compound and glucose when introducing an oligosaccharide chain.
[0072]
Embedded image

[0073]
As shown in the above, the linker compound represented by the general formula (1) is converted to NaBH. _Three CN, CH _Three COOH (denoted AcOH) and H ₂ In the presence of O, the following general formula (12) at pH 3 and reaction temperature of 37 ° C.
[0074]
Embedded image

[0075]
It can be easily prepared by a reductive amination reaction with D-glucose represented by
[0076]
In the present embodiment, the reducing end is efficiently utilized by causing the linker compound represented by the general formula (1) to undergo a reductive amination reaction with D-glucose represented by the general formula (12) under the above conditions. Thus, a hydrophilic ligand represented by the general formula (3) was obtained in a high yield of 92%.
[0077]
Thus, by introducing a site having a disulfide bond (SS bond) in the molecule into the linker compound, the linker compound is placed on the surface of the support for protein analysis such as an SPR sensor chip. Coated gold and sulfur-gold bond (S-Au bond), and the oligosaccharide chain bonded to the linker compound on the support for protein analysis, that is, in the ligand using the linker compound described above The oligosaccharide chains contained in can be firmly bound.
[0078]
That is, according to the present invention, by using the above-mentioned ligand incorporating a disulfide bond in a linker molecule, the ligand is directly bonded to a support for protein analysis via, for example, an S-Au bond. Can do. For this reason, if the above-mentioned ligand, that is, a ligand containing a structural unit derived from the linker compound represented by the general formula (1) is used, an oligosaccharide chain is simply immobilized on the surface of a support for protein analysis. In addition, a system capable of almost ignoring non-specific interaction based on hydrophobic interaction with a protein to be analyzed using a support for protein analysis can be constructed.
[0079]
Next, a ligand having a specific partial disaccharide structure (GlcNS6S-IdoA2S) represented by the general formula (7) as a ligand according to the present invention having the above-described linker compound and a structural unit derived from the ligand will be described below. explain.
[0080]
The ligand according to the present invention is obtained by reacting the linker compound represented by the general formula (1) with a compound containing a partial disaccharide structure (GlcNS6S-IdoA2S) represented by the general formula (7). A ligand obtained by introducing a disaccharide structure (GlcNS6S-IdoA2S) into the above-described linker compound according to the present invention, which has the following general formula (4)
[0081]
Embedded image

[0082]
It has the structure represented by these.
[0083]
For this reason, the ligand represented by the general formula (4) also has a structural unit derived from the linker compound represented by the general formula (1), particularly a disulfide bond in the molecule.
[0084]
The ligand (GlcNS6S-IdoA2S-Ligand) having the structure represented by the general formula (4) has the following reaction formula:
[0085]
Embedded image

[0086]
As shown, a disaccharide which is a partial structure of heparin, that is, a glucose unit was inserted into the reducing end of the partial disaccharide structure represented by the general formula (7) (hereinafter referred to as GlcNS6S-IdoA2S). The following general formula (13)
[0087]
Embedded image

[0088]
A trisaccharide having a structure represented by formula (1) is separately synthesized by a known method, and the trisaccharide and the linker compound represented by the general formula (1) are combined with CH. _Three COOH (in the formula, indicated as AcOH) / H ₂ O / CH _Three In a mixed solvent of OH (in the formula, indicated as MeOH), NaBH _Three It can be prepared by an optimized reductive amination reaction in the presence of CN. The trisaccharide can be synthesized, for example, by the method described in “S. Koshida et al., Tetrahedron lett. Vol. 42, p1289, 2001”. Table 1 shows the reaction conditions between the linker compound represented by the general formula (1) and the trisaccharide. NaBH _Three CN was added in multiples of 10 equivalents (eq).
[0089]
[Table 1]

