JP3761152B2 - Human glial cell line-derived neurotrophic factor promoter, vector containing the promoter, and compound screening method using the promoter - Google Patents

Abstract

The distal and proximal promoters for the human glial cell line-derived neurotrophic factor (GDNF) gene are provided. In addition, constructs comprising a human GDNF promoter and a reporter gene, a vector comprising the construct and a host cell comprising the vector are provided, as is a method for screening compounds capable of modulating the expression of GDNF by stimulating GDNF promoter-directed transcription.

Description

【０００１】
本発明は広く神経栄養因子に関する。さらに詳しくは、本発明はヒトグリア細胞株由来の神経栄養因子(GDNF)プロモーター、ヒトGDNFプロモーターを含むリポーター遺伝子構築物、およびパーキンソン病または他の中枢および末梢神経変性疾患の治療において治療上有効な化合物をスクリーニングするために、その構築物を用いる方法に関する。
【０００２】
パーキンソン病は、アメリカにおいて推定60万人から100万人が罹患している原因不明の進行性神経変性疾患である。この病気は明確な階級または人種の選択性がなく、男女共に罹患する。パーキンソン病は、筋振せん、筋脱力、強直、姿勢および平衡の変化に伴う遅い動き（運動緩徐）のような症状を特徴とする。治療しなければ、罹患した人は５〜10年の間に、恒常的なケアを必要とする硬直した無動症へと進行的に悪化する。運動性の欠如から起こる合併症によりしばしば死に至る。現在のところ、パーキンソン病の診断法はなく、あらゆる治療はむしろ病気を治すというよりも一時的に軽減するといったものである。病理生理学からみると、パーキンソン病では、黒質緻密部内の色素沈着ドーパミン作動神経、ならびに青斑核および迷走神経背側運動核のメラニン含有ニューロンが重度に失われている。パーキンソン病の主な神経病理的病変は、ドーパミン作動神経が失われて線条体におけるドーパミン作動神経末端が枯渇することである。この選択的なニューロンの損失により、線条体内で神経伝達物質ドーパミンの濃度が減少する。
【０００３】
現在、パーキンソン病の症状を緩和する最も有効な治療は、芳香族L-アミノ酸デカルボキシラーゼの末梢的に作用する阻害剤と併用してL-3,4-ジヒドロキシフェニルアラニン（L-DOPA）を経口投与することである。L-DOPAは、ドーパミンと異なり、血液脳関門を通して、ドーパミン作動神経のシナプス前細胞終末へと能動的に輸送されるが、その際L-DOPAが脱炭酸されてドーパミンとなり、輸送タンパク質によって貯蔵小胞に隔離される。特に疾患過程の初期に治療を開始した場合には、L-DOPA治療はパーキンソン病の全症状を軽減する。
【０００４】
トランスフォーミング増殖因子-―(TGF-―)スーパーファミリーの遠戚メンバーに当たる、グリア細胞株由来の神経栄養因子（GDNF）は本来、胚腹側中脳（embryonic ventral midbrain）のドーパミン作動性神経の培養において、ドーパミン取り込みおよび細胞生存の誘発能があることから単離された。GDNFはラットB49グリア細胞の条件培地(conditioned media)から精製され、シークエンシングされており(リン（Lin）ら (1993), Science 260, 1130)、ラットGDNF cDNAはクローニングされて、ヒトゲノムライブラリーからその遺伝子のタンパク質コード部分を単離するために用いられている（国際特許公開番号、国際公開公報第93/06116号; GenBank 寄託番号L19062およびL19063）。
【０００５】
GDNFは、その天然型がホモダイマーとして存在する約39 kDのグリコシル化タンパク質である。ヒトおよび齧歯類では、一個の遺伝子から異なるスプライシング型を生じる。いずれの型も、タンパク分解プロセシングのためのコンセンサスシグナルペプチド配列およびコンセンサス配列を含む。タンパク分解的切断によって同一の成熟した134個のアミノ酸残基型が得られる。
【０００６】
GDNFは、哺乳類神経系の発生および分化に重大な役割を担っている。GDNFは、胚中脳ドーパミン作動神経のドーパミン取り込みおよび細胞生存ならびに、広範にわたる中枢・末梢神経系および非神経系細胞集団の生存および/または分化を促進する。中枢神経系では、インビトロ研究によって、中脳のドーパミン作動神経、小脳プルキンエ神経、ならびに頭蓋および脊髄運動神経の生存におけるGDNFの発生的役割が裏付けられている。末梢神経系では、GDNFは、交感、副交感、知覚および自律神経を含む、多くの神経細胞集団の発生をサポートする。
【０００７】
GDNF mRNA転写産物がGDNF感受性神経標的領域に局在することは、標的由来神経栄養因子としてのインビボにおけるGDNFの機能と一致している。さらに、GDNF欠損マウスを使った研究により、末梢神経細胞発生におけるGDNFの多面的役割ならびに、胚発生の際の、腎臓の発生にGDNFが不可欠な役割をもつことが確認されている。
【０００８】
発生の際のGDNFの重要性は充分明らかにされているが、成人におけるGDNFの役割はあまり明確ではない。臨床的な重要性については、外因性GDNFは、成体ラット脳の軸索切除による変性、および齧歯類における黒質ドーパミン作動神経の1-メチル-4-フェニル-1,2,3,6-テトラヒドロピリジン(MPTP)誘発変性に対して、中脳のドーパミン作動神経を保護している。さらに、MPTPにより誘発されたパーキンソン病様症状を示すアカゲザルにGDNFを脳内投与すると、運動緩徐、筋強直および姿勢不安定性に有意な改善を示す。少なくとも一部これらの結果に基づき、パーキンソン病の治療に関して組換えGDNFを投与する臨床試験が行われている。
【０００９】
GDNF発現を調節する細胞および分子の働きについてはほとんど知られていない。細胞レベルにおいて、GDNF mRNAは神経細胞および星状細胞の双方に存在し、多くの神経栄養因子と同様、損傷組織ではその発現が上昇する。GDNF mRNAレベルは、興奮性アミノ酸に応答して、海馬神経、および海馬ならびに線条体の一次星状細胞において上昇する。
【００１０】
その相対的に大きいサイズのため、GDNFは血液脳関門を通過せず、脳内への直接投与が唯一の実行可能な投与手段となっている。このため、GDNFは脳内へ脳定位固定的（stereotaxic）に注入するか、またはGDNFを脳室内(intracerebroventricular: ICV)投与する必要があり、それによってGDNFの治療上の有用性は著しく制限される。一方、黒質神経を細胞死から保護する非侵襲的療法、例えば、内因性GDNFレベルおよび/またはその放出を特異的に増加させることを目的とした小分子は好ましいであろう。理想的には、そのような小分子を何らかの簡便な経路により投与して血液脳関門を通過させ、そしてGDNFの局所合成を増やすことができれば、それによってドーパミン作動神経の標的集団をパーキンソン病の危険にさらさないようにすることができる。そうした療法は、GDNFの実質内注射やICV注射、あるいはクモ膜下注射よりも脈動性が少なく、また侵襲性も低いであろう。
【００１１】
当技術分野ではGDNFの組織濃度を増加させる代替手段が求められている。そのような方法の一つは、転写レベルでGDNFの遺伝子発現を誘導することによって、内因性のGDNFレベルを高めることである。
【００１２】
従って、ヒトGDNF遺伝子から近位プロモーターおよび遠位プロモーターが初めて、同定され、シークエンシングされ、特徴付けされ、そしてクローニングされた。遠位および近位プロモーターは、真核細胞遺伝子調節エレメントに特徴的な配列をもっている。例えば、これらプロモーターは転写因子結合部位コンセンサス配列を含む。特定の態様において、遠位プロモーターは図3A〜3B(配列番号：1)の-62から-1位に記載のプロモーターヌクレオチド配列、図3A〜3B(配列番号：1)の-363から-1位に記載のプロモーターヌクレオチド配列、または図3A〜3B(配列番号：1)の-1635から-1位に記載のプロモーターヌクレオチド配列を含む。
【００１３】
さらに、プロモーターが、当技術分野で周知の様々な手法のいずれかにより検出可能なポリペプチドをコードするリポーター遺伝子に機能的に結合された組換え構築物が作製された。この構築物を、ヒト神経細胞およびグリア細胞にトランスフェクトさせ、プロモーターの制御下で遺伝子発現を刺激するか否かについて、候補化合物をスクリーニングすることができる。このようにして、本発明は、インビボでGDNF遺伝子発現を誘導できる化合物が同定される手段および方法を提供する。そのような化合物は、許容される薬学的製剤において哺乳類被験者に投与した場合、中枢および末梢神経変性疾患ならびに腎疾患、泌尿生殖器疾患、胃腸疾患、そして物理的神経外傷の神経変性後遺症の治療に有用である。
【００１４】
さらに、本発明はGDNFの発現を調節する化合物を同定する方法を提供する。本方法は、(a)リポーター遺伝子に機能的に結合されたヒト遠位GDNFプロモーターを含むDNA断片を細胞に導入する段階；(b)試験化合物を細胞と混合して、細胞をリポーター遺伝子が発現し得る条件下で培養する段階；そして(c)リポーター遺伝子産物の発現レベルが変化すれば、試験化合物がGDNF発現レベルを調節できることが示される、試験化合物の存在下および非存在下において発現されたリポーター遺伝子産物のレベルを比較する段階を含む。
【００１５】
本発明のこれらおよび他の態様は、本明細書の開示を鑑みて、当業者には容易に想起されると思われる。
【００１６】
本発明の実施には、特記しない限り、当業者の技術内にある通常のタンパク質化学および生化学手法、分子生物学、微生物学および組換えDNA技術が使用される。そのような手法は文献に詳記されている。例えば、サムブルック（Sambrook）ら, 「分子のクローニング：実験マニュアル（Molecular Cloning: A Laboratory Manual）」, 第2版(1989)；「DNAクローニング（DNA Cloning）」、第I巻、第II巻(グローバー（D.N. Glover）編、1985)；「オリゴヌクレオチド合成（Oligonucleotide Synthesis）」 (ゲイト（M.J. Gait）編1984)；「核酸のハイブリダイゼーション（Nucleic Acid Hybridization ）」(ハームス（B.D. Hames）およびヒギンス（S.J. Higgins）編、1984)；「動物細胞培養（Animal Cell Culture）」 (フレッシュネイ（R.K. Freshney）編、1986)；シュライフ（Schleif）、「分子生物学の実際の方法（Practical Methods in Molecular Biology ）」(Springer-Verlag, NY, 1981)；「固定細胞と酵素（Immobilized Cells and Enzymes）」 (IRL Press, 1986); 「PCR：実際のアプローチ（PCR: A Practical Approach）」 (マクファーソン（McPherson）ら編、(1991) IRL Press); パーバル（Perbal, B.）、「分子クローニングの実際の手引き（A Practical Guide to Molecular Cloning）」 (1984); 叢書Methods In Enzymology (クロウィック（S. Colowick）およびカプラン（N. Kaplan）編、Academic Press, Inc.)。
【００１７】
本明細書に挙げた、上記および下記の特許、特許出願および刊行物はすべて参照として本明細書に組み入れられる。
【００１８】
I. 定義および命名法
本発明を詳細に開示・記載する前に、本発明は特定のアッセイ形式、材料または試薬に限定されず、当然それらは変更可能であることを理解しておくべきである。本明細書に使用する用語は特定の態様だけを説明する目的のためであり、限定する意図ではないことも理解するべきである。
【００１９】
本明細書および特許請求の範囲において使用される、単数形(「a」「an」および「the」)は、文脈中で明らかにそうではないことを明記していない限り、複数の対象を含むことに留意しなければならない。従って、例えば、「GDNFプロモーター（a GDNF promoter）」を含むプラスミドまたはベクターと記載した場合、この用語にはそのようなプロモーターを複数含む複数のプラスミドまたは複数のベクターが含まれ、「ヒト細胞株（a human cell line）」と記載した場合、これはそのような細胞株を１以上含むことを意味し、「転写開始部位（a transcription initiation site）」と記載した場合、これは転写開始部位を1つ以上含むことを意味する。
【００２０】
本明細書および特許請求の範囲では、以下の意味を有すると定義される多数の用語が使用される。
【００２１】
「GDNFプロモーター」とは、RNAポリメラーゼに結合し、下流（3'方向）のコード配列の転写を開始することができるDNA調節領域である。本発明の目的のためのGDNFプロモーターは、一般に、転写開始起点の上流の5'隣接DNAにおける約50〜約200 bpまたはそれ以上のDNA断片である。このプロモーターはRNAポリメラーゼと開始複合体を形成して下流配列の転写を開始および推進する。開始複合体は、「エンハンサー」と呼ばれるエレメントを活性化することにより、または「サプレッサー」と呼ばれるエレメントを阻害することにより、改変することができる。「プロモーター」なる語は、特に断って明記しない限り、エレメントを活性化することおよび阻害することを含む。本発明の目的のため、プロモーター配列は、バックグラウンド以上の検出可能なレベルの転写を開始するのに必要な最小限の塩基またはエレメントを含む断片を含むように、その3'末端で転写開始部位（1または2以上）に結合し（しかし必ずしも異種5'-UTRによって提供可能な開始部位を含むとは限らない）、上流（5'方向）に伸びる。
【００２２】
さらに、本明細書で使用される「GDNFプロモーター」は、そのプロモーターがバックグラウンド以上の検出可能なレベルで転写を開始する能力を維持する限り、天然の配列に対して、欠失、付加および置換のような修飾を含む配列を意図する。これらの修飾は、部位特異的突然変異誘発を通じてのように意図的であってもよいし、あるいは天然の突然変異事象やPCR増幅によるエラーを通してなど偶発的なものであってもよい。
【００２３】
例えば、以下の実施例に記載するように、また、添付図面に示すように、多数の転写因子に対するコンセンサス結合部位は、本明細書に記載のGDNFプロモーター中に見出されており、上皮増殖因子受容体転写因子（ETF）、egr1およびegr2（例えば、リウ（Liu）ら、(1996), Crit. Rev. Oncogen. 7, 101参照)のような 初期増殖応答（early growth response: egr）ファミリーメンバー、 Sp1（例えば、ダイナン（Dynan）ら(1983) Cell 35, 79; ブリッグス（Briggs）ら、 (1986), Science 234, 47; ハーゲン（Hagen）ら、 EMBO J. 13, 3843参照)、CREB/ATFファミリーメンバー（例えば、パラバッシリオウ（Papavassiliu） (1994), Anticancer Res. 14, 1801参照)、AP-2（例えば、ミッチェル（Mitchell）ら、(1987), Cell 50, 847; イマガワ（Imagawa）ら (1987), Cell 51, 251;ウィリアムス（Williams）ら、(1988), Genes Dev. 2, 1557参照)、核因子κB(NF-κB)（例えば、バエウエール（Baeuerle）ら、(1996), Cell 87, 13; バルディン（Baldwin）ら、(1996), Ann. Rev. Immunol. 14, 649参照)、yin-yang-1 (YY-1)およびGC因子（GCF）に対する結合部位が挙げられる。ETF、GCFおよびYY-1のようなこれら因子のうちのある因子は転写を抑制する。従って、プロモーター配列に機能的に結合された遺伝子の転写を高めるためには、これら因子の結合部位を含む一またはそれ以上の領域の欠失または変異（図3A〜3Bおよび4A〜4Cに明記されている）が望ましい場合がある。
【００２４】
例えば、遠位プロモーターに関して、図7に示すように、そして実施例に記載のように、エキソンIに関して番号を付した-62位で末端を切断したプロモーター配列（例えば、図7の-62から-1位の配列を含む）は、ヒト神経芽細胞腫SK-N-AS細胞において使用すると、高い活性を維持する。従って、本発明の目的のための遠位GDNFプロモーターは、そのプロモーターが所定の細胞株においてバックグラウンド以上の検出可能なレベルで転写を開始する能力を保持している限り、図7に記載された欠失のどれを含んでいてもよいし、並びに、例えば、-63、-194、-308、-363などの位置で末端を切断したプロモーター配列のような介在トランケーション（末端切断）を含んでもよい。本明細書に使用される「GDNFプロモーター」の定義から具体的に除外されるのは、エキソンIで始まり、エキソンIの上流に続くヒトGDNF配列に対応するマウスGDNF配列部分と完全に一致する配列である（例えば、GenBank登録番号D88350S1参照）。
【００２５】
「遠位」GDNFプロモーターは、ヒトGDNF遺伝子のエキソンIに直ちに隣接し、かつ、その上流にあるGDNFプロモーターである。「中位」GDNFプロモーターは、遠位GDNFプロモーターの下流にあって、ヒトGDNF遺伝子のエキソンIIへ直ちに隣接し、かつ、その上流にあるGDNFプロモーターである。「近位」GDNFプロモーターは、エキソンIIの下流にあって、ヒトGDNF遺伝子のエキソンIIIa+IIIb（本明細書では「エキソンIII」ともいう）の上流にあるGDNFプロモーターである。本明細書に使用するように、「近位GDNFプロモーター」なる語句は、別の意味であると明記されない限り、中位GDNFプロモーターおよび近位GDNFプロモーターの両方を含むと解釈される。ヒトGDNF遺伝子とプロモーターのマッピングについては以下に詳細に記載する。
【００２６】
「リポーター遺伝子」は、発現の際、適当な条件で細胞を同定することができるように、リポーター遺伝子を発現する細胞に表現型を与える遺伝子である。例えば、リポーター遺伝子は、通常のアッセイ法で容易に検出または測定できるポリペプチド産物を産生してもよい。この特徴を与える当技術分野に既知の適当なリポーター遺伝子としては、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ(CAT活性)、β-ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリフォスファターゼ、ヒト成長ホルモン、緑色蛍光タンパク質（GFP）のような蛍光タンパク質などをコードする遺伝子が含まれる。実際、例えば、酵素免疫測定法（ELISA）のようなイムノアッセイにより、または、検出可能な生成物に基質を酵素的に変換することにより容易に測定できるタンパク質または酵素をコードする遺伝子であって、かつ、宿主細胞では実質的に発現されない（バックグラウンドなしの特異的発現）遺伝子であれば、プロモーター活性を調べるリポーター遺伝子として使用することができる。本発明において使用される他のリポーター遺伝子としては、本質的な細胞機能を阻害する化学物質または他の物質の存在下または非存在下での増殖能に基づいて細胞を選択できる遺伝子が含まれる。従って、適当なマーカーとしては、薬剤耐性もしくは薬剤感受性を与えるか、または、適当な選択培地でその細胞を増殖させる場合に、リポーター遺伝子を発現するそれら細胞の抗原特性を変化させるタンパク質をコードする遺伝子が挙げられる。例えば、リポーター遺伝子には、一またはそれ以上の細胞傷害抗体または薬剤含有培地で増殖する能力によって細胞を選択する細胞傷害性および薬剤耐性マーカー；特定の栄養源または添加剤の添加または無添加による、定められた培地での増殖能によって細胞を選択する栄養要求性マーカー；および例えば、唯一の炭素源として適当な糖を含有する特定の培地での増殖能によって細胞を選択する代謝マーカーが含まれる。これらのリポーター遺伝子およびその他のリポーター遺伝子は当技術分野では周知である。
【００２７】
「リポーター遺伝子産物レベルの変化」は、候補化合物に暴露されない細胞で発現されたリポーター遺伝子産物のレベル、および/または、対照化合物に暴露された細胞に対して、候補化合物に暴露された細胞中のリポーター遺伝子産物の発現レベルを比べることにより示される。このレベルの変化は、例えば、分光光度計、蛍光分光光度計、発光計（luminometer）などを用いて測定することにより定量的に測定することができ、一般にバックグラウンドに対するレベルの統計的に有意な増加または減少を表す。しかしながら、そのような変化は定量的な測定を行うことなく、可視化することによって簡単に知ることもでき、それは、例えば、リポーター遺伝子が発色性基質によって着色コロニーを形成する能力を細胞に与えるような場合である。
【００２８】
本明細書に使用する「発現」という用語は、転写および翻訳プロセスの両方、すなわち、メッセンジャーRNAの産生および/またはそれからタンパク質を産生することの両方を意図する。
【００２９】
「パーキンソン病様症状」とは、筋振せん、筋脱力、強直、運動緩徐、姿勢および平衡の変化、痴呆および一般にパーキンソン病または他の神経変性疾患に伴う同様の症状を含む。
【００３０】
本明細書に使用する「ポリヌクレオチド」または「オリゴヌクレオチド」という用語は、リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドのいずれかであって、あらゆる長さのヌクレオチドのポリマー体を意味する。この用語は、分子の一次構造を指すにとどまる。従って、この用語には、二本鎖および一本鎖DNAならびに二本鎖および一本鎖RNAが含まれる。この用語はさらに、メチル化および/またはキャップ形成によるような改変、およびポリヌクレオチドの未改変形態も含む。
【００３１】
「組換え宿主細胞」、「宿主細胞」、「細胞」、「細胞株」、「細胞培養」およびその他単細胞体として培養される微生物、または、より高等な真核細胞株を指すそのような用語は、そのDNAが細胞に導入される方法またはその後の細胞処理によらず、組換えベクターまたは他のトランスファーDNAのレシピエントとして用いることができる、もしくは用いられていた細胞を指す。この用語はトランスフェクトされているもとの細胞の子孫を含む。初代培養の細胞ならびに卵母細胞のような細胞もまたレシピエントとして用いることができる。
【００３２】
「ベクター」とは、付着セグメントの複製および/または発現を生じるような、もう一つのポリヌクレオチドセグメントが付いているレプリコンである。この用語には発現ベクター、クローニングベクターなどが含まれる。
【００３３】
「コード配列」とは、mRNAに転写されポリペプチドに翻訳されるポリヌクレオチド配列である。コード配列の境界は、5'末端の翻訳開始コドンおよび3'末端の翻訳終止コドンによって決定される。コード配列には、mRNA、cDNA、合成DNAおよび組換えポリヌクレオチド配列が含まれるが、これらに限定しない。またコード配列がイントロンによって中断しているゲノムDNAも含まれる。
【００３４】
「機能的に結合された」とは、記載された成分がその意図されたやり方でそれらを機能させ得る関係にある状況を指す。従って、例えば、コード配列と「機能的に結合された」プロモーターのような制御配列は、制御配列と適合可能な条件下、コード配列が発現されるように配置される。コード配列は、ポリヌクレオチドの転写を指示する制御配列と機能的に結合されていてもよく、それによってポリヌクレオチドが宿主細胞で発現される。制御配列は、その発現を指示するように機能する限り、コード配列と隣接している必要はない。従って、例えば、介在する未翻訳転写配列は、プロモーター配列とコード配列との間に存在することができ、そのプロモーター配列は、それでもなおコード配列と「機能的に結合されている」と考えられる。機能的に結合されたGDNFプロモーターは、適当なリーディングフレームでこれと結合した核酸分子の転写に指示を与える。
【００３５】
「トランスフェクション」という用語は、挿入に使用される方法、または挿入されたポリヌクレオチドの分子形態とは関わりなく、外因性ポリヌクレオチドを宿主細胞に挿入することを指称する。この中には、ポリヌクレオチド自体の挿入および外因性ポリヌクレオチドを含むプラスミドまたはベクターの挿入が含まれる。外因性ポリヌクレオチドは、その細胞により直接転写・翻訳され、非組み込みベクターとして、例えば、プラスミドとして維持されるか、または、宿主ゲノムへ安定に組み込まれてもよい。
【００３６】
「トランスフェクション」は一般に、真核細胞に関して使用されるのに対し、「形質転換」なる用語は、原核細胞へのポリヌクレオチドの挿入を指すのに使用される。
【００３７】
「単離された」という用語は、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドに関する場合、表記の分子が他の同様な生物学的マクロ分子を実質的に欠如する状態で存在することを意図するものである。本明細書に使用する「単離」なる用語は、組成物の少なくとも75重量%、より好ましくは少なくとも85重量%、さらに好ましくは少なくとも95重量%、そして最も好ましくは少なくとも98重量%が単離ポリヌクレオチドまたはポリペプチドであることを意味する。特定のポリペプチドをコードする「単離ポリヌクレオチド」とは、対象ポリペプチドをコードしない他の核酸分子を実質的に含まないポリヌクレオチドを指称する。しかしながら、その分子は、本明細書に定義するように、機能的および/または構造的に保存的突然変異を含んでもよい。
【００３８】
二個のポリヌクレオチド配列またはポリヌクレオチド配列の二個の断片またはセグメントは、ヌクレオチドの少なくとも約65重量%、好ましくは少なくとも約75重量%、より好ましくは少なくとも約80〜85重量%、そして最も好ましくは少なくとも約90〜95重量%以上が分子の規定の長さにわたってマッチする場合、「実質的に相同」である。本明細書において使用するように、実質的な相同体はまた、特定のポリヌクレオチド配列に対する同一性を示す配列をいう。実質的に相同であるポリヌクレオチド配列は、例えば、その特定の系に合わせて規定されたストリンジェントな条件下、サザンハイブリダイゼーション実験で同定することができる。適当なハイブリダイゼーション条件を定めることは当技術分野の範囲内である。例えば、上記サムブルック（Sambrook）ら；「DNAクローニング（DNA Cloning）」、第I巻、第II巻、前記；「核酸のハイブリダイゼーション（Nucleic Acid Hybridization）」、前記参照。
【００３９】
核酸配列の同一性を決定する他の技術は当技術分野において周知であり、対象とするポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を決定し、これを第二の塩基配列と比較することを含む。ウイスコンシン配列分析パッケージ第8版（ウィスコンシン州マジソンのGenetics Computer Groupから入手可）で利用できるプログラム、例えば、BESTFIT、FASTAおよびGAPプログラムは、二つのポリヌクレオチド間の同一性を計算することができる。さらに、データベース検索ツールBLAST (アルツシュル（Altschul）ら (1990)、J. Mol. Biol. 215, 403-410)を使用して、遺伝子データベースを検索し、所定の配列とデータベースに存在する配列との同一性パーセントを決定してもよい。配列間の同一性または類似性を計算する他のプログラムは当分野に既知である。
【００４０】
GDNFプロモーター配列と「機能的に同等な」配列とは、対応するGDNFプロモーターと同じ方法で機能する配列である。従って、本明細書に記載されている、例えば、遠位GDNFプロモーターに対して「機能的に同等な」プロモーター配列は、バックグラウンドのレベル以上において適当なリーディングフレームにおいて結合する核酸分子の転写を指示できる配列である。
【００４１】
II. 一般的な方法
本発明において提供されるのは、ヒト遠位GDNFプロモーターおよび近位GDNFプロモーターとを含む単離DNA、およびGDNFプロモーターを含むリポーター遺伝子構築物である。本発明はまた、前記構築物を用いてGDNFプロモーター誘導活性について化合物をスクリーニングする方法、この構築物で形質転換またはトランスフェクトされた細胞、ヒトGDNFプロモーター誘導物質として同定される化合物、およびヒトGDNFプロモーター誘導物質として同定された化合物の投与により、パーキンソン病様症状を示す被験者を治療する方法も含むものである。
