JP3753533B2 - Bacteria detection method - Google Patents

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、細菌を特定しかつ定量的に検査検出することができる方法に関し、詳しくはバクテリオファージを用いて細菌を溶菌させることなく検査検出する方法に関する。
【０００２】
【従来技術】
細菌を検査検出する技術は、医薬品、食品、上下水の衛生管理、環境汚染などを評価する分野において、例えば、細菌の総数を把握して汚染の状況を把握するためとか特定の有害細菌を検出するために従来から重要な位置を占めており、一般的には、検査対象の違いなど多少の違いがあるものの多くは培養法によって実施されていた。
【０００３】
しかし、培養法による検査には従来から次の▲１▼〜▲４▼ようないくつかの問題が指摘される。即ち、▲１▼：結果が得られるまでに時間がかかる、▲２▼：判定があいまいである、▲３▼：定量性が十分でない、▲４▼：熟練した技術者が作業に当たらなければならない、などである。
【０００４】
このうちの特に上記▲１▼の検査に時間がかかるという問題は、これが解決されないと、近年、迅速な結果判定を得るために検査スピードの向上が求められている要求に応えることができず、同時に、単位時間あたりの処理サンプル数に限界を招くという問題がある。
【０００５】
このような培養法による細菌検査の不都合を改善し、迅速性を重視した検査検出方法として、例えば生物エネルギーであるＡＴＰを利用する方法、細菌が持っている酵素を利用して検出する活性染色法などが提案されているが、これらの方法は、生菌数の概算検出を迅速に行うことには適しているが菌種の特定には不向きである。また、菌種の特定を重視して、特定の菌種だけを正確に検出する検査法も提案されており、例えば、細菌に対する抗体に標識した酵素を利用する酵素免疫法、ＰＣＲ法、蛍光プローブ法が知られている。しかしこれらの方法は、一般に操作が煩雑で、汎用性に乏しいという問題がある。また生菌，死菌の判別ができないという問題もある。
【０００６】
以上のように、上述した細菌検査検出技術は、種々の産業分野において要求されている項目、すなわち細菌の種類の特定、生菌数だけの定量、操作の簡易性，迅速性などの種々の目的を満足することが難しく、特に、検出操作が煩雑であるという問題の解決が難しかった。
【０００７】
また、特開平８−１５４７００号公報では、バクテリオファージ（以下「ファージ」と略称する）を利用した細菌検査検出技術が提案されている。この提案技術は、ファージ自体を放射性同位元素（ＲＩ）や酵素で直接標識したファージ粒子、あるいはファージ頭部に充填されている核酸にレポータ遺伝子を組み込んだファージ粒子を用いて、特定の細菌に特異的にファージが吸着してファージ核酸を細菌に注入するという特性を利用することで細菌を特定した検出を行い、他方、定量は、放射性同位元素標識の場合には放射線量の測定、酵素標識の場合には基質添加による発色の比色測定や発光の光度測定、レポータ遺伝子標識の場合には注入された核酸（遺伝子）の複製，転写及び翻訳を活発に行わせた後、レポータ遺伝子の発現による活性測定に基づいて行うものである。
【０００８】
また、これとは別に、本出願人は、ファージ核酸を蛍光物質で標識し、この蛍光物質が、ファージが特異的に吸着する細菌に注入されることで光学的手法で容易な検出を可能とした提案をしている。
【０００９】
これらのファージを利用した細菌の検査検出方法は、周知のように厳密に宿主となる細菌細胞を認識して結合し、核酸を宿主細胞に注入するというファージの特性を利用するものであり、ファージ核酸の宿主細胞への注入の過程は一般に宿主細胞のエネルギー状態に依存していて、代謝活性を失った細菌細胞には核酸が注入されないという特性があるため、この方法によれば、ファージが特異的に結合することを指標にして細菌を同定することができると同時に、ファージ核酸が細胞内に取り込まれるか否かによって生死の判定もできるという検査検出方法上の特徴が得られる。
【００１０】
しかも上記のような特徴に加えて、蛍光物質をファージ核酸に標識した方法では、標識されたファージ核酸がファージ頭部に充填されている状態では、核酸を標識している色素，蛍光色素は、光学的には、ファージ頭部の大きさに相当する小さなシグナルとしてしか認められないが（３０〜１００ｎｍ）、ファージ核酸と共に宿主細胞に注入されると細胞全体に拡散し、細胞の大きさに相当する大きくて強いシグナル（１〜５μｍ）を与えるようになるので、ファージの標識された核酸から得られるシグナルはファージ頭部に充填されている状態と宿主細胞内へ注入された状態とでは大きさ及び強度に顕著な差があり、光学系で容易に判別できる。従って蛍光顕微鏡、フローサイトメーターなどを用いることにより、簡易な操作でファージ核酸が注入された細菌細胞を定量的に検出できる。
【００１１】
しかも、ファージと宿主細菌の反応は非常に速く、適当な濃度で両者が存在する条件下では数分の内に、ファージの宿主細菌への結合とそれに続く核酸の注入が終了する。従って標識したファージをある細菌を含む溶液と混合するだけで数分以内に、ファージの宿主となる細菌細胞のうち、生きている細胞だけを特異的に検出することができる。
【００１２】
【発明が解決しようとする課題】
ところで、ファージを用いた上述した細菌検査検出技術は、迅速性、特異性において優れた方法であるものの、一方でファージの本来の性質に起因する避けられない問題がある。すなわち、ファージのライフサイクルは、多くの場合、注入された核酸を鋳型として宿主の中で子ファージが増殖し、最終的には宿主を破壊、溶菌するという過程を比較的短時間のうちに経過する。このため、ファージを用いて細菌検出を行う場合に、検出操作が長引いたり、感染するファージの数が１個の細菌に対して多すぎたりすると、測定前の段階で溶菌が起こり、細菌の数が正碓に測定できなくなる虞れがある。
【００１３】
本発明者はこのような不都合を解決するために研究を進めた。上記の問題を解消するためにはファージに由来する溶菌酵素を発現させないようにすることが考えられ、例えば、ファージと細菌の反応液にタンパク質合成阻害剤を添加する方法、窒素源を含まない溶液中で反応させる方法、あるいは検出に供するファージの遺伝子にナンセンス変異を導入する方法を挙げることができる。
【００１４】
しかしこれらの方法を用いても、溶菌を回避するには十分とは言い難い。例えば、タンパク質合成を阻害する抗生物質に耐性を示す細菌はすでに自然界に数多く存在しており、これらの細菌においてはタンパク質合成阻害剤の存在下でもファージは増殖可能である。また別の問題として過剰の阻害剤が細菌の代謝活性に損傷を与え、結果としてファージの感染自体を阻害してしまう事態も起こり得る。一方、窒素源を含まない糖液中で反応させる方法は有効ではあるが、ファージの感染によって宿主細胞中に含まれていたタンパク質が分解され、窒素源としてファージの増殖に供与される可能性を否定できない。またファージ遺伝子中にナンセンス変異を導入しても、感染した宿主の側にナンセンス変異を抑制するような変異があった場合、感染は成立し、溶菌が起こる。
【００１５】
