JP3748887B2 - Vr−2332 ウィルスヌクレオチド配列および使用方法 - Google Patents
Vr−2332 ウィルスヌクレオチド配列および使用方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP3748887B2 JP3748887B2 JP50679096A JP50679096A JP3748887B2 JP 3748887 B2 JP3748887 B2 JP 3748887B2 JP 50679096 A JP50679096 A JP 50679096A JP 50679096 A JP50679096 A JP 50679096A JP 3748887 B2 JP3748887 B2 JP 3748887B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- virus
- sequence
- seq
- cdna
- protein
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 35
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 title claims abstract description 9
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 title description 13
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims abstract description 123
- 208000005342 Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Diseases 0.000 claims abstract description 33
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims abstract description 12
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 63
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 58
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 claims description 56
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 25
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 24
- 230000028993 immune response Effects 0.000 claims description 11
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 claims description 9
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 6
- 238000002955 isolation Methods 0.000 claims description 5
- 230000003053 immunization Effects 0.000 claims description 4
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 claims description 4
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 claims 3
- 241000701959 Escherichia virus Lambda Species 0.000 claims 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 abstract description 37
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 abstract description 37
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 abstract description 25
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 abstract description 20
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 abstract description 18
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 abstract description 18
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 abstract description 17
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 abstract description 15
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 abstract description 12
- 108010067390 Viral Proteins Proteins 0.000 abstract description 10
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 abstract description 9
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 abstract description 9
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 6
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 abstract description 5
- 238000003556 assay Methods 0.000 abstract 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 52
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 32
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 25
- 101710110895 Uncharacterized 7.3 kDa protein in cox-rep intergenic region Proteins 0.000 description 22
- 241000710803 Equine arteritis virus Species 0.000 description 21
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 19
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 18
- 241000282898 Sus scrofa Species 0.000 description 17
- 101000621943 Acholeplasma phage L2 Probable integrase/recombinase Proteins 0.000 description 16
- 101000618348 Allochromatium vinosum (strain ATCC 17899 / DSM 180 / NBRC 103801 / NCIMB 10441 / D) Uncharacterized protein Alvin_0065 Proteins 0.000 description 16
- 101000781117 Autographa californica nuclear polyhedrosis virus Uncharacterized 12.4 kDa protein in CTL-LEF2 intergenic region Proteins 0.000 description 16
- 101000708323 Azospirillum brasilense Uncharacterized 28.8 kDa protein in nifR3-like 5'region Proteins 0.000 description 16
- 101000770311 Azotobacter chroococcum mcd 1 Uncharacterized 19.8 kDa protein in nifW 5'region Proteins 0.000 description 16
- 101000748761 Bacillus subtilis (strain 168) Uncharacterized MFS-type transporter YcxA Proteins 0.000 description 16
- 101000765620 Bacillus subtilis (strain 168) Uncharacterized protein YlxP Proteins 0.000 description 16
- 101000916134 Bacillus subtilis (strain 168) Uncharacterized protein YqxJ Proteins 0.000 description 16
- 101000754349 Bordetella pertussis (strain Tohama I / ATCC BAA-589 / NCTC 13251) UPF0065 protein BP0148 Proteins 0.000 description 16
- 101000827633 Caldicellulosiruptor sp. (strain Rt8B.4) Uncharacterized 23.9 kDa protein in xynA 3'region Proteins 0.000 description 16
- 101000947628 Claviceps purpurea Uncharacterized 11.8 kDa protein Proteins 0.000 description 16
- 101000686796 Clostridium perfringens Replication protein Proteins 0.000 description 16
- 101000788129 Escherichia coli Uncharacterized protein in sul1 3'region Proteins 0.000 description 16
- 101000788370 Escherichia phage P2 Uncharacterized 12.9 kDa protein in GpA 3'region Proteins 0.000 description 16
- 101000787096 Geobacillus stearothermophilus Uncharacterized protein in gldA 3'region Proteins 0.000 description 16
- 101000976889 Haemophilus phage HP1 (strain HP1c1) Uncharacterized 19.2 kDa protein in cox-rep intergenic region Proteins 0.000 description 16
- 101000827627 Klebsiella pneumoniae Putative low molecular weight protein-tyrosine-phosphatase Proteins 0.000 description 16
- 101001130841 Middle East respiratory syndrome-related coronavirus (isolate United Kingdom/H123990006/2012) Non-structural protein ORF5 Proteins 0.000 description 16
- 101710087110 ORF6 protein Proteins 0.000 description 16
- 101000974028 Rhizobium leguminosarum bv. viciae (strain 3841) Putative cystathionine beta-lyase Proteins 0.000 description 16
- 101000756519 Rhodobacter capsulatus (strain ATCC BAA-309 / NBRC 16581 / SB1003) Uncharacterized protein RCAP_rcc00048 Proteins 0.000 description 16
- 101000948219 Rhodococcus erythropolis Uncharacterized 11.5 kDa protein in thcD 3'region Proteins 0.000 description 16
- 101000936711 Streptococcus gordonii Accessory secretory protein Asp4 Proteins 0.000 description 16
- 101000929863 Streptomyces cinnamonensis Monensin polyketide synthase putative ketoacyl reductase Proteins 0.000 description 16
- 101000788468 Streptomyces coelicolor Uncharacterized protein in mprR 3'region Proteins 0.000 description 16
- 101000845085 Streptomyces violaceoruber Granaticin polyketide synthase putative ketoacyl reductase 1 Proteins 0.000 description 16
- 101000711771 Thiocystis violacea Uncharacterized 76.5 kDa protein in phbC 3'region Proteins 0.000 description 16
- 101710095001 Uncharacterized protein in nifU 5'region Proteins 0.000 description 16
- 101000711318 Vibrio alginolyticus Uncharacterized 11.6 kDa protein in scrR 3'region Proteins 0.000 description 16
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 16
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 16
- 241000710788 Lelystad virus Species 0.000 description 14
- 101710159752 Poly(3-hydroxyalkanoate) polymerase subunit PhaE Proteins 0.000 description 13
- 101710130262 Probable Vpr-like protein Proteins 0.000 description 13
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 13
- 230000000241 respiratory effect Effects 0.000 description 13
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 12
- 101710197985 Probable protein Rev Proteins 0.000 description 12
- 101000768957 Acholeplasma phage L2 Uncharacterized 37.2 kDa protein Proteins 0.000 description 11
- 101000823746 Acidianus ambivalens Uncharacterized 17.7 kDa protein in bps2 3'region Proteins 0.000 description 11
- 101000916369 Acidianus ambivalens Uncharacterized protein in sor 5'region Proteins 0.000 description 11
- 101000769342 Acinetobacter guillouiae Uncharacterized protein in rpoN-murA intergenic region Proteins 0.000 description 11
- 101000823696 Actinobacillus pleuropneumoniae Uncharacterized glycosyltransferase in aroQ 3'region Proteins 0.000 description 11
- 101000786513 Agrobacterium tumefaciens (strain 15955) Uncharacterized protein outside the virF region Proteins 0.000 description 11
- 101000618005 Alkalihalobacillus pseudofirmus (strain ATCC BAA-2126 / JCM 17055 / OF4) Uncharacterized protein BpOF4_00885 Proteins 0.000 description 11
- 102100020724 Ankyrin repeat, SAM and basic leucine zipper domain-containing protein 1 Human genes 0.000 description 11
- 101000967489 Azorhizobium caulinodans (strain ATCC 43989 / DSM 5975 / JCM 20966 / LMG 6465 / NBRC 14845 / NCIMB 13405 / ORS 571) Uncharacterized protein AZC_3924 Proteins 0.000 description 11
- 101000823761 Bacillus licheniformis Uncharacterized 9.4 kDa protein in flaL 3'region Proteins 0.000 description 11
- 101000819719 Bacillus methanolicus Uncharacterized N-acetyltransferase in lysA 3'region Proteins 0.000 description 11
- 101000789586 Bacillus subtilis (strain 168) UPF0702 transmembrane protein YkjA Proteins 0.000 description 11
- 101000792624 Bacillus subtilis (strain 168) Uncharacterized protein YbxH Proteins 0.000 description 11
- 101000790792 Bacillus subtilis (strain 168) Uncharacterized protein YckC Proteins 0.000 description 11
- 101000819705 Bacillus subtilis (strain 168) Uncharacterized protein YlxR Proteins 0.000 description 11
- 101000948218 Bacillus subtilis (strain 168) Uncharacterized protein YtxJ Proteins 0.000 description 11
- 101000718627 Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki Putative RNA polymerase sigma-G factor Proteins 0.000 description 11
- 101000641200 Bombyx mori densovirus Putative non-structural protein Proteins 0.000 description 11
- 101000947633 Claviceps purpurea Uncharacterized 13.8 kDa protein Proteins 0.000 description 11
- 102100031725 Cortactin-binding protein 2 Human genes 0.000 description 11
- 101000948901 Enterobacteria phage T4 Uncharacterized 16.0 kDa protein in segB-ipI intergenic region Proteins 0.000 description 11