【００４２】
実施例1で詳細に述べるように、ヒトGDNF遺伝子（図1参照）のエキソンIおよびその上流にある遠位プロモーターは、以下の一般的な構成に従って、同定、増幅、クローニング、そしてシークエンシングを行うことができる。ヒト組織にGDNF mRNAが存在することは、ラットGDNF cDNAの5'末端に基づくオリゴヌクレオチドプライマーを用いる逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（「RT-PCR」）によって証明される。ヒトGDNF遺伝子配列のPCR同定は、ヒトゲノムまたはcDNAライブラリーからの配列を増幅することを伴う。PCR用の縮重または非縮重オリゴヌクレオチドは、ラットGDNFの配列またはヒトGDNFの一部と実質的に相同であることが分かっている哺乳類のGDNF配列に基づいて作ることができる。そのようなPCR反応産物は、ゲル電気泳動によりサイズに従って選択し、適当なベクターにクローニングし、クローニングしたDNAをシークエンシングしてGDNFプロモーター配列を同定してもよい。
【００４３】
さらに詳細には、PCRはDNA分子内の望ましい配列の反対末端がマッチする短いオリゴヌクレオチドプライマー（一般に長さ10〜20個のヌクレオチド）を使用する。プライマー間の配列が分かっている必要はない。最初の鋳型はRNAかDNAのどちらかであってもよい。RNAを使用する場合、まずcDNAへ逆転写する。次いで加熱のような周知技術を用いてcDNAを変性し、適当なオリゴヌクレオチドプライマーを過剰モル添加する。
【００４４】
プライマーを相補標的ポリヌクレオチドとハイブリダイズさせた後、デオキシヌクレオチド三リン酸またはヌクレオチド同族体の存在下、DNAポリメラーゼを用いてプライマー伸長を行う。得られた生成物には、元の鎖の新しく合成された相補体と5'末端で共有結合したそれぞれのプライマーが含まれる。複製された分子を再び変性し、プライマーとハイブリダイズすること等を生成物が充分に増幅されるまで行う。そのようなPCR法は、例えば、米国特許第4,965,188号、第4,800,159号、第4,683,202号および第4,683,195号に記載されており、参照としてその全文が本明細書に組み入れられる。PCR産物をクローニングし、プライマー伸長鎖の分離により誘導される増幅DNAを含むクローンを選択する。選択は、元のプライマーをハイブリダイゼーションプローブとして用いて行うことができる。
【００４５】
上記の方法を用いると、遺伝子の当該部分の翻訳起点のすぐ上流にあるヒト遺伝子配列（本発明では「エキソンIII」とよぶ）が、スプライス連結部アクセプター部位が認められる点まで、ラットおよびマウスcDNAと相同性であることが判明した。しかしながら、スプライス連結部アクセプター部位上流のヒトcDNA配列の多様性から、本明細書ではエキソンIという他のエキソン（1または複数）が存在することが示された。エキソンIの場所は、PCRにより、エキソンIII開始の約5 kb上流であることが分かった。約9.4 kbのEcoRI断片は、サザンブロット分析を用いて、エキソンIとエキソンIIIの両方を含むと同定された。約9.4 kbのEcoRI断片をクローニングし、ベクターpBK-CMVで増殖させ、それから切り出した後シークエンシングを行った。本断片のヌクレオチド配列分析は、(1)ラットGDNF cDNAの5'末端に対し90%よりも高い相同性をもつエキソンI配列が存在すること、(2)エキソンI配列の3'末端にある5'スプライス供与体部位、(3)エキソンIがエキソンIII起点の約5 kb上流にあること、そして(4)該断片は、マウスGDNF遺伝子の限定された領域と約79%一致するエキソンIの上流にある領域をもっていること（エキソンIからエキソンIの上流140 bpまで、GenBank登録番号D88350S1）を示した。GDNFプロモーター転写起点はGDNF cDNAの5'末端分析により決定した。
【００４６】
ヒト近位GDNFプロモーターは、前記と同様にして単離することができる。特に近位プロモーター由来のcDNAは、実施例4で詳細に記載するように、ヒトGDNFをコードするDNAに基づくオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、ヒト胎児腎、脳または骨格筋のポリA+ RNAからRT-PCR分析により同定・増幅することができる。
【００４７】
一旦産生されたDNAは次に、適当な宿主細胞に複製のためのベクターに組み込んでもよい。ヒト遠位GDNFプロモーター、ヒト近位GDNFプロモーターおよびヒト遠位・近位両方のGDNFプロモーターは、例えば、ルシフェラーゼ遺伝子のようなリポーター遺伝子の上流にある適当なベクターにクローニングしてもよい。GDNFプロモーターとルシフェラーゼとの構築物をそれぞれヒト細胞株にトランスフェクトし、これはこの後にプロモーター調節ルシフェラーゼ発現を調べるために、およびルシフェラーゼ産生を指標とするヒトGDNFプロモーター誘導活性について候補化合物をスクリーニングするために使用することができる。もちろん、ベクター構築の他の方法ならびに種々のリポーターおよび細胞株も、本発明のプロモーター活性の測定に使用することができる。
【００４８】
特に、ベクター構築には当分野で既知の方法が使用される。一般に、部位特異的なDNA切断は、適当な制限酵素を用いて、通常これら市販の酵素のメーカーが指定する条件下で処理することによって行われる。制限酵素とのインキュベーション後、タンパク質を変性・抽出して、沈降によりDNAを回収する。切断断片は、当業者に知られている方法に従い、例えば、ポリアクリルアミドまたはアガロースゲル電気泳動法を用いて、分離してもよい。
【００４９】
粘着末端切断断片は、混合物中に存在する適当なデオキシヌクレオチド三リン酸（dNTPs）の存在下、大腸菌のDNAポリメラーゼ1（クレノウ）を用いて平滑末端化することができる。S1ヌクレアーゼによる処理を使用してもよく、これによって一本鎖DNA部分の加水分解を生じる。
【００５０】
ライゲーションは、T4 DNAリガーゼおよびATPを使用して、標準的な緩衝液および温度条件とを用いて行う。あるいは、望まない断片の制限酵素消化を用いてライゲーションを防止することができる。ライゲーション反応混合物を適当な宿主に形質転換またはトランスフェクトし、成功したトランスフェクタント/トランスフォーマント（形質転換細胞）を薬剤耐性またはその他のマーカーにより選択する。
【００５１】
例えば、標準的なベクター構築物には、一般にリポーターおよび/または選択マーカーエレメントが含まれる。そのようなエレメントは、適当な条件でその細胞を同定することができるように、マーカーを発現する細胞に表現型を与える遺伝子である。一般に、リポーター遺伝子および選択マーカーは、基本的な細胞機能を阻害する化学物質または他の作用物質の存在下または非存在下での増殖能に基づいて、形質転換細胞を選択する。従って、適当なマーカーには、薬剤耐性もしくは感受性を与えたり、色を与えたり、または、適当な選択培地で細胞が増殖する時に選択マーカーを発現するそれら細胞の抗原特徴を変化させたりするタンパク質をコードする遺伝子が含まれる。例えば、選択マーカーには、一つ以上の細胞傷害物質、抗生物質または薬剤を含有する培地での増殖能によって細胞を選択する細胞傷害性マーカー、抗生物質マーカーおよび薬剤耐性マーカー；特定の栄養源または添加剤の添加または無添加で、定められた培地での増殖能によって細胞を選択する栄養要求性マーカー；例えば、唯一の炭素源として適当な糖を含有する定められた培地での増殖能によって細胞を選択する代謝性マーカー；または、色素産生基質上での着色コロニー形成能を細胞に与えるかまたは細胞に蛍光を生じさせるマーカーが含まれる。
【００５２】
次に、当業者に公知の方法に従って、トランスフェクタント/トランスフォーマント（形質転換細胞）からプラスミドを作製し、クレウェル（Clewell）ら(1972), J. Bacteriol. 110, 667に報告されているように、通常その後にクロラムフェニコール増幅を行うことができる。DNAを単離して、通常は制限酵素分析および/またはシークエンシングにより分析を行う。シークエンシングは、さらにメッシング（Messing）ら(1981), Nucleic Acid Res. 9, 309にも記載されている、サンガー（Sanger）ら(1977), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74、5463の周知のジデオキシ法、または、マキサム（Maxam）ら、(1980), Meth. Enzymol. 65, 499に報告された方法によって行ってもよい。
【００５３】
次いで、宿主細胞を本発明のベクターで形質転換またはトランスフェクトする。ベクターは、プラスミド、ウイルス粒子、ファージなどの形態であってよい。宿主細胞は、プロモーターの活性化、トランスフォーマント/トランスフェクタントの選択等に適するよう通常の栄養培地を改変した培地で培養することができる。温度、pHなどの培養条件は、一般に選択された宿主細胞についてこれまで使用されている条件と同様であり、当業者には既知である。
【００５４】
原核宿主細胞および真核宿主細胞の双方を望ましいオリゴヌクレオチド断片のクローニングに用いることができる。例えば、原核宿主細胞のなかでは大腸菌がしばしば用いられる。しかしながら、望ましい場合には、バシラス（Bacillus）、シュードモナス（Pseudomonas）菌株などのような原核宿主細胞を使用してもよい。原核宿主細胞適合性トランスファーベクターは、例えば、アンピシリンおよびテトラサイクリン耐性を与えるオペロンを含むプラスミドpBR322由来のもの、および抗生物質耐性マーカーを与える配列も含む種々のpUCベクターであることができる。これらのマーカーを使用して、選択により成功した形質転換体を得ることができる。
【００５５】
真核宿主細胞には培養系の酵母および哺乳類細胞が含まれる。通常使用される酵母宿主は、ピチア・パストリス（Pichia pastoris）、サッカロミセス・セレビジエ（Saccharomyces cerevisiae）およびS.カールスベルゲンシス（S. carlsbergensis）である。酵母と適合するベクターは、栄養要求性変異体に原栄養要求性を、または野生型株に重金属抵抗性与えることによって、成功した形質転換体を選択できるマーカーをもっている。酵母適合性ベクターとしては、2-_複製起点（ブローチ（Broach）、(1983), Meth. Enzymol. 101, 307)、GEN3とARS1との組合せ、または、適当な断片を宿主細胞ゲノムに組み込んだ結果生じる配列のような、複製を確実にする他の手段を使用することができる。
【００５６】
クローニング用宿主として利用可能な哺乳類の細胞株は当分野に既知であり、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションのような寄託機関から入手することができる。これらは、ヒトグリオブラストーマ細胞、神経芽細胞腫細胞、HeLa細胞、ヒト胎児腎(HEK)細胞、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞、ベビーハムスター腎(BHK)細胞などを含むが、これらに限定されない。哺乳類細胞において発現される遺伝子は、上記のサムブルック（Sambrook）らに記載のSV40から由来するもののような、転写終了配列およびポリアデニル化配列、ならびにウシ成長ホルモンターミネーター配列を必要とすることがある。発現を増加させるエンハンサー配列も含んでもよく、リポーター遺伝子を増幅させる配列もまた望ましい。これらの配列は当技術分野に既知であり、例えば、コード配列に隣接するマウスジヒドロ葉酸レダクターゼ(dhfr)遺伝子が含まれる。次に、細胞を、dhfr-欠損細胞におけるメトトレキセート耐性に関して選択を行うことができる。例えば、ウルラウブ（Urlaub）ら、（1980), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 4216-4220; リンゴールド（Ringold）ら、(1981), J. Mol. and Appl. Genet. 1, 165〜175参照。哺乳類細胞での複製に適当なベクターは、ウイルスレプリコンまたは、GDNFプロモーターおよびリポーター遺伝子をコードする配列を含む適当な配列を宿主ゲノムへ確実に組み込む配列を含んでもよい。
【００５７】
ポリヌクレオチドを導入する方法は、当分野に周知の方法を用いて両生動物細胞のような系、サマーズ＆スミス（Summers & Smith）、Texas Agricultural Experiment Station Bulletin No. 1555 (1987)に記載の方法を用いて昆虫細胞のような系などに、導入する方法が知られているように、他の真核細胞系もまた既知である。
【００５８】
形質転換またはトランスフェクションは、当事者に既知の、宿主細胞によるポリヌクレオチドの直接取り込みによってウイルスにポリヌクレオチドをパッケージングし、そのウイルスで宿主細胞を形質導入することなどを含む、宿主細胞にポリヌクレオチドを導入する既知方法のいずれで行ってもよい。そのような方法としては、DEAE-デキストラン媒介トランスフェクション、リン酸カルシウム沈殿法、ポリリジン-もしくはポリオルニチン媒介トランスフェクション、または、リン酸ストロンチウム、ベントナイトおよびカオリンを含む珪酸アルミニウム、酸化クロム、珪酸マグネシウム、タルクなど、その他不溶性無機塩を用いる沈殿法、エレクトロポレーション、ソノポレーション、プロトプラスト融合法、リポフェクション、ペプトイド輸送またはマイクロインジェクションがある。細胞を形質転換しトランスフェクトする手法の検討については、例えば、上記サムブルック（Sambrook）らを参照のこと。選択された形質転換またはトランスフェクション技法は一部、使用する宿主細胞に依存し、当業者により日常的に決定されるものである。
【００５９】
組換え宿主細胞の中に発現されたりまたはそれから単離されるヒトGDNFプロモーター・リポーター遺伝子構築物は、化合物がリポーター遺伝子産物発現を刺激することができるか否か、およびGDNFのインビボ発現を刺激することができるか否かを調べる候補化合物のスクリーニングに使用することができる。ヒトGDNFプロモーター制御リポーター遺伝子発現を刺激する化合物を同定する好ましい一方法は、リポーター遺伝子と機能的に結合されたGDNFプロモーターを含むDNA構築物を細胞に導入する段階、供試化合物をこの細胞と混合する段階、およびリポーター遺伝子産物の発現レベルを測定する段階を含む。リポーター遺伝子産物の発現レベルが変化すれば、その化合物がGDNF発現レベルを調節できることを示している。リポーター遺伝子構築物は、好ましくは細胞の染色体DNAへ安定に組み込まれるが、染色体外エレメントの形では本明細書に開示した目的において機能的でもある。細胞は真核細胞、好ましくは哺乳類の細胞、より好ましくはヒト細胞、さらにより好ましくはGDNFを発現するヒト細胞、または、哺乳類遺伝子プロモーターの調節的影響下、構造遺伝子を発現するために必要なエレメントを含む如何なる細胞であってもよい。本明細書の実施例では、プロモーター/リポーター構築物の宿主として、ヒトグリオブラストーマU-87 MGおよびヒト神経芽細胞腫SK-N-AS細胞を用いたが、その理由はこれらの細胞が、ELISAによる定量ではGDNFを生成し、従ってRT-PCRによって確認するとGDNF mRNAを産生したためである。
【００６０】
従って、例えば、供試化合物は、ルシフェラーゼ発現の調節能について、またはヒトGDNFプロモーター・ルシフェラーゼ遺伝子構築物によってトランスフェクトした哺乳類宿主細胞において、例えば、フォースコリン(forskolin)などのヒトGDNF誘導化合物によってリポーター遺伝子発現の調節を干渉することができるかまたは増強することができるかについて評価する。
【００６１】
リポーター遺伝子に機能的に結合されたヒトGDNFプロモーターの活性化をもたらす細胞内シグナルの発生により、候補化合物がリポーター遺伝子発現を誘発するか否かを評価するには、無処理細胞のほうが好ましいが、候補化合物の有効性を調べるためには透過細胞を使用してもよい。ヒトGDNFプロモーター・リポーター遺伝子構築物をもつ宿主細胞の透過化は当分野に周知の方法により行われる。
【００６２】
候補化合物はまた、ハームス（Hames）ら編、「遺伝子の転写：実際のアプローチ（Gene Transcription: A Practical Approach）」 (IRL Press, 1993)における、シエラ（Sierra）ら「分化組織からの核抽出物によるインビトロ転写(In Vitro transcription with nuclear extracts from differentiated tissues)」125〜152頁に記載のインビトロ転写アッセイにおいて、GDNFプロモーター遺伝子構築物を用いてGDNF発現を調節するか否かを評価してもよい。
【００６３】
GDNFプロモーターまたはその断片と結合することによってGDNF発現を調節する化合物は、例えば、ゴッテスフェルド（Gottesfeld）ら(1997), Nature 387, 202〜205およびヘグイ（Heguy）ら(1995), Gene Expression 4, 337〜344に記載の手法を用いて評価することができる。
【００６４】
従って、ヒトGDNFプロモーター・リポーター遺伝子構築物でトランスフェクトされた細胞においてリポーター遺伝子の発現を刺激することが分かっている物質(agents)は、パーキンソン病、筋萎縮性軸索硬化症、てんかん、アルツハイマー病、あるいはその他、天然GDNFの欠如またはレベルの低下が病因となる症状または病気を含むが、これらに限定しないいくつかの神経変性疾患の有望な治療剤と考えられる。さらに、そのようなは物質(agents)は、出生前の末梢神経発生ならびに胎児発生期の腎発生をサポートする有望な治療剤である。治療剤の有効性は、当分野に既知である多数の上記疾患動物モデルのいずれかで試験されている。
【００６５】
例えば、最も広く使われているパーキンソン病の動物モデルでは、通常、毒素の投与によってドーパミン作動神経の神経変性を模倣している。6-ヒドロキシドーパミン(6-OHDA)をマウスまたはラットの黒質に一側性に注入すると、同側の線条体および黒質緻密部には神経の損失が生じるが、反対側半球にはほとんど変化がない。同様に、メタンフェタミン誘発神経傷害性は、ドーパミン作動神経およびセロトニン作動神経の神経変性を生じ、これは、当業者によればヒトの状態と密接に関連すると考えられている。薬剤の有効性は、アポモルフィン誘発旋回行動を用いた行動結果により評価される。
【００６６】
もう一つのパーキンソン病モデルは、神経毒N-メチル-4-フェニル-1,2,3,6-テトラヒドロピリジン(MPTP)を用いて構築される。マウス、ラットおよびサルにMPTP を投与した。サルにMPTPを投与すると、黒質緻密部および線条体においてドーパミン作動性およびセロトニン作動神経の損失が起こるばかりでなく、無動や硬直姿勢のような、ヒトパーキンソン病患者に見られるそれと同様な行動的症状が起こる。
【００６７】
上記パーキンソン病の動物モデルに対し、ドーパミン作動神経細胞数が徐々に減少することが証明されている多数のマウス近交系を利用することができる。例えば、その行動特性がパーキンソン病に罹った患者と類似するD2受容体欠損マウスは、相同組換えによって作出された。フィッツジェラルド（Fitzgerald）ら、(1993), Brain Res. 608, 247-258。第二の例は、40%までの間中、中脳のドーパミン作動神経の数が時と共に40％まで減少するウィーバー（weaver）変異マウスである。ベリナ（Verina）ら、(1997), Exp. Brain Res. 113, 5-12;アーデルブレヒト（Adelbrecht）ら、(1996), Mol. Brain Res. 43, 291-300; ミツモト（Mitsumoto）ら、(1994), Science 265, 1107-1110。
【００６８】
他の神経変性疾患の動物モデルも記載されており、本明細書に記載する通り、ヒトGDNFプロモーター・リポーター遺伝子でトランスフェクトした細胞においてリポーター遺伝子の発現を調節することが分かっている作用物質の治療効果を評価するために有用である。例えば、マーチン（Martin）ら、(1995), Brain Res. 683, 172-178には、てんかんの動物モデルが記載されており、マテソン（Matheson）ら(1997), NeuroReport 8, 1739-1742およびオッペンハイム（Oppenheim）ら、(1995), Nature 373, 344-346には、物理的外傷から起こる神経変性モデルが記載されており、さらに、サゴット（Sagot）ら、(1996), J. Neurosci. 16, 2335-2341には動物の運動神経変性モデルが記載されている。
【００６９】
このように同定された作用物質は、液体の溶液または懸濁液、錠剤、ピル、粉末剤、軟膏、坐剤、ポリマーマイクロカプセルまたは微小胞体、リポソーム、および注射可能または持続注入可能な溶液などの様々な剤形で治療組成物に処方することができるが、これらに限定されない。好ましい剤形は、投与方法および標的とされる疾病のタイプに依存する。組成物は好ましくは、ヒト血清アルブミン、イオン交換剤、アルミナ、レシチン、リン酸塩のような緩衝物質、グリシン、ソルビン酸、ソルビン酸カリウムおよび硫酸プロタミンなどの塩または電解質のような当分野に周知の薬学的に許容される溶媒、担体またはアジュバントも含む。適当な溶媒は例えば、水、生理食塩水、デキストローズ、グリセロール、エタノールなど、およびその組合せである。そのような組成物を実際に製造する方法は既知であり、当業者には明らかであろう。例えば、「レミントンの薬剤化学(Remington's Pharmaceutical Sciences), マック出版社(Mack Publishing Company)、ペンシルバニア州イーストン、第18版、1990年参照。
【００７０】
上記組成物は、静脈内、筋肉内、腹腔内、経口、リンパ内または皮下投与など通常の投与形態を用いて投与することができるが、これらに限定しない。
【００７１】
治療的有効量は、当業者により容易に決定されるものであり、また、疾病の重篤度および進行度、患者の健康および治療に対する応答、ならびに治療する医者の判断に依存するであろう。
【００７２】
パーキンソン病のような神経変性疾患の治療に有用な作用物質を同定するためにリポーター遺伝子構築物にヒトGDNFプロモーターDNAを使用することに加え、ヒトGDNFプロモーターは、例えば、診断目的のためにヒトGDNF発現に影響を及ぼす変異を検出するオリゴヌクレオチドプローブをデザインするために使用することができる。本明細書に用いられるように、「プローブ」なる用語は、上に定義したように、標的ポリヌクレオチドに存在する核酸配列と相補性の核酸配列を含むポリヌクレオチドを含む構造を指す。プローブのポリヌクレオチド領域はDNA、および/またはRNA、および/または合成ヌクレオチド同族体を含んでもよい。そのようなプローブは、インビトロのハイブリダイゼーションアッセイにおいて、ヒトGDNF野生型プロモーターをその変異体と識別するため、およびGDNFプロモーターにおける欠損の有無をスクリーニングするために有用であり、パーキンソン病または他の中枢性および末梢性神経変性疾患の診断薬となる可能性がある。
【００７３】
プローブは通常参照ポリヌクレオチドの約6〜8から約75個の隣接核酸を含み、一般には約10〜12から約50個の隣接核酸、そして好ましくは参照配列の約15〜20から約30個の隣接核酸を含む。特に、GDNFプロモーターのプローブはハイブリダイゼーションによって非反復配列を検出できる長さである。
【００７４】
従って、単離したヒト遠位GDNFプロモーターまたは単離した近位GDNFプロモーターの既定の一部を用い、切り出しのような慣用の標準的な方法を用いて、または、例えば、自動オリゴヌクレオチド合成法により、そのプロモーターとハイブリダイズする約6〜8以上のヌクレオチドのオリゴマーを作出することができる。そのようなオリゴマーは、例えば、パーキンソン病発症のリスクを有する人において変異GDNFプロモーターの有無をスクリーニングするために、または同様に異常な末梢神経発生または腎発生のリスクを有する胎児の出生前スクリーニングとして、有用である。
【００７５】
オリゴヌクレオチドプローブを診断試薬として使用する場合、血液、血清または羊水などの分析対象となる試験試料は、その核酸分画を抽出するように処理することができる。試料から得られた核酸は、ゲル電気泳動またはその他のサイズ分離法に付すことができ、または、核酸試料をサイズ分離することなくドットブロット法に供してもよい。次に、試料を検出可能な標識を付けたオリゴヌクレオチドプローブに暴露する。適当な標識およびプローブに標識を付ける方法は当分野に既知であり、ニックトランスレーションまたはキナーゼ化(kinasing)によって組み込まれる放射性標識、ビオチン、蛍光および化学発光プローブ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、β-ガラクトシダーゼのように検出可能な生成物の産生を触媒する酵素などが含まれるが、これらに限定しない。次に、試料から抽出した核酸を適当なハイブリダイゼーションストリンジェンシー条件下、標識プローブで処理する。
【００７６】
ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは、温度、イオン強度、処理時間およびホルムアミド濃度を含む、洗浄工程の際の多数の要因によって左右される(上記サムブルック（Sambrook）ら参照)。ハイブリダイゼーションは多くの手法により行うことができる。試料核酸の増幅は、必要ならば、例えば、リガーゼ連鎖反応(LCR)、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、Q-ベータレプリカーゼまたは当技術分野に周知の方法により行うことができる。次に、増幅された核酸は、これも当技術分野において周知のハイブリダイゼーションアッセイを用いて検出することができる。
【００７７】
GDNFプロモーターポリヌクレオチドまたはその一部は診断用キットに供することができる。例えば、GDNFプロモーターポリヌクレオチドと特異的にハイブリダイズできるオリゴマープローブは、標識していてもよいプローブ核酸配列を含む診断用キットにパッケージ化することができる。または、プローブを標識しない状態で提供することができ、標識用成分をキットに含めることができる。キットはまた、特定のハイブリダイゼーションプロトコールに必要であるまたは望ましい他の適した同封の試薬および物質、例えば、標準物質ならびにそのアッセイを行うための説明書を含んでもよい。
【００７８】
本発明は、好ましい特定の態様に関連して説明したが、上記説明ならびに以下の実施例は本発明を例示するものであって本発明の範囲を限定するものではないことを理解すべきである。本発明の範囲内の他の局面、利点および改変は本発明が属する技術分野の当業者には明らかであろう。
【００７９】
III. 実験
以下の実施例において、使用する数字(例えば、量、温度など)については正確を期すよう努めたが、なんらかの実験誤差はあると考えなければならない。特記しない限り、温度は常に摂氏で表し、圧力は大気圧かまたはほぼ大気圧である。
【００８０】
ポリヌクレオチドにおける所定の位置でヌクレオチド対のどちらか一方の選択的な存在を示すため、全体を通して以下の一文字ヌクレオチド略号を用いた。R = GまたはA；Y = CまたはT；S = CまたはG；W = AまたはT；M = AまたはC；そしてK = GまたはTである。
【００８１】
実施例1
ヒト遠位 GDNF プロモーターのクローニング
A. ヒト組織からのGDNF cDNAの証明
ヒトGDNF cDNAは、シャール（Schaar）ら、(1994), Exp. Neurol. 130, 387-393に記載の方法に従い、ラットGDNF cDNAの配列に基づくプライマー対を用いて、胎児脳、胎児腎、成人骨格筋のcDNAライブラリーから、PCRによって増幅した。センスおよびアンチセンスプライマー対はそれぞれ以下の通りであった。
5'-GGT CTA CGG AGA CCG GAT CCG AGG TGC-3'（配列番号：3）
および
5'-TCT CTG GAG CCA GGG TCA GAT ACA TC-3'（配列番号：4）
これらの結果は、少なくとも一つのヒトGDNF cDNAがラットGDNF cDNAと実質的に相同の5'末端をもっていることを示す。
【００８２】
ヒト胎児腎（huGDNF）からのPCRにより増幅したそのようなcDNA一個をpCR II(Invitrogen)にクローニングしてシークエンシングしたところ、以下に示す配列が得られた。
【００８３】