以上のように、ファージを用いた細菌検査検出系では、ファージ感染による宿主の溶菌を阻止することが定量性を高める上で重要であるが、上述したいずれの方法においても完全に宿主の溶菌を回避することは難しい。
【００１６】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、上記の検査検出方法においてファージの感染による宿主の溶菌を完全に阻止する検討を更に進めて本発明をなすに至ったものである。
【００１７】
本願の請求項１の発明は、ファージ核酸を色素又は蛍光色素で標識したバクテリオファージを宿主細菌に接触・結合させて細菌を検出する方法において、前記バクテリオファージとして、ファージ核酸を細菌に注入する能力を欠損したバクテリオファージを用いることを特徴とする。
【００１８】
この発明は、ファージ遺伝子の宿主細胞内への注入を阻止することを特徴とするものである。ファージ核酸（遺伝子）は宿主の遺伝子発現系に依存して発現するから、ファージが宿主細胞に結合しても遺伝子が細胞内へ注入されることがなければ、遺伝子は発現されず、溶菌も起こらない。ファージ核酸の宿主への注入を阻止する方法としては、宿主との相互作用に欠陥があってファージ核酸を細菌に注入する能力を欠損した変異株ファージが用いられ、このような欠損ファージは宿主細胞を認識して結合はするものの、結合に引き続く宿主細胞との相互作用に欠陥があるためにファージ自身の核酸を宿主細胞内へ注入できない。上記能力の欠損は、主に尾部の先端を構成するタンパク質の変異によってもたらされる。大腸菌ファージλであればＪタンパク質の変異、大腸菌ファージＴ４であればＧｐ１９タンパク質の変異などを例示でき、このような欠損をもつ変異株ファージは例えば後述の実施例１により取得することができる。
【００１９】
この発明においては、色素，蛍光色素で標識されたファージ核酸は細菌内に注入されないので標識のシグナルは極小さな（３０〜１００ｎｍ）ものとなるため多数のファージを細菌に吸着させることが好ましく、標識の種類、ファージの大きさ等により一律には決まらないが、一般的には、後述の実施例１で示す通り一細菌当たり１００個以上、好ましくは１５０個以上となるように、感染させるファージの数を十分に多くすることで細胞表面に吸着したファージによってその宿主細菌の存在を知ることができる。
【００２０】
なお、光学的な測定は蛍光顕微鏡、蛍光光度計、蛍光検出器を備えたフローセルなどを用い、得られた光学的情報を画像解析処理することなどして目的とする細菌の検査検出を行うことができる。
【００２１】
本発明によれば、ファージ核酸の注入に欠陥のある欠損ファージは核酸の注入に必要な宿主側因子との相互作用を適正に行うことができず、結果としてファージ核酸を宿主に取り込ませることができないから、これらの欠損ファージの核酸を色素あるいは蛍光色素で標識し、目的とする細菌に感染させることで、細菌に吸着結合するが核酸の細胞内への取り込みが阻止された状態が得られ、溶菌のない細菌検査検出ができる。
【００２２】
なお上記発明による場合、生菌，死菌の区別ができないが、これらの区別を必要としない用途において簡易な操作による細菌検査検出を実現できる。
【００２３】
本願の請求項２の発明は、ファージ核酸を色素又は蛍光色素で標識したバクテリオファージを宿主細菌に接触・結合させて細菌を検出する方法において、前記バクテリオファージとして、宿主内でＤＮＡが分断されるようになしたバクテリオファージを用いることを特徴とする。
【００２４】
この発明は、ファージ核酸が注入されたとしても、ファージ遺伝子の発現に必要な最低の大きさ以下に分断することで、遺伝子の発現を阻止し、溶菌が起こらないようにしたことを特徴とし、例えば、制限修飾系を欠損した宿主細菌で増殖させたバクテリオファージを用いることで、細菌が内在的に持っている制限修飾系を利用して得ることができる。
【００２５】
上記の「制限修飾系」とは、細菌が有している、特定の配列を認識してＤＮＡを切断する制限酵素と、その制限酵素によって認識される同じ塩基配列を化学修飾する修飾酵素から成る酵素系をいう。制限修飾系は外来遺伝子の進入を阻止する上で重要であり、細菌に特有の機構である。すなわちある細菌に外来のＤＮＡが進入すると、速やかに制限酵素によって分断される。しかし一方で細菌は、自分自身のＤＮＡに対する防御のために、自身の制限酵素に認識される塩基配列をメチル化して、分断を免れるようにするための修飾酵素を備えており、個々の種の細菌はそれぞれに特有の制限修飾系を持っている。つまり大腸菌は大腸菌に特有の、サルモネラ菌はサルモネラ菌に特有の、枯草菌は枯草菌に特有の制限修飾系をもち、またそれぞれの菌種の中でも株が異なると制限修飾系も異なる場合がある。「菌種や株に特有」という意味は、それぞれの酵素系が認識するＤＮＡ塩基配列が異なる、という意味である。
【００２６】
ファージの感染も宿主細胞の制限修飾系の影響を受ける。すなわち、大腸菌Ｂ株で増殖したファージを次に大腸菌Ｋ株に感染させると、多くの場合感染効率は非常に低下する。これはＢ株で増殖したファージのＤＮＡはＢ株の修飾を受けており、Ｋ株中ではＫ株の制限酵素によって分断されてしまうからである。なお、非常に低い確率ではあるが、Ｋ株の制限酵素による分断を逃れ増殖してくるファージもあり、これはＫ株の修飾酵素による修飾を受けたためであるが、このようにＫ株で増殖するようになったファージは次にＢ株に感染させた場合には、Ｂ株の制限を受けるために感染効率は下がる。細菌間で遺伝子のやり取りをする遺伝子操作技術においては制限修飾系は不都合である場合が多く、制限修飾系を欠損した変異株は多く知られているのでこれを用いることができる。
【００２７】
この発明は、ファージを用いた細菌の検査検出方法において、上記のメカニズムを示す細菌の制限修飾系を利用してファージによる宿主細胞の溶菌を阻止するようにしたものである。すなわち、ある細菌を宿主とするファージを制限修飾系を欠損した宿主で増殖させて得た子ファージは、本来の宿主による修飾を受けていないため、次にこれを野生型の宿主に感染させた場合に、細胞内に注入された該ファージのＤＮＡは制限酵素によって分断され、遺伝子を発現することができない。従って溶菌を起こすことがない。
【００２８】
この発明によれば、野生型の宿主に感染しＤＮＡを注入した時に分断されるように制限修飾系が欠損した宿主で増殖され、ファージ核酸が色素，蛍光色素で標識されたファージを用いることで、該ファージの感染により細胞内に導入された前記色素，蛍光色素が大きなシグナルとして光学的に容易に検出することができる状態になり、かつ他方において、細胞内に注入されたＤＮＡは該細菌が有する制限酵素により分断されるので遺伝子が発現できずに増殖しないので、細菌の溶菌が阻止される。したがって、簡易な操作で、精度の高い細菌の検査検出を行うことができる。また、ファージ核酸の細菌への注入が行われるので、吸着ファージ数をコントロールすることで、核酸の注入が起こらない死菌と、注入が起こる生菌を区別して検査検出を行うことができる。
【００２９】
なお、上記によりＤＮＡが分断されるサイズは一般に２００〜１００００塩基対であり、遺伝子発現には不十分ではあるものの、細胞内に留まるには十分なサイズであるから、この分断によって検出が阻害されることはない。
