JP3770706B2 - Amidine derivative and drug carrier comprising the same - Google Patents

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、新規なアミジン誘導体およびそれを構成成分とする薬物担体に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
近年、リポソーム、エマルジョン、リピッドマイクロスフェアなどの閉鎖小包を薬物担体としてドラッグデリバリーシステム（以下、ＤＤＳと称す）に応用しようとする研究が盛んに行われている。これら閉鎖小包は一般的にリン脂質あるいはその誘導体、またはステロールやリン脂質以外の脂質等を基本膜構成成分として調製される、しかしながら、これら基本構成成分のみでは、閉鎖小包同士の凝集、体内における滞留性の低下などの実際に応用していく上での様々な困難を克服することはできなかった。さらに、実際にＤＤＳ製剤として目的の部位に薬物を到達させることは非常に困難であった。
【０００３】
そこで、薬物封入率の向上および閉鎖小包の細胞接着性の向上を目的として、ステアリルアミン等のカチオン化脂質を少量配合することにより、閉鎖小包体の表面を生理的ｐＨ範囲でカチオン化する試みも行われている。カチオン性のリポソームの用途の一つにはＤＮＡの細胞中への移動、すなわち、トランスフェクションを促進することが知られているが、さらに導入効率、発現率、安全性の高いものが切望されている。しかし、カチオン化脂質として選択できる脂質は限られており、安全性が高く、高機能を発現する薬物担体用カチオン化脂質の開発が強く望まれている。現在のところ、公知のカチオン化脂質としては、例えば米国特許第４８９７３５５号、米国特許第５３３４７６１号、日本特許公報特開平２−２９２２４６号、日本特許公報特開平４−１０８３９１号が報告されているが十分な効果は得られていない。
【０００４】
一方、本発明のアミジン誘導体と類似の化学構造を有する化合物は、例えば J.Med.Chem.,12,1049-52(1969)、J.Med.Chem.17,1160-1167(1974)に報告されているが、薬物担体機能については一切記載されていない。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
従って、薬物、 ＤＮＡ、ペプチドおよびタンパク質を目的の部位、例えば肺ガン、肝ガン、腎ガン、膵ガン、肺炎、肝炎、腎炎、リンパ腫、血管内皮損傷部位などの患部に確実に、効率良くかつ安全に薬物のターゲッティングが行え、ＤＤＳ療法に有効な薬物担体の開発が強く望まれている。
【０００６】
従って本発明の目的は、核酸、ポリヌクレオチド、遺伝子およびその類縁体を細胞へ効率良くしかも安全にトランスフェクションを行える薬物担体、およびそれを形成し得るカチオン化脂質を提供することである。また本発明の目的は薬物、ペプチドおよびタンパク質を目的の部位に効果的に送達する薬物担体、およびそれを形成しうるカチオン化脂質および薬物担体を提供することである。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
１．本発明は下記一般式（１）で示されるアミジン誘導体である。
【０００８】
【化３】

【０００９】
式（１）中、Ａは芳香環であり、Ｒ¹、Ｒ²、Ｒ³、Ｒ⁴は同一または異なって水素（但し、Ｒ¹、Ｒ²、Ｒ³、Ｒ⁴がすべて水素の場合は除く）、炭素数８〜２５のアルキル基またはアルケニル基である。Ｘ、Ｙは同一または異なってＯまたはＳであり、ｐ、ｑは同一または異なって０または１、ｌ、ｍ、ｎは同一または異なって０または１から６までの自然数を示す（但し、ｐ＝ｍ＝ｑ＝ｎ＝０であってＲ ^１ またはＲ ^２ 、Ｒ ^３ またはＲ ^４ のそれぞれ一方が水素の場合は除く）。
【００１０】
２．本発明は、下記一般式（２）で示されるアミジン誘導体である。
【００１１】
【化４】

【００１２】
式（２）中、Ａは芳香環であり、Ｒ¹、Ｒ²は同一または異なって水素（但し、Ｒ¹、Ｒ²が共に水素の場合は除く）、炭素数８〜２５のアルキル基またはアルケニル基である。ＸはＯまたはＳであり、ｐは０または１、ｌ、ｍは同一または異なって０または１から６までの自然数を示す。
【００１３】
３．本発明は、上記１または２に記載のアミジン誘導体を構成成分とする薬物担体である。
４．本発明は、前記の担体の内部に診断および／または治療するための薬物を封入してなる上記３に記載の薬物担体である。
【００１４】
５．本発明は、前記の担体の径が０.０２〜２５０μｍの大きさである上記３乃至４に記載の薬物担体である。
６．本発明は、前記の担体がリポソームから構成される上記３乃至５に記載の薬物担体である。
【００１５】
７．本発明は、前記の担体がリン脂質あるいはその誘導体、および／またはリン脂質以外の脂質あるいはその誘導体、および／または安定化剤、および／または酸化防止剤、および／またはその他の表面修飾剤を含有する上記３乃至６に記載の薬物担体である。
８．本発明は、前記の診断および／または治療するための薬物が、核酸、ポリヌクレオチド、遺伝子およびその類縁体である上記３乃至７に記載の薬物担体である。
【００１６】
９．本発明は、前記の診断および／または治療するための薬物が、抗癌剤、抗生物質、酵素剤、酵素阻害剤、抗酸化剤、脂質取り込み阻害剤、ホルモン剤、抗炎症剤、ステロイド剤，血管拡張剤、アンジオテンシン変換酵素阻害剤、アンジオテンシン受容体拮抗剤、平滑筋細胞の増殖・遊走阻害剤、血小板凝集阻害剤、抗凝固剤、ケミカルメデイエーターの遊離抑制剤、血管内皮細胞の増殖または抑制剤、アルドース還元酵素阻害剤、メサンギウム細胞増殖阻害剤、リポキシゲナーゼ阻害剤、免疫抑制剤、免疫賦活剤、抗ウイルス剤、メイラード反応抑制剤、アミロイドーシス阻害剤、ＮＯＳ阻害剤、ＡＧＥｓ阻害剤あるいはラジカルスカベンチャーである上記３乃至７に記載の薬物担体である。
【００１７】
１０．本発明は、前記の診断および／または治療するための薬物が、グリコサミノグリカンおよびその誘導体である上記３乃至７に記載の薬物担体である。
１１．本発明は、前記の診断および／または治療するための薬物が、オリゴおよび／または多糖、およびそれらの誘導体である上記３乃至７に記載の薬物担体である。
【００１８】
１２．本発明は、前記の診断および／または治療するための薬物が、タンパク質またはペプチドである上記３乃至７に記載の薬物担体である。
１３．本発明は、前記の診断および／または治療するための薬物が、Ｘ線造影剤、放射性同位元素標識核医学診断薬、核磁気共鳴診断用診断薬等の各種体内診断薬である上記３乃至７に記載の薬物担体である。
【００１９】
【発明の実施の形態】
本発明の一般式（１）及び（２）に示す化合物はいずれも新規化合物であり、その合成経路の例を下記に示す。但し、本発明の合成方法はこれらに限定されるものでない。下記一般式（３）又は（４）で表わされる化合物のＣＮの部位をアミジノ基に変換することによって製造することができる。
【００２０】
【化５】

【００２１】
式（３）中、Ａは芳香環であり、Ｒ¹、Ｒ²、Ｒ³、Ｒ⁴は同一または異なって水素（但し、Ｒ¹、Ｒ²、Ｒ³、Ｒ⁴がすべて水素の場合は除く）、炭素数８〜２５のアルキル基またはアルケニル基である。Ｘ、Ｙは同一または異なってＯまたはＳであり、ｐ、ｑは同一または異なって０または１、ｌ、ｍ、ｎは同一または異なって０または１から６までの自然数を示す（但し、ｐ＝ｍ＝ｑ＝ｎ＝０であってＲ ^１ またはＲ ^２ 、Ｒ ^３ またはＲ ^４ のそれぞれ一方が水素の場合は除く）。
【００２２】
【化６】
一般式（４）