【００８４】
ヌクレオチド配列1〜27および675〜700はプライマー配列と相同である。ヌクレオチド50〜674間の配列は、GenBank登録番号L19062およびL19063と同一である。
【００８５】
B. ヒトゲノムDNAのPCRウオーキング
ヒトゲノムDNAのDNAウオーキングは、遺伝子特異的プライマー1および2としてそれぞれoutGDNF1プライマー(5'-CAG CAC CAG GCA GAC AGC-3' (配列番号：6))およびinGDNF1 (5'-GCC ACG ACA TCC CAT AAC TT-3' (配列番号：7))を用い、プロモーター・ファインダー（PromoterFinder）DNAウオーキングキット(Clontech Laboratories, Palo Alto, Calif., USA)によって行った。5%ジメチルスルホキシドの存在下、メーカーの指示に従ってPCRを行った。増幅したDNAをpCR II(Invitrogen, San Diego, Calif., USA)にクローニングしてシークエンシングした。増幅したセグメントのヌクレオチド配列を以下に示す。
【００８６】

【００８７】
ヌクレオチド699〜721（太字）は翻訳された配列を表し、ヌクレオチド702〜721はプライマーinGDNF1と相同である。ヌクレオチド671〜721は、ラットおよびマウスのGDNF cDNA(それぞれGenBank登録番号L15305およびU37372)に認められるヌクレオチドとの相同性が高い。本配列はヌクレオチド671から上流で分岐する。配列(YYYYYYYNY AGG)(配列番号：9)で示すスプライス連結部アクセプターと思われる部位は、ヌクレオチド671の上流近くにあり、そこでこの配列はラットおよびマウスのcDNAと分かれる。これはもう一つのエキソンがこの配列の前に存在することを示している。
【００８８】
C. ヒトGDNFのエキソンIおよびGDNFプロモーターのクローニングおよび同定 シンデルハウアー（Schindelhauer）、(1995), Genomics 28, 605〜607に記載されているように、プライマーGDNFg246F (5'-TAT GCC AGA GGA TTA TCC TGA TCA G-3' (配列番号：10))およびプライマーGDNFg246R (5'-TAG CCC AGA CCC AAG TCA GTG AC-3' (配列番号：11))を用いたPCRによって、P1バクテリオファージベクターpAd10sacBII (Du Pont Merck Pharmaceutical Company、ヒト***繊維芽細胞P1ライブラリー番号 1;スターンバーグ（Sternberg）、(1992), Trends in Genetics 8, 11-16)におけるヒトゲノムライブラリをプールしてスクリーニングし、ヒトGDNF遺伝子のエキソンIVを含むヒトゲノムクローンを同定した。
【００８９】
クローンDMPC-HFF#1-0575-F3、DMPC-HFF#1-0994-A6およびDMPC-HFF#1-1332-H5を同定して大腸菌NS3516株に形質転換した。これらのクローンからDNAを単離した後、その中にエキソンIIIが存在することを、プライマー番号 5188 (5'-CCC TGC TTG AAA CTC TGA CC-3' (配列番号：12)、実施例1Bに示す配列のヌクレオチド400〜419)およびプライマーinGDNF1 (上記実施例1B)を用いて、PCRにより以下のように確認した。反応混合物は、50 mM KCl、10 mM トリス-HCl (pH 8.3, 20℃)、1.5 mM MgCl₂、0.2 mM dNTP、各プライマー1μMおよび50 U/ml Taq DNAポリメラーゼ(Boehringer/Mannheim)を含んでいた。増幅用鋳型DNAは、ルリア・ベルタニ(LB)寒天に25μg/mlカナマイシンを添加したプレート上で、単離されたコロニーから得た、対象とするP1クローンを含む細菌に反応混合物50μｌずつを接種することにより得られた。反応混合物をミネラルオイルで重層し、以下の構成を用いて増幅した。最初の変性段階、94℃で4分間；94℃で1分間変性、60℃で1分間アニーリングそして72℃で1分間プライマー伸長を30サイクル；最後の伸長段階を72℃で10分間。各クローンは、アガロースゲル電気泳動により予想された約322 bpの生成物を生じた。ベクターのみを含む菌はこのサイズのシグナルを示さず、各クローンにエキソンIIIが存在することが確認された。
【００９０】
メーカーが勧める緩衝液の存在下、ゲノムクローンDMPC-HFF#1-0575-F3、DMPC-HFF#1-0994-A6およびDMPC-HFF#1-1332-H5のDNAをそれぞれ制限酵素SmaI、NarI、EcoRI、SalI、BamHIおよびBglII(いずれもBoehringer/Mannheimより)で消化して得られた断片をトリス/ホウ酸/EDTA緩衝0.5%アガロースゲルで分離し、エチジウムブロミドで染色した。ゲル中のDNAを変性・中和し、一晩かけて毛細管移動によりナイロンメンブランへ移した。紫外光でDNAをナイロンメンブランとクロスリンクさせ、メーカーが勧める通り、2% w/vブロック試薬(Boehringer/Mannheim、5X SSC緩衝液(20X SCC緩衝液は水1リットル中NaCl 175グラム、クエン酸ナトリウム88グラムである)、0.1% N-ラウロイルサルコシン、0.02%ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)および50%ホルムアミドの組成をもつ緩衝液中42℃で16時間プレハイブリダイゼーションを行った後、プレハイブリダイゼーションと同様の緩衝液中、42℃で16時間、実施例1Aに記載の通り、サザンブロットをジゴキシゲニン標識ヒトGDNF cDNA 10 ng/mlとハイブリダイズした。0.1%のドデシル硫酸ナトリウム(SDS)を含む2X SSC中室温で15分間、メンブランを2回洗浄した後、0.1% SDSを含む0.1X SSCで60℃30分間洗浄を行った。特異的ハイブリダイゼーションは、メーカー(Boehringer/Mannheim)提供の試薬および手順で検出した。約9.4 kb、2.7 kbおよび0.7 kbのEcoRIバンドが、ヒトGDNF cDNAプローブとハイブリダイズすることが観察された。
【００９１】
上記シャール（Schaar）らに記載のGDNFセンス配列およびエキソンIII上流の配列(実施例1B参照)に基づいてPCRプライマーをデザインし、エキソンIIIに対する推定エキソンIの位置をマッピングした。プライマー番号5231 (5'-GGT CTA CIG AGA CCG GAT CCG AGG T-3' (配列番号：13))は、その3'末端でコンセンサススプライス連結部供与体部位の一部を含むようにデザインされ、かつ、そうでなければプライマー内に生成されるはずの予想される安定なヘアピンループを不安定にする一個の2'-デオキシイノシン残基を含む、GDNFセンス配列の末端切断型である。プライマー番号5230 (5'-CGG CCC AAG CAA GGA CGG TGT TTC T-3' (配列番号：14))は、エキソンIII起点の約480 bp上流にある実施例1Bに示す配列のヌクレオチド191〜215と相同である。PCR増幅反応混合物は、0.2 mM dNTPs、各プライマー番号5230と5231をそれぞれ0.6 _Mずつ、Expand DNA ポリメラーゼ52.5 U/ml、そしてポリメラーゼのメーカー(Boehringer/Mannheim)が提供する1X濃度の専用緩衝液を含んでいた。増幅用の鋳型DNAは、ヒトゲノムDNA(Boehringer/Mannheim)200 ng、クローンDMPC-HFF#1-0575-F3 0.1 ng、または、ヒトGDNF遺伝子のエキソンIV内のEcoRI部位から約1.75 kb下流のSalI部位から始まる挿入DNAの約半分を切除するこのクローンのSalI欠失体0.1 ngのいずれかであった。各50μlの反応混合物をミネラルオイルで重層し、以下の構成を用いて増幅した。最初の変性段階、95℃で3分間；95℃で1分間変性、30秒間で60℃まで、60℃で1分間アニーリング、30秒間で72℃まで、そして72℃で4分間プライマー伸長を20サイクル；伸長時間を各サイクルにおいて15秒間ずつ増やす以外は同様の時間・温度で15サイクル；最後の伸長段階を72℃で10分間。各PCR反応混合物からのアリコットを電気泳動したところ、鋳型DNAが存在する各レーンでは約4.5 kbの生成物を示したが、鋳型DNAが存在しない場合、生成物は生成しなかった。これらの結果は、エキソンIがプライマー番号5230のハイブリダイゼーション位置から約4.5 kb上流にあるか、または、エキソンIIIの起点の約5.0 kb上流にあることを示した。
【００９２】
プライマー5230/5231からのPCR増幅産物を精製し、その約100 ngを³²P-dCTP(Pharmacia Biotechのオリゴ標識キット)で標識した。先にジゴキシゲニン標識ヒトGDNF cDNAとハイブリダイズしたサザンブロットを前記と同様の緩衝液中42℃で一晩、放射標識生成物1 x 10⁶ CPM/mlとハイブリダイズした。前記のように洗浄後、各P1ゲノムクローンの約9.4 kb EcoRI断片だけがオートラジオグラフィで検出された。これらの結果は、ヒトGDNF遺伝子のエキソンIおよびエキソンIIIが共に、互いに約5.0 kb離れて同じ約9.4 kb EcoRI断片内にあることを示している。
【００９３】
まずEcoRI処理およびウシ腸アルカリフォスファターゼ処理Zap Expressベクターアーム(Stratagene)にクローニングすることにより、約9.4 kbのEcoRI断片をベクターpBK-CMVにクローニングした。P1ヒトゲノムクローンDMPC-HFF#1-0575-F3 10μgをEcoRIで完全に切断した。断片を0.5%アガロースゲルで分離して、ゲルから精製した。EcoRI断片をEcoRI-およびウシ腸アルカリフォスファターゼ-処理Zap Expressベクターアームにライゲーションした。ライゲーション混合物をGigapack II Goldパッケージング抽出物(Stratagene)によってバクテリオファージラムダ粒子にパッケージングした。メーカー(Stratagene)の指示に従い、パッケージ化したDNAを、NZY寒天プレートに0.7%NZY寒天を上層したプレートにおいて、XL-1ブルーMRF'宿主細胞と共に播種した。単離プラーク11個を抜き取り、ファージ粒子を一晩SM緩衝液0.25 mlに溶出し、メーカーの指示によりXL-1ブルーMRF'細胞を組換えラムダファージおよびExAssist f1ヘルパーファージに共感染させることにより、ラムダファージからプラスミドを切り出した。XLOLR細胞を繊維状ファージ粒子としてパッケージングされた熱処理した切り出されたpBK-CMVファージミドとインキュベートし、LB寒天 + 50μg/mlカナマイシン寒天プレート上に播種することにより、切り出したファージミドを繊維状ファージ粒子から回収した。37℃で一晩プレートのインキュベーション後、単離したコロニーをつまみとり、LB + 50μg/mlカナマイシン中で増殖させた培養液からプラスミドDNAを作出した。一個のプラスミドpRBSEco9.4#8の特徴付けをさらに行った。
【００９４】
D. クローニングした9.4 kb EcoRI断片のシークエンシング
まず始めにプライマー番号5231を利用して、プラスミドpRBSEco9.4#8（図2参照)をシークエンシングした。導出された配列に基づいて合成した他のプライマーを用いて、さらにシークエンシングを行った。最初のシークエンシングから以下に示す配列が明らかになった。
【００９５】

【００９６】
さらに詳しくシークエンシングを行ったところ、図3A〜3B (配列番号：1)に示す配列が明らかになった。この配列は、メーカーが提案するデフォルトパラメーターをもつBESTFITプログラム（ウイスコンシン州マジソン、Wisconsin Sequence Analysis Package, Genetics Computer Group)を用いて、マウスGDNF遺伝子の限定された領域(エキソンIからエキソンIの140 bp上流まで、GenBank登録番号#D88350S1)と79%同一であることが分かった。
【００９７】
E. GDNF cDNAの5'末端分析による遠位GDNFプロモーターの転写開始部位の決定
RACE(cDNA末端の迅速増幅)変法(PCR Protocols (PCRプロトコール）(Academic Press, San Diego)におけるフローマン（Frohman）、(1989), 28-38))において、CapFinder PCR cDNA合成キット(Clontech Laboratories)を出発点として使用し、GDNF cDNA 5'末端に富むcDNAライブラリーを形成した。cDNA合成をランダム6量体(Gibco/BRL) 1μl(50 ng/μl)でプライミングした以外は、指示通りに(CapFinderキット、Clontech Laboratories)、ヒト胎児腎、胎児脳または成人骨格筋ポリA+ RNAの0.5μgについて第一ストランドcDNA合成を行った。PCRは指示通りに行ったが、ただし、プライマーは、供給されたCapFinder PCRプライマーおよびGDNFアンチセンスに関してそれぞれ0.4μMずつであり、最初の変性を94℃で3分間、そして、94℃で1分間の変性、58℃で1分間アニーリング、72℃で1分間プライマー伸長を行うサイクルを24回、最後の伸長を72℃で10分間行った。
【００９８】
一次PCR反応物を滅菌蒸留水で1000倍に希釈した後、CapFinder PCRプライマー0.2μMおよびプライマー番号5191 (5'-GGT CAT CAT CAA AGG CGA TGG GT-3' (配列番号：16))0.4μMの存在下、同じ温度プログラムを25サイクル行ったこと以外は、先に使用したのと同様の反応混合物中でアリコット1μlを二次増幅した。PCR反応のアリコットのサザンブロットを、アガロースゲル電気泳動により分離して³²P-ATP標識outGDNF1（上記実施例1B）をプローブとして調べると、長さ100 bpの複合バンド600-1が示された。このサイズ範囲のPCR産物をアガロースゲル電気泳動で精製してDNAを回収し、pCR 2.1 (Invitrogen)にライゲーションした。ライゲーション混合物を、ElectroMAX DH10B細胞(Gibco/BRL)に電気穿孔して、LB寒天+ 50 mg/mlアンピシリン+ 50 mg/mlカナマイシンプレートに播種した。37℃で一晩インキュベーション後、コロニーをナイロンメンブランに載せ、標準的な方法によって、DNAを変性、中和そしてクロスリンクさせた。実施例1Aに記載したように、フィルターを標識cDNAプローブとハイブリダイズし、ハイブリダイゼーション陽性コロニーからDNAを調製してシークエンシングを行った。
【００９９】
ヒト胎児腎からの遠位プロモーター由来cDNAの配列を以下に示し、配列中、ヌクレオチド1〜174は図1に示すようにエキソンIに相当し(図3Bのヌクレオチド1〜174)、ヌクレオチド175〜351は図1に示すようにエキソンIIIbに相当し、ヌクレオチド352〜763は図1に示すようにエキソンIVに相当し、ヌクレオチド740〜762はプライマー#5191によって与えられるものであり、ヌクレオチド175〜762は上記実施例1Aで得られた配列のヌクレオチド24〜611と同一である。
【０１００】

