JP3765983B2 - Lactobacillus strains that can prevent diarrhea caused by pathogenic bacteria and rotavirus - Google Patents

Description

【０００１】
本発明はラクトバチルス属の新規微生物に関し、これらの微生物は病原菌およびロタウイルスによりひき起こされる下痢の予防に有用である。特に本発明は摂取できる支持物質の製造のためにこの微生物の使用およびこの微生物を含む組成物に関する。
【０００２】
主要代謝成分として乳酸を産生する微生物は古くから知られている。これらの細菌はそれぞれ乳または乳加工工場に、生きている植物や腐朽植物に、またヒトおよび動物の腸に見出すことができる。「乳酸菌」と要約されるこれらの微生物はむしろ不均質性群を表わし、例えばラクトコッカス、ラクトバチルス、ストレプトコッカス、ビフィドバクテリウム、ペディオコッカス属などを含む。
【０００３】
乳酸菌は低ｐＨの利益を受ける食品の保存に、および腐敗菌の生育を阻害するその発酵活性中産生する発酵産物の作用に対し発酵剤として利用されてきた。このため、乳酸菌はチーズ、ヨーグルトおよび乳からの他の発酵乳製品のような各種の異る食品の製造に使用されている。
【０００４】
ごく最近乳酸菌は、ある種の菌株が摂取によりヒトおよび動物に有用な性質を示すことが分かったことで多大の注意を引いた。特にラクトバチルスまたはビフィドバクテリウム属の特定菌株は腸粘膜にコロニーを作り、かつヒトおよび動物の生活状態の維持に役立ちうることが分かった。
【０００５】
この点で、ヨーロッパ特許０７６８３７５号明細書は腸フローラに移植できかつ腸細胞に付着できるビフィドバクテリウム属の特定菌株を開示する。これらのビフィズス菌は免疫調節を助け、かつ病原菌が腸細胞に付着することを競合的に排除することができ、したがって個人の健康の維持に役立つことが報告されている。
【０００６】
最近の数年間、プロビオチック剤として乳酸菌の潜在的使用に対し研究が集中した。プロビオチックは、腸内の天然ミクロフローラを保持することにより個人の健康を増進する生育可能な微生物製剤であると考えられる。微生物製剤はその有効な微生物およびその作用様式が既知である場合、プロビオチックとして通常許容できる。プロビオチックは腸粘膜に付着し、腸管にコロニーを形成し、同様にその上に有害な微生物の付着を防止すると考えられる。これらの作用に対する決定的必要条件は、乳酸菌が適当かつ生育しうる形で腸粘膜に到達しなければならず、かつ胃腸管の上部で、特に胃で普通の低ｐＨの影響により破壊されないことにある。
【０００７】
この点で、ＷＯ９７／０００７８号明細書はこのようなプロビオチックとしてラクトバチルスＧＧ（ＡＴＣＣ ５３１０３）と呼ばれる特定の菌株を開示する。本微生物は食品に由来する過敏症反応を予防または治療する方法において特に使用され、この方法ではペプシンおよび／またはトリプシンにより加水分解処理された食品物質を受容者に投与するものである。選択されたラクトバチルス菌株は付着性およびコロニー形成性を示し、かつプロテアーゼ酵素系を示すとして記載され、投与される食品に含有されるタン白物質は特定のラクトバチルス菌株が分泌するプロテアーゼによりさらに加水分解される。この文献に記載の方法は、結局腸によりもはやアレルギー物質の実質量を示さないタン白物質を吸収することになる。
【０００８】
さらに、ヨーロッパ特許０５７７９０３号明細書にはヘリオバクター・ピロリの作用と関連する潰瘍の治療または予防処置用に意図された支持物質の製造に、潰瘍の発現に認知された原因であるヘリオバクター・ピロリに取って代る能力を有するような乳酸菌の使用について言及されている。
【０００９】
介在するＷＯ９９／２９８３３号明細書には、確定した大きさの３つのプラスミドをもつ特別の菌株、ＬＭＧＰ１７８０６が記載される。この菌株はサルモネラ・ティフィムリウムによる侵入から腸細胞を防止できることを記載する。
【００１０】
乳酸菌の特定菌株が有し得る有用な性質を認識して、ヒトおよび／または動物の生活状態に有利である付加的乳酸菌菌株に対する願望が業界にある。
従って、本発明の課題はヒトおよび／または動物に有利な新しい性質を示す付加的細菌菌株を供することである。
【００１１】
上記問題は新規微生物、すなわち下痢を起こす病原菌による腸のコロニー形成を予防しかつロタウイルスによる腸上皮細胞の感染を予防しうる特性を有するラクトバチルス属に属する乳酸菌を供することにより解決された。好ましい態様によれば、このラクトバチルス菌株は宿主生物の腸粘膜に付着することができ、そしてそこに本質的にコロニーを形成することができるものである。
【００１２】
別の好ましい態様によれば、このラクトバチルス菌株は０．４％までの胆汁酸塩の存在下で生育することができるので、容易に胃腸管を通過でき、本質的に活性のままでとどまることができる。
【００１３】
他の好ましい態様によれば、本乳酸菌はラクトバチルス・ラム、サスまたはラクチトバチルス・パラカゼイ、好ましくはラクトバチルス・パラカゼイから選択され、一層好ましくはラクトバチルス・パラカゼイＣＮＣＭ Ｉ−２１１６である。
【００１４】
本発明の微生物は次の性質を有することが分った。即ち、グラム陽性、カタラーゼ陰性、ＮＨ₃形成アルギニン陰性およびＣＯ₂産生陰性である。これらはＬ(＋)乳酸を産生し、約０．４％までの濃度の胆汁酸塩の存在下で生育でき、かつロタウイルスによる上皮細胞の感染を本質的に予防できる。
【００１５】
新規微生物は各種摂取可能な支持物質、例えば乳、ヨーグルト、カード、発酵乳、乳をベースとする発酵製品、発酵穀類をベースとする製品、乳をベースとする粉末、乳児用調製粉乳の製造に使用でき、約１０⁵ｃｆｕ／ｇ〜約１０¹¹ｃｆｕ／ｇの量で支持物質に含ませることができる。本発明において、各語ｃｆｕは「コロニー形成単位」を示し、寒天プレート上の微生物数により示される細菌細胞数として規定される。
本発明はまた上記特性を有する少なくとも１つのラクトバチルス菌株を含有する食品または医薬組成物を供する。
【００１６】
本発明の食品組成物の製造に対し、本発明による少なくとも１つのラクトバチルス菌株は適当な支持物質に約１０⁵ｃｆｕ／ｇ〜約１０¹¹ｃｆｕ／ｇ、好ましくは約１０⁶ｃｆｕ／ｇ〜約１０¹⁰ｃｆｕ／ｇ、一層好ましくは約１０⁷ｃｆｕ／ｇ〜約１０⁹ｃｆｕ／ｇの量で添加される。
【００１７】
医薬製剤の場合、製品は錠剤、細菌液体サスペンジョン、乾燥経口サプリメント、含水経口サプリメント、乾燥経管栄養または含水経管栄養などの形で製造することができ、そこに添加されるラクトバチルス菌株量は１０¹²ｃｆｕ／ｇまでの範囲、好ましくは約１０⁷ｃｆｕ／ｇ〜約１０¹¹ｃｆｕ／ｇ、一層好ましくは約１０⁷ｃｆｕ／ｇ〜約１０¹⁰ｃｆｕ／ｇである。
【００１８】
固体の腸における新規微生物の活性は当然用量依存である。すなわち、上記食品物質または医薬組成物を摂取することにより新規微生物の量が多い程、微生物の保護活性および／または治療活性は高い。新規微生物は人類および動物には有害でなくかつ最終的に乳児の***物から単離されるので、本質的に個体の腸の高割合が新規微生物によりコロニー形成できるようにその高量を添加できる。
【００１９】
図中、
図１は細菌菌株によるロタウイルス保護性を評価するために選別する細胞培養の概略図を示す。
図２は異る生育培地のＬ．カゼイ菌株ＣＮＣＭ Ｉ−２１１６（ＳＴ１１と呼ぶ）の酸性化を示す。
図３は１０℃で３０日間測定したＬ．カゼイ菌株ＳＴ１１の生存割合を示す。
図４はＳＴ１１の連続稀釈により細胞を培養した後骨髄由来のマウス付着細胞の１Ｌ−１２およびＩＬ−１０のｍＲＮＡパターンを示す。
図５はＩＬ−４産生が減少したことによるＴｈ２分化の結果を示す。
図６は培養ＳＴ１１細胞を、病原性大腸菌が上皮細胞に付着するのを防止する試験で使用された細胞培養実験結果の概畧を示す。
図７はＳＴ１１培養物の上澄液を、病原性大腸菌が上皮細胞に付着するのを阻止する試験で使用する細胞培養実験結果の概畧を示す。
図８は培養ＳＴ１１細胞を、サルモネラ・チフィムリウムが上皮細胞中に侵入するのを阻止する試験で使用する、細胞培養実験結果の概畧を示す。
図９はＳＴ１１培養物の上澄液を、サルモネラ・チフィムリウムが上皮細胞中に侵入するのを阻止する試験で使用する、細胞培養実験結果の概畧を示す。
【００２０】
本発明に導く広汎な研究中、発明者らは乳児***物を調査し、そこから多種の異る細菌菌株を単離した。これらの菌株は続いてロタウイルスおよび下痢を引き起こすことが既知の病原菌による上皮細胞の感染を防止するその能力を試験した。
【００２１】
ラクトバチルス、ラクトコッカス、ストレプトコッカスを含む数種の菌属の阻害活性を選別した。試験は本質的にヒトのウイルス性下痢の主要な病原体を表わす３つのロタウイルスセロタイプ（セロタイプＧ１、Ｇ３およびＧ４）および感染個体に下痢を起こす代表的病原性微生物として病原性大腸菌およびサルモネラ・チフィムリウムにより行なった。
【００２２】
各種乳酸菌はＭＲＳ、Ｈｕｇｏ−ＪａｇｏまたはＭ１７培地のような適当な培地でこれらの最適生育温度に相当する約３０°〜４０℃の温度で生育させた。定常生育に到達後、細菌は遠心分離して集め、生理的食塩水に再懸濁した。異る試験別に細菌細胞は冷凍貯蔵した（−２０℃）。
【００２３】
ロタウイルス試験