【００３０】
【実施例】
実施例１：宿主にＤＮＡを注入できないファージ変異株を用いた細菌の検出
（１）宿主にＤＮＡを注入できないファージの調製
大腸菌ファージλ（ラムダ）を用いた。λファージは宿主である大腸菌に感染する過程で、結合レセプターとして宿主のマルトース透過タンパク質（ＬａｍＢ）、ＤＮＡの注入には宿主の細胞質膜にある糖輸送系のタンパク質（ＰｔｓＭ）を必要とし、細胞質膜にある糖輸送系のタンパク質に欠損があると、λファージは宿主に結合できてもＤＮＡを注入できない。そこでこの糖輸送系のタンパク質に変異のある大腸菌を宿主として、ＤＮＡ注入に欠陥のあるλファージを以下のようにして得た。
【００３１】
すなわち、λファージの宿主として大腸菌株Ｗ３１１０（ＩＦＯｌ２７１３）：Ｆ ^- ，λ ^- ， thyA36,deoC2,IN1を用いた。Ｗ３１１０を変異誘発剤（エタンメタンスルホネート）で処理した後に増殖させ、対数増殖期のＷ３１１０にλファージをm.o.i.(multiplicuty of infection) １以上で感染させ、感染を回避して生き残った変異株を１０００株以上取得した。このようなλファージ耐性の変異株には主に細胞表層のレセプタータンパク質に関する変異株と糖輸送系の変異株が含まれる。目的とする糖輸送系の変異株は２−デオキシグルコースを唯一の炭素原としては成育できなくなるので、これを指標として目的とする糖輸送系の変異株を取得した。すなわち、上記操作で得られたλファージ耐性変異株のそれぞれを、２−デオキシグルコースを唯一の炭素原として含む培地に移し替え、増殖できない変異株を選び出した。増殖できない変異株それぞれについてλファージに対する耐性を再度確認し、最終的に蛍光標識したλファージとの相互作用を蛍光顕微鏡下で観察し、ファージが結合しているが、ＤＮＡの取り込みが起こっていない株を選び出した。ここで得られた変異株は糖輸送系の変異株であり、λファージを吸着するが、ＤＮＡを取り込めなくなった変異株である。このような変異株では糖輸送系のタンパク質に欠損が起きていることが予想できる。
【００３２】
次にλファージＤＮＡの取り込みができなくなった変異株を宿主として、ＤＮＡを野生型の宿主に注入できなくなったλファージの変異株を取得した。すなわち、野生株のλファージに紫外線照射して変異を誘発した後、ＤＮＡを取り込めなくなった上記大腸菌変異株に感染させ、生じたプラークからファージを調製した、このようにして調製したファージは、糖輸送系が変異した宿主にＤＮＡを注入できるようになったλファージの変異株であり、ファージ尾部の構造が野生型のファージとは異なることが予想される。このようなλファージの変異株を野生株の宿主に感染させても、宿主側の野生型糖輸送系と正常な相互作用が行われず、ＤＮＡを宿主に注入することはできない。こうして得られたλファージの変異株（以下「λＤＮＡ注入変異１」と称する）を蛍光標識し、蛍光顕微鏡下で観察すると、ファージの宿主への吸着結合は観察されるものの、ＤＮＡの宿主への取り込みは認められなかった。
【００３３】
（２）宿主にＤＮＡを注入できないファージを用いた大腸菌の検出
（２−１）蛍光標識したファージの調製
λＤＮＡ注入変異１の頭部ＤＮＡをＤＡＰＩで蛍光染色（蛍光標識）した。染色は下記により行った。
【００３４】
すなわち、上述の糖輸送系が変異した大腸菌の変異株をＬブロス培地（１リットル中にバクトトリプトン１０ｇ、酵母エキス５ｇ、塩化ナトリウム５ｇを含む）中、３７℃で好気的に培養し、バクテリオファージλＤＮＡ注入変異１を添加しファージを増殖させた。ファージの増殖培養に使用する培地は、栄養リッチな培地であれば特に限定されない。ＤＮＡを蛍光標識したファージ粒子を調製するために、培地にファージを加えると同時に、蛍光色素として４，６−ジアミジノ−２−フェニルインドールハイドロクロライド（ＤＡＰＩ）を培地１リットル当たり１ｍｇ添加した。なお蛍光色素は、ファージＤＮＡに親和性を持つ物質であれば特に限定されない。ファージが大腸菌細胞内で増殖し、細胞を溶かして培地中に放出されるまで、３７℃で好気的に培養を続けた。その後、ファージを含む培養液を低速遠心（３０００ｒｐｍ １０分）して細胞の残渣を除き、塩化ナトリウムを１Ｍになるように加えて溶解し、さらにポリエチレングリコールを１０％になるように加えて溶解し、４℃で一晩放置した。放置後生じた凝集物を遠心（１５０００ｒｐｍ ２０分）によって回収し、この沈殿を、５ｍＭ硫酸マグネシウムを含む２０ｍＭトリス塩酸緩衝液の少量に懸濁した。懸濁液に等量のクロロホルムを加え、３０秒間激しく攪拌した後、遠心してクロロホルム層と水層を分離した。ファージを含んだ水層を採り、３００００ｒｐｍ、３０分の遠心により、ファージを回収した。得られた沈殿を少量の５ｍＭ硫酸マグネシウム−２０ｍＭトリス塩酸緩衝液に懸濁した。
【００３５】
この懸濁液を、密度を５７％、４６％、３３％とした塩化セシウムの不連続密度勾配の上に乗せ、水平ロータで３００００ｒｐｍ、４℃で３時間遠心した。形成されたファージのバンドを採り、透析して塩化セシウムを除去し、蛍光標識ファージの精製標品とした。得られたファージの精製標品の濃度は１０¹²個／ｍｌであった。
【００３６】
（２−２）大腸菌の検出
蛍光標識したλＤＮＡ注入変異１と大腸菌Ｂ株を混合して蛍光観察するとファージが大腸菌細胞に吸着しているのが認められたが、ファージＤＮＡの細胞内への取り込みは起きていなかった。大腸菌細胞１個当たりに吸着するファージ粒子の数が少ないと（１０個以下）ファージの菌体への結合は認められるが菌体を確認することは困難であった。吸着するファージ粒子の数を多くすると（本例では２００個以上）、ファージが菌体を取り囲むように観察され、菌体の存在を確認できた。
【００３７】
次にフローサイトメトリーによつて定量性の確認を行った。大腸菌細胞ｌ個当たり２００個の蛍光標識λファージを吸着結合させ、バイオラッド社製ブライトＨＳによって計測した。Ｌブロス（１リットル中にバクトトリプトン１０ｇ、塩化ナトリウム２．５ｇを含む）で培養した大腸菌を１０⁶ 個／ｍｌ、１０⁷ 個／ｍｌ、１０⁸ 個／ｍｌの濃度になるように調整し、蛍光標識したλＤＮＡ注入変異１を１０¹¹個／ｍｌになるように添加した。３７℃で１０分間静置した後、蛍光標識された大腸菌の数を測定した。大腸菌濃度１０⁶ 個／ｍｌの標品について得られた計測値は７×１０⁵ 個／ｍｌ、１０⁷ 個／ｍｌの標品では３×１０⁷ 個／ｍｌ、１０⁸ 個／ｍｌの標品では１．５×１０⁸ 個／ｍｌであり、コロニー数から得られた結果とよく一致した。
【００３８】
次に測定時間が長引いた場合に、野生型λファージとλＤＮＡ注入変異１で測定結果に差が認められるか否かの試験を行った。Ｌブロスで培養した大腸菌を１０⁶ 個／ｍｌ、１０⁷ 個／ｍｌ、１０⁸ 個／ｍｌの濃度になるように調整し、蛍光標識したλＤＮＡ注入変異１を１０¹¹個／ｍｌとになるように添加した。また比較のために、１０⁶ 個／ｍｌ、１０⁷ 個／ｍｌ、１０⁸ 個／ｍｌの濃度になるように調整した大腸菌に、蛍光標識した野生型λファージを１０¹¹個／ｍｌとなるように添加した。
【００３９】