【００２３】
式（４）中、Ａは芳香環であり、Ｒ¹、Ｒ²は同一または異なって水素（但し、Ｒ¹、Ｒ²が共に水素の場合は除く）、炭素数８〜２５のアルキル基またはアルケニル基である。ＸはＯまたはＳであり、ｐは０または１、ｌ、ｍは同一または異なって０または１から６までの自然数を示す。
【００２４】
このように製造されるアミジン誘導体は、公知の分離、精製手段（例えば、クロマトグラフィー、再結晶）などにより単離採取することができる。
【００２５】
本発明の担体は、粒径が０.０２〜２５０μｍ、とりわけ０.０５〜０.４μｍの大きさが好ましい。また、構造としては様々な形態が考えられ、限定する必要はないが、特にその内部に薬物を高濃度封入することのできる潜在的機能を有する、例えば巨大分子、微集合体、微粒子、微小球、ナノ小球、リポソームおよびエマルジョンの中より少なくとも一つ以上からなることが最も望ましい。
【００２６】
本発明において、薬物担体の構成成分としては、上記の形態を形成できるものであれば特にその配合に限定する必要はないが、その安全性や、生体内における安定性を考慮すると、リン脂質あるいはその誘導体、リン脂質以外の脂質あるいはその誘導体、または安定化剤、酸化防止剤、その他の表面修飾剤の配合が望ましい。
【００２７】
リン脂質の例としては、ホスファチジルコリン（＝レシチン）、ホスファジルグリセロール、ホスファチジン酸、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、スフィンゴミエリン、カルジオリビン等の天然あるいは合成のリン脂質、またはこれらを常法にしたがって水素添加したもの等を挙げることができる。
【００２８】
安定化剤の例としては、膜流動性を低下させるコレステロールなどのステロール、あるいはグリセロール、シュクロースなどの糖類が挙げられる。
酸化防止剤の例としては、アスコルビン酸、尿酸あるいはトコフェロール同族体例えばビタミンＥなどが挙げられる。トコフェロールには、α、β、γ、δの４個の異性体が存在するが本発明においてはいずれも使用できる。
【００２９】
その他の表面修飾剤の例としては、親水性高分子やグルクロン酸、シアル酸、デキストランなどの水溶性多糖類の誘導体が挙げられる。
前記の親水性高分子の例としては、ポリエチレングリコール、デキストラン、プルラン、フィコール、ポリビニルアルコール、スチレン−無水マレイン酸交互共重合体、ジビニルエーテル−無水マレイン酸交互共重合体、合成ポリアミノ酸、アミロース、アミロペクチン、キトサン、マンナン、シクロデキストリン、ペクチン、カラギーナンなどが挙げられる。その中でもポリエチレングリコールは血中滞留性を向上させる効果が顕著である。
【００３０】
また前記の親水性高分子は、長鎖脂肪族アルコール、ステロール、ポリオキシプロピレンアルキル、またはグリセリン脂肪酸エステル等の疎水性化合物と結合させた誘導体を用いることによって、疎水性化合物部位を薬物担体（例えばリポソーム）の膜へ安定に挿入することができる。そのことにより、薬物担体表面に親水性高分子を存在させることができる。本発明において具体的に用いることができる親水性高分子誘導体の例としては、ポリエチレングリコール−フォスファチジルエタノールアミン等が挙げられる。
【００３１】
本発明において、薬物担体に封入する薬剤としては、診断および／または治療の目的に応じて薬学的に許容し得る薬理的活性物質、生理的活性物質または診断用物質を用いることができる。
封入する薬剤の性質としては、基本的にはどの物質においても問題ないが、担体の表面が陽電荷を持つ特徴から、電気的に中性あるいはアニオン性である物質の方が高封入率が期待できる。
【００３２】
封入する治療するための薬剤の種類としては、薬物担体の形成を損ねない限り特に限定されるものではない。具体的には、核酸、ポリヌクレオチド、遺伝子およびその類縁体、抗癌剤、抗生物質、酵素剤、抗酸化剤、脂質取り込み阻害剤、ホルモン剤、抗炎症剤、ステロイド剤、血管拡張剤、アンジオテンシン変換酵素阻害剤、アンジオテンシン受容体拮抗剤、平滑筋細胞の増殖・遊走阻害剤、血小板凝集阻害剤、抗凝固剤、ケミカルメデイエーターの遊離阻害剤、血管内皮細胞の増殖促進または抑制剤、アルドース還元酵素阻害剤、メサンギウム細胞増殖阻害剤、リポキシゲナーゼ阻害剤、免疫抑制剤、免疫賦活剤、抗ウイルス剤、メイラード反応抑制剤、アミロイドーシス阻害剤、一酸化窒素合成阻害剤、Advanced glycation endproducts阻害剤、ラジカルスカベンチャー、タンパク質、ペプチド等が挙げられる。
【００３３】
例えば、抗癌剤の例としては、シクロホスファミド、イホスファミド、塩酸ナイトロジェンマスタード−Ｎ−オキシド、チオテパ、ブルスファン、カルボコン、塩酸ニムスチン、ラニムスチン、メルファラン、トシル酸インプロスルファン、ダカルバジン、塩酸プロカルバジン、シタラビン、シタラビンオクスファート、エノシタビン、メルカプトプリン、チオイノシン、フルオロウラシル、ドキシフルリジン、テガフール、メトトレキサート、カルモフール、ヒドロキシカルバミド、硫酸ビンクリスチン、硫酸ビンブラスチン、硫酸ビンデシン、エトポシド、クロモマイシンＡ3、塩酸ダウノルビシン、塩酸ドキソルビシン、塩酸アラクルビシン、ピラルビシン、塩酸エピルビシン、ダクチノマイシン、塩酸ミトキサントロン、塩酸ブレオマイシン、硫酸ペプロマイシン、マイトマイシンＣ、ネオカルノスタチン、Ｌ−アスパラギナーゼ、アセグラトンミトプロニトール、デキストラン硫酸ナトリウム、酢酸オクトレオチド、シスプラチン、カルボプラチン、クエン酸タモキシフェン、酢酸メドロキシプロゲステロン、リン酸エストラムスチンナトリウム、酢酸ゴセレリン、酢酸リュープロレリン、塩酸イリノテカンなどが挙げられる。
【００３４】
抗生物質の例としては、ベンジルペニシリンカリウム、ベンジルペニシリンベンザチン、フェノキシメチルペニシリンカリウム、フェネチシリンカリウム、クロキサシリンナトリウム、フルクロキサシリンナトリウム、アンピシリン、トシル酸スルタミシリン、塩酸バカンピシリン、塩酸タランピシリン、レナンピシリン、ヘタシリンカリウム、シクラシリン、アモキシシリン、塩酸ピブメシリナム、アスポキシシリン、カルベニシリンナトリウム、カリンダシリンナトリウム、スルベニシリンナトリウム、チカルシリンナトリウム、ピペラシリンナトリウム、セファロリジン、セファロチンナトリウム、セファゾリンナトリウム、セファピリンナトリウム、セフラジン、セファレキシン、セファトリジンプロピレングリコール、セフロキサジン、セファクロル、セファドロキシル、塩酸セフォチアム、塩酸セフォチアムヘキセチル、セフロキシムナトリウム、セフロキシムアキセチル、セファマンドールナトリウム、セフジニル、塩酸セフェタメトピポキシル、セフチプテン、セフメタゾールナトリウム、セフォキシチンナトリウム、セフォテタンナトリウム、セフミノクスナトリウム、セフプペラゾンナトリウム、セフピラミドナトリウム、セフスロジンナトリウム、セフォタキシムナトリウム、セフォペラゾンナトリウム、セフチゾキシムナトリウム、塩酸セフメノキシム、セフトリアキソンナトリウム、セフタジジム、セフピミゾールナトリウム、セフィキシム、セフテラムピポキシル、セフゾナムナトリウム、セフポドキシプロキセチル、セフォジジム、硫酸セフピロム、ラタモキセフナトリウム、フロモキセフナトリウム、イミペネム、シラスタチンナトリウム、アズトレオナム、カルモナムナトリウム、硫酸ステレプトマイシン、硫酸カナマイシン、硫酸フラジオマイシン、硫酸アミカシン、硫酸ゲンタマイシン、硫酸パロモマイシン、硫酸ペカナマイシン、硫酸リポスタマイシン、硫酸ジベカシン、トブラマイシン、硫酸シソマイシン、硫酸ミスロノマイシン、硫酸アストロマイシン、硫酸ネチルマイシン、硫酸イセパマイシン、硫酸アルベカシン、エリスロマイシン、キタサマイシン、アセチルキタサマイシン、リン酸オレアンドマイシン、ジョサマイシン、アセチルスピラマイシン、ミデカマイシン、酢酸ミデカマイシン、ロキタマイシン、ロキシスロマイシン、クラリスロマイシン、塩酸テトラサイクリン、塩酸オキシテトラサイクリン、メタリン酸テトラサイクリン、塩酸デメチルクロルテトラサイクリン、ロリテトラサイクリン、塩酸ドキシサイクリン、塩酸ミノサイクリン、クロラムフェニコール、コハク酸クロラムフェニコールナトリウム、パルミチン酸クロラムフェニコール、チアンフェニコール、塩酸アミノ酢酸チアンフェニコール、硫酸コリスチン、コリスチンメタンスルホン酸ナトリウム、硫酸ポリミキシンＢ、バシトラシン、塩酸バンコマイシン、塩酸リンコマイシン、クリンダマイシン、塩酸スペクチノマイシン、ホスホマイシンナトリウム、ホスホマイシンカルシウムなどが挙げられる。
【００３５】
酵素剤の例としては、キモトリプシン、結晶トリプシン、ストレプトキナーゼ・ストレプトドルナーゼ、ヒアルロニダーゼ、ウロキナーゼ、ナサルプラーゼ、アルテプラーゼ、塩化リゾチーム、セミアルカリプロティナーゼ、セラペプターゼ、チソキナーゼ、デュテプラーゼ、バトロキソビン、プロナーゼ、プロメラインなどが挙げられる。
抗酸化剤の例としては、トコフェロール、アスコルビン酸、尿酸などが挙げられる。
【００３６】
抗炎症剤の例としては、サリチル酸コリン、サザピリン、サリチル酸ナトリウム、アスピリン、ジフルニサル、フルフェナム酸、メフェナム酸、フロクタフェニン、トルフェナム酸、ジクロフェナクナトリム、トルメチンナトリウム、スリンダク、フェンブフェン、フェルビナクエチル、インドメタシン、インドメタシンファルネシル、アセメタシン、マレイン酸プログルメタシン、アンフェナクナトリウム、ナブメトン、イブプロフェン、フルルビプロフェン、フルルビプロフェンアキセチル、ケトプロフェン、ナプロキセン、プロチジン酸、プラノプロフェン、フェノプロフェンカルシウム、チアプロフェン酸、オキサプロジン、ロキソプロフェンナトリウム、アルミノプロフェン、ザルトプロフェン、フェニルブタゾン、クロフェゾン、ケトフェニルブタゾン、ピロキシカム、テノキシカム、アンピロキシカム、塩酸チアラミド、塩酸チノリジン、塩酸ベンジダミン、エピリゾール、エルモファゾンなどが挙げられる。
【００３７】
ステロイド剤の例としては酢酸コルチゾン、ヒドロコルチゾン（リン酸エステル、酢酸塩）、酪酸ヒドロコルチゾン、コハク酸ヒドロコルチゾンナトリウム、プレドニゾロン（アセテート、サクシネート、第三級ブチル酢酸エステル、リン酸エステル）、メチルプレドニゾロン（アセテート）、コハク酸メチルプレドニゾロンナトリウム、トリアムシノロン、トリアムシノロンアセトニド（酢酸トリアムシノロン）、デキサメタゾン（リン酸エステル、酢酸塩、リン酸ナトリウム塩、硫酸エステル）、パルミチン酸デキサメタゾン、ベタメタゾン（リン酸塩、２ナトリウム塩）、酢酸パラメタゾン、酢酸フルドロコルチゾン、酢酸ハロプレドン、プロピオン酸クロベタゾール、ハルシノニド、プロピオン酸ベクロメタゾン、吉草酸ベタメタゾン、酢酸ベタメタゾン、酢酸コルチゾンなどが挙げられる。
【００３８】
アンジオテンシン変換酵素阻害剤の例としては、アラセプリル、塩酸イミダプリル、塩酸テモカプリル、塩酸デラプリル、塩酸ベナゼプリル、カプトプリル、シラザプリル、マレイン酸エナラプリル、リシノプリルなどが挙げられる。
血管拡張剤の例としては、テオフィリン、ジプロフィリン、プロキシフィリン、アミノフィリン、コリンテオフィリン、プロスタグランジン、プロスタグランジン誘導体、アルプロスタジルアルファデクス、アルプロスタジル、リマプロストアルファデクス、パパベリン、シクランデラート、シンナリジン、フマル酸ベンシクラン、マレイン酸シネパジド、塩酸ジラゼプ、トラピジル、塩酸ジフェニドール、ニコチン酸、イノシトールヘキサニコチネート、クエン酸ニカメタート、酒石酸ニコチニックアルコール、ニコチン酸トコフェロール、ヘプロニカート、塩酸イソクスプリン、硫酸バメタン、塩酸トラリゾン、メシル酸ジヒドロエルゴトキシン、酒石酸イフェンプロジル、塩酸モキシシリト、ニセルゴリン、塩酸ニカルジピン、ニルバジピン、ニフェジピン、塩酸ベニジピン、塩酸ジルチアゼム、ニソルジピン、ニトレンジピン、塩酸マニジピン、塩酸バルニジピン、塩酸エホニジピン、塩酸ベラパミル、塩酸トリメタジジン、カプトプリル、マレイン酸エナラプリル、アラセプリル、塩酸デラプリル、シラザプリル、リシノプリル、塩酸ベナゼプリル、塩酸ヒドララジン、塩酸トドララジン、ブドララジン、カドララジン、インダパミド、塩酸カルボクロメン、エフロキサート、塩酸エタフェノン塩酸オキシフェドリン、ニコランジル、亜硝酸アミル、硝酸イソソルビドなどが挙げられる。
【００３９】
平滑筋細胞遊走・増殖抑制剤の例としては、ヘパリンナトリウム、ダルテパリンナトリウム（低分子ヘパリン）、ヘパリンカルシウム、デキストラン硫酸などが挙げられる。
血小板凝集阻害剤の例としては、塩酸チクロピジン、シロスタゾール、イコサペント酸エチル、ベラプロストナトリウム、塩酸サルプグレラート、バトロキソビン、ジピリダモールなどが挙げられる。
【００４０】
抗凝固剤の例としては、ヘパリンナトリウム、ダルテパリンナトリウム（低分子ヘパリン）、ヘパリンカルシウム、デキストラン硫酸、ワルファリンカリウム、アルガトロバンなどが挙げられる。
ケミカルメディエーター遊離抑制剤の例としては、トラニラスト、フマル酸ケトフェチン、塩酸アゼラスチン、オキサトミド、アンレキサノクス、レピリナストなどが挙げられる。
免疫抑制剤の例としては、シクロスポリンなどが挙げられる。
抗ウイルス剤の例としては、アシクロビル、ガンシクロビル、ジダノシン、ジドブジン、ソリブジン、ビダラビンなどが挙げられる。
【００４１】
また、封入する診断するための薬剤の種類としては、薬物担体の形成を損ねない限り特に限定されるものではない。具体的には、Ｘ線造影剤、放射性同位元素標識核医学診断薬、核磁気共鳴診断用診断薬等が挙げられる。例えば、 Ｘ線造影剤の例としては、アミドトリゾ酸メグルミン、イオタラム酸ナトリウム、イオタラム酸メグルミン、ガストログラフィン、ヨーダミドメグルミン、リピオドールウルトラフルイド、アジピオドンメグルミン、イオキサグル酸、イオトロクス酸メグルミン、イオトロラン、イオパノ酸、イオパミドール、イオヘキソール、イオベルソール、イオポダートナトリウム、イオメプロール、イソペーク、ヨードキサム酸などが挙げられる。
【００４２】
本発明の薬物担体は常法によって容易に得ることができるが、その一例を以下に示す。フラスコ内に一般式（１）又は（２）で示されるアミジン誘導体およびリン脂質等の他の担体構成成分を、クロロホルム等の有機溶媒により混合し、有機溶媒を留去後に真空乾燥することによりフラスコ内壁に薄膜を形成させる。次に、当該フラスコ内に薬物を加え、激しく攪拌することにより、リポソーム分散液を得る。得られたリポソーム分散液を遠心分離し、上清をデカンテーションし封入されなかった薬物を除去することにより、薬物担体を分散液として得ることができる。また、上記の各構成成分を混合し、高圧吐出型乳化機により高圧吐出させることにより得ることもできる。
【００４３】
【実施例】
次に実施例、試験例を挙げて本発明をさらに詳しく説明する。
（実施例１）
３,５−ビス（（Ｎ−ドデシルカルバモイル）メトキシ）ベンゼンカルボキシアミジンの合成
３,５−ジヒドロキシベンゾニトリル０.６７ｇ、 Ｎ−ドデシル−２−クロロアセトアミド２.６１ｇ、炭酸カリウム１.５２ｇ及びＮ,Ｎ−ジメチルホルムアミド（２５ml）溶液を６０℃で５時間加熱攪拌した。反応溶液を水にあけ、結晶を濾取し、水、メタノールで洗浄し、無色の結晶として３,５−ビス（（Ｎ−ドデシルカルバモイル）メトキシ）ベンゼンカルボニトリル２.２２ｇを得た。
【００４４】
先に得た３,５−ビス（（Ｎ−ドデシルカルバモイル）メトキシ）ベンゼンカルボニトリル１.７６ｇをエタノール（１００ml）−ベンゼン（１５０ml）−クロロホルム（５０ml）の混合溶液に、氷冷下に１時間塩化水素ガスを導入した。減圧下に溶媒を留去し３,５−ビス（（Ｎ−ドデシルカルバモイル）メトキシ）-α-エトキシ-α-イミノトルエン塩酸塩を得た。これをクロロホルム（１６０ml）−メタノール（８０ml）の混合溶液に溶解し、氷冷下に３０分間アンモニアガスを導入した後、７時間加熱還流した。減圧下に溶媒を留去して得られた固体からクロロホルム不溶物を除去して、クロロホルムを減圧留去した。残渣をシリカゲルクロマトグラフィーに付し、５％メタノール−クロロホルム溶出画分より無色結晶として３,５−ビス（（Ｎ−ドデシルカルバモイル）メトキシ）ベンゼンカルボキシアミジン１.２２ｇを得た。このものの機器分析データは下記式（５）の構造を支持する。
【００４５】
¹Ｈ−ｎｍｒ（ＣＤＣｌ₃） δ（ｐｐｍ）：７.２５（２Ｈ，ｓ），６.７１（１Ｈ，ｓ），４.５８（４Ｈ，ｓ），３.２８−３.２１（４Ｈ，ｍ），１.５２（４Ｈ，ｓ），１.３３−１.１９（３６Ｈ，ｍ），０.８７（６Ｈ，ｔ，Ｊ＝６.８Ｈｚ）
融点：２０２−２０４℃
【００４６】
【化６】