【０１０１】
実施例2
ヒト遠位 GDNF プロモーター・リポーター遺伝子構築物の製造および構築物の大腸菌へのトランスフェクション
プロモーター活性を調べるため、ホタルに発現されるルシフェラーゼに対する応答の感度および直線性の理由により、ホタルルシフェラーゼリポーター遺伝子を含む市販のプラスミドpGL3-Basic (Promega, Madison, WI, GenBank登録番号U47295)を使用して、リポーター遺伝子プラスミドを作出した。実施例1に記載のようにして作ったプラスミドpRBSEco9.4#8内に含まれる遠位GDNFプロモーターを、二段階法により、図5に示すとおり、ベクターのルシフェラーゼ遺伝子から上流の、pGL3-Basicの独自のNheI制限部位へ移動させた。
【０１０２】
第一段階において、プラスミドpGL3-Basicを制限エンドヌクレアーゼNheIで切断した。65℃で20分間インキュベーションして酵素を不活性化した後、ベクターの自己ライゲーションを防止するためエビアルカリフォスファターゼで処理して、この酵素を65℃で15分間加熱し不活化した。一方、pRBSEco9.4#8をAvrII次いでNheIで消化した。740 bp断片を0.5%アガロースゲルで電気泳動により分析し、ゲルからバンドを回収した。次に、回収したプロモーターのAvrII/NheI断片は、NheI切断pGL3-Basicにライゲーションした。ライゲーション混合物はINVaF'コンピテントな大腸菌細胞(Invitrogen)に形質導入し、LBアンピシリン寒天プレートに播種した。37℃で一晩増殖後、液体LBアンピシリン培地の小さい培養において増殖した各コロニーからプラスミドDNAを作出した。pGL3-BasicにおけるAvrII/NheIプロモーター断片の方向性は、プラスミドDNA調製物のXbaIによる消化およびルシフェラーゼ遺伝子に最も近い連結部における連結部配列をシークエンシングすることによって決定した。NheI/AvrII部分的プロモーター断片をもつ中間体プラスミドはp Nhe-GDNFと命名された。
【０１０３】
遠位GDNFプロモーターをpGL3-Basicへ転移させる第二段階において、中間体プラスミドp Nhe-GDNFを制限酵素NheIおよびPstIで順次切断し、混合物をフェノール/CHCl₃で抽出後、エタノールで沈澱させた。SpeI (これはゲノムDNAインサートのEcoRI挿入部位に隣接するポリリンカーで切断する)およびPstIによりプラスミドpRBSEco9.4#8を切断した。約1095 bpのSpeI/PstI断片を0.5%アガロースゲルの電気泳動により分離および精製した。次いでSpeI/PstIプライマー断片を、NheIおよびPstIで切断したpNhe-GDNFにライゲーションした。LB +アンピシリンプレートに播種して37℃で一晩増殖させた、INVaF'コンピテント大腸菌細胞(Invitrogen)に前記断片を形質導入した。単離したコロニーからプラスミドDNAを調製し、プロモーターが挿入されていることを制限酵素消化およびシークエンシングにより確認した。ヒトGDNFプロモーターを含むルシフェラーゼプロモータープラスミドはpGDNF-1635と命名された。
【０１０４】
ヒト遠位GDNFプロモーターの様々なプロモーターまたはエンハンサー領域の重要性を評価するためのpGDNF-1635の制御欠失体は容易に作出される。プラスミドp Nhe-GDNFは、pGDNF-1635からの遠位GDNFプロモーターの5'末端で約1,040 bpを欠失した欠失体の一つである。前記プロモーターの5'末端の約255 bp 欠失体は、制限エンドヌクレアーゼSacIによるpGDNF-1635の消化、酵素の不活化、そして低DNA濃度におけるベクター部分の再ライゲーションにより達成され、こうしてp Sac-GDNFが得られる。さらなる欠失体は、制限酵素による操作かまたはヘニコフ（Henikoff）(1984), Gene 28, 357に記載されているように、エキソヌクレアーゼによって産生される制御欠失体によって作製する。全長のヒトGDNF遠位プロモーターの地図およびいくつかの5'末端切断型構築物を図7に示す。
【０１０５】
実施例 3
ヒト細胞への pGDNF-1635 のトランスフェクションおよびヒト遠位 GDNF プロモーター活性のアッセイ
ヒトグリオブラストーマU-87 MG細胞(ATCC番号HTB-14)または神経芽細胞腫SK-N-AS細胞(ATCC番号CRL-2137)に、リポフェクション法(フェルナー（Felgner）ら、(1987), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 7413-7417)を用いて、実施例2に記載したようにして調製したプラスミドpGDNF-1635をトランスフェクトした。
【０１０６】
U-87 MG細胞は、ラット尾コラーゲンI型(Collaborative Research, カタログ番号40450)をコーティングした直径8.5 cmの培養皿で約40%コンフルエンスになるまで増殖させた。培地を取り除き、細胞をリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で1回洗浄し、メーカーの指示通りに調製したOptiMEM (Gibco/BRL番号31985)6.4 ml中にDNA 15μgとlipofectAMINE(Gibco/BRL番号18324-012)100μgとを含む溶液を静かに重層した。細胞は、5% CO₂湿潤大気下37℃で5時間または24時間までインキュベートした。次いでトランスフェクション溶液を除き、10%ウシ胎児血清、1%非必須アミノ酸、1%グルタミンおよび1%ピルビン酸ナトリウムを含む最小基本培地(Gibco/BRL番号11095-080)10 mlと交換した。37℃で48時間インキュベーション後、細胞を回収して細胞抽出物を調製し、ルシフェラーゼアッセイ試薬(Promegaカタログ番号E1501)によってアッセイした。
【０１０７】
SK-N-AS細胞を、直径8.5 cmの培養皿で約50%コンフルエンスになるまで増殖させ、PBSで1回洗浄後、前記細胞は、上記のように調製したOptiMEM (Gibco/BRL番号31985)6.4 ml中でDNA 15μgとlipofectAMINE(Gibco/BRL番号18324-012)80μgとを含む溶液を静かに重層した。細胞は、5% CO₂湿潤大気下37℃で5時間インキュベートした。次いでトランスフェクション溶液を除き、10%ウシ胎児血清、1%非必須アミノ酸を含むダルベッコ改変イーグル培地(Gibco/BRL番号11965-092)10 mlと交換した。48時間後、細胞を回収して細胞抽出物を調製し、ルシフェラーゼアッセイ試薬(Promegaカタログ番号E1501)によってアッセイした。
【０１０８】
前述のトランスフェクション手法をわずかに変更して、リポーター遺伝子発現に及ぼす種々のプロモーター欠失の影響を調べた。一つのプロモーター構築物の発現を他のそれと比べる場合、二つ異なるトランスフェクション間のトランスフェクション効率の変動を考慮することが重要である。本発明では、第二の独立して測定されるリポーター酵素を少量発現するもう一つの対照プラスミドと共トランスフェクションを行うことによってこの点を考慮した。ホタルのルシフェラーゼを発現するGDNFプロモーター欠失構築物と内部対照リポータープラスミドとの混合物で共トランスフェクション後、両リポーターを独立にアッセイし、ホタルルシフェラーゼ活性を対照リポーターの酵素活性によって標準化する。各実験間のトランスフェクション変動はそれによって排除される。本明細書において利用した対照リポータープラスミドは、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼプロモーターの制御下、海洋生物ウミシイタケ（Renilla）由来の第二の独立してアッセイ可能なルシフェラーゼを低レベルで発現するpRL-TK(Promega #E2241)であった。別々の基質添加および緩衝液組成の条件下、細胞溶解液は、ホタルとウミシイタケのルシフェラーゼ酵素活性が互いに混入しないように、異なる２つのルシフェラーゼについて順番にアッセイを行う。
【０１０９】
ヒトグリオブラストーマU-87 MG細胞は、前記のように、lipofectAMINE 100μgの存在下、図7に示すリポータープラスミド13.5μgとpRL-TK内部対照プラスミドとの混合物を24時間トランスフェクトさせた。トランスフェクション後、U-87 MG培地(10%ウシ胎児血清、1%非必須アミノ酸、1%グルタミンおよび1%ピルビン酸ナトリウムを含むMEM)中で20時間、インキュベーターにてインキュベートして細胞を回収した後、直径8.5 cm のプレートから採取して、同じ培地において、ラット尾コラーゲンをコーティング12ウエルプレート(Becton Dickinson Labware #40500)に分散した。プレートを9時間インキュベートし、その後U-87 MG培地を取り除いてOptiMEMと交換した。細胞を37℃で18時間インキュベートして培地を除去し、細胞を冷リン酸緩衝生理食塩水で洗浄し、1X受動溶解緩衝液(Promega #E194A)0.25 mlを各ウエルに添加し、プレートを静かに振とうしながら室温で15分間インキュベーションすることにより、細胞溶解物をインサイチューで調製した。前記のように、SK-N-AS細胞に同じプラスミドをトランスフェクトさせた。
【０１１０】
各細胞溶解物の15μlアリコットは、Dual-Luciferaseリポーターアッセイシステムキット(Promega #E1910)の試薬を用い、ホタルルシフェラーゼ、次いでウミシイタケのルシフェラーゼについてアッセイした。ウシフェラーゼ活性は、増強モードで操作される96ウエル型ルミノメーター(Dynex Technologies, ML-3000モデル)を用いて定量した。各細胞溶解物の測定は3回繰り返し、所定の処置の結果はすべて6回の繰り返し処置の平均値から得た。
【０１１１】
可能性のあるエンハンサーおよびサイレンサーエレメントならびに基本プロモーター自体の位置をマッピングするために、pGDNF-1635の5'欠失変異体を構築し、トランスフェクトしてルシフェラーゼ活性を測定した。その結果を図7に示す。U-87 MGグリオブラストーマ細胞において、最も5'側の120 bp (-1516)の欠失により、プロモーター活性が30%減少し、これは、-1635と-1516との間にエンハンサーエレメントが存在することを示している。さらに-1304までの欠失によりプロモーター活性は2倍増加して、-1378と-1304との間にサイレンサーエレメントが存在することを示唆している。次の170 bp から-1134までを欠失しても、U-87 MG細胞に明白な影響を認めなかった。さらに-1134から-366までの欠失によって、プロモーター活性は徐々に失われ、これはエンハンサーエレメントの領域が広いことを示している。興味深いことに、egr2およびAP-2のコンセンサス結合部位を含む領域である-744から-593までのこの領域内の欠失によって、プロモーター活性はより顕著に減少し、このことは、egr2および/またはAP-2が調節活性に重要であることを示唆している。これに対し、コンセンサスNF-κB結合部位を含む領域である-366と-307間を欠失しても、U-87 MG細胞のプロモーター活性に何の変化も生じなかった。最後に、-307から-193までを欠失すると、プロモーター活性は約5倍増加したのに対し、さらに-62までを欠失しても、活性はわずかに増えただけであった。これは、この領域に強いサイレンサーエレメント(一または複数)が存在することを示している。
【０１１２】
SK-N-ASニューロブラストーマ細胞における調節領域の欠失は、U-87 MG細胞で得られた結果と比べ、顕著な違いを生じた。図7は、U-87 MG細胞についてこれまでに述べた結果と同様、最初の120 bpにエンハンサーが存在すること、その後にSK-N-AS細胞の-1378から-1304にサイレンサーが存在することを示している。しかしながら、領域-1304から-1134の欠失はU-87 MG細胞では何の影響も与えなかったが、SK-N-AS細胞では減少を生じたことから、この領域に細胞型特異的エンハンサーが存在することが示唆される。転写因子AP-2の一対のコンセンサス結合部位がこの領域で見つかった。これら二つの細胞株間のもう一つの違いは-1134と-853間に見られる。U-87 MG細胞においてエンハンサーであることが既に分かっているこの領域の欠失により、SK-N-AS細胞ではルシフェラーゼ発現の増加を生じた。CREBのコンセンサス結合部位はこの領域内に見出された。-852と-593との間の近位欠失により、U-87 MG細胞に認められた効果と同様、SK-N-AS細胞においてもエンハンサー領域が存在することが判明した。さらに、-593と-366間および-366と-307間の欠失により、SK-N-AS細胞ではルシフェラーゼ活性がそれぞれ3倍および2倍まで増加し、これはこの細胞株においてサイレンサーが存在することを示すものである。これに対し、U-87 MG細胞では、-593から-366の領域がエンハンサーとして機能するように思われるのに対し、明らかなNF-κB結合部位を含む-366から-307までの領域は全く影響を示さなかった。以上を総合すると、これらの結果は、細胞型特異的エレメントが本プロモーターの活性を変化させる可能性があることを示唆している。
【０１１３】
実施例 4
ヒト中位および近位 GDNF プロモーターのクローニングおよび特徴付け
A. ヒト胎児腎からの中位プロモーター由来cDNA
RACE変法の出発点としてCapFinder PCR cDNA合成キット(Clontech Laboratories)を用いて、GDNF cDNAの5'末端に富むcDNAライブラリーを作製した。ヒト胎児腎、胎児脳または成人骨格筋ポリA+ RNA(Clontech Laboratories)の0.5 _gについての第一ストランドcDNA合成は、cDNA合成をランダム6量体(Gibco/BRL) 1μl(50 ng/μl)でプライミングした以外は、メーカーの指示(CapFinderキット、Clontech Laboratories)に従って行った。PCRは、プライマーは供給されたCapFinder PCRプライマーおよびGDNFアンチセンスがそれぞれ0.4μMずつであったことを除いては、指示通りに行った。PCRプログラムは、最初の変性を94℃で3分間、そして、94℃で1分間の変性、58℃で1分間アニーリング、および72℃で1分間プライマー伸長のサイクルを24回、72℃で10分間の最後の伸長であった。
【０１１４】
一次PCR反応液を滅菌蒸留水で1000倍に希釈した。希釈反応液それぞれの1μlアリコットを、CapFinder PCRプライマー0.2μMおよびプライマー番号5191 (5'-GGT CAT CAT CAA AGG CGA TGG GT-3' (配列番号：18))0.4μMの存在下、同じ温度プログラムを25サイクル行ったこと以外は、先に使用したそれと同様の反応混合物において二次増幅させた。二次PCR反応液アリコットのサザンブロットをアガロースゲル電気泳動により分離して、³²P-ATP標識outGDNF1（上記実施例1B）をプローブとして調べたところ、長さ100 bpの複合バンド600-1が示された。このサイズ範囲のPCR産物をアガロースゲル電気泳動で精製してDNAを回収し、プラスミドpCR 2.1 (Invitrogen)にライゲーションした。ライゲーション混合物を、ElectroMAX DH10B細胞(Gibco/BRL)に電気穿孔し、LB寒天+ 50 μg/mlアンピシリン+ 50 μg/mlカナマイシンを含むプレートに播種した。37℃で一晩インキュベーション後、コロニーをナイロンメンブランに写し、標準的な方法を用いて、DNAを変性、中和そして紫外光に暴露することによりメンブランとクロスリンクさせた。フィルターを標識cDNAプローブ(上記実施例1AのhuGDNF)とハイブリダイズし、ハイブリダイゼーション陽性コロニーからDNAを調製してシークエンシングを行った。ヒト胎児腎由来のそのようなcDNAの配列を以下に示す。
【０１１５】

【０１１６】
上記配列において、ヌクレオチド585〜607はプライマー番号5191によって与えられ、ヌクレオチド1〜97 (エキソンII、図1参照)およびヌクレオチド98〜146は、実施例1Bに記載のヒトゲノムDNAのPCRウオーキングフラグメントのうち、それぞれヌクレオチド5〜101およびヌクレオチド673〜721と相同であり、ヌクレオチド98〜607は実施例1Aに記載のcDNA配列において、ヌクレオチド122〜201間に78 bpの欠失をもつ塩基24〜611と相同である。
【０１１７】
B. ヒト胎児脳からの近位プロモーター由来のcDNA
ランダムプライミングしたヒト胎児脳ポリA+ RNA (Clontech Laboratories)および、内側(nested)のプライマーセットを利用する2ラウンドのPCR増幅とを用いて、5'-AmpliFINDER RACEキット(Clontech Laboratories)によって5' RACEを行った。一次PCR増幅は、メーカーが提案する条件に従い、アンカープライマー(5'-CCT CTG AAG GTT CCA GAA TCG ATA G-3' (配列番号：20)および遺伝子特異的プライマー1 (5'-GGT CAT CAT CAA AGG CGA TGG GT-3' (配列番号：16))によって、アニーリング温度54℃を用いて40サイクルを行った。蒸留水で100倍希釈後、希釈した一次PCR産物1μlを、プライマー番号3442 (5'-GGA ACC TCG AGA ATC GAT AGT GAA TTC GTG-3' (配列番号：21))および遺伝子特異的プライマー2 (5'-TCG TAC GTT GTC TCA GCT GCA TC-3' (配列番号：22))または遺伝子特異的プライマー3 (5'-ACC TTT TCC TCT GGA ATT CTC TG-3' (配列番号：23))のどちらかによって、さらに30サイクル増幅した。PCRの条件は、57℃のアニーリング温度を使ったこと以外、一次PCR増幅と同様であった。増幅されたPCR産物をベクターpCR2.1 (Invitrogen)にクローニングした後シークエンシングした。プライマー番号3442および遺伝子特異的プライマー2による二次増幅から得られた産物を以下に示す。
【０１１８】

【０１１９】
上記配列において、ヌクレオチド1〜30および513〜535は、それぞれ、プライマー番号3442および遺伝子特異的プライマー2によって与えられ、ヌクレオチド33〜166は、実施例1Bに記載されたヒトゲノムDNAのPCRウオーキングフラグメントのヌクレオチド588〜721と相同であり、そしてヌクレオチド118〜535は実施例1Aに記載のcDNA配列のヌクレオチド122〜201間に78 bpの欠失をもつヌクレオチド24〜519と相同である。
【０１２０】
C. 近位プロモーターの配列
鋳型としてプラスミドpRBSEco9.4#8を用いて、実施例1Bに記載されたヒトゲノムDNAのPCRウオーキングフラグメント配列を伸長し、図4A〜4C (配列番号：2)に示す近位プロモーターのプロモーター配列を得た。
【０１２１】
図4Bに示す配列中+6および+67の位置は、異なるゲノムDNAにおいて可変であるように思われる。+6位はAまたはGであってもよく、+67位はTまたはCのどちらでもよい。
【０１２２】
実施例 5
ヒト遠位および近位 GDNF プロモーターの両方を含むルシフェラーゼリポータープラスミドの構築
図6A〜6Bに示す手法に従って、ヒト近位および遠位GDNFプロモーターおよびこれに機能的に結合されたルシフェラーゼをコードする遺伝子を含むリポーター遺伝子プラスミドを作製した。プラスミドpRBSEco9.4#8内に含まれる近位および遠位GDNFプロモーターを二段階で、pGL3-Basicリポータープラスミド誘導体であるpGDNF-1635の唯一のEcoRIおよびHindIII部位に移動させた。この方法をまず簡単に述べ、続けてさらに詳細な説明を行う。
【０１２３】
まず、図4A〜4Cに示す近位プロモーター配列中-10と+705間の領域をPCRによって修飾し、696〜698塩基対の翻訳開始部位を取り除く。次いでPCR産物をプラスミドpKS bluescript IIにクローニングした。そのプラスミドのポリリンカーの隣接HindIII部位およびインサート内の唯一のEcoRV部位を利用して、1個のクローンからインサートを切除。次に、HindIIIからEcoRVまでのインサート断片をEcoRV-およびHindIII-切断pRBSEco9.4#8にクローニングしてプラスミドpRBSEco9.4proxmodを得た。唯一のEcoRIおよびHindIII部位の切断によって、プラスミドpRBSEco9.4proxmodからのインサートを切除して、実施例2の記載通りに調製したEcoRI-およびHindIII-切断pGDNF-1635にクローニングし、プラスミドpGDNFprox+distを得た。
【０１２４】
エキソンIIIの翻訳開始部位を、プライマー番号5361 (5'-CCA GAT ATC CCA TAC AGG CCA A-3' (配列番号：25))および5363 (5'-ATA ACT AGA TCT TAA AGT CCC GTC C-3' (配列番号：26))を用いたPCRにより改変した。PCR反応物は、0.2 mM dNTPs、各プライマー番号5361と5363をそれぞれ0.4 _Mずつ、Expand DNA ポリメラーゼ70 U/ml、そしてポリメラーゼのメーカー(Boehringer/Mannheim)が提供する1X濃度の専用緩衝液を含んでいた。増幅用の鋳型DNAは0.1 ngのプラスミドpRBSEco9.4#8 であった。各50μlの反応物に鉱油を重層し、まず94℃で3分間変性し、94℃で1分間変性、42℃で1分間アニーリングそして72℃で1分間のプライマー伸長を5サイクル行った後、アニーリング温度を53℃とした以外は同じ時間・同じ温度で30サイクルを行い、最後の伸長を72℃でさらに10分間行った。PCR反応物からのアリコットを電気泳動したところ、約700 bpの予想生成物を示した。PCR産物を精製後(Promega MagicPrep)、EcoRV切断プラスミドpBluescript II KSにクローニングした。EcoRVおよびHindIIIで消化することにより、得られたプラスミド1個からの約700 bp のインサートが放出され、インサートを含むゲルを精製した。これを、EcoRVおよびHindIIIで切断されているpRBSEco9.4#8にクローニングした。カナマイシン含有プレートで選択し、PCRによって該プラスミドに導入されたさらなるBglII部位の有無をスクリーニングした後、得られた1個の産生物プラスミドpEco9.4proxmodを、シークエンシングおよびさらなる遺伝子操作用として選択した。
【０１２５】
プラスミドpEco9.4proxmodをEcoRVおよびHindIIIで切断して約6.8 kbの挿入物を放出した。断片をゲル精製することなく、これを、EcoRVおよびHindIIIで切断したpGDNF-1635 (唯一のEcoRI部位がその構築中に、上流ポリリンカーセグメントのすぐ内側へ導入されたため、このpGL3-Basic誘導体を使用した)にライゲーションした。アンピシリン含有プレートで形質転換体(トランスフォーマント)を選択した。所望のインサートをもつ1個のプラスミドpGDNFprox+distを次の作業に使用した。
【０１２６】
実施例 6
ヒト近位 GDNF プロモーターを含むルシフェラーゼリポータープラスミドの構築
pGDNFprox+distにおいてプロモーターの上流部分を除いたところ、ルシフェラーゼの発現を誘発する近位の(すなわち、中位および近位の)プロモーターだけをもつリポータープラスミドが得られた。これは、制限エンドヌクレアーゼMluIでpGDNFprox+distを切断することによって達成され、残りのプラスミドを再度ライゲーションするとpGDNFprox Mluが得られた。このプラスミド(すなわち、pGDNFprox+dist)を、MluIおよび近位プロモーター内で切断するがプラスミドの残部では切断しない他の制限酵素で切断すると、さらなる欠失体を生じる。例えば、MluIで切断後NruIで切断し、クレノウ断片プラスdNTPsによって平滑末端に変換後再びライゲーションすると、pGDNFprox Nruが得られる。
【０１２７】
実施例 7
逆転写 / ポリメラーゼ連鎖反応 (RT-PCR) の結果
ヒト組織またはU-87 MG細胞における転写産物3個の相対量を決定するため、共通の下流プライマーならびに、遠位、中位および近位GDNF転写産物に特異的な上流プライマーを用いて、種々のRNA調製物に対してRT-PCRを行った。遠位プライマー5'-CCC AGG ATT GCG AAC TCT TGC-3' (配列番号：27)は実施例1Eに示す配列のヌクレオチド35〜55と同一であった。中位プライマー5'-TCT CCA AGT CCC TGC TAA CTT CT-3' (配列番号：27)は実施例4Aに示す配列のヌクレオチド16〜38と同一であった。近位プライマー5'-CGT GCA TTC TGC GGT TCT-3' (配列番号：29)は実施例4Eに示す配列のヌクレオチド72〜89と同一であった。エキソンII/エキソンIII連結部で起こり得る選択的スプライシングから生じる複雑さを排除するため、共通の下流プライマー5'-GAG CAG CAC CAG GCA GAC-3' (配列番号：30)が選択された。
【０１２８】
U-87 MG細胞から全RNAを調製した。U-87 MG細胞は、実施例3に記載のように、8.5 cmの培養皿でコンフルエンスになるまで増殖させた。次いで、培地を0.5%ウシ血清アルブミン添加OptiMEM (Gibco/BRL番号31985)に交換し、この培地で細胞をさらに12時間インキュベートし、その際、10 ng/ml IL-1^-、10 nM ジデカノン酸ホルボール、50 ng/ml塩基性FGF(線維芽細胞増殖因子)、1 mMジブチリル-サイクリックAMP、1 Mデキサメサゾン、10 ng/ml TNF^、または無添加(培地)のいずれかで行った。さらに12時間細胞をインキュベートし、メーカーの指示(Tel-Test, Inc., Friendswood, TX)に従いRNAzol（登録商標）Bを用いて、全RNAを単離した。
【０１２９】
RNA試料に混入するゲノムDNAを除くため、試料をまずDNase Iで処理した。ヒト胎児肝、成人肝、胎児腎、胎児脳、成人脳または成人骨格筋からのポリA⁺ mRNA(Clontech Laboratories)1μgまたは全RNA(U-87 MG細胞)の3μgは、第一ストランドcDNA合成の前に、37℃で30分間1単位のDNase I (RQ1 RNase不含DNase, Promega #M610A)で前処理した後、70℃で20分間の加熱不活化を行った。第一ストランドcDNAは、ランダムプライマー50 ngを用い、指示された通りGibco SuperScript（登録商標）前増幅システムキット(Gibco #18089-011)で、全RNA(U-87 MG細胞)3μgまたはポリA⁺ RNA(ヒト組織RNAs)1μgのいずれかから合成した。ポリメラーゼを添加した緩衝液の存在下、0.2 mM dNTPs、1μMの遠位、中位、近位および共通プライマー、鋳型としてcDNAを1μl、そしてAdvantage（登録商標）KlenTaq ポリメラーゼ混合物(Clontech #8417-1)1μlを含む反応液50μl中でPCRを行った。陽性対照は、1μlのcDNA鋳型を、0.1アットモル、0.01アットモルまたは0.001アットモル（1ゼプトモル=1 x 10^-21モル）の遠位、中位もしくは近位cDNA(それぞれ実施例1E、4A、4E)のうち一個を含む1μlで、または上記cDNAsのそれぞれの等モル量で置換することによって与えられたものである。陰性対照は、1μlのcDNA鋳型を、逆転写酵素を添加しない同様の反応液1μlで置換することを含む。温度サイクルのパラメーターは、最初の変性を94℃で2分間、その後94℃で30秒間の変性、66℃で30秒間のアニーリング、そして72℃で1分間の伸長を30サイクル、その後最後のインキュベーションを72℃で10分間で構成された。TBE緩衝液(FMC BioProducts #54906)中、PCR反応液のアリコート10μlを4% NuSieve(登録商標)3 : 1アガロースゲルに載せて電気泳動により分離した。ゲルを可視化し、302 nmでトランスイルミネーター(transilluminator)を用いて写真撮影を行った。
【０１３０】
図8Aは、RT-PCRの評価結果を示す。レーン1は、実施例4Eからのクローニングされた近位転写産物0.1アットモルをプライマー混合物と共に増幅した結果である予想された114 bpと一致するサイズのバンドを示す。レーン2は、実施例4Aからのクローニングされた中位転写産物0.1アットモルをプライマー混合物と共に増幅することにより生じる、予想された150 bpの生成物と一致するバンドを示す。レーン3は、実施例1Eからのクローニングされた遠位転写産物0.1アットモルをプライマー混合物と共に増幅することから生じる、予想された208 bpの生成物と一致するバンドを示す。レーン1、2および3における生成物のバンドは、ほとんど等しい強度であり、これらの条件下では、各生成物の増幅が同様の効率で起こることが示唆される。レーン4は、鋳型を加えなければ生成物が産生されないことを示す。レーン5は、近位、中位および遠位鋳型の各0.1アットモル混合物をプライマー混合物と共に増幅した結果である。レーン6および7は、各鋳型が0.01アットモル(レーン6)または0.001アットモル(1ゼプトモル、レーン7)存在する以外はレーン5と同じである。レーン5、6および7は、これらを総合すると、各生成物の増幅は同様の効率で起こること、そして、アッセイの感度は3つの鋳型のどれに対しても1ゼプトモル以下であることを示す。中位、遠位および共通プライマーのみの存在下、0.1アットモルの近位鋳型をサイクルさせた場合、または、近位、遠位および共通プライマーのみの存在下、0.1アットモルの中位鋳型をサイクルさせた場合、または、近位、中位および共通プライマーのみの存在下、0.1アットモルの遠位鋳型をサイクルさせた場合について別々の実験を行ったところ、生成物は何も産生しなかった。これは、類似していない鋳型とプライマー間の交叉反応性が欠如していることを示す（結果図示せず）。
【０１３１】
図8Bは種々の処置後、U-87 MG細胞から単離したRNAについて、近位、中位および遠位転写産物プライマーでRT-PCRを行った結果を示す。レーン1は、各鋳型の0.1アットモル混合物を増幅した後の生成物を含む。レーン4は、培地のみの存在下、U-87 MG細胞から単離されたRNAの増幅によるRT-PCR産物を示し、一方レーン3は、逆転写酵素をcDNA合成反応液に添加していないことを除けば、同じ反応液である(-RT対照)。レーン4では、遠位および近位増幅によりほとんど等量の生成物が見られるのに対し、レーン3は何も生成せず、これは、生成物の形成が逆転写酵素の存在に依存することを示している。レーン5、6、7および8は、10 ng/ml インターロイキン-1^-(IL-1^-)、10 nM ジデカノン酸ホルボール(PDD)、50 ng/ml塩基性線維芽細胞増殖因子(bFGF)、または1 mMジブチリル-cAMP (db-cAMP)でU-87 MG細胞を12時間処理したところ、培地のみ(レーン4)の場合に比べて、GDNFの近位および遠位転写産物の量に増加が見られたことを示す。レーン5〜8では、近位および遠位転写産物の割合はほぼ同等であったが、各レーンにおいて近位産物よりもいくらか遠位産物のほうが多いことが認められた。レーン9は、U-87 MG細胞を1 Mデキサメサゾンで12時間処理すると、培地のみの場合と比べて、GDNFの近位および遠位転写産物の量が減少することを示す。最後にレーン10は、U-87 MG細胞を10 ng/ml の腫瘍壊死細胞^(TNF^)で12時間処理すると、培地のみの場合と比べて、GDNFの近位および遠位転写産物の量が増加することを示す。従って、U-87 MG細胞では、GDNFの近位および遠位転写産物を認めるが中位転写物は認められず、これら転写産物の量は、IL-1^-、PDD、bFGF、db-cAMPまたはTNF^処理によって増加させることができるが、デキサメサゾンでは転写産物が減少する。
【０１３２】
図8Cは、種々のヒト組織から単離されたRNAについて、近位、中位および遠位プライマー混合物によるRT-PCRの結果を示す。レーン3〜8は、それぞれ、胎児肝、成人肝、胎児腎、成人脳、胎児脳および成人骨格筋からのRNA増幅産物を含むものであるが、これらは、遠位転写産物由来の生成物の存在のみを示す。胎児腎(レーン5)および成人骨格筋(レーン8)はほとんど等しい、最高濃度の生成物を示すのに対し、胎児脳(レーン7)、胎児肝(レーン3)および成人肝(レーン4)では、順に生成物の量が減少した。成人脳(レーン6)は、ようやく検出できる程度の生成物を示す。cDNA合成反応から逆転写酵素を除いた対照反応では、上記の組織すべてについて生成物を産生しなかった(結果示さず)。従って、U-87 MG細胞とは対照的に、これらの組織にはGDNFの遠位転写産物のみが含まれる。
【０１３３】
図8Aに示すRT-PCRの結果は、このアッセイがGDNFの三つの転写産物に感受性であり、かつ、特異的であることを示している。図8Bの結果は、多様な方法で処理したU-87 MG細胞において、近位および遠位転写産物が共にほぼ等しい割合で容易に検出されることを示している。しかしながら、選択されたヒト組織から単離したRNAのRT-PCでRは、遠位プロモーター活性のために、ほぼ遠位転写産物に限って検出された。これらのヒト組織に他の転写産物が存在する可能性はあるが、遠位転写産物は、これらの増幅条件下で検出される唯一の産物であるため、はるかに高い濃度で存在している。さらに、U-87 MG細胞は、特定の細胞型または、この限定された組織サンプリングには存在しない発生期を表す可能性がある。本発明の結果は、遠位プロモーターがインビボにおけるGDNF発現の主要な決定因子であることを示唆している。
【０１３４】
以上、1、2または3個のプロモーターを含む、遠位および近位ヒトGDNFプロモーターおよびリポーター遺伝子の構築物を開示してきた。本発明の好ましい態様をある程度詳細に記載したが、種々の変更を行うことができること、およびそれらも請求の範囲に定義する本発明の精神および範囲に含まれることと理解される。
【０１３５】
実施例1Cで得られた大腸菌形質転換体XLOLR/pRBSEco9.4#8の生物学的に純粋な培養物は、1997年7月15日、米国メリーランド州ロックビル、パークローンドライブ12301、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション(ATCC)に寄託され、寄託番号98498が付与された。この寄託はブダペスト条約の規定の下で行われた。本出願に記載した配列とルーチンのシークエンシングエラーによる寄託プラスミドに含まれる対象とする遺伝子配列との間に万一相違があったとしても、寄託したプラスミド対照の配列が基準となる。
【図面の簡単な説明】
【図１】 図1A〜1Dは種々のヒトGDNFプロモーターの構造を示す。図1Aは、エキソンI、II、IIIa+IIIbおよびIVの位置、および遠位、中位、近位プロモーターを示すヒトGDNFの遺伝子地図である。図1B、1Cおよび1Dは、それぞれ、遠位GDNFプロモーター、中位GDNFプロモーターおよび近位GDNFプロモーターに由来するGDNF遺伝子転写産物を図示する概略図である。
【図２】 図２はプラスミドpRBSEco9.4#8の一覧図である。
【図３】 図3A〜3B（配列番号：1）はヒト遠位GDNFプロモーターのヌクレオチド配列および最初のイントロン部分を示す。エキソンI（nt +1から開始する）には下線を付してあり、実施例1Eのヌクレオチド1〜174と同一である。コンセンサススプライス部位(ジャンクション)供与配列は、エキソンIの最も3'側の配列の下に示す。転写因子のコンセンサス配列はDNA配列の上に示し、転写因子の略称はコンセンサス配列の上に斜体で示す。ヌクレオチドの番号付けはエキソン1の起点に対してである。
【図４】 図4A〜4C（配列番号：2）はヒト近位GDNFプロモーターのヌクレオチド配列を示す。図中、エキソンIIには下線（中間転写産物）、エキソンIIIには二重下線を付けてあり、近位転写産物（エキソンIIIaで生じる）の起点は太字で示し、推定の転写因子名はこれらコンセンサス結合部位の上に示す。番号付けはエキソン2の起点に対してである。
【図５】 図５はプラスミドpGDNF-1635を実施例2に記載のように作る方法を示す。
【図６】 図6A〜6Bは、実施例5に記載するようにプラスミドpGDNFprox+distを作る方法を示す。
【図７】 図７は、ヒトGDNF遠位プロモーターおよびその様々な5'欠失体の地図を示す。1行目は、表示の転写因子の結合部位と思われる位置と共に完全な5'隣接断片を線状に記載したものである。以下の各行は、欠失の左側の5'-隣接配列の量を直線状に示したマップを示し、最も5'-側の配列の程度を（図3A〜3Bに示すように）各サブクローンの左側に表示する。実施例に記載されているように、クローンはすべてルシフェラーゼリポーターベクターpGL3の中に存在した。異なる二種の宿主における相対ルシフェラーゼ平均値+/- sem (n=6)を、それぞれの欠失体について右側に示す。
【図８】 図8A〜8Cは、実施例7に記載されているように、三種類の異なるGDNF転写産物についてRT-PCRの結果を示す。図8Aは、クローニングしたcDNA鋳型の較正結果を示す。レーン1：近位鋳型100ゼプトモル＋全プライマー；レーン2：中位鋳型100ゼプトモル＋全プライマー；レーン3：遠位鋳型100ゼプトモル＋全プライマー；レーン4：鋳型なし；レーン5：各鋳型100ゼプトモル＋全プライマー；レーン6：各鋳型10ゼプトモル＋全プライマー；レーン7：各鋳型1ゼプトモル＋全プライマー。図8Bは、種々の処理を12時間行った後のU-87 MG細胞の結果を示す。レーン1、クローニングした各鋳型10ゼプトモル＋全プライマーの陽性対照；レーン2、マーカー100 および200 hp；レーン3、レーン4と同じであるが逆転写酵素による処理を行っていない陰性対照；レーン4、培地のみ；レーン5、IL-1^- (10 ng/ml)；レーン6、PDD (10 nM)；レーン7、BFGF (50 ng/ml)；レーン8、db-cAMP (1 mM)；レーン9、デキサメサゾン(1 M)；レーン10、TNF^ (10 ng/ml)。図8Cはヒト組織の結果を示す。レーン1、クローニングした各鋳型10ゼプトモルの陽性対照；レーン2、マーカー100 および200 hp；レーン3、胎児肝；レーン4、成人肝；レーン5、胎児腎；レーン6、成人脳；レーン7、胎児脳、およびレーン8、成人骨格筋。
【配列表】