３７℃で１時間静置した後、フローサイトメトリーで蛍光標識された大腸菌の数を測定したところ、大腸菌濃度１０⁶ 個／ｍｌの標品について得られた計測値は野生型λファージを用いた場合には１．５×１０⁵ 個／ｍｌ、λＤＮＡ注入変異１を用いた場合には１．５×１０⁵ 個／ｍｌ、１０⁷ 個／ｍｌの標品では野生型λファージを用いた場合には２×１０⁵ 個／ｍｌ、λＤＮＡ注入変異１を用いた場合には３×１０⁷ 個／ｍｌ、１０⁸ 個／ｍｌの標品では野生型λファージを用いた場合には２×１０⁵ 個／ｍｌ、λＤＮＡ注入変異１を用いた場合には２×１０⁸ 個／ｍｌとなった。
【００４０】
上記のいずれの場合も野生型λファージを用いた場合には３７℃ １時間の培養時間内に菌体が溶菌し、測定数が著しく減少したため、正確な測定値は得られなかった。一方λＤＮＡ注入変異１を用いた場合には測定値は培養時間に関係なくコロニー数から得られた結果とよく一致した。
【００４１】
これらの結果から、ＤＮＡを宿主に注人できなくなったファージは溶菌を阻止し、定量性を向上させるのに有効であることが示された。
【００４２】
実施例２：宿主細胞内に注入されたＤＮＡが分断されるファージを用いた細菌の検出
（１）大腸菌の修飾酵素によって修飾を受けていないＤＮＡを有するファージの調製
ファージとしてはバクテリオファージＴ７を用い、制限修飾系を欠損した大腸菌株ＨＢ１０１を宿主とした他は上記実施例１の（２−１）と同様にして、蛍光標識したファージを調製した。この制限修飾系を欠損した変異株ＨＢ１０１で増殖させることで、ＤＮＡが修飾を受けていないファージＴ７を得た（このＤＮＡが修飾を受けていないバクテリオファージＴ７を、以下「Ｔ７（ＭＯＤ^- ）」と称する）。
【００４３】
こうして調製したＴ７（ＭＯＤ^- ）をm.o.i.１００で大腸菌Ｂ株に感染させ蛍光顕微鏡下で観察すると、ＤＮＡの細胞内への取り込みは正常におこっていることが確認できた。
【００４４】
（２）ＤＮＡが修飾されていないＴ７（ＭＯＤ^- ）を用いた大腸菌の検出
Ｔ７（ＭＯＤ^- ）を野生型大腸菌Ｂ株に感染させ、３７℃で静置して、―定時間ごとに蛍光顕微鏡下で観察した。また、比較のために制限修飾系を正常に有する野生株の大腸菌Ｂ株で増殖させたＤＮＡが修飾を受けているＴ７（以下「Ｔ７（ＭＯＤＢ⁺ ）と称する）を用いて同様の実験を行った。いずれのファージを用いた場合でも、感染後数分以内に蛍光標識されたファージＤＮＡによって大腸菌細胞が染色されているのが観察された。野生型の大腸菌Ｂ株で増殖させたＴ７（ＭＯＤＢ⁺ ）を用いた系では、感染後３０分で大多数の大腸菌細砲が桿菌の形態を保特しておらず球形になっており、また背景光が増加していて一部の細菌が溶菌したことが示唆された。一方、制限修飾系を欠損した宿主（ＨＢ１０１０）で増殖させたＴ７（ＭＯＤ^- ）を用いた系では、感染後３０分以上経過しても大腸菌細胞の桿菌の形態は保たれており、背景光の増加は認められなかった。以上の結果により、制限修飾系によるＤＮＡの修飾がされていないファージを用いることにより、宿主細胞内に取り込まれたファージＤＮＡは宿主が有している制限酵素によって分断され、ファージ遺伝子の発現が阻害された結果、溶菌が阻止できることが確かめられた。
【００４５】
次にフローサイトメトリーを用いた定量試験によって、ＤＮＡが宿主内で分断されるファージの有効性を確かめる試験を行った。Ｌブロス（１リットル中にバクトトリプトン１０ｇ、酵母エキス５ｇ、塩化ナトリウム５ｇを含む）で培養した野生型大腸菌Ｂ株を１０⁶ 個／ｍｌ、１０⁷ 個／ｍｌ、１０⁸ 個／ｍｌの濃度になるように調整し、蛍光標識したＴ７（ＭＯＤ^- ）を１０¹⁰個／ｍｌになるように添加した。３７℃で１０分間静置した後、蛍光標識された大腸菌の数を測定した。大腸菌濃度１０⁶ 個／ｍｌの標品について得られた計測値は９×１０⁵ 個／ｍｌ、１０⁷ 個／ｍｌの標品では２×１０⁷ 個／ｍｌ、１０⁸ 個／ｍｌの標品では１×１０⁸ 個／ｍｌであり、コロニー数から得られた結果とよく―致した。次に測定時間が長引いた場合に、Ｔ７（ＭＯＤＢ⁺ ）とＴ７（ＭＯＤ^- ）とで測定結果に差が認められるか否かの試験を行った。Ｌブロスで培養した大腸菌Ｂ株を１０⁶ 個／ｍｌ、１０⁷ 個／ｍｌ、１０⁸ 個／ｍｌの濃度になるように調整し、蛍光標識したＴ７（ＭＯＤ^- ）を１０¹⁰個／ｍｌになるように添加した。また比較のために、１０⁶ 個／ｍｌ、１０⁷ 個／ｍｌ、１０⁸ 個／ｍｌの濃度になるように調整した大腸菌Ｂ株に、蛍光標識したＴ７（ＭＯＤＢ⁺ ）を１０¹⁰個／ｍｌとなるように添加した。
【００４６】
３７℃で１時間静置した後、フローサイトメトリーで蛍光標識された大腸菌の数を測定したところ、大腸菌濃度１０⁶ 個／ｍｌの標品について得られた計測値はＴ７（ＭＯＤＢ⁺ ）を用いた場合には１．５×１０⁵ 個／ｍｌ、Ｔ７（ＭＯＤ^- ）を用いた場合には１．３×１０⁵ 個／ｍｌ、１０⁷ 個／ｍｌの標品ではＴ７（ＭＯＤＢ⁺ ）を用いた場合には２×１０⁵ 個／ｍｌ、Ｔ７（ＭＯＤ^- ）を用いた場合には３．５×１０⁷ 個／ｍｌ、１０⁸ 個／ｍｌの標品ではＴ７（ＭＯＤＢ⁺ ）を用いた場合には２×１０⁵ 個／ｍｌ、Ｔ７（ＭＯＤ^- ）を用いた場合には２×１０⁸ 個／ｍｌとなった。
【００４７】
いずれの場合もＴ７（ＭＯＤＢ⁺ ）を用いた場合には３７℃ １時間の培養時間内に菌体が溶菌し、測定数が著しく減少したため正確な測定値は得られなかった。一方Ｔ７（ＭＯＤ^- ）を用いた場合には測定値は培養時間に関係なくコロニー数から得られた結果とよく一致した。
【００４８】
これらの結果から、注入されたＤＮＡが宿主内で分断されるように処理したファージは宿主を溶菌しないので、処理時間の長短によって検査検出精度に影響することが実質的にないか、極めて小さくでき、測定の定量性を向上させるのに有効であることが示された。
【００４９】
【発明の効果】
本願の発明によれば、ファージを用いた細菌の検査検出において、細菌に非吸着のファージと、細菌に吸着・結合したファージとを物理的に分離することなく光学的に簡易な手法で検出を行うことができ、しかもファージが吸着・結合した細菌の溶菌が起こらないので、処理時間の長短により測定精度が実質的に変わらないか極めて小さくできて精度の高い検査検出を行うことができるという効果がある。
【００５０】
また、請求項１の発明によれば、ファージ核酸の細胞内への注入がないので溶菌を確実に阻止することができ、生菌，死菌の区別をせずに細菌の検査検出を行うことが求められる用途において迅速かつ操作容易で、定量精度の高い検出を実現できるという効果がある。
【００５１】
また請求項２、３の発明によれば、上記の効果に加えて、ファージ核酸の細菌への注入が行われるので、死菌と生菌を区別して生菌のみの検出を行うことができるという効果がある。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a method capable of identifying and quantitatively detecting and detecting bacteria, and more particularly, to a method of detecting and detecting bacteria using bacteriophage without lysing the bacteria.