[0090]
In Table 1, a) is 6 mM, b) is 13 mM, and c) is 37 mM.
[0091]
The linker compound represented by the general formula (1) is dissolved in an acetic acid / water / methanol solvent system. As can be seen from Table 1, the linker compound represented by the general formula (1) is NaBH in an acetic acid / water / methanol solvent system. _Three By reacting with a trisaccharide in the presence of CN, for example, by reacting the linker compound represented by the general formula (1) with the trisaccharide under the conditions shown in Reaction Example 5, the target ligand according to the present invention ( GlcNS6S-IdoA2S-Ligand; ESI-MS (negative) m / z = 1072.15 [M-3Na + 2H] ^- ) Can be obtained.
[0092]
The thus obtained ligand according to the present invention has an SS bond in the molecule, a solution containing these ligands, and a support for protein analysis having gold on the surface, such as gold coated on the surface. By contacting a chip such as a sensor chip of SPR, the oligosaccharide chain contained in these ligands, that is, the oligosaccharide chain of the oligosaccharide incorporated into the linker compound represented by the general formula (1) is shown in FIG. As shown in FIG. 1, it can be immobilized on the surface of the support for protein analysis in one step via an Au-S bond. Thus, as shown in FIG. 1, a linker compound having a disulfide group in the molecule is condensed to a sugar chain in one step by a reductive amination reaction, and this is immobilized on a chip via an Au-S bond. A sensor chip in which a two-dimensional cluster of a disaccharide structure (GlcNS6S-IdoA2S) is formed is obtained. In FIG. 1, NS6S represents GlcNS6S in the partial disaccharide structure (GlcNS6S-IdoA2S), I2S represents IdoA2S, and G represents a glucose unit.
[0093]
The solution containing the ligand used for immobilizing the oligosaccharide chain in one step on the surface of the support for protein analysis using each of the ligands according to the present invention is not particularly limited, Specific examples include methanol solutions of these ligands.
[0094]
In the present embodiment, a glass chip whose surface is coated with gold is immersed in a methanol solution (0.1 mM) of the ligand represented by the general formula (3) or (4) for 2 hours. The oligosaccharide was immobilized on the chip surface by converting the S—S bond in the ligand represented by the formula (3) or (4) into an Au—S bond with gold on the chip surface. Using the surface plasmon resonance apparatus (SPR670, manufactured by Nippon Laser Electronics Co., Ltd.), the bovine serum albumin (hereinafter referred to as BSA) was used as a sample for the non-specific interaction of the two types of chips prepared in this manner. It examined by measuring.
[0095]
In the above measurement, for comparison, oligosaccharide chains were immobilized on the chip surface via hydrophobic interaction as reported in “GMKuziemko et al, Biochemistry, Vol. 35, p6375, 1996”. The non-specific interaction of the chip was measured using a surface plasmon resonance apparatus (manufactured by Nippon Laser Electronics Co., Ltd., SPR670) using 0.1 mg / ml BSA as a sample.
[0096]
FIG. 2 shows the following general formula (14)
[0097]
Embedded image

