JP3813602B2 - Lipid replacement method in artificial lipid bilayer membrane, apparatus for producing the artificial lipid bilayer membrane, ion permeation measurement method, and ion permeation measurement apparatus - Google Patents
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本発明は、膜タンパク、ペプチド等を介した微小電流の検出に利用される脂質平面膜法において、人工脂質二重膜の脂質の組成を変える脂質置換方法、および、この人工脂質二重膜を製造する装置、ならびに、脂質二重膜におけるイオン透過を測定するための方法、よび、装置であって、上記の脂質置換を利用して測定途中に人工脂質二重膜における脂質組成を変更するイオン透過測定方法、および、イオン透過測定装置に関するものである。 The present invention relates to a lipid substitution method for changing the lipid composition of an artificial lipid bilayer membrane in a lipid planar membrane method used for detection of minute currents via membrane proteins, peptides, etc. , and the artificial lipid bilayer membrane Apparatus for manufacturing, and method and apparatus for measuring ion permeation in lipid bilayer membrane, which changes lipid composition in artificial lipid bilayer membrane during measurement using the above lipid substitution The present invention relates to a transmission measurement method and an ion transmission measurement device .
生物が生命活動を維持するためには、生物を構成する細胞が細胞膜を介して外部とイオンの授受を行うことが必要となる。このイオンの授受は、細胞膜上に存在するイオンチャネルと呼ばれる膜タンパク質などの分子によって行われるため、細胞膜上でのイオンチャネルの作用について研究することは、医学・細胞工学の基礎研究および応用開発において重要である。 In order for a living organism to maintain its vital activity, it is necessary for cells constituting the living organism to exchange ions with the outside through the cell membrane. Since the exchange of ions is performed by molecules such as membrane proteins called ion channels existing on the cell membrane, research on the action of ion channels on the cell membrane is important in basic research and application development of medicine and cell engineering. is important.
このイオンチャネルは、イオンの通り道であるポアとチャネルの開閉を制御するゲートから構成され、ゲートは膜電位や生理活性物質を感受することにより開閉する。この機能は、イオンがイオンチャネルを透過するときのイオン電流を測定することによって観察することができる。単一のイオンチャネルのイオン電流を測定する方法としてパッチクランプ法が用いられるが、チャネルの構造機能相関研究を深めるために単純な再構成系で実験を行う必要のある場合に用いられるのが脂質平面膜法である。 This ion channel is composed of a pore that is a path for ions and a gate that controls the opening and closing of the channel, and the gate opens and closes by sensing a membrane potential or a physiologically active substance. This function can be observed by measuring the ionic current as ions pass through the ion channel. The patch clamp method is used as a method for measuring the ion current of a single ion channel, but it is used when it is necessary to conduct experiments in a simple reconstruction system to deepen the structure-function relationship study of the channel. Planar membrane method.
この脂質平面膜法は、イオン、水、人工脂質二重膜、イオンチャネルという最小限の単純系を用いて、イオンチャネルの基本的な構造や詳細な構造機能相関について調査するというものである（非特許文献１参照）。また、この脂質平面膜法を利用してイオンチャネル研究を行うための装置として、イオンチャネル分子の構造と機能を同時に測定できる測定装置が、本発明者等により報告されている（非特許文献２参照）。
上記非特許文献１や非特許文献２に記載されているように、脂質平面膜法では、人工の脂質二重膜を形成する。それゆえ、脂質組成が様々に異なる脂質二重膜を形成することで、脂質組成がイオンチャネルに及ぼす影響を調査することも可能である。
As described in Non-Patent Document 1 and Non-Patent
しかしながら、上述の従来の脂質平面膜法においては、一旦人工脂質二重膜を作製してしまうと、測定の途中で脂質の組成を変更することは不可能である。そのため、脂質組成とイオンチャネルとの関係を調査しようとした場合、異なる組成の脂質溶液をそれぞれ調製し、人工脂質二重膜を別々に形成しなければならない。 However, in the conventional lipid planar membrane method described above, once an artificial lipid bilayer membrane is produced, it is impossible to change the lipid composition during the measurement. Therefore, when investigating the relationship between the lipid composition and the ion channel, it is necessary to prepare lipid solutions having different compositions and form artificial lipid bilayers separately.
このように、従来の脂質平面膜法において、人工脂質二重膜の脂質組成を変更するためは、再度人工膜を形成し直す必要があり二度手間となる。また、イオンチャネルとして働く膜タンパク質の機能は、膜の脂質組成に依存するため、イオン透過の測定を行いながら脂質組成を変更することは、イオンチャネルの研究を行う上で有用性が高い。しかしながら、上述の従来の方法では、脂質組成とイオンチャネルとの関係を経時的に観察することはもちろん不可能であり、脂質組成によってはイオンチャネルを組み込むこと自体が不可能な場合もある。 Thus, in the conventional lipid planar membrane method, in order to change the lipid composition of the artificial lipid bilayer membrane, it is necessary to re-form the artificial membrane again, which is troublesome twice. In addition, since the function of the membrane protein that functions as an ion channel depends on the lipid composition of the membrane, changing the lipid composition while measuring ion permeation is highly useful for studying ion channels. However, in the conventional method described above, it is of course impossible to observe the relationship between the lipid composition and the ion channel over time, and depending on the lipid composition, it may be impossible to incorporate the ion channel itself.
本発明は上記の問題点に鑑みてなされたものであって、脂質平面膜法において、人工脂質二重膜を再形成することなく、人工脂質二重膜の脂質の組成を簡単に変えることのできる脂質置換方法、この脂質置換方法を用いて得られる人工脂質二重膜およびその製造装置、ならびに、この脂質置換方法を利用して、人工脂質二重膜の脂質組成を変えながらイオン透過を測定することのできるイオン透過測定方法、および、イオン透過測定装置を提供することを目的とする。 The present invention has been made in view of the above problems, and in the lipid planar membrane method, the lipid composition of the artificial lipid bilayer membrane can be easily changed without re-forming the artificial lipid bilayer membrane. Possible lipid substitution method, artificial lipid bilayer membrane obtained by using this lipid substitution method and apparatus for producing the same, and measurement of ion permeation while changing lipid composition of artificial lipid bilayer membrane using this lipid substitution method It is an object of the present invention to provide an ion transmission measurement method and an ion transmission measurement device that can be used.
本願発明者は、上記の問題点について鋭意検討した結果、脂質平面膜法によって形成された人工脂質二重膜において、脂質二重層が形成されている領域の周囲に形成されたバルク相に細管を接触させて、この細管を通じて上記人工脂質二重膜を形成している脂質溶液とは組成の異なる脂質溶液を添加すると、脂質の拡散によって当該脂質二重膜の組成を変えることができることを見出し、本発明を完成させるに至った。 As a result of intensive studies on the above-mentioned problems, the present inventor has found that in an artificial lipid bilayer membrane formed by the lipid planar membrane method, a capillary tube is formed in the bulk phase formed around the region where the lipid bilayer is formed. When a lipid solution having a composition different from that of the lipid solution forming the artificial lipid bilayer membrane is added through this capillary tube, the composition of the lipid bilayer membrane can be changed by the diffusion of the lipid. The present invention has been completed.
すなわち、本発明の人工脂質二重膜における脂質置換方法は、人工脂質二重膜のバルク相に脂質置換用の細管を取り付け、該細管から上記人工脂質二重膜を形成している第１の脂質溶液とは異なる組成の第２の脂質溶液を添加することを特徴とするものである。 That is, in the method for replacing lipid in the artificial lipid bilayer membrane of the present invention, the first lipid substitution membrane is attached to the bulk phase of the artificial lipid bilayer membrane, and the artificial lipid bilayer membrane is formed from the capillary tube. A second lipid solution having a composition different from that of the lipid solution is added.
なお、ここで人工脂質二重膜の「バルク相」とは、脂質平面膜法によって形成された人工脂質二重膜において、脂質二重膜部分を取り囲むように形成されている脂質溶液からなる環状の相のことを意味する。 Here, the “bulk phase” of the artificial lipid bilayer refers to a ring formed of a lipid solution formed so as to surround the lipid bilayer part in the artificial lipid bilayer formed by the lipid planar membrane method. Means the phase.