- 101000805958 Equine herpesvirus 4 (strain 1942) Virion protein US10 homolog Proteins 0.000 description 11
- 101000790442 Escherichia coli Insertion element IS2 uncharacterized 11.1 kDa protein Proteins 0.000 description 11
- 101000788354 Escherichia phage P2 Uncharacterized 8.2 kDa protein in gpA 5'region Proteins 0.000 description 11
- 101000770304 Frankia alni UPF0460 protein in nifX-nifW intergenic region Proteins 0.000 description 11
- 101000797344 Geobacillus stearothermophilus Putative tRNA (cytidine(34)-2'-O)-methyltransferase Proteins 0.000 description 11
- 101000748410 Geobacillus stearothermophilus Uncharacterized protein in fumA 3'region Proteins 0.000 description 11
- 101000772675 Haemophilus influenzae (strain ATCC 51907 / DSM 11121 / KW20 / Rd) UPF0438 protein HI_0847 Proteins 0.000 description 11
- 101000631019 Haemophilus influenzae (strain ATCC 51907 / DSM 11121 / KW20 / Rd) Uncharacterized protein HI_0350 Proteins 0.000 description 11
- 101000768938 Haemophilus phage HP1 (strain HP1c1) Uncharacterized 8.9 kDa protein in int-C1 intergenic region Proteins 0.000 description 11
- 101000785414 Homo sapiens Ankyrin repeat, SAM and basic leucine zipper domain-containing protein 1 Proteins 0.000 description 11
- 101000782488 Junonia coenia densovirus (isolate pBRJ/1990) Putative non-structural protein NS2 Proteins 0.000 description 11
- 101000811523 Klebsiella pneumoniae Uncharacterized 55.8 kDa protein in cps region Proteins 0.000 description 11
- 101000818409 Lactococcus lactis subsp. lactis Uncharacterized HTH-type transcriptional regulator in lacX 3'region Proteins 0.000 description 11
- 101000878851 Leptolyngbya boryana Putative Fe(2+) transport protein A Proteins 0.000 description 11
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 11
- 101000758828 Methanosarcina barkeri (strain Fusaro / DSM 804) Uncharacterized protein Mbar_A1602 Proteins 0.000 description 11
- 101001122401 Middle East respiratory syndrome-related coronavirus (isolate United Kingdom/H123990006/2012) Non-structural protein ORF3 Proteins 0.000 description 11
- 101001055788 Mycolicibacterium smegmatis (strain ATCC 700084 / mc(2)155) Pentapeptide repeat protein MfpA Proteins 0.000 description 11
- 101000740670 Orgyia pseudotsugata multicapsid polyhedrosis virus Protein C42 Proteins 0.000 description 11
- 101000769182 Photorhabdus luminescens Uncharacterized protein in pnp 3'region Proteins 0.000 description 11
- 101000961392 Pseudescherichia vulneris Uncharacterized 29.9 kDa protein in crtE 3'region Proteins 0.000 description 11
- 101000731030 Pseudomonas oleovorans Poly(3-hydroxyalkanoate) polymerase 2 Proteins 0.000 description 11
- 101001065485 Pseudomonas putida Probable fatty acid methyltransferase Proteins 0.000 description 11
- 101000711023 Rhizobium leguminosarum bv. trifolii Uncharacterized protein in tfuA 3'region Proteins 0.000 description 11
- 101000948156 Rhodococcus erythropolis Uncharacterized 47.3 kDa protein in thcA 5'region Proteins 0.000 description 11
- 101000917565 Rhodococcus fascians Uncharacterized 33.6 kDa protein in fasciation locus Proteins 0.000 description 11
- 101000790284 Saimiriine herpesvirus 2 (strain 488) Uncharacterized 9.5 kDa protein in DHFR 3'region Proteins 0.000 description 11
- 101000936719 Streptococcus gordonii Accessory Sec system protein Asp3 Proteins 0.000 description 11
- 101000788499 Streptomyces coelicolor Uncharacterized oxidoreductase in mprA 5'region Proteins 0.000 description 11
- 101001102841 Streptomyces griseus Purine nucleoside phosphorylase ORF3 Proteins 0.000 description 11
- 101000708557 Streptomyces lincolnensis Uncharacterized 17.2 kDa protein in melC2-rnhH intergenic region Proteins 0.000 description 11
- 101000649826 Thermotoga neapolitana Putative anti-sigma factor antagonist TM1081 homolog Proteins 0.000 description 11
- 101000827562 Vibrio alginolyticus Uncharacterized protein in proC 3'region Proteins 0.000 description 11
- 101000778915 Vibrio parahaemolyticus serotype O3:K6 (strain RIMD 2210633) Uncharacterized membrane protein VP2115 Proteins 0.000 description 11
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 description 11
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 10
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 10
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 10
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 8
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 8
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 8
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 7
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 7
- 102100034349 Integrase Human genes 0.000 description 6
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 6
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 6
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 6
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 6
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 6
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 6
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 6
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 6
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 6
- 239000000047 product Substances 0.000 description 6
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 6
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 5
- 241001292006 Arteriviridae Species 0.000 description 5
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 5
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 5
- 101710172711 Structural protein Proteins 0.000 description 5
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 5
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 5
- 208000000509 infertility Diseases 0.000 description 5
- 231100000535 infertility Toxicity 0.000 description 5
- 230000036512 infertility Effects 0.000 description 5
- 239000000463 material Substances 0.000 description 5
- 238000011160 research Methods 0.000 description 5
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 5
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 5
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 5
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 4
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000711573 Coronaviridae Species 0.000 description 4
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 4
- 241001516645 Simian hemorrhagic fever virus Species 0.000 description 4
- 206010000210 abortion Diseases 0.000 description 4
- 231100000176 abortion Toxicity 0.000 description 4
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 4
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 description 4
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 4
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 4
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 4
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 4
- 230000009260 cross reactivity Effects 0.000 description 4
- 241001493065 dsRNA viruses Species 0.000 description 4
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 4
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 4
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 4
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 4
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 4
- 230000000405 serological effect Effects 0.000 description 4
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 3
- 108090000565 Capsid Proteins Proteins 0.000 description 3
- 102100023321 Ceruloplasmin Human genes 0.000 description 3
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 3
- JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-M Lactate Chemical compound CC(O)C([O-])=O JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 241000710789 Lactate dehydrogenase-elevating virus Species 0.000 description 3
- 108091092724 Noncoding DNA Proteins 0.000 description 3
- 108090001074 Nucleocapsid Proteins Proteins 0.000 description 3
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 3
- 238000002123 RNA extraction Methods 0.000 description 3
- BFDMCHRDSYTOLE-UHFFFAOYSA-N SC#N.NC(N)=N.ClC(Cl)Cl.OC1=CC=CC=C1 Chemical compound SC#N.NC(N)=N.ClC(Cl)Cl.OC1=CC=CC=C1 BFDMCHRDSYTOLE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 3
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 3
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 3
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 3
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 3
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 3
- FFYPMLJYZAEMQB-UHFFFAOYSA-N diethyl pyrocarbonate Chemical compound CCOC(=O)OC(=O)OCC FFYPMLJYZAEMQB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 231100000676 disease causative agent Toxicity 0.000 description 3
- BJDWURMSYDDCRX-UHFFFAOYSA-N ethoxycarbonyl ethyl carbonate;hydrate Chemical compound O.CCOC(=O)OC(=O)OCC BJDWURMSYDDCRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 3
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 3
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 3
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 3
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 230000001850 reproductive effect Effects 0.000 description 3
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 208000012153 swine disease Diseases 0.000 description 3
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NGYHUCPPLJOZIX-XLPZGREQSA-N 5-methyl-dCTP Chemical compound O=C1N=C(N)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C1 NGYHUCPPLJOZIX-XLPZGREQSA-N 0.000 description 2
- RDYSDCWZHHUGIB-UHFFFAOYSA-N 6,8-dihydroxy-3-methyl-2h-isoquinolin-1-one Chemical compound OC1=CC(O)=C2C(=O)NC(C)=CC2=C1 RDYSDCWZHHUGIB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010000234 Abortion spontaneous Diseases 0.000 description 2
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 2
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 2