[0098]
When a oligosaccharide (maltose) is bound to a chip via a hydrophobic interaction using a conventional ligand represented by (indicated by a line A in FIG. 2), a response (RU) : Resonance Unit) and the ligand of the present invention represented by the above general formula (3), glucose is bound to the chip via the Au-S bond (indicated by line B in FIG. 2). A comparison with the response (RU) due to specific interaction is shown. In addition, pH 7.4 phosphate buffered saline (PBS) was used for the buffer. The buffer flow rate was 5 μl / min.
[0099]
It has been found that BSA does not interact with maltose and glucose. However, in the measurement system using the hydrophobic interaction by the conventional ligand represented by the general formula (14), such a substance is formed on the hydrophobic chip. When a ligand having a glucose structure was immobilized and BSA as a hydrophobic protein was added thereon, a large response (RU) was observed as shown by line A, and a resonance angle change (ΔRU) as large as 1240 was observed. It can be seen that non-specific binding occurs.
[0100]
This is due to the non-specific interaction between the BSA and the hydrophobic field on the chip. With such a large non-specific interaction, it is very difficult to observe the specific interaction. Become.
[0101]
On the other hand, when the same concentration of BSA was added to a chip on which a glucose unit was immobilized via an Au-S bond, that is, a chip on which a hydrophilic ligand according to the present invention having a disulfide bond was immobilized, line B As shown, the response (RU) was almost a straight line and almost no non-specific binding was observed. From this, when glucose is bound to the chip via Au-S bond using the ligand of the present invention represented by the general formula (3), non-specific interaction based on hydrophobic interaction is ignored. I found that I can do it.
[0102]
Similarly, using a chip in which a partial disaccharide structure (GlcNS6S-IdoA2S) of heparin is immobilized by the above-described method using the ligand represented by the general formula (4), Response (RU) by interaction with synthetic vWF peptide (heparin binding site in vWF: YIGLKDRKRPSELRRIASQVKYA-NH) which is a heparin binding domain in plant factor protein, surface plasmon resonance device (manufactured by Nippon Laser Electronics Co., Ltd., SPR670) And measured.
[0103]
In FIG. 3, line C shows the response (RU) when 0.1 mg / ml BSA is used as the sample, and line D shows the response (RU) when 2 μM synthetic vWF peptide is used as the sample. In addition, PBS of pH 7.4 was used for the buffer. The buffer flow rate was 5 μl / min.
[0104]
BSA is known to slightly interact non-specifically with heparin, but as a result of the above measurement, as shown by line C, a slight interaction is observed, but the strength is almost negligible. It turned out to be.
[0105]
On the other hand, when SPR was measured by using 2 μM synthetic vWF peptide, which is a heparin binding domain in human-derived von Willeplant factor protein, which has been confirmed to bind and interact with heparin, instead of BSA, line D As shown in Fig. 1, a clear binding curve was observed, and it was found that there was a very high interaction. From this, when using the above-mentioned chip, it is considered that the influence of non-specific interaction due to hydrophobic interaction can be ignored, and the dissociation constant K of the synthetic vWF peptide _D Asked.
[0106]
FIG. 4 shows a binding curve when the concentration of the synthetic vWF peptide is continuously changed from 0.05 μM to 2.0 μM and the ligand represented by the general formula (4) is added onto the immobilized chip. . In FIG. 4, ↑ indicates the injection of the synthetic vWF peptide, and ↓ indicates that the buffer has been switched. In addition, the amount of the synthetic vWF peptide immobilized on the chip reached parallel after the synthetic vWF peptide was dissociated after switching to the buffer from the baseline before the vWF peptide injection (indicated by a dotted line in the figure). Each difference is taken up to now. In the above measurement, PBS with pH 7.4 was used as the buffer, and the flow rate of the buffer was 5 μl / min. As the surface plasmon resonance apparatus, a surface plasmon resonance apparatus “SPR670” manufactured by Nippon Laser Electronics Co., Ltd. was used.
[0107]
Line E in FIG. 5 shows the change in the amount of immobilization at this time, that is, the amount of immobilization of the synthesized vWF peptide on the chip when the chip to which the ligand represented by the general formula (4) is immobilized is used. (Response (RU)) is plotted against the concentration of synthetic vWF peptide.
[0108]