また、本発明の脂質置換方法は、上記の特徴に加えて、第１の脂質溶液を用いて脂質二重膜を形成する人工脂質二重膜形成工程と、脂質置換用の細管に上記第１の脂質溶液とは異なる組成の第２の脂質溶液を注入する脂質溶液注入工程と、上記細管を上記脂質二重膜のバルク相に接触させ、上記第２の脂質溶液をバルク相へ添加する脂質溶液添加工程とからなることを特徴としている。 In addition to the above-described features, the lipid replacement method of the present invention includes an artificial lipid bilayer formation step of forming a lipid bilayer using a first lipid solution, and the lipid replacement tubules as described above. A lipid solution injecting step of injecting a second lipid solution having a composition different from that of the lipid solution; a lipid in which the thin tube is brought into contact with the bulk phase of the lipid bilayer membrane, and the second lipid solution is added to the bulk phase It is characterized by comprising a solution addition step.
上記の脂質置換方法によれば、第１の脂質溶液中の脂質によって形成された人工脂質二重膜から、連続して第２の脂質溶液中の脂質からなる人工脂質二重膜を得ることができる。つまり、これまで人工脂質二重膜において脂質の組成を変更するために、人工脂質二重膜形成工程を再度行って人工脂質二重膜を最初から形成し直す必要があったものを、本方法では、既に形成されている人工脂質二重膜を破壊することなく脂質の組成を変更させることができる。 According to the above lipid substitution method, an artificial lipid bilayer consisting of lipids in the second lipid solution can be obtained continuously from the artificial lipid bilayer formed by the lipids in the first lipid solution. it can. In other words, in order to change the lipid composition in the artificial lipid bilayer membrane until now, it was necessary to repeat the artificial lipid bilayer formation step and re-form the artificial lipid bilayer membrane from the beginning. Then, it is possible to change the lipid composition without destroying the already formed artificial lipid bilayer membrane.
また、上記脂質置換方法には、上記脂質溶液添加工程の後に、余分な上記第１の脂質溶液を上記細管を用いて吸引する脂質溶液吸引工程がさらに含まれていてもよい。また、本発明の脂質置換方法において、上記人工脂質二重膜形成工程は、ペインティング法あるいはフォールディング法によって行われてもよい。また、本発明の脂質置換方法において、上記人工脂質二重膜には、チャネル分子が組み込まれていることが好ましい。また、本発明の脂質置換方法において、上記第１の脂質溶液は、エルゴステロールを含まないものであり、上記第２の脂質溶液は、エルゴステロールを含むものであり、かつ、上記チャネル分子はアンフォテリシンＢであってもよい。 In addition, the lipid replacement method may further include a lipid solution suction step of sucking the excess first lipid solution using the capillary after the lipid solution addition step. In the lipid replacement method of the present invention, the artificial lipid bilayer formation step may be performed by a painting method or a folding method. In the lipid substitution method of the present invention, it is preferable that a channel molecule is incorporated in the artificial lipid bilayer membrane. In the lipid replacement method of the present invention, the first lipid solution does not contain ergosterol, the second lipid solution contains ergosterol, and the channel molecule is amphotericin. B may be sufficient.
また、本発明の人工脂質二重膜は、上記の何れかの人工脂質二重膜の置換方法を用いて、脂質組成が変えられた人工脂質二重膜である。この人工脂質二重膜は、形成された後に脂質の組成を変化させることができるため、組み込まれるイオンチャネルの機能解析に有効に利用することができる。 The artificial lipid bilayer membrane of the present invention is an artificial lipid bilayer membrane whose lipid composition has been changed using any one of the above-described artificial lipid bilayer replacement methods. Since this artificial lipid bilayer membrane can change the lipid composition after being formed, it can be effectively used for functional analysis of the ion channel to be incorporated.
また、本発明の人工脂質二重膜製造装置は、水溶液で満たされた２つの溶液槽である、第１の溶液槽および第２の溶液槽と、上記第１の溶液槽と上記第２の溶液槽との間に配置され、上記２つの溶液槽を仕切る隔壁とを備え、上記隔壁に設けられた開口部の周辺に第１の脂質溶液を塗布することによって、該開口部に脂質二重膜を形成する人工脂質二重膜製造装置において、上記開口部近傍の隔壁には、脂質置換用の細管が取り付けられており、上記細管から上記第１の脂質溶液とは組成の異なる第２の脂質溶液を注入することによって、上記第２の脂質溶液中の脂質を成分として含む人工脂質二重膜を形成することを特徴とするものである。また、本発明の人工脂質二重膜製造装置において、上記細管は、微動マニュピレーターに接続されていることが好ましい。 Moreover, the artificial lipid bilayer membrane production apparatus of the present invention includes two solution tanks filled with an aqueous solution, the first solution tank and the second solution tank, the first solution tank, and the second solution tank. A partition wall disposed between the solution tank and partitioning the two solution tanks, and by applying a first lipid solution around the opening provided in the partition wall, In the artificial lipid bilayer membrane production apparatus for forming a membrane, a thin tube for lipid replacement is attached to the partition wall in the vicinity of the opening, and a second composition having a composition different from that of the first lipid solution is formed from the thin tube. By injecting the lipid solution, an artificial lipid bilayer membrane containing the lipid in the second lipid solution as a component is formed. Moreover, in the artificial lipid bilayer membrane production apparatus of the present invention, it is preferable that the tubule is connected to a fine movement manipulator.
本発明のイオン透過測定方法は、水溶液を隔てる人工脂質二重膜のバルク相に脂質置換用の細管を取り付け、該細管から上記人工脂質二重膜を形成している第１の脂質溶液とは異なる組成の第２の脂質溶液を添加し、上記人工脂質二重膜の脂質組成が、第１の脂質溶液中の脂質組成から、第２の脂質溶液中に含まれる脂質組成へ置換される過程において、上記水溶液中を流れる電流を測定することを特徴とするものである。In the ion permeation measuring method of the present invention, a lipid replacement capillary is attached to the bulk phase of an artificial lipid bilayer separating an aqueous solution, and the first lipid solution forming the artificial lipid bilayer from the capillary A process in which a second lipid solution having a different composition is added and the lipid composition of the artificial lipid bilayer membrane is replaced with the lipid composition contained in the second lipid solution from the lipid composition in the first lipid solution And measuring the current flowing through the aqueous solution.
また、本発明のイオン透過測定装置は、水溶液で満たされた２つの溶液槽である、第１の溶液槽および第２の溶液槽と、上記水溶液中を流れる電流を検出する電極とを備え、上記第１の溶液槽と上記第２の溶液槽との境界に形成された人工脂質二重膜に組み込まれたイオンチャネルにおけるイオンの透過を測定するイオン透過測定装置において、上記人工脂質二重膜は、上記第１の溶液槽と上記第２の溶液槽との間に配置された隔壁に設けられた開口部に形成されており、上記開口部近傍の隔壁には、脂質置換用の細管が取り付けられていることを特徴とするものである。 Moreover, the ion permeation measuring apparatus of the present invention includes two solution tanks filled with an aqueous solution, a first solution tank and a second solution tank, and an electrode for detecting a current flowing in the aqueous solution. In the ion permeation measuring apparatus for measuring the permeation of ions in an ion channel incorporated in an artificial lipid bilayer membrane formed at the boundary between the first solution tank and the second solution tank, the artificial lipid bilayer membrane Is formed in an opening provided in a partition wall disposed between the first solution tank and the second solution tank, and in the partition wall in the vicinity of the opening, a capillary tube for lipid substitution is formed. It is characterized by being attached.
ここで、上記脂質置換用の細管は、隔壁の開口部に形成されている人工脂質二重膜の脂質組成とは異なる組成の脂質溶液を、開口部近傍に形成されている脂質溶液のバルク相に注入するためのものである。上記のイオン透過測定装置によれば、人工脂質二重膜が上記の脂質置換方法によって脂質置換される過程において、イオンチャネルでのイオン透過の様子を確認することができる。それゆえ、上記のイオン透過測定装置は、イオンチャネルの機能に対して脂質分子が及ぼす影響を調査することができ、イオンチャネルの機能解析に役立てることができる。 Here, the above-mentioned capillary tube for lipid replacement is a lipid solution having a composition different from the lipid composition of the artificial lipid bilayer membrane formed in the opening of the partition wall, and the bulk phase of the lipid solution formed in the vicinity of the opening. It is intended for injection. According to the above ion permeation measuring apparatus, the state of ion permeation through the ion channel can be confirmed in the process of replacing the artificial lipid bilayer membrane with the lipid replacement method described above. Therefore, the above ion permeation measuring apparatus can investigate the influence of lipid molecules on the function of the ion channel, and can be used for the function analysis of the ion channel.