各種ロタウイルスのストックを集密的細胞単層の感染により調製した。ロタウイルスは感染前に培養した。細胞は２０の組織培養感染用量により感染させた。抗−ロタウイルス特性を評価するために、２つの異るプロトコルを適用した。１つのプロトコルによれば各種細菌菌株はロタウイルスとの直接の相互作用を試験し、一方第２プロトコルでは細菌は細胞性ロタウイルス受容体と相互作用する菌株を選別した。第１プロトコルは各細菌サスペンジョンを異るロタウイルス菌株と接触させ、ついで適当な培地で培養することを含んだ。その後、ウイルス−細菌混合物はヒト未分化結腸腺腫細胞ＨＴ−２９の細胞単層に適用し、そして培養を続けた。次にウイルス複製を試験した。第２プロトコルは先ず各細菌サスペンジョンをヒト未分化結腸腺腫細胞ＨＴ−２９の細胞単層と一緒に培養し、次にウイルスを添加するものである。連続培養後ウイルス複製を試験した。ロタウイルスの複製は感染細胞のロタウイルスタン白の組織−免疫学染色により容易に評価できる。ロタウイルスを単独接種した細胞と比較して、ロタウイルス＋指示細菌を接種した細胞カルチャーで感染細胞数が９０％まで減少した場合、ロタウイルスの阻害効果は供試細菌によるものとされた。
【００２４】
最初に単離した合計２６０種の細菌菌株のうち単に９種が本質的にロタウイルス複製を阻害することが分った。異る細菌はラクトバチルス属亜種ラムノサスまたはパラカゼイに属することが確かめられた。ブタペスト條約により寄託され、寄託番号ＮＣＣ２４６１（Ｉ−２１１６）を受けたラクトバチルス・カゼイＳＴ１１と命名された１菌株は、ロタウイルスによるヒト細胞の感染防止に非常に有効であることが分った。さらに、この特別の菌株は各種培地で酸性化を示すことから、すぐれた生育性を示す。本菌株はまた約１０℃の低温で貯蔵中生存割合に関しすぐれた性能を示し、これにより冷蔵条件で貯蔵される食品または医薬組成物に含まれるすぐれた候補対象になる。
【００２５】
抗−病原菌試験
抗−細菌性を評価するために、次のアプローチを選択した。１プロトコルによれば、本発明の培養ラクトバチルス菌株は腸細胞に下痢を起こす病原菌の付着または腸細胞中へのその侵入を防止するその能力について試験した。このため、腸細胞を病原菌および本発明の培養ラクトバチルス菌株と接触させ、付着または侵入の各割合を評価した。第２プロトコルによれば、本発明のラクトバチルス菌株の細胞培養物の上澄を病原性微生物と一緒に腸細胞に添加し、付着または侵入のそれぞれの割合を評価した。実験中、培養したラクトバチルスおよび上澄は腸細胞に付着および細胞中への侵入の双方の防止に非常に有効であることの証拠を示すことができ、これは新規微生物が分泌する代謝化合物が病原菌に関し抗−下痢活性に寄与しているらしいことを示している。
【００２６】
上記発見の他に、本菌株は意外なことに異る免疫メディエーターの合成にインパクトを有することで抗−アレルギー性も示すことも分った。
【００２７】
体液性免疫応答およびアレルギー反応はタイプ２フェノタイプ（Ｔｈ２）を有するＣＤ４⁺Ｔ細胞により媒介されることが一般に認められる。Ｔｈ２−細胞は高レベルのインターロイキン４（ＩＬ−４）、ＩｇＥ（アレルギー反応に含まれる主要な抗体クラスである）の分泌に必要なサイトカインを産生することで特徴づけられる。
【００２８】
Ｔｈ２細胞の分化はＩＦＮ−ｒ、ＣＤ４⁺Ｔ細胞の相互に排他的のＴＨ１サブセットから生ずる特別のサイトカインにより損なわれる。このＴＨ１細胞は順次インターロイキン１２（ＩＬ−１２）により強く誘発される。これと対照的にＩＬ−１０、別のサイトカインはＴＨ１細胞の増殖に強い抑制インパクトを有することが分ったから、免疫−抑制機作に役割を演ずると思われる。
【００２９】
要約すれば、ＩＬ−１２およびＩＬ−１０の双方はＴｈ１サブセットの発生に影響を与えることにより、ＣＤ４⁺Ｔ細胞の発生に強い調節効果を有する。ＩＬ−１２はＴｈ１分化の誘発に対し鍵となる調整サイトカインであるから、Ｔｈ２応答の発生を抑止する。従って、Ｔｈ２細胞を抑止する主な道は補助細胞によるＩＬ−１２合成の刺激に見られる。
【００３０】
ＬＰＳのようなグラム陰性菌のいくつかの成分はマクロファージおよび樹枝状細胞のような付着細胞に高レベルのＩＬ−１２を誘発することは周知である。一貫して、グラム陰性菌はＣＤ４⁺Ｔ細胞の分化をＴｈ１フェノタイプの方向に強くかたよらせることができることが分った。
【００３１】
本発明のラクトバチルス菌株の例として、微生物ＳＴ１１はＣＤ４⁺Ｔ細胞の分化の調節に含まれるサイトカインの誘導の潜在的な役割を試験した。特に、Ｔｈ２分化中のＣＤ４⁺Ｔ細胞のフェノタイプに及ぼすＳＴ１１の効果が研究された。
【００３２】
この点で骨髄由来のマウス付着細胞のこれら２つの調節サイトカインをコードするｍＲＮＡの合成を誘導するＳＴ１１の能力は４つの他のラクトバチルス菌株および対照のグラム陰性菌（大腸菌Ｋ１２）と比較した。ｍＲＮＡは１０⁹〜１０⁷ｃｆｕ／ｍｌの範囲の細菌の連続稀釈した細胞を６時間培養後、半定量的ＲＴ−ＰＣＲにより測定した。
【００３３】
すべてのラクトバチルス菌株は或る程度までＩＬ−１２ｍＲＮＡの転写を誘導できるが、ＳＴ１１は最強の誘導物質であることが分った。強いＰＣＲシグナルとして最低細菌用量でさえ検出できるからである。実際に、ＩＬ−１２ｍＲＮＡ転写を誘導するＳＴ１１の能力は大腸菌と同じくらい強かった。ＩＬ−１０ｍＲＮＡの誘導はＩＬ−１２ｍＲＮＡより一般に弱く、より高い細菌用量でのみシグナルは検出できた。それでもやはりＳＴ１１は他のラクトバチルスおよび大腸菌対照と比較してＩＬ−１０ｍＲＮＡの最強の誘導物質であった。
【００３４】
すなわち、ＳＴ１１はＣＤ４⁺Ｔ細胞の分化に含まれる免疫−調節サイトカインの誘導に有効であると思われる。ＩＬ−１２を誘導するその強い能力はＴｈ２応答を阻害する候補であり、その測定可能なＩＬ−１０の誘導は炎症性応答を防止できる。
【００３５】
上記知見の他に、ＳＴ１１がＴｈ２分化中のＣＤ４⁺Ｔ細胞に対する阻害効果およびＴｈ１機能に対するプラス効果を示すかどうかも測定された。十分に樹立した分化培養系が使用され、そこで前駆体ＣＤ４⁺Ｔ細胞はポリクローナル的に活性化させかつ培養培地に供された共通刺激（ｃｏ−ｓｔｉｍｕｌｉ）の型により、Ｔｈ１またはＴｈ２分化を経るように調節させた。Ｔｈ１／Ｔｈ２分化は７日の最初の培養中誘発され、その後細胞は培地単独を有する第２培養で２日間再刺激され、そして特異的フェノタイプ（Ｔｈ１またはＴｈ２）の獲得は上澄で生産されたサイトカインの型（ＩＦＮ−ｒ対ＩＬ−４）を測定することにより評価した。
【００３６】
ＢＡＬＢ／ｃバックグラウンドのマウスからの前駆体ＣＤ４⁺Ｔ細胞は中性条件下（１ｒｙ培養で培地単独）で活性化後優勢なＴｈ２フェノタイプ（２ｒｙカルチャー上澄の高ＩＬ−４、低ＩＦＮ−ｒ）に優先的に分化することが知られる。このフェノタイプは１ｒｙカルチャーのＩＬ−４にブロッキング性モノクロナール抗体を添加すると完全にＴｈ１パターン（高ＩＦＮ−ｒ、低ＩＬ−４）に復帰できた。
【００３７】
Ｔｈ２阻害に対しＳＴ１１の潜在的な役割を調査するために、ＢＡＬＢ／ｃマウスからの精製前駆体ＣＤ４⁺Ｔ細胞は１ｒｙ培養中補助細胞として骨髄付着細胞の存在下で活性化させた。これらの細胞は培地単独で、または１ｍｇ／ｍｌ ＬＰＳ、または１０⁸ｃｆｕ／ｍｌ ＳＴ１１、または１０⁸ｃｆｕ／ｍｌの別のラクトバチルスの存在で共同培養した。この後細胞を洗浄し、ＣＤ４⁺Ｔ細胞はもう一度精製し、そして培地単独で２ｒｙ培養で再刺激させた。分化ＣＤ４⁺Ｔ細胞により生成されたサイトカインは２日後測定した。予期されたように、培地単独の存在下で分化した細胞は優勢なＴｈ２フェノタイプを示した。１ｒｙ培養にＳＴ１１を添加すると、ＩＬ−４の生産が８倍の減少となるように、Ｔｈ２分化の結果を調節した。この阻害はＬＰＳの存在下で分化した細胞から誘導された培養で観察されたものと同様の大きさのものであった。対照的に、他のラクトバチルス菌株はＩＬ−４量に測定可能なインパクトを有しなかった。興味あることに、ＩＦＮ−ｒ量は１ｒｙ培養でＳＴ１１の添加により増加しなかった。
【００３８】
要約すると、ＳＴ１１はＴｈ２分化を経るＣＤ４⁺Ｔ細胞によるＩＬ−４産生を特異的に損なったが、ＩＦＮ−ｒ分泌を有意に増加しなかった。ＳＴ１１がＩＦＮ−ｒ生産を増加しない事実はＩＬ−１０を誘導するその能力によるが、その結果抗−Ｔｈ２活性にも拘らず低炎症性インパクトを保持できる。
結果として、ＳＴ１１はすぐれた抗−Ｔｈ２プロフィルを有するラクトバチルス菌株であり、このプロフィルにより抗−アレルギー、プロビオチック活性を有する細菌としてその用途のすぐれた候補たらしめていることが分った。
【００３９】
本発明は例としてここに記載する。
培地および溶液
ＭＲＳ（ディフコ）、
Ｈｕｇｏ−Ｊａｇｏ（トリプトン ディフコ ３０ｇ／ｌ、酵母抽出物 ディフコ １０ｇ／ｌ、ラクトース ディフコ ５ｇ／ｌ、ＫＨ₂ＰＯ₄ ５ｇ／ｌ、牛肉抽出物 ディフコ ２ｇ／ｌ、寒天 ディフコ ２ｇ／ｌ）、
Ｍ１７（ディフコ）、
Ｍ１９９（セロメッド）、
リンゲル液（オキソイド）、
ＰＢＳ（ＮａＣｌ ８ｇ／ｌ，ＫＣｌ ０．２ｇ／ｌ，Ｎａ₂ＨＰＯ₄ １．１５ｇ／ｌ，ＫＨ₂ＰＯ₄ ０．２ｇ／ｌ）、
トリプトース ホスフェート ブロス（フロー）トリプシン−ＥＤＴＡ溶液（セロメッド）。
ヒトロタウイルス Ｗａ（Ｇ１ セロタイプ）およびシミアン ロタウイルスＳＡ−１１（Ｇ３ セロタイプ）は、Ｐ．Ａ．オフィット、フィラデルフィア小児病院、米国から得た。ＤＳ−ＩｘＲＲＶ リアソルタント ウイルスはＡ．カピキアン、ＮＩＨ ベセスダ、米国から得た。セロタイプ４ヒト ロタウイルス ホチはＰ．バックマン、ミュンヘン大学、ドイツから得た。大腸菌ＤＡＥＣ Ｃ１８４５はワシントン大学、シアトルから得、かつ大腸菌ＪＰＮ １５はメリーランド大（米国）のワクチン開発センターから得た。サルモネラ・チフィムリウム菌株ＳＬ１３４４はスタンフォード大の微生物学部、米国から得た。
【００４０】
例１
乳児***物から乳酸菌の単離
新しい***物を生後１５〜２７日の健康な乳児１６人のおしめから集めた。１ｇの新しい***物は実験室に輸送するため嫌気条件下に置き、微生物分析は試料収集後２時間内にリンゲル液に連続稀釈し、選択培地に置くことにより行なった。ＭＲＳ寒天＋抗生物質（ホスフォマイシン ８０μｇ／ｍｌ、スルファメトキサゾール ９３μｇ／ｍｌ、トリメトプライム ５μｇ／ｍｌ）は３７℃、４８時間培養し、乳酸菌を単離するために使用した。コロニーをランダムに採取し、精製した。生理学的および遺伝的特徴づけを単離物について行なった。