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-N Guanidine Chemical compound NC(N)=N ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 2
- 238000000636 Northern blotting Methods 0.000 description 2
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 108091023045 Untranslated Region Proteins 0.000 description 2
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108020000999 Viral RNA Proteins 0.000 description 2
- 230000005856 abnormality Effects 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 2
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 2
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M caesium chloride Chemical compound [Cl-].[Cs+] AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 2
- 239000001569 carbon dioxide Substances 0.000 description 2
- 229910002092 carbon dioxide Inorganic materials 0.000 description 2
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 2
- BKHZIBWEHPHYAI-UHFFFAOYSA-N chloroform;3-methylbutan-1-ol Chemical compound ClC(Cl)Cl.CC(C)CCO BKHZIBWEHPHYAI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J dCTP(4-) Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)C1 RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J 0.000 description 2
- 238000013461 design Methods 0.000 description 2
- 239000005546 dideoxynucleotide Substances 0.000 description 2
- 208000032625 disorder of ear Diseases 0.000 description 2
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- ZJYYHGLJYGJLLN-UHFFFAOYSA-N guanidinium thiocyanate Chemical compound SC#N.NC(N)=N ZJYYHGLJYGJLLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 2
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 2
- 238000010255 intramuscular injection Methods 0.000 description 2
- 239000007927 intramuscular injection Substances 0.000 description 2
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 2
- PHTQWCKDNZKARW-UHFFFAOYSA-N isoamylol Chemical compound CC(C)CCO PHTQWCKDNZKARW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 2
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 description 2
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 2
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 2
- 208000015994 miscarriage Diseases 0.000 description 2
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 2
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 2
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 2
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 2
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 2
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 2
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 2
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 2
- 238000012552 review Methods 0.000 description 2
- 229940016590 sarkosyl Drugs 0.000 description 2
- 108700004121 sarkosyl Proteins 0.000 description 2
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- KSAVQLQVUXSOCR-UHFFFAOYSA-M sodium lauroyl sarcosinate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCC(=O)N(C)CC([O-])=O KSAVQLQVUXSOCR-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 208000000995 spontaneous abortion Diseases 0.000 description 2
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 229960000737 tolpropamine Drugs 0.000 description 2
- 238000009281 ultraviolet germicidal irradiation Methods 0.000 description 2
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 1
- 101000977065 Acidithiobacillus ferridurans Uncharacterized 11.6 kDa protein in mobS 3'region Proteins 0.000 description 1
- 208000031295 Animal disease Diseases 0.000 description 1
- 101100136076 Aspergillus oryzae (strain ATCC 42149 / RIB 40) pel1 gene Proteins 0.000 description 1
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 1
- 101000861180 Cupriavidus necator (strain ATCC 17699 / DSM 428 / KCTC 22496 / NCIMB 10442 / H16 / Stanier 337) Uncharacterized protein H16_B0147 Proteins 0.000 description 1
- 108010017826 DNA Polymerase I Proteins 0.000 description 1
- 102000004594 DNA Polymerase I Human genes 0.000 description 1
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 1
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 1
- 101710091045 Envelope protein Proteins 0.000 description 1
- 108700007698 Genetic Terminator Regions Proteins 0.000 description 1
- CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N Gentamicin Chemical compound O1[C@H](C(C)NC)CC[C@@H](N)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](NC)[C@@](C)(O)CO2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N 0.000 description 1
- 229930182566 Gentamicin Natural products 0.000 description 1
- 108010024636 Glutathione Proteins 0.000 description 1
- 108010053070 Glutathione Disulfide Proteins 0.000 description 1
- 206010061192 Haemorrhagic fever Diseases 0.000 description 1
- 239000012981 Hank's balanced salt solution Substances 0.000 description 1
- 206010020880 Hypertrophy Diseases 0.000 description 1
- 241000713869 Moloney murine leukemia virus Species 0.000 description 1
- CHJJGSNFBQVOTG-UHFFFAOYSA-N N-methyl-guanidine Natural products CNC(N)=N CHJJGSNFBQVOTG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 1
- 238000009004 PCR Kit Methods 0.000 description 1
- 108010021757 Polynucleotide 5'-Hydroxyl-Kinase Proteins 0.000 description 1
- 102000008422 Polynucleotide 5'-hydroxyl-kinase Human genes 0.000 description 1
- 101100028161 Porcine circovirus 2 ORF4 gene Proteins 0.000 description 1
- 241001135989 Porcine reproductive and respiratory syndrome virus Species 0.000 description 1
- 101710192141 Protein Nef Proteins 0.000 description 1
- 101710188315 Protein X Proteins 0.000 description 1
- 206010037660 Pyrexia Diseases 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 208000004756 Respiratory Insufficiency Diseases 0.000 description 1
- 102000006382 Ribonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108010083644 Ribonucleases Proteins 0.000 description 1
- 239000012506 Sephacryl® Substances 0.000 description 1
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 1
- 239000008049 TAE buffer Substances 0.000 description 1
- 101000980463 Treponema pallidum (strain Nichols) Chaperonin GroEL Proteins 0.000 description 1
- 101000714195 Varicella-zoster virus (strain Dumas) Tegument protein UL51 homolog Proteins 0.000 description 1
- HGEVZDLYZYVYHD-UHFFFAOYSA-N acetic acid;2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;2-[2-[bis(carboxymethyl)amino]ethyl-(carboxymethyl)amino]acetic acid Chemical compound CC(O)=O.OCC(N)(CO)CO.OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O HGEVZDLYZYVYHD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 230000005875 antibody response Effects 0.000 description 1
- 238000011888 autopsy Methods 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 108010058966 bacteriophage T7 induced DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- NTOWNLCWAWIJJA-UHFFFAOYSA-N carboxy hydrogen carbonate;hydrate Chemical compound O.OC(=O)OC(O)=O NTOWNLCWAWIJJA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 108091092328 cellular RNA Proteins 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N dATP Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 1
- SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N dATP Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1CC(O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N dGTP Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N 0.000 description 1
- 206010061428 decreased appetite Diseases 0.000 description 1
- 238000012631 diagnostic technique Methods 0.000 description 1
- 125000004177 diethyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- SWSQBOPZIKWTGO-UHFFFAOYSA-N dimethylaminoamidine Natural products CN(C)C(N)=N SWSQBOPZIKWTGO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 210000005069 ears Anatomy 0.000 description 1
- 230000002500 effect on skin Effects 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 1
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 1
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 229960002518 gentamicin Drugs 0.000 description 1
- RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N glutathione Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC(O)=O RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- YPZRWBKMTBYPTK-BJDJZHNGSA-N glutathione disulfide Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@H](C(=O)NCC(O)=O)CSSC[C@@H](C(=O)NCC(O)=O)NC(=O)CC[C@H](N)C(O)=O YPZRWBKMTBYPTK-BJDJZHNGSA-N 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- YQOKLYTXVFAUCW-UHFFFAOYSA-N guanidine;isothiocyanic acid Chemical compound N=C=S.NC(N)=N YQOKLYTXVFAUCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 1
- 230000002055 immunohistochemical effect Effects 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 210000003000 inclusion body Anatomy 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 239000012678 infectious agent Substances 0.000 description 1
- 238000011850 initial investigation Methods 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 244000144972 livestock Species 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 108010026228 mRNA guanylyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 239000002480 mineral oil Substances 0.000 description 1
- 235000010446 mineral oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 description 1
- 210000002445 nipple Anatomy 0.000 description 1
- 108091027963 non-coding RNA Proteins 0.000 description 1
- 102000042567 non-coding RNA Human genes 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 1
- 101150040383 pel2 gene Proteins 0.000 description 1
- 101150050446 pelB gene Proteins 0.000 description 1
- 230000000149 penetrating effect Effects 0.000 description 1
- 238000002205 phenol-chloroform extraction Methods 0.000 description 1
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 1