また、上記イオン透過測定装置において、人工脂質二重膜の形成はペインティング法あるいはフォールディング法を利用して行われてもよい。また、上記のイオン透過測定装置において、上記細管は、微動マニュピレーターに接続されていることが好ましい。 In the ion permeation measuring apparatus, the artificial lipid bilayer membrane may be formed using a painting method or a folding method. Moreover, in the above ion permeation measuring apparatus, it is preferable that the thin tube is connected to a fine movement manipulator.
以上のように、本発明の人工脂質二重膜における脂質置換方法によれば、これまで人工脂質二重膜において脂質の組成を変更するために、人工脂質二重膜形成工程を再度行って人工脂質二重膜を最初から形成し直す必要があったものを、既に形成されている人工脂質二重膜を破壊することなく脂質の組成を容易に変更させることができる。また、上記の脂質置換方法を利用して実現される本発明の人工脂質二重膜の製造装置によれば、人工脂質二重膜における脂質組成を自在に変更することの可能な人工脂質二重膜を作製することができる。 As described above, according to the lipid substitution method in the artificial lipid bilayer membrane of the present invention, in order to change the lipid composition in the artificial lipid bilayer membrane so far, the artificial lipid bilayer formation step is performed again to perform artificial The composition of the lipid can be easily changed without destroying the artificial lipid bilayer that has already been formed, in which it was necessary to re-form the lipid bilayer from the beginning. Moreover, according to the artificial lipid bilayer membrane production apparatus of the present invention realized by using the above lipid substitution method, the artificial lipid bilayer capable of freely changing the lipid composition in the artificial lipid bilayer membrane A film can be made.
さらに、本発明のイオン透過測定装置によれば、上述のように脂質置換される人工脂質二重膜に組み込まれたイオンチャネルにおけるイオン透過の様子を確認することができる。それゆえ、上記のイオン透過測定装置は、イオンチャネルの機能に対して脂質分子が及ぼす影響を調査することができ、イオンチャネルの機能解析に役立てることができる。 Furthermore, according to the ion permeation measuring apparatus of the present invention, it is possible to confirm the state of ion permeation in the ion channel incorporated in the artificial lipid bilayer membrane to be lipid-substituted as described above. Therefore, the above ion permeation measuring apparatus can investigate the influence of lipid molecules on the function of the ion channel, and can be used for the function analysis of the ion channel.
イオンチャネルは、種類も多く、ほとんどすべての細胞に分布して生体が生存するために重要な役割を果たすことから、疾患の原因にもなりやすい。このことから、イオンチャネルをターゲットとする薬剤が多く必要とされている。本発明は、イオンチャンネルをターゲットとする薬剤開発におけるスクリーニングや薬理試験にも利用できる可能性を有しているため、その有用性は高いと言える。 There are many types of ion channels, and since they play an important role in the survival of living organisms by being distributed to almost all cells, they are likely to cause diseases. For this reason, many drugs that target ion channels are needed. Since the present invention has a possibility of being used for screening and pharmacological tests in drug development targeting ion channels, it can be said that its usefulness is high.
本発明の実施の形態について以下に説明するが、本発明はこの記載に限定されるものではない。 Embodiments of the present invention will be described below, but the present invention is not limited to this description.
（１）人工脂質二重膜について
本発明の実施の形態について説明するに先立ち、一般的な人工脂質二重膜について説明する。
(1) About Artificial Lipid Bilayer Prior to describing the embodiment of the present invention, a general artificial lipid bilayer will be described.
人工脂質二重膜とは、生体膜の基本構成である脂質二重層を人工的に形成したものであり、例えば、リン脂質の単分子膜を張った水槽に小孔を開けたテフロン（登録商標）板を入れることによって形成させることができる。さらに、このようにして形成された脂質二重膜にイオンチャネルとして働く膜タンパク質（チャネル分子）を組み込むことによって、実際の生体膜を模した人工脂質二重膜が得られる。このイオンチャネルが組み込まれた人工脂質二重膜は、例えば、疾患に関与すると考えられるイオンチャネルの機能の研究などに利用することができる。 Artificial lipid bilayers are artificially formed lipid bilayers, which are the basic components of biological membranes. For example, Teflon (registered trademark) with a small hole in a water tank filled with a monomolecular film of phospholipid. ) It can be formed by inserting a plate. Furthermore, by incorporating a membrane protein (channel molecule) that functions as an ion channel into the thus formed lipid bilayer membrane, an artificial lipid bilayer membrane imitating an actual biological membrane can be obtained. The artificial lipid bilayer membrane in which this ion channel is incorporated can be used, for example, for studying the function of an ion channel considered to be involved in a disease.
この人工脂質二重膜の作製は、従来公知の種々の方法によって実施することができる。その一例としては、非特許文献１に記載のペインティング法や貼り合わせ法（フォールディング法とも呼ばれる）などを挙げることができる。 The artificial lipid bilayer membrane can be produced by various conventionally known methods. Examples thereof include a painting method and a bonding method (also referred to as a folding method) described in Non-Patent Document 1.
図２（ａ）には、人工脂質二重膜の断面構造を模式的に示す。この図に示すように、人工脂質二重膜は、両親媒性のリン脂質分子２１が規則的に並ぶことによって水中（あるいは、水溶液中）で二層構造を形成している。このリン脂質分子の二層構造において、各リン脂質分子のリン酸や塩基からなる親水性部分が外部の水相に接し、脂肪酸からなる疎水性部分が互いに向き合うようにして並んでいる。
FIG. 2 (a) schematically shows a cross-sectional structure of the artificial lipid bilayer membrane. As shown in this figure, the artificial lipid bilayer membrane forms a bilayer structure in water (or in an aqueous solution) by regularly arranging
この人工二重脂質膜は、直径０．１〜０．５ｍｍ程度の開口部（小孔）Ｃが設けられたテフロン（登録商標）板あるいはプラスチック板などの支持体２３の開口部Ｃに形成されている。つまり、この人工脂質二重膜は、有機溶媒に溶解されたリン脂質（これを脂質溶液２２と呼ぶ）を上記開口部Ｃの周辺に塗布することによって、両親媒性分子であるリン脂質が水と有機溶媒の界面に配向して単分子層となり、さらに、２層の単分子層の間から有機溶媒が排除されたことによって形成されたものである。それゆえ、この人工脂質二重膜には、脂質二重膜部分Ａと、それを取り囲んで形成される脂質溶液から成る環状のバルク相Ｂとが存在する。
This artificial double lipid membrane is formed in the opening C of the
さらに、上記人工脂質二重膜には、イオンチャネル２４を脂質二重層構造の間に埋め込ませることによって、イオンチャネル２４を組み込むこともできる。イオンチャネルを上記人工脂質二重膜に埋め込む方法は、従来公知の方法を用いることができ、特に限定されるものではない。具体的には、例えばイオンチャネルを含む膜分画を界面活性剤で可溶化し、膜ベシクルへ再構成し、人工脂質二重膜に融合させる方法が挙げられる。
Further, the artificial lipid bilayer membrane can incorporate the
（２）人工脂質二重膜における脂質置換方法
続いて、本発明の人工脂質二重膜における脂質置換方法について、図２（ｂ）を用いて説明する。
(2) Lipid Replacement Method in Artificial Lipid Bilayer Subsequently, the lipid replacement method in the artificial lipid bilayer membrane of the present invention will be described with reference to FIG.
本発明の人工脂質二重膜の脂質置換方法は、人工脂質二重膜のバルク相に脂質置換用の細管を取り付け、該細管から上記人工脂質二重膜を形成している第１の脂質溶液とは異なる組成の第２の脂質溶液を添加するものである。 The lipid replacement method of the artificial lipid bilayer membrane of the present invention is the first lipid solution in which a capillary tube for lipid substitution is attached to the bulk phase of the artificial lipid bilayer membrane, and the artificial lipid bilayer membrane is formed from the capillary tube And adding a second lipid solution having a different composition.