【００４１】
例２
抗−ロタウイルス活性に対し細胞培養の菌株の試験
ラクトバチルス、ラクトコッカス、ストレプトコッカス属を含む数種の乳酸菌を選択し、細胞培養阻害試験で抗−ロタウイルス活性を示したものに対し試験した。ラクトコッカス属では２つの亜種（Ｌｃ．ラクチス亜種ラクチスおよびクレモリス）から成る単一種（Ｌｃ．ラクチス）により表わした。合計３０菌株を試験した。ストレプトコッカス属では４５菌株で１種（Ｓ．サーモフィラス）を表わした。ロイコノストックおよびプロピオニバクテリウム属では単一種（６菌株）を表わしたが、エンテロコッカスおよびスタフィロコッカス属では各２種で合計１７菌株を表わした。
全体で２６０個の菌株についてロタウイルス阻害活性を試験した。
第１プロトコル
３０μｌの細菌サスペンジョン（平均３×１０⁶細菌を含有）は１０％トリプトース ホスフェート ブロス（フロー）および５％トリプシン−ＥＤＴＡ溶液（セロメッド）（ＨＴ−２９細胞の場合１：４に稀釈）および補充Ｍ１９９培地では１００μｌウイルスを補充した７０μｌ Ｍ１９９培地と混合した。ウイルス−細菌混合物は４℃で１時間および３７℃で１時間培養した。９６の穴を有する微量定量プレートの集密的細胞単層として生育するヒト未分化結腸腺腫細胞ＨＴ−２９の細胞はリン酸塩緩衝生理的食塩水（ＰＢＳ、ｐＨ７．２）で３回洗浄した。ウイルス−細菌混合物は細胞に適用し、微量定量プレートはＣＯ₂インキュベータ（ヘレウス）で１８時間培養した。ウイルスの複製は下記のように試験した。
第２プロトコル
３０μｌの細菌サスペンジョン（前記）は１０％ トリプトース ホスフェート ブロス（フロー）および５％ トリプシン−ＥＤＴＡ溶液（セロメッド）（ＨＴ−２９細胞の場合１：４に稀釈）を補充した７０μｌ Ｍ１９９培地と混合し、そして微量定量プレートの細胞に直接適用した。３７℃で１時間培養後、補充したＭ１９９培地の１００μｌのウイルスを微量定量プレートの細胞に添加した。培養はＣＯ₂インキュベータ（ヘレウス）で１８時間継続した。ウイルスの複製は下記のように試験した。
ロタウイルス複製は下記のように感染細胞のロタウイルス タン白の組織−免疫染色により評価した。
感染１日後、細胞培養培地は微量定量プレートから捨て、細胞は無水エタノールで１０分固定した。エタノールは捨て、プレートは３回ＰＢＳ緩衝液で洗浄した。次にウサギに産生し（ローザンヌのＩＳＲＥＣ大学から得た）、ＰＢＳに１：２０００に稀釈した５０μｌの抗−ロタウイルス血清（主としてＶＰ６ タン白に向けられる）を各穴に添加し、穴の乾燥を防止するためにカバースリップをかぶせて３７℃で１時間培養した。抗血清はその後捨て、プレートはＰＢＳにより３回洗浄した。山羊に産生しかつペルオキシダーゼに結合した（ＧＡＲ−ＩｇＧ−ＰＯ、ノルディック）５０μｌの抗−ウサギ免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）抗血清はＰＢＳに１：５００に稀釈して各穴に添加し、そしてプレートは３７℃で１時間培養した。血清は捨て、プレートはもう一度ＰＢＳにより３回洗浄した。次に１００μｌの次の基質混合物を各穴に添加した：１０ｍｌの０．０５Ｍトリス−塩酸塩（ｐＨ７．８）、１ｍｌのＨ₂Ｏ₂（３０％容、Ｈ₂Ｏに１：６００に稀釈、メルク）および２００μｌの３−アミノ−９−エチルカルバゾール（−８０℃で２００μｌ試料で貯蔵した０．１ｇ／１０ｍｌ エタノール、Ａ−５７５４、シグマ）。プレートは室温で少なくとも３０分インキュベートした。基質は捨て、穴は２００μｌのＨ₂Ｏを満たして反応を停止させた。感染細胞病巣は倒立顕微鏡（ダイアバート、レイツ）により計数した。
ごく少数の細菌菌株がロタウイルスと相互作用した。初めに選択した２６０個の細菌細胞のうち単に９個のみが少なくとも１つのプロトコルのロタウイルス複製を阻害した。ラクトバチルス・パラカゼイＮＣＣ２４６１（ＳＴ１１）はセロタイプ１ロタウイルス、セロタイプ３ロタウイルスＳＡ１１およびセロタイプ４ロタウイルスホチに対し非常に高い活性を示した。
【００４２】
例３
Ｃａｃｏ−２細胞の培養
（病原性）細菌阻害試験では、細胞系Ｃａｃｏ−２を腸のモデルとして使用した。この細胞系は例えば、ポーラリゼーション、腸酵素の発現、特別構造のポリペプチドの生産のような腸細胞に対し特有の特徴を提示する。
この細胞は３つの異る支持体、すなわち生育および増殖用にプラスチック皿で（２５ｃｍ²、コーニング）、付着試験では脱脂および滅菌した６個の穴を有するガラスプレート（２２×２２ｍｍ、コーニング）および阻害試験では２４個の穴を有するガラスプレート（コーニング）で生育させた。
培養２日後に培地（ＤＭＥＭ）を毎日変えた。使用前培地は１００Ｕ／ｍｌペニシリン／ストレプトマイシン、１μｇ／ｍｌ アンホテリンおよび５６°で３０分不活性化した２０％ＦＣＳを補充した。培養は９０％空気と１０％ＣＯ₂を含む大気で３７℃で行なった。細胞は６日毎に分離した。細胞は０．２５％トリプシンおよび３ｍＭＥＤＴＡを含むｐＨ７．２のＰＢＳで処理して穴の壁から分離した。トリプシンの効果を中和するために、等容積のＦＣＳを生成細胞サスペンジョンに添加し、混合物は遠心分離し（１０００ｒｐｍで１０分）、ペレットは再び培養物に入れた。約３．５×１０⁵細胞を新しい培養びんに移し、集密的細胞単層を得るまで培養した。
【００４３】
例４
細菌の培養
ＳＴ１１：
細菌菌株は１５％グリセロールを含有するＭＲＳ培地に−２０℃で貯蔵した。菌株はＭＲＳに嫌気条件下で成育し、阻害試験に使用する前２４時間の間隔で新しい培地に２回移した。この試験では、２×１０⁹ｃｆｕ／ｍｌの濃度を使用した。
上澄は２０，０００ｒｐｍで１時間遠心分離して集め、得た上澄はその後細菌の存在を点検した。
大腸菌：
２つの大腸菌菌株、大腸菌ＤＡＥＣ Ｃ１８４５（拡散付着大腸菌）および大腸菌ＪＰＮ１５（ＥＰＥＣ、エンテロ・パソジェニック大腸菌）を使用した。
解凍後、最初の継代培養はＣＦＡ−ミュラーヒントン寒天培地で行ない、これは細菌による付着率を表現するのに適する。
各実験前に細菌細胞は３７℃で培養し、新しい培地への移送は各２４時間後に２回行なう。ＪＰＮ１５はアンピシリン耐性遺伝子を有するので、この抗生物質は生育中の選択に使用した。
サルモネラ：
サルモネラ・チフィムリウム菌株ＳＬ１３４４を実験に使用し、これはＬＢ培地に使用前生育した。
【００４４】
例５
大腸菌の阻害試験
新しい培地に第２継代培養後、病原菌菌株はＬＢ培地で１０μＣｉ／ｍｌのＣ¹⁴−アセテートを使用して放射性同位元素により標識した。この培地で菌株の培養は３７℃で１８時間行なった。
その後細菌サスペンジョンは遠心分離（１０４１ｇ、１５分）して、残留するＣ¹⁴−アセテートを含む上澄を除いた。ペレットを懸濁し、ＰＢＳで洗浄し、ついで細胞を１％無菌マンノースｍｌ当たり約１０⁸細胞の濃度で懸濁させた。マンノースは特別の付着を示さないことが分っている。
異る病原菌株（大腸菌）をＣａｃｏ−２細胞（３７℃、１０％ＣＯ₂、９０％空気）の単層と３時間接触させた。同じ実験は上澄（２０，０００ｒｐｍで４０分遠心分離して得た）を使用して行なった。
対照として病原菌はＳＴ１１または培養上澄のそれぞれを同時添加せずにＣａｃｏ−２単層と接触させた。
３時間の培養後、培地を変え、単層はＰＢＳで３回洗浄した。各洗浄工程は本質的にすべての非特異的付着を除くためにＰＢＳ溶液の２０×撹拌を含んだ。細胞はその後１ｍｌの炭酸ナトリウムを添加しそして３７℃で４０分培養して溶解した。均質化後、試料（２５０ｍｌ）は５ｍｌのシンチレーション流体（ヒオニック−フルオル パッカード）で稀釈し、計数した（パッカード２０００）。病原性細胞のＣａｃｏ−２細胞への付着率％は１００％（付着、又は例６の侵入）にセットした対照に対し計算した。
【００４５】
例６
サルモネラに対する阻害試験
サルモネラは表皮細胞に侵入しかつそこで増殖する細菌である。ＳＴ１１の阻害活性を測定するために、サルモネラ・チフィムリウム菌株ＳＬ１３４４を上記のように¹⁴Ｃ−アセテート含有培地で培養し、例５記載の実験を行なった。
培養後、Ｃａｃｏ−２細胞はＰＢＳで洗浄してすべての非付着細胞を除いた。その後ゲンタマイシン（２０μｇ／ｍｌ）を含有する培地を添加し、培養は３７℃で１時間継続した。ゲンタマイシンはすべての菌体外微生物が殺されるように腸細胞に入りこまない抗生物質であり、一方腸細胞に既に侵入したサルモネラは生き残こる。ＰＢＳにより２回細胞を洗浄後、細胞は無菌蒸留水を添加して溶解し、放射能は例４に記載のように測定した。
例５および６の結果は図６〜９に示す。培養ＳＴ１１細胞および培養上澄は下痢を起こす病原性微生物による腸細胞への付着および細胞中への侵入防止に非常に有効であった。
【００４６】
例７
ＳＴ１１の性質
ＳＴ１１は人工胃液中で培養した。人工胃液はペプシン（３ｇ／ｌ）を無菌生理的食塩水（０．５％ ｗ／ｖ）に懸濁し、ｐＨをそれぞれ２．０および３に濃ＨＣｌにより調整して製造した。ＳＴ１１は上記培地で量を変えて生育させ、微生物の耐性を測定した。
結果は表１に要約する。

ＳＴ１１は乳酸菌の属で開示した方法により規定された次の性質を有する（Ｅｄ．Ｂ．Ｊ．Ｂ．Ｗｏｏｄ ａｎｄ Ｗ．Ｈ．Ｈｏｌｚａｐｆｅｌ，Ｂｌａｃｋｉｅ Ａ＆Ｐ）。
−グラム陽性
−カタラーゼ陰性
−ＮＨ₃生成アルギニン陰性
−ＣＯ₂産生陰性
−Ｌ（＋）乳酸の産生
−約０．４％までの濃度の胆汁酸塩の存在で生育。
【００４７】
例８
各種条件下のＳＴ１１の生育
ＳＴ１１はシュクロース（０，０．５，１または２％）または大豆ペプトン（０．５％）またはグルコース（０．５％）を補充したトマトをベースとする培地（蒸留水に水和した４％トマト粉末）に異る期間３７℃で培養した。結果は図２に示す。
ＳＴ１１はさらに米粉（３％）、小麦粉（２％）およびシュクロース（３％）から成る培地に２．５％の量で添加し、４．４のｐＨに達するまで３７℃で培養した。冷却後、製品はビタミンＣを添加または添加せずに包装し、１０℃で貯蔵した。