As shown in FIG. 5, the concentration of the synthetic vWF peptide is changed and the degree of binding is measured from the response (RU) to each concentration of the synthetic vWF peptide. _D As shown by line E, when the ligand (GlcNS6S-IdoA2S-ligand) represented by the general formula (4) was used, the value (M. Sobel et al. J. Biol. Chem. (1992), vol.267, p8857, K _D = 370 ± 100 nM) (K) _D = 210 nM).
[0109]
On the other hand, the synthetic vWF peptide was injected in the same manner as described above onto the chip on which the ligand (hydrophilic ligand) represented by the general formula (3) was immobilized. In this case, as shown by the line F in FIG. The binding interaction between the synthetic vWF peptide and the chip was hardly observed, and it was confirmed that there was no non-specific interaction.
[0110]
As described above, the binding behavior with the synthetic peptide containing the heparin binding domain in vWF was measured by SPR using the chip on which the ligand represented by the general formula (3) was immobilized. As a result, only specific interaction was observed. Furthermore, the dissociation constant K between natural heparin and this synthetic peptide (synthetic vWF peptide) _D Since the value approximately equal to was obtained from the SPR analysis, the usefulness of this chip became clear.
[0111]
In addition, from the above, each of the above-mentioned ligands according to the present invention and the linker compound represented by the general formula (1) used for these ligands can be used for protein analysis via an oligosaccharide chain, for example, via an Au-S bond. It was revealed that the compound has very excellent properties for immobilization on the surface of a support for use.
[0112]
As described above, according to the present invention, a linker having a disulfide bond in a molecule can be introduced into a sulfated disaccharide, that is, a partial disaccharide structure of heparin (GlcNS6S-IdoA2S) by reductive amination reaction. did it. Then, by using the ligand synthesized in this manner and fixing the sulfated disaccharide to the chip via the Au-S bond, an experimental system capable of ignoring non-specific interaction with the chip is established. I was able to. Furthermore, it was found that a specific interaction between a sulfated disaccharide and a synthetic vWF peptide can be observed using this chip.
[0113]
In the present invention, the above-described synthetic vWF peptide is used as a heparin-binding protein. However, the present invention is not limited to this, and by using the above-described chip, it is possible to connect with other heparin-binding proteins. The binding behavior can also be analyzed.
[0114]
As described above, according to the present invention, not only can the oligosaccharide chain having the reducing end be easily immobilized on the chip surface by using the linker compound, but also analysis can be performed using the chip. It was possible to construct a system that can almost ignore non-specific interactions based on hydrophobic interactions with proteins.
[0115]
Furthermore, the inventors of the present application conducted extensive studies to efficiently assemble oligosaccharides and introduce polysaccharide oligosaccharides onto the surface of a support for protein analysis in one step in order to evaluate the biological activity of oligosaccharides. As a result, the inventors of the present application assembled an oligosaccharide chain using a linker compound (biotin linker) having a polyvalent aromatic amine moiety and a biotin moiety as shown in FIG. By immobilizing biotin-streptavidin (or avidin) binding to the surface of a protein analysis support such as a sensor chip for SPR or a carrier for affinity chromatography, a single oligosaccharide of a polysaccharide can be obtained. It was found that it can be introduced to the surface of a support for protein analysis at a stage to realize both assembly and immobilization of oligosaccharides. In FIG. 6 and the following figures, St represents streptavidin (or avidin), and Bi represents biotin.
[0116]
Hereinafter, as another linker compound according to the present invention, a biotin linker obtained by introducing biotin into a linker compound instead of a site having an SS bond in the molecule will be described, and a ligand using the biotin linker will be described. A method for immobilizing an oligosaccharide chain using the ligand and a support for protein analysis on which the ligand is immobilized will be described.
[0117]
Another linker compound according to the present invention is a versatile linker having both reaction points capable of binding biotin and a plurality of oligosaccharides,
General formula (2)
[0118]
Embedded image

