JP3746658B2 - Method and apparatus for producing probe array using fine particles - Google Patents

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Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明はペプチド、蛋白質、ＤＮＡ、ＲＮＡ等の生体関連物質の検出、診断、およびＤＮＡをはじめとする生体関連物質の分析に用いるプローブアレーおよびその作製方法と作製装置に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
ＤＮＡの分析やDNA検査あるいは診断には微量のDNAを増幅する方法、得られたDNA断片を分離検出する方法等が必要である。DNAの増幅にはＰＣＲ（polymerase chain reaction)が広く用いられている。此れによれば非常にわずかな量のＤＮＡでもそのコピー数を数桁増やして検出できる。一方、種々DNAの分離検出にはゲル電気泳動と蛍光検出を組み合わせたDNAシーケンサーやフラグメントアナライザー等が用いられている。しかし、検体数が多くなったり、検査項目が多くなると電気泳動による方法では手間がかかる難点があり、DNAプローブを用いた簡便な方法が注目されはじめている。特に、プローブを固体表面に多種類固定したプローブアレーを作製し、検体との間でハイブリダイゼーションを起こさせて特定のＤＮＡだけを固体表面にトラップして検出するDNAチップが注目されはじめている( Nature Medicine 2, 753 (1996)）。
一方、蛋白質やペプチド、あるいはこれらと相互作用する種々生体関連物質の分析でもプローブ検出が用いられ、DNAチップに相当するペプチドチップなどが用いられ始めている。
【０００３】
このように固体表面にペプチドやＤＮＡを固定して検体との間でハイブリダイゼーションを行い、分離検出する方法は、放射性標識をもちい、メンブレン上に固定したプローブで目的DNAなどの存在を調べるブロッティング法として昔から用いられてきた。しかし、ガラスあるいはシリコンといった固体表面の小さな領域（１cm2）に沢山のプローブを固定したDNAチップは試料の節約ができると同時に非常に多くの種類のプローブを用いて検査できる等の利点がある。 これらDNAチップの作製法には大別して２つがある。第一は半導体などで用いる光マスクの方法を用いて固体の区画された狭い領域（0.05mm-0.2mm四方）にDNAプローブを一塩基づつ光化学反応により合成していく方法である（Science 251, 767(1991)）。 第２は合成したDNAあるいはPCR増幅したDNA、クローニングで得たDNAを固体表面の小さな区画にプローブの区画ごとに固定していく方法である（Nature Biotech 16, 27 (1998)）。 この方法では必要なプローブを持ったペプチドチップやDNAチップを比較的に簡単につくれる利点があり、多くのベンチャー企業が採用している。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
DNAをはじめとする生体物質のプローブチップは期待のおおきな検査技術であるが、実用化には １）少量多品種を安く作れる事、２）プローブ固定の均一度が良い事、３）データーの再現性が良い事、くりかえし使用できる事、４）非特異的吸着を除くため加熱できること、などが必要である。しかし、プローブを固体表面に液滴としてのせて固定化するので、区画毎にばらつきが出る、作るのに手間がかかる、プローブの位置を決めることと固体表面に固定する事を同時に行っているのであまり細かいプローブ固定区画はつくれない、プローブの均一度も良くない、などの問題点がある。また、これらの多くは吸着などにより固定されており、固体との結合力が弱く、加熱によりプローブが表面から剥離したりすることがある。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
上記課題を解決するために、プローブの固体表面への固定と、プローブの配列を別工程にした。これにより、均一に固体表面にDNAプローブを作製することができる。プローブの固定は共有結合で行うことができるので熱に強く、非特異的吸着などを加熱除去するのに適している。微粒子をプローブを固定する固体として用い、それらを並べる事で目的にあった区画サイズのプローブアレーを作製する。配列するプローブ付き微粒子を交換することで容易に目的のプローブアレーを作製することができる。これら微粒子を並べる方法は微粒子が直径0.3mm程度のサイズではピンセットでつまんで並べることができるが、0.1mm以下になると困難である。そこで、微細な穴をもったシートを用い、この穴に微粒子を保持して運び、キャピラリーあるいは平板にもうけた溝等に並べることによりプローブアレーを作製する方法およびその作製装置を提供する。また、別の方法として液体フロー中に微粒子を一個づつ制御しながら流し込んでそれをキャピラリーに受けることでプローブアレーとする。本明細書において、「アレーとする」とは、プローブ付き微粒子を一次元または二次元に配列させてプローブアレーの構成とすることを意味する。さらに、計測の再現性等を高めるために複数のプローブ付き微粒子をプローブ毎に複数個ならべて検査のばらつきなどを確認して信頼度の高いデーターが得られるようにした。