【００４８】
例９
マウス付着細胞のＳＴ１１による１Ｌ−１２および１Ｌ１０−ｍＲＮＡの合成の誘導
８週令の特別の病原体を含まないＣ５７ＢＬ／６マウスの大腿骨および脛骨から骨髄を単離し、１０％牛胎児血清、１ｍＭ Ｌ−グルタミン、１２ｍＭヘペス、０．０５ｍＭ ２−メルカプトエタノール、１００Ｕ／ｍｌペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン（すべての試薬はギブコから）を含有するＲＰＭＩ培地（ギブコ）に２×１０⁶細胞／ｍｌの濃度で、３７℃で１２時間、５％ＣＯ₂大気で培養した。非付着細胞は温かい培地で３回連続洗浄して捨て、残こる付着細胞を集め、１０⁶細胞／ｍｌの濃度で６時間細菌の存在または不存在下で培養した。６時間はＬＰＳの応答でマウス付着細胞によるサイトカインｍＲＮＡ合成の最適時点を表わすことは予め測定した。細菌は１０⁹〜１０⁷ｃｆｕ／ｍｌの範囲の異る濃度で添加した。細胞を生育し、上記のように貯蔵した。
６時間の培養期間の最後に、細胞は遠心分離により単離し、ＴＲＩｚｏｌ試薬キット（ｇｉｂｃｏＢＲＬ，Ｃａｔ．Ｎｏ．１５５９６−０１８）を使用し、メーカーの教示に従って溶解した。総ＲＮＡはイソプロパノール沈澱により単離し、２００ｍＭトリスｐＨ８．３、２５ｍＭ ＫＣｌ、１μｇ／ｍｌオリゴｄ（Ｔ）₁₅（ベーリンガー マンハイム）、１ｍＭ ＤＤＴ（ベーリンガー マンハイム）、４ｍＭの各ｄＮＴＰ（ベーリンガー マンハイム）および４０Ｕ／ｍｌ Ｒｎａｓｉｎ（プロメガ）を含有する４０−μｌ反応容量で２００Ｕ逆転写酵素（スーパースクリプトＩＩ，ＢＲＬ）を使用して４２℃で９０分ｃＤＮＡに逆転写した。ＰＣＲプライマーおよび条件は既にコプフらが記載したものを使用した（ジャーナル・オブ・エクスペリメンタル・メディシン、１９９６年９月１日、１８４（３）、１１２７−３６）。ｃＤＮＡ量はハウスキーピング遺伝子（β−２−ミクログロブリン）に特異的プライマーを使用して試料内で標準化した。ＰＣＲ生成物は２％アガロースゲル上で分離し、バンドはＵＶ下で分析した。
図４に示すように、ＳＴ１１はもっとも強い１Ｌ−１２および１Ｌ−１０ｍＲＮＡの誘導を示し、これは積極的なコントロール（腸菌）で観察されたレベルに匹敵できるものであった。最低細菌濃度（１０⁷ｃｆｕ／ｍｌ）で最大の差が見られた。
【００４９】
例１０
ＳＴ１１による１Ｌ−４合成の抑制
ＣＤ４⁺Ｔ細胞はミルテニ・バイオテク（Ｃａｔ．Ｎｏ．４９２−０１）からＭｉｎｉＭＡＣＳキットを使用して特定病原体未感染のＢＡＬＢ／ｃマウスの脾臓から精製した。ＣＤ４⁺Ｔ細胞は１０％牛胎児血清、１ｍＭＬ−グルタミン、１２ｍＭヘペス、０．０５ｍＭ ２−メルカプトエタノール、１００Ｕ／ｍｌペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンを含有するＲＰＭＩ培地に２×１０⁵細胞／ｍｌの濃度で培養し、プレート−結合モノクローナル抗体と架橋結合することにより１週中活性化し、ＣＤ₃（クローン ２Ｃ１１）およびＣＤ２８（クローン３７．５１、双方の抗体はファーミンゲンから）を得た。この１ｒｙ培養中、ＣＤ４⁺Ｔ細胞は補助細胞として骨髄付着細胞（上記のように単離）と、および１０⁸ｃｆｕ／ｍｌ ＳＴ１１、または１０⁸ｃｆｕ／ｍｌ Ｌａｌ、または１ｍｇ／ｍｌ ＬＰＳと、または培地のみで同時培養した。この後、この細胞は洗浄し、ＣＤ４⁺Ｔ細胞はＭｉｎｉＭＡＣＳキット技術を使用してもう一度精製し、ついで培地のみを含有する２ｒｙ培養で再刺激した。分化ＣＤ４⁺Ｔ細胞により産生されたサイトカインは２日後サンドイッチＥＬＩＳＡ（エンドーゲンおよびファーミンゲンからのキット）を使用して上澄で測定した。
結果は図５に示す。培地のみの存在で分化した細胞は高レベルの１Ｌ−４を特徴とする優勢なＴｈ２フエノタイプを示した。１ｒｙ培養物にＳＴ１１を添加することにより、１Ｌ−４産生が８倍減少したように、Ｔｈ２分化の結果を強く調節した。この阻害はＬＰＳの存在で分化した細胞から誘導された培養物に認められるものと同様の大きさのものであった。これと対照的に、他のラクトバチルス菌株は１Ｌ−４レベルについて測定可能なインパクトを有しなかった。興味あることに、ＩＦＮ−ｒ量は１ｒｙ培養物にＳＴ１１を添加することにより増加しなかった。
上記から分かるように、本発明の菌株は微生物の有用な性質を利用して食品および／または医薬品キャリアの製造に十分に準備できる。
【００５０】
例１１
ＳＴ１１菌株はガテマラ市郊外のコンミュニティでこの地域の大部分の子供が経験する雨期の急性下痢疾病の媒介および体験に影響を与えるその能力に関し臨床試験を行なった。３５〜７０ヶ月令の合計２０３人の子供が研究に登録し、２９日の供与期間にわたって１０¹⁰の生菌（ＳＴ１１）の目標用量を受け、または何も（偽薬）受けなかった。試料および偽薬の双方をそれぞれ選択した子供は栄養不十分のため年令に対する体重および年令に対する身長で典型的不足があった。
学令前の子供の供与試験の開始前、安全評価は試験管内および生体内研究に基づいて行なった。試験管内研究では食品適用に使用する他のラクトバチルスと同様の抗生物質耐性パターンを示したが、生体アミンの形成、ムチンの分解および胆汁酸塩の脱結合の可能性はない。４２人の成人ボランティアを含む偽薬−調整臨床研究では、ＳＴ１１は十分に許容され、そして皷腸、１日の便通の回数および便の固さのような監視される可能性のある発現のうち悪影響を全く誘導せず、血清の急性期タン白量は潜在的炎症反応に関し何らの懸念も起こさなかった。
試料および偽薬はネスレの製品技術センターで小袋に包装し、ガテマラに冷凍して船積みした。各１０ｇの小袋はチョコレートフレーバ付与ビヒクルおよび０．２ｇのＳＴ１１（１０¹⁰ｃｆｕ）、または偽薬の場合、０．２ｇの粉乳から成っていた。チョコレートフレーバ付与ビヒクルはココア粉末、糖、大豆レシチン、バニラおよびシナモンから成るものであった。小袋は使用前２時間まで４°〜６℃で貯蔵した。使用前、小袋はネスレが供する、細菌汚染の全くない１００ｍｌの水に溶解しなければならなかった。
適用されたプロトコルによれば、下痢は２４時間中に３回以上の液体または未固形***の発生として規定された。下痢症状は下痢の証拠（２４時間中に３回の下痢***）を提示した場合として規定された。その合計期間（時間で）は最初の３回の指標便通時から最初の有形便通の出現まで、または２４時間排便のない期間までが計算された。「新しい」症状を有する子供では、前期症状の終るまで４８時間経過しなければならなかった。そうでなければ、同じ症状の継続が考えられ、その場合全体の期間が評価に使用される。２９日の観察期間中１回以上の実証された下痢の症状を経験するのは子供の場合であった。下痢症状の強さは産生した軟便の総回数を基準とした。症状のきびしさの要素は便通に血液、粘液または膿汁の存在、同時に伴なう発熱および嘔吐を包含する。２４時間に７回の便通の烈しさ、または診療所、健康センター、または病院で健康専門職による介在が必要の場合も症状をきびしいものとして分類する。
下痢の症状が監視系によって診断される場合、下痢便通は症状に対し可能な病因病原体を確認するため顕微鏡試験および培養を行なうため収集した。試験品は試料が赤痢である場合、ロタウイルス抗原、（ｇｉａｒｄｉａ，ａｎｄ Ｅ．ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃａ）に対し、およびシゲラ、サルモネラ、アエロモナス、プレシオモナス・シゲロイデス、大腸菌、あるいはＶ．コレラに対し診断された。
試験期間中、製品試料は投与期間中に含まれる微生物の生存性を試験するため集めた。微生物は全試験中小袋中で生存可能な状態のままであり、試験の終了時にも小袋は水により再構成すると１０¹⁰の生存可能な微生物を含むことが分かった。
プロビオチック微生物を含有する試料は対照群（偽薬）と比較して下痢の発生を約３０％だけ減少できたことが試験により分かった。尚、また対照群は試料または偽薬のそれぞれを受けない通常の人以上に下痢発生数の減少を既に示した。この後者の発見は付加的の貴重な栄養と汚染のない水を受ける子供基準で一部説明できる。しかし、試験は現場で行われたので、ＳＴ１１は生体内の下痢の発生を疑いなく低減できることを明らかに誘導できる。
【図面の簡単な説明】
【図１】 ロタウイルスに対し保護性を示す細菌菌株の細胞培養概略図である。
【図２】 異る培地におけるＬ．カゼイ ＳＴ１１菌株の酸性化を示す。
【図３】 １０℃、３０日間のＬ．カゼイ ＳＴ１１菌株の生存割合を示す。
【図４】 骨髄由来のマウス付着細胞の１Ｌ−１２および１Ｌ−１０のｍＲＮＡパターンを示す。
【図５】 １Ｌ−４産生の減少によるＴｈ２分化を示す。
【図６】 ＳＴ１１細胞による大腸菌の上皮細胞への付着阻害を示す。
【図７】 ＳＴ１１カルチャー上澄による大腸菌の上皮細胞への付着阻害を示す。
【図８】 ＳＴ１１細胞によるサルモネラ・チフィムリウムの上皮細胞への侵入防止を示す。
【図９】 ＳＴ１１カルチャー上澄によるサルモネラ・チフィムリウムの上皮細胞への侵入防止を示す。[0001]
The present invention relates to novel microorganisms of the genus Lactobacillus, which are useful for preventing diarrhea caused by pathogenic bacteria and rotavirus. In particular, the invention relates to the use of this microorganism for the production of ingestible support materials and to compositions containing this microorganism.