[0001]
The present invention relates generally to neurotrophic factors. More particularly, the present invention relates to a neuroglia trophic factor (GDNF) promoter derived from a human glial cell line, a reporter gene construct comprising the human GDNF promoter, and a compound that is therapeutically effective in the treatment of Parkinson's disease or other central and peripheral neurodegenerative diseases. It relates to a method of using the construct for screening.
[0002]
Parkinson's disease is an unexplained progressive neurodegenerative disease affecting an estimated 600,000 to 1 million people in the United States. The disease has no clear class or racial selectivity and affects both men and women. Parkinson's disease is characterized by symptoms such as muscle tremors, muscle weakness, stiffness, slow movements associated with changes in posture and balance (motion slowness). Without treatment, affected individuals progressively worsen to stiff ataxia requiring constant care in 5 to 10 years. Complications resulting from lack of mobility often result in death. At present, there is no diagnostic method for Parkinson's disease, and any treatment is rather a temporary relief rather than a cure. From the viewpoint of pathophysiology, Parkinson's disease has severely lost pigmented dopaminergic nerves in the substantia nigra and melanin-containing neurons in the locus coeruleus and dorsal motor nucleus of the vagus nerve. The main neuropathological lesion of Parkinson's disease is the loss of dopaminergic nerves and depletion of dopaminergic terminals in the striatum. This selective neuronal loss reduces the concentration of the neurotransmitter dopamine in the striatum.
[0003]
Currently, the most effective treatment to relieve symptoms of Parkinson's disease is oral administration of L-3,4-dihydroxyphenylalanine (L-DOPA) in combination with peripherally acting inhibitors of aromatic L-amino acid decarboxylase It is to be. Unlike dopamine, L-DOPA is actively transported through the blood-brain barrier to the presynaptic cell terminals of dopaminergic nerves. At that time, L-DOPA is decarboxylated into dopamine, which is stored by transport proteins. Isolated in the cell. L-DOPA treatment alleviates all symptoms of Parkinson's disease, especially when treatment is initiated early in the disease process.
[0004]
Transforming growth factor-(TGF--), a superfamily distant member, is a glial cell line-derived neurotrophic factor (GDNF) originally cultured in embryonic ventral midbrain dopaminergic neurons Isolated from the ability to induce dopamine uptake and cell survival. GDNF has been purified and sequenced from conditioned media of rat B49 glial cells (Lin et al. (1993), Science 260, 1130), and rat GDNF cDNA has been cloned from a human genomic library. It has been used to isolate the protein coding portion of the gene (International Patent Publication No. WO 93/06116; GenBank accession numbers L19062 and L19063).
[0005]
GDNF is an approximately 39 kD glycosylated protein whose native form exists as a homodimer. In humans and rodents, different splicing forms result from a single gene. Both types include consensus signal peptide sequences and consensus sequences for proteolytic processing. Proteolytic cleavage yields the same mature 134 amino acid residue type.
[0006]
GDNF plays a critical role in the development and differentiation of the mammalian nervous system. GDNF promotes dopamine uptake and cell survival of embryonic midbrain dopaminergic neurons and the survival and / or differentiation of a broad central and peripheral nervous system and non-neural cell population. In the central nervous system, in vitro studies support the developmental role of GDNF in the survival of midbrain dopaminergic, cerebellar Purkinje, and cranial and spinal motor neurons. In the peripheral nervous system, GDNF supports the development of many neuronal populations, including sympathetic, parasympathetic, sensory and autonomic nerves.
[0007]
Localization of GDNF mRNA transcripts in the GDNF-sensitive neural target region is consistent with the function of GDNF in vivo as a target-derived neurotrophic factor. Furthermore, studies using GDNF-deficient mice have confirmed that GDNF plays an indispensable role in the development of the kidney during embryonic development as well as the multifaceted role of GDNF in peripheral nerve cell development.
[0008]
Although the importance of GDNF during development is well known, the role of GDNF in adults is less clear. For clinical significance, exogenous GDNF is degenerated by axotomy of the adult rat brain and 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6- of nigrodopaminergic neurons in rodents. Protects midbrain dopaminergic neurons against tetrahydropyridine (MPTP) -induced degeneration. Furthermore, when GDNF is administered intracerebrally to rhesus monkeys that exhibit Parkinson's disease-like symptoms induced by MPTP, they show significant improvements in motor slowness, muscle rigidity, and posture instability. Based at least in part on these results, clinical trials are underway to administer recombinant GDNF for the treatment of Parkinson's disease.
[0009]
Little is known about how cells and molecules regulate GDNF expression. At the cellular level, GDNF mRNA is present in both neurons and astrocytes and, like many neurotrophic factors, its expression is elevated in damaged tissues. GDNF mRNA levels are elevated in hippocampal nerves, and hippocampus and striatum primary astrocytes in response to excitatory amino acids.
[0010]
Due to its relatively large size, GDNF does not cross the blood-brain barrier and direct administration into the brain is the only viable means of administration. This requires that GDNF be injected stereotaxically into the brain or administered GDNF intracerebroventricular (ICV), which severely limits the therapeutic utility of GDNF. . On the other hand, non-invasive therapies that protect the substantia nigra from cell death, such as small molecules aimed at specifically increasing endogenous GDNF levels and / or their release would be preferred. Ideally, if such small molecules can be administered by any convenient route to cross the blood brain barrier and increase the local synthesis of GDNF, this would make the target population of dopaminergic neurons dangerous for Parkinson's disease To avoid exposure. Such therapies will be less pulsatile and less invasive than intraparenchymal, ICV, or subarachnoid injections of GDNF.
[0011]
There is a need in the art for alternative means of increasing the tissue concentration of GDNF. One such method is to increase endogenous GDNF levels by inducing GDNF gene expression at the transcriptional level.
[0012]
Therefore, proximal and distal promoters were first identified, sequenced, characterized and cloned from the human GDNF gene. Distal and proximal promoters have sequences characteristic of eukaryotic gene regulatory elements. For example, these promoters contain transcription factor binding site consensus sequences. In certain embodiments, the distal promoter is a promoter nucleotide sequence as described at positions −62 to −1 of FIGS. 3A-3B (SEQ ID NO: 1), and −363 to −1 of FIGS. 3A-3B (SEQ ID NO: 1). Or the promoter nucleotide sequence described at positions −1635 to −1 in FIGS. 3A to 3B (SEQ ID NO: 1).
[0013]
In addition, recombinant constructs were made in which the promoter was operably linked to a reporter gene encoding a polypeptide detectable by any of a variety of techniques well known in the art. Candidate compounds can be screened for whether this construct is transfected into human neurons and glial cells to stimulate gene expression under the control of a promoter. In this way, the present invention provides means and methods by which compounds that can induce GDNF gene expression in vivo are identified. Such compounds are useful for the treatment of central and peripheral neurodegenerative diseases and neurodegenerative sequelae of renal, genitourinary, gastrointestinal and physical neurotrauma when administered to mammalian subjects in an acceptable pharmaceutical formulation It is.
[0014]
Furthermore, the present invention provides methods for identifying compounds that modulate the expression of GDNF. The method comprises the steps of: (a) introducing a DNA fragment comprising a human distal GDNF promoter operably linked to a reporter gene into a cell; (b) mixing a test compound with the cell and expressing the cell with the reporter gene Culturing under possible conditions; and (c) if the expression level of the reporter gene product is changed, the test compound is expressed in the presence and absence of the test compound, indicating that it can modulate the level of GDNF expression Comparing the level of the reporter gene product.
[0015]
These and other aspects of the present invention will readily occur to those skilled in the art in view of the disclosure herein.
[0016]
The practice of the present invention will employ, unless otherwise specified, routine protein chemistry and biochemistry techniques, molecular biology, microbiology and recombinant DNA techniques within the skill of the art. Such techniques are described fully in the literature. For example, Sambrook et al., “Molecular Cloning: A Laboratory Manual”, 2nd edition (1989); “DNA Cloning”, Volume I, Volume II ( Grover (DN Glover, 1985); “Oligonucleotide Synthesis” (MJ Gait, 1984); “Nucleic Acid Hybridization” (BD Hames and Higgins (SJ)) Higgins, 1984); “Animal Cell Culture” (RK Freshney, 1986); Schleif, “Practical Methods in Molecular Biology” (Springer-Verlag, NY, 1981); “Immobilized Cells and Enzymes” (IRL Press, 1986); “PCR: A Practical Approach” (McPherson et al. Hen, (199 1) IRL Press); Perbal, B., "A Practical Guide to Molecular Cloning" (1984); Series Methods In Enzymology (S. Colowick) and Kaplan (N Kaplan), Academic Press, Inc.).
[0017]
All patents, patent applications and publications mentioned above and below are hereby incorporated by reference.
[0018]
I.Definitions and nomenclature
Before the present invention is disclosed and described in detail, it should be understood that the present invention is not limited to a particular assay format, material or reagent, and of course they can be varied. It should also be understood that the terminology used herein is for the purpose of describing particular embodiments only and is not intended to be limiting.
[0019]
As used herein and in the claims, the singular forms (“a,” “an,” and “the”) include plural unless the context clearly dictates otherwise. It must be noted. Thus, for example, reference to a plasmid or vector comprising a “GDNF promoter” includes a plurality of plasmids or vectors comprising a plurality of such promoters, and “human cell lines ( "a human cell line)" means that one or more such cell lines are included, and "a transcription initiation site" means that the transcription start site is 1 It means to include more than one.
[0020]
In this specification and in the claims, a number of terms are used that are defined to have the following meanings.
[0021]
A “GDNF promoter” is a DNA regulatory region capable of binding RNA polymerase and initiating transcription of a downstream (3 ′ direction) coding sequence. A GDNF promoter for the purposes of the present invention is generally a DNA fragment of about 50 to about 200 bp or more in the 5 'flanking DNA upstream of the transcription start site. This promoter forms an initiation complex with RNA polymerase to initiate and drive transcription of downstream sequences. The initiation complex can be modified by activating an element called an “enhancer” or by inhibiting an element called a “suppressor”. The term “promoter” includes activating and inhibiting elements, unless otherwise specified. For the purposes of the present invention, the promoter sequence is a transcription initiation site at its 3 'end so that it contains a fragment containing the minimum bases or elements necessary to initiate a detectable level of transcription above background. Binds (but not necessarily includes a start site that can be provided by a heterologous 5′-UTR) and extends upstream (5 ′ direction).
[0022]
Furthermore, as used herein, a “GDNF promoter” refers to deletions, additions and substitutions relative to the native sequence so long as the promoter retains the ability to initiate transcription at a detectable level above background. Sequences containing modifications such as are contemplated. These modifications may be intentional, such as through site-directed mutagenesis, or may be incidental, such as through natural mutation events or errors due to PCR amplification.
[0023]
For example, as described in the examples below and as shown in the accompanying drawings, consensus binding sites for a number of transcription factors have been found in the GDNF promoter described herein, and epidermal growth factor Early growth response (egr) family members such as receptor transcription factor (ETF), egr1 and egr2 (see, eg, Liu et al. (1996), Crit. Rev. Oncogen. 7, 101) Sp1 (see, eg, Dynan et al. (1983) Cell 35, 79; Briggs et al. (1986), Science 234, 47; Hagen et al., EMBO J. 13, 3843), CREB / ATF family members (see, eg, Papavassiliu (1994), Anticancer Res. 14, 1801), AP-2 (eg, Mitchell et al., (1987), Cell 50, 847; Imagawa et al. ( 1987), Cell 51, 251; Williams et al. (1988), Genes Dev. 2, 1557), nucleus. Factor κB (NF-κB) (see, for example, Baeuerle et al. (1996), Cell 87, 13; Baldwin et al. (1996), Ann. Rev. Immunol. 14, 649), yin-yang -1 (YY-1) and binding sites for GC factor (GCF). Some of these factors, such as ETF, GCF and YY-1, repress transcription. Thus, to enhance transcription of genes operably linked to promoter sequences, deletion or mutation of one or more regions containing the binding sites for these factors (as specified in FIGS. 3A-3B and 4A-4C). May be desirable).
[0024]
For example, with respect to the distal promoter, as shown in FIG. 7, and as described in the Examples, the promoter sequence truncated at position -62, numbered with respect to exon I (eg, from -62 in FIG. 7- (Including the sequence at position 1) maintains high activity when used in human neuroblastoma SK-N-AS cells. Thus, the distal GDNF promoter for the purposes of the present invention is described in FIG. 7 as long as the promoter retains the ability to initiate transcription at a detectable level above background in a given cell line. Any of the deletions may be included, as well as intervening truncations (terminal truncations) such as promoter sequences truncated at positions such as -63, -194, -308, -363, etc. . Specifically excluded from the definition of “GDNF promoter” as used herein are sequences that begin with exon I and that completely match the mouse GDNF sequence portion corresponding to the human GDNF sequence that follows upstream of exon I (See, for example, GenBank registration number D88350S1).
[0025]
The “distal” GDNF promoter is the GDNF promoter immediately adjacent to and upstream of exon I of the human GDNF gene. The “medium” GDNF promoter is the GDNF promoter downstream of the distal GDNF promoter, immediately adjacent to and upstream of exon II of the human GDNF gene. A “proximal” GDNF promoter is a GDNF promoter downstream of exon II and upstream of exon IIIa + IIIb (also referred to herein as “exon III”) of the human GDNF gene. As used herein, the phrase “proximal GDNF promoter” is intended to include both the intermediate GDNF promoter and the proximal GDNF promoter unless otherwise stated. The mapping between the human GDNF gene and the promoter is described in detail below.
[0026]
A “reporter gene” is a gene that gives a phenotype to a cell that expresses a reporter gene so that the cell can be identified under appropriate conditions during expression. For example, a reporter gene may produce a polypeptide product that can be easily detected or measured by conventional assays. Suitable reporter genes known in the art that provide this feature include chloramphenicol acetyltransferase (CAT activity), β-galactosidase, luciferase, alkaline phosphatase, human growth hormone, green fluorescent protein (GFP) Genes encoding fluorescent proteins and the like are included. In fact, a gene encoding a protein or enzyme that can be readily measured, for example, by an immunoassay, such as an enzyme immunoassay (ELISA), or by enzymatic conversion of a substrate to a detectable product, and Any gene that is not substantially expressed in a host cell (specific expression without background) can be used as a reporter gene for examining promoter activity. Other reporter genes used in the present invention include genes that can select cells based on their ability to grow in the presence or absence of chemicals or other substances that inhibit essential cell functions. Therefore, as a suitable marker, a gene encoding a protein that imparts drug resistance or drug sensitivity, or a protein that changes the antigenic properties of those cells that express the reporter gene when the cells are grown in an appropriate selective medium. Is mentioned. For example, reporter genes include cytotoxic and drug resistance markers that select cells by their ability to grow in one or more cytotoxic antibodies or drug-containing media; with or without the addition of specific nutrients or additives, Included are auxotrophic markers that select cells by their ability to grow on a defined medium; and, for example, metabolic markers that select cells by their ability to grow on a particular medium that contains an appropriate sugar as the sole carbon source. These reporter genes and other reporter genes are well known in the art.
[0027]
A “change in reporter gene product level” refers to the level of reporter gene product expressed in cells not exposed to the candidate compound and / or in cells exposed to the candidate compound relative to cells exposed to the control compound. This is shown by comparing the expression levels of the reporter gene product. This level change can be measured quantitatively, for example, by measuring with a spectrophotometer, fluorescence spectrophotometer, luminometer, etc., and is generally statistically significant in level relative to background. Represents an increase or decrease. However, such changes can also be easily seen by visualization without making quantitative measurements, such as giving the cells the ability of the reporter gene to form colored colonies with chromogenic substrates. Is the case.
[0028]
As used herein, the term “expression” intends both transcriptional and translational processes, ie, production of messenger RNA and / or production of protein therefrom.
[0029]
“Parkinson's disease-like symptoms” include muscle tremor, muscle weakness, tonicity, slow movement, changes in posture and balance, dementia and similar symptoms commonly associated with Parkinson's disease or other neurodegenerative diseases.
[0030]
As used herein, the term “polynucleotide” or “oligonucleotide” refers to a polymer of nucleotides of any length, either ribonucleotides or deoxyribonucleotides. The term only refers to the primary structure of the molecule. The term thus includes double- and single-stranded DNA and double- and single-stranded RNA. The term further includes modifications, such as by methylation and / or capping, and unmodified forms of the polynucleotide.
[0031]
“Recombinant host cell”, “host cell”, “cell”, “cell line”, “cell culture” and other terms that refer to microorganisms cultured as unicellular bodies, or higher eukaryotic cell lines Refers to a cell that could or has been used as a recipient of a recombinant vector or other transfer DNA, regardless of the method by which the DNA is introduced into the cell or subsequent cell treatment. The term includes the progeny of the original cell that has been transfected. Primary cultured cells as well as cells such as oocytes can also be used as recipients.
[0032]
A “vector” is a replicon with another polynucleotide segment that results in replication and / or expression of the attached segment. The term includes expression vectors, cloning vectors and the like.
[0033]
A “coding sequence” is a polynucleotide sequence that is transcribed into mRNA and translated into a polypeptide. The boundaries of the coding sequence are determined by a translation start codon at the 5 ′ end and a translation stop codon at the 3 ′ end. A coding sequence includes, but is not limited to, mRNA, cDNA, synthetic DNA, and recombinant polynucleotide sequences. Also included is genomic DNA in which the coding sequence is interrupted by an intron.
[0034]
“Functionally coupled” refers to a situation in which the described components are in a relationship that allows them to function in their intended manner. Thus, for example, a control sequence, such as a promoter “operably linked” to a coding sequence, is positioned so that the coding sequence is expressed under conditions compatible with the control sequences. A coding sequence may be operably linked to control sequences that direct transcription of the polynucleotide, whereby the polynucleotide is expressed in the host cell. A control sequence need not be contiguous with a coding sequence, so long as it functions to direct its expression. Thus, for example, an intervening untranslated transcription sequence can exist between a promoter sequence and a coding sequence, and the promoter sequence is still considered “operably linked” to the coding sequence. A functionally linked GDNF promoter directs transcription of the nucleic acid molecule bound to it in an appropriate reading frame.
[0035]
The term “transfection” refers to the insertion of an exogenous polynucleotide into a host cell, regardless of the method used for insertion or the molecular form of the inserted polynucleotide. This includes insertion of the polynucleotide itself and insertion of a plasmid or vector containing the exogenous polynucleotide. The exogenous polynucleotide may be directly transcribed and translated by the cell and maintained as a non-integrating vector, eg, as a plasmid, or may be stably integrated into the host genome.
[0036]
“Transfection” is generally used with respect to eukaryotic cells, whereas the term “transformation” is used to refer to the insertion of a polynucleotide into a prokaryotic cell.
[0037]
The term “isolated” when referring to a polynucleotide or polypeptide is intended to mean that the indicated molecule is present in a substantial absence of other similar biological macromolecules. As used herein, the term `` isolated '' refers to at least 75%, more preferably at least 85%, more preferably at least 95%, and most preferably at least 98% by weight of the composition of the isolated poly Means a nucleotide or polypeptide. An “isolated polynucleotide” that encodes a specific polypeptide refers to a polynucleotide that is substantially free of other nucleic acid molecules that do not encode the polypeptide of interest. However, the molecule may contain functionally and / or structurally conservative mutations as defined herein.
[0038]
Two polynucleotide sequences or two fragments or segments of a polynucleotide sequence are at least about 65%, preferably at least about 75%, more preferably at least about 80-85%, and most preferably at least about 65% by weight of the nucleotide. “Substantially homologous” if at least about 90-95% by weight or more matches over a defined length of the molecule. As used herein, a substantial homologue also refers to a sequence that exhibits identity to a particular polynucleotide sequence. Polynucleotide sequences that are substantially homologous can be identified, for example, in Southern hybridization experiments under stringent conditions defined for that particular system. Defining appropriate hybridization conditions is within the skill of the art. See, for example, Sambrook et al., “DNA Cloning,” Volume I, Volume II, supra; Nucleic Acid Hybridization, supra.
[0039]
Other techniques for determining nucleic acid sequence identity are well known in the art and include determining the nucleotide sequence of a polynucleotide of interest and comparing it to a second base sequence. Programs available in the 8th edition of the Wisconsin Sequence Analysis Package (available from Genetics Computer Group, Madison, Wis.), Such as the BESTFIT, FASTA, and GAP programs, can calculate the identity between two polynucleotides. Furthermore, the database search tool BLAST (Altschul et al. (1990), J. Mol. Biol.215403-410) may be used to search a genetic database to determine the percent identity between a given sequence and the sequences present in the database. Other programs that calculate identity or similarity between sequences are known in the art.
[0040]
A “functionally equivalent” sequence to a GDNF promoter sequence is a sequence that functions in the same manner as the corresponding GDNF promoter. Thus, for example, a “functionally equivalent” promoter sequence described herein, eg, to a distal GDNF promoter, directs transcription of a nucleic acid molecule that binds in an appropriate reading frame above background levels. This is a possible sequence.
[0041]
II.General method
Provided in the present invention is an isolated DNA comprising a human distal GDNF promoter and a proximal GDNF promoter, and a reporter gene construct comprising a GDNF promoter. The present invention also provides a method of screening a compound for GDNF promoter inducing activity using the construct, a cell transformed or transfected with the construct, a compound identified as a human GDNF promoter inducer, and a human GDNF promoter inducer Also included is a method of treating a subject exhibiting Parkinson's disease-like symptoms by administration of a compound identified as.
[0042]