【０００６】
すなわち本発明は、以下の（１）〜（１８）を提供する。
（１）プローブの種類ごとに複数の微粒子にプローブを固定化し、複数のプローブに対する該微粒子を定められた個数ずつ集めてアレーとしたことを特徴とするプローブアレー。
【０００７】
（２）微粒子表面にプローブを固定化し、該固定化微粒子をプローブの種類ごとに決められた順序で一次元あるいは二次元に配列させて生体関連物質のプローブアレーを構成することを特徴とするプローブアレーであって、マーカーとなる微粒子を一定間隔で配置したことを特徴とする、上記プローブアレー。
（３）プローブごとに複数の微粒子をプローブアレーホルダーに保持せしめ、種類の異なるプローブを区分するためにサイズの異なる微粒子を分離隔壁として用いたことを特徴とするプローブアレー。
【０００８】
（４）種々のプローブを固定化した微粒子をプローブの種類に従って決められた配列でキャピラリーまたは光学セル内に並べる方法において、微粒子よりも大きな穴をもつシートと、該シートに接触し、キャピラリーを保持するか、または溝を有する基板とを相対的に移動可能とし、シートの穴にトラップした微粒子の位置を制御移動し、前記のキャピラリーまたは溝に上記微粒子を順次移送することを特徴とする、プローブアレーの作製方法。
【０００９】
（５）単一種類のプローブを固定化した微粒子を穴付きシート上に散布して穴の部分に落とし込む工程と、穴に入らなかった余剰の微粒子を除去する工程と、穴部分に保持された微粒子をキャピラリーまたは溝に移送する工程とを繰り返すことを特徴とする、上記（４）に記載のプローブアレーの作製方法。
【００１０】
（６）複数の異なるプローブをそれぞれ固定化した複数の微粒子をシート上の異なる穴に保持し、プローブアレーホルダーまたは該プローブアレーホルダーにつながるキャピラリーへ種類ごとに定められた順序で移送することを特徴とする、上記（４）に記載のプローブアレーの作製方法。
【００１１】
（７）プローブを固定化した微粒子をプローブの種類に従って決められた配列でキャピラリーまたは光学セル内に並べる方法において、微粒子を導入細管に保持し、溶液と共に微粒子をひとつずつ制御しながら溶液流中に放出し、キャピラリー管内に導入することで種々のプローブ付き微粒子を決められた順序で配列保持してプローブアレーを作製する方法。
【００１２】
（８）プローブを固定化した微粒子をプローブの種類ごとに異なる区画に分割保持し、その区画の底面にある穴に微粒子を保持し、これを別の基板平面に掘られた溝に落とし込むことによりプローブ付き微粒子を定められた順序で配列させ、ついで別途キャピラリー、溝または光学セルに移送すると同時に間隔を密集させてプローブアレーを作製する方法。
【００１３】
（９）プローブを固体表面に固定化する手段と、プローブを定められた順序で配列させる手段とを独立して有することを特徴とするプローブアレーの作製装置。
（１０）種々のプローブを固定化した微粒子をプローブの種類にしたがって決められた配列でキャピラリーあるいは光学セル内に並べるプローブアレー作製装置において、微粒子よりも大きな穴をもつシートと、該シートに接触し、キャピラリーを保持するか、または溝を有する基板とを相対的に移動可能とする手段と、シートの穴にトラップした微粒子の位置を制御移動し、前記のキャピラリーまたは溝に上記微粒子を順次移送する手段とを有することを特徴とする、プローブアレーの作製装置。
【００１４】
（１１）単一種類のプローブを固定化した微粒子を穴付きシート上に散布して穴の部分に落とし込む手段と、穴に入らなかった余剰の微粒子を除去する手段と、穴部分に保持された微粒子をキャピラリーまたは溝に移送する手段とを有する、上記（１０）に記載のプローブアレーの作製装置。
（１２）複数の異なるプローブをそれぞれ固定化した複数の微粒子をシート上の異なる穴に保持する手段と、プローブアレーホルダーまたは該プローブアレーホルダーにつながるキャピラリーへ種類ごとに定められた順序で移送する手段とを有することを特徴とする、上記（１０）に記載のプローブアレーの作製装置。
【００１５】
（１３）プローブを固定化した微粒子をプローブの種類に従って決められた配列でキャピラリーまたは光学セル内に並べるプローブアレーの作製装置において、微粒子を導入細管に保持し、溶液と共に微粒子をひとつづつ制御しながら溶液流中に放出する手段と、キャピラリー管内に導入する手段と、導入された種々プローブ付き微粒子を決められた順序で配列保持する手段とを有することを特徴とする、プローブアレーの作製装置。
【００１６】