[0002]
Microorganisms that produce lactic acid as a major metabolic component have been known for a long time. Each of these bacteria can be found in milk or milk processing plants, in living and decaying plants, and in the intestines of humans and animals. These microorganisms, summarized as “lactic acid bacteria”, rather represent a heterogeneous group and include, for example, Lactococcus, Lactobacillus, Streptococcus, Bifidobacterium, Pediococcus and the like.
[0003]
Lactic acid bacteria have been used as fermenting agents for the preservation of foods that benefit from low pH and for the action of fermentation products produced during their fermentation activity that inhibit the growth of spoilage bacteria. For this reason, lactic acid bacteria are used in the manufacture of a variety of different foods such as cheese, yogurt and other fermented dairy products from milk.
[0004]
Most recently, lactic acid bacteria have drawn great attention because it has been found that certain strains show useful properties in humans and animals upon ingestion. In particular, it has been found that certain strains of the genus Lactobacillus or Bifidobacterium can colonize the intestinal mucosa and help maintain the living conditions of humans and animals.
[0005]
In this regard, EP 0 768 375 discloses a specific strain of the genus Bifidobacterium that can be transplanted into intestinal flora and attached to enterocytes. These bifidobacteria have been reported to assist in immune regulation and to competitively eliminate the pathogenic bacteria from adhering to intestinal cells and thus help maintain personal health.
[0006]
In recent years, research has focused on the potential use of lactic acid bacteria as probiotic agents. Probiotics are thought to be viable microbial formulations that promote personal health by retaining the natural microflora in the gut. Microbial preparations are usually acceptable as probiotics if their effective microorganisms and their mode of action are known. Probiotics are thought to adhere to the intestinal mucosa and form colonies in the intestinal tract, as well as prevent the attachment of harmful microorganisms thereon. The decisive requirement for these actions is that the lactic acid bacteria must reach the intestinal mucosa in a suitable and viable form and are not destroyed by the effects of normal low pH in the upper part of the gastrointestinal tract, especially in the stomach. is there.
[0007]
In this regard, WO 97/00078 discloses a specific strain called Lactobacillus GG (ATCC 53103) as such a probiotic. The microorganisms are particularly used in methods for preventing or treating hypersensitivity reactions derived from foods, in which food substances hydrolyzed with pepsin and / or trypsin are administered to recipients. The selected Lactobacillus strains are described as exhibiting adherence and colony formation and exhibiting a protease enzyme system, and the protein substances contained in the administered food are further hydrolyzed by the protease secreted by the specific Lactobacillus strain. Disassembled. The method described in this document eventually absorbs protein substances that no longer show substantial amounts of allergens by the intestines.
[0008]
In addition, European Patent No. 0 577 903 describes the production of supporting substances intended for the treatment or prevention of ulcers associated with the action of Heliobacter pylori, which is a recognized cause of the development of ulcers. Reference is made to the use of lactic acid bacteria that have the ability to replace them.
[0009]
The intervening WO 99/29833 describes a special strain, LMGP 17806, with three plasmids of defined size. It is described that this strain can prevent enterocytes from invasion by Salmonella typhimurium.
[0010]
Recognizing the useful properties that certain strains of lactic acid bacteria may have, there is a desire in the industry for additional lactic acid bacteria strains that are advantageous for human and / or animal living conditions.
The object of the present invention is therefore to provide additional bacterial strains exhibiting new properties advantageous to humans and / or animals.
[0011]
The above problems have been solved by providing a novel microorganism, that is, a lactic acid bacterium belonging to the genus Lactobacillus, which has the characteristics of preventing intestinal colonization by pathogenic bacteria causing diarrhea and preventing infection of intestinal epithelial cells by rotavirus. According to a preferred embodiment, the Lactobacillus strain is capable of adhering to the intestinal mucosa of the host organism and essentially forming colonies therein.
[0012]
According to another preferred embodiment, the Lactobacillus strain can grow in the presence of up to 0.4% bile salts, so that it can easily pass through the gastrointestinal tract and remain essentially active. Can do.
[0013]
According to another preferred embodiment, the lactic acid bacterium is selected from Lactobacillus ram, Sus or Lactobacillus paracasei, preferably Lactobacillus paracasei, more preferably Lactobacillus paracasei CNCM I-2116.
[0014]
It has been found that the microorganism of the present invention has the following properties. That is, Gram positive, Catalase negative, NH_ThreeFormed arginine negative and CO₂Production negative. They produce L (+) lactic acid, can grow in the presence of bile salts at concentrations up to about 0.4%, and can essentially prevent epithelial cell infection by rotavirus.
[0015]
New microorganisms are used to produce various ingestible support materials such as milk, yogurt, curd, fermented milk, fermented products based on milk, fermented cereal based products, milk based powders, infant formulas About 10^Fivecfu / g to about 10¹¹It can be included in the support material in an amount of cfu / g. In the present invention, each word cfu indicates “colony forming unit” and is defined as the number of bacterial cells indicated by the number of microorganisms on the agar plate.
The present invention also provides a food or pharmaceutical composition containing at least one Lactobacillus strain having the above characteristics.
[0016]
For the production of the food composition according to the invention, at least one Lactobacillus strain according to the invention is about 10^Fivecfu / g to about 10¹¹cfu / g, preferably about 10⁶cfu / g to about 10^Tencfu / g, more preferably about 10⁷cfu / g to about 10⁹Added in the amount of cfu / g.
[0017]
In the case of pharmaceutical preparations, the product can be manufactured in the form of tablets, bacterial liquid suspension, dry oral supplement, hydrous oral supplement, dry tube nutrition or hydro tube nutrition, etc., and the amount of Lactobacillus strain added to it is 10¹²up to cfu / g, preferably about 10⁷cfu / g to about 10¹¹cfu / g, more preferably about 10⁷cfu / g to about 10^Tencfu / g.
[0018]
The activity of new microorganisms in the solid intestine is naturally dose dependent. That is, the greater the amount of new microorganisms obtained by ingesting the food substance or pharmaceutical composition, the higher the protective activity and / or therapeutic activity of the microorganism. Since the new microorganisms are not harmful to mankind and animals and are ultimately isolated from infant excrement, high amounts can be added so that essentially a high percentage of an individual's intestine can be colonized by the new microorganisms.
[0019]
In the figure,
FIG. 1 shows a schematic diagram of a cell culture selected to evaluate rotavirus protection by bacterial strains.
FIG. 2 shows L. of different growth media. The acidification of casei strain CNCM I-2116 (referred to as ST11) is shown.
FIG. 3 is a graph showing L.P. The survival rate of casei strain ST11 is shown.
FIG. 4 shows the 1L-12 and IL-10 mRNA patterns of bone marrow-derived mouse adherent cells after cells were cultured by serial dilution of ST11.
FIG. 5 shows the results of Th2 differentiation due to decreased IL-4 production.
FIG. 6 shows an overview of the results of cell culture experiments used in the test for preventing cultured ST11 cells from attaching pathogenic E. coli to epithelial cells.
FIG. 7 shows an overview of the results of cell culture experiments in which ST11 culture supernatants are used in tests to prevent pathogenic E. coli from adhering to epithelial cells.
FIG. 8 shows an overview of the results of cell culture experiments in which cultured ST11 cells are used in a test that blocks Salmonella typhimurium from entering epithelial cells.
FIG. 9 shows an overview of the results of cell culture experiments in which the supernatant of the ST11 culture is used in a test that blocks Salmonella typhimurium from entering the epithelial cells.
[0020]
During extensive research leading to the present invention, the inventors investigated infant excreta and isolated a variety of different bacterial strains therefrom. These strains were subsequently tested for their ability to prevent infection of epithelial cells by rotavirus and pathogens known to cause diarrhea.