- 230000001766 physiological effect Effects 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 230000035935 pregnancy Effects 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 239000002987 primer (paints) Substances 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 230000009465 prokaryotic expression Effects 0.000 description 1
- 230000001915 proofreading effect Effects 0.000 description 1
- 230000004853 protein function Effects 0.000 description 1
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 1
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 1
- 230000022532 regulation of transcription, DNA-dependent Effects 0.000 description 1
- 201000004193 respiratory failure Diseases 0.000 description 1
- 239000003161 ribonuclease inhibitor Substances 0.000 description 1
- 239000007320 rich medium Substances 0.000 description 1
- 238000001542 size-exclusion chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 1
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 1
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 1
- 208000002254 stillbirth Diseases 0.000 description 1
- 231100000537 stillbirth Toxicity 0.000 description 1
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 1
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 1
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
- C12N2770/00011—Details
- C12N2770/10011—Arteriviridae
- C12N2770/10022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Virology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Oncology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Public Health (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Description
この出願には配列表が伴っており、コンピューターで読み出し可能なASCIIファイル形式の同じ内容のものも提出する。
発明の背景
1.発明の技術分野
本発明は分子遺伝学、特に動物の病気を診断する、または動物の病気に対して予防接種する際の人工ヌクレオチドの使用方法に関する。より詳細には好ましいヌクレオチドは豚繁殖呼吸症候群(porcine reproductive and respiratory syndorome(PRRS))ウィルスの別の株に由来し、予防接種や診断技術への応用において選択的にこのウィルスを標的にする。
2.先行技術の記載
1987年に北アメリカで新しい豚のウィルス性の病気が見つかり、不可解な豚病委員会会議、10月6日、デンバー、コロラドのマジソン動物保存研究所、ウィスコンシン、から出された議事録29〜30頁(1990)において、ヒルにより「不可解な豚病の概要と歴史(豚の不妊呼吸症候群)」(Overview and History of Mystery Swinne Disease(Swine Infertility and Respiratory syndrome))が報告された。実質的に同一の症状の徴候をもつ病気が1990年ヨーロッパで見つかり、パットン(Paton)等により「豚の青耳病」128、ベット レック(Vet Rec)617(1991)が報告された。病状から観察された病気は普通豚繁殖呼吸症候群(PRRS)、豚不妊呼吸症候群(SIRS)、豚流行性流産呼吸症候群(PEARS)、不可解な豚病、を含む様々な名称で知られているが、ここではPRRSという用語をでこれらの名称すべてを示すこととする。
この病気の結果には、ほとんど回復せずあっけなく死んでしまう幼い豚の呼吸不全と同様に、雌豚における後期の流産、死産が含まれる。雌豚においては妊娠速度および胎児の大きさに減少が見られた。推定では繁殖が出来ないために豚の生産の約10〜15%が年間で失われた。この疾患の初期の臨床上の症状としては食欲減退や微熱が挙げられた。他の症状としては病気の一群の動物の皮膚に青くしみが出来、そのしみははじめは耳、乳頭、耳口部、首や肩の前部にできた。検死結果により、マクロファージ、退化した細胞、肺胞中のくずによって肺胞中空の肥大が引き起こされたことがわかった。これらの異常によりPRRSウィルスの存在が示された。
この原因となるウィルス因子は、小さく、エンベロープ(細胞膜)に包まれたプラス(+)鎖のRNAウィルスと予想されベンフィールド等「豚の不妊呼吸症候群(SIRS)ウィルス(単離ATTC VR−2332)の特徴」4.ジャーナル オブ ベトリナリー ダイアグノシス インベスティゲイション 127〜133頁(1992)(Benfield et al.,Characterization of swine infertility and respiratory syndoromu(SIRS)virus(isolate ATCC VR-2332),4 J.Vet, Diagn.Invest.127-133(1992))およびウェンスボート等、レリスタッドウィルス、豚流行性流産呼吸症候群の原因:レリスタッドにおける不可解な豚病の研究の概観、33 ベット マイクロ 185〜193頁(1992)(Wensvoort et al., Lelystad virus,the cause of porcine epidemic abortion and respiratory syndrome: a review of mystery swine disease research at Lelystad, 33 Vet. Micro. 185-193(1992))。レリスタッド(LV)ウィルスの単離技術は感染した豚の肺組織をすりつぶすこと;ホモジェネイトを生理食塩水、例えばリンガー溶液、ハンクス液、最小必要培地(MEM)を破砕物の10%wt/volになるように混合すること;および該混合物を0.45、0.2および0.1マイクロフィルターで濾過することを含む。
プラグマン等、「乳酸デヒドロゲナーゼ−促進ウィルス、馬アルテリティスウィルスおよびシアミン出血性熱ウィルス:プラス(+)鎖RNAウィルスの新しいグループ」、41 アドバンテージ オブ ウィルス リサーチ 99−192頁(1992)(Plagemann et al., Lactate dehydrogenase elevating virus, equine arteritis virus and simian hemorrhagic fever virus: a new group of positive-strand RNA viruses, 41 Adv. Vir. Res. 99-192(1992))によれば、LVウィルスは、形態学、ゲノム構成、転写調節、およびマクロファージ特異性においてアルテリウィルス(arterivirus)に非常に近いらしい。
PRRSウィルスのLV株の完全なヌクレオチド配列はニューレンバーク等、「レリスタッドウィルス、豚流行性流産呼吸症候群(PEARS)の原因はLDVとEAVに関係している。」192ヴィロロジイ 62〜72頁(1993)(Meulenberg et al., Lelystad virus, the causative agent of porcine epidemic abortion and respiratory syndrome(PEARS),is related to LDV and EAV,192 Virology 62-72(1993))により同定された。部分的なLV配列もまたコンゼルマン等「豚繁殖呼吸症候群ウィルス、アルテリウィルス群の一員の分子的な特徴。」193 ウィロロジイ 193、329〜339頁(Conzelmann et al., Molecular characterization of porcine reproductive and respiratory syndrome virus, a member of the arterivirus group, 193 Virology 193, 329-339)により同定された。LVウィルスのプラス鎖ゲノム(配列番号14〜26)はコロナウィルスとアルテリウィルスの遺伝子と比べて幾分似ている8つのオープンリーディングフレーム(ORF)を含んでいた。2つのオープンリーディングフレームは同様にウィルスRNAポリメラーゼをコードしていた。2から6までのLV ORFはウィルスの膜と関係のある構造蛋白質をコードしているようで、LV ORF 7はヌクレオカプシドをコードしていると思われた。
LVウィルス蛋白質は3’末端が重複しているRNA転写物のいれこ状のセットから発現された。この発現方法はコロナウィルス属と共通であるが、LVウィルスの生理学的な性質は本来トガウィルス(Togavirus)族と同じである。
プラグマン等(上述)はこれらの二重の性質を有するウィルスを含む新しい族、アルテリヴィリダ(Alteriviridae)を提唱した。この族にはPRRSウィルス、馬アルテリティスウィルス(EAV)、乳酸デヒドロゲナーゼ−促進ウィルス(LDL)、およびシミアン出血性熱ウィルス(SHFV)が含まれる。
ベンフィールド等「豚不妊呼吸症候群(SIRS)ウィルス(単離ATCC VR−2332)の特徴決定」、4 ジャーナル オブ ベトリナリー ダイアグノシス インベスティゲイション 4、127〜133(1992)(Benfield et al., Characterization of swine infertility and respiratory syndrome(SIRS)virus(isolate ATCC VR-2332), 4 J. Vet. Diagn. Invest. 4, 127-133(1992))により報告されたとおり、PRRSウィルスの第二株(VR−2332)は第4継代細胞培養として単離された。それにもかかわらず、該ウィルスのゲノムの配列は決定されなかった。VR−2332単離体はアメリカン タイプ カルチャー コレクションに寄託され、現在ATCCカタログ番号VR−2332になっている。VR−2332ウィルスは平均直径62nmでエンベロープにより囲まれた25〜30nmの核を有する球状であると特徴づけられた。ウィルス粒子は塩化セシウム中で1.18−1.19g/mlの浮遊密度を有し、組織の破砕物を塩化セシウム濃度勾配をかけて遠心し濾過してさらに精製した。
それぞれVR−2332とLVウィルス単離体は、特に共通の形態学的および豚の似かよった臨床上の症状の点から、抗原性の多様性に広範な違いを示した。ヨーロッパと北アメリカから得た24カ所の血清と7つのウィルス単離体は、ウェンスボート等、「レリスタッドウリルスと豚不妊呼吸症候群(SIRS)ウィルスの抗原性の比較」。4 ジャーナル オブ ベトリナリー ダイアグノシス インベスティゲイション 134〜138頁(1992)(Wensvoort et al., Antigenic comparison of Lelystad virus and swine infertility and respiratory syndrome(SIRS)virus,4 J. Vet. Diagn. Invest. 134-138(1992))に報告されたとおり、両方のウィルスに対して信頼できる方法で感染を診断できる単一の共通する抗原を認識することができなかった。したがって、2つのウィルス株間の構造および徴候学的な類似性にかかわらず、豚を2つの株にたいして免疫する目的にたいして単一の株のウィルスから単一のワクチンを開発することは無理のようである。
発明の要約
本発明は、免疫学的にPRRSウィルスのVR−2332株と異なった人工ヌクレオチド配列、同様にこれら核酸由来のワクチンおよび対応する予防接種の方法を提供することを概要とする問題を解決する。
広くいえば、本発明はPRRS病原体のVR−2332に由来する物質および方法を含む。該物質は好ましくはVR−2332ウィルスに由来する核酸、およびPRRS病原体のLV型と比較してそれらを特異なものにするのに充分な長さを有する蛋白質を含む。上記方法は診断における分析や予防接種方法にこれらの物質を使用することを含む。
本発明において、特に好ましい物質は、精製され単離されたORF2とORF7の間のVR−2332ゲノム配列の断片部分をコードする核酸を含む。これらの配列はLVウィルスゲノムに関して特異的であり、好ましくは豚の抗−VR−2332PRRS免疫反応を誘導することができるポリペプチドの発現物をコードする。VR−2332およびLVウィルス間のPRRSの臨床上の症状およびウィルス形態学的な類似性にかかわらず、VR−2332由来のオリゴヌクレオチドはVR−2332 cDNAの選択的増幅のためにポリメラーゼチェインリアクション(PCR)のプライマーとして用いることができる。これらの配列はVR−2332ゲノム由来の逆の相補的オリゴヌクレオチド配列も含む。これらのヌクレオチド配列はまた選択的に野生型VR−2332 cDNAを同定するためのハイブリダイゼイションの研究においてプローブとして用いることができる。
VR−2332ヌクレオチド配列は部分的に、キメラベクターと組み替えられて、挿入したVR−2332コード領域の挿入物を適当なプロモーター配列とターミネーター配列の制御下に置く。このベクターは挿入物によってコードされる蛋白質の宿主での発現に用いられる。宿主での発現は原核細胞でも真核細胞でも成し遂げられる。これらのベクターは組み替えプラスミドとして構築され、宿主の豚がウィルス蛋白質を生産するとき免疫応答を誘導するように直接豚に導入する。さもなければ、ウィルス蛋白質を細胞培養で生産して、免疫応答を誘導するために豚に導入する。
これらのヌクレオチド配列はまた、VR−2332由来cDNAまたはLV由来cDNAを選択的に増幅するプライマーを用いて、PCR診断分析に使用できる。または、これらのプライマー配列の特定のPRRS原因ウィルスの存在を示すハイブリダイゼーション反応に使用することができる。
他の目的、本発明の有利で顕著な特徴は、添付される図面と共に考慮され、本発明のいくつかの実施例を開示する以下の詳細な説明で明らかになる。
【図面の簡単な説明】
図1は、配列番号1を生産するPRRSウィルスのVR−2332株のヌクレオチド配列を決定するために使用された種々のクローンから得たcDNA断片に対応する影付き領域を参考にVR−2332 ORF2〜7の位置的構造を示す。
図2は配列番号1〜13に対応するVR−2332 ORF2〜7のヌクレオチドと推定アミノ酸配列を示す。
図3Aは、IUPAC一文字表記アミノ酸コードに従ってVR−2332とLVウィルスのORF7のそれぞれのアミノ酸配列間の比較を示し、同一の残基は大文字で表し、異なっている残基は小文字で表し、これらの残基に対する完全な3文字アミノ酸コードは配列番号13(VR−2332)と配列番号26(LV ウィルス)に表す。
図3BはVR−2332 ORF7の疎水性プロフィール(hydropathy profile)を示し、ここで縦軸は疎水性の値を示し、横軸は残基の番号を示す。
図3CはLVウィルスORF7の疎水性プロフィールを示し、実質的に図3Bに類似している。
図4AはIUPAC一文字表記アミノ酸コードに従ってVR−2332とLVウィルスのORF6のそれぞれのアミノ酸の配列間の比較を示し、同一の残基は大文字で表し、異なっている残基は小文字で表し、これらの残基に対する完全な3文字アミノ酸コードは配列番号11(VR−2332)と配列番号24(LVウィルス)に表す。
図4BはVR−2332 ORF6の疎水性プロフィールを示し、ここで縦軸は疎水性の値を示し、横軸は残基の番号を示す。
図4CはLVウィルスORF6の疎水性プロフィールを示し、実質的に図4Bに類似している。
図5AはIUPAC一文字表記アミノ酸コードに従ってVR−2332とLVウィルスのORF5のそれぞれのアミノ酸の配列間の比較を示し、同一の残基は大文字で表し、異なっている残基は小文字で表し、これらの残基に対する完全な3文字アミノ酸コードは配列番号9(VR−2332)と配列番号22(LVウィルス)に表す。
図5BはVR−2332 ORF5の疎水性プロフィールを示し、ここで縦軸は疎水性の値を示し、横軸は残基の番号を示す。
図5CはLVウィルスORF5の疎水性プロフィールを示し、実質的に図5Bに類似している。
図6AはIUPAC一文字表記アミノ酸コードに従ってVR−2332とLVウィルスのORF4のそれぞれのアミノ酸の配列間の比較を示し、同一の残基は大文字で表し、異なっている残基は小文字で表し、これらの残基に対する完全な3文字アミノ酸コードは配列番号7(VR−2332)と配列番号20(LVウィルス)に表す。
図6BはVR−2332 ORF4の疎水性プロフィールを示し、ここで縦軸は疎水性の値を示し、横軸は残基の番号を示す。
図6CはLVウィルスORF4の疎水性プロフィールを示し、実質的に図6Bに類似している。
図7AはIUPAC一文字表記アミノ酸コードに従ってVR−2332とLVウィルスのORF3のそれぞれのアミノ酸の配列間の比較を示し、同一の残基は大文字で表し、異なっている残基は小文字で表し、これらの残基に対する完全な3文字アミノ酸コードは配列番号5(VR−2332)と配列番号18(LVウィルス)に表す。
図7BはVR−2332 ORF3の疎水性プロフィールを示し、ここで縦軸は疎水性の値を示し、横軸は残基の番号を示す。
図7CはLVウィルスORF3の疎水性プロフィールを示し、実質的に図7Bに類似している。
図8AはIUPAC一文字表記アミノ酸コードに従ってVR−2332とLVウィルスのORF2のそれぞれのアミノ酸の配列間の比較を示し、同一の残基は大文字で表し、異なっている残基は小文字で表し、これらの残基に対する完全な3文字アミノ酸コードは配列番号3(VR−2332)と配列番号16(LVウィルス)に表す。
図8BはVR−2332 ORF2の疎水性プロフィールを示し、ここで縦軸は疎水性の値を示し、横軸は残基の番号を示す。
図8CはLVウィルスORF2の疎水性プロフィールを示し、実質的に図8Bに類似している。
図9はそれぞれVR−2332とLVウィルス3’の非翻訳領域の比較を示す。
好ましい実施例の詳細な説明
以下の限定していない実施例は本発明を実施するための好ましい方法と物質を提示する。
実施例1
VR−2332ウィルスの生育
ATCC VR−2332ウィルスのウィルス的に純粋なMA−104セルラインの培養物はウィルスの接種物として使用するために得られた、リッジフィールド、コネチカットのベーリンガーインゲルハイム(Boehringer Ingelheim of Rdgefield, Connecticut)に多謝。
培養物はVR−2332接種物を繁殖させるために調製された。VR−2332ウィルスは、グレイベル等、181 プロシーディング オブ ソサイティ オブ エクスプレシング バイオロジカル メヂシン、112〜119(Gravell et al., 181 Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 112-119)に概説される方法に従って、サル腎臓セルライン由来の細胞中で増殖された。当業者は、又は2621、MA−104やUに言及してもよい。非感染細胞は、セントルイス、ミズーリのシグマケミカル社から購入した10%胎児牛血清、50μg/mlゲンタマイシンイーグルを添加したMEM培地(ゲイサースバーグ、メリーランドのライフテクノロギー社から購入)50mlで培養された。細胞はトリプシン−ベルセン(versene)でフラスコ表面からはがされ、遠心して細胞を沈澱させ、トリプシン−ベンセン(versene)上清から分離され、前培養のために1:4に分けられた。細胞は加湿した5%二酸化炭素大気中、37℃で75cm2プラスチック組織培養フラスコ中で、5〜7日間隔で培地を交換して継代された。
4つの50ml細胞培養物は、増殖培地を除去して、だいたい105〜106組織培養感染単位(TCID50)の力価を有する増殖培地1ml中のVR−2332接種物を添加して、それぞれ感染させられた。得られた混合物は30分間保温して、時間経過後、4%胎児牛血清を含有する新鮮なMEM培地30mlを添加した。
感染した細胞は24または48時間、上述のとおり二酸化炭素雰囲気下で保温され、培地を除去して、フラスコ壁面に付着した細胞を取り出して回収される。
実施例2
cDNAライブラリーの構築
実施例1で回収された細胞はリン酸で緩衝した生理食塩水で洗浄して、5Mグアニジンイソチオシアネイトを添加して溶解された。全細胞RNAは、コムジンスキー等、「チオシアン酸グアニジニウム−フェノール−クロロフォルム抽出によるRNA単離の1段階法」、162 アナリティカル バイオケミストリー 156〜159(1987)(Chomczynski et al., Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform ectraction,162 Anal. Biochem. 156-159(1987))に記載された方法に従って抽出された。ポリA含有RNAはゲイサースバーグ、メリーランドのギブコBRLの通常の装置と方法を使ってオリゴdTカラムクロマトグラフィーにより選抜された。