【００４７】
（実施例２）
４−（Ｎ,Ｎ−ジオクタデシルカルボモイル）ベンゼンカルボキシアミジンの合成
４−シアノベンゾイルクロライド１６６mg、Ｎ,Ｎ−ジオクタデシルアミン５２２mgとトリエチルアミン１１１mgの塩化メチレン（２０ml）溶液を室温で３時間攪拌した。反応溶液に水を加えクロロホルム抽出し、有機層を順に希アルカリ、水で洗い、無水硫酸マグネシウムで乾燥し、減圧下に濃縮した残渣をシリカゲルクロマトグラフィーに付し、クロロホルム溶出画分よりＮ,Ｎ−ジオクタデシル−４−シアノベンズアミド６００mgを得た（収率９２、無色結晶）。
【００４８】
先に得たＮ,Ｎ−ジオクタデシル−４−シアノベンズアミド１.３０ｇをエタノール（１００ml）−ベンゼン（１５０ml）の混合溶媒に、氷冷下に３０分間塩化水素ガスを導入した。減圧下に溶媒を留去し（４−（エトキシイミノメチル）フェニル）−Ｎ,Ｎ−ジオクタデシルアミド塩酸塩を得た。これをクロロホルム（１６０ml）−メタノール（８０ml）の混合溶液に溶解し、氷冷下に３０分間アンモニアガスを導入した後、８時間加熱還流した。減圧下に溶媒を留去して得られた固体からクロロホルム不溶物を除去して、クロロホルムを減圧留去した。残渣をシリカゲルクロマトグラフィーに付し、５％メタノール-クロロホルム溶出画分より４−（Ｎ,Ｎ−ジオクタデシルカルボモイル）ベンゼンカルボキシアミジン９１０mgを得た（収率68％、無色結晶）。このものの機器分析データは下記式（６）の構造を支持する。
【００４９】
¹Ｈ−ｎｍｒ（ＣＤＣｌ₃） δ（ｐｐｍ）：７.９６（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８.０Ｈｚ），７.３５（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８.０Ｈｚ），３.４９−３.３８（２Ｈ，ｍ），３.１７−３.０６（２Ｈ，ｍ），１.７０−１.０１（６４Ｈ，ｍ），０.８８（６Ｈ，ｔ，Ｊ＝６.４Ｈｚ）
融点：１６８−１６９℃
【００５０】
【化７】