[0002]
[Prior art]
Bacteria detection and detection technologies are used to assess the hygiene management of pharmaceuticals, foods, water and sewage, environmental pollution, etc., for example, to detect the total number of bacteria and to detect the status of contamination, or to detect specific harmful bacteria. In order to do so, it has traditionally occupied an important position, and in general, many of them have been carried out by the culture method although there are some differences such as differences in test objects.
[0003]
However, several problems such as the following (1) to (4) have been pointed out in the inspection by the culture method. That is, (1): It takes time until results are obtained, (2): Judgment is ambiguous, (3): Quantitative property is not enough, (4): If a skilled engineer does not work It must not be.
[0004]
Of these, the problem that the inspection of the above (1) takes a long time, unless this is solved, has not been able to meet the demand for improving the inspection speed in order to obtain a quick result determination in recent years. At the same time, there is a problem that the number of processed samples per unit time is limited.
[0005]
As a test detection method that improves the inconvenience of the bacterial test by such a culture method and emphasizes rapidity, for example, a method using ATP which is bioenergy, an active staining method for detecting using an enzyme possessed by bacteria Although these methods are proposed, these methods are suitable for rapid detection of the approximate number of viable bacteria, but are not suitable for identifying bacterial species. In addition, examination methods for accurately detecting only specific bacterial species with emphasis on the identification of bacterial species have been proposed. For example, enzyme immunoassay, PCR method, fluorescent probe using an enzyme labeled with an antibody against bacteria. The law is known. However, these methods generally have a problem that the operation is complicated and the versatility is poor. There is also the problem that live and dead bacteria cannot be distinguished.
[0006]
As described above, the above-described bacterial test detection technology has various purposes such as items required in various industrial fields, that is, identification of the type of bacteria, quantification of only the number of viable bacteria, simplicity of operation, and rapidity. In particular, it is difficult to solve the problem that the detection operation is complicated.
[0007]
Japanese Patent Application Laid-Open No. 8-154700 proposes a technique for detecting and detecting bacteria using bacteriophage (hereinafter abbreviated as “phage”). The proposed technology uses phage particles that are directly labeled with a radioisotope (RI) or an enzyme, or phage particles in which a reporter gene is incorporated into the nucleic acid packed in the phage head, and are specific to specific bacteria. Detection is carried out by identifying the bacteria by utilizing the characteristic that the phages are adsorbed and the phage nucleic acid is injected into the bacteria. On the other hand, in the case of radioisotope labeling, measurement of radiation dose, enzyme labeling is performed. In some cases, colorimetric measurement of chromogenicity by substrate addition, photometric measurement of luminescence, and in the case of reporter gene labeling, replication, transcription and translation of the injected nucleic acid (gene) are actively performed, followed by reporter gene expression This is based on activity measurement.
[0008]
In addition to this, the present applicant can easily detect by an optical method by labeling a phage nucleic acid with a fluorescent substance and injecting the fluorescent substance into a bacterium to which the phage specifically adsorbs. Have made suggestions.
[0009]
As is well known, the method for detecting and detecting bacteria using these phages utilizes the characteristics of phages that strictly recognize and bind to bacterial cells as hosts and inject nucleic acids into host cells. The process of injecting a nucleic acid into a host cell generally depends on the energy state of the host cell and has the property that the nucleic acid is not injected into bacterial cells that have lost metabolic activity. Thus, it is possible to identify bacteria using the binding as an index, and at the same time, it is possible to determine whether a phage nucleic acid is taken up into a cell or not, and whether the life or death can be determined.
[0010]
Moreover, in addition to the above features, in the method in which the fluorescent substance is labeled on the phage nucleic acid, in the state where the labeled phage nucleic acid is packed in the phage head, the dye and fluorescent dye that label the nucleic acid are: Optically, it is recognized only as a small signal corresponding to the size of the phage head (30 to 100 nm), but when it is injected into the host cell together with the phage nucleic acid, it diffuses throughout the cell and corresponds to the size of the cell. The signal obtained from the labeled nucleic acid of the phage is large in the state filled in the phage head and the state injected into the host cell. In addition, there is a significant difference in intensity, which can be easily discriminated by an optical system. Therefore, by using a fluorescence microscope, a flow cytometer, etc., bacterial cells into which phage nucleic acid has been injected can be quantitatively detected by a simple operation.
[0011]
Moreover, the reaction between the phage and the host bacterium is very fast, and the binding of the phage to the host bacterium and the subsequent injection of the nucleic acid are completed within a few minutes under conditions where both are present at an appropriate concentration. Therefore, only a living cell among the bacterial cells serving as the phage host can be specifically detected within a few minutes just by mixing the labeled phage with a solution containing a certain bacterium.
[0012]
[Problems to be solved by the invention]
By the way, although the above-described bacterial test and detection technology using phages is an excellent method in terms of rapidity and specificity, there is an unavoidable problem due to the inherent properties of phages. In other words, in many cases, the life cycle of phages progresses in a relatively short period of time, in which a progeny phage grows in the host using the injected nucleic acid as a template and eventually destroys and lyses the host. To do. For this reason, when detecting bacteria using phages, if the detection operation is prolonged or the number of infected phages is too large for one bacterium, lysis occurs at the stage before measurement, and the number of bacteria May not be measured correctly.
[0013]
The present inventor has conducted research in order to solve such disadvantages. In order to solve the above problems, it is conceivable not to express a lytic enzyme derived from phage. For example, a method of adding a protein synthesis inhibitor to a reaction solution of phage and bacteria, a solution not containing a nitrogen source And a method of introducing a nonsense mutation into a gene of a phage used for detection.
[0014]
However, using these methods is not sufficient to avoid lysis. For example, there are already many bacteria that are resistant to antibiotics that inhibit protein synthesis in nature, and phages can grow in these bacteria even in the presence of protein synthesis inhibitors. Another problem is that excessive inhibitors can damage bacterial metabolic activity, resulting in inhibition of phage infection itself. On the other hand, the method of reacting in a sugar solution that does not contain a nitrogen source is effective, but the protein contained in the host cell is degraded by the infection of the phage and may be used as a nitrogen source for the growth of the phage. I can't deny it. Even if a nonsense mutation is introduced into the phage gene, if there is a mutation that suppresses the nonsense mutation on the infected host side, the infection is established and lysis occurs.