cDNAライブラリーはキットの説明書(ラホヤ、カリホルニアのストラタジーン社)に従って、Gigapack▲R▼II Gold1パッケージング抽出物と大腸菌SURETMを用いてラムダ一方向性ファージベクターUniZapTMXR中でで構築された(UniZapTMXR、Gigapack▲R▼II GoldSURETMはラホヤ、カリホルニアのストラタジーン社の商標である)。この方法は市販のキットで提供される材料を参考にしてまとめられる。
細胞溶解物2mlから得られたポリA選抜RNAはモロニーネズミ白血病ウィルス逆転写酵素とXhoI制限酵素部位を含む配列をもつ合成50塩基オリゴdTプライマーにより以下のとおり逆転写された。
第一の鎖合成反応は5−メチル dCTPを含有した。第二の鎖合成はDNAポリメラーゼIと5−メチル dCTPの代わりに標準dCTPを用いて行われた。二重鎖cDNAの末端はT4DNAポリメラーゼにより平滑化され、EcoRIアダプターがT4DNAリガーゼにより付着された。該アダプターは以下のような合成ヌクレオチド配列を有した:
得られたcDNAはポリヌクレオチドキナーゼで処理され、5’末端をリン酸化され,XhoIで完全に消化して、セファクリルS−400カラムで精製した。
cDNAはUni−ZapTMXRベクターのアームとDNAリガーゼで連結され、高効率パッケージ抽出、Gigapack▲R▼II ゴールド中でパッケージングを行った。得られたパッケージングされた感染力のあるファージ調製物は大腸菌セルラインSURETMに感染させた。
実施例3
PCRによるcDNAライブタリーのスクリーニング
報告されたLVウィルス由来のPCRプライマー配列を使って複製連鎖反応によりVR−2332陽性プラークを同定することを目的として実施例2のcDNAライブラリーをスクリーニングするためになされた多くの試みは、不成功に終わった。合成DNA配列またはプライマーは、通常の方法に従って指示体として作られ、32Pでラベルされた。ニューレンバーク等、「レリスタッドウィルス、豚流行性流産呼吸症候群(PEARS)の原因はLDVとEAVに関係している。」192 バイロロジイ 62〜72頁(1993)(Meulenberg et al., Lelystad virus, the causative agent of porcine epidemic abortion and respiratory syndrome(PEARS),is related to LDV and EAV,192 Virology 62-72(1993))に報告されたとおり、これらのオリゴヌクレオチドプライマーは、LVウィルスのORF2、6、および7の部分を複製した。PCRで増幅されたヌクレオチド産物は、いかなる条件下でも全く得られなかった。
VR−2332の核酸配列のPCRによる増幅で観察された全ての失敗により、2種(LVとVR−2332)のウィルスは、LV由来プライマーを用いたVR−2332のcDNAの特異的PCR増幅を妨げるのに充分な著しいヌクレオチド配列の相違を有していることが示された。それ故、PRRSウィルスのVR−2332株の構造遺伝子に相当するヌクレオチド配列を決定するために、LV配列をPCRのためでなくハイブリダイゼーションのために用いる別のクローニング戦略が考え出された。
実施例4
プラークハイブリダイゼイションによるcDNAライブラリーのスクリーニング
LV ORF7(LVウィルスの配列番号26)由来のcDNAを複製するPCRにより作られたヌクレオチド断片が32Pでラベルされ、VR−2332ウィルスにより感染したMA−104細胞を用いるプローブノーザンブロットに使用された。ラジオグラフのバンドが感染した細胞から得られたが、感染していない細胞からは得られなかった。これらのバンドはLVとVR−2332が実施例3でPCRができなかったのにかかわらず、ハイブリダイゼイションはできるような類似する配列を共有することを示した。
全部でおよそ50,000のプラークができている、15cmの寒天プレート枚数をNitorPlusニトロセルロース膜(マサチューセッツ、ウエストボロのマイクロセパレーション社)で複製体からスクリーニングされた。相当するLVウィルスプローブにハイブリダイズされた陽性プラークは、X線フィルムへの照射により決定されたとおり、対応するラジオグラフのバンドにより同定された。これらの陽性プラークは確認のために、再度播き直して、スクリーニングされた。ハイブリダイゼイション陽性組み替えUni−ZapTMXRファージに、配列分析のためのプラスミドDNAを得るために、ストラタジーン社の解説書に記載の通りインビボでの抽出が行われた。ストラタジーン社の方法を以下に概説する。
組み替えファージは、ExAssistヘルパーファージと同様に37℃15分間で、大腸菌XL1−Blue細胞に組み込んで、37℃で振とうしながら2〜3時間栄養豊富な培地で培養した。培養物は70℃で20分間暖められ、遠心により、不純物を除かれた。回収されたファージミドを含む上清はSOLR細胞に加えられ、アンピリシン含有寒天プレートにまかれた。これらのバクテリアのコロニーは、組み替えプラスミドを含んでいた。
得られたクローンは液体培地で増殖された。DNAは抽出され、さらにEcoRIおよびXhoI制限エンドヌクレアーゼ消化(10倍過剰)で分析された。VR−2332特異的挿入物のサイズは、分子量スタンダードを用いて、寒天ゲル中での電気泳動により見積もられた。次いで、23クローンのヌクレオチド配列がシーケナーゼ、35S−dATPおよびストラタジーン社の合成M13−20プライマーを使ったジデオキシヌクレオチド配列決定により決定された;
配列決定産物は6%変性ポリアクリルアミドゲルで分析された。23クローンのうち20が3’配列と同一であり、これらのクローンは両末端とも入れ子状になっていることを示唆した。全て同じ3’末端を含有している、これらの様々なサイズの20クローンのうち6つはさらにDNA配列決定のために選抜された。
実施例5
VR−2332配列分析
ヌクレオチド配列データはシーケナーゼを用いた手動ジデオキシヌクレオチド配列決定(オハイオ、クリーブランド、USバイオケミカルズ社)と自動蛍光配列決定(カリホルニア フォスターシティ アプライドバイオシステムズ社)により実施例4の6つの選択されたクローンそれぞれに対して得られた。
図1は6つのクローンの本来の位置を図示したもので、つまりこれらはさらに配列分析のために選ばれて761、712、431、412、513、および416と名づける。配列番号1を位置の参照にすると、断片の長さの範囲は0から3.5kbにわたる、。クローン431、412、513、および416は5’末端から次の小さいクローンから得られた配列と重なるまで配列決定が行われた。クローン416の5’末端とORF2の間の間隔はクローン712と761の両方から配列決定がされ、合成VR−2332特異的プライマーにより両末端から配列が決定された。更なる配列決定が逆の鎖で配列を確認するために行われた。この方法により6つの独立したクローンを組み合わせて両方の鎖から、3358ヌクレオチド、つまり、配列番号1の配列を読んだ。図2はこの全配列を、それから導きだれるアミノ酸翻訳とともに示す。
LVとVR−2332ウィルスの多くの違いは、3’末端非翻訳領域と同様にORF2から7をコードする3’ゲノム配列にわたって起こった。これらの違いはヌクレオチドの置換、塩基の欠損、塩基の付加によって起こった。この配列の違いはたぶんエラーが起こりやすい複製から起こり、ウィルスのレプリカーゼは精度が低く、プルーフリーディング活性が欠けている。
実施例6
アミノ酸残基配列比較および免疫交差反応性
はじめの調査はこれら6つのVR−2332ORFから導き出された蛋白質はLVウィルス、LDV、EAVのそれぞれにおいて知られているORF2〜7とに大雑把に相当することを示した。従って、LDVとEAVを含む他のアルテリビリダと同様に、VR−2332とLVウィルスのアミノ酸残基配列の間の違いを決定するために詳細な比較研究を行った。アミノ酸配列比較はGCG(ウィスコンシン、マジソン、ウィスコンシン大学)とインテリジェネテックス社(カリホルニア、マウンテンビュー)(Intelligenetics,Inc.(Mountain View,Ca))のソフトウェアーを用いて行われた。配列番号1は、ORF2の開始点に先行する最も5’よりの84塩基と共にVR−2332ヌクレオチド配列の最も3’よりの3442塩基に対するVR−2332配列を含む。これら3358ヌクレオチドはウィルスの構造蛋白質をコードし、それぞれ配列番号2〜13に対応する各ORFを備える6つのORFを含む。これらのVR−2332 ORFはLVウィルス,LDV、EAVを含むアルテリビリダ族の他のウィルスと同様にLV ORF2〜7と比較して様々な程度の相同性を有する。さらに詳細には、比較配列分析はVR−2332ウィルスとLVウィルスの間のアミノ酸配列相同性がORF5の55%からORF6の79%にわたることを示す。表1はこのアルテリビリダ族の比較結果を示す。
VR−2332のORFは最もLVウィルスに似ているが、VR−2332とLDVの比較は進化における歴史をLDVと共有していることを示した。VR−2332はLVウィルスのORF5と55%の同一性を有するが、LVとの相同性の程度にわたって最も低い。VR−2332 ORF5はLDVの相当する物の相同性全体にわたって高い程度を示す。VR−2332 ORF5はLDV ORF5と52%の同一性を有し、LDVよりLVにほんの少し似ている。VR−2332がLDVと比較される場合、相同性はORF2、3および4より、ORF5、6および7において高い。これらの関連するウィルス間の観察された抗原性の違いを説明する根拠を提供するほかには、部分的にはORF2、3、および4由来の蛋白質の機能は知られていないために、これ以上の相違の重要性は不明である。
これらアミノ酸配列分析はまた、殆ど予期しなかったが、配列の相違は広く分布していたことを示した。重要な相違はシグナル配列をコードするORFの5’末端とアミノ酸残基50〜70の領域にあるORF4にあった。
VR−2332とLVウィルスの両者はPRRSの臨床上の症状を引き起こす異なった感染要因として同定されが、ウェンスバート等により報告されたとおり(上述)あってもほんの僅かしか免疫学的交差反応を示さなかった。それにもかかわらず、VR−2332の3’末端から誘導されたアミノ酸配列(配列番号3、5、7、9、11、および13)はアルテリビリダの特徴を有するゲノム構造を明らかにした、つまり、配列番号1の異なるリーディングフレームのコード領域が重なっていた。
ドット−マトリックス分析がVR−2332とLVウィルスとVR−2332のORF2〜7とLVウィルスの予測されるタンパク構造を比較するためにGCGソフトウェアーを使って行われた。当業者には理解できるとおり、ドット−マトリックス分析はそれぞれの部位で13の同一の残基を必要とする21アミノ酸のスライドする枠を使って通常の技術に従って行われた。この分析はVR−2332とLVの間でORFの全部が実質的に同一線上にある、つまり、それぞれのウィルスの構造は、アミノ酸が多岐にわたるのにかかわらず、非常に似ていることを示した。VR−2332とLVのORFのほとんど同一線上にある性質はアミノ酸残基の相違はゲノムの組み替えによって起こるのではないこともまた示した。表2はVR−2332とLVウィルスのそれぞれのORFに対応する様々な導き出されたアミノ酸残基の詳細な比較を示す。
これらの研究がVR−2332がアルテリビリダの他の構成員よりLVウィルスに非常に関係することを示したにもかかわらず、相同性は同じ病気を引き起こす2つのウィルスに予想されたよりずっと低かった、つまり、比較する配列の全体に生じた置換、欠損、および付加が起こった。予想された蛋白質は異なった分子量、等電点、および異なった予想されるグリコシル化部位を有した。(表2)
同一の病気を起こすと思われるウィルス間で予想されるより、アミノ酸相同性は、実質的には少ないが、得られた知見はウェンスバート等による血清学的研究から報告された目立った抗原性の多様性と一致する。これらの研究はなぜ野生のVR−2332とLVウィルス間の血清学的交差反応性が、仮にあっても僅かしか観察されないのかに関する説明を提供した。VR−2332とLVウィルス間の抗原性の違いは豚のウィルスの似ていないアミノ酸配列領域に対する免疫学的な反応性による。
実施例7
疎水性プロフィールの研究
疎水性プロフィールと百分率の塩基特性を含む予想される蛋白質の他の特徴が比較された。結果は2つのウィルス(LVとVR−2332)は実施例6のアミノ酸比較や免疫交差反応の報告により示されるより非常に似ている機能と構造を有することを確認した。
比較疎水性プロフィールはシンシナティー、オハイオのダニベンシステムズ社のEUGENEソフトウェアーパックを用いて作られ、VR−2332(配列番号2〜13)とLVウィルス(配列番号14〜26)の導き出されたアミノ酸残基配列に基づいた。これらのプロフィールはVR−2332とLVウィルスのORFが著しいアミノ酸残基配列の違いにもかかわらず構造的に対応することを示した。これらの結果は観察された生物学的類似性と一致し、VR−2332とLVウィルス単離物の間の異なった血清学的役割と対照をなす。
疎水性プロフィールは、蛋白質構造や蛋白質機能が大きな配列の差にかかわらず保存されていたことを示すためにVR−2332とLVウィルスのそれぞれに対応する各ORFを比較した。これらのプロフィールにより無電荷、および電荷を有するアミノ酸の高度に類似した領域を示し、膜を貫通するもの、しないもののどちらの領域の膜結合蛋白質の類似する機能を正確に予測するものある。このように、VR−2332蛋白質は構造及び機能においてLVウィルスの蛋白質と似ているが、ウィルス蛋白質の広範なアミノ酸の相違は血清学的交差反応の大きな差を説明する。
図3、3A、3B、および3CはVR−2332(配列番号13)とLV(配列番号26)のORF7のアミノ酸配列をならべたものと疎水性プロフィールを示す。このORFは、ゴッデニイ等、乳酸デヒドロゲナーゼ−促進ウィルス(LDV)カプシド蛋白質(Vpl))遺伝子地図の位置決め、177 バイロロジイイ 768−771(1990)(Godeny et al., Map location of actate dehydrogenase-elevating virus(LDV)capsid protein(Vp1)gene,177 Virol. 768-771(1990))とデブリエス等、馬アルテリティスウィルスの構造蛋白質、66 ジャーナル オブ バイロロジイ 6294−6303(1992)(de Vries et al., Structural proteins of equine arteritis virus, 66 J. Virol. 6294-6303(1992))により報告されたとおり、LDVとEAVでヌクレオカプシド蛋白質が位置するLVゲノムの3’末端に位置する。ORF7はPPRSウィルスのヌクレオカプシド蛋白質を最も形成している可能性が高い。該蛋白質はVR−2332とLVウィルス間で64%類似しており、VR−2332のORF7は5アミノ酸だけ小さかった。それにもかかわらず、ORF7によりコードされる両方の蛋白質のN末端部分は26〜28%塩基性で、疎水性の様子は殆ど同一である。該塩基性残基はRNAゲノムとの相関作用をたぶん容易にする。
図4、4A、4Bおよび4CはVR−2332(配列番号11)とLV(配列番号24)のORF6のアミノ酸配列のならべたものと疎水性プロフィールを示す。ORF6は、LVウィルスの相当する部分に最もよく似たVR−2332の蛋白質であり、明らかなアミノ末端シグナル配列をコードする唯一のORFであった。LVとVR−2332蛋白質は79%同一で、1つのグリコシル化部位を予期させる。(LVウィルスはVR−2332に見つかっていないもう1つのグリコシル化部位を有していた。)VR−2332,LVおよびEAVのORF6の疎水性プロフィールはすべてに膜貫通領域を示す蛋白質のN末端半分に3つの非常に疎水性が高い領域を示した。これらの領域はアルテリビリダのすべての膜の保存された特徴らしい。
図5、5A、5B、および5CはVR−2332(配列番号9)とLV(配列番号22)のORF5のアミノ酸配列のならべたものと疎水性プロフィールを示す。ORF5はその疎水性プロフィールと予測されるグリコシル化部位のためアルテリビリダ中のエンベロープ蛋白質をコードすると思われる。同様に、デブリエス等(上記参照)によれば、EAVのGLやORF5蛋白質はグリコシル化されている。VR−2332のORF5は3つの潜在的なグリコシル化部位を含んでおり、そのうち2つは、LVと共通である。それらの百分率の同一性(55%)はすべてのORFのうち最も低いにかかわらず、LVとVR−2332の疎水性プロフィールは非常に似ている。特に、アミノ末端の40アミノ酸のうち7残基だけが同じだが、疎水性プロフィールは事実上同一である。65残基と130残基の間の膜貫通領域と予想されるところはVR−2332でより明言されている。
図6、6A、6B、および6CはVR−2332(配列番号7)とLV(配列番号20)のORF4のアミノ酸配列のならべたものと疎水性プロフィールを示す。ORF6の後で、ORF4は基もよく保存されているORFである。カルボキシル末端もまた例外的に両方のウィルスで疎水性である。5つの予想される膜貫通領域はVR−2332とLVウィルスで非常に異なっている。
図7、7A、7B、および7CはVR−2332(配列番号7)とLV(配列番号18)のORF3のアミノ酸配列のならべたものと疎水性プロフィールを示す。ORF3はVR−2332とLVウィルス間で60%類似している。それにもかかわらず、ORF3は疎水性プロフィールによれば2つのウィルス間で最も似ていない蛋白質で、VR−2332では、カルボキシル末端の12アミノ酸が欠損している。これらの相違の結果として、対応するLVの蛋白質は残基240を中心とする非常に親水性な領域を有しているが、一方VR−2332蛋白質は、この領域で両親媒性らしい。ORF3の形式上の分子量はだいたい30kDで、しかしそれぞれのウィルスで、この蛋白質は7つの潜在的なグリコシル化部位を有しており、そのため見かけ上の大きさはずっと大きいであろう。
図8、8A、8B、および8CはVR−2332(配列番号5)とLV(配列番号16)のORF2のアミノ酸配列のならべたものと疎水性プロフィールを示す。ORF2はVR−2332の3’ORFのうち最も大きいことが決定され、256アミノ酸の発現物をコードしている。それは11.0という非常に塩基性な等電点を有しており、11.3の等電点をもつORF6だけがこれを上回っている。VR−2332とLVウィルス間のアミノ酸配列のこの違いはORF全体に分布しているが、疎水性プロフィールの基本的な効果はアミノ酸末端にあるようだった。
図9のVR−2332はVR−2332とLVウィルスのORF7に続く3’末端の非翻訳配列を並べた物を示す。この領域はVR−2332においては151ヌクレオチドと19から20塩基のポリAテールから成っていた。同様に、LVウィルスは115塩基の非コード領域を有していた。VR−2332の非コード領域の50から171塩基はLVの非コード領域の13から135塩基と強い相同性を共有していた。
実施例8
VR−2332のRNAの単離
感染した細胞の上清から得られるウィルスRNAはLVまたはPRRSの診断手段として選択的にVR−2332もLVウィルスヌクレオチドも増幅する逆転写とPCR増幅反応を使って、単離される。さらに、PCR増幅はワクチンに使用するヌクレオチドを量産するのに使われる。
診断における測定として、豚肺組織破砕物を好ましくは、PRRSに典型的である歯茎音異状疾患から組織サンプルの選抜により得られる;これらのサンプルを破砕し;適当な生理食塩水、例えば最小必須培地と、10%(w/v)組織濃度に成るよう破砕物を混合し;0.45、0.2および0.1マイクロの孔があいている一連のフィルターを通して破砕物混合液を濾過する。
濾過した破砕物は適当なセルライン、例えばサル腎臓細胞やMA−104、の細胞を感染させるための接種物として使われる。接種された培養物はおよそlog5からlog7の高いウィルス力価を持った培養物ストックが得られるまで、保温する。
5Mイソチオシアン酸グアニジニウム、50mMトリス−塩酸pH7.5、25mM EDTA、0.5w/v サルコシル、および1%(v/v)2−メルカプトエタノールを含む第一の溶液が調製される。この溶液を10mlに分けた物が100μlの2−メルカプトエタノールと混合される。ウィルスストック培養物の2mlがチューブ中で第一の溶液2mlと、0.4mlの2M酢酸ナトリウム、4mlフェノール、およびクロロホルム対イソアミルアルコールを24対1で混合したクロロホルム−イソアミルアルコール溶液1mlと同様に、混合される。それぞれの試薬を混合した後、ウィルスを含有した混合液は短時間ボルテックス(vortexed)にかけられる。最終混合液は30秒間ボルテックスにかけられ、15秒間氷の上で冷やされて、次いでJA−20ローターで8000rpm、20分間、4℃で遠心される。水相は遠心により一番上にきて分けられ、目的のRNAが含まれている。
水相は除去され新しいチューブに移される。滅菌前のジエチルピロカーボネイトが2%(v/v)で含まれているおよび4mlの滅菌水が、4mlのフェノール、1.6mlの24:1のクロロホルム−イソアミルアルコール混合液と同様に、この第二のチューブに加えられる。これらの成分はボルテックスされ、15分間氷の上で冷やされて、次いでJA−20ローターで8000rpm、20分間、4℃で遠心され、水相が再び抽出される。得られた水相抽出液は等量のイソプロパノールと混ぜて、氷の上で1時間冷やしてRNAを沈澱させる。
沈澱したRNAはJA−20ローターで8000rpm、20分間、4℃で遠心により沈澱された。イソプロパノールが除去され、見えないRNA沈澱物が5Mイソチオシアン酸グアニジニウム、50mMトリス−塩酸 pH7.5、25mM EDTA、0.5%サルコシル、および1% 2−メルカプタノール、および0.1% 2−メルカプトエタノールを含む溶液0.3mlに溶解される。溶解した沈殿物を含む溶液は1.5mlマイクロフュージチューブに移されて、RNAは再び0.3mlのイソプロパノールで、氷上で1時間で、沈澱される。冷やした溶液は10分間、マイクロフュージチューブ中で、15,000rpmで遠心され、その後にイソプロパノールを除去する。