【００５１】
（実施例３）
実施例１、２で合成したアミジン誘導体を膜構成成分として含有するリポソームを下記の通りに調製した。
アミジン誘導体を３μＭ、ジパルミトイルフォスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）を２１μＭ、コレステロールを６μＭを、容量１０mlのナス型フラスコに秤りとり、１mlのクロロホルムにて完全に溶解した。エバポレータによりクロロホルムを減圧留去してフラスコ内壁に脂質薄膜を形成する。次いで０.５μＭのカルセインを含む１０mMＴｒｉｓ-ＨＣｌ緩衝液１mlをフラスコに加え、激しく振とう攪拌することにより、リポソーム（ＭＬＶ）分散液を得た。
【００５２】
（試験例１）
カルセインの封入率の測定
カルセインのリポソームへの封入率は、次のように求めた。５０倍に希釈したリポソーム懸濁液４０μｌを２.０mlの１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液に添加し、蛍光強度を測定する（励起波長４９０ｎｍ、蛍光波長５３０ｎｍ）。この時の蛍光強度をＦｔとする。つぎに１０ｍＭＣｏＣｌ₂水溶液を２０μｌ添加しリポソームに封入されなかったカルセインを消光させ、リポソームの内部に封入されたカルセインの蛍光を測定する。この時の蛍光強度をＦｉｎとする。さらに２０％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００溶液を２０μｌ添加することにより、リポソームを破壊し、すべてのカルセインをＣｏ²⁺と結合させ消光させる。この時の蛍光強度を、Ｆｑとする。リポソームの保持効率は以下の式にて計算される。
【００５３】
保持効率（％）＝（Ｆｉｎ−Ｆｑ×ｒ）／（Ｆｔ−Ｆｑ×ｒ）×１００
【００５４】
式中のｒは、リポソーム懸濁液および薬物の添加に伴う反応液の体積変化を補正した値で本実験ではｒ＝（２.０＋０.０４＋０.０２＋０.０２）／２.０＝１.０４である。結果を表１に示す。
【００５５】
【表１】

【００５６】
（実施例４）
実施例１、２で合成したアミジン誘導体膜構成成分として含有するリポソームを下記の通りに調製した。
アミジン誘導体を１０μＭ、ジラウロイルホスファチジルコリン（ＤＬＰＣ）を２０μＭ、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）２０μＭを秤りとり、１mlのクロロホルム溶液とする。
【００５７】
クロロホルム溶液の２０μlを容量１０mlのナス型フラスコに取りさらに１mlのクロロホルムを加えた。エバポレータによりクロロホルムを減圧留去してフラスコ内壁に脂質薄膜を形成した。次いで、β-galactosodase の遺伝子を組み込んだプラスミドｐｃＤＮＡ／Ａｍｐ（Invitrogen社）２０μｇを溶解した水溶液１mlをフラスコ内に加え、激しく振とう攪拌することによりＤＮＡ封入リポソームを得た。
【００５８】
（試験例２）
細胞の調製とトランスフェクション
細胞：大日本製薬株式会社より購入した、Ｃｏｓ−１細胞（ATCC No. CRL-1650）を１０％牛胎児血清（FCS）を含むIscove's modified Dulbecco's medium（IMDM）を用いて５％ＣＯ₂，９５％Ｏ₂，３７℃のインキュベータ中で継代培養した。
トランスフェクション：１０％ＦＣＳ ＩＭＤＭ培地（１ml）を添加した、６穴マルチウェルプレートに約２×１０⁴のＣｏｓ−１細胞を加え細胞培養を行った。約２４時間培養後にＦＣＳを含まない新鮮培地と交換し、０.２μｇのＤＮＡを含むリポソーム懸濁液を加える。１６時間培養後、１０％ＦＣＳ ＩＭＤＭ培地にて培地交換し、さらに４８時間培養した。細胞を、ホルムアルデヒドで固定し、β-galactosidaseの基質である、5-bromo-4chloro-3-indolyl-β-galactopyranoside（X-gal）を加え、β-galactosidaseを発現した細胞を同定した。発色した細胞の全体に対する割合は、画像処理により測定した。結果を表２に示す。
【００５９】
【表２】

【００６０】
（急性毒性）
ＩＣＲ系雄性マウス（５週齢）を用いて経口投与により急性毒性試験を行った結果、本発明の化合物のＬＤ₅₀はいずれも３２０mg/kg以上であり有効性に比べて高い安全性が確認された。
【００６１】
【発明の効果】
上述した通り、本発明により新規アミジン誘導体が供給される。本発明のアミジン誘導体を構成成分とする薬物担体は試験例に示されるように、従来の薬物担体に比べ細胞への導入効率が高いことが明らかである。このような特徴から、薬学的に許容し得る薬理的活性物質、生理的活性物質または診断用物質を封入させた本発明の薬物担体は、治療および診断という目的に対して非常に効果的である。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a novel amidine derivative and a drug carrier comprising the same.
[0002]
[Prior art]
2. Description of the Related Art In recent years, research has been actively conducted to apply closed parcels such as liposomes, emulsions, and lipid microspheres to drug delivery systems (hereinafter referred to as DDS) as drug carriers. These closed parcels are generally prepared using phospholipids or derivatives thereof, or lipids other than sterols or phospholipids as basic membrane constituents. However, with these basic constituents alone, the closure parcels aggregate and stay in the body. It was impossible to overcome various difficulties in actual application, such as a decline in sex. Furthermore, it was very difficult to actually reach the target site as a DDS preparation.
[0003]
Therefore, an attempt to cationize the surface of the closed package within a physiological pH range by adding a small amount of a cationized lipid such as stearylamine for the purpose of improving the drug encapsulation rate and the cell adhesion of the closed package. Has been done. One of the uses of cationic liposomes is known to promote the transfer of DNA into cells, that is, transfection, but it is also desired to have high introduction efficiency, expression rate, and safety. Yes. However, lipids that can be selected as cationized lipids are limited, and there is a strong demand for the development of cationized lipids for drug carriers that have high safety and high functionality. At present, as known cationized lipids, for example, U.S. Pat. No. 4,897,355, U.S. Pat. No. 5,334,761, Japanese Patent Publication No. 2-292246, and Japanese Patent Publication No. 4-108391 are reported. A sufficient effect has not been obtained.
[0004]
On the other hand, compounds having a chemical structure similar to the amidine derivative of the present invention are reported in, for example, J. Med. Chem., 12, 1049-52 (1969), J. Med. Chem. 17, 1160-1167 (1974). However, it does not describe any drug carrier function.
[0005]
[Problems to be solved by the invention]
Therefore, ensure that drugs, DNA, peptides and proteins are efficiently, safely and safely applied to the affected area, such as lung cancer, liver cancer, kidney cancer, pancreatic cancer, pneumonia, hepatitis, nephritis, lymphoma, vascular endothelial injury site, etc. The development of drug carriers that can target drugs and are effective for DDS therapy is strongly desired.
[0006]
Accordingly, an object of the present invention is to provide a drug carrier capable of efficiently and safely transfecting nucleic acids, polynucleotides, genes and analogs thereof into cells, and a cationized lipid capable of forming the same. It is also an object of the present invention to provide a drug carrier that effectively delivers drugs, peptides and proteins to the target site, and a cationized lipid and drug carrier that can form the drug carrier.
[0007]
[Means for Solving the Problems]
1. The present invention is an amidine derivative represented by the following general formula (1).
[0008]
[Chemical Formula 3]