As described in detail in Example 1, exon I of the human GDNF gene (see FIG. 1) and the distal promoter upstream thereof are identified, amplified, cloned, and sequenced according to the following general configuration: be able to. The presence of GDNF mRNA in human tissue is evidenced by reverse transcriptase polymerase chain reaction (“RT-PCR”) using oligonucleotide primers based on the 5 ′ end of rat GDNF cDNA. PCR identification of human GDNF gene sequences involves amplifying sequences from the human genome or cDNA library. Degenerate or non-degenerate oligonucleotides for PCR can be made based on the sequence of rat GDNF or a mammalian GDNF sequence known to be substantially homologous to a portion of human GDNF. Such PCR reaction products may be selected according to size by gel electrophoresis, cloned into an appropriate vector, and the cloned DNA sequenced to identify the GDNF promoter sequence.
[0043]
More specifically, PCR uses short oligonucleotide primers (typically 10-20 nucleotides in length) that match the opposite ends of the desired sequence in the DNA molecule. It is not necessary to know the sequence between the primers. The initial template can be either RNA or DNA. When RNA is used, it is first reverse transcribed into cDNA. The cDNA is then denatured using well known techniques such as heating and an appropriate molar amount of the appropriate oligonucleotide primer is added.
[0044]
After hybridizing the primer to the complementary target polynucleotide, primer extension is performed using DNA polymerase in the presence of deoxynucleotide triphosphates or nucleotide congeners. The resulting product includes each primer covalently linked at the 5 'end with the newly synthesized complement of the original strand. The replicated molecules are denatured again and hybridized with primers, etc., until the product is sufficiently amplified. Such PCR methods are described, for example, in US Pat. Nos. 4,965,188, 4,800,159, 4,683,202, and 4,683,195, which are incorporated herein by reference in their entirety. The PCR product is cloned and clones containing amplified DNA derived by separation of primer extension strands are selected. Selection can be performed using the original primer as a hybridization probe.
[0045]
When the above method is used, rat and mouse cDNAs have reached the point where the human gene sequence immediately upstream of the translation origin of the relevant part of the gene (referred to as “exon III” in the present invention) has a splice junction acceptor site. And was found to be homologous. However, the diversity of human cDNA sequences upstream of the splice junction acceptor site indicated that there is another exon (s), exon I, herein. The location of exon I was found by PCR to be approximately 5 kb upstream of exon III start. An approximately 9.4 kb EcoRI fragment was identified as containing both exon I and exon III using Southern blot analysis. An approximately 9.4 kb EcoRI fragment was cloned, propagated with the vector pBK-CMV, excised from it and sequenced. Nucleotide sequence analysis of this fragment revealed that (1) there was an exon I sequence with greater than 90% homology to the 5 'end of rat GDNF cDNA, and (2) the 5' end of the exon I sequence was 5 ' 'Splice donor site, (3) exon I is about 5 kb upstream of exon III origin, and (4) the fragment is about 79% identical to a limited region of the mouse GDNF gene upstream of exon I (Exon I to 140 bp upstream of exon I, GenBank accession number D88350S1). The origin of GDNF promoter transcription was determined by 5 'end analysis of GDNF cDNA.
[0046]
The human proximal GDNF promoter can be isolated as described above. In particular, a cDNA derived from a proximal promoter can be obtained from human fetal kidney, brain or skeletal muscle poly A + RNA using RT-- as described in detail in Example 4 using oligonucleotide primers based on DNA encoding human GDNF. It can be identified and amplified by PCR analysis.
[0047]
Once produced, the DNA may then be incorporated into a vector for replication into a suitable host cell. The human distal GDNF promoter, human proximal GDNF promoter and both human distal and proximal GDNF promoters may be cloned into an appropriate vector upstream of a reporter gene such as, for example, a luciferase gene. Each of the GDNF promoter and luciferase constructs was transfected into a human cell line, which was then used to examine promoter-regulated luciferase expression and to screen candidate compounds for human GDNF promoter-inducing activity indexed by luciferase production. Can be used. Of course, other methods of vector construction and various reporters and cell lines can also be used to measure promoter activity of the present invention.
[0048]
In particular, methods known in the art are used for vector construction. In general, site-specific DNA cleavage is performed by treating with an appropriate restriction enzyme under conditions usually specified by the manufacturers of these commercially available enzymes. After incubation with the restriction enzyme, the protein is denatured and extracted, and DNA is recovered by precipitation. The cleaved fragments may be separated according to methods known to those skilled in the art, for example, using polyacrylamide or agarose gel electrophoresis.
[0049]
The sticky end-cleaved fragment can be blunted using E. coli DNA polymerase 1 (Klenow) in the presence of the appropriate deoxynucleotide triphosphates (dNTPs) present in the mixture. Treatment with S1 nuclease may be used, which results in hydrolysis of the single stranded DNA portion.
[0050]
Ligation is performed using T4 DNA ligase and ATP using standard buffers and temperature conditions. Alternatively, restriction enzyme digestion of unwanted fragments can be used to prevent ligation. The ligation reaction mixture is transformed or transfected into a suitable host and successful transfectants / transformants (transformed cells) are selected by drug resistance or other markers.
[0051]
For example, standard vector constructs generally include a reporter and / or a selectable marker element. Such an element is a gene that phenotypes a cell that expresses the marker so that the cell can be identified under appropriate conditions. In general, reporter genes and selectable markers select transformed cells based on their ability to grow in the presence or absence of chemicals or other agents that inhibit basic cell function. Thus, suitable markers include proteins that confer drug resistance or sensitivity, impart color, or change the antigenic characteristics of those cells that express the selectable marker when the cells are grown in a suitable selective medium. Contains the encoding gene. For example, selectable markers include cytotoxic markers, antibiotic markers and drug resistance markers that select cells by their ability to grow in media containing one or more cytotoxic agents, antibiotics or drugs; specific nutrient sources or An auxotrophic marker that selects cells by their ability to grow in a defined medium with or without additives; for example, cells by their ability to grow in a defined medium containing a suitable sugar as the sole carbon source Or a marker that confers color colony-forming ability on the chromogenic substrate or causes the cell to fluoresce.
[0052]
Next, plasmids are prepared from transfectants / transformants (transformed cells) according to methods known to those skilled in the art and reported in Clewell et al. (1972), J. Bacteriol. 110, 667. As such, chloramphenicol amplification can usually be performed thereafter. DNA is isolated and analyzed, usually by restriction enzyme analysis and / or sequencing. Sequencing is further described in Messing et al. (1981), Nucleic Acid Res. 9, 309, Sanger et al. (1977), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 5463. The well-known dideoxy method, or Maxam et al. (1980), Meth. Enzymol.65, 499 may be used.
[0053]
The host cell is then transformed or transfected with the vector of the invention. The vector may be in the form of a plasmid, virus particle, phage or the like. The host cell can be cultured in a medium obtained by modifying a normal nutrient medium so as to be suitable for activation of a promoter, selection of a transformant / transfectant, and the like. Culture conditions such as temperature, pH, etc. are generally the same as those used so far for the selected host cell and are known to those skilled in the art.
[0054]
Both prokaryotic and eukaryotic host cells can be used to clone the desired oligonucleotide fragment. For example, E. coli is often used among prokaryotic host cells. However, if desired, prokaryotic host cells such as Bacillus, Pseudomonas strains and the like may be used. Prokaryotic host cell compatible transfer vectors can be, for example, those derived from plasmid pBR322 containing operons that confer ampicillin and tetracycline resistance, and various pUC vectors that also include sequences that confer antibiotic resistance markers. These markers can be used to obtain successful transformants by selection.
[0055]
Eukaryotic host cells include cultured yeast and mammalian cells. Commonly used yeast hosts are Pichia pastoris, Saccharomyces cerevisiae and S. carlsbergensis. Vectors that are compatible with yeast have markers that allow selection of successful transformants by conferring auxotrophy to auxotrophic mutants or heavy metal resistance to wild type strains. Yeast compatible vectors include 2-_ origin of replication (Broach, (1983), Meth. Enzymol. 101, 307), a combination of GEN3 and ARS1, or an appropriate fragment integrated into the host cell genome. Other means of ensuring replication can be used, such as the resulting sequence.
[0056]
Mammalian cell lines that can be used as cloning hosts are known in the art and can be obtained from depository institutions such as the American Type Culture Collection. These include, but are not limited to, human glioblastoma cells, neuroblastoma cells, HeLa cells, human embryonic kidney (HEK) cells, Chinese hamster ovary (CHO) cells, baby hamster kidney (BHK) cells, etc. . Genes expressed in mammalian cells may require transcription termination and polyadenylation sequences, as well as bovine growth hormone terminator sequences, such as those derived from SV40 as described above in Sambrook et al. Enhancer sequences that increase expression may also be included, and sequences that amplify the reporter gene are also desirable. These sequences are known in the art and include, for example, the mouse dihydrofolate reductase (dhfr) gene flanking the coding sequence. The cells can then be selected for methotrexate resistance in dhfr-deficient cells. For example, Urlaub et al. (1980), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 4216-4220; Ringold et al. (1981), J. Mol. And Appl. Genet. 1, 165 See ~ 175. Suitable vectors for replication in mammalian cells may include sequences that reliably integrate the viral replicon or appropriate sequences, including sequences encoding GDNF promoter and reporter genes, into the host genome.
[0057]
Polynucleotides can be introduced by methods described in amphibian cell-like systems, Summers & Smith, Texas Agricultural Experiment Station Bulletin No. 1555 (1987) using methods well known in the art. Other eukaryotic cell systems are also known, as are methods for using and introducing into systems such as insect cells.
[0058]
Transformation or transfection involves packaging a polynucleotide into a host cell, such as packaging the polynucleotide into a virus by direct uptake of the polynucleotide by the host cell, transducing the host cell with the virus, and the like. Any of the known methods to be introduced may be used. Such methods include DEAE-dextran mediated transfection, calcium phosphate precipitation, polylysine- or polyornithine mediated transfection, or aluminum silicates containing strontium phosphate, bentonite and kaolin, chromium oxide, magnesium silicate, talc, etc. Other methods include precipitation using an insoluble inorganic salt, electroporation, sonoporation, protoplast fusion, lipofection, peptoid transport, or microinjection. For a discussion of techniques for transforming and transfecting cells, see, for example, Sambrook et al. The selected transformation or transfection technique will depend, in part, on the host cell used and will be routinely determined by one skilled in the art.
[0059]
A human GDNF promoter-reporter gene construct expressed in or isolated from a recombinant host cell can stimulate whether the compound can stimulate reporter gene product expression and stimulate in vivo expression of GDNF. It can be used for screening candidate compounds to examine whether or not they can. One preferred method for identifying compounds that stimulate human GDNF promoter-controlled reporter gene expression is to introduce a DNA construct comprising a GDNF promoter operably linked to a reporter gene into a cell, and to mix a test compound with the cell And measuring the expression level of the reporter gene product. A change in the expression level of the reporter gene product indicates that the compound can regulate the GDNF expression level. The reporter gene construct is preferably stably integrated into the chromosomal DNA of the cell, but is also functional for the purposes disclosed herein in the form of extrachromosomal elements. The cell is a eukaryotic cell, preferably a mammalian cell, more preferably a human cell, even more preferably a human cell expressing GDNF, or an element necessary to express a structural gene under the regulatory influence of a mammalian gene promoter Any cell may be included. In the examples herein, human glioblastoma U-87 MG and human neuroblastoma SK-N-AS cells were used as the hosts for the promoter / reporter construct because these cells were ELISA. This is because GDNF was produced in the quantification by, and therefore GDNF mRNA was produced when confirmed by RT-PCR.
[0060]
Thus, for example, the test compound is capable of modulating reporter gene expression by a human GDNF-inducing compound, such as forskolin, in the ability to modulate luciferase expression or in a mammalian host cell transfected with a human GDNF promoter-luciferase gene construct. Assess whether it can interfere with or enhance the regulation of.
[0061]
To evaluate whether a candidate compound induces reporter gene expression by generating an intracellular signal that results in activation of the human GDNF promoter operably linked to the reporter gene, untreated cells are preferred, Permeabilized cells may be used to examine the effectiveness of candidate compounds. Permeabilization of host cells carrying the human GDNF promoter / reporter gene construct is performed by methods well known in the art.
[0062]
Candidate compounds are also described in “Transfer of Genes: A Practical Approach” (IRL Press, 1993), edited by Hames et al., Sierra et al., “Nuclear Extracts from Differentiated Tissues”. In the in vitro transcription assay described in pages 125 to 152 of “In Vitro transcription with nuclear extracts from differentiated tissues”, it may be evaluated whether or not GDNF expression is regulated using a GDNF promoter gene construct.
[0063]
Compounds that modulate GDNF expression by binding to the GDNF promoter or fragments thereof are described, for example, by Gottesfeld et al. (1997), Nature 387, 202-205 and Heguy et al. (1995), Gene Expression 4, Evaluation can be performed using the method described in 337-344.
[0064]
Thus, agents known to stimulate reporter gene expression in cells transfected with human GDNF promoter / reporter gene constructs include Parkinson's disease, amyotrophic axosclerosis, epilepsy, Alzheimer's disease, Alternatively, it is considered a promising therapeutic agent for a number of neurodegenerative diseases including, but not limited to, symptoms or illnesses that are pathogenic due to lack of or reduced levels of natural GDNF. In addition, such agents are promising therapeutic agents that support prenatal peripheral neurogenesis as well as fetal neurogenesis. The effectiveness of therapeutic agents has been tested in any of a number of the above animal models of the disease known in the art.
[0065]
For example, the most widely used animal models of Parkinson's disease usually mimic dopaminergic neurodegeneration by the administration of toxins. Unilateral injection of 6-hydroxydopamine (6-OHDA) into the substantia nigra of mice or rats results in neuronal loss in the ipsilateral striatum and substantia nigra, but almost in the contralateral hemisphere no change. Similarly, methamphetamine-induced neurotoxicity results in neurodegeneration of dopaminergic and serotonergic neurons, which is considered by those skilled in the art to be closely related to the human condition. The effectiveness of the drug is evaluated by behavioral results using apomorphine-induced turning behavior.
[0066]
Another Parkinson's disease model is constructed using the neurotoxin N-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine (MPTP). MPTP was administered to mice, rats and monkeys. The administration of MPTP to monkeys not only causes dopaminergic and serotonergic loss in the substantia nigra and striatum, but is similar to that seen in human Parkinson's disease patients, such as ataxia and stiff posture Behavioral symptoms occur.
[0067]
For the above animal model of Parkinson's disease, a large number of mouse inbred lines that have been proven to gradually decrease the number of dopaminergic neurons can be used. For example, D2 receptor-deficient mice whose behavioral characteristics are similar to patients with Parkinson's disease have been created by homologous recombination. Fitzgerald et al. (1993), Brain Res. 608, 247-258. The second example is a weaver mutant mouse in which the number of midbrain dopaminergic neurons decreases to 40% over time, up to 40%. Verina et al., (1997), Exp. Brain Res. 113, 5-12; Adelbrecht et al., (1996), Mol. Brain Res. 43, 291-300; Mitsumoto et al., ( 1994), Science 265, 1107-1110.
[0068]
Other neurodegenerative disease animal models have also been described, and treatment of agents known to modulate reporter gene expression in cells transfected with the human GDNF promoter / reporter gene as described herein. Useful for evaluating effects. For example, Martin et al. (1995), Brain Res. 683, 172-178 describe animal models of epilepsy, including Matheson et al. (1997), NeuroReport 8, 1739-1742 and Oppen. Oppenheim et al. (1995), Nature 373, 344-346 describe a model of neurodegeneration resulting from physical trauma, and further, Sagot et al. (1996), J. Neurosci. 16 , 2335-2341, describe an animal motor neurodegeneration model.
[0069]
Agents thus identified include liquid solutions or suspensions, tablets, pills, powders, ointments, suppositories, polymer microcapsules or microvesicles, liposomes, and injectable or continuous injectable solutions. It can be formulated into a therapeutic composition in various dosage forms, but is not limited thereto. The preferred dosage form depends on the method of administration and the type of disease targeted. The composition is preferably well known in the art such as human serum albumin, ion exchangers, buffers such as alumina, lecithin, phosphate, salts or electrolytes such as glycine, sorbic acid, potassium sorbate and protamine sulfate. Or a pharmaceutically acceptable solvent, carrier or adjuvant. Suitable solvents are, for example, water, saline, dextrose, glycerol, ethanol and the like, and combinations thereof. Methods of actually producing such compositions are known and will be apparent to those skilled in the art. See, for example, “Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, Pa., 18th edition, 1990.
[0070]
The composition can be administered using conventional dosage forms such as, but not limited to, intravenous, intramuscular, intraperitoneal, oral, intralymphatic or subcutaneous administration.
[0071]
A therapeutically effective amount is readily determined by one of ordinary skill in the art and will depend on the severity and progression of the disease, the patient's health and response to treatment, and the judgment of the treating physician.
[0072]
In addition to using human GDNF promoter DNA in reporter gene constructs to identify agents useful in the treatment of neurodegenerative diseases such as Parkinson's disease, the human GDNF promoter is expressed, for example, for human GDNF for diagnostic purposes. Can be used to design oligonucleotide probes that detect mutations that affect. As used herein, the term “probe” refers to a structure comprising a polynucleotide comprising a nucleic acid sequence complementary to a nucleic acid sequence present in a target polynucleotide, as defined above. The polynucleotide region of the probe may include DNA, and / or RNA, and / or synthetic nucleotide congeners. Such probes are useful in in vitro hybridization assays to distinguish the human GDNF wild-type promoter from its mutants and to screen for the presence or absence of a defect in the GDNF promoter, which can be used in Parkinson's disease or other central And may be a diagnostic agent for peripheral neurodegenerative diseases.
[0073]
A probe usually comprises about 6-8 to about 75 contiguous nucleic acids of a reference polynucleotide, generally about 10-12 to about 50 contiguous nucleic acids, and preferably about 15-20 to about 30 of a reference sequence. Contains adjacent nucleic acids. In particular, the GDNF promoter probe is of a length that allows detection of non-repetitive sequences by hybridization.
[0074]
Thus, using a pre-defined portion of the isolated human distal GDNF promoter or an isolated proximal GDNF promoter, using conventional standard methods such as excision, or, for example, by automated oligonucleotide synthesis Oligomers of about 6-8 or more nucleotides that hybridize with the promoter can be produced. Such oligomers are, for example, to screen for the presence or absence of a mutated GDNF promoter in a person at risk of developing Parkinson's disease, or as a prenatal screen for fetuses that are also at risk of abnormal peripheral neurogenesis or kidney development. Useful.
[0075]
When an oligonucleotide probe is used as a diagnostic reagent, a test sample to be analyzed such as blood, serum or amniotic fluid can be processed to extract its nucleic acid fraction. The nucleic acid obtained from the sample can be subjected to gel electrophoresis or other size separation methods, or can be subjected to dot blotting without size separation of the nucleic acid sample. The sample is then exposed to a detectable labeled oligonucleotide probe. Appropriate labels and methods for labeling probes are known in the art, including radioactive labels incorporated by nick translation or kinase, biotin, fluorescent and chemiluminescent probes, horseradish peroxidase, alkaline phosphatase, β- Examples include, but are not limited to, enzymes that catalyze the production of detectable products such as galactosidase. Next, the nucleic acid extracted from the sample is treated with a labeled probe under appropriate hybridization stringency conditions.
[0076]
Hybridization stringency depends on a number of factors during the washing step, including temperature, ionic strength, processing time and formamide concentration (see Sambrook et al., Supra). Hybridization can be performed by a number of techniques. Amplification of the sample nucleic acid can be performed, for example, by ligase chain reaction (LCR), polymerase chain reaction (PCR), Q-beta replicase, or methods well known in the art, if necessary. The amplified nucleic acid can then be detected using hybridization assays that are also well known in the art.
[0077]
The GDNF promoter polynucleotide or a part thereof can be used in a diagnostic kit. For example, an oligomer probe that can specifically hybridize with a GDNF promoter polynucleotide can be packaged in a diagnostic kit that includes an optionally labeled probe nucleic acid sequence. Alternatively, the probe can be provided unlabeled and the labeling component can be included in the kit. The kit may also include other suitable enclosed reagents and materials necessary or desirable for a particular hybridization protocol, eg, standards and instructions for performing the assay.
[0078]
Although the invention has been described with reference to a preferred specific embodiment, it is to be understood that the above description as well as the following examples are illustrative of the invention and are not intended to limit the scope of the invention. . Other aspects, advantages and modifications within the scope of the invention will be apparent to those skilled in the art to which the invention belongs.
[0079]
III.Experiment
In the following examples, efforts have been made to ensure accuracy with respect to numbers used (eg, amounts, temperatures, etc.) but some experimental error should be considered. Unless otherwise noted, temperatures are always expressed in degrees Celsius and pressures are at or near atmospheric.
[0080]
The following single letter nucleotide abbreviations were used throughout to indicate the selective presence of either nucleotide pair at a given position in a polynucleotide. R = G or A; Y = C or T; S = C or G; W = A or T; M = A or C; and K = G or T.
[0081]
Example 1
Human distal GDNF Promoter cloning
A. Demonstration of GDNF cDNA from human tissue
Human GDNF cDNA is obtained from a fetal brain, fetal kidney, adult using a primer pair based on the sequence of rat GDNF cDNA according to the method described in Schaar et al. (1994), Exp. Neurol. 130, 387-393. Amplified by PCR from a skeletal muscle cDNA library. The sense and antisense primer pairs were as follows.
5'-GGT CTA CGG AGA CCG GAT CCG AGG TGC-3 '(SEQ ID NO: 3)
and
5'-TCT CTG GAG CCA GGG TCA GAT ACA TC-3 '(SEQ ID NO: 4)
These results indicate that at least one human GDNF cDNA has a 5 ′ end that is substantially homologous to the rat GDNF cDNA.
[0082]
When one such cDNA amplified by PCR from human fetal kidney (huGDNF) was cloned into pCR II (Invitrogen) and sequenced, the following sequence was obtained.
[0083]