得られた沈殿物は0.2%(v/v)ジエチルピロカーボネイトを含む25%の水と混ぜた75%のエタノールを含む溶液、およそ0.5mlで洗浄される。洗浄後、混合物をボルテックスにかけ、5〜10分遠心する。アルコールは除去され、RNA沈澱は3分間吸引乾燥する。沈殿物は0.2%(v/v)ジエチルピロカーボネイトを含有する水50mlで溶解される。
実施例9
cDNAを形成するためのRNAの逆転写
RNAと0.2%のジエチルピロカーボネイト水を含有する実施例8で得られた溶液は、次いでcDNAの相補断片を得るためにRNAの逆転写に供される。この方法は、パーキンエルマー社のRT−PCRキットのような市販されているキットを用いて行うのが好ましい。キットは、該キットの試薬の適切な使用が記載されている業者の指示書に従って使用する。
実施例によれば、主混合液は、4μl 塩化マグネシウム、2μl 10倍濃縮バッファー、2μl dGTP、2μl dATP、2μl dCTP、2μl TTP、1μl RNアーゼ阻害剤、および1μl逆転写酵素を混合することによってRT−PCRキットと名付けられた試薬から調製される。3μl等量のRNAと0.2%ジエチルピロカーボネイト水の混合液を注意してマイクロフュージチューブに入れ、必要ならチューブ内の全RNA量が1μg以上にならないように等量の0.2%ジエチルピロカーボネイト水で希釈する。キットはランダム6マーの混合液を含有し、この溶液の1μlがRNAとジエチルピロカーボネイト水に添加される。この溶液は、次いで任意に65〜70℃で5〜10分間熱して、氷上に静置しても良い。主混合液16μlがサンプルに添加され、室温で10分間保温される。それから、以下の条件でチューブをサーマルサイクラーで保温する:42℃15分間、99℃5分間、および5℃5分間。チューブをサーマルサイクラーからはずし、4℃で保存する。この逆転写酵素反応の結果、cDNAが得られ、それは続いてPCR増幅が行われる。
実施例10
cDNAの選択的PCR増幅
PCR増幅の準備において、以下の試薬の主混合液が用意される;塩化マグネシウム1μl、10倍濃縮バッファー2μl、5’プライマー0.5μl、3’プライマー0.5μl、滅菌水15.875μl、およびTaqポリメラーゼ0.125μl。5’および3’プライマーはおよそ10μMの濃度であり、好ましくは以下の表3に挙げられた配列に基づいた合成ヌクレオチドを含む。5μl等量の実施例9の逆転写酵素反応溶液が20μlの主混合液に添加される。その結果得られる主混合液と逆転写酵素cDNAを組み合わせた物25μlとミネラル油100μlとチューブの中にいれる。チューブはサーマルサイクラーで以下の条件下、保温される:93℃4分を1サイクル、55℃30秒、72℃45秒で、93℃45秒を30サイクル行い;55℃30秒、続いて72℃10分を1サイクル。これら32サイクルの後、溶液をサーマルサイクラーから回収するまで4℃で保存する。得られた溶液はPCRで増幅されたcDNAを含んでおり、アガロースゲルで分析される。
アガロースゲルはTAEバッファーと混合された1.5%寒天、つまり100mlのバッファーに対して1.5gの寒天、を含んでいることが好ましい。混合液は電磁波で溶解され、10mg/mlエチジウムブロマイド溶液1μlがゲル100mlに対して加えられる。混合液を型にそそぎ込み30〜45分固定しておく。PCR反応溶液の5μlがチューブに加えられ、UV反応性の泳動染色液(running dye)が添加される。さらにギブコ−BRL社の100塩基ラダーのような適当な分子量マーカー1〜2μlも添加される。ゲルは電気泳動漕に置かれ、泳動層は通常のTAE泳動バッファーで満たされる。サンプルが搭載され、80ボルトで1時間泳動が実施される。電気泳動されたPCR産物はUV照射下で見ることができる。アガロースゲル電気泳動後、UV照射下で見ることができるPCRで作られた断片は、ウィルスヌクレオチド産物の同一性をはっきり確認するためにDNA配列決定が行われる。
実施例11
選択的PCR増幅またはハイブリダイゼイションのためのオリゴヌクレオチド設計
実施例10のPCR増幅に使われる5’および3’プライマーは、VR−2332ゲノムの関心のある領域を複製する合成ヌクレオチド配列として、好ましくは、通常の方法に従うか、商業的な注文により構築される。プライマーの設計は、好ましくは、ウィルス蛋白質、選択されたORF、又は、最も好ましくは蛋白質断片を表すアミノ酸配列をコードする領域の全アミノ酸コード配列として、適当なプライマーを選択して含んでいる。
好ましいオリゴヌクレオチドはVR−2332のコード領域の小さな部分を特異的に標的とするが、LV由来ヌクレオチドとはアニールできないものを含むよう選択される。これらの好ましいオリゴヌクレオチドはワクチンと予防接種の方法に用いられるプライマーにより選択されるcDNAの長い配列を複製するPCR増幅技術のプライマーとして用いられる。同様にオリゴヌクレオチドも続いて行うハイプリダイゼーション、クローニング、蛋白質断片の宿主発現、および続いてワクチンに用いるヌクレオチド産物のプローブとしても用いられる。
これらの末端配列はウィルス蛋白質の通常成熟型には存在しないから、ワクチンを生産する際に用いるために選ばれる発現された蛋白質断片のcDNAコード領域の好ましい実施例は翻訳されたアミノ酸末端疎水性配列を除かれたものを含む。膜貫通配列は免疫反応を誘導しないだろうし、この除去により組み替え遺伝子技術により免疫学的に反応性を有する蛋白質の生産が簡単になるので、選ばれたcDNAコード領域は膜を貫通すると推定される領域を除いた蛋白質断片もコードする。
以下の表3に挙げられた配列は添付する配列表で位置を参照してプライマーを例示する。すべての配列は5’から3’方向に記載する。実施例をとおして、プライマーAは配列5’−GCTGTTAAACAGGGAGTGG−3’を表す。プライマーA’は配列5’−GTCACCTATTCAATTAGGG−3’(配列番号1の3271−3289の位置)の逆の相補鎖、つまり逆の順の相補的なヌクレオチドが271−3289の位置で配列に置き換わっている配列5’−CCCTAATTGAATAGGTGAC−3’である。
表3のプライマーAとA’はLV単離物を含む他のウィルスのヌクレオチドの単離物からVR−2332のヌクレオチドを見分けてVR−2332 ORF7蛋白質コードヌクレオチドを選択的に増幅する。同様に、プライマーBとB’は他のウィルスのヌクレオチドの単離物からVR−2332のヌクレオチドを見分けてVR−2332 ORF6蛋白質コードヌクレオチドを選択的に増幅する。一方、プライマーCとC’はVR−2332のORF6を増幅せずに、LVウィルス ORF6コード領域を選択的に増幅する。プライマーDとD’はVR−2332のORF7を増幅せずに、LV ORF7を選択的に増幅する。
表3の好ましいオリゴヌクレオチドはcDNAのPCR増幅や通常のハイブリダイゼイション反応を試みることによって特定のPRRS原因株やウィルスの診断に使用される。実施例を通して、PRRSの症状が病気の動物に臨床的に確認され、レリスタッドウィルス(例えばプライマーC、C’やD、D’)の増幅に特異的なプライマーがPCR反応でcDNA増幅を生産できなかったら、そのときはLVのcDNAがないことはVR−2332の感染の診断と一致している。一方、VR−2332のプライマーA,A’やB,B’がPCRで増幅できないことはLVの感染診断と一致している。
ウィルスcDNAの存在が表3のこれらプライマーやプローブに対するハイブリダイゼーションにより確認されたときは、ハイブリダイゼーションはニトロセルロースやナイロン膜のような固体の支持体に固定されたcDNAやRNAのどちらかの含まれた溶液中でおこる。回収されたハイブリダイズした産物は通常の放射線活性や放射線を使用しない技術で検出され、ウィルス核酸配列の存在を示す。当業者は診断技術の必須項目にドットブロットハイブリダイゼーション、スロットブロットハイブリダイゼイション、溶液ハイブリダイゼーション、サザンブロット、ノーザンブロット、RNaseプロテクション分析を含むことを理解するだろう。
実施例12
組み替え技術に由来するウィルス蛋白質の生産のための宿主発現系におけるVR−2332蛋白質コード配列のクローニング
VR−2332ヌクレオチド配列(配列番号1、2、4、6、8、10、および12)の選択された部分は1つのオープンリーディングフレーム、または複数のオープンリーディングフレームを宿主生物内での蛋白質発現のために設計されている市販されているプラスミド中で増やすために用いられる。真核あるいは原核細胞中でウィルス蛋白質の発現に使用される市販されている、または自分で設計した系の例は以下のとおりである。
サンディエゴ、カリホルニアのパーミンゲン社から市販されている真核バキュロウィルス系は、ベクターpAcGP67Bを含んでおり、プライマーCおよびC’に使用するのが好ましい。表3で示したとおり、プライマーCおよびC’はそれぞれこれらのプライマーをpAcGP67Bベクターと結合させる際に使用するための合成により結合されたヌクレオチドにより形成されたBamHIとEcoRI制限酵素部位を含んで提供されても良い。この方法によって、得られた増幅されたcDNAは実質的にVR−2332のORF7の全体のコード領域を取り入れて、最も3’よりもEcoRIサイトと同様に最も5’末端よりのBamHIサイトも有する。これらの制限酵素部位はVR−2332のコード領域をVR−2332のORF7蛋白質の真核細胞宿主発現ために適当なpAcGP67Bのプロモーターや終結配列の制御下に置くために使われる。
ウィルス蛋白質の原核細胞宿主発現は多様な市販されている宿主発現系において行われる。ウィスコンシン、マゾソンのノバゲン社のPETシステムが原核生物での発現には好ましく、ベクターpET25bを含む。PETシステムはプライマーDとD’を使用するのに好ましく、VR−2332のORF7コード領域を適当なプロモーターや終了配列の制御下に置いて使うためにそれぞれNdelとHindIIIの制限酵素部位を有して提供されても良い。
配列番号12と13のVR−2332のORF7に相当する蛋白質はORF7の成熟蛋白質と推定されるものに相当する選択された蛋白質のコード配列を増幅することにより発現される。この増幅方法は実施例8、9および10に概説されるRT−PCR増幅方法に続く。PCRプライマーは好ましくはpET25bベクターにクローニングするためにNdelおよびHindIIIを含むように設計される。これらの部位により結果としてpelBリーダーやHisTag配列のない蛋白質ができ、これにより他の発現系を任意に選ぶこともできる。この成熟蛋白質はアミノ酸番号20または30のどちらかをコードするヌクレオチド配列で始めることによりシグナルペプチドなしで発現される。PCR断片はpET25bベクター増幅配列中にクローニングし、宿主発現系で使用する。
ORF7以外の蛋白質コード領域を選ぶ際に、特定の蛋白質コード領域を欠損させたり、短くしたりする方が有利である、例えば、ORF4由来の膜を貫通するC−末端17アミノ酸の欠失は該蛋白質の生物学的に意味のある部分に対する抗体応答に直接結びつくであろう。
組み替えクローンはイソプロピル−β−D−チオガラクトピラノシド(IPTG)による誘導のためにBL21細胞に導入される。誘導して適当な保温の後、発現された組み替えバイオ蛋白質は誘導を行った細胞と誘導を行わなかった細胞から得た溶解物を比較することによってゲル上で検出される。インクルージョンボディ調製物は可溶性ORF4蛋白質以外の蛋白質を放出させる濃度で尿素やグアニジンで洗浄される。沈殿物は尿素で再溶解され、酸化および還元グルタチオン中で巻き戻(リホールディング)される。得られた可溶性の、透析された蛋白質はさらにイオン交換およびサイズエクスクルージョンクロマトグラフィーにより精製される。
実施例13
組み替えウィルス蛋白質の注入による動物の免疫反応の誘導
実施例12で生産されたとおり、バクテリアや真核生物発現系から得られた精製蛋白質はPRRSウィルスのVR−2332株に対して動物を免疫するに充分な免疫応答を誘導するように、通常の免疫化経路により動物に注入される。当該蛋白質単独でも、通常の補助剤と組み合わせてもよく、筋肉注射、皮膚注射、皮下注射、その他の方法により投与する。
もしくは、生体分子工学によるVR−2332配列に相当する蛋白質を発現するバクテリアやウィルスは動物にインビボでVR−2332蛋白質の発現体を注射することにより投与される。この組み替え蛋白質のインビボ発現はVR−2332ウィルスに対する免疫応答も誘導するだろう。
実施例14
動物における直接的な免疫応答を誘導するVR−2332 DNAの使用
ORFやORFの断片部分をコードするVR−2332に由来するオリゴヌクレオチド断片は動物における直接的な免疫応答を起こすのに用いられる。この方法はおおむねオマー等、259、サイエンス、1745−1749(1993)(Omer et al., 259 Science 1745-1749(1993))に記載された方法に従う。DNAは好ましくはバクテリア内で増殖するプラスミド構造体に含まれ、精製され、筋肉注射、皮膚注射、又は他の経路で動物体内に注入される。注射された動物は典型的にはクローニングされた蛋白質を発現し、発現した蛋白質に対する免疫応答を生じる。
参考文献
以下の参考文献はPRRSウィルスに関し、これをもって本明細書の一部となす。
ベンフィールド等、(1992)、ジャーナル オブ ベトリナリー ダイアグノシス インベスティゲイション 4、127〜133頁(Benfield, D. A., Nelson, E., Collins, J. E., Harris. L., Goyal, S. M., Robison,D., Christianson, W. T., Morrison, R. B., Gorcyca, D. E., and Chladek, D. W.(1992). Characterization of swine infertility and respiratory syndrome(SIRS)virus(isolate ATCC VR-2332), J. Vet. Diagn. Invest. 4, 127-133.)
コムジンスキー等、(1987)、アナリティカル バイオケミストリー 162、156〜159頁(Chomczynski, P. and Sacchi, N.(1987). Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform ectraction. Anal. Biochem. 162, 156-159.)
コリンズ等、(1992)、ジャーナル オブ ベトリナリー ダイアグノシス インベスティゲイション 4、117〜126頁(Collins, J. E., Benfield, D. A., Christianson, W. T., Harris, L., Hennings, J. C., Shaw, D. P., Goyal, S. M., McCullough, S., Morrison, R. B., Joo, H. S., Gorcyca, D. E., and Chladek, D. W.(1992). Isolation of swine infertility and respiratory syndrome virus(isolate ATCC VR-2332)in North America and experimental reproduction of disease in gnotobiotic pigs, J. Vet. Diagn. Invest. 4, 117-126.)
コンゼルマン等、(1993)、バイロロジイ 193、326〜339頁(Conzelmann, K., Visser, N., Van Woensel, P. and Thiel, H.(1993). Molecular characterization of porcine reproductive and respiratory syndrome virus, a member of the arterivirus group. Virology 193, 329-339.)
デンブー等、(1991)、ジャーナル オブ バイロロジイ 65、2910〜2920頁(den Boon, J. A., Snijder, E. J., Chirnside, E. D., de Vries, A. A. F., Horzinek, M. C., and Spann, W. J. M.(1991). Equine arteritis virus is not a togavirus but belongs to the coronavirus superfamily. J. Virol. 65, 2910-2920.)
デブリエス等、(1992)、ジャーナル オブ バイロロジイ 66、6294−6303頁(de Vries, A. A. F., Chirnside, E. D., Horzinek, M. C., and Rottier, P. J. M.(1992). Structural proteins of equine arteritis virus. J. Virol. 66, 6294-6303.)
ゴッデニー等、(1990)、バイロロジイ 177、768〜771頁(Godeny, E. K., Speicher, D. W., and Brinton, M. A.(1990). Map location of lactate dehydrogenase-elevating virus(LDV)capsid protein(Vp1)gene. Virol. 177, 768-771.)
ゴッデニー等、(1993)、第9回ウィルス学国際会議議事録 22頁(Godeny, E. K., Zeng, L., Smith, S. L., and Brinton, M. A.(1993). In Proceedings of the 9th International Congress of Virology, p22, August 8-13, Glasgow, Scotland.)
グレイベル等、プロシーディング オブ ソサイティ オブ エクスプレシング バイオロジカル メヂシン、181、112〜119頁(Gravell, M., W. T. London, M. E. Leon, A. E. Palmer and R. S. Hamilton. Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 181, 112-119.)
ヒル、(1990)、不可解な豚病委員会会議議事録 29〜30頁(Hill, H.(1990). Overview and History of Mystery Swine Disease(Swine Infertility and Respiratory syndrome). In : Proceedings of the Mystery Swine Disease Committee Meeting, October 6, Denver CO, pp.29-30. Livestock Conservation Institute, Madison, WI.)
クー等、(1991)、ジャーナル オブ バイロロジイ 65、5118〜5123頁(Kuo, L., Harty, J. T., Erickson, L., Palmer, G. A., and Plagemann, P. G. W.(1991). A nested set of eight mRNAs is formed in macrophages infected with lactate dehydrogenase-elevating virous. J. Virol. 65,5118-5123.)
ニューレンバーク等、(1993)、バイロロジイ 192、62〜72頁(Meulenberg, J. J. M., Hulst, M. M., de Veijer, E. J., Moone, P. L. J. M., den Besten, A., de Kluyver, E. P., Wensvoort, G., and Moormann, R. J. M.(1993). Lelystad virus, the causative agent of porcine epidemic abortion and respiratory syndrome(PEARS), is related to LDV and EAV. Virology 192, 62-72.)
パットン等、(1991)、ベット レック 128、617頁(Paton, D. J., Brown, I. H., Edwards., S. and Wensvoort, G.(1991). Blue ear disease of pigs. Vet Rec. 128, 617.)
プラグマン等、(1992)、アドバンテージ オブ バイロロジカルリサーチ 41、99〜192頁(Plagemann, P. G. W. and Moennig. V.(1992). Lactate dehydrogenase-elevating virus, equine arteritis virus and simian hemorrhagic fever virus : a new group of positive-strand RNA viruses. Adv. Vir. Res. 41, 99-192.)
ポール等、(1991)、ベット キュー 13、137〜143頁(Pol, J. M. A., Van Dijk, J. E., Wensvoort, G., and Terpstra, C.(1991). Pathological, ultrastructural, and immunohistochemical changes caused by Lelystad virus in experimentally induced infections of mystery swine disease(synonym : porcine epidemic abortion and respiratory syndrome(PEARS)). Vet. Q. 13, 137-143.)
スパン等、(1988)、ジャーナル オブ ジェネラル バイロロジイ 69、2939〜2952頁(Spaan, W. J. M., Cavanagh, D. and Horzinek, M. C.(1988). Coronaviruses : structure and genome erxpression. J. Gen. Virol. 69, 2939-2952.)