[0009]
In the formula (1), A is an aromatic ring, and R¹, R², R^Three, R^FourAre the same or different and hydrogen (provided that R¹, R², R^Three, R^FourAre all alkyl groups or alkenyl groups having 8 to 25 carbon atoms. X and Y are the same or different and are O or S, p and q are the same or different and 0 or 1, l, m, n are the same or different and represent a natural number from 0 or 1 to 6(However, p = m = q = n = 0 and R ¹ Or R ² , R ³ Or R ⁴ Except when one of them is hydrogen).
[0010]
2. The present invention is an amidine derivative represented by the following general formula (2).
[0011]
[Formula 4]

[0012]
In formula (2), A is an aromatic ring and R¹, R²Are the same or different and hydrogen (provided that R¹, R²Is an alkyl group or an alkenyl group having 8 to 25 carbon atoms. X is O or S, p is 0 or 1, l, m are the same or different and represent a natural number from 0 or 1 to 6.
[0013]
3. The present invention provides the above 1OrA drug carrier comprising the amidine derivative described in 2 as a constituent.
4). The present invention is the drug carrier according to 3 above, wherein a drug for diagnosis and / or treatment is encapsulated inside the carrier.
[0014]
5). The present invention is the drug carrier according to 3 to 4 above, wherein the carrier has a diameter of 0.02 to 250 μm.
6). The present invention provides the carrier described above.Liposome6. The drug carrier according to 3 to 5 above, comprising:
[0015]
7). In the present invention, the carrier contains phospholipids or derivatives thereof, and / or lipids or derivatives thereof other than phospholipids, and / or stabilizers, and / or antioxidants, and / or other surface modifiers. The drug carrier according to 3 to 6 above.
8). The present invention is the drug carrier according to 3 to 7 above, wherein the drug for diagnosis and / or treatment is a nucleic acid, a polynucleotide, a gene, or an analog thereof.
[0016]
9. In the present invention, the drug for diagnosis and / or treatment is an anticancer agent, antibiotic, enzyme agent, enzyme inhibitor, antioxidant, lipid uptake inhibitor, hormone agent, anti-inflammatory agent, steroid agent, or vasodilator. Agents, angiotensin converting enzyme inhibitors, angiotensin receptor antagonists, smooth muscle cell proliferation / migration inhibitors, platelet aggregation inhibitors, anticoagulants, chemical mediator release inhibitors, vascular endothelial cell growth or inhibitors, Aldose reductase inhibitor, mesangial cell growth inhibitor, lipoxygenase inhibitor, immunosuppressant, immunostimulator, antiviral agent, Maillard reaction inhibitor, amyloidosis inhibitor, NOS inhibitor, AGEs inhibitor or radical scavenger 8. The drug carrier according to 3 to 7 above.
[0017]
10. The present invention is the drug carrier according to 3 to 7 above, wherein the drug for diagnosis and / or treatment is glycosaminoglycan and a derivative thereof.
11. The present invention is the drug carrier according to 3 to 7 above, wherein the drug for diagnosis and / or treatment is an oligo and / or polysaccharide and a derivative thereof.
[0018]
12 The present invention is the drug carrier according to 3 to 7 above, wherein the drug for diagnosis and / or treatment is a protein or a peptide.
13. In the present invention, the above-mentioned drugs for diagnosis and / or treatment are various in-vivo diagnostic agents such as an X-ray contrast agent, a radioisotope-labeled nuclear medicine diagnostic agent, and a diagnostic agent for nuclear magnetic resonance diagnosis. As a drug carrier.
[0019]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
The compounds represented by the general formulas (1) and (2) of the present invention are both novel compounds, and examples of their synthesis routes are shown below. However, the synthesis method of the present invention is not limited to these. It can manufacture by converting the site | part of CN of the compound represented by the following general formula (3) or (4) into an amidino group.
[0020]
[Chemical formula 5]

[0021]
In the formula (3), A is an aromatic ring, and R¹, R², R^Three, R^FourAre the same or different and hydrogen (provided that R¹, R², R^Three, R^FourAre all alkyl groups or alkenyl groups having 8 to 25 carbon atoms. X and Y are the same or different and are O or S, p and q are the same or different and 0 or 1, l, m, n are the same or different and represent a natural number from 0 or 1 to 6(However, p = m = q = n = 0 and R ¹ Or R ² , R ³ Or R ⁴ Except when one of them is hydrogen).
[0022]
[Chemical 6]
General formula (4)