具体的には、上記脂質置換方法は、第１の脂質溶液を用いて脂質二重膜を人工的に形成する人工脂質二重膜形成工程と、脂質置換用の細管に上記第１の脂質溶液とは異なる脂質組成の第２の脂質溶液を注入する脂質溶液注入工程と、上記人工脂質二重膜のバルク相Ｂに脂質置換用の細管１７を接触させ、上記第２の脂質溶液をバルク相へ添加する脂質溶液添加工程とからなる。
Specifically, the lipid replacement method includes an artificial lipid bilayer formation step in which a lipid bilayer is artificially formed using the first lipid solution, and the first lipid solution in a capillary tube for lipid replacement. A lipid solution injecting step of injecting a second lipid solution having a different lipid composition from the above, a
図２（ｂ）は、人工脂質二重膜のバルク相Ｂに脂質置換用の細管１７を接触させた脂質溶液添加工程の様子を示す。この脂質溶液添加工程では、細管１７の上端部を、例えば、注射器、スポイト、あるいは、パッチクランプ法で微小電極内に薬物を添加する装置であるマイクロインジェクターなどのような添加・注入手段（図示せず）と接続させておくことによって、上記第２の脂質溶液のバルク相Ｂへの添加を容易に行うことができる。なお、細管１７に第２の脂質溶液を注入する脂質溶液注入工程においても、上記の添加・注入手段を用いれば、細管１７へ容易に第２の脂質溶液を注入することができる。
FIG. 2 (b) shows a state of the lipid solution addition step in which a lipid-
なお、上記人工脂質二重膜形成工程は、上記（１）で説明したように、従来公知の種々の脂質二重膜形成方法によって実施すればよく、特に限定されるものではない。この脂質二重膜形成方法としては、例えば、ペインティング法あるいはフォールディング法が好適に用いられる。言い換えれば、本発明の脂質置換方法は、バルク相を有する人工脂質二重膜であれば適用することが可能であり、特にペインティング法やフォールディング法で形成された人工脂質二重膜に適用することが好ましい。 The artificial lipid bilayer formation step is not particularly limited as long as it is performed by various conventionally known lipid bilayer formation methods as described in (1) above. As the lipid bilayer formation method, for example, a painting method or a folding method is preferably used. In other words, the lipid substitution method of the present invention can be applied to an artificial lipid bilayer membrane having a bulk phase, and particularly to an artificial lipid bilayer membrane formed by a painting method or a folding method. It is preferable.
上記の脂質置換方法によれば、第１の脂質溶液によって人工脂質二重膜を形成した後に、第１の脂質溶液とは脂質組成の異なる第２の脂質溶液を細管１７から添加することによって、第２の脂質溶液に含まれる脂質からなる人工脂質二重膜へ変化させることができる。
According to the above lipid replacement method, after the artificial lipid bilayer membrane is formed by the first lipid solution, the second lipid solution having a different lipid composition from the first lipid solution is added from the
つまり、本発明の人工脂質二重膜における脂質置換方法では、バルク相Ｂが支持体１３を覆うように形成されている脂質膜を構成するリン脂質１１と連続していることを利用したものである。脂質二重膜部分Ａは非常に弱い構造であるため、この部分に直接細管を接触させることは不可能であるが、バルク相Ｂに多少の力学刺激を加えても脂質二重膜部分Ａの構造を破壊することはない。そこで、本発明にかかる脂質置換方法では、上記バルク相Ｂに細管を通じて脂質溶液を添加し、脂質の拡散を脂質二重膜部分の脂質組成を変更しているのである。
That is, the lipid substitution method in the artificial lipid bilayer membrane of the present invention utilizes the fact that the bulk phase B is continuous with the
したがって、本方法を用いれば、第１の脂質溶液中の脂質によって形成された人工脂質二重膜から、連続して第２の脂質溶液中の脂質からなる人工脂質二重膜を得ることができる。つまり、これまで人工脂質二重膜において脂質の組成を変更するために、人工脂質二重膜形成工程を再度行って人工脂質二重膜を最初から形成し直す必要があったものを、本方法では、既に形成されている人工脂質二重膜を破壊することなく脂質の組成を変更させることができる。 Therefore, if this method is used, an artificial lipid bilayer consisting of lipids in the second lipid solution can be obtained continuously from the artificial lipid bilayer formed by the lipids in the first lipid solution. . In other words, in order to change the lipid composition in the artificial lipid bilayer membrane until now, it was necessary to repeat the artificial lipid bilayer formation step and re-form the artificial lipid bilayer membrane from the beginning. Then, it is possible to change the lipid composition without destroying the already formed artificial lipid bilayer membrane.
ここで、本方法の人工脂質二重膜を構成する脂質としては、上述のリン脂質が好適に用いられるが、人工脂質二重膜を形成するものであれば特に限定されない。具体的には、例えば、ホスファチジルコリン、ジフィタノイルホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン等が挙げられる。これらのリン脂質の２本の炭化水素鎖は、１０個〜２４個の炭素長であることが好ましい。また、上記炭化水素鎖は、飽和炭化水素であってもよいし、不飽和炭化水素であってもよい。これらの脂質は純粋なものを用いてもよいし、少なくとも２種類の脂質を混合したものであってもよい。また、イオンチャネルの活性維持のために、必要に応じて、例えば、コレステロール等を添加してもよい。 Here, as the lipid constituting the artificial lipid bilayer membrane of the present method, the above-mentioned phospholipid is preferably used, but is not particularly limited as long as it forms an artificial lipid bilayer membrane. Specific examples include phosphatidylcholine, diphytanoyl phosphatidylcholine, phosphatidylethanolamine, phosphatidylserine, and the like. The two hydrocarbon chains of these phospholipids are preferably 10 to 24 carbons long. The hydrocarbon chain may be a saturated hydrocarbon or an unsaturated hydrocarbon. These lipids may be pure or may be a mixture of at least two types of lipids. Further, for example, cholesterol or the like may be added as necessary to maintain the activity of the ion channel.
上記脂質溶液とは脂質を有機溶媒に溶解させたものを意味する。この脂質溶液に用いられる有機溶媒としては、非極性有機溶媒であれば特に限定されるものではない。具体的な一例としては、例えば、デカン、ヘキサデカン、ヘキサン等の飽和炭化水素やスクアレン等が好適に用いられる。また、脂質濃度は５〜４０ｍｇ／ｍｌであることが好ましく、１５〜２０ｍｇ／ｍｌであることがより好ましい。これにより、安定な人工脂質二重膜を迅速に形成することが可能となる。 The lipid solution means a solution in which lipid is dissolved in an organic solvent. The organic solvent used in the lipid solution is not particularly limited as long as it is a nonpolar organic solvent. As a specific example, saturated hydrocarbons such as decane, hexadecane, and hexane, squalene, and the like are preferably used. The lipid concentration is preferably 5 to 40 mg / ml, and more preferably 15 to 20 mg / ml. This makes it possible to quickly form a stable artificial lipid bilayer membrane.
また、上記人工脂質二重膜には、チャネル分子として、膜タンパク質からなるイオンチャネルが組み込まれていてもよい。イオンチャネルが組み込まれた上記イオンチャネルには、生体膜や人工膜においてイオンチャネルとして機能するあらゆるものが含まれる。このイオンチャネルとしては、アンフォテリシンＢ、バリノマイシンなどの抗生物質、ヘモリシン等細菌毒素によって形成されるチャネル、電依存性Ｎａチャネル、アセチルコリン受容体チャネルなど生体のあらゆる種類のチャネルが含まれる。 The artificial lipid bilayer membrane may incorporate an ion channel made of a membrane protein as a channel molecule. Examples of the ion channel in which the ion channel is incorporated include all those that function as ion channels in biological membranes and artificial membranes. Examples of the ion channel include all types of biological channels such as antibiotics such as amphotericin B and valinomycin, channels formed by bacterial toxins such as hemolysin, electric-dependent Na channels, and acetylcholine receptor channels.
このイオンチャネルは、生物が生命活動を維持するための非常に重要な要素であり、種々の疾患の原因にもなりやすい。それゆえ、このイオンチャネルの機能解析は、医学・細胞工学の基礎研究および応用開発において重要である。イオンチャネルとして働く膜タンパク質の機能は、膜の脂質組成に依存している。 This ion channel is a very important element for living organisms to maintain life activity, and is likely to cause various diseases. Therefore, functional analysis of this ion channel is important in basic research and application development of medicine and cell engineering. The function of membrane proteins that act as ion channels depends on the lipid composition of the membrane.
そこで、本発明の脂質置換方法を用いれば、人工脂質二重膜におけるイオンチャネルの機能を解析するための脂質平面膜法において、イオンチャネルにおけるイオン透過の測定を行いながら人工脂質二重膜の脂質組成を変更することができる。つまり、人工脂質二重膜の脂質組成の変化とイオンチャネルにおけるイオン透過との関係を経時的に観察することができる。 Therefore, by using the lipid substitution method of the present invention, in the lipid planar membrane method for analyzing the function of the ion channel in the artificial lipid bilayer membrane, the lipid of the artificial lipid bilayer membrane is measured while measuring the ion permeation in the ion channel. The composition can be changed. That is, the relationship between the change in the lipid composition of the artificial lipid bilayer membrane and the ion permeation in the ion channel can be observed over time.