[0119]
It has the structure represented by these.
[0120]
The linker compound represented by the general formula (2) is, for example, the following formula:
[0121]
Embedded image

[0122]
It can be easily obtained by the reaction shown by.
[0123]
First, according to the above reaction formula, the following general formula (15)
[0124]
Embedded image

[0125]
P-aminobenzoic acid represented by (Boc) in the presence of MeOH and triethylamine (TEA) ₂ By reacting with O at room temperature and protecting the amino group of p-aminobenzoic acid represented by the above general formula (15) with a Boc group (Boc), the following general formula (16)
[0126]
Embedded image

[0127]
Is obtained.
[0128]
Next, the reaction temperature is raised from 0 ° C. to room temperature, and the compound represented by the general formula (16) is converted to CH. ₂ Cl ₂ HOBt, EDC. In the presence of HCl, the following general formula (17)
[0129]
Embedded image

[0130]
Is reacted with diethylenetriamine (0.5 equivalent) represented by the following general formula (18):
[0131]
Embedded image

[0132]
Is obtained.
[0133]
Next, the compound represented by the general formula (18) is dissolved in N, N-dimethylformamide (DMF), and in the presence of TEA (2 equivalents), the following general formula (19)
[0134]
Embedded image

[0135]
By reacting with an active ester compound of biotin represented by the following general formula (20)
[0136]
Embedded image

[0137]
Is obtained.
[0138]
Next, the reaction temperature is raised from 0 ° C. to room temperature, and the Boc group of the compound represented by the general formula (20), that is, the protecting group of the amino group is removed (deprotected) with trifluoroacetic acid (TFA). Thus, a biotin linker for assembling two units of sugar chains represented by the general formula (2) is obtained as the linker compound according to the present invention.
[0139]
In the present embodiment, the amino group of p-aminobenzoic acid represented by the above general formula (15) is protected (Bocated) with a Boc group, whereby the compound represented by the general formula (16) is obtained in a yield. After being obtained at 75%, the compound represented by the general formula (16) is reacted with diethylenetriamine (0.5 equivalent) represented by the general formula (17) under the above-described conditions to obtain a yield of 93%. The compound represented by general formula (18) was prepared. Thereafter, the compound represented by the general formula (18) is reacted with the active ester compound of biotin represented by the general formula (19) under the above-described conditions to thereby obtain the compound represented by the general formula (20). (ESI-MS (positive) m / z = 524.4 [M + H] ⁺ ) Table 2 shows the yields of the compound represented by the general formula (20) when the reaction conditions (solvent and reaction temperature) indicated by the description of conditions in the biotin active ester compound and the reaction formula are changed. .
[0140]
[Table 2]

[0141]
As shown in Table 2, the target compound represented by the general formula (18) could be obtained with the highest yield by a system using a pentafluorophenyl group (Pfp) as a biotin activated ester. .
[0142]
Subsequently, by deprotecting the Boc group of the compound represented by the general formula (18) with TFA, the biotin linker, that is, the linker compound represented by the general formula (2) is obtained in a yield of 91%. Obtained.
[0143]
Subsequently, oligosaccharide chains were assembled using this linker compound. The sugar chain to be assembled includes a sulfated partial disaccharide in heparin that interacts with von Willebrand factor peptide (vWF peptide) involved in blood coagulation, that is, a partial disaccharide represented by the general formula (7) The structure (GlcNS6S-IdoA2S) was used.
[0144]
That is, the ligand according to the present invention using the biotin linker is represented by the following general formula (5)
[0145]
Embedded image

[0146]
The sulfated partial disaccharide (GlcNS6S-IdoA2S) in heparin is introduced into the linker compound represented by the general formula (2).
[0147]
Accordingly, the ligand represented by the general formula (5) has a structural unit derived from the linker compound represented by the general formula (2), and has high affinity between biotin and streptavidin (or avidin). Can be used to immobilize the sulfated partial disaccharide (GlcNS6S-IdoA2S) as an oligosaccharide chain on a support for protein analysis through a biotin-streptavidin (or avidin) bond.
[0148]
The ligand represented by the general formula (5) has the following reaction formula:
[0149]
Embedded image

[0150]
As shown in the above, by using an optimized reductive amination reaction, a glucose unit is added to the reducing terminus of the trisaccharide containing the sulfated partial disaccharide, that is, the partial disaccharide in heparin (GlcNS6S-IdoA2S). The introduced trisaccharide represented by the general formula (13) is H ₂ Dissolved in a mixed solvent of O / AcOH / MeOH and NaBH _Three It was prepared by introducing into a biotin linker, which is a versatile linker compound represented by the general formula (2), in the presence of CN.
[0151]
Table 3 shows the reaction conditions between the linker compound represented by the general formula (2) and the trisaccharide.
[0152]
[Table 3]