[0023]
In the formula (4), A is an aromatic ring, and R¹, R²Are the same or different and hydrogen (provided that R¹, R²Is an alkyl group or an alkenyl group having 8 to 25 carbon atoms. X is O or S, p is 0 or 1, l, m are the same or different and represent a natural number from 0 or 1 to 6.
[0024]
The amidine derivative thus produced can be isolated and collected by known separation and purification means (for example, chromatography, recrystallization) and the like.
[0025]
The carrier of the present invention preferably has a particle size of 0.02 to 250 μm, particularly 0.05 to 0.4 μm. In addition, various forms are conceivable as the structure, and it is not necessary to limit the structure. For example, macromolecules, microassemblies, microparticles, microspheres having a potential function capable of encapsulating drugs in high concentration therein It is most desirable to be composed of at least one of nano globules, liposomes and emulsions.
[0026]
In the present invention, the component of the drug carrier is not particularly limited as long as it can form the above-mentioned form. However, in view of its safety and stability in vivo, phospholipid or It is desirable to incorporate such derivatives, lipids other than phospholipids or derivatives thereof, or stabilizers, antioxidants, and other surface modifiers.
[0027]
Examples of phospholipids include phosphatidylcholine (= lecithin), phosphatidylglycerol, phosphatidic acid, phosphatidylcholine, phosphatidylethanolamine, phosphatidylserine, phosphatidylinositol, sphingomyelin, cardioribine, etc. In accordance with the above, hydrogenated ones can be mentioned.
[0028]
Examples of stabilizers include sterols such as cholesterol that reduce membrane fluidity, or sugars such as glycerol and sucrose.
Examples of antioxidants include ascorbic acid, uric acid or tocopherol homologues such as vitamin E. Tocopherol has four isomers, α, β, γ, and δ, and any of them can be used in the present invention.
[0029]
Examples of other surface modifiers include hydrophilic polymers and derivatives of water-soluble polysaccharides such as glucuronic acid, sialic acid, and dextran.
Examples of the hydrophilic polymer include polyethylene glycol, dextran, pullulan, ficoll, polyvinyl alcohol, styrene-maleic anhydride alternating copolymer, divinyl ether-maleic anhydride alternating copolymer, synthetic polyamino acid, amylose, Examples include amylopectin, chitosan, mannan, cyclodextrin, pectin, and carrageenan. Among them, polyethylene glycol has a remarkable effect of improving the retention in blood.
[0030]
In addition, the hydrophilic polymer may be a derivative of a hydrophobic compound such as a long chain aliphatic alcohol, a sterol, a polyoxypropylene alkyl, or a glycerin fatty acid ester. It can be stably inserted into the membrane of liposomes. Thereby, a hydrophilic polymer can be present on the surface of the drug carrier. Examples of hydrophilic polymer derivatives that can be specifically used in the present invention include polyethylene glycol-phosphatidylethanolamine and the like.
[0031]
In the present invention, as a drug encapsulated in a drug carrier, a pharmaceutically acceptable pharmacologically active substance, physiologically active substance or diagnostic substance can be used depending on the purpose of diagnosis and / or treatment.
As for the nature of the drug to be encapsulated, there is basically no problem with any substance, but due to the characteristic that the surface of the carrier has a positive charge, a substance that is electrically neutral or anionic is expected to have a higher encapsulation rate. it can.
[0032]
There are no particular limitations on the type of therapeutic agent to be encapsulated as long as it does not impair the formation of the drug carrier. Specifically, nucleic acids, polynucleotides, genes and analogs thereof, anticancer agents, antibiotics, enzyme agents, antioxidant agents, lipid uptake inhibitors, hormone agents, anti-inflammatory agents, steroid agents, vasodilators, angiotensin converting enzyme Inhibitors, angiotensin receptor antagonists, smooth muscle cell proliferation / migration inhibitors, platelet aggregation inhibitors, anticoagulants, chemical mediator release inhibitors, vascular endothelial cell growth promoters or inhibitors, aldose reductase inhibitors Agents, mesangial cell growth inhibitors, lipoxygenase inhibitors, immunosuppressants, immunostimulators, antiviral agents, Maillard reaction inhibitors, amyloidosis inhibitors, nitric oxide synthesis inhibitors, advanced glycation endproducts inhibitors, radical scavengers, Examples include proteins and peptides.
[0033]
For example, examples of anticancer agents include cyclophosphamide, ifosfamide, nitrogen mustard-N-oxide, thiotepa, brusphan, carbocon, nimustine hydrochloride, ranimustine, melphalan, improsulfane tosylate, dacarbazine, procarbazine hydrochloride, Cytarabine, cytarabine oxfert, enositabine, mercaptopurine, thioinosine, fluorouracil, doxyfluridine, tegafur, methotrexate, carmofur, hydroxycarbamide, vincristine sulfate, vinblastine sulfate, vindesine sulfate, etoposide, chromomycin A3, daunorubicin hydrochloride, doxorubicin hydrochloride hydrochloride Pirarubicin, epirubicin hydrochloride, dactinomycin, mitoxantrone hydrochloride, bleoma hydrochloride Isine, pepromycin sulfate, mitomycin C, neocarnostatin, L-asparaginase, acegraton mitopronitol, sodium dextran sulfate, octreotide acetate, cisplatin, carboplatin, tamoxifen citrate, medroxyprogesterone acetate, estramustine phosphate sodium, Examples include goserelin acetate, leuprorelin acetate, and irinotecan hydrochloride.
[0034]
Examples of antibiotics include benzylpenicillin potassium, benzylpenicillin benzathine, phenoxymethylpenicillin potassium, pheneticillin potassium, cloxacillin sodium, flucloxacillin sodium, ampicillin, sultamicillin tosylate, bacampicillin hydrochloride, tarampicillin hydrochloride, lenampicillin , Hetacillin potassium, cyclacillin, amoxicillin, pibmesilinum hydrochloride, aspoxicillin, carbenicillin sodium, calindacillin sodium, sulbenicillin sodium, ticarcillin sodium, piperacillin sodium, cephalolidine, cephalothin sodium, cefazolin sodium, cefapirin sodium, cefradine, cephalexin , Cephatrizine propylene glycol, cefloxa , Cefaclor, cefadroxyl, cefotiam hydrochloride, cefotiam hexetyl, cefuroxime sodium, cefuroxime axetil, cefamandol sodium, cefdinir, cefetamethopoxyl hydrochloride, ceftipten, cefmetazole sodium, cefoxitin sodium, Cefotetan sodium, cefminox sodium, cefpuperazone sodium, cefpyramide sodium, cefthrodine sodium, cefotaxime sodium, cefoperazone sodium, ceftizoxime sodium, cefmenoxime hydrochloride, ceftriaxone sodium, ceftazidime, cefpimi Zole sodium, cefixime, cefterampipoxil, cefzonam sodium, cefpodoxyproxetyl, cefodizime, cefpirom sulfate Ratamoxef sodium, flomoxef sodium, imipenem, cilastatin sodium, aztreonam, carmonam sodium, strepeptomycin sulfate, kanamycin sulfate, fradiomycin sulfate, amikacin sulfate, gentamicin sulfate, paromomycin sulfate, pecanamicin sulfate, liposta sulfate Mycin, dibekacin sulfate, tobramycin, sisomycin sulfate, mythromycin sulfate, astronomycin sulfate, netilmycin sulfate, isepamicin sulfate, arbekacin sulfate, erythromycin, kitasamycin, acetyl kitasamycin, oleandomycin phosphate, josamycin, acetyl spiramycin, midecamycin , Midecamycin acetate, rokitamycin, roxithromycin, clarithromycin, tetrasai hydrochloride Culin, oxytetracycline hydrochloride, tetracycline metaphosphate, demethylchlortetracycline hydrochloride, loritetracycline, doxycycline hydrochloride, minocycline hydrochloride, chloramphenicol, chloramphenicol sodium succinate, chloramphenicol palmitate, thianphenicol, hydrochloric acid Examples include aminoacetic acid thianphenicol, colistin sulfate, colistin sodium methanesulfonate, polymyxin B sulfate, bacitracin, vancomycin hydrochloride, lincomycin hydrochloride, clindamycin, spectinomycin hydrochloride, fosfomycin sodium, and fosfomycin calcium.
[0035]
Examples of enzyme agents include chymotrypsin, crystalline trypsin, streptokinase / streptodolase, hyaluronidase, urokinase, nasarplase, alteplase, lysozyme chloride, semi-alkaline proteinase, serrapeptase, tisokinase, duteprase, batroxobin, pronase, promeline, etc. .
Examples of the antioxidant include tocopherol, ascorbic acid, uric acid and the like.
[0036]
Examples of anti-inflammatory agents include choline salicylate, sazapyrine, sodium salicylate, aspirin, diflunisal, flufenamic acid, mefenamic acid, fructaphenine, tolfenamic acid, diclofenacnatrim, tolmetine sodium, sulindac, fenbufen, ferbinacethyl, indomethacin, indomethacin farnesyl, Acemetacin, Progouritacin maleate, Amfenac sodium, Nabumetone, Ibuprofen, Flurbiprofen, Flurbiprofen axetil, Ketoprofen, Naproxen, Protidic acid, Planoprofen, Fenoprofen calcium, Thiaprofenic acid, Oxaprozin, Loxoprofen Sodium, aluminoprofen, zaltoprofen, phenylbutazone, clofezone Keto phenylbutazone, piroxicam, tenoxicam, ampiroxicam, tiaramide hydrochloride, hydrochloric tinoridine, benzydamine hydrochloride, epirizole, Erumofazon the like.
[0037]
Examples of steroids include cortisone acetate, hydrocortisone (phosphate ester, acetate salt), hydrocortisone butyrate, hydrocortisone sodium succinate, prednisolone (acetate, succinate, tertiary butyl acetate ester, phosphate ester), methylprednisolone (acetate) , Methylprednisolone sodium succinate, triamcinolone, triamcinolone acetonide (triamcinolone acetate), dexamethasone (phosphate ester, acetate salt, sodium phosphate salt, sulfate ester), dexamethasone palmitate, betamethasone (phosphate salt, sodium salt), Acetic acid parameterzone, fludrocortisone acetate, halopredone acetate, clobetasol propionate, harsinonide, beclomethasone propionate, betamethazozo valerate , Betamethasone acetate, acetic acid cortisone and the like.
[0038]
Examples of angiotensin converting enzyme inhibitors include alacepril, imidapril hydrochloride, temocapril hydrochloride, delapril hydrochloride, benazepril hydrochloride, captopril, cilazapril, enalapril maleate, lisinopril and the like.
Examples of vasodilators include theophylline, diprofylline, proxyphylline, aminophylline, choline theophylline, prostaglandin, prostaglandin derivatives, alprostadil alphadex, alprostadil, limaprost alphadex, papaverine, cyclandelate, cinnarizine, fumarate Bencicurn acid, cinepazide maleate, dirazep hydrochloride, trapidil, diphenidol hydrochloride, nicotinic acid, inositol hexanicotinate, nitricate citrate, nicotinic alcohol tartrate, tocopherol nicotinate, hepronicart, isoxpurine hydrochloride, bamethane sulfate, tolarizone hydrochloride, dihydromesylate Ergotoxin, ifenprodil tartrate, moxysilito hydrochloride, nicergoline, nicardipine hydrochloride, nilva Pin, nifedipine, benidipine hydrochloride, diltiazem hydrochloride, nisoldipine, nitrendipine, manidipine hydrochloride, varnidipine hydrochloride, efonidipine hydrochloride, verapamil hydrochloride, trimetazidine hydrochloride, captopril, enalapril maleate, alacepril, delapril hydrochloride, cilazapril, ricinopril hydrochloride, benzapril hydrochloride hydrochloride Todralazine hydrochloride, budralazine, cadralazine, indapamide, carbochromene hydrochloride, efloxate, etaphenone hydrochloride, oxyfedrine hydrochloride, nicorandil, amyl nitrite, isosorbide nitrate and the like.
[0039]
Examples of the smooth muscle cell migration / proliferation inhibitor include heparin sodium, dalteparin sodium (low molecular weight heparin), heparin calcium, dextran sulfate and the like.
Examples of the platelet aggregation inhibitor include ticlopidine hydrochloride, cilostazol, ethyl icosapentate, beraprost sodium, sarpgrelate hydrochloride, batroxobin, dipyridamole and the like.
[0040]
Examples of the anticoagulant include heparin sodium, dalteparin sodium (low molecular heparin), heparin calcium, dextran sulfate, warfarin potassium, argatroban and the like.
Examples of the chemical mediator release inhibitor include tranilast, ketofetin fumarate, azelastine hydrochloride, oxatomide, amlexanox, and repirinast.
Examples of immunosuppressive agents include cyclosporine.
Examples of the antiviral agent include acyclovir, ganciclovir, didanosine, zidovudine, sorivudine, vidarabine and the like.
[0041]
In addition, the type of diagnostic agent to be encapsulated is not particularly limited as long as the formation of the drug carrier is not impaired. Specific examples include X-ray contrast agents, radioisotope-labeled nuclear medicine diagnostic agents, diagnostic agents for nuclear magnetic resonance diagnosis, and the like. For example, examples of X-ray contrast media include meglumine amidotrizoate, sodium iotaramate, meglumine iotalamate, gastrografin, iodamide meglumine, lipiodol ultrafluid, adipiodon meglumine, oxaglucic acid, meglumine iotroxate, iotrolan, iopanoic acid Iopamidol, iohexol, ioversol, iopodate sodium, iomeprol, isopaque, iodoxamic acid and the like.
[0042]
The drug carrier of the present invention can be easily obtained by a conventional method, an example of which is shown below. The flask is prepared by mixing the amidine derivative represented by the general formula (1) or (2) and other carrier constituents such as phospholipid in an flask with an organic solvent such as chloroform, and distilling off the organic solvent followed by vacuum drying. A thin film is formed on the inner wall. Next, a drug is added to the flask and vigorously stirred to obtain a liposome dispersion. The obtained liposome dispersion is centrifuged, and the supernatant is decanted to remove the unencapsulated drug, whereby a drug carrier can be obtained as a dispersion. Moreover, it can also obtain by mixing each said component and carrying out high pressure discharge with a high pressure discharge type emulsifier.
[0043]
【Example】
Next, the present invention will be described in more detail with reference to examples and test examples.
Example 1
Synthesis of 3,5-bis ((N-dodecylcarbamoyl) methoxy) benzenecarboxyamidine
A solution of 0.67 g of 3,5-dihydroxybenzonitrile, 2.61 g of N-dodecyl-2-chloroacetamide, 1.52 g of potassium carbonate and N, N-dimethylformamide (25 ml) was heated and stirred at 60 ° C. for 5 hours. The reaction solution was poured into water, and the crystals were collected by filtration and washed with water and methanol to obtain 2.22 g of 3,5-bis ((N-dodecylcarbamoyl) methoxy) benzenecarbonitrile as colorless crystals.
[0044]
1.76 g of the 3,5-bis ((N-dodecylcarbamoyl) methoxy) benzenecarbonitrile obtained above was added to a mixed solution of ethanol (100 ml) -benzene (150 ml) -chloroform (50 ml) for 1 hour under ice cooling. Hydrogen chloride gas was introduced. The solvent was distilled off under reduced pressure to obtain 3,5-bis ((N-dodecylcarbamoyl) methoxy) -α-ethoxy-α-iminotoluene hydrochloride. This was dissolved in a mixed solution of chloroform (160 ml) -methanol (80 ml), and after introducing ammonia gas for 30 minutes under ice cooling, the mixture was heated to reflux for 7 hours. The solvent was distilled off under reduced pressure to remove chloroform insolubles from the resulting solid, and chloroform was distilled off under reduced pressure. The residue was subjected to silica gel chromatography, and 1.22-g of 3,5-bis ((N-dodecylcarbamoyl) methoxy) benzenecarboxyamidine was obtained as colorless crystals from the fraction eluted with 5% methanol-chloroform. The instrumental analysis data of this support the structure of the following formula (5).
[0045]
¹H-nmr (CDCl_Three) Δ (ppm): 7.25 (2H, s), 6.71 (1H, s), 4.58 (4H, s), 3.28-3.21 (4H, m), 1.52 ( 4H, s), 1.33-1.19 (36H, m), 0.87 (6H, t, J = 6.8 Hz)
Melting point: 202-204 ° C
[0046]
[Chemical 6]