[0015]
As described above, in bacterial test detection systems using phages, it is important to prevent lysis of the host due to phage infection in order to improve quantitativeness. It is difficult to avoid.
[0016]
[Means for Solving the Problems]
The present inventor has further studied to completely prevent lysis of the host due to phage infection in the test and detection method described above, and has reached the present invention.
[0017]
The invention of claim 1 of the present application is a method for detecting a bacterium by contacting and binding a bacteriophage labeled with a dye or a fluorescent dye to a host bacterium, and capable of injecting a phage nucleic acid into the bacterium as the bacteriophage. It is characterized by using a bacteriophage deficient in.
[0018]
This invention is characterized in that injection of a phage gene into a host cell is prevented. Since the phage nucleic acid (gene) is expressed depending on the host gene expression system, if the gene is not injected into the cell even if the phage binds to the host cell, the gene will not be expressed and lysis will occur. Absent. As a method for preventing the injection of phage nucleic acid into the host, mutant phage lacking the ability to inject phage nucleic acid into bacteria due to a defect in the interaction with the host is used. The phage itself nucleic acid cannot be injected into the host cell due to a defect in the interaction with the host cell following the binding. The loss of ability is mainly caused by mutations in the proteins that make up the tip of the tail. For example, mutation of the J protein can be exemplified for E. coli phage λ, and mutation of the Gp19 protein can be exemplified for E. coli phage T4. A mutant phage having such a defect can be obtained by, for example, Example 1 described later.
[0019]
In the present invention, since the phage nucleic acid labeled with a dye or a fluorescent dye is not injected into the bacterium, the labeling signal is extremely small (30 to 100 nm). Therefore, it is preferable to adsorb a large number of phages to the bacterium. In general, the number of phages to be infected is not less than 100, preferably 150 or more per bacterium, as shown in Example 1 described later. By sufficiently increasing the number, the presence of the host bacterium can be known by the phage adsorbed on the cell surface.
[0020]
In addition, optical measurement uses a flow cell equipped with a fluorescence microscope, a fluorimeter, a fluorescence detector, etc., and performs inspection analysis of the target bacteria by performing image analysis processing on the obtained optical information. Can do.
[0021]
According to the present invention, defective phage defective in phage nucleic acid injection cannot properly interact with host-side factors necessary for nucleic acid injection, and as a result, the phage nucleic acid can be incorporated into the host. Since it is not possible, by labeling the nucleic acid of these defective phages with a dye or fluorescent dye and infecting the target bacteria, a state where adsorption to the bacteria but binding of the nucleic acid into the cells is blocked is obtained, Bacteria test detection without lysis is possible.
[0022]
In the case of the above invention, live bacteria and dead bacteria cannot be distinguished from each other, but it is possible to realize bacterial test detection by a simple operation in applications that do not require such distinction.
[0023]
According to the invention of claim 2 of the present application, in the method of detecting bacteria by bringing a bacteriophage labeled with a phage nucleic acid with a dye or a fluorescent dye into contact with and binding to a host bacterium, DNA is fragmented in the host as the bacteriophage. It is characterized by using a bacteriophage prepared as described above.
[0024]
The present invention is characterized in that even when a phage nucleic acid is injected, the gene expression is blocked by disrupting it to below the minimum size required for the expression of the phage gene, and no lysis occurs. For example, by using a bacteriophage grown in a host bacterium lacking the restriction modification system, it can be obtained using a restriction modification system inherently possessed by the bacteria.
[0025]
The above-mentioned “restriction modification system” is composed of a restriction enzyme that recognizes a specific sequence and cleaves DNA, and a modification enzyme that chemically modifies the same base sequence recognized by the restriction enzyme. An enzyme system. Restriction modification systems are important in blocking the entry of foreign genes and are a mechanism unique to bacteria. That is, when foreign DNA enters a certain bacterium, it is quickly cleaved by a restriction enzyme. However, bacteria, on the other hand, have a modification enzyme for methylating the base sequence recognized by its own restriction enzyme to prevent fragmentation in order to protect against its own DNA. Each bacterium has its own restriction modification system. That is, Escherichia coli is unique to Escherichia coli, Salmonella is unique to Salmonella, Bacillus subtilis has a restriction modification system unique to Bacillus subtilis, and the restriction modification system may be different depending on the strain of each bacterial species. The meaning of “specific to bacterial species and strains” means that the DNA base sequences recognized by the respective enzyme systems are different.
[0026]
Phage infection is also affected by the host cell restriction modification system. That is, when the phage grown in the E. coli B strain is then infected with the E. coli K strain, the infection efficiency often decreases greatly. This is because the DNA of the phage grown in the B strain has been modified by the B strain and is cleaved in the K strain by the restriction enzyme of the K strain. In addition, although there is a very low probability, there are also phages that proliferate by escaping from the K-strain restriction enzyme because it has been modified by the K-strain modification enzyme. When the phages that have come to do so are then infected with the B strain, the infection efficiency is lowered due to the restriction of the B strain. In gene manipulation techniques for exchanging genes between bacteria, restriction modification systems are often inconvenient, and many mutant strains lacking restriction modification systems are known and can be used.
[0027]
According to the present invention, in a method for detecting and detecting bacteria using phages, lysis of host cells by phages is prevented by utilizing a bacterial restriction modification system showing the above-described mechanism. That is, since a child phage obtained by growing a phage having a certain host as a host in a host lacking the restriction modification system has not been modified by the original host, it was then infected with a wild-type host. In some cases, the DNA of the phage injected into the cell is cleaved by the restriction enzyme and cannot express the gene. Therefore, no lysis occurs.
[0028]
According to the present invention, by using a phage that is propagated in a host lacking a restriction modification system so as to be disrupted when a wild-type host is injected and DNA is injected, and the phage nucleic acid is labeled with a dye or a fluorescent dye, The dye and fluorescent dye introduced into the cell due to the infection of the phage can be easily detected optically as a large signal, and on the other hand, the DNA injected into the cell Since it is cleaved by the restriction enzyme it has, the gene cannot be expressed and does not grow, thus preventing bacterial lysis. Therefore, it is possible to detect and detect bacteria with high accuracy by a simple operation. In addition, since the injection of phage nucleic acid into bacteria is performed, by controlling the number of adsorbed phages, test detection can be performed by distinguishing dead bacteria that do not inject nucleic acid from live bacteria that undergo injection.
[0029]
It should be noted that the size at which DNA is divided by the above is generally 200 to 10,000 base pairs, which is insufficient for gene expression, but is sufficient to remain in the cell. Never happen.
[0030]
【Example】
Example 1: Detection of bacteria using a phage mutant that cannot inject DNA into the host
(1) Preparation of phage that cannot inject DNA into host
E. coli phage λ (lambda) was used. In the process of infecting the host E. coli, λ phage requires the host maltose permeation protein (LamB) as a binding receptor and the sugar transport system protein (PtsM) in the host cytoplasmic membrane for DNA injection. If there is a defect in the sugar transport system protein in λ, λ phage can bind to the host but cannot inject DNA. Thus, λ phage defective in DNA injection was obtained as follows using Escherichia coli having a mutation in the protein of the sugar transport system as a host.