[0153]
As can be seen from Table 3, the linker compound represented by the general formula (2) is NaBH in acetic acid / water / methanol solvent system. _Three By reacting with a trisaccharide in the presence of CN, for example, by reacting the linker compound represented by the general formula (2) with the trisaccharide under the conditions shown in Reaction Example 3, two units of sugar chains are assembled. The target ligand according to the present invention, that is, a versatile ligand represented by the above general formula (5) containing 2 units of a heparin partial disaccharide structure (oligosaccharide chain ligand; ESI-MS (negative) m / z = 523.8 [M-7Na + 3H] ^Four- I was able to get
[0154]
Next, using the above oligosaccharide chain ligand, the interaction between the oligosaccharide chain ligand and the synthetic vWF peptide was confirmed by SPR. First, a compound represented by the above general formula (5) is arranged on the surface of a sensor chip of SPR on which streptavidin is immobilized using the high affinity of biotin-streptavidin, and a compound with a heparin-binding model peptide is used. The interaction was examined and the usefulness was examined.
[0155]
Here, the operation of immobilizing the oligosaccharide chain ligand on the SPR sensor chip will be described below with reference to FIGS.
[0156]
The oligosaccharide chain ligand according to the present invention is obtained by bringing a solution containing the oligosaccharide chain ligand into contact with an SPR sensor chip (streptavidin-immobilized chip) in which streptavidin has been immobilized in advance. The oligosaccharide chain contained in the ligand, that is, the oligosaccharide chain of the oligosaccharide incorporated into the biotin linker can be immobilized on the SPR sensor chip surface in one step.
[0157]
A streptavidin-immobilized chip is an SPR sensor chip having a glass substrate surface coated with gold as shown in FIG. 7A, and an Au-S bond as shown in FIG. (21)
[0158]
Embedded image