[0021]
The inhibitory activity of several species of fungi including Lactobacillus, Lactococcus and Streptococcus was selected. The study is based on three rotavirus serotypes (cellotypes G1, G3 and G4), which essentially represent the major pathogens of human viral diarrhea, and pathogenic E. coli and Salmonella typhimurium as representative pathogenic microorganisms that cause diarrhea in infected individuals. I did it.
[0022]
The various lactic acid bacteria were grown in a suitable medium such as MRS, Hugo-Jago or M17 medium at a temperature of about 30 ° to 40 ° C. corresponding to their optimum growth temperature. After reaching steady growth, the bacteria were collected by centrifugation and resuspended in physiological saline. Bacterial cells were stored frozen (−20 ° C.) for different tests.
[0023]
Rotavirus test
Various rotavirus stocks were prepared by confluent cell monolayer infection. Rotavirus was cultured before infection. Cells were infected with 20 tissue culture infectious doses. Two different protocols were applied to assess anti-rotavirus properties. According to one protocol, various bacterial strains were tested for direct interaction with rotavirus, while in the second protocol, bacteria selected strains that interacted with cellular rotavirus receptors. The first protocol involved contacting each bacterial suspension with a different rotavirus strain and then culturing in an appropriate medium. The virus-bacteria mixture was then applied to the cell monolayer of human anaplastic colon adenoma cells HT-29 and culture continued. Virus replication was then tested. In the second protocol, each bacterial suspension is first cultured with a cell monolayer of human undifferentiated colon adenoma cells HT-29 and then the virus is added. Virus replication was tested after continuous culture. Rotavirus replication can be readily assessed by tissue-immunology staining of rotavirus proteins in infected cells. When the number of infected cells was reduced to 90% in the cell culture inoculated with rotavirus + indicator bacteria compared to cells inoculated with rotavirus alone, the inhibitory effect of rotavirus was attributed to the test bacteria.
[0024]
Of the total 260 bacterial strains isolated initially, only 9 were found to essentially inhibit rotavirus replication. Different bacteria were confirmed to belong to Lactobacillus subsp. Rhamnosus or paracasei. One strain, designated Lactobacillus casei ST11, deposited by the Budapest Spare and received the deposit number NCC2461 (I-2116), was found to be very effective in preventing infection of human cells by rotavirus. Furthermore, since this special strain shows acidification in various media, it exhibits excellent growth. The strain also exhibits excellent performance in terms of survival during storage at low temperatures of about 10 ° C., making it a good candidate for inclusion in food or pharmaceutical compositions stored under refrigerated conditions.
[0025]
Anti-pathogenic bacteria test
The following approach was chosen to evaluate anti-bacterial properties. According to one protocol, the cultured Lactobacillus strains of the present invention were tested for their ability to prevent the attachment of pathogens that cause diarrhea to enterocytes or their entry into enterocytes. For this reason, intestinal cells were brought into contact with pathogenic bacteria and the cultured Lactobacillus strain of the present invention, and each rate of adhesion or invasion was evaluated. According to the second protocol, cell culture supernatants of Lactobacillus strains of the invention were added to enterocytes together with pathogenic microorganisms to assess the respective rates of adhesion or invasion. During the experiment, the cultured Lactobacillus and the supernatant can show evidence that it is very effective in preventing both adhesion and entry into the enterocytes, which is the metabolic compound secreted by new microorganisms. This indicates that it seems to contribute to anti-diarrheal activity with respect to pathogenic bacteria.
[0026]
In addition to the above findings, it has also been found that this strain also exhibits anti-allergic properties by having an impact on the synthesis of a different immune mediator.
[0027]
Humoral immune and allergic reactions are CD4 with type 2 phenotype (Th2)⁺It is generally accepted that it is mediated by T cells. Th2-cells are characterized by producing cytokines necessary for the secretion of high levels of interleukin 4 (IL-4), IgE (a major antibody class involved in allergic reactions).
[0028]
Differentiation of Th2 cells is IFN-r, CD4⁺Damaged by special cytokines that arise from mutually exclusive TH1 subsets of T cells. TH1 cells are sequentially strongly induced by interleukin 12 (IL-12). In contrast, IL-10, another cytokine, has been found to have a strong inhibitory impact on TH1 cell proliferation and appears to play a role in immune-suppressive mechanisms.
[0029]
In summary, both IL-12 and IL-10 affect CD4 by affecting the development of the Th1 subset.⁺It has a strong regulatory effect on T cell development. Since IL-12 is a regulatory cytokine that is key to the induction of Th1 differentiation, it suppresses the generation of a Th2 response. Therefore, the main way to suppress Th2 cells is seen in the stimulation of IL-12 synthesis by auxiliary cells.
[0030]
It is well known that some components of Gram-negative bacteria such as LPS induce high levels of IL-12 in adherent cells such as macrophages and dendritic cells. Consistently, Gram-negative bacteria are CD4⁺It has been found that T cell differentiation can be strongly driven in the direction of the Th1 phenotype.
[0031]
As an example of the Lactobacillus strain of the present invention, the microorganism ST11 is CD4.⁺The potential role of cytokine induction involved in the regulation of T cell differentiation was examined. In particular, CD4 during Th2 differentiation⁺The effects of ST11 on T cell phenotypes were studied.
[0032]
In this regard, the ability of ST11 to induce synthesis of mRNA encoding these two regulatory cytokines in bone marrow-derived mouse adherent cells was compared to four other Lactobacillus strains and a control Gram-negative bacterium (E. coli K12). mRNA is 10⁹-10⁷Bacteria serially diluted in the range of cfu / ml were cultured for 6 hours and then measured by semi-quantitative RT-PCR.
[0033]
Although all Lactobacillus strains can induce IL-12 mRNA transcription to some extent, ST11 has been found to be the strongest inducer. This is because even the lowest bacterial dose can be detected as a strong PCR signal. Indeed, ST11's ability to induce IL-12 mRNA transcription was as strong as E. coli. The induction of IL-10 mRNA was generally weaker than IL-12 mRNA, and a signal could only be detected at higher bacterial doses. Nevertheless, ST11 was the strongest inducer of IL-10 mRNA compared to other Lactobacillus and E. coli controls.
[0034]
That is, ST11 is CD4⁺It appears to be effective in inducing immune-regulated cytokines involved in T cell differentiation. Its strong ability to induce IL-12 is a candidate to inhibit the Th2 response, and its measurable induction of IL-10 can prevent an inflammatory response.
[0035]
In addition to the above findings, ST4 is CD4 during Th2 differentiation⁺It was also determined whether it exhibited an inhibitory effect on T cells and a positive effect on Th1 function. A well-established differentiation culture system is used, where the precursor CD4⁺T cells were polyclonally activated and adjusted to undergo Th1 or Th2 differentiation according to the type of co-stimuli provided to the culture medium. Th1 / Th2 differentiation is induced in the first culture on day 7, after which the cells are restimulated for 2 days in a second culture with medium alone and the acquisition of a specific phenotype (Th1 or Th2) is produced in the supernatant. The cytokine type (IFN-r vs. IL-4) was measured.
[0036]
Precursor CD4 from BALB / c background mice⁺It is known that T cells preferentially differentiate into Th2 phenotypes (high IL-4, low IFN-r in 2ry culture supernatant) that are dominant after activation under neutral conditions (medium alone in 1ry culture). This phenotype could be completely restored to the Th1 pattern (high IFN-r, low IL-4) when a blocking monoclonal antibody was added to IL-4 of 1ry culture.
[0037]
To investigate the potential role of ST11 for Th2 inhibition, purified precursor CD4 from BALB / c mice⁺T cells were activated as auxiliary cells in 1ry culture in the presence of bone marrow adherent cells. These cells are medium alone, or 1 mg / ml LPS, or 10⁸cfu / ml ST11 or 10⁸Co-cultured in the presence of another cfu / ml Lactobacillus. The cells are then washed and CD4⁺T cells were once more purified and restimulated in 2ry cultures with medium alone. Differentiation CD4⁺Cytokines produced by T cells were measured after 2 days. As expected, cells differentiated in the presence of medium alone showed a predominant Th2 phenotype. The results of Th2 differentiation were adjusted so that the addition of ST11 to 1ry culture resulted in an 8-fold decrease in IL-4 production. This inhibition was similar in magnitude to that observed in cultures derived from cells differentiated in the presence of LPS. In contrast, other Lactobacillus strains had no measurable impact on IL-4 levels. Interestingly, the amount of IFN-r was not increased by addition of ST11 in 1ry culture.
[0038]
In summary, ST11 is CD4 undergoing Th2 differentiation.⁺Although specifically impaired IL-4 production by T cells, it did not significantly increase IFN-r secretion. The fact that ST11 does not increase IFN-r production depends on its ability to induce IL-10, so that it can retain a low inflammatory impact despite anti-Th2 activity.
As a result, it was found that ST11 is a Lactobacillus strain having an excellent anti-Th2 profile, and this profile makes it an excellent candidate for its use as a bacterium having anti-allergic and probiotic activities.
[0039]
The invention will now be described by way of example.
Medium and solution
MRS (Difco),
Hugo-Jago (Trypton Difco 30 g / l, Yeast Extract Difco 10 g / l, Lactose Difco 5 g / l, KH₂PO_Four  5 g / l, beef extract diffco 2 g / l, agar diffco 2 g / l),
M17 (Difco),
M199 (Ceromed),
Ringer's solution (oxoid),
PBS (NaCl 8 g / l, KCl 0.2 g / l, Na₂HPO_Four  1.15 g / l, KH₂PO_Four  0.2 g / l),
Tryptose phosphate broth (flow) trypsin-EDTA solution (Cellomed).
Human rotavirus Wa (G1 serotype) and simian rotavirus SA-11 (G3 serotype) A. Obtained from Offfit, Philadelphia Children's Hospital, USA. The DS-IxRRV reassortant virus is Obtained from Kapikian, NIH Bethesda, USA. Serotype 4 human rotavirus Obtained from Bachmann, University of Munich, Germany. E. coli DAEC C1845 was obtained from the University of Washington, Seattle, and E. coli JPN 15 was obtained from the University of Maryland (USA) Vaccine Development Center. Salmonella typhimurium strain SL1344 was obtained from Stanford Microbiology, USA.
[0040]
Example 1
Isolation of lactic acid bacteria from infant excrement
New excreta was collected from the diapers of 16 healthy babies 15 to 27 days old. 1 g of fresh excreta was placed under anaerobic conditions for transport to the laboratory, and microbial analysis was performed by serial dilution in Ringer's solution within 2 hours after sample collection and placing in selective media. MRS agar + antibiotics (fosfomycin 80 μg / ml, sulfamethoxazole 93 μg / ml, trimethoprim 5 μg / ml) were cultured at 37 ° C. for 48 hours and used to isolate lactic acid bacteria. Colonies were randomly picked and purified. Physiological and genetic characterization was performed on the isolate.