上記細管１７の素材は、化学試験、生化学試験などで細管として使用されるものであれば特に限定されることはないが、例えば、ガラス、プラスチックなどが好適に使用される。また、上記細管１７のバルク相Ｂと接触する先端部の開口径は、５μｍ〜２０μｍであることが好ましい。上記細管１７の素材としてガラスを用いる場合、例えば、口径１〜１．５ｍｍの市販のガラス管を熱伸展して先端口径を５μｍ〜２０μｍとすればよい。
Although the material of the said
なお、人工脂質二重膜のバルク相Ｂとの接触位置を調節するために、上記細管１７の上端部は、微動マニュピレーターと接続されていることが好ましい。これによれば、細管１７をバルク相Ｂの所望とする位置へ接触させ、バルク相Ｂへ確実に第２の脂質溶液を注入することができ、人工脂質二重膜における脂質の置換が確実に実現される。なお、上記細管１７に上記添加・注入手段が取り付けられている場合には、上記微動マニュピレーターはこの添加・注入手段に接続されている。
In addition, in order to adjust a contact position with the bulk phase B of an artificial lipid bilayer membrane, it is preferable that the upper end part of the said
さらに、本発明の人工脂質二重膜における脂質置換方法においては、上記脂質溶液添加工程の後に、余分な上記第１の脂質溶液を上記細管を用いて吸引する脂質溶液吸引工程がさらに含まれることが好ましい。この脂質溶液吸引工程における余分な脂質溶液の吸引にも、上述の添加・注入手段を細管に接続させて利用することができる。 Furthermore, the lipid replacement method in the artificial lipid bilayer membrane of the present invention further includes a lipid solution suction step of sucking the excess first lipid solution using the capillary after the lipid solution addition step. Is preferred. The above-described addition / injection means can be connected to a capillary tube for use in suctioning excess lipid solution in the lipid solution suction step.
この脂質溶液吸引工程がさらに含まれることによって、脂質二重膜を迅速に形成できるという効果を得ることができる。 By further including this lipid solution suction step, an effect that a lipid bilayer membrane can be formed quickly can be obtained.
本発明にかかる脂質置換方法における、人工脂質二重膜の脂質置換の具体例としては、後述の実施例に示すような、上記第１の脂質溶液としてエルゴステロールを含まないもの、上記第２の脂質溶液としてエルゴステロールを含むものを用い、かつ、チャネル分子としてアンフォテリシンＢを組み込ませたものを挙げることができる。 Specific examples of the lipid replacement of the artificial lipid bilayer membrane in the lipid replacement method according to the present invention include those that do not contain ergosterol as the first lipid solution, as described in the examples below. Examples include lipid solutions containing ergosterol and those incorporating amphotericin B as channel molecules.
アンフォテリシンＢは、抗生物質の一種であり、脂質二重膜に水相から入り込みイオンチャネルを形成する。そして、このアンフォテリシンＢは、エルゴステロールを多く含む真菌の細胞膜においてはチャネル分子として機能を発揮するが、エルゴステロールを少量しか含まないヒトの細胞膜においては機能を発揮しないと考えられている。 Amphotericin B is a kind of antibiotic, and enters the lipid bilayer membrane from the aqueous phase to form an ion channel. And this amphotericin B is considered to function as a channel molecule in a fungal cell membrane containing a large amount of ergosterol, but not to function in a human cell membrane containing only a small amount of ergosterol.
そこで、本発明の脂質置換方法を用いて、エルゴステロールを含まない人工脂質二重膜を形成した後、細管からエルゴステロールを含む第２の脂質溶液をバルク相に添加して脂質の置換を行い、エルゴステロールを含む人工脂質脂質二重膜を形成する。この脂質置換の間、アンフォテリシンＢを膜の上方に添加した状態にしておけば、人工脂質二重膜における脂質組成の変化に伴うアンフォテリシンＢの活性の変化を観察することができる。 Then, after forming the artificial lipid bilayer membrane which does not contain ergosterol using the lipid substitution method of the present invention, a second lipid solution containing ergosterol is added from the tubule to the bulk phase to perform lipid substitution. An artificial lipid-lipid bilayer membrane containing ergosterol is formed. If amphotericin B is added above the membrane during this lipid substitution, the change in the activity of amphotericin B accompanying the change in the lipid composition in the artificial lipid bilayer can be observed.
実際、実施例にも示すように、エルゴステロールを添加して、エルゴステロールを含む人工脂質二重膜を形成することによって、アンフォテリシンＢの活性が生じたことが確認された。 In fact, as shown in Examples, it was confirmed that the activity of amphotericin B was generated by adding ergosterol to form an artificial lipid bilayer membrane containing ergosterol.
これ以外にも、例えば、第１の脂質溶液としてホスファチジルコリン等正味の電荷を持たない脂質を用い、第２の脂質溶液としてホスファチジルエタノールアミン等荷電した脂質を含むものを用い、チャネル分子として骨格筋筋小胞体Ｋチャネルを用いて、脂質二重膜の脂質組成とチャネルとの関係を調査することができる。 Other than this, for example, a lipid having no net charge such as phosphatidylcholine is used as the first lipid solution, and a charged lipid such as phosphatidylethanolamine is used as the second lipid solution, and skeletal muscle muscle is used as the channel molecule. Using the endoplasmic reticulum K channel, the relationship between the lipid composition of the lipid bilayer membrane and the channel can be investigated.
また、本発明にかかる人工脂質二重膜は、ここで説明した人工脂質二重膜の置換方法を用いて第１の脂質溶液中の脂質からなる人工脂質二重膜から、第２の脂質溶液中の脂質を含む人工脂質二重膜へと脂質の組成が変化したものである。 In addition, the artificial lipid bilayer membrane according to the present invention is obtained by using the artificial lipid bilayer membrane composed of lipids in the first lipid solution using the artificial lipid bilayer membrane replacement method described here, and then the second lipid solution. The composition of the lipid is changed to an artificial lipid bilayer membrane containing the lipid therein.
上記の人工脂質二重膜は、それに組み込まれるイオンチャネルの機能解析に有効に利用することができるだけでなく、人工脂質二重膜の脂質組成によるチャネル分子組み込みの可否の判定に利用することもできる。 The above artificial lipid bilayer membrane can be used not only effectively for functional analysis of ion channels incorporated therein, but can also be used to determine whether or not channel molecules can be incorporated according to the lipid composition of the artificial lipid bilayer membrane. .
（３）人工脂質二重膜の製造装置について
次に、本発明にかかる人工脂質二重膜の製造装置について説明する。
(3) Apparatus for producing artificial lipid bilayer membrane Next, an apparatus for producing an artificial lipid bilayer membrane according to the present invention will be described.
本発明の人工脂質二重膜の製造装置の一例の概略構成を図１に示す。本発明の人工脂質二重膜製造装置は、水溶液１３で満たされた上溶液槽（第１の溶液槽）１１と下溶液槽（第２の溶液槽）１２という２つの溶液槽を備えている。図１に示すように、上記の製造装置１では、下溶液槽１２に比べて大きさの小さい上溶液槽１１が、下溶液槽１２内に配置されている。そして、図１に示す製造装置１において、「第１の溶液槽と第２の溶液槽との間に配置され、上記２つの溶液槽を仕切る隔壁」とは、上溶液槽１１の底面のことを意味する。そのため、ここでは、上溶液槽１１の底面のことを隔壁１５とする。
A schematic configuration of an example of an apparatus for producing an artificial lipid bilayer membrane of the present invention is shown in FIG. The artificial lipid bilayer membrane production apparatus of the present invention includes two solution tanks, an upper solution tank (first solution tank) 11 and a lower solution tank (second solution tank) 12 filled with an
上記隔壁１５には、開口部１６が設けられている。上記の製造装置１においては、この開口部１６の周辺に第１の脂質溶液を塗布することによって、開口部１６に人工脂質二重膜を形成することができる。ここで、人工脂質二重膜が形成される仕組みについては、上記（１）で説明した通りである。
The
さらに、本発明の製造装置１においては、上記開口部１６が設けられている位置の近傍の隔壁１５、すなわち、人工脂質二重膜のバルク相が形成される部分の隔壁１５に、脂質置換用の細管１７が取り付けられている。この細管１７は、上述の（２）の脂質置換方法の項で説明したものと同様の機能を果たすものであり、上述の（２）の脂質置換方法の項で説明したものと同じ方法で得ることができるので、ここではその説明を省略する。該細管１７から上記第１の脂質溶液とは組成の異なる第２の脂質溶液を注入することによって、上記第２の脂質溶液中の脂質を成分として含む人工脂質二重膜を形成することができる。また、上記細管１７には、上述の添加・注入手段が接続されていることが好ましい。これによって、第２の脂質溶液の注入・添加、および、余分な第１の脂質溶液の吸引などを容易に行うことができる。
Further, in the production apparatus 1 of the present invention, the
以上のように、上記製造装置１は、先ず、第１の脂質溶液中の脂質によって人工脂質二重膜を形成し、さらに、第２の脂質溶液を細管１７を通して脂質二重膜のバルク相へ添加することによって、脂質二重膜の脂質組成を変化させ、第２の脂質溶液中の脂質からなる人工脂質二重膜を形成するというものである。
As described above, the production apparatus 1 first forms an artificial lipid bilayer with the lipid in the first lipid solution, and further passes the second lipid solution through the
つまり、本発明の人工脂質二重膜製造装置は、上述の（２）の脂質置換方法を利用したものであり、本発明にかかる人工脂質二重膜を作製することができるものであると言える。それゆえ、この人工脂質二重膜を形成する際に必要な各要素（脂質、脂質溶液、チャネル分子など）については、上述の（２）の脂質置換方法おいて説明したものを同様に使用することができる。 That is, it can be said that the artificial lipid bilayer membrane production apparatus of the present invention utilizes the lipid substitution method of (2) described above, and can produce the artificial lipid bilayer membrane according to the present invention. . Therefore, as for each element (lipid, lipid solution, channel molecule, etc.) necessary for forming this artificial lipid bilayer membrane, those described in the lipid replacement method of (2) above are used in the same manner. be able to.