[0159]
In the presence of water-soluble carbodiimide, N-hydroxysuccinimide and 4,4-dithiodibutyric acid represented by formula (4) were immobilized and immobilized as shown in FIG. After activation by reaction, as shown in FIG. 7 (d), it is prepared by condensing the terminal amino group of streptavidin, that is, streptavidin can be immobilized.
[0160]
FIG. 8 is an example of the SPR sensorgram result when streptavidin is immobilized on the SPR sensor chip, the horizontal axis indicates the flow time of the running buffer, and the vertical axis indicates the change in resonance angle (RU: Resonance Unit). ).
[0161]
Further, in FIG. 8, an arrow X indicates the injection of the streptavidin solution, and an arrow Y indicates that the running buffer is automatically switched. The running buffer was PBS with pH 7.4 and the flow rate was 5 μl / min. As the surface plasmon resonance apparatus, a surface plasmon resonance apparatus “SPR670” manufactured by Nippon Laser Electronics Co., Ltd. was used. Then, streptavidin that was not involved in the binding was washed away with a running buffer, and the active ester remaining on the chip was capped with 1M aminoethanol. The final amount of immobilized streptavidin was defined as the difference between the baseline before streptavidin injection and the change in resonance angle after capping with aminoethanol. The immobilized amount of streptavidin in this sensorgram was 2930 RU.
[0162]
The oligosaccharide chain ligand according to the present invention can be immobilized on the streptavidin-immobilized chip thus prepared using the high affinity of biotin-streptavidin. If used, as described above, the solution containing the oligosaccharide chain ligand is brought into contact with the SPR sensor chip on which streptavidin has been immobilized in advance, so that the oligosaccharide chain assembled on the surface of the sensor chip is one step. It can be fixed with.
[0163]
Specific examples of the solution containing the oligosaccharide chain ligand used at this time include a PBS solution of the oligosaccharide chain ligand.
[0164]
According to the present embodiment, the sensor chip on which streptavidin is immobilized is immersed in a solution containing the oligosaccharide chain ligand, for example, a PBS solution of the oligosaccharide chain ligand, or streptavidin is immobilized as described later. By injecting a solution containing an oligosaccharide chain ligand into the immobilized sensor chip and immobilizing the oligosaccharide chain ligand on the sensor chip by biotin-streptavidin binding using a known biotin-avidin specific binding interaction A sensor chip having a heparin partial disaccharide structure on the surface could be produced.
[0165]
Next, using this sensor chip, the binding constant K with vWF peptide _D Was measured.
FIG. 9A shows an SPR sensor chip on which streptavidin is immobilized. When measuring the binding constant with the vWF peptide, a PBS solution containing an oligosaccharide chain ligand was injected into the sensor chip shown in FIG. 9 (a) at a different concentration, and the oligosaccharide as shown in FIG. 9 (b) was injected. The sugar chain ligand was immobilized, and then the vWF peptide was injected at different concentrations as shown in FIG. 9 (c). An example of the sensorgram thus obtained is shown in FIG.
[0166]
FIG. 10 shows an example of the SPR sensorgram results when the oligosaccharide chain ligand was immobilized on the sensor chip and the vWF peptide was injected at different concentrations. The horizontal axis represents the flow time of the running buffer, The axis indicates the resonance angle change (RU).
[0167]
In FIG. 10, ↑ indicates injection of an oligosaccharide chain ligand, and ↓ indicates injection of a running buffer for washing the oligosaccharide chain ligand that was not involved in binding. The oligosaccharide chain ligand was added to the sensor chip by continuously changing its concentration from 1.39 μM to 2.22 μM. The running buffer was PBS with a pH of 7.4 and the flow rate was 10 μl / min. As the surface plasmon resonance apparatus, a surface plasmon resonance apparatus “SPR670” manufactured by Nippon Laser Electronics Co., Ltd. was used. The amount of the oligosaccharide chain immobilized is the difference between the baseline before injection of the oligosaccharide chain ligand and when the excess oligosaccharide ligand is washed away and the change in resonance angle (RU) becomes constant. It corresponds to. In the above sensorgram, the amount of oligosaccharide chain ligand immobilized was 140 RU.
[0168]
Subsequently, the vWF peptide was injected into the sensor chip on which the oligosaccharide chain ligand was immobilized, bound, and then dissociated with a running buffer, and the change in the resonance angle (RU) at that time was observed. The vWF peptide was added to the sensor chip by continuously changing its concentration from 0.5 μM to 1.0 μM. Coupling constant K _D For the calculation, the binding rate obtained from the positive resonance angle change due to the binding between the oligosaccharide chain ligand and the vWF peptide and the dissociation rate obtained from the negative resonance angle change due to the dissociation were used.
[0169]
Coupling constant K calculated from the above measurements _D Is the value determined by the radiolabeling method by Sobel et al. (M. Sobel et al. J. Biol. Chem. (1992), vol. 267, p8857, K _D = 370 ± 100 nM) and almost the same value (K _D = 280 nM).
[0170]