[0031]
That is, Escherichia coli strain W3110 (IFO2713) as a host of λ phage:F ^- , Λ ^- , thyA36, deoC2, IN1 was used. W3110 was treated with a mutagen (ethane methanesulfonate) and then propagated, and λ phage was infected with W3110 in the logarithmic growth phase at moi (multiplicuty of infection) 1 or more, and 1000 mutant strains that survived infection were avoided. I got more. Such mutants resistant to λ phage mainly include mutants related to receptor proteins on the cell surface layer and mutants of the sugar transport system. Since the target mutant strain of the sugar transport system cannot grow using 2-deoxyglucose as the sole carbon source, the target mutant strain of the sugar transport system was obtained using this as an index. That is, each of the λ phage-resistant mutant strains obtained by the above operation was transferred to a medium containing 2-deoxyglucose as the only carbon source, and mutant strains that could not grow were selected. For each mutant strain that cannot grow, the resistance to λ phage is confirmed again. Finally, the interaction with the fluorescently labeled λ phage is observed under a fluorescence microscope, and the phage is bound, but no DNA uptake has occurred. Selected stocks. The mutant obtained here is a sugar transport mutant, which adsorbs λ phage but is unable to take up DNA. In such a mutant strain, it can be expected that a defect occurs in the protein of the sugar transport system.
[0032]
Next, using a mutant strain incapable of incorporating λ phage DNA as a host, a mutant strain of λ phage in which DNA could not be injected into a wild type host was obtained. That is, after inducing the mutation by irradiating the wild-type λ phage with ultraviolet light, infecting the E. coli mutant strain incapable of taking up DNA, and preparing the phage from the resulting plaque. It is a mutant of λ phage that can inject DNA into a host with a mutated transport system, and the structure of the phage tail is expected to be different from that of the wild-type phage. Even when a wild type host is infected with such a λ phage mutant, normal interaction with the wild type sugar transport system on the host side is not performed, and DNA cannot be injected into the host. When the mutant of λ phage thus obtained (hereinafter referred to as “λDNA injection mutation 1”) is fluorescently labeled and observed under a fluorescence microscope, the binding of the phage to the host is observed, but the DNA is not bound to the host. Uptake was not observed.
[0033]
(2) Detection of E. coli using phages that cannot inject DNA into the host
(2-1) Preparation of fluorescently labeled phage
The head DNA of λDNA injection mutation 1 was fluorescently stained (fluorescently labeled) with DAPI. Staining was performed as follows.
[0034]
That is, the above-mentioned mutant strain of Escherichia coli mutated in sugar transport system was aerobically cultured at 37 ° C. in L broth medium (containing 10 g of bactotryptone, 5 g of yeast extract, and 5 g of sodium chloride in 1 liter). Bacteriophage λ DNA injection mutation 1 was added to grow the phage. The medium used for phage growth culture is not particularly limited as long as it is a nutrient-rich medium. In order to prepare phage particles fluorescently labeled with DNA, at the same time as adding phage to the medium, 1 mg of 4,6-diamidino-2-phenylindole hydrochloride (DAPI) was added as a fluorescent dye per liter of the medium. The fluorescent dye is not particularly limited as long as it is a substance having affinity for phage DNA. The culture was continued aerobically at 37 ° C. until the phage grew in E. coli cells, lysed and released into the medium. Thereafter, the culture broth containing the phages is centrifuged at a low speed (3000 rpm for 10 minutes) to remove cell residues, and sodium chloride is added to dissolve to 1 M, and polyethylene glycol is added to 10% to dissolve. Left at 4 ° C. overnight. Aggregates formed after standing were collected by centrifugation (15000 rpm, 20 minutes), and the precipitate was suspended in a small amount of 20 mM Tris-HCl buffer containing 5 mM magnesium sulfate. An equal amount of chloroform was added to the suspension and stirred vigorously for 30 seconds, followed by centrifugation to separate the chloroform layer and the aqueous layer. The aqueous layer containing the phage was taken, and the phage was recovered by centrifugation at 30000 rpm for 30 minutes. The obtained precipitate was suspended in a small amount of 5 mM magnesium sulfate-20 mM Tris-HCl buffer.
[0035]
This suspension was placed on a discontinuous density gradient of cesium chloride having a density of 57%, 46%, and 33%, and centrifuged at 30000 rpm at 4 ° C. for 3 hours in a horizontal rotor. The formed phage band was collected and dialyzed to remove cesium chloride to obtain a purified preparation of fluorescently labeled phage. The concentration of the purified phage preparation is 10¹²Pieces / ml.
[0036]
(2-2) Detection of E. coli
When the fluorescence-labeled λDNA injection mutation 1 and E. coli B strain were mixed and observed for fluorescence, it was observed that phages were adsorbed to E. coli cells, but no phage DNA was taken into the cells. When the number of phage particles adsorbed per E. coli cell was small (less than 10), binding of phages to the cells was observed, but it was difficult to confirm the cells. When the number of adsorbed phage particles was increased (200 or more in this example), the phages were observed to surround the cells, and the presence of the cells could be confirmed.
[0037]
Next, the quantitative property was confirmed by flow cytometry. 200 fluorescently labeled λ phages were adsorbed and bound per 1 E. coli cell, and measured with Bright HS manufactured by Bio-Rad. 10 E. coli cells cultured in L broth (containing 10 g of bactotryptone and 2.5 g of sodium chloride in 1 liter)⁶ Pieces / ml, 10⁷ Pieces / ml, 10⁸ ΛDNA injection mutation 1 that was adjusted to a concentration of 1 cell / ml and fluorescently labeled was 10¹¹It added so that it might become a piece / ml. After standing at 37 ° C. for 10 minutes, the number of fluorescently labeled E. coli was measured. E. coli concentration 10⁶ The measured value obtained for the sample per piece / ml is 7 × 10^Five Pieces / ml, 10⁷ 3 × 10 for standard / ml⁷ Pieces / ml, 10⁸ 1.5 × 10 for standard / ml⁸ This was in good agreement with the result obtained from the number of colonies.
[0038]
Next, when the measurement time was prolonged, it was tested whether there was a difference in the measurement results between the wild type λ phage and the λDNA injection mutation 1. 10 E. coli cultured in L broth⁶ Pieces / ml, 10⁷ Pieces / ml, 10⁸ ΛDNA injection mutation 1 that was adjusted to a concentration of 1 cell / ml and fluorescently labeled was 10¹¹It added so that it might become a piece / ml. For comparison, 10⁶ Pieces / ml, 10⁷ Pieces / ml, 10⁸ 10 wild-type λ phages labeled with fluorescence were added to E. coli adjusted to a concentration of 5 cells / ml.¹¹It added so that it might become a piece / ml.
[0039]
After standing at 37 ° C. for 1 hour, the number of fluorescently labeled E. coli was measured by flow cytometry.⁶ When the wild type λ phage was used, the measured value obtained for the sample / ml was 1.5 × 10^Five 1.5 × 10 when λDNA injection mutation 1 is used^Five Pieces / ml, 10⁷ 2 × 10 when the wild type λ phage is used in the standard / ml sample^Five 3 × 10 when 1 / ml, λDNA injection mutation 1 is used⁷ Pieces / ml, 10⁸ 2 × 10 when the wild type λ phage is used in the standard / ml sample^Five 2 × 10 when 1 / ml, λDNA injection mutation 1 is used⁸ It became the piece / ml.