ウェンスバート等、(1991)、ベット キュー 13、121〜130頁(Wensvoort, G., Terpstra, C., Pol, J. M. A., Ter Laak, E. A., Bloemraad, M., De Kluyver, E. P., Kragten, C., Van Buiten, L., Den Besten, A., Wagenaar, F., Broekhuijsen, J. M., Moone, P. L. J. M., Zetstra, T., De Boer, E. A., Tibben, H. J., De Jong, M. F., Van't Veld, P., Groenland, G. J. R., Van Gennep, J. A., Voets, M. T., Verheijeden, J. H. M., and Braamskamp, J.(1991). Mystery swine disease in the Netherlands : the isolation of Lelystad virus. Vet. Q. 13, 121-130.)
ウェンスバート等、(1992a)、ベット マイクロ 33、185〜193頁(Wensvoort, G., de Kluyver, E. P., Pol, J. M. A., Wagenaar, F., Moormann, R. J. M., Hulst. M. M. Bloemraad, R., den Besten, A., Zetstra, T. and Terpstra, C.(1992a). Lelystad virus, the cause of porcine epidemic abortion and respiratory syndrome: a review of mystery swine disease research at Lelystad. Vet. Micro. 33, 185-193.)
ウェンスバート等、(1992b)、ジャーナル オブ ベット ダイアグノシス インベスティゲイション 4、134〜138頁(Wensvoort, G., de kluyver, E. P., Lujtze, E. A., den Besten, A., Harris, L., Collins, J. E., Christianson, W. T. and Chladek, D.(1992b). Antigenic comparison of Lelystad virus and swine infertility and respiratory syndrome(SIRS)virus. J. Vet. Diagn. Invest. 4, 134-138.)
配列表
(1)一般的な情報
(i)出願人:マートウ,ミッシェル ピー.
(ii)発明の名称:VR−2332ウィルスヌクレオチド配列および使用方法
(iii)配列の数:26
(iv)連絡先:
(A)受信者:ジョン エム.コリンズ
(B)通り:1101 ウォールナッツ,スウィート 1400
(C)市:カンザスシティ
(D)州:ミズーリ
(E)国:アメリカ合衆国
(F)郵便番号:64106
(v)コンピューターで読みとり可能な形式:
(A)媒体の型:フロッピーデスク
(B)コンピューター:IBM PC 互換性
(C)操作形式:PC−DOS/MS−DOS
(D)ソフトウェアー:パテントイン配布#1.0、バージョン#1.25
(vi)現在の出願日
(A)出願番号:
(B)出願日:
(C)分類:
(viii)弁理士/代理人
(A)コリンズ,ジョン エム.
(B)電話:(816)474−9050
(C)テレファック:(816)474−9057
(2)配列番号1の情報
(i)配列の特徴:
(A)長さ:3358塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:二本鎖
(D)トポロジー:不明
(ii)配列の種類:cDNA
(iii)ハイポセティカル:No
(iv)アンチセンス:No
(v)起源:
(A)生物名:アルテリビリダ(Alteriviridae)(未分類)
(B)株名:VR−2332
(ix)配列の特徴
(A)特徴を表す記号:misc feature
(B)存在位置:1..768
(C)特徴を決定した方法:E
(D)他の情報:/証拠=実験/標準名=VR−2332 ORF2
(ix)配列の特徴
(A)特徴を表す記号:misc feature
(B)存在位置:624..1385
(D)他の情報:/標準名=VR−2332 ORF3
(ix)配列の特徴
(A)特徴を表す記号:misc feature
(B)存在位置:1169..1701
(D)他の情報:/標準名=VR−2332 ORF4
(ix)配列の特徴
(A)特徴を表す記号:misc feature
(B)存在位置:1716..2315
(D)他の情報:/標準名=VR−2332 ORF5
(ix)配列の特徴
(A)特徴を表す記号:misc feature
(B)存在位置:2303..2824
(D)他の情報:/標準名=VR−2332 ORF6
(ix)配列の特徴
(A)特徴を表す記号:misc feature
(B)存在位置:2817..3185
(D)他の情報:/標準名=VR−2332 ORF7
(xi)配列の記載:配列番号1
(2)配列番号2の情報
(i)配列の特徴:
(A)長さ:768塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:二本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:cDNA
(ix)配列の特徴
(A)特徴を表す記号:CDS
(B)存在位置:1..768
(C)特徴を決定した方法:E
(D)他の情報:/証拠=実験/標準名=VR−2332 ORF2
(xi)配列の記載:配列番号2
(2)配列番号3の情報
(i)配列の特徴:
(A)長さ:256アミノ酸
(B)型:アミノ酸
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:蛋白質
(xi)配列の記載:配列番号3
(2)配列番号4の情報
(i)配列の特徴:
(A)長さ:762塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:二本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:cDNA
(ix)配列の特徴
(A)特徴を表す記号:CDS
(B)存在位置:1..762
(C)特徴を決定した方法:E
(D)他の情報:/証拠=実験/標準名=VR−2332 ORF3
(xi)配列の記載:配列番号4
(2)配列番号5の情報
(i)配列の特徴:
(A)長さ:254アミノ酸
(B)型:アミノ酸
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:蛋白質
(xi)配列の記載:配列番号5
(2)配列番号6の情報
(i)配列の特徴:
(A)長さ:534塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:二本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:cDNA
(ix)配列の特徴
(A)特徴を表す記号:CDS
(B)存在位置:1..534
(C)特徴を決定した方法:E
(D)他の情報:/証拠=実験/標準名=VR−2332 ORF4
(xi)配列の記載:配列番号6
(2)配列番号7の情報
(i)配列の特徴:
(A)長さ:178アミノ酸
(B)型:アミノ酸
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:蛋白質
(xi)配列の記載:配列番号7
(2)配列番号8の情報
(i)配列の特徴:
(A)長さ:600塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:二本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:cDNA
(ix)配列の特徴
(A)特徴を表す記号:CDS
(B)存在位置:1..600
(C)特徴を決定した方法:E
(D)他の情報:/証拠=実験/標準名=VR−2332 ORF5
(xi)配列の記載:配列番号8
(2)配列番号9の情報
(i)配列の特徴:
(A)長さ:200アミノ酸
(B)型:アミノ酸
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:蛋白質
(xi)配列の記載:配列番号9
(2)配列番号10の情報
(i)配列の特徴:
(A)長さ:522塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:二本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:cDNA
(ix)配列の特徴
(A)特徴を表す記号:CDS
(B)存在位置:1..522
(C)特徴を決定した方法:E
(D)他の情報:/証拠=実験/標準名=VR−2332 ORF6
(xi)配列の記載:配列番号10
(2)配列番号11の情報
(i)配列の特徴:
(A)長さ:174アミノ酸
(B)型:アミノ酸
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:蛋白質
(xi)配列の記載:配列番号11
(2)配列番号12の情報
(i)配列の特徴:
(A)長さ:369塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:二本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:cDNA
(ix)配列の特徴
(A)特徴を表す記号:CDS
(B)存在位置:1..369
(C)特徴を決定した方法:E
(D)他の情報:/証拠=実験/標準名=VR−2332 ORF7
(xi)配列の記載:配列番号12
(2)配列番号13の情報
(i)配列の特徴:
(A)長さ:123アミノ酸
(B)型:アミノ酸
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:蛋白質
(xi)配列の記載:配列番号13
(2)配列番号14の情報
(i)配列の特徴:
(A)長さ:15101塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:二本鎖
(D)トポロジー:不明
(ii)配列の種類:cDNA
(iii)ハイポセティカル:No
(iv)アンチセンス:No
(v)起源:
(A)生物名:アルテリビリダ(Alteriviridae)
(B)株名:VR−2332
(ix)配列の特徴
(A)特徴を表す記号:misc feature
(B)存在位置:7384..11775
(C)特徴を決定した方法:E
(D)他の情報:/証拠=実験/ラベル=ORF1b/引例=([1])
(ix)配列の特徴
(A)特徴を表す記号:misc feature
(B)存在位置:11786..12535
(D)他の情報:/標準名=LV ORF2/引例=([1])
(ix)配列の特徴
(A)特徴を表す記号:misc feature
(B)存在位置:212..7402
(D)他の情報:/標準名=LV ORF1a/引例=([1])
(ix)配列の特徴
(A)特徴を表す記号:misc feature
(B)存在位置:12394..13191
(D)他の情報:/標準名=LV ORF3/引例=([1])
(ix)配列の特徴
(A)特徴を表す記号:misc feature
(B)存在位置:12936..13487
(D)他の情報:/標準名=LV ORF4/引例=([1])
(ix)配列の特徴
(A)特徴を表す記号:misc feature
(B)存在位置:13484..14089
(D)他の情報:/標準名=LV ORF5/引例=([1])
(ix)配列の特徴
(A)特徴を表す記号:misc feature
(B)存在位置:14077..14598
(D)他の情報:/標準名=LV ORF6/引例=([1])
(ix)配列の特徴
(A)特徴を表す記号:misc feature
(B)存在位置:14588..14974
(D)他の情報:/標準名=LV ORF7/引例=([1])
(x)刊行物情報
(A)著者:ニューレンバーク,ジェー.ジェー.エム.
ホルスト,エム.エム.
デ ベイジャー、イー.ジェー.
ムーネン,ピー.エル.
デン ベステン,エー.
デ クルイバー,イー.ピー.
ウェンスバート,ジー.
ムアマン,アール.ジェー.
(B)題:レリスタッド ウィルス、豚流行性流産呼吸症候群(PEARS)の原因因子はLDVとEAVに関係する。
(C)雑誌:バイロロジイ
(D)巻:192
(F)ページ:62−72
(G)日付:1993
(K)配列番号14の意味のある残基:1〜15101
(xi)配列の記載:配列番号14
(2)配列番号15の情報
(i)配列の特徴:
(A)長さ:747塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:二本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:cDNA
(ix)配列の特徴
(A)特徴を表す記号:CDS
(B)存在位置:1..747
(D)他の情報:/標準名=LV ORF2
(xi)配列の記載:配列番号15
(2)配列番号16の情報
(i)配列の特徴:
(A)長さ:249アミノ酸
(B)型:アミノ酸
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:蛋白質
(xi)配列の記載:配列番号16
(2)配列番号17の情報
(i)配列の特徴:
(A)長さ:795塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:二本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:cDNA
(ix)配列の特徴
(A)特徴を表す記号:CDS
(B)存在位置:1..795
(D)他の情報:/標準名=LV ORF3
(xi)配列の記載:配列番号17
(2)配列番号18の情報
(i)配列の特徴:
(A)長さ:265アミノ酸
(B)型:アミノ酸
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:蛋白質
(xi)配列の記載:配列番号18
(2)配列番号19の情報
(i)配列の特徴:
(A)長さ:549塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:二本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:cDNA
(ix)配列の特徴
(A)特徴を表す記号:CDS
(B)存在位置:1..549
(D)他の情報:/標準名=LV ORF4
(xi)配列の記載:配列番号19
(2)配列番号20の情報
(i)配列の特徴:
(A)長さ:183アミノ酸
(B)型:アミノ酸
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:蛋白質
(xi)配列の記載:配列番号20
(2)配列番号21の情報
(i)配列の特徴:
(A)長さ:603塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:二本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:cDNA
(ix)配列の特徴
(A)特徴を表す記号:CDS
(B)存在位置:1..603
(D)他の情報:/標準名=LV ORF5
(xi)配列の記載:配列番号21
(2)配列番号22の情報
(i)配列の特徴:
(A)長さ:201アミノ酸
(B)型:アミノ酸
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:蛋白質
(xi)配列の記載:配列番号22
(2)配列番号23の情報
(i)配列の特徴:
(A)長さ:519塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:二本鎖
(D)トポロジー:不明
(ii)配列の種類:cDNA
(ix)配列の特徴
(A)特徴を表す記号:CDS
(B)存在位置:1..519
(D)他の情報:/標準名=LV ORF6
(xi)配列の記載:配列番号23
(2)配列番号24の情報
(i)配列の特徴:
(A)長さ:173アミノ酸
(B)型:アミノ酸
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:蛋白質
(xi)配列の記載:配列番号24
(2)配列番号25の情報
(i)配列の特徴:
(A)長さ:384塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:二本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:cDNA
(ix)配列の特徴
(A)特徴を表す記号:CDS
(B)存在位置:1..384
(D)他の情報:/標準名=LV ORF7
(xi)配列の記載:配列番号25
(2)配列番号26の情報
(i)配列の特徴:
(A)長さ:128アミノ酸
(B)型:アミノ酸
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:蛋白質
(xi)配列の記載:配列番号26
Claims (12)
- PRRSウイルスのゲノム由来であり、配列番号3,5,7,9,11および13からなる群から選択されるアミノ酸配列からなる、免疫応答をしうる(免疫原性の)蛋白質をコードする単離されたcDNA。
- 前記蛋白質が配列番号7のアミノ酸配列からなる請求項1に記載のcDNA。
- 前記cDNAが、ファージラムダベクターに含まれている請求項1に記載のcDNA。
- 前記cDNAが、宿主細胞に入っている請求項1に記載のcDNA。
- 前記宿主細胞が原核細胞である請求項4に記載のcDNA。
- 配列番号1,2,4,6,8,10および12からなる群から選択されるDNA配列からなる配列であるPRRSウイルス−特異的cDNA。
- 前記cDNAが、プラスミド中に含まれる請求項6に記載のcDNA。
- 宿主細胞に入っている請求項6に記載のcDNA。
- 前記宿主細胞が原核細胞である請求項8に記載のcDNA。
- 配列番号3、5、7、9、11および13からなる群から選択されるアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするPRRSウイルス−特異的cDNAによりコードされる免疫原性蛋白質を含有するワクチン。
- 前記免疫原性蛋白質が配列番号7のアミノ酸配列からなる請求項10に記載のワクチン。
- 豚に請求項10に記載のワクチンを投与する工程を含む、豚繁殖呼吸症候群(PRRS)に対して豚を免疫する方法。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US28794194A | 1994-08-05 | 1994-08-05 | |
US08/287,941 | 1994-08-05 | ||
PCT/US1995/009927 WO1996004010A1 (en) | 1994-08-05 | 1995-08-04 | Vr-2332 viral nucleotide sequence and methods of use |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH10504191A JPH10504191A (ja) | 1998-04-28 |
JP3748887B2 true JP3748887B2 (ja) | 2006-02-22 |
Family
ID=23105037
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP50679096A Expired - Lifetime JP3748887B2 (ja) | 1994-08-05 | 1995-08-04 | Vr−2332 ウィルスヌクレオチド配列および使用方法 |
Country Status (11)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US5998601A (ja) |
EP (2) | EP1704869A1 (ja) |
JP (1) | JP3748887B2 (ja) |
AT (1) | ATE329616T1 (ja) |
CA (1) | CA2196555C (ja) |
DE (1) | DE69535061T2 (ja) |
DK (1) | DK0783321T3 (ja) |
ES (1) | ES2262142T3 (ja) |
MX (1) | MX9700817A (ja) |
PT (1) | PT783321E (ja) |
WO (1) | WO1996004010A1 (ja) |
Families Citing this family (40)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DE69201441T3 (de) | 1991-06-06 | 2008-12-04 | Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh | Erreger der mysteriösen schweinekrankheit,impfstoff-zusammensetzungen und diagnose kits. |
US5695766A (en) * | 1992-10-30 | 1997-12-09 | Iowa State University Research Foundation | Highly virulent porcine reproductive and respiratory syndrome viruses which produce lesions in pigs and vaccines that protect pigs against said syndrome |
US6592873B1 (en) | 1992-10-30 | 2003-07-15 | Iowa State University Research Foundation, Inc. | Polynucleic acids isolated from a porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) and proteins encoded by the polynucleic acids |
US6773908B1 (en) | 1992-10-30 | 2004-08-10 | Iowa State University Research Foundation, Inc. | Proteins encoded by polynucleic acids of porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) |
US6380376B1 (en) | 1992-10-30 | 2002-04-30 | Iowa State University Research Foundation | Proteins encoded by polynucleic acids of porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) |
US20040224327A1 (en) * | 1996-10-30 | 2004-11-11 | Meulenberg Johanna Jacoba Maria | Infectious clones of RNA viruses and vaccines and diagnostic assays derived thereof |
EP0839912A1 (en) * | 1996-10-30 | 1998-05-06 | Instituut Voor Dierhouderij En Diergezondheid (Id-Dlo) | Infectious clones of RNA viruses and vaccines and diagnostic assays derived thereof |