また、上記製造装置１の細管１７の上端側には、微動マニュピレーター１８が接続されている。これによれば、細管１７を人工脂質二重膜のバルク相の所望とする位置へ接触させ、バルク相へ確実に第２の脂質溶液を注入することができるため、人工脂質二重膜における脂質の置換が確実に実現される。なお、上記細管１７に上記添加・注入手段が取り付けられている場合には、上記微動マニュピレーターはこの添加・注入手段に接続されている。この微動マニュピレーター１８は、特に限定されることはなく従来公知の種々のものを用いることができるが、例えば、水圧式、油圧式、ピエゾ式のものを好適に使用することができる。
A
上記の２つの溶液槽１１・１２の形状は、特に限定されるものではないが、例えば、円筒形状のものを用いることができる。また、上記２つの溶液槽の材質も、上溶液槽１１の底面をなす隔壁１５以外は、特に限定されることはないが、例えば、ガラス、プラスチック等が用いられる。上記隔壁１５の材質は、特に限定されるものではないが、具体的には、例えば、ポリプロピレン、ポリ塩化ビニル、ポリスチレン等のプラスチック、テフロン（登録商標）等が好適に用いられる。また、上記隔壁１５の厚さに関しては、浮遊電気容量を減らすためには厚い方がよいが、開口部１６が厚いと、その開口に沿って膜が移動する可能性があり不安定になる。したがって、隔壁１５は、通常、０．１〜０．３ｍｍ程度の誘電体の板を用いて作成し、開口部１６の周辺に限り上記の厚さ（０．１〜０．３ｍｍ）よりも薄く加工することが好ましい。
Although the shape of said two
また、上記水溶液は、界面活性剤、有機溶媒等を含まなければ特に限定されるものではない。上記水溶液の好ましい一例としては塩化カリウム、塩化ナトリウム、塩化カルシウム等の塩が溶解されている水溶液が挙げられる。なお、上記上溶液槽１１内の水溶液と下溶液槽１２内の水溶液とは、同一の組成および濃度に調製されていてもよいし、異なる濃度および組成であってもよい。
The aqueous solution is not particularly limited as long as it does not contain a surfactant, an organic solvent, or the like. A preferable example of the aqueous solution is an aqueous solution in which a salt such as potassium chloride, sodium chloride, calcium chloride or the like is dissolved. The aqueous solution in the
また、上記開口部１６は、隔壁１５のほぼ中央部に円形状に設けられていることが好ましい。また、上記円形状の開口部の直径は、０．０５〜０．５ｍｍであることが好ましく、この程度の大きさの開口には、最も安定した膜を迅速に形成することができる。
In addition, the
（４）イオン透過測定装置について
また、上記人工脂質二重膜の製造装置において、溶液槽中の水溶液を流れる電流を検出する電極を取り付ければ、イオン透過測定装置として使用することもできる。
(4) Ion permeation measuring device Moreover, in the apparatus for producing an artificial lipid bilayer membrane, if an electrode for detecting a current flowing through an aqueous solution in a solution tank is attached, it can be used as an ion permeation measuring device.
すなわち、本発明のイオン透過測定装置は、水溶液１３で満たされた２つの溶液槽である、上溶液槽（第１の溶液槽）１１および下溶液槽（第２の溶液槽）１２と、上記水溶液１３中を流れる電流を検出する電極１４とを備え、上記電極１４が電流を検出することによって、上記上溶液槽１１と上記下溶液槽１２との境界の隔壁１５に形成された人工脂質二重膜に組み込まれたイオンチャネルにおけるイオンの透過を測定するものである。
That is, the ion permeation measuring apparatus of the present invention includes two solution tanks filled with the
なお、上記人工脂質二重膜は、上溶液槽１１と下溶液槽１２との間に配置された隔壁１５に設けられた開口部１６に形成されており、上記開口部１６近傍の隔壁１５には、脂質置換用の細管１７が取り付けられている。
The artificial lipid bilayer membrane is formed in the
図３には、本発明にかかるイオン透過測定装置の具体例を示す。図３に示すイオン透過測定装置２は、水溶液１３で満たされた上溶液槽（第１の溶液槽）１１と下溶液槽（第２の溶液槽）１２という２つの溶液槽を備えている。このイオン透過測定装置２では、上述の人工脂質二重膜製造装置１と同じく、下溶液槽１２に比べて大きさの小さい上溶液槽１１が、下溶液槽１２内に配置されている。そして、イオン透過測定装置２において、「第１の溶液槽と第２の溶液槽との間に配置された隔壁１５」とは、上溶液槽１１の底面のことを意味する。そのため、ここでは、上溶液槽１１の底面のことを隔壁１５とする。
FIG. 3 shows a specific example of an ion transmission measuring device according to the present invention. The ion
上記隔壁１５には、開口部１６が設けられており、この開口部１６の周辺に第１の脂質溶液を塗布することによって、開口部１６に人工脂質二重膜を形成することができる。ここで、人工脂質二重膜が形成される仕組みについては、上記（１）で説明した通りである。
An
また、上記イオン透過測定装置２には、電極１４が備えられており、水溶液中を流れる電流を測定することによって、開口部１６に形成された人工脂質二重膜におけるイオンの透過を測定することができる。この電極１４は、従来公知のイオン透過測定装置の電極として使用されているものを用いればよく、特に限定されるものではない。この電極１４には、Ａｇ−ＡｇＣｌ電極を用いることが多い。
In addition, the ion
さらに、上記イオン透過測定装置２においては、上記開口部１６が設けられている位置の近傍の隔壁１５、すなわち、人工脂質二重膜のバルク相が形成される部分の隔壁１５に、脂質置換用の細管１７が取り付けられている。この細管１７は、上述の（２）の脂質置換方法の項で説明したものと同様の機能を果たすものであり、上述の（２）の脂質置換方法の項で説明したものと同じ方法で得ることができるので、ここではその説明を省略する。
Furthermore, in the ion
上記のイオン透過測定装置２においては、該細管１７から上記第１の脂質溶液とは組成の異なる第２の脂質溶液を注入することによって、上記第２の脂質溶液中の脂質を成分として含む人工脂質二重膜を形成することができる。また、上記細管１７には、上述の添加・注入手段が接続されていることが好ましい。これによって、第２の脂質溶液の注入・添加、および、余分な第１の脂質溶液の吸引などを容易に行うことができる。
In the ion
以上のように、上記イオン透過測定装置２は、先ず、第１の脂質溶液中の脂質によって人工脂質二重膜を形成した後、第２の脂質溶液を細管１７を通して脂質二重膜のバルク相へ添加することによって、脂質二重膜の脂質組成を変化させ、第２の脂質溶液中の脂質からなる人工脂質二重膜を形成する。そして、ここで形成されている人工脂質二重膜の脂質組成が、第１の脂質溶液中の脂質組成から、第２の脂質溶液中に含まれる脂質組成へ置換される過程において、電極１４によって人工脂質二重膜におけるイオン透過を常に測定することができる。
As described above, the ion
つまり、本発明のイオン透過測定装置は、上述の（２）の脂質置換方法を利用して、人工脂質二重膜の脂質組成を変えながらイオン透過を測定することのできるものであると言える。それゆえ、この脂質置換に必要な各要素については、上述の（２）の脂質置換方法おいて説明したものを同様に適用することができる。上記のイオン透過測定装置によれば、人工脂質二重膜の脂質組成の変化とイオンチャネルにおけるイオン透過との関係を経時的に観察することができる。それゆえ、イオンチャネルの機能解析を行う上で非常に有用である。 That is, it can be said that the ion permeation measuring apparatus of the present invention can measure ion permeation while changing the lipid composition of the artificial lipid bilayer membrane using the lipid substitution method (2) described above. Therefore, for each element necessary for this lipid substitution, those described in the lipid substitution method of (2) above can be similarly applied. According to the above ion permeation measuring apparatus, the relationship between the change in the lipid composition of the artificial lipid bilayer membrane and the ion permeation in the ion channel can be observed over time. Therefore, it is very useful for functional analysis of ion channels.