As described above, in the present embodiment, a novel biotin linker for assembling sugar chains is provided. And by using this biotin linker, sugar chains could be assembled. Then, it was found that the biotin linker can be applied to SPR by confirming the interaction between the assembled sugar chain and protein by SPR.
[0171]
In this way, the biotin linker has a biotin-introduced biotin linker, and thus a strong specific interaction between biotin and avidin is applied to a chip or affinity chromatography support on which streptavidin has been previously immobilized by a known method. An oligosaccharide chain can be immobilized by a biotin-streptavidin bond utilizing the action.
[0172]
As a result, by using the biotin linker, an oligosaccharide chain having a reducing end can be easily immobilized on the surface of a support for protein analysis. In addition, it has become possible to immobilize oligosaccharides obtained by simple purification from nature, which has been impossible in the past, on the surface of a support for protein analysis.
[0173]
【The invention's effect】
As described above, according to the present invention, various oligosaccharides obtained by isolation and purification from the natural world are introduced into the linker compound by introducing a site having an SS bond or biotin in the molecule. At this stage, it can be immobilized on the surface of a support for protein analysis, and the influence of non-specific interaction based on hydrophobic interaction with the protein to be analyzed using such a support is reduced. The linker compound and ligand capable of obtaining a support for protein analysis, an oligosaccharide chain immobilization method, and a support for protein analysis can be provided.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a schematic view showing a support for protein analysis in which a partial disaccharide structure in sulfated polysaccharide heparin is immobilized using the ligand of the present invention represented by the general formula (4).
FIG. 2 shows a response for non-specific interaction when maltose is bound to a sensor chip using a conventional ligand and glucose for protein analysis using the ligand of the present invention represented by the general formula (3). It is a graph which compares the response by a nonspecific interaction when it makes it couple | bond with a support body.
FIG. 3 is a graph showing the results of measuring the response due to non-specific interaction with BSA and a synthetic vWF peptide using the support for protein analysis shown in FIG.
4 is a graph showing a binding curve when the concentration of a synthetic vWF peptide is continuously changed and added to the support for protein analysis shown in FIG. 1. FIG.
FIG. 5 shows changes in the amount of synthetic vWF peptide immobilized on the protein analysis support when the concentration of the synthetic vWF peptide is continuously changed and added to the protein analysis support shown in FIG. It is a graph to show.
FIG. 6 is a schematic view showing a support for protein analysis in which oligosaccharide chains can be assembled and immobilized using the ligand of the present invention represented by the general formula (5).
FIGS. 7A to 7D are explanatory views showing an operation of immobilizing the ligand of the present invention represented by the general formula (5) on the protein analysis support.
FIG. 8 is a sensorgram of SPR when streptavidin is immobilized on a support for protein analysis used in SPR.
FIG. 9 (a) is a schematic view showing a support for protein analysis for SPR to which streptavidin is immobilized, and FIG. 9 (b) shows a general formula for the support for protein analysis shown in (a). (5) is a schematic diagram showing a state in which the ligand of the present invention represented by (5) is immobilized, and (c) is an injection of a vWF peptide at a different concentration on the support for protein analysis shown in (b). It is a schematic diagram which shows the interaction of the support body for said protein analysis and vWF peptide when it does.
FIG. 10 is a sensorgram of SPR when a ligand represented by the general formula (5) is immobilized on a support for protein analysis used for SPR and vWF peptide is injected at different concentrations.
FIG. 11 is a schematic view showing a conventional sensor chip in which a partial disaccharide structure in sulfated polysaccharide heparin is immobilized by hydrophobic interaction using a conventional ligand.
12 is a graph showing the results of analyzing the binding behavior between a partial disaccharide structure in sulfated polysaccharide heparin and a sulfated polysaccharide heparin-binding protein using the sensor chip shown in FIG.

Claims

一般式（４）

で表される構造を有し、ヘパリン結合性蛋白質との結合挙動の解析に用いられるリガンド。 General formula (4)

And a ligand used for analysis of binding behavior with a heparin-binding protein.

オリゴ糖鎖をヘパリン結合性蛋白質分析用の支持体の表面に固定化するオリゴ糖鎖の固定化方法であって、
請求項１記載のリガンドを含む溶液と、表面に金を有する支持体とを接触させることを特徴とするオリゴ糖鎖の固定化方法。An oligosaccharide chain immobilization method comprising immobilizing an oligosaccharide chain on the surface of a support for analyzing heparin-binding protein,
A method for immobilizing an oligosaccharide chain, comprising contacting a solution containing the ligand according to claim 1 with a support having gold on the surface.

請求項１記載のリガンドを、Ｓ−Ａｕ結合を介して表面に固定化させてなることを特徴とするヘパリン結合性蛋白質分析用の支持体。A support for analyzing a heparin-binding protein, wherein the ligand according to claim 1 is immobilized on the surface via an S-Au bond.