[0041]
Example 2
Testing cell culture strains for anti-rotavirus activity
Several types of lactic acid bacteria including Lactobacillus, Lactococcus and Streptococcus were selected and tested against those that showed anti-rotavirus activity in cell culture inhibition tests. In the genus Lactococcus, it was represented by a single species (Lc. Lactis) consisting of two subspecies (Lc. Lactis subspecies lactis and cremolith). A total of 30 strains were tested. In the genus Streptococcus, 45 strains represented one species (S. thermophilus). Leukonostock and Propionibacterium spp. Represented a single species (6 strains), whereas Enterococcus and Staphylococcus spp. Each represented 17 strains in total.
A total of 260 strains were tested for rotavirus inhibitory activity.
First protocol
30 μl of bacterial suspension (average 3 × 10⁶Bacteria) contain 10% tryptophosphate broth (flow) and 5% trypsin-EDTA solution (Ceromed) (diluted 1: 4 for HT-29 cells) and supplemented M199 medium with 70 μl M199 medium supplemented with 100 μl virus Mixed. The virus-bacteria mixture was incubated for 1 hour at 4 ° C and 1 hour at 37 ° C. Cells of human undifferentiated colon adenoma cells HT-29 growing as confluent cell monolayers in a microtiter plate with 96 holes were washed 3 times with phosphate buffered saline (PBS, pH 7.2). . The virus-bacteria mixture is applied to the cells and the microtiter plate is CO.₂The cells were cultured for 18 hours in an incubator (Heraeus). Viral replication was tested as follows.
Second protocol
30 μl of bacterial suspension (above) is mixed with 70 μl M199 medium supplemented with 10% tryptophosphate phosphate broth (flow) and 5% trypsin-EDTA solution (cellomed) (diluted 1: 4 for HT-29 cells), and Applied directly to cells in microtiter plates. After 1 hour incubation at 37 ° C., 100 μl virus in supplemented M199 medium was added to the cells on the microtiter plate. Cultivation is CO₂Continued for 18 hours in incubator (Heraeus). Viral replication was tested as follows.
Rotavirus replication was assessed by rotavirus protein tissue-immunostaining of infected cells as described below.
One day after infection, the cell culture medium was discarded from the microtiter plate, and the cells were fixed with absolute ethanol for 10 minutes. The ethanol was discarded and the plate was washed 3 times with PBS buffer. Next, 50 μl of anti-rotavirus serum (primarily directed to the VP6 protein) produced in rabbits (obtained from ISREC University in Lausanne) and diluted 1: 2000 in PBS was added to each well and the wells dried. In order to prevent this, it was incubated at 37 ° C. for 1 hour with a cover slip. The antiserum was then discarded and the plate was washed 3 times with PBS. 50 μl of anti-rabbit immunoglobulin G (IgG) antiserum produced in goat and conjugated to peroxidase (GAR-IgG-PO, Nordic) was diluted 1: 500 in PBS and added to each well, and the plate was The cells were cultured at 37 ° C for 1 hour. The serum was discarded and the plate was washed once more with PBS three times. Then 100 μl of the following substrate mixture was added to each well: 10 ml 0.05 M Tris-hydrochloride (pH 7.8), 1 ml H₂O₂(30% volume, H₂Diluted 1: 600 in O, Merck) and 200 μl of 3-amino-9-ethylcarbazole (0.1 g / 10 ml ethanol, A-5754, Sigma stored in 200 μl sample at −80 ° C.). Plates were incubated at room temperature for at least 30 minutes. The substrate is discarded and the hole is 200 μl H₂The reaction was stopped by filling O. Infected cell lesions were counted with an inverted microscope (Diavert, Leitz).
Only a few bacterial strains interacted with rotavirus. Of the 260 bacterial cells initially selected, only 9 inhibited rotavirus replication of at least one protocol. Lactobacillus paracasei NCC2461 (ST11) showed very high activity against serotype 1 rotavirus, serotype 3 rotavirus SA11 and serotype 4 rotavirus hot spot.
[0042]
Example 3
Caco-2 cell culture
In the (pathogenicity) bacterial inhibition test, the cell line Caco-2 was used as an intestinal model. This cell line presents unique features for intestinal cells such as, for example, polarization, expression of intestinal enzymes, production of specially structured polypeptides.
The cells are placed in three different supports: a plastic dish (25 cm for growth and propagation).², Corning), degreased and sterilized glass plates (22 × 22 mm, Corning) for adhesion tests and 24 plates (cornings) for inhibition tests.
The medium (DMEM) was changed every day after 2 days of culture. The pre-use medium was supplemented with 100 U / ml penicillin / streptomycin, 1 μg / ml amphoterin and 20% FCS inactivated at 56 ° for 30 minutes. Culture is 90% air and 10% CO₂At 37 ° C. in an atmosphere containing Cells were detached every 6 days. Cells were detached from the hole wall by treatment with PBS pH 7.2 containing 0.25% trypsin and 3 mM EDTA. To neutralize the effect of trypsin, an equal volume of FCS was added to the production cell suspension, the mixture was centrifuged (10 minutes at 1000 rpm), and the pellet was again placed in the culture. 3.5 × 10^FiveThe cells were transferred to a new culture bottle and cultured until a confluent cell monolayer was obtained.
[0043]
Example 4
Bacterial culture
ST11:
Bacterial strains were stored at −20 ° C. in MRS medium containing 15% glycerol. Strains were grown in MRS under anaerobic conditions and transferred twice to fresh medium at 24 hour intervals before being used for inhibition testing. In this test, 2 × 10⁹A concentration of cfu / ml was used.
The supernatant was collected by centrifugation at 20,000 rpm for 1 hour, and the resulting supernatant was then checked for the presence of bacteria.
E. coli:
Two E. coli strains, E. coli DAEC C1845 (Diffusion-attached E. coli) and E. coli JPN15 (EPEC, Entero-Pasogenic E. coli) were used.
After thawing, the first subculture is performed on CFA-Müller Hinton agar, which is suitable for expressing the adherence rate by bacteria.
Bacterial cells are cultured at 37 ° C. before each experiment and transferred to fresh medium twice after 24 hours each. Since JPN15 has an ampicillin resistance gene, this antibiotic was used for selection during growth.
Salmonella:
Salmonella typhimurium strain SL1344 was used in the experiment and was grown in LB medium before use.
[0044]
Example 5
E. coli inhibition test
After the second subculture in a new medium, the pathogenic strain is 10 μCi / ml C in LB medium.¹⁴-Labeled with radioisotope using acetate. The strain was cultured in this medium at 37 ° C. for 18 hours.
The bacterial suspension is then centrifuged (1041 g, 15 min) to leave residual C¹⁴-The supernatant containing acetate was removed. The pellet is suspended and washed with PBS, then the cells are about 10 per ml of 1% sterile mannose.⁸Suspended at cell concentration. Mannose is known not to show any particular adhesion.
Different pathogenic strains (E. coli) were transformed into Caco-2 cells (37 ° C, 10% CO₂, 90% air) for 3 hours. The same experiment was performed using the supernatant (obtained by centrifugation at 20,000 rpm for 40 minutes).
As a control, the pathogen was contacted with the Caco-2 monolayer without the simultaneous addition of ST11 or culture supernatant, respectively.
After 3 hours of culture, the medium was changed and the monolayer was washed 3 times with PBS. Each wash step included 20 × agitation of the PBS solution to remove essentially all non-specific attachment. The cells were then lysed by adding 1 ml of sodium carbonate and incubating at 37 ° C. for 40 minutes. After homogenization, the sample (250 ml) was diluted with 5 ml of scintillation fluid (Hionic-Fluor Packard) and counted (Packard 2000). The percent adherence of pathogenic cells to Caco-2 cells was calculated relative to a control set at 100% (attachment or invasion of Example 6).
[0045]
Example 6
Inhibition test against Salmonella
Salmonella is a bacterium that invades and grows in epidermal cells. In order to determine the inhibitory activity of ST11, Salmonella typhimurium strain SL1344 was¹⁴Culturing was carried out in a medium containing C-acetate, and the experiment described in Example 5 was performed.
After incubation, Caco-2 cells were washed with PBS to remove all non-adherent cells. Thereafter, a medium containing gentamicin (20 μg / ml) was added, and the culture was continued at 37 ° C. for 1 hour. Gentamicin is an antibiotic that does not enter the gut cells so that all extracellular microorganisms are killed, while Salmonella that has already entered the gut cells survive. After washing the cells twice with PBS, the cells were lysed by adding sterile distilled water and the radioactivity was measured as described in Example 4.
The results of Examples 5 and 6 are shown in FIGS. Cultured ST11 cells and culture supernatant were very effective in preventing adhesion to enterocytes and invasion into cells by pathogenic microorganisms causing diarrhea.
[0046]
Example 7
Properties of ST11
ST11 was cultured in artificial gastric juice. The artificial gastric juice was prepared by suspending pepsin (3 g / l) in sterile physiological saline (0.5% w / v) and adjusting the pH to 2.0 and 3 with concentrated HCl, respectively. ST11 was grown in various amounts in the above medium, and the resistance of microorganisms was measured.
The results are summarized in Table 1.

ST11 has the following properties defined by the method disclosed in the genus of lactic acid bacteria (Ed. B. J. B. Wood and W. H. Holzapfel, Blackie A & P).
-Gram positive
-Catalase negative
-NH_ThreeArginine negative
-CO₂Production negative
Production of -L (+) lactic acid
-Growing in the presence of bile salts at concentrations up to about 0.4%.
[0047]
Example 8
Growth of ST11 under various conditions
ST11 is a tomato-based medium (4 hydrated in distilled water) supplemented with sucrose (0, 0.5, 1 or 2%) or soy peptone (0.5%) or glucose (0.5%). % Tomato powder) at 37 ° C. for different periods. The results are shown in FIG.
ST11 was further added to a medium consisting of rice flour (3%), wheat flour (2%) and sucrose (3%) in an amount of 2.5% and cultured at 37 ° C. until a pH of 4.4 was reached. After cooling, the product was packaged with or without vitamin C and stored at 10 ° C.
[0048]
Example 9
Induction of synthesis of 1L-12 and 1L10-mRNA by ST11 in mouse adherent cells
Bone marrow was isolated from femur and tibia of C57BL / 6 mice free of special pathogens at 8 weeks of age, 10% fetal bovine serum, 1 mM L-glutamine, 12 mM hepes, 0.05 mM 2-mercaptoethanol, 100 U / ml 2 × 10 2 in RPMI medium (Gibco) containing penicillin and 100 μg / ml streptomycin (all reagents from Gibco)⁶5% CO2 at 37 ° C for 12 hours at a concentration of cells / ml₂Cultured in air. Non-adherent cells are washed three times with warm medium and discarded, and the remaining adherent cells are collected.⁶Incubated in the presence or absence of bacteria at a concentration of cells / ml for 6 hours. It was determined in advance that 6 hours represents the optimal time point for cytokine mRNA synthesis by mouse adherent cells in response to LPS. 10 bacteria⁹-10⁷Added at different concentrations in the cfu / ml range. Cells were grown and stored as described above.