[0040]
In any of the above cases, when wild-type λ phage was used, the cells were lysed within the culture time of 37 ° C. for 1 hour, and the number of measurements was significantly reduced, so an accurate measurement value could not be obtained. On the other hand, when λDNA injection mutation 1 was used, the measured values agreed well with the results obtained from the number of colonies regardless of the culture time.
[0041]
From these results, it was shown that phages that can no longer pour DNA into the host are effective in preventing lysis and improving quantification.
[0042]
Example 2: Detection of bacteria using a phage that cleaves DNA injected into host cells
(1) Preparation of phage having DNA not modified by E. coli modifying enzyme
Bacteriophage T7 was used as the phage, and a fluorescently labeled phage was prepared in the same manner as in (2-1) of Example 1 except that E. coli strain HB101 lacking the restriction modification system was used as the host. By growing the mutant HB101 lacking this restriction modification system, phage T7 whose DNA was not modified was obtained (bacteriophage T7 whose DNA was not modified is hereinafter referred to as “T7 (MOD^- ) ").
[0043]
Thus prepared T7 (MOD^- ) Was infected with Escherichia coli B strain with m.o.i.100 and observed under a fluorescence microscope, it was confirmed that DNA was normally taken up into cells.
[0044]
(2) Unmodified T7 (MOD^- Of Escherichia coli using
T7 (MOD^- ) Was infected with wild type E. coli B strain, allowed to stand at 37 ° C., and observed under a fluorescence microscope at regular intervals. For comparison, T7 (hereinafter referred to as “T7 (MODB) in which DNA grown in a wild-type E. coli B strain that normally has a restriction modification system is modified.⁺ A similar experiment was conducted using In any case, it was observed that E. coli cells were stained with fluorescently labeled phage DNA within several minutes after infection. T7 (MODB) grown in wild type E. coli B strain⁺ ), The majority of Escherichia coli artillery was not spherical in the shape of gonococcus, and the background light increased and some bacteria were lysed 30 minutes after infection. It has been suggested. On the other hand, T7 (MOD grown in a host (HB1010) lacking the restriction modification system.^- ), The gonococcal morphology of E. coli cells was maintained even after 30 minutes or more after infection, and no increase in background light was observed. Based on the above results, by using a phage whose DNA is not modified by a restriction modification system, the phage DNA incorporated into the host cell is cleaved by the restriction enzyme possessed by the host, and the expression of the phage gene is inhibited. As a result, it was confirmed that lysis can be prevented.
[0045]
Next, a test for confirming the effectiveness of the phage that cleaves DNA in the host was performed by a quantitative test using flow cytometry. 10 wild-type Escherichia coli B strains cultured in L broth (containing 10 g of bactotryptone, 5 g of yeast extract and 5 g of sodium chloride in 1 liter)⁶ Pieces / ml, 10⁷ Pieces / ml, 10⁸ T7 (MOD^- ) 10^TenIt added so that it might become a piece / ml. After standing at 37 ° C. for 10 minutes, the number of fluorescently labeled E. coli was measured. E. coli concentration 10⁶ The measured value obtained for the sample per piece / ml is 9 × 10^Five Pieces / ml, 10⁷ 2 × 10 for standard / ml⁷ Pieces / ml, 10⁸ 1 × 10 for standard / ml⁸ Per ml, which is in good agreement with the results obtained from the number of colonies. Next, when the measurement time is prolonged, T7 (MODB⁺ ) And T7 (MOD^- ) And whether or not there is a difference in the measurement results. 10 strains of E. coli B cultured in L broth⁶ Pieces / ml, 10⁷ Pieces / ml, 10⁸ T7 (MOD^- ) 10^TenIt added so that it might become a piece / ml. For comparison, 10⁶ Pieces / ml, 10⁷ Pieces / ml, 10⁸ E. coli B strain adjusted to a concentration of 1 cell / ml, T7 (MODB⁺ ) 10^TenIt added so that it might become a piece / ml.
[0046]
After standing at 37 ° C. for 1 hour, the number of fluorescently labeled E. coli was measured by flow cytometry.⁶ The measurement value obtained for the sample / ml was T7 (MODB⁺ ) Is 1.5 × 10^Five Pieces / ml, T7 (MOD^- ) Is 1.3 × 10^Five Pieces / ml, 10⁷ T7 (MODB for standard / ml⁺ ) Is used, 2 × 10^Five Pieces / ml, T7 (MOD^- ) Is 3.5 × 10⁷ Pieces / ml, 10⁸ T7 (MODB for standard / ml⁺ ) Is used, 2 × 10^Five Pieces / ml, T7 (MOD^- ) Is used, 2 × 10⁸ It became the piece / ml.
[0047]
In either case, T7 (MODB⁺ When) was used, the microbial cells were lysed within the culture time of 37 ° C. for 1 hour, and the number of measurements was significantly reduced, so an accurate measurement value could not be obtained. On the other hand, T7 (MOD^- The measured value was in good agreement with the results obtained from the number of colonies regardless of the culture time.
[0048]
From these results, since the phage treated so that the injected DNA is disrupted in the host does not lyse the host, the length of the treatment time does not substantially affect the test detection accuracy or can be extremely small. It has been shown to be effective in improving the quantitativeness of the measurement.
[0049]
【The invention's effect】
According to the invention of the present application, in the detection and detection of bacteria using phages, detection can be performed by an optically simple technique without physically separating phages that are not adsorbed on bacteria and phages that are adsorbed and bound to bacteria. The effect of the ability to perform high-accuracy test detection is possible because the measurement accuracy can be substantially unchanged or extremely small due to the length of the processing time, since the lysis of the bacteria adsorbed and bound to the phage does not occur. There is.
[0050]
In addition, according to the invention of claim 1, since there is no injection of phage nucleic acid into cells, lysis can be surely prevented, and bacteria are detected and detected without distinguishing between live and dead bacteria. Therefore, there is an effect that it is possible to realize detection with high quantification accuracy that is quick and easy to operate in applications requiring high quantification.
[0051]
According to the inventions of claims 2 and 3, in addition to the above-described effects, since the phage nucleic acid is injected into bacteria, it is possible to detect only live bacteria by distinguishing between dead and live bacteria. effective.

Claims (3)

ファージ核酸を色素又は蛍光色素で標識したバクテリオファージを宿主細菌に接触・結合させて細菌を検出する方法において、前記バクテリオファージとして、ファージ核酸を細菌に注入する能力が欠損したバクテリオファージを用いることを特徴とする細菌の検出方法。In a method for detecting bacteria by contacting and binding a phage nucleic acid labeled with a dye or fluorescent dye to a host bacterium, the bacteriophage lacking the ability to inject phage nucleic acid into the bacterium is used as the bacteriophage. Bacterial detection method characterized. ファージ核酸を色素又は蛍光色素で標識したバクテリオファージを宿主細菌に接触・結合させて細菌を検出する方法において、前記バクテリオファージとして、宿主内でＤＮＡが分断されるようになしたバクテリオファージを用いることを特徴とする細菌の検出方法。In the method of detecting bacteria by contacting and binding a bacteriophage labeled with a dye or a fluorescent dye to a host bacterium, a bacteriophage in which DNA is disrupted in the host is used as the bacteriophage. A method for detecting bacteria. 請求項２において、バクテリオファージが、制限修飾系を欠損した宿主細菌で増殖させたバクテリオファージであることを特徴とする細菌の検出方法。The method for detecting a bacterium according to claim 2, wherein the bacteriophage is a bacteriophage grown in a host bacterium lacking a restriction modification system.