[0084]
Nucleotide sequences 1-27 and 675-700 are homologous to the primer sequences. The sequence between nucleotides 50-674 is identical to GenBank accession numbers L19062 and L19063.
[0085]
B. PCR walking of human genomic DNA
DNA walking of human genomic DNA consists of outGDNF1 primer (5'-CAG CAC CAG GCA GAC AGC-3 '(SEQ ID NO: 6)) and inGDNF1 (5'-GCC ACG ACA TCC CAT AAC) as gene-specific primers 1 and 2, respectively. TT-3 ′ (SEQ ID NO: 7)) was used with a PromoterFinder DNA walking kit (Clontech Laboratories, Palo Alto, Calif., USA). PCR was performed according to the manufacturer's instructions in the presence of 5% dimethyl sulfoxide. The amplified DNA was cloned into pCR II (Invitrogen, San Diego, Calif., USA) and sequenced. The nucleotide sequence of the amplified segment is shown below.
[0086]

[0087]
Nucleotides 699-721 (bold) represent the translated sequence and nucleotides 702-721 are homologous to primer inGDNF1. Nucleotides 671-721 are highly homologous to the nucleotides found in rat and mouse GDNF cDNAs (GenBank accession numbers L15305 and U37372, respectively). This sequence branches upstream from nucleotide 671. The likely splice junction acceptor shown by the sequence (YYYYYYYNY AGG) (SEQ ID NO: 9) is near the upstream of nucleotide 671, where the sequence separates from rat and mouse cDNAs. This indicates that another exon is present in front of this sequence.
[0088]
C. Cloning and Identification of Exon I and GDNF Promoters of Human GDNF Primer GDNFg246F (5'-TAT GCC AGA GGA TTA TCC as described in Schindelhauer, (1995), Genomics 28, 605-607 P1 bacteriophage vector pAd10sacBII (by TGA TCA G-3 ′ (SEQ ID NO: 10)) and primer GDNFg246R (5′-TAG CCC AGA CCC AAG TCA GTG AC-3 ′ (SEQ ID NO: 11)) The human genomic library in Du Pont Merck Pharmaceutical Company, human foreskin fibroblast P1 library number 1; Sternberg, (1992), Trends in Genetics 8, 11-16) was pooled and screened for the human GDNF gene A human genomic clone containing exon IV was identified.
[0089]
Clones DMPC-HFF # 1-0575-F3, DMPC-HFF # 1-0994-A6 and DMPC-HFF # 1-1332-H5 were identified and transformed into E. coli NS3516 strain. After isolating DNA from these clones, the presence of exon III in it was confirmed in primer number 5188 (5′-CCC TGC TTG AAA CTC TGA CC-3 ′ (SEQ ID NO: 12), Example 1B). Using the nucleotides 400 to 419) of the sequence shown and the primer inGDNF1 (Example 1B above), it was confirmed by PCR as follows. The reaction mixture was 50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl (pH 8.3, 20 ° C), 1.5 mM MgCl₂0.2 mM dNTP, 1 μM of each primer and 50 U / ml Taq DNA polymerase (Boehringer / Mannheim). As template DNA for amplification, inoculate 50 μl each of the reaction mixture to the bacteria containing the target P1 clone obtained from the isolated colonies on a plate containing 25 μg / ml kanamycin added to Luria Bertani (LB) agar. Was obtained. The reaction mixture was overlaid with mineral oil and amplified using the following configuration. First denaturation step, 94 ° C. for 4 minutes; 94 ° C. for 1 minute denaturation, 60 ° C. for 1 minute annealing and 72 ° C. for 1 minute primer extension for 30 cycles; last extension step for 10 minutes at 72 ° C. Each clone yielded a product of approximately 322 bp as expected by agarose gel electrophoresis. Bacteria containing only the vector showed no signal of this size, confirming the presence of exon III in each clone.
[0090]
In the presence of the buffer recommended by the manufacturer, the DNA of the genomic clones DMPC-HFF # 1-0575-F3, DMPC-HFF # 1-0994-A6 and DMPC-HFF # 1-1332-H5 were respectively converted into restriction enzymes SmaI, NarI, Fragments obtained by digestion with EcoRI, SalI, BamHI and BglII (all from Boehringer / Mannheim) were separated on a Tris / boric acid / EDTA buffered 0.5% agarose gel and stained with ethidium bromide. The DNA in the gel was denatured and neutralized and transferred to a nylon membrane by capillary movement overnight. Crosslink DNA with nylon membrane with UV light and as recommended by the manufacturer, 2% w / v blocking reagent (Boehringer / Mannheim, 5X SSC buffer (20X SCC buffer is 175 grams NaCl in 1 liter water, sodium citrate 88g), 0.1% N-lauroyl sarcosine, 0.02% sodium dodecyl sulfate (SDS) and 50% formamide in a buffer solution at 42 ° C for 16 hours, followed by prehybridization Southern blots were hybridized with 10 ng / ml of digoxigenin labeled human GDNF cDNA in 2X SSC containing 0.1% sodium dodecyl sulfate (SDS) as described in Example 1A for 16 hours at 42 ° C. The membrane was washed twice for 15 minutes at room temperature, and then washed with 0.1X SSC containing 0.1% SDS for 30 minutes at 60 ° C. Specific hybridization was performed by the manufacturer (Boehringer / Mannheim). And it was detected in step. About 9.4 kb, 2.7 kb and 0.7 kb EcoRI band was observed to hybridize to the human GDNF cDNA probe.
[0091]
PCR primers were designed based on the GDNF sense sequence described in Schaar et al. And the sequence upstream of exon III (see Example 1B), and the position of putative exon I relative to exon III was mapped. Primer number 5231 (5'-GGT CTA CIG AGA CCG GAT CCG AGG T-3 '(SEQ ID NO: 13)) is designed to include a portion of the consensus splice junction donor site at its 3' end, And it is a truncated version of the GDNF sense sequence that contains a single 2'-deoxyinosine residue that destabilizes the expected stable hairpin loop that would otherwise be generated in the primer. Primer number 5230 (5′-CGG CCC AAG CAA GGA CGG TGT TTC T-3 ′ (SEQ ID NO: 14)) is nucleotides 191 to 215 of the sequence shown in Example 1B approximately 480 bp upstream of the exon III origin. Homologous. The PCR amplification reaction mixture contains 0.2 mM dNTPs, each primer number 5230 and 5231 each 0.6 _M, Expand DNA polymerase 52.5 U / ml, and 1X concentration dedicated buffer provided by the polymerase manufacturer (Boehringer / Mannheim) It was out. Template DNA for amplification is 200 ng of human genomic DNA (Boehringer / Mannheim), 0.1 ng of clone DMPC-HFF # 1-0575-F3, or a SalI site about 1.75 kb downstream from the EcoRI site in exon IV of the human GDNF gene One of the 0.1 ng SalI deletions of this clone excising about half of the inserted DNA starting from. Each 50 μl reaction mixture was overlaid with mineral oil and amplified using the following configuration. First denaturation step, 95 ° C for 3 minutes; 95 ° C for 1 minute denaturation, 30 seconds to 60 ° C, 60 ° C for 1 minute annealing, 30 seconds to 72 ° C, and 72 ° C for 4 minutes primer extension 20 cycles 15 cycles at the same time and temperature except increasing the extension time by 15 seconds in each cycle; final extension step at 72 ° C. for 10 minutes. An aliquot from each PCR reaction mixture was electrophoresed to show about 4.5 kb of product in each lane where template DNA was present, but no product was produced when no template DNA was present. These results indicated that exon I was approximately 4.5 kb upstream from the hybridization position of primer number 5230, or approximately 5.0 kb upstream from the origin of exon III.
[0092]
Purify the PCR amplification product from primer 5230/5231³²Labeled with P-dCTP (Pharmacia Biotech oligo labeling kit). Southern blots previously hybridized with digoxigenin-labeled human GDNF cDNA were subjected to 1 × 10 radiolabeled product overnight at 42 ° C. in the same buffer as above.⁶ Hybridized with CPM / ml. After washing as described above, only the approximately 9.4 kb EcoRI fragment of each P1 genomic clone was detected by autoradiography. These results indicate that exon I and exon III of the human GDNF gene are both about 5.0 kb apart and within the same about 9.4 kb EcoRI fragment.
[0093]
First, an about 9.4 kb EcoRI fragment was cloned into the vector pBK-CMV by cloning into EcoRI-treated and calf intestine alkaline phosphatase-treated Zap Express vector arms (Stratagene). 10 μg of P1 human genomic clone DMPC-HFF # 1-0575-F3 was completely cut with EcoRI. Fragments were separated on a 0.5% agarose gel and purified from the gel. The EcoRI fragment was ligated into EcoRI- and calf intestinal alkaline phosphatase-treated Zap Express vector arms. The ligation mixture was packaged into bacteriophage lambda particles by Gigapack II Gold packaging extract (Stratagene). According to the manufacturer's instructions (Stratagene), the packaged DNA was seeded with XL-1 blue MRF ′ host cells in a NZY agar plate overlaid with 0.7% NZY agar. By eluting 11 isolated plaques, eluting the phage particles overnight in 0.25 ml SM buffer and co-infecting XL-1 Blue MRF 'cells with recombinant lambda phage and ExAssist f1 helper phage according to the manufacturer's instructions, The plasmid was excised from lambda phage. XLOLR cells are incubated with heat-treated excised pBK-CMV phagemids packaged as filamentous phage particles and seeded on LB agar + 50 μg / ml kanamycin agar plates to remove the excised phagemids from filamentous phage particles. It was collected. After incubation of the plate overnight at 37 ° C., isolated colonies were picked and plasmid DNA was generated from cultures grown in LB + 50 μg / ml kanamycin. One plasmid pRBSEco9.4 # 8 was further characterized.
[0094]
D. Sequencing of the cloned 9.4 kb EcoRI fragment
First, plasmid pRBSEco9.4 # 8 (see FIG. 2) was sequenced using primer number 5231. Further sequencing was performed using other primers synthesized based on the derived sequence. The following sequence was revealed from the initial sequencing.
[0095]

[0096]
Further detailed sequencing revealed the sequence shown in FIGS. 3A to 3B (SEQ ID NO: 1). This sequence is a limited region of the mouse GDNF gene (exon I to exon I 140 bp upstream using the BESTFIT program with default parameters suggested by the manufacturer (Madison, Wisconsin, Wisconsin Sequence Analysis Package, Genetics Computer Group). Until now, it was found to be 79% identical to GenBank accession number # D88350S1).
[0097]
E. Determination of the transcription start site of the distal GDNF promoter by 5 'end analysis of GDNF cDNA
Modified RACE (rapid amplification of cDNA ends) (PCR Protocols (PCR protocol) (Frohman (Academic Press, San Diego), (1989), 28-38)) using the CapFinder PCR cDNA synthesis kit (Clontech Laboratories) as a starting point and the GDNF cDNA 5 'end A rich cDNA library was formed. Except that cDNA synthesis was primed with 1 μl (50 ng / μl) of random hexamer (Gibco / BRL) as directed (CapFinder kit, Clontech Laboratories), human fetal kidney, fetal brain or adult skeletal muscle polyA + RNA First strand cDNA synthesis was performed on 0.5 μg. PCR was performed as indicated, except that the primers were 0.4 μM each for the supplied CapFinder PCR primer and GDNF antisense, with initial denaturation at 94 ° C. for 3 minutes and 94 ° C. for 1 minute. Denaturation, annealing at 58 ° C for 1 minute, primer extension at 72 ° C for 1 minute, 24 cycles, and final extension at 72 ° C for 10 minutes.
[0098]
After the primary PCR reaction was diluted 1000-fold with sterile distilled water, CapFinder PCR primer 0.2 μM and primer number 5191 (5′-GGT CAT CAT CAA AGG CGA TGG GT-3 ′ (SEQ ID NO: 16)) 0.4 μM A 1 μl aliquot was secondarily amplified in the same reaction mixture used previously except that 25 cycles of the same temperature program were run in the presence. Aliquots of Southern blots of PCR reactions were separated by agarose gel electrophoresis.³²When P-ATP-labeled outGDNF1 (Example 1B above) was examined as a probe, a composite band 600-1 having a length of 100 bp was shown. The PCR product in this size range was purified by agarose gel electrophoresis, and DNA was recovered and ligated to pCR 2.1 (Invitrogen). The ligation mixture was electroporated into ElectroMAX DH10B cells (Gibco / BRL) and seeded on LB agar + 50 mg / ml ampicillin + 50 mg / ml kanamycin plates. After overnight incubation at 37 ° C., colonies were mounted on nylon membranes and the DNA was denatured, neutralized and cross-linked by standard methods. As described in Example 1A, the filter was hybridized with a labeled cDNA probe and DNA was prepared from hybridization positive colonies and sequenced.
[0099]
The sequence of cDNA derived from a distal promoter from human fetal kidney is shown below, in which nucleotides 1 to 174 correspond to exon I as shown in FIG. 1 (nucleotides 1 to 174 in FIG. 3B) and nucleotides 175 to 351 Corresponds to exon IIIb as shown in FIG. 1, nucleotides 352 to 763 correspond to exon IV as shown in FIG. 1, nucleotides 740 to 762 are provided by primer # 5191, and nucleotides 175 to 762 are It is identical to nucleotides 24-611 of the sequence obtained in Example 1A above.
[0100]

[0101]
Example 2
Human distal GDNF Production of promoter / reporter gene construct and transfection of the construct into E. coli
To investigate promoter activity, a commercially available plasmid pGL3-Basic (Promega, Madison, WI, GenBank accession number U47295) containing the firefly luciferase reporter gene was used because of the sensitivity and linearity of the response to the luciferase expressed in firefly. Thus, a reporter gene plasmid was produced. The distal GDNF promoter contained in the plasmid pRBSEco9.4 # 8 produced as described in Example 1 was transformed into the pGL3-Basic upstream of the vector luciferase gene as shown in FIG. Moved to a unique NheI restriction site.
[0102]
In the first step, plasmid pGL3-Basic was cut with the restriction endonuclease NheI. The enzyme was inactivated by incubation at 65 ° C. for 20 minutes, then treated with shrimp alkaline phosphatase to prevent vector self-ligation, and the enzyme was inactivated by heating at 65 ° C. for 15 minutes. On the other hand, pRBSEco9.4 # 8 was digested with AvrII and then with NheI. The 740 bp fragment was analyzed by electrophoresis on a 0.5% agarose gel and the band was recovered from the gel. Next, the recovered AvrII / NheI fragment of the promoter was ligated to NheI-cut pGL3-Basic. The ligation mixture was transduced into INVaF 'competent E. coli cells (Invitrogen) and seeded on LB ampicillin agar plates. After overnight growth at 37 ° C., plasmid DNA was generated from each colony that grew in a small culture in liquid LB ampicillin medium. The orientation of the AvrII / NheI promoter fragment in pGL3-Basic was determined by digesting the plasmid DNA preparation with XbaI and sequencing the junction sequence at the junction closest to the luciferase gene. An intermediate plasmid with the NheI / AvrII partial promoter fragment was named pNhe-GDNF.
[0103]
In the second step of transferring the distal GDNF promoter to pGL3-Basic, the intermediate plasmid pNhe-GDNF is sequentially cleaved with the restriction enzymes NheI and PstI and the mixture is phenol / CHCl_ThreeAnd extracted with ethanol. Plasmid pRBSEco9.4 # 8 was cut with SpeI (which cuts with a polylinker adjacent to the EcoRI insertion site of the genomic DNA insert) and PstI. An approximately 1095 bp SpeI / PstI fragment was separated and purified by electrophoresis on a 0.5% agarose gel. The SpeI / PstI primer fragment was then ligated to pNhe-GDNF cut with NheI and PstI. The fragment was transduced into INVaF 'competent E. coli cells (Invitrogen) seeded on LB + ampicillin plates and grown overnight at 37 ° C. Plasmid DNA was prepared from the isolated colony, and it was confirmed by restriction enzyme digestion and sequencing that the promoter was inserted. The luciferase promoter plasmid containing the human GDNF promoter was named pGDNF-1635.
[0104]
Controlled deletions of pGDNF-1635 are readily generated to assess the importance of various promoter or enhancer regions of the human distal GDNF promoter. Plasmid pNhe-GDNF is one of the deletions in which about 1,040 bp has been deleted at the 5 ′ end of the distal GDNF promoter from pGDNF-1635. An approximately 255 bp deletion at the 5 ′ end of the promoter was achieved by digestion of pGDNF-1635 with the restriction endonuclease SacI, enzyme inactivation, and religation of the vector portion at low DNA concentrations, thus p Sac-GDNF Is obtained. Additional deletions are made either by restriction enzyme manipulations or by controlled deletions produced by exonucleases, as described in Henikoff (1984), Gene 28, 357. A map of the full length human GDNF distal promoter and several 5 'truncated constructs are shown in FIG.
[0105]
Example Three
To human cells pGDNF-1635 Transfection and distal human GDNF Promoter activity assay
Human glioblastoma U-87 MG cells (ATCC No. HTB-14) or neuroblastoma SK-N-AS cells (ATCC No. CRL-2137) were added to the lipofection method (Felgner et al., (1987), Proc Natl. Acad. Sci. USA 84, 7413-7417) was used to transfect plasmid pGDNF-1635 prepared as described in Example 2.
[0106]
U-87 MG cells were grown to approximately 40% confluence in 8.5 cm diameter culture dishes coated with rat tail collagen type I (Collaborative Research, catalog number 40450). Remove the medium, wash the cells once with phosphate buffered saline (PBS), 15 μg of DNA and lipofectAMINE (Gibco / BRL # 18324) in 6.4 ml of OptiMEM (Gibco / BRL # 31985) prepared as per manufacturer's instructions. -012) A solution containing 100 μg was gently overlaid. Cells are 5% CO₂Incubate at 37 ° C in a humid atmosphere for up to 5 or 24 hours. The transfection solution was then removed and replaced with 10 ml of minimal basal medium (Gibco / BRL # 11095-080) containing 10% fetal bovine serum, 1% non-essential amino acids, 1% glutamine and 1% sodium pyruvate. After 48 hours incubation at 37 ° C., cells were harvested to prepare cell extracts and assayed with luciferase assay reagent (Promega catalog number E1501).
[0107]
SK-N-AS cells were grown to approximately 50% confluence in a 8.5 cm diameter culture dish, washed once with PBS, and the cells were prepared as described above OptiMEM (Gibco / BRL # 31985) A solution containing 15 μg of DNA and 80 μg of lipofectAMINE (Gibco / BRL No. 18324-012) in 6.4 ml was gently overlaid. Cells are 5% CO₂Incubate for 5 hours at 37 ° C. in a humid atmosphere. The transfection solution was then removed and replaced with 10 ml Dulbecco's modified Eagle's medium (Gibco / BRL # 11965-092) containing 10% fetal bovine serum and 1% non-essential amino acids. After 48 hours, cells were harvested to prepare cell extracts and assayed with luciferase assay reagent (Promega catalog number E1501).
[0108]
The effect of various promoter deletions on reporter gene expression was examined with slight modifications to the transfection procedure described above. When comparing the expression of one promoter construct to that of the other, it is important to consider the variation in transfection efficiency between two different transfections. The present invention takes this into account by co-transfection with another control plasmid that expresses a small amount of the second independently measured reporter enzyme. After co-transfection with a mixture of a GDNF promoter deletion construct expressing firefly luciferase and an internal control reporter plasmid, both reporters are assayed independently and firefly luciferase activity is normalized by the enzyme activity of the control reporter. Transfection variations between each experiment are thereby eliminated. The control reporter plasmid utilized herein is a pRL-TK (Promega) that expresses low levels of a second independently assayable luciferase from the marine organism Renilla under the control of the herpes simplex virus thymidine kinase promoter. # E2241). Under conditions of separate substrate addition and buffer composition, the cell lysate is assayed in turn for two different luciferases so that the firefly and Renilla luciferase enzyme activities do not contaminate each other.
[0109]
As described above, human glioblastoma U-87 MG cells were transfected with a mixture of 13.5 μg of the reporter plasmid shown in FIG. 7 and the pRL-TK internal control plasmid in the presence of 100 μg of lipofectAMINE for 24 hours. After transfection, cells were collected by incubation in an incubator for 20 hours in U-87 MG medium (MEM containing 10% fetal bovine serum, 1% non-essential amino acids, 1% glutamine and 1% sodium pyruvate). Later, from a 8.5 cm diameter plate, rat tail collagen was dispersed in a coated 12 well plate (Becton Dickinson Labware # 40500) in the same medium. The plate was incubated for 9 hours, after which the U-87 MG medium was removed and replaced with OptiMEM. Incubate cells for 18 hours at 37 ° C, remove media, wash cells with cold phosphate buffered saline, add 0.25 ml of 1X passive lysis buffer (Promega # E194A) to each well, and gently plate the plate Cell lysates were prepared in situ by incubation for 15 minutes at room temperature with shaking. As described above, SK-N-AS cells were transfected with the same plasmid.
[0110]
A 15 μl aliquot of each cell lysate was assayed for firefly luciferase followed by Renilla luciferase using the reagents of the Dual-Luciferase Reporter Assay System Kit (Promega # E1910). Bovine ferase activity was quantified using a 96-well luminometer (Dynex Technologies, ML-3000 model) operated in an enhanced mode. Each cell lysate measurement was repeated 3 times, and the results of a given treatment were all obtained from the average of 6 repeated treatments.
[0111]
To map potential enhancer and silencer elements and the position of the basic promoter itself, a 5 ′ deletion mutant of pGDNF-1635 was constructed, transfected and measured for luciferase activity. The result is shown in FIG. In U-87 MG glioblastoma cells, deletion of the 5'-most 120 bp (-1516) reduced promoter activity by 30%, with an enhancer element between -1635 and -1516 It shows that Furthermore, deletion up to -1304 increased promoter activity 2-fold, suggesting that a silencer element exists between -1378 and -1304. Deletion of the next 170 bp to -1134 had no apparent effect on U-87 MG cells. Furthermore, the deletion from -1134 to -366 gradually lost the promoter activity, indicating that the region of the enhancer element is large. Interestingly, deletion in this region from -744 to -593, the region containing the consensus binding site for egr2 and AP-2, reduced promoter activity more significantly, indicating that egr2 and / or It suggests that AP-2 is important for regulatory activity. In contrast, deletion between -366 and -307, a region containing the consensus NF-κB binding site, did not cause any change in the promoter activity of U-87 MG cells. Finally, deletion of -307 to -193 increased promoter activity by about 5-fold, whereas deletion of -62 only slightly increased activity. This indicates the presence of strong silencer element (s) in this region.
[0112]
Deletion of regulatory regions in SK-N-AS neuroblastoma cells made a significant difference compared to the results obtained with U-87 MG cells. Figure 7 shows the presence of an enhancer at the first 120 bp, followed by a silencer at -1378 to -1304 in SK-N-AS cells, similar to the results previously described for U-87 MG cells. Is shown. However, deletion of region-1304 to -1134 had no effect in U-87 MG cells, but decreased in SK-N-AS cells, so cell-type specific enhancers were found in this region. It is suggested to exist. A pair of consensus binding sites for transcription factor AP-2 was found in this region. Another difference between these two cell lines is seen between -1134 and -853. Deletion of this region already known to be an enhancer in U-87 MG cells resulted in increased luciferase expression in SK-N-AS cells. A consensus binding site for CREB was found within this region. The proximal deletion between -852 and -593 revealed the presence of an enhancer region in SK-N-AS cells, similar to the effect observed in U-87 MG cells. In addition, deletions between -593 and -366 and between -366 and -307 increased luciferase activity in SK-N-AS cells by a factor of 3 and 2, respectively, which is silenced in this cell line It shows that. In contrast, in U-87 MG cells, the region from -593 to -366 seems to function as an enhancer, whereas the region from -366 to -307 containing an obvious NF-κB binding site is completely absent. No effect was shown. Taken together, these results suggest that cell-type specific elements may alter the activity of this promoter.
[0113]
Example Four
Human middle and proximal GDNF Promoter cloning and characterization
A. cDNA derived from the middle promoter from human fetal kidney
Using the CapFinder PCR cDNA synthesis kit (Clontech Laboratories) as a starting point for the modified RACE method, a cDNA library enriched in the 5 ′ end of GDNF cDNA was prepared. First strand cDNA synthesis for 0.5 _g of human fetal kidney, fetal brain or adult skeletal muscle poly A + RNA (Clontech Laboratories) primed cDNA synthesis with 1 μl (50 ng / μl) of random hexamer (Gibco / BRL) Except for the above, the manufacturer's instructions (CapFinder kit, Clontech Laboratories) were followed. PCR was performed as indicated except that the primers were 0.4 MM each of the supplied CapFinder PCR primer and GDNF antisense. The PCR program consists of 24 cycles of initial denaturation at 94 ° C for 3 minutes, followed by denaturation at 94 ° C for 1 minute, annealing at 58 ° C for 1 minute, and primer extension for 1 minute at 72 ° C for 10 minutes at 72 ° C. Was the last extension.
[0114]
The primary PCR reaction solution was diluted 1000 times with sterilized distilled water. 1 μl aliquot of each diluted reaction is run in the presence of 0.4 μM CapFinder PCR primer 0.2 μM and primer number 5191 (5′-GGT CAT CAT CAA AGG CGA TGG GT-3 ′ (SEQ ID NO: 18)) Secondary amplification was performed in a reaction mixture similar to that used previously, except that 25 cycles were performed. Separate the Southern blot of secondary PCR reaction aliquots by agarose gel electrophoresis,³²When P-ATP-labeled outGDNF1 (Example 1B above) was examined as a probe, a composite band 600-1 having a length of 100 bp was shown. The PCR product in this size range was purified by agarose gel electrophoresis, and the DNA was recovered and ligated to the plasmid pCR 2.1 (Invitrogen). The ligation mixture was electroporated into ElectroMAX DH10B cells (Gibco / BRL) and seeded on plates containing LB agar + 50 μg / ml ampicillin + 50 μg / ml kanamycin. After overnight incubation at 37 ° C., colonies were transferred to nylon membranes and DNA was denatured, neutralized, and cross-linked by exposure to ultraviolet light using standard methods. The filter was hybridized with a labeled cDNA probe (huGDNF from Example 1A above), DNA was prepared from hybridization positive colonies, and sequencing was performed. The sequence of such a cDNA derived from human fetal kidney is shown below.
[0115]