[0047]
(Example 2)
Synthesis of 4- (N, N-dioctadecylcarbomoyl) benzenecarboxyamidine
A solution of 166 mg of 4-cyanobenzoyl chloride, 522 mg of N, N-dioctadecylamine and 111 mg of triethylamine was stirred at room temperature for 3 hours. Water was added to the reaction solution, followed by extraction with chloroform. The organic layer was washed with dilute alkali and water in that order, dried over anhydrous magnesium sulfate, and the residue concentrated under reduced pressure was subjected to silica gel chromatography. -600 mg of dioctadecyl-4-cyanobenzamide was obtained (yield 92, colorless crystals).
[0048]
Hydrogen chloride gas was introduced into a mixed solvent of ethanol (100 ml) -benzene (150 ml) for 30 minutes under ice-cooling with 1.30 g of N, N-dioctadecyl-4-cyanobenzamide obtained above. The solvent was distilled off under reduced pressure to obtain (4- (ethoxyiminomethyl) phenyl) -N, N-dioctadecylamide hydrochloride. This was dissolved in a mixed solution of chloroform (160 ml) -methanol (80 ml), ammonia gas was introduced for 30 minutes under ice cooling, and the mixture was heated to reflux for 8 hours. The solvent was distilled off under reduced pressure to remove chloroform insolubles from the resulting solid, and chloroform was distilled off under reduced pressure. The residue was subjected to silica gel chromatography, and 910 mg of 4- (N, N-dioctadecylcarbomoyl) benzenecarboxyamidine was obtained from the fraction eluted with 5% methanol-chloroform (yield 68%, colorless crystals). This instrumental analysis data supports the structure of the following formula (6).
[0049]
¹H-nmr (CDCl_Three) Δ (ppm): 7.96 (2H, d, J = 8.0 Hz), 7.35 (2H, d, J = 8.0 Hz), 3.49-3.38 (2H, m), 3 .17-3.06 (2H, m), 1.70-1.01 (64H, m), 0.88 (6H, t, J = 6.4 Hz)
Melting point: 168-169 ° C
[0050]
[Chemical 7]

[0051]
(Example 3)
Liposomes containing the amidine derivative synthesized in Examples 1 and 2 as membrane constituents were prepared as follows.
An amidine derivative (3 μM), dipalmitoylphosphatidylcholine (DPPC) (21 μM) and cholesterol (6 μM) were weighed into a 10 ml eggplant type flask and completely dissolved in 1 ml of chloroform. Chloroform is distilled off under reduced pressure by an evaporator to form a lipid thin film on the inner wall of the flask. Subsequently, 1 ml of 10 mM Tris-HCl buffer containing 0.5 μM calcein was added to the flask, and the mixture was vigorously shaken to obtain a liposome (MLV) dispersion.
[0052]
(Test Example 1)
Measurement of calcein encapsulation rate
The encapsulation rate of calcein in the liposome was determined as follows. 40 μl of liposome suspension diluted 50-fold is added to 2.0 ml of 10 mM Tris-HCl buffer, and the fluorescence intensity is measured (excitation wavelength: 490 nm, fluorescence wavelength: 530 nm). The fluorescence intensity at this time is Ft. Then 10 mM CoCl₂20 μl of an aqueous solution is added to quench the calcein not encapsulated in the liposome, and the fluorescence of calcein encapsulated in the liposome is measured. The fluorescence intensity at this time is defined as Fin. Furthermore, 20 μl of 20% Triton X-100 solution was added to break the liposomes, and all calcein was replaced with Co.²⁺Combined with quenching. The fluorescence intensity at this time is Fq. The retention efficiency of the liposome is calculated by the following formula.
[0053]
Holding efficiency (%) = (Fin−Fq × r) / (Ft−Fq × r) × 100
[0054]
In the formula, r is a value obtained by correcting the volume change of the reaction solution accompanying the addition of the liposome suspension and the drug, and in this experiment, r = (2.0 + 0.04 + 0.02 + 0.02) /2.0=1.04. It is. The results are shown in Table 1.
[0055]
[Table 1]