At the end of the 6 hour culture period, the cells were isolated by centrifugation and lysed using the TRIzol reagent kit (gibcoBRL, Cat. No. 15596-018) according to the manufacturer's instructions. Total RNA was isolated by isopropanol precipitation, 200 mM Tris pH 8.3, 25 mM KCl, 1 μg / ml oligo d (T)₁₅(Boehringer Mannheim), 1Um DDT (Boehringer Mannheim), 4OmM each dNTP (Boehringer Mannheim) and 40U / ml Rnasin (Promega) in a 40-μl reaction volume using 200U reverse transcriptase (Superscript II, BRL) And reverse transcribed into cDNA at 42 ° C. for 90 minutes. The PCR primers and conditions already described by Kopf et al. Were used (Journal of Experimental Medicine, September 1, 1996, 184 (3), 1127-36). The amount of cDNA was normalized within the sample using primers specific for the housekeeping gene (β-2-microglobulin). PCR products were separated on a 2% agarose gel and bands were analyzed under UV.
As shown in FIG. 4, ST11 showed the strongest induction of 1L-12 and 1L-10 mRNA, which was comparable to the level observed with aggressive controls (enterococci). Minimum bacterial concentration (10⁷cfu / ml) showed the greatest difference.
[0049]
Example 10
Inhibition of 1L-4 synthesis by ST11
CD4⁺T cells were purified from the spleen of BALB / c mice uninfected with a specific pathogen using the MiniMACS kit from Milteni Biotech (Cat. No. 492-01). CD4⁺T cells were 2 × 10 2 in RPMI medium containing 10% fetal bovine serum, 1 mM L-glutamine, 12 mM hepes, 0.05 mM 2-mercaptoethanol, 100 U / ml penicillin and 100 μg / ml streptomycin.^FiveCultured at a concentration of cells / ml and activated throughout the week by cross-linking with plate-bound monoclonal antibody, CD_Three(Clone 2C11) and CD28 (clone 37.51, both antibodies were from Pharmingen). During this 1ry culture, CD4⁺T cells are bone marrow adherent cells (isolated as described above) as accessory cells, and 10⁸cfu / ml ST11 or 10⁸Co-cultured with cfu / ml Lal, 1 mg / ml LPS, or medium alone. After this, the cells are washed and CD4⁺T cells were purified once again using MiniMACS kit technology and then restimulated with 2ry cultures containing medium only. Differentiation CD4⁺Cytokines produced by T cells were measured in the supernatant after 2 days using a sandwich ELISA (kit from Endogen and Pharmingen).
The results are shown in FIG. Cells differentiated in the presence of medium alone showed a predominant Th2 phenotype characterized by high levels of 1L-4. The addition of ST11 to 1ry cultures strongly regulated the results of Th2 differentiation, such that 1L-4 production was reduced 8-fold. This inhibition was similar in magnitude to that observed in cultures derived from cells differentiated in the presence of LPS. In contrast, other Lactobacillus strains had no measurable impact on 1L-4 levels. Interestingly, the amount of IFN-r was not increased by adding ST11 to 1ry cultures.
As can be seen from the above, the strains of the present invention can be fully prepared for the production of food and / or pharmaceutical carriers utilizing the useful properties of microorganisms.
[0050]
Example 11
The ST11 strain was clinically tested in a suburb of Guatemala City for its ability to influence and influence the rainy season acute diarrhea disease experienced by most children in the region. A total of 203 children, 35-70 months old, enrolled in the study and 10^TenReceived a target dose of live bacteria (ST11) or nothing (placebo). Children who chose both sample and placebo each had a typical deficiency in weight relative to age and height relative to age due to poor nutrition.
Safety assessments were based on in vitro and in vivo studies prior to the start of pre-decoration child donation studies. In vitro studies showed similar antibiotic resistance patterns as other lactobacilli used for food applications, but there is no possibility of biogenic amine formation, mucin degradation and bile salt debinding. In a placebo-controlled clinical study involving 42 adult volunteers, ST11 is well tolerated and adversely affects the potential monitored such as enema, number of bowel movements and stool consistency Serum acute protein levels did not raise any concern regarding the potential inflammatory response.
Samples and placebo were packaged in sachets at the Nestlé Product Technology Center, frozen in Guatemala and shipped. Each 10 g sachet contains chocolate flavored vehicle and 0.2 g ST11 (10^Tencfu), or placebo, consisted of 0.2 g of milk powder. The chocolate flavored vehicle consisted of cocoa powder, sugar, soy lecithin, vanilla and cinnamon. The pouches were stored at 4 ° -6 ° C. for up to 2 hours before use. Prior to use, the sachets had to be dissolved in 100 ml of water provided by Nestlé without any bacterial contamination.
According to the protocol applied, diarrhea was defined as the occurrence of 3 or more liquid or non-solid excretions during 24 hours. Diarrhea symptoms were defined as presenting evidence of diarrhea (3 diarrhea excretion over 24 hours). The total duration (in hours) was calculated from the time of the first three indicator stools to the appearance of the first tangible bowel movement or the period without 24-hour defecation. For children with “new” symptoms, 48 hours had to pass before the end of the first symptom. Otherwise, continuation of the same symptoms can be considered, in which case the entire period is used for evaluation. It was in the case of children that they experienced one or more demonstrated symptoms of diarrhea during the 29-day observation period. The intensity of diarrhea symptoms was based on the total number of loose stools produced. Symptoms of severity include the presence of blood, mucus or pus in the bowel, as well as fever and vomiting. Symptoms are also classified as severe if seven days of bowel movements are required, or if intervention by a health professional is required in a clinic, health center, or hospital.
When diarrheal symptoms were diagnosed by the monitoring system, diarrheal bowel movements were collected for microscopic examination and culture to identify possible etiological pathogens for the symptoms. The test article is against rotavirus antigen, (giardia, and E. histolytica), and Shigella, Salmonella, Aeromonas, Plesiomonas sigeloides, E. coli, or V. Diagnosed for cholera.
During the test period, product samples were collected to test the viability of the microorganisms contained during the dosing period. The microorganisms remain viable in the sachet during the entire test, and the sachet is reconstituted with water at the end of the test.^TenOf viable microorganisms.
Tests have shown that samples containing probiotic microorganisms can reduce the incidence of diarrhea by about 30% compared to the control group (placebo). In addition, the control group already showed a decrease in the incidence of diarrhea over normal people who did not receive either the sample or placebo. This latter finding can be explained in part by child standards that receive additional valuable nutrition and clean water. However, since the test was performed in the field, ST11 can clearly induce that the occurrence of diarrhea in vivo can be reduced without any doubt.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a schematic diagram of cell culture of a bacterial strain showing protection against rotavirus.
FIG. 2 L. in different media. Casei shows acidification of ST11 strain.
FIG. 3 is a graph showing L.P. The survival rate of casei ST11 strain is shown.
FIG. 4 shows 1L-12 and 1L-10 mRNA patterns of bone marrow derived mouse adherent cells.
FIG. 5 shows Th2 differentiation by decreasing 1L-4 production.
FIG. 6 shows inhibition of adhesion of E. coli to epithelial cells by ST11 cells.
FIG. 7 shows inhibition of adhesion of E. coli to epithelial cells by ST11 culture supernatant.
FIG. 8 shows the prevention of entry of Salmonella typhimurium into epithelial cells by ST11 cells.
FIG. 9 shows the prevention of invasion of Salmonella typhimurium into epithelial cells by ST11 culture supernatant.

Claims (8)

ラクトバチルス・パラカゼイＣＮＣＭ Ｉ−２１１６（ＮＣＣ２４６１）。  Lactobacillus paracasei CNCM I-2116 (NCC2461). ラクトバチルス・パラカゼイＣＮＣＭ Ｉ−２１１６（ＮＣＣ２４６１）を含む、摂取できる支持物質。  An ingestible support material comprising Lactobacillus paracasei CNCM I-2116 (NCC2461). ラクトバチルス・パラカゼイＣＮＣＭ Ｉ−２１１６（ＮＣＣ２４６１）は約１０⁵ｃｆｕ／ｇ〜約１０¹²ｃｆｕ／ｇ支持物質の量で支持物質に含まれる、請求項２に記載の摂取できる支持物質。The ingestible support material of claim 2, wherein Lactobacillus paracasei CNCM I-2116 (NCC2461) is included in the support material in an amount of from about 10 ⁵ cfu / g to about 10 ¹² cfu / g support material. ラクトバチルス・パラカゼイＣＮＣＭ Ｉ−２１１６（ＮＣＣ２４６１）の培養物の上澄を含む、摂取できる支持物質。  An ingestible support material comprising a culture supernatant of Lactobacillus paracasei CNCM I-2116 (NCC2461). 前記支持物質は、乳、ヨーグルト、カード、チーズ、発酵乳、乳をベースとする発酵製品、アイスクリーム、発酵穀類をベースとする製品、乳をベースとする粉末、乳児用調製粉乳から選択した食品組成物である、請求項２又は４に記載の摂取できる支持物質。  The support material is selected from milk, yogurt, curd, cheese, fermented milk, fermented milk-based products, ice cream, fermented cereal-based products, milk-based powder, infant formula The ingestible support material according to claim 2 or 4, which is a composition. 支持物質は下痢と関連する疾病の治療および／または予防に使用する、請求項２から５のいずれか１項に記載の摂取できる支持物質。  6. An ingestible support material according to any one of claims 2 to 5, wherein the support material is used for the treatment and / or prevention of diseases associated with diarrhea. ラクトバチルス・パラカゼイＣＮＣＭ Ｉ−２１１６（ＮＣＣ２４６１）又はその培養物の上澄を含有する、食品組成物又は医薬組成物。  A food composition or a pharmaceutical composition comprising Lactobacillus paracasei CNCM I-2116 (NCC2461) or a supernatant of a culture thereof. 乳、ヨーグルト、カード、チーズ、発酵乳、乳をベースとする発酵製品、アイスクリーム、発酵穀物をベースとする製品、乳をベースとする粉末、乳児用調製粉乳、錠剤、細菌液体サスペンジョン、経口用乾燥サプリメント、経口用含水サプリメント、乾燥経管栄養又は含水経管栄養から選択する、請求項７に記載の組成物。  Milk, yogurt, curd, cheese, fermented milk, fermented milk-based products, ice cream, fermented cereal-based products, milk-based powder, infant formula, tablets, bacterial liquid suspension, oral 8. A composition according to claim 7, selected from dry supplements, oral hydrous supplements, dry tube feeding or water containing tube feeding.

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