[0116]
In the above sequence, nucleotides 585 to 607 are given by primer number 5191, nucleotides 1 to 97 (exon II, see FIG. 1) and nucleotides 98 to 146 are among the PCR walking fragments of human genomic DNA described in Example 1B, Homologous to nucleotides 5 to 101 and nucleotides 673 to 721, respectively, nucleotides 98 to 607 are homologous to bases 24 to 611 with a 78 bp deletion between nucleotides 122 to 201 in the cDNA sequence described in Example 1A. is there.
[0117]
B. cDNA from the proximal promoter from the human fetal brain
Randomly primed human fetal brain poly A + RNA (Clontech Laboratories) and two rounds of PCR amplification using a nested primer set, and 5 'RACE with 5'-AmpliFINDER RACE kit (Clontech Laboratories) went. The primary PCR amplification was carried out according to the conditions proposed by the manufacturer. The anchor primer (5'-CCT CTG AAG GTT CCA GAA TCG ATA G-3 '(SEQ ID NO: 20) and gene-specific primer 1 (5'-GGT CAT CAT CAA AGG CGA TGG GT-3 ′ (SEQ ID NO: 16)) was used for 40 cycles using an annealing temperature of 54 ° C. After dilution 100-fold with distilled water, 1 μl of the diluted primary PCR product was added to primer number 3442 (5 '-GGA ACC TCG AGA ATC GAT AGT GAA TTC GTG-3' (SEQ ID NO: 21)) and gene specific primer 2 (5'-TCG TAC GTT GTC TCA GCT GCA TC-3 '(SEQ ID NO: 22)) Alternatively, it was amplified for another 30 cycles with either gene-specific primer 3 (5'-ACC TTT TCC TCT GGA ATT CTC TG-3 '(SEQ ID NO: 23). PCR conditions were set at an annealing temperature of 57 ° C. Similar to the primary PCR amplification except that it was used, and the amplified PCR product was cloned into the vector pCR2.1 (Invitrogen) and then sequenced. The products obtained from secondary amplification with primer number 3442 and gene specific primer 2 are shown below.
[0118]

[0119]
In the above sequence, nucleotides 1-30 and 513-535 are provided by primer number 3442 and gene-specific primer 2, respectively, and nucleotides 33-166 are nucleotides of the PCR walking fragment of human genomic DNA described in Example 1B. 588 to 721, and nucleotides 118 to 535 are homologous to nucleotides 24 to 519 with a 78 bp deletion between nucleotides 122 to 201 of the cDNA sequence described in Example 1A.
[0120]
C. Proximal promoter sequence
Using the plasmid pRBSEco9.4 # 8 as a template, the PCR walking fragment sequence of human genomic DNA described in Example 1B is extended to obtain the promoter sequence of the proximal promoter shown in FIGS. 4A to 4C (SEQ ID NO: 2). It was.
[0121]
The positions of +6 and +67 in the sequence shown in FIG. 4B appear to be variable in different genomic DNA. The +6 position may be A or G, and the +67 position may be either T or C.
[0122]
Example Five
Human distal and proximal GDNF Construction of a luciferase reporter plasmid containing both promoters
According to the procedure shown in FIGS. 6A-6B, a reporter gene plasmid containing a gene encoding a human proximal and distal GDNF promoter and luciferase operably linked thereto was generated. The proximal and distal GDNF promoters contained in plasmid pRBSEco9.4 # 8 were transferred in two steps to the unique EcoRI and HindIII sites of pGDNF-1635, a pGL3-Basic reporter plasmid derivative. This method is briefly described first, followed by a more detailed description.
[0123]
First, the region between −10 and +705 in the proximal promoter sequence shown in FIGS. 4A to 4C is modified by PCR to remove a translation start site of 696 to 698 base pairs. The PCR product was then cloned into the plasmid pKS bluescript II. Cut the insert from a single clone using the adjacent HindIII site of the plasmid polylinker and the unique EcoRV site in the insert. Next, the insert fragment from HindIII to EcoRV was cloned into EcoRV- and HindIII-cut pRBSEco9.4 # 8, resulting in plasmid pRBSEco9.4proxmod. The insert from plasmid pRBSEco9.4proxmod is excised by cutting the only EcoRI and HindIII sites and cloned into EcoRI- and HindIII-cut pGDNF-1635 prepared as described in Example 2, resulting in plasmid pGDNFprox + dist. It was.
[0124]
The translation start site of exon III is represented by primer numbers 5361 (5'-CCA GAT ATC CCA TAC AGG CCA A-3 '(SEQ ID NO: 25)) and 5363 (5'-ATA ACT AGA TCT TAA AGT CCC GTC C-3. '(SEQ ID NO: 26)). The PCR reaction contains 0.2 mM dNTPs, 0.4 _M each of primer numbers 5361 and 5363, Expand DNA polymerase 70 U / ml, and a 1X concentration dedicated buffer provided by the polymerase manufacturer (Boehringer / Mannheim). It was. The template DNA for amplification was 0.1 ng of plasmid pRBSEco9.4 # 8. Each 50 μl reaction is overlaid with mineral oil, denatured at 94 ° C for 3 minutes, denatured at 94 ° C for 1 minute, annealed at 42 ° C for 1 minute, and primer extension at 72 ° C for 1 minute followed by annealing. 30 cycles were performed at the same time and at the same temperature except that the temperature was 53 ° C., and the final extension was performed at 72 ° C. for another 10 minutes. An aliquot from the PCR reaction was electrophoresed to show the expected product of approximately 700 bp. The PCR product was purified (Promega MagicPrep) and cloned into EcoRV digested plasmid pBluescript II KS. Digestion with EcoRV and HindIII released an approximately 700 bp insert from one of the resulting plasmids, and the gel containing the insert was purified. This was cloned into pRBSEco9.4 # 8 that had been cut with EcoRV and HindIII. After selection on kanamycin-containing plates and screening for the presence of additional BglII sites introduced into the plasmid by PCR, the resulting single product plasmid pEco9.4proxmod was selected for sequencing and further genetic manipulation.
[0125]
Plasmid pEco9.4proxmod was cut with EcoRV and HindIII to release an approximately 6.8 kb insert. Without gel-purifying the fragment, we used pGDNF-1635 digested with EcoRV and HindIII (this pGL3-Basic derivative was used because a unique EcoRI site was introduced just inside the upstream polylinker segment during its construction. Ligated). Transformants (transformants) were selected on ampicillin-containing plates. One plasmid pGDNFprox + dist with the desired insert was used for the next work.
[0126]
Example 6
Human proximal GDNF Construction of a luciferase reporter plasmid containing a promoter
Removal of the upstream portion of the promoter in pGDNFprox + dist resulted in a reporter plasmid with only proximal (ie, middle and proximal) promoters that induce luciferase expression. This was achieved by cleaving pGDNFprox + dist with the restriction endonuclease MluI, and religation of the remaining plasmid yielded pGDNFprox Mlu. Cleavage of this plasmid (ie, pGDNFprox + dist) with Mlul and other restriction enzymes that cut within the proximal promoter but not the rest of the plasmid results in additional deletions. For example, pGDNFprox Nru is obtained by cleaving with MluI, cleaving with NruI, converting to blunt ends with Klenow fragment plus dNTPs, and ligating again.
[0127]
Example 7
Reverse transcription / Polymerase chain reaction (RT-PCR) Result of
To determine the relative amount of the three transcripts in human tissue or U-87 MG cells, using a common downstream primer and upstream primers specific for the distal, middle and proximal GDNF transcripts, a variety of RT-PCR was performed on the RNA preparation. The distal primer 5′-CCC AGG ATT GCG AAC TCT TGC-3 ′ (SEQ ID NO: 27) was identical to nucleotides 35-55 of the sequence shown in Example 1E. The middle primer 5′-TCT CCA AGT CCC TGC TAA CTT CT-3 ′ (SEQ ID NO: 27) was identical to nucleotides 16-38 of the sequence shown in Example 4A. The proximal primer 5′-CGT GCA TTC TGC GGT TCT-3 ′ (SEQ ID NO: 29) was identical to nucleotides 72-89 of the sequence shown in Example 4E. A common downstream primer 5'-GAG CAG CAC CAG GCA GAC-3 '(SEQ ID NO: 30) was selected to eliminate the complexity resulting from alternative splicing that could occur at the exon II / exon III junction.
[0128]
Total RNA was prepared from U-87 MG cells. U-87 MG cells were grown to confluence in 8.5 cm culture dishes as described in Example 3. The medium was then replaced with OptiMEM (Gibco / BRL # 31985) supplemented with 0.5% bovine serum albumin, and the cells were further incubated for 12 hours with 10 ng / ml IL-1^-, 10 nM phorbol didecanoate, 50 ng / ml basic FGF (fibroblast growth factor), 1 mM dibutyryl-cyclic AMP, 1 M dexamethasone, 10 ng / ml TNF ^, or no addition (medium) I went there. Cells were further incubated for 12 hours and total RNA was isolated using RNAzol® B according to the manufacturer's instructions (Tel-Test, Inc., Friendswood, TX).
[0129]
The sample was first treated with DNase I to remove genomic DNA contaminating the RNA sample. Poly A from human fetal liver, adult liver, fetal kidney, fetal brain, adult brain or adult skeletal muscle⁺ 1 μg of mRNA (Clontech Laboratories) or 3 μg of total RNA (U-87 MG cells) is 1 unit DNase I (RQ1 RNase-free DNase, Promega # M610A) for 30 min at 37 ° C prior to first strand cDNA synthesis After pretreatment with, heating inactivation at 70 ° C. for 20 minutes was performed. First strand cDNA was generated using Gibco SuperScript® Preamplification System Kit (Gibco # 18089-011) with 50 ng random primer and 3 μg total RNA (U-87 MG cells) or poly A as indicated.⁺ Synthesized from 1 μg of RNA (human tissue RNAs). 0.2 mM dNTPs, 1 μM distal, middle, proximal and common primers, 1 μl cDNA as template, and Advantage® KlenTaq polymerase mixture (Clontech # 8417-1) in the presence of buffer plus polymerase PCR was performed in 50 μl of a reaction solution containing 1 μl. The positive control was 1 μl cDNA template, 0.1 atmole, 0.01 atmole or 0.001 atmole (1 zeptomole = 1 × 10^{-twenty one}Mole) of a distal, intermediate or proximal cDNA (Examples 1E, 4A, 4E, respectively) with 1 μl or by replacement with an equimolar amount of each of the above cDNAs. . Negative controls include replacing 1 μl of cDNA template with 1 μl of a similar reaction without the addition of reverse transcriptase. The temperature cycling parameters are: initial denaturation at 94 ° C for 2 minutes, followed by denaturation at 94 ° C for 30 seconds, annealing at 66 ° C for 30 seconds, and extension at 72 ° C for 1 minute for 30 cycles, followed by the final incubation. Consists of 10 minutes at 72 ° C. A 10 μl aliquot of the PCR reaction in TBE buffer (FMC BioProducts # 54906) was loaded onto a 4% NuSieve® 3: 1 agarose gel and separated by electrophoresis. The gel was visualized and photographed using a transilluminator at 302 nm.
[0130]
FIG. 8A shows the evaluation results of RT-PCR. Lane 1 shows a band of a size consistent with the expected 114 bp resulting from amplification of the cloned proximal transcript from Example 4E 0.1 atmol with the primer mix. Lane 2 shows a band consistent with the expected 150 bp product resulting from amplification of the cloned intermediate transcript from Example 4A 0.1 atmol with the primer mix. Lane 3 shows a band consistent with the expected 208 bp product resulting from amplifying 0.1 attomole of the cloned distal transcript from Example 1E with the primer mix. The product bands in lanes 1, 2 and 3 are nearly equal in intensity, suggesting that under these conditions, amplification of each product occurs with similar efficiency. Lane 4 shows that no product is produced without the addition of template. Lane 5 is the result of amplifying a 0.1 atmole mixture of each of the proximal, middle and distal templates with the primer mixture. Lanes 6 and 7 are the same as Lane 5 except that each template is present at 0.01 atmol (lane 6) or 0.001 atmol (1 zeptomole, lane 7). Lanes 5, 6 and 7, taken together, show that amplification of each product occurs with similar efficiency and that the sensitivity of the assay is less than 1 zeptomole for all three templates. Cycling 0.1 attomole proximal template in the presence of only the middle, distal and common primers, or cycling 0.1 attomole middle template in the presence of only the proximal, distal and common primers When the separate experiments were performed in the case of or cycling of 0.1 attomole distal template in the presence of only proximal, middle and common primers, no product was produced. This indicates a lack of cross-reactivity between the dissimilar template and primer (results not shown).
[0131]
FIG. 8B shows the results of RT-PCR with proximal, middle and distal transcript primers on RNA isolated from U-87 MG cells after various treatments. Lane 1 contains the product after amplification of a 0.1 attomole mixture of each template. Lane 4 shows RT-PCR products from amplification of RNA isolated from U-87 MG cells in the presence of medium alone, while Lane 3 does not contain reverse transcriptase added to the cDNA synthesis reaction. Except for the same reaction (-RT control). In lane 4, distal and proximal amplifications show almost equal products, while lane 3 produces nothing, which is dependent on the presence of reverse transcriptase. Is shown. Lanes 5, 6, 7 and 8 are 10 ng / ml interleukin-1^-(IL-1^-), 10 nM didecanoate phorbol (PDD), 50 ng / ml basic fibroblast growth factor (bFGF), or 1 mM dibutyryl-cAMP (db-cAMP) treated with U-87 MG cells for 12 hours, Shows an increase in the amount of proximal and distal transcripts of GDNF compared to medium alone (lane 4). In lanes 5-8, the proportion of proximal and distal transcripts was approximately the same, but some more distal product was observed in each lane than the proximal product. Lane 9 shows that treatment of U-87 MG cells with 1 M dexamethasone for 12 hours reduces the amount of GDNF proximal and distal transcripts compared to medium alone. Finally, lane 10 shows the amount of proximal and distal transcripts of GDNF when U-87 MG cells were treated with 10 ng / ml tumor necrotic cells ^ (TNF ^) for 12 hours compared to medium alone. Indicates an increase. Thus, in U-87 MG cells, we can see proximal and distal transcripts of GDNF but no intermediate transcripts, and the amount of these transcripts is^-It can be increased by treatment with PDD, bFGF, db-cAMP or TNF ^, but dexamethasone reduces transcripts.
[0132]
FIG. 8C shows RT-PCR results with proximal, middle and distal primer mixtures for RNA isolated from various human tissues. Lanes 3-8 contain RNA amplification products from fetal liver, adult liver, fetal kidney, adult brain, fetal brain and adult skeletal muscle, respectively, but these are only the presence of products from distal transcripts Indicates. Fetal kidney (lane 5) and adult skeletal muscle (lane 8) show almost equal, highest concentrations of product, whereas fetal brain (lane 7), fetal liver (lane 3) and adult liver (lane 4). In turn, the amount of product decreased. The adult brain (lane 6) shows a product that is finally detectable. In the control reaction in which reverse transcriptase was removed from the cDNA synthesis reaction, no product was produced for all the above tissues (results not shown). Thus, in contrast to U-87 MG cells, these tissues contain only the GDNF distal transcript.
[0133]
The RT-PCR results shown in FIG. 8A indicate that this assay is sensitive and specific for the three transcripts of GDNF. The results in FIG. 8B show that both proximal and distal transcripts are easily detected in approximately equal proportions in U-87 MG cells treated in various ways. However, R was detected only in the distal transcript due to the distal promoter activity in RT-PC of RNA isolated from selected human tissues. Although other transcripts may be present in these human tissues, the distal transcript is present at a much higher concentration because it is the only product detected under these amplification conditions. Furthermore, U-87 MG cells may represent a particular cell type or developmental phase that is not present in this limited tissue sampling. The results of the present invention suggest that the distal promoter is a major determinant of GDNF expression in vivo.
[0134]
Thus far, distal and proximal human GDNF promoter and reporter gene constructs have been disclosed, including one, two or three promoters. While preferred embodiments of the invention have been described in some detail, it will be understood that various modifications can be made and still fall within the spirit and scope of the invention as defined in the claims.
[0135]
A biologically pure culture of the E. coli transformant XLOLR / pRBSEco9.4 # 8 obtained in Example 1C was obtained on July 15, 1997, Rockville, Maryland, USA, Park Lane Drive 12301, American Deposited with the Type Culture Collection (ATCC) and assigned deposit number 98498. This deposit was made under the provisions of the Budapest Treaty. In the unlikely event that there is a difference between the sequence described in this application and the gene sequence of interest contained in the deposited plasmid due to routine sequencing errors, the sequence of the deposited plasmid control is the reference.
[Brief description of the drawings]
1A-1D show the structures of various human GDNF promoters. FIG. 1A is a genetic map of human GDNF showing the positions of exons I, II, IIIa + IIIb and IV and the distal, middle and proximal promoters. 1B, 1C, and 1D are schematic diagrams illustrating GDNF gene transcripts derived from the distal GDNF promoter, the middle GDNF promoter, and the proximal GDNF promoter, respectively.
FIG. 2 is a list of plasmids pRBSEco9.4 # 8.
Figures 3A-3B (SEQ ID NO: 1) show the nucleotide sequence and the first intron portion of the human distal GDNF promoter. Exon I (starting from nt +1) is underlined and is identical to nucleotides 1-174 of Example 1E. A consensus splice site (junction) donor sequence is shown below the most 3 'sequence of exon I. The transcription factor consensus sequence is shown above the DNA sequence, and the transcription factor abbreviation is shown in italics above the consensus sequence. Nucleotide numbering is relative to the origin of exon 1.
FIGS. 4A-4C (SEQ ID NO: 2) show the nucleotide sequence of the human proximal GDNF promoter. In the figure, exon II is underlined (intermediate transcript), exon III is double-underlined, and the origin of the proximal transcript (generated by exon IIIa) is shown in bold, and the putative transcription factor names are these Shown above the consensus binding site. Numbering is relative to the origin of exon 2.
FIG. 5 shows how plasmid pGDNF-1635 is made as described in Example 2.
6A-6B show how to make plasmid pGDNFprox + dist as described in Example 5. FIG.
FIG. 7 shows a map of the human GDNF distal promoter and its various 5 ′ deletions. The first line is a complete 5 'flanking line with a position that appears to be the binding site for the indicated transcription factor. Each row below shows a map showing the amount of 5'-flanking sequence on the left side of the deletion in a straight line, and the extent of the 5'-side sequence to each subclone (as shown in Figures 3A-3B) Display on the left side of. As described in the examples, all clones were present in the luciferase reporter vector pGL3. Relative luciferase mean values +/- sem (n = 6) in two different hosts are shown on the right for each deletion.
FIGS. 8A-8C show RT-PCR results for three different GDNF transcripts, as described in Example 7. FIG. FIG. 8A shows the calibration result of the cloned cDNA template. Lane 1: Proximal template 100 zeptomoles + all primers; Lane 2: Medium template 100 zeptomoles + all primers; Lane 3: Distant template 100 zeptomoles + all primers; Lane 4: No template; Lane 5: Each template 100 zeptomoles + Lane 6: each template 10 zeptomoles + all primers; Lane 7: each template 1 zeptomoles + all primers. FIG. 8B shows the results of U-87 MG cells after various treatments for 12 hours. Lane 1, 10 zeptomoles of each template cloned + positive control for all primers; Lane 2, markers 100 and 200 hp; negative controls similar to Lane 3, Lane 4 but not treated with reverse transcriptase; Lane 4, Medium only; Lane 5, IL-1^- Lane 10, PDD (10 nM); Lane 7, BFGF (50 ng / ml); Lane 8, db-cAMP (1 mM); Lane 9, Dexamethasone (1 M); Lane 10, TNF ^ (10 ng / ml). FIG. 8C shows the results for human tissue. Lane 1, positive control for each cloned template 10 zeptomoles; Lane 2, markers 100 and 200 hp; Lane 3, fetal liver; Lane 4, adult liver; Lane 5, fetal kidney; Lane 6, adult brain; Lane 7, fetus Brain, and lane 8, adult skeletal muscle.
[Sequence Listing]

Claims (12)

ヒト遠位グリア細胞株由来の神経栄養因子（GDNF）プロモーター機能を有し、図3A〜3Bの-62位から-1位（配列番号:1のヌクレオチド1575から1636に相当）に記載のヌクレオチド配列、または図3A〜3Bの配列に沿って5’側へ延長された図3A〜3Bの-62位から-1位（配列番号:1のヌクレオチド1575から1636に相当）に記載のヌクレオチド配列からなるDNA。  Nucleotide sequence having a neurotrophic factor (GDNF) promoter function derived from a human distal glial cell line and located at positions -62 to -1 in FIGS. 3A to 3B (corresponding to nucleotides 1575 to 1636 of SEQ ID NO: 1) Or consisting of the nucleotide sequence described in FIGS. 3A-3B at positions −62 to −1 (corresponding to nucleotides 1575 to 1636 of SEQ ID NO: 1) extended 5 ′ along the sequence of FIGS. DNA. レポーター遺伝子に機能的に結合された請求項1記載のDNA。  2. The DNA of claim 1 operably linked to a reporter gene. レポーター遺伝子が、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリフォスファターゼ、ヒト成長ホルモン、および緑色蛍光タンパク質からなる群より選択されるポリペプチドをコードする、請求項2記載のDNA。  The DNA according to claim 2, wherein the reporter gene encodes a polypeptide selected from the group consisting of chloramphenicol acetyltransferase, β-galactosidase, luciferase, alkaline phosphatase, human growth hormone, and green fluorescent protein. 請求項1から3のいずれか一項記載のDNAを含むベクター。  A vector comprising the DNA according to any one of claims 1 to 3. 請求項1から3のいずれか一項記載のDNAまたは請求項4記載のベクターを含む宿主細胞。  A host cell comprising the DNA according to any one of claims 1 to 3 or the vector according to claim 4. 哺乳動物細胞である請求項5記載の宿主細胞。  6. The host cell according to claim 5, which is a mammalian cell. GDNFを発現することができる請求項6記載の宿主細胞。  7. The host cell according to claim 6, capable of expressing GDNF. 請求項1から3のいずれか一項記載のDNAが宿主細胞の染色体DNAに組み込まれている、請求項5から7のいずれか一項記載の宿主細胞。  The host cell according to any one of claims 5 to 7, wherein the DNA according to any one of claims 1 to 3 is integrated into the chromosomal DNA of the host cell. ヒト遠位グリア細胞株由来の神経栄養因子(GDNF)の発現を調節することができる化合物の同定方法であって、下記の段階を含む方法：
(a) 請求項2または3記載のDNAを細胞に導入する段階、
(b) 試験化合物を該細胞と混合し、レポーター遺伝子が発現しえる条件下で該細胞を培養する段階、
(c) 試験化合物の存在下および非存在下において、発現されたレポーター遺伝子産物のレベルを比較する段階であって、レポーター遺伝子産物の発現レベルの変化により該試験化合物がGDNF発現のレベルを調節することができることが示される段階。A method for identifying a compound capable of modulating the expression of neurotrophic factor (GDNF) from a human distal glial cell line, comprising the following steps:
(a) introducing the DNA according to claim 2 or 3 into a cell;
(b) mixing a test compound with the cell and culturing the cell under conditions that allow expression of the reporter gene;
(c) comparing the level of the expressed reporter gene product in the presence and absence of the test compound, wherein the test compound regulates the level of GDNF expression by changing the expression level of the reporter gene product The stage shown to be able to. 宿主細胞が、GDNFを発現する哺乳動物細胞である、請求項9記載の方法。  10. The method of claim 9, wherein the host cell is a mammalian cell that expresses GDNF. 哺乳動物細胞が、U-87 MG細胞およびSK-N-AS細胞からなる群より選択される、請求項10記載の方法。  11. The method of claim 10, wherein the mammalian cell is selected from the group consisting of U-87 MG cells and SK-N-AS cells. ヒトグリア細胞株由来神経栄養因子(GDNF)の発現を調節することのできる化合物を同定することを目的とする、請求項2または3記載のDNAの使用。  4. Use of the DNA according to claim 2 or 3 for the purpose of identifying a compound capable of regulating the expression of human glial cell line-derived neurotrophic factor (GDNF).

Images