また、上記イオン透過測定装置２の細管１７の上端側には、微動マニュピレーター１８が接続されている。これによれば、細管１７を人工脂質二重膜のバルク相の所望とする位置へ接触させ、バルク相へ確実に第２の脂質溶液を注入することができるため、人工脂質二重膜における脂質の置換が確実に実現される。なお、上記細管１７に上記添加・注入手段が取り付けられている場合には、上記微動マニュピレーターはこの添加・注入手段に接続されている。この微動マニュピレーター１８は、特に限定されることはなく従来公知の種々のものを用いることができるが、例えば、水圧式、油圧式、ピエゾ式のものを好適に使用することができる。
A
なお、本発明のイオン透過測定用装置には、下溶液槽１２の底面と対向する位置に光学測定装置が備えられていてもよい。これにより、イオンチャネルを介して流れる電流の測定と同時に、イオンチャネルを光学的に観察することが可能となる。かかる観察としては、例えば、ゲートの開閉に伴う蛍光標識したイオンチャネルの蛍光強度の変化、イオンチャネルの動き、２つの蛍光染料間のエネルギー転移によるスペクトルの変化等の観察が挙げられる。また、人工脂質二重膜が形成されていること、および、人工脂質二重膜における脂質置換の様子を上記光学測定装置により観察することも可能である。さらに、蛍光標識した脂質を用いた人工脂質二重膜を用いて脂質分子の動きを観察することもできる。もちろん光学測定はこれらに限定されるものではなく、従来公知のあらゆる方法が適用される。上記光学測定装置としては例えば、近接場光励起蛍光顕微鏡、光学顕微鏡、分光光度計等が挙げられる。
In the ion transmission measurement device of the present invention, an optical measurement device may be provided at a position facing the bottom surface of the
（５）本発明の利用方法について
本発明の人工脂質膜における脂質置換方法を利用すれば、既に形成されている人工脂質二重膜を直接脂質置換して、脂質組成の異なる人工脂質二重膜を形成することができる。さらに、本発明のイオン透過測定装置を利用すれば、上記のように脂質置換される人工脂質二重膜に組み込まれたイオンチャネルにおけるイオン透過の様子を確認することができる。
(5) Utilization method of the present invention If the lipid substitution method in the artificial lipid membrane of the present invention is utilized, the artificial lipid bilayer membrane having different lipid composition is obtained by directly replacing the artificial lipid bilayer membrane that has already been formed. Can be formed. Furthermore, if the ion permeation measuring apparatus of the present invention is used, it is possible to confirm the state of ion permeation in the ion channel incorporated in the artificial lipid bilayer membrane that is lipid-substituted as described above.
それゆえ、本発明は、例えば、イオンチャネルの機能に対する脂質分子の影響評価に用いることができる。つまり、イオンチャネル研究のための脂質平面膜法に本発明を応用すれば、様々なイオンチャネルに対する脂質二重膜の脂質組成の影響を調べることができる。イオンチャネルは、組み込まれる脂質二重膜の脂質組成と密接に関連している場合が多く、特定の脂質のみに活性を有するものも多数存在する。したがって、イオンチャネルと脂質二重膜の脂質組成との関係を調査することは、イオンチャネルの機能解析において重要であり、本発明の有用性は高い。 Therefore, the present invention can be used, for example, to evaluate the influence of lipid molecules on the function of ion channels. That is, if the present invention is applied to the lipid planar membrane method for ion channel research, the influence of the lipid composition of the lipid bilayer membrane on various ion channels can be examined. Ion channels are often closely related to the lipid composition of the incorporated lipid bilayer membrane, and many have activity only on specific lipids. Therefore, investigating the relationship between the ion channel and the lipid composition of the lipid bilayer membrane is important in the functional analysis of the ion channel, and the usefulness of the present invention is high.
また、本発明のイオン透過測定装置は、疾患に関与するイオンチャンネルを用いた創薬におけるスクリーニングや薬理試験に用いることができる。イオンチャネルとして機能する膜タンパクは、種類も多く、ほとんどすべての細胞に分布しており、これらは疾患の原因にもなりやすい。このことから、イオンチャネルをターゲットとする多くの薬剤の開発が将来に渡って見込まれる。また、既に開発されているイオンチャネルをターゲットとする薬剤の中には、特定の脂質に活性を示すものも多数存在する。それゆえ、本発明を利用してイオンチャネルの活性に対する脂質分子の影響を評価すれば、上記の薬剤の薬理実験にて、特定の脂質の効果を直接確認することができる。特に、向精神薬など神経系に作用する薬は、チャネルタンパクに直接働くものが多く、この分野の創薬に好適に用いることができる。また、農薬の創薬に際しては、逆に、人間のチャネルに作用しないものを選択するために用いることができる。 Moreover, the ion permeation measuring apparatus of the present invention can be used for screening and pharmacological tests in drug discovery using ion channels involved in diseases. There are many types of membrane proteins that function as ion channels, and they are distributed in almost all cells, which are likely to cause diseases. Therefore, the development of many drugs targeting ion channels is expected in the future. In addition, among the drugs that have already been developed that target ion channels, there are many drugs that exhibit activity on specific lipids. Therefore, if the influence of a lipid molecule on the activity of an ion channel is evaluated using the present invention, the effect of a specific lipid can be directly confirmed in the pharmacological experiment of the above drug. In particular, many drugs that act on the nervous system, such as psychotropic drugs, work directly on channel proteins and can be suitably used for drug discovery in this field. On the contrary, in drug discovery of agricultural chemicals, it can be used to select those that do not act on human channels.
以下、実施例により、本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。 EXAMPLES Hereinafter, although an Example demonstrates this invention further in detail, this invention is not limited to this.
本実施例では、上記第１の脂質溶液としてエルゴステロールを含まないもの、上記第２の脂質溶液としてエルゴステロールを含むものを用い、かつ、チャネル分子としてアンフォテリシンＢを用いて、チャネル分子の機能に対する人工脂質二重膜の脂質分子の影響を評価した。 In this example, the first lipid solution does not contain ergosterol, the second lipid solution contains ergosterol, and amphotericin B is used as the channel molecule. The influence of lipid molecules on the artificial lipid bilayer membrane was evaluated.
本実施例においては、上述のイオン透過測定装置（図３参照）を用いて、開口部１６に形成した人工脂質二重膜におけるイオン透過を測定することによって、チャネル分子に対する脂質の影響を評価した。
In this example, the influence of lipid on channel molecules was evaluated by measuring ion permeation in the artificial lipid bilayer formed in the
先ず、エルゴステロールを含まない第１の脂質溶液として、ホスファチジルコリン（Avanti製）を有機溶媒デカンに濃度２０ｍｇ／ｍｌとなるように溶解した脂質溶液を用いて、上記の実施の形態に記載の手順に従って自立型水平膜の人工脂質二重膜を形成した。なお、上溶液槽１１および下溶液槽１２内に満たされた水溶液は、３Ｍ KCl,１０ｍＭ Hepes/Tris（pH7.4）であった。
First, as a first lipid solution not containing ergosterol, a lipid solution in which phosphatidylcholine (manufactured by Avanti) is dissolved in an organic solvent decane so as to have a concentration of 20 mg / ml is used according to the procedure described in the above embodiment. A self-standing horizontal membrane artificial lipid bilayer was formed. The aqueous solution filled in the
続いて、ＤＭＳＯ（Sigma製）に溶解したアンフォテリシンＢ（Sigma製）を、形成した脂質二重膜の上方から１０−７Ｍ程度添加した。アンフォテリシン添加後から、電極１４において、経時的に電流を検出した（図４参照）。 Subsequently, amphotericin B (manufactured by Sigma) dissolved in DMSO (manufactured by Sigma) was added at about 10 −7 M from above the formed lipid bilayer membrane. After addition of amphotericin, current was detected over time at the electrode 14 (see FIG. 4).