CA2703181C (en) * | 1997-05-06 | 2016-06-28 | Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh | Prrsv antigenic sites identifying peptide sequences of prrs virus for use in vaccines or diagnostic assays |
AU7960598A (en) * | 1997-06-05 | 1998-12-21 | Origen, Inc. | Recombinant porcine reproductive and respiratory syndrome virus (prrsv) for use as a vaccine |
DE19836559A1 (de) * | 1998-08-12 | 2000-03-23 | Antigen Gmbh | Gefäß zur Entnahme von Blut |
CA2440933A1 (en) * | 1998-12-22 | 2000-06-22 | Pfizer Products Inc. | An infectious cdna clone of north american porcine reproductive and respiratory syndrome (prrs) virus and uses thereof |
US7132106B2 (en) | 1998-12-22 | 2006-11-07 | Pfizer Inc. | Infectious cDNA clone of North American porcine reproductive and respiratory syndrome (PRRS) virus and uses thereof |
US7691389B2 (en) | 1998-12-22 | 2010-04-06 | Pfizer Inc | Infectious cDNA clone of north american porcine reproductive and respiratory syndrome (PRRS) virus and uses thereof |
US7618797B2 (en) | 1998-12-22 | 2009-11-17 | Pfizer Inc | Infectious cDNA clone of North American porcine reproductive and respiratory syndrome (PRRS) virus and uses thereof |
CA2366072C (en) * | 1999-03-08 | 2007-07-10 | Id-Lelystad, Instituut Voor Dierhouderij En Diergezondheid B.V. | Prrsv vaccines |
AU4482200A (en) | 1999-04-22 | 2000-11-10 | United States Department Of Agriculture | Porcine reproductive and respiratory syndrome vaccine, based on isolate ja-142 |
EA200200743A1 (ru) * | 2000-01-26 | 2002-12-26 | Бёрингер Ингельхайм Ветмедика Кг | Рекомбинантное ослабление вируса репродуктивного и респираторного синдрома свиней (prrsv) |
DE60121545T2 (de) | 2000-02-08 | 2007-06-28 | Regents Of The University Of Minnesota, Minneapolis | Virus des porcinen reproduktiven und respiratorischen syndroms und dessen verwendung |
EP1397498A1 (en) * | 2001-05-21 | 2004-03-17 | ID-Lelystad, Instituut voor Dierhouderij en Diergezondheid B.V. | Delections in arterivirus replicons |
US6841364B2 (en) * | 2002-01-22 | 2005-01-11 | Protatek International, Inc. | Infectious cDNA clones of porcine reproductive and respiratory syndrome virus and expression vectors thereof |
WO2005035794A2 (en) * | 2003-10-09 | 2005-04-21 | Tetracore, Inc. | Detection of prrsv |
CA2571452A1 (en) | 2004-06-18 | 2006-01-26 | Regents Of The University Of Minnesota | Identifying virally infected and vaccinated organisms |
US7632636B2 (en) | 2004-09-21 | 2009-12-15 | Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. | Porcine reproductive and respiratory syndrome isolates and methods of use |
WO2006091824A2 (en) * | 2005-02-25 | 2006-08-31 | Idexx Laboratories, Inc. | Peptides for detection of antibody to porcine reproductive respiratory syndrome virus |
UA95778C2 (ru) | 2005-06-24 | 2011-09-12 | Риджентс Оф Зе Юниверсити Оф Миннесота | Вирусы репродуктивно-респираторного синдрома свиней, их инфекционные клоны и мутанты и способы применения |
US7666585B2 (en) * | 2007-06-15 | 2010-02-23 | Protatek International, Inc. | Construction of chimera PRRSV, compositions and vaccine preparations |
ES2389748T3 (es) * | 2007-06-25 | 2012-10-31 | South Dakota State University | Virus del síndrome reproductivo y respiratorio porcino de tipo 1 norteamericano recombinante y métodos de uso |
RU2561595C2 (ru) * | 2008-08-25 | 2015-08-27 | Бёрингер Ингельхайм Ветмедика, Инк. | Вакцина против высокопатогенного репродуктивно-респираторного синдрома свиней (hp prrs) |
TWI627281B (zh) | 2009-09-02 | 2018-06-21 | 百靈佳殷格翰家畜藥品公司 | 降低pcv-2組合物殺病毒活性之方法及具有改良免疫原性之pcv-2組合物 |
UA108902C2 (uk) | 2010-11-10 | 2015-06-25 | Вірус північноамериканського репродуктивного та респіраторного синдрому свиней (prrs) та його застосування | |
PL2959916T3 (pl) | 2011-02-17 | 2019-05-31 | Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh | Nowy europejski szczep prrsv |
JP2014506795A (ja) | 2011-02-17 | 2014-03-20 | ベーリンガー インゲルハイム フェトメディカ ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング | Prrsvの工業規模の製造方法 |
JP6101251B2 (ja) * | 2011-05-07 | 2017-03-22 | ラボラトリオ アヴィメキシコ エスエー ディーイー シーヴィーLaboratorio Avi−Mex, S.A. De C.V. | ウイルスベクターにおける抗prrs組換えワクチン |
WO2012166493A1 (en) * | 2011-06-01 | 2012-12-06 | Merial Limited | Needle-free administration of prrsv vaccines |
US9187731B2 (en) | 2011-07-29 | 2015-11-17 | Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh | PRRS virus inducing type I interferon in susceptible cells |
EP2737059A1 (en) | 2011-07-29 | 2014-06-04 | Boehringer Ingelheim Vetmedica GmbH | Novel prrs virus inducing type i interferon in susceptible cells |
CN105688201A (zh) | 2012-05-17 | 2016-06-22 | 佐蒂斯有限责任公司 | 在断奶之前对抗猪繁殖与呼吸综合征(prrs)病毒的有效疫苗接种 |
US9579373B2 (en) | 2013-03-15 | 2017-02-28 | Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. | Porcine reproductive and respiratory syndrome virus, compositions, vaccine and methods of use |
MX2017016895A (es) | 2015-06-23 | 2018-04-10 | Merial Inc | Vectores virales recombinantes que contienen la proteina menor del virus del sindrome reproductor y respiratorio porcino (prrsv) y sus metodos de elaboracion y uso. |
BR112019012158A2 (pt) | 2016-12-14 | 2019-11-12 | Zoetis Services Llc | vacinação eficaz contra cepas europeias de vírus da síndrome reprodutiva e respiratória suína (prrs) antes do desmame |
Family Cites Families (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DE69201441T3 (de) * | 1991-06-06 | 2008-12-04 | Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh | Erreger der mysteriösen schweinekrankheit,impfstoff-zusammensetzungen und diagnose kits. |
DK0601062T4 (da) * | 1991-08-26 | 2001-03-14 | Univ Minnesota | SIRS-vaccine og diagnosefremgangsmåde |
US5695766A (en) * | 1992-10-30 | 1997-12-09 | Iowa State University Research Foundation | Highly virulent porcine reproductive and respiratory syndrome viruses which produce lesions in pigs and vaccines that protect pigs against said syndrome |
PT676467E (pt) * | 1994-04-11 | 2002-02-28 | Akzo Nobel Nv | Estirpes europeias de vacina do virus do sindroma reprodutivo e respiratorio porcino (prrsv) |
-
1995
- 1995-08-04 WO PCT/US1995/009927 patent/WO1996004010A1/en active IP Right Grant
- 1995-08-04 JP JP50679096A patent/JP3748887B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1995-08-04 EP EP06007265A patent/EP1704869A1/en not_active Withdrawn
- 1995-08-04 PT PT95928746T patent/PT783321E/pt unknown
- 1995-08-04 MX MX9700817A patent/MX9700817A/es active IP Right Grant
- 1995-08-04 CA CA2196555A patent/CA2196555C/en not_active Expired - Lifetime
- 1995-08-04 DE DE69535061T patent/DE69535061T2/de not_active Revoked
- 1995-08-04 EP EP95928746A patent/EP0783321B1/en not_active Revoked
- 1995-08-04 AT AT95928746T patent/ATE329616T1/de active
- 1995-08-04 ES ES95928746T patent/ES2262142T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1995-08-04 DK DK95928746T patent/DK0783321T3/da active
-
1997
- 1997-02-13 US US08/799,464 patent/US5998601A/en not_active Expired - Lifetime
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
EP0783321B1 (en) | 2006-06-14 |
ATE329616T1 (de) | 2006-07-15 |
CA2196555A1 (en) | 1996-02-15 |
EP1704869A1 (en) | 2006-09-27 |
DE69535061D1 (de) | 2006-07-27 |
CA2196555C (en) | 2012-07-03 |
PT783321E (pt) | 2006-08-31 |
ES2262142T3 (es) | 2006-11-16 |
US5998601A (en) | 1999-12-07 |
DE69535061T2 (de) | 2007-01-25 |
DK0783321T3 (da) | 2006-10-02 |
JPH10504191A (ja) | 1998-04-28 |
WO1996004010A1 (en) | 1996-02-15 |
EP0783321A1 (en) | 1997-07-16 |
EP0783321A4 (en) | 1998-01-14 |
MX9700817A (es) | 1997-05-31 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP3748887B2 (ja) | Vr−2332 ウィルスヌクレオチド配列および使用方法 | |
CN1138859C (zh) | Rna病毒的感染性克隆及其衍生的疫苗及诊断分析 | |
Key et al. | Genetic variation and phylogenetic analyses of the ORF5 gene of acute porcine reproductive and respiratory syndrome virus isolates | |
Allende et al. | Mutations in the genome of porcine reproductive and respiratory syndrome virus responsible for the attenuation phenotype | |
EP0587780B2 (en) | Causative agent of the mystery swine disease, vaccine compositions and diagnostic kits | |
Wootton et al. | Full-length sequence of a Canadian porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) isolate | |
KR102270344B1 (ko) | Prrs 바이러스 변이체, 유럽형 prrs 바이러스 cdna 클론, 및 이들의 용도 | |
Morozov et al. | Sequence analysis of open reading frames (ORFs) 2 to 4 of a US isolate of porcine reproductive and respiratory syndrome virus | |
US20020012670A1 (en) | Recombinant attenuation of porcine reproductive and respiratory syndrome (PRRSV) | |
MXPA03007751A (es) | Cepas vivas atenuadas del virus prrs. | |
US20040224327A1 (en) | Infectious clones of RNA viruses and vaccines and diagnostic assays derived thereof | |
Mardassi et al. | Structural gene analysis of a Quebec reference strain of porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) | |
EP1254213A2 (en) | Recombinant attenuation of prrsv | |
US6410031B1 (en) | Attentuated porcine reproductive and respiratory syndrome virus strain and method of use | |
Meng et al. | SEQUE. HIG | |
AU2002256653A1 (en) | Life attenuated strains of PRRS virus | |
Allende | Studies on the biology of porcine reproductive and respiratory syndrome (PRRS) virus infection | |
MXPA99003967A (en) | Infectious clones of rna viruses and vaccines and diagnostic assays derived thereof |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20040727 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20041021 |
|
A602 | Written permission of extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602 Effective date: 20041206 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20050127 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20050315 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20050614 |
|
A602 | Written permission of extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602 Effective date: 20050801 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20050915 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20051101 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20051130 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20091209 Year of fee payment: 4 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20101209 Year of fee payment: 5 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20101209 Year of fee payment: 5 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20111209 Year of fee payment: 6 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20111209 Year of fee payment: 6 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20121209 Year of fee payment: 7 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20131209 Year of fee payment: 8 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
EXPY | Cancellation because of completion of term |