[0056]
Example 4
Liposomes containing the amidine derivative membrane constituents synthesized in Examples 1 and 2 were prepared as follows.
Weigh 10 μM amidine derivative, 20 μM dilauroylphosphatidylcholine (DLPC), and 20 μM dioleoylphosphatidylethanolamine (DOPE) to make 1 ml of chloroform solution.
[0057]
20 μl of the chloroform solution was placed in a 10 ml eggplant type flask and 1 ml of chloroform was added. Chloroform was distilled off under reduced pressure by an evaporator to form a lipid thin film on the inner wall of the flask. Next, 1 ml of an aqueous solution in which 20 μg of plasmid pcDNA / Amp (Invitrogen) incorporating the β-galactosodase gene was dissolved was added to the flask, and vigorously shaken to obtain DNA-encapsulated liposomes.
[0058]
(Test Example 2)
Cell preparation and transfection
Cells: Cos-1 cells (ATCC No. CRL-1650) purchased from Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd. using Iscove's modified Dulbecco's medium (IMDM) containing 10% fetal calf serum (FCS)₂, 95% O₂Subcultured in an incubator at 37 ° C.
Transfection: Approximately 2 x 10 in a 6-well multiwell plate supplemented with 10% FCS IMDM medium (1 ml)^FourOf Cos-1 cells was added and cell culture was performed. After culturing for about 24 hours, the medium is replaced with fresh medium containing no FCS, and a liposome suspension containing 0.2 μg of DNA is added. After culturing for 16 hours, the medium was replaced with 10% FCS IMDM medium, followed by further culturing for 48 hours. Cells were fixed with formaldehyde, and 5-bromo-4chloro-3-indolyl-β-galactopyranoside (X-gal), which is a substrate of β-galactosidase, was added to identify cells expressing β-galactosidase. The ratio of the developed cells to the whole was measured by image processing. The results are shown in Table 2.
[0059]
[Table 2]

[0060]
(Acute toxicity)
As a result of an acute toxicity test by oral administration using ICR male mice (5 weeks old), LD of the compound of the present invention₅₀All were 320 mg / kg or more, and high safety was confirmed compared with the effectiveness.
[0061]
【The invention's effect】
As described above, novel amidine derivatives are provided by the present invention. As shown in the test examples, it is clear that the drug carrier comprising the amidine derivative of the present invention as a constituent component has higher introduction efficiency into cells than the conventional drug carrier. Because of these characteristics, the drug carrier of the present invention encapsulating a pharmaceutically acceptable pharmacologically active substance, physiologically active substance or diagnostic substance is very effective for therapeutic and diagnostic purposes. .

Claims (13)

下記一般式（１）で示されるアミジン誘導体。

式（１）中、Ａは芳香環であり、Ｒ ¹ 、Ｒ ² 、Ｒ ³ 、Ｒ ⁴ は同一または異なって水素（但し、Ｒ ¹ 、Ｒ ² 、Ｒ ³ 、Ｒ ⁴ がすべて水素の場合は除く）、炭素数８〜２５のアルキル基またはアルケニル基である。Ｘ、Ｙは同一または異なってＯまたはＳであり、ｐ、ｑは同一または異なって０または１、ｌ、ｍ、ｎは同一または異なって０または１から６までの自然数を示す（但し、ｐ＝ｍ＝ｑ＝ｎ＝０であってＲ ^１ またはＲ ^２ 、Ｒ ^３ またはＲ ^４ のそれぞれ一方が水素の場合は除く）。An amidine derivative represented by the following general formula (1).

In the formula (1), A is an aromatic ring, and R ¹ , R ² , R ³ and R ⁴ are the same or different and hydrogen (provided that R ¹ , R ² , R ³ and R ⁴ are all hydrogen) And an alkyl group or an alkenyl group having 8 to 25 carbon atoms. X and Y are the same or different and are O or S, p and q are the same or different and 0 or 1, l, m, n are the same or different and represent a natural number from 0 or 1 to 6 (provided that p = M = q = n = 0, and ^{one of} R ¹ or R ² , R ³ or R ⁴ is hydrogen) . 下記一般式（２）で示されるアミジン誘導体。

式（２）中、Ａは芳香環であり、Ｒ¹、Ｒ²は同一または異なって水素（但し、Ｒ¹、Ｒ²が共に水素の場合は除く）、炭素数８〜２５のアルキル基またはアルケニル基である。ＸはＯまたはＳであり、ｐは０または１、ｌ、ｍは同一または異なって０または１から６までの自然数を示す。An amidine derivative represented by the following general formula (2).

In the formula (2), A is an aromatic ring, and R ¹ and R ² are the same or different and are hydrogen (except when R ¹ and R ² are both hydrogen), an alkyl group having 8 to 25 carbon atoms, or An alkenyl group. X is O or S, p is 0 or 1, l, m are the same or different and represent a natural number from 0 or 1 to 6. 請求項１または請求項２に記載のアミジン誘導体を構成成分とする薬物担体。A drug carrier comprising the amidine derivative according to claim 1 or 2 as a constituent component. 前記の担体の内部に診断および／または治療するための薬物を封入してなる請求項３に記載の薬物担体。The drug carrier according to claim 3, wherein a drug for diagnosis and / or treatment is enclosed in the carrier. 前記の担体の径が０.０２〜２５０μｍの大きさである請求項３乃至請求項４に記載の薬物担体。The drug carrier according to any one of claims 3 to 4, wherein the carrier has a diameter of 0.02 to 250 µm. 前記の担体がリポソームから構成される請求項３乃至請求項５に記載の薬物担体。The drug carrier according to any one of claims 3 to 5, wherein the carrier comprises a liposome . 前記の担体がリン脂質あるいはその誘導体、および／またはリン脂質以外の脂質あるいはその誘導体、および／または安定化剤、および／または酸化防止剤、および／またはその他の表面修飾剤を含有する請求項３乃至請求項６に記載の薬物担体。The said carrier contains phospholipid or its derivative, and / or lipid or its derivative other than phospholipid, and / or a stabilizer, and / or antioxidant, and / or other surface modifier. The drug carrier according to any one of claims 6 to 6. 前記の診断および／または治療するための薬物が、核酸、ポリヌクレオチド、遺伝子およびその類縁体である請求項３乃至請求項７に記載の薬物担体。The drug carrier according to any one of claims 3 to 7, wherein the drug for diagnosis and / or treatment is a nucleic acid, a polynucleotide, a gene, or an analog thereof. 前記の診断および／または治療するための薬物が、抗癌剤、抗生物質、酵素剤、酵素阻害剤、抗酸化剤、脂質取り込み阻害剤、ホルモン剤、抗炎症剤、ステロイド剤，血管拡張剤、アンジオテンシン変換酵素阻害剤、アンジオテンシン受容体拮抗剤、平滑筋細胞の増殖・遊走阻害剤、血小板凝集阻害剤、抗凝固剤、ケミカルメデイエーターの遊離抑制剤、血管内皮細胞の増殖または抑制剤、アルドース還元酵素阻害剤、メサンギウム細胞増殖阻害剤、リポキシゲナーゼ阻害剤、免疫抑制剤、免疫賦活剤、抗ウイルス剤、メイラード反応抑制剤、アミロイドーシス阻害剤、ＮＯＳ阻害剤、ＡＧＥｓ阻害剤あるいはラジカルスカベンチャーである請求項３乃至請求項７に記載の薬物担体。The aforementioned drug for diagnosis and / or treatment is an anticancer agent, antibiotic, enzyme agent, enzyme inhibitor, antioxidant, lipid uptake inhibitor, hormone agent, anti-inflammatory agent, steroid agent, vasodilator, angiotensin conversion Enzyme inhibitors, angiotensin receptor antagonists, smooth muscle cell proliferation / migration inhibitors, platelet aggregation inhibitors, anticoagulants, chemical mediator release inhibitors, vascular endothelial cell proliferation or inhibitors, aldose reductase inhibition 4. An agent, a mesangial cell growth inhibitor, a lipoxygenase inhibitor, an immunosuppressant, an immunostimulator, an antiviral agent, a Maillard reaction inhibitor, an amyloidosis inhibitor, a NOS inhibitor, an AGEs inhibitor or a radical scavenger. The drug carrier according to claim 7. 前記の診断および／または治療するための薬物が、グリコサミノグリカンおよびその誘導体である請求項３乃至請求項７に記載の薬物担体。The drug carrier according to any one of claims 3 to 7, wherein the drug for diagnosis and / or treatment is glycosaminoglycan and a derivative thereof. 前記の診断および／または治療するための薬物が、オリゴおよび／または多糖、およびそれらの誘導体である請求項３乃至請求項７に記載の薬物担体。8. The drug carrier according to claim 3, wherein the drug for diagnosis and / or treatment is an oligo and / or polysaccharide and a derivative thereof. 前記の診断および／または治療するための薬物が、タンパク質またはペプチドである請求項３乃至請求項７に記載の薬物担体。The drug carrier according to any one of claims 3 to 7, wherein the drug for diagnosis and / or treatment is a protein or a peptide. 前記の診断および／または治療するための薬物が、Ｘ線造影剤、放射性同位元素標識核医学診断薬、核磁気共鳴診断用診断薬等の各種体内診断薬である請求項３乃至請求項７に記載の薬物担体。The medicine for diagnosis and / or treatment is an in-vivo diagnostic agent such as an X-ray contrast agent, a radioisotope-labeled nuclear medicine diagnostic agent, or a diagnostic agent for nuclear magnetic resonance diagnosis. The drug carrier as described.