ここで、２０分程度放置したが、電流に変化が見られず、イオンチャネルの活性がないことを確認した。その後、第２の脂質溶液として調製した、エルゴステロール（ナカライテスク製）を有機溶媒デカンに濃度５ｍｇ／ｍｌとなるように溶解した脂質溶液を、細管１１から人工脂質二重膜のバルク相へ添加した。この間も、電極１４において、経時的に電流を検出した。
Here, it was allowed to stand for about 20 minutes, but no change was observed in the current, and it was confirmed that there was no ion channel activity. Thereafter, a lipid solution prepared by dissolving ergosterol (manufactured by Nacalai Tesque) as a second lipid solution in an organic solvent decane to a concentration of 5 mg / ml is added from the capillary 11 to the bulk phase of the artificial lipid bilayer membrane. did. During this time, current was detected at the
図４には、電極１４において電流を検出した結果を経時的に示す。図４には、エルゴステロール溶液を添加してから約数分経過した後の電流検出結果を、時間経過の順に上段から記載している。図４には示していないが、第１の脂質溶液から形成されたホスファチジルコリン人工膜では、アンフォテリシンＢを添加しても電流に変化が見られず、ホスファチジルコリンに対してアンフォテリシンＢはチャネル活性を示さないことが判った。
FIG. 4 shows the results of detecting the current at the
しかし、図４に示すように、第２の脂質溶液としてエルゴステロール溶液を添加した数分後には、電流に変化が見られ、エルゴステロールに対してアンフォテリシンＢがチャネル活性を示すことが確認された。この結果から、上記第２の脂質溶液を添加することによって、人工脂質二重膜において脂質組成が変化し、アンフォテリシンＢがイオンチャネルとしての機能を発揮することが裏付けられた。 However, as shown in FIG. 4, a few minutes after the addition of the ergosterol solution as the second lipid solution, a change in current was observed, confirming that amphotericin B exhibited channel activity against ergosterol. . From these results, it was confirmed that by adding the second lipid solution, the lipid composition in the artificial lipid bilayer changes, and amphotericin B exhibits a function as an ion channel.
以上の実施例の結果から、本発明の人工脂質二重膜における脂質置換方法によって、人工脂質二重膜の脂質の組成を簡単に変えることのできることが示された。また、本発明のイオン透過測定装置によって、人工脂質二重膜を形成する特定の脂質のチャネル分子に対する効果を確認することができることが示された。 From the results of the above examples, it was shown that the lipid composition of the artificial lipid bilayer membrane of the present invention can easily change the lipid composition of the artificial lipid bilayer membrane. Moreover, it was shown that the effect with respect to the channel molecule of the specific lipid which forms an artificial lipid bilayer membrane can be confirmed with the ion-permeation measuring apparatus of this invention.
本発明のイオン透過測定装置は、イオンチャネルの機能に対して脂質分子が及ぼす影響を調査することができ、イオンチャネルの機能解析に役立てることができる。イオンチャネルは、種類も多く、ほとんどすべての細胞に分布して生体が生存するために重要な役割を果たすことから、疾患の原因にもなりやすい。そのため、イオンチャネルをターゲットとする薬剤が、今後益々必要とされるようになると予想される。本発明は、イオンチャンネルをターゲットとする薬剤開発におけるスクリーニングや薬理試験にも利用できる可能性を有しているため、その有用性は高いと言える。 The ion permeation measuring apparatus of the present invention can investigate the influence of lipid molecules on the function of ion channels, and can be used for functional analysis of ion channels. There are many types of ion channels, and since they play an important role in the survival of living organisms by being distributed to almost all cells, they are likely to cause diseases. Therefore, it is expected that drugs targeting ion channels will be required more and more in the future. Since the present invention has a possibility of being used for screening and pharmacological tests in drug development targeting ion channels, it can be said that its usefulness is high.
１ 人工脂質二重膜製造装置
２ イオン透過測定装置
１１ 上溶液槽（第１の溶液槽）
１２ 下溶液槽（第２の溶液槽）
１３ 水溶液
１４ 電極
１５ 隔壁
１６ 開口部
１７ 細管
１８ 微動マニュピレーター
２１ リン脂質（脂質）
２２ 脂質溶液（第１・第２の脂質溶液）
２３ 支持体
２４ イオンチャネル（チャネル分子）
Ａ 脂質二重層部分
Ｂ バルク相
Ｃ 小孔（開口部）
DESCRIPTION OF SYMBOLS 1 Artificial lipid bilayer
12 Lower solution tank (second solution tank)
13
22 Lipid solutions (first and second lipid solutions)
23
A Lipid bilayer part B Bulk phase C Small pore (opening)
Claims (12)
脂質置換用の細管に上記第１の脂質溶液とは異なる組成の第２の脂質溶液を注入する脂質溶液注入工程と、
上記細管を上記脂質二重膜のバルク相に接触させ、上記第２の脂質溶液をバルク相へ添加する脂質溶液添加工程とからなることを特徴とする請求項１に記載の人工脂質二重膜の脂質置換方法。 An artificial lipid bilayer formation step of forming a lipid bilayer using the first lipid solution;
A lipid solution injection step of injecting a second lipid solution having a composition different from that of the first lipid solution into the lipid-displacement capillary;
The artificial lipid bilayer membrane according to claim 1, comprising a lipid solution addition step of bringing the capillary tube into contact with the bulk phase of the lipid bilayer membrane and adding the second lipid solution to the bulk phase. Lipid replacement method.
上記人工脂質二重膜の脂質組成が、第１の脂質溶液中の脂質組成から、第２の脂質溶液中に含まれる脂質組成へ置換される過程において、上記水溶液中を流れる電流を測定することを特徴とするイオン透過測定方法。Measuring the current flowing in the aqueous solution in the process of replacing the lipid composition of the artificial lipid bilayer membrane with the lipid composition contained in the second lipid solution from the lipid composition in the first lipid solution. An ion permeation measuring method characterized by the above.
上記隔壁に設けられた開口部の周辺に第１の脂質溶液を塗布することによって、該開口部に脂質二重膜を形成する人工脂質二重膜製造装置において、
上記開口部近傍の隔壁には、脂質置換用の細管が取り付けられており、上記細管から上記第１の脂質溶液とは組成の異なる第２の脂質溶液を注入することによって、上記第２の脂質溶液中の脂質を成分として含む人工脂質二重膜を形成することを特徴とする人工脂質二重膜製造装置。 Two solution tanks filled with an aqueous solution, the first solution tank and the second solution tank, and the two solution tanks disposed between the first solution tank and the second solution tank. A partition wall for partitioning,
In the artificial lipid bilayer membrane manufacturing apparatus for forming a lipid bilayer membrane in the opening by applying the first lipid solution around the opening provided in the partition wall,
A lipid replacement capillary is attached to the partition wall in the vicinity of the opening, and the second lipid solution is injected from the capillary by injecting a second lipid solution having a composition different from that of the first lipid solution. An artificial lipid bilayer production apparatus characterized by forming an artificial lipid bilayer membrane containing lipids in a solution as a component.
上記人工脂質二重膜は、上記第１の溶液槽と上記第２の溶液槽との間に配置された隔壁に設けられた開口部に形成されており、
上記開口部近傍の隔壁には、脂質置換用の細管が取り付けられていることを特徴とするイオン透過測定装置。 A first solution tank and a second solution tank, which are two solution tanks filled with an aqueous solution, and an electrode for detecting a current flowing in the aqueous solution, the first solution tank and the second solution tank; In an ion permeation measuring device that measures the permeation of ions in an ion channel incorporated in an artificial lipid bilayer membrane formed at the boundary with a solution tank,
The artificial lipid bilayer membrane is formed in an opening provided in a partition wall disposed between the first solution tank and the second solution tank,
An ion permeation measuring device, wherein a lipid replacement capillary is attached to the partition wall in the vicinity of the opening.
12. The ion permeation measuring apparatus according to claim 10, wherein the thin tube is connected to a fine movement manipulator.
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