（１４）プローブを固定化した微粒子をプローブの種類ごとに異なる区画に分割保持する手段と、その区画の底面にある穴に微粒子を保持する手段と、これを別の基板平面に掘られた溝に落とし込むことによりプローブ付き微粒子を定められた順序で配列させる手段と、キャピラリー、溝または光学セルに移送すると同時に間隔を密集させる手段とを有する、プローブアレーの作製装置。
【００１７】
（１５）微粒子表面にプローブを固定化し、該固定化微粒子をプローブの種類ごとに決められた順序で一次元あるいは二次元に配列させ、生体関連物質のプローブアレーを構成することを特徴とするプローブアレーを有する分析装置。
（１６）上記プローブアレーが、プローブの種類ごとに微粒子に固定化し、該微粒子を複数集めてアレーとしたものであることを特徴とする、上記（１５）に記載の分析装置。
【００１８】
（１７）一次元あるいは二次元に分布し、微粒子を保持できる穴を有するセルと、少なくとも各セルを区画している壁と、微粒子のサイズよりも小さな間隔におかれた光学的に透明な部材とで形成された微粒子アレーホルダーからなるプローブアレー。
（１８）上記（１）〜（３）、及び（１７）のいずれかに記載のプローブアレーを用いた分析装置。
【００１９】
【発明の実施の形態】
以下本発明を実施例を用いて説明する。本発明はDNA、ＲＮＡ、蛋白質、ペプチド他の生体関連物質のプローブアレーに共通であるがここではDNAを例に説明する。
【００２０】
本発明によるDNAプローブアレーは、キャピラリー管中に一次元的に保持する場合と狭い間隙の光学セル内に固体プローブを２次元的に保持する場合とがあるが、説明の都合で主としてキャピラリー管を用いた例で説明する。微粒子として、球形のビーズを用いた例で説明するが、矩形あるいは他の形状のものでもよい。ビーズのサイズは１-３００ミクロンまで使用可能であるが、ここでは20ミクロンのビーズを用いた例を中心に説明する。なお、ビーズの材質にはガラスあるいはプラスチックのものが普通に利用できるが金等の金属も利用可能である。ここではプラスチックを用いた。
【００２１】
［実施例１］
図１は本発明によるプローブアレーの例である。プローブを保持したプローブビーズ１０５の直径は20ミクロンであり、キャピラリー１０３の内径は25ミクロンである。この例では両端にダミーのビーズ１０６を約２０個並べその内側にビーズを９９９個並べた。１０個ごとに黒色のマーカービーズ１０４を入れ、１００個目は赤色とした。マーカービーズ１０４の数は９９個なので、プローブビーズ１０５の数は９００個となる。すなわち９００種類のプローブをならべて検査できる。これらは密集すると２mmの幅の中に入るが、ハイブリダイゼーション反応のこと等を考え、やや荒い密度で５mmの領域にこれらを保持した。領域の長さはもっと長くても短くても良いが、長すぎるとサンプルが多く必要となり、短いと取り扱いが厄介である上、十分なハイブリダイゼーションを行うだけのサンプルが確保できない場合もある。反応領域の体積は約2.3nlである。両端はストッパーが置かれており、ビーズが流出しないようにできている。サンプルおよび洗浄液は注入口１０１から注入され、出口１０２から排出される。プローブ数が１万個でも反応領域の長さは20-30ｍｍで良いため、コンパクトで扱い易い利点がある。
【００２２】
これに用いる蛍光検出装置は図２に示した様なもので、レーザー光源２０９から、ミラー及びレンズ２０５を介して照射されるレーザービーム２０６とプローブアレー保持キャピラリー２０２を相対的にスキャンして得られる蛍光を測定する。相対的移動は、ミラーの調節および／またはプローブアレー移動板２０３によって行い、検出位置２０４にレーザーを照射する。検出位置２０４からの発光は、レンズ２０５、光学フィルター２０７、レンズ２０８を介して検出器２１０で検出し、データー処理および検出器コントローラー２１１で処理し、表示装置２１２に表示する。本発明において、プローブビーズ２０１の１０個毎にマーカービーズが入っており、各ビーズの順番に従ってプローブの種類を容易に知る事ができる。マーカービーズを色分けしておき何番目か容易にわかるようにしてもよいし、マーカービーズの代わりにプローブをつけたビーズに色をつけておき、１０個ごとに色が変わるようにしてもよい。この場合、色は蛍光検出の障害とならない波長のものを採用する必要がある。
【００２３】
［実施例２］
次の実施例はビーズを一つずつ定められた順序でキャピラリー内に並べる方法および装置に関するものである。図３及び４はビーズアレー作製方法及び装置の一例である。説明の都合上一本のキャピラリー３０６にビーズアレーを作製する例で説明するが、実用上はこのようなシート上の穴とキャピラリーが多数並んだものを使用する。ステップ１（図3-a）：ビーズ供給用ノズル３０９から、第一のプローブが付いたプローブビーズ３０４（第一のプローブビーズ）を溶液注入口３０２から注入された溶媒とともにビーズ捕捉用穴３０５を有するシートを底面に持つセル内に導入する。ビーズを沈殿させ前後左右に液を移動させると、ビーズのうち一つがビーズ捕捉用穴３０５の中に落ち込む。ステップ２(図3-b)：次いで残りのビーズを溶媒とともに排出口３０１から除去し、洗浄する。穴３０５に落ちたビーズ３０８だけがセルの中に残る。この場合、シートに垂直の方向から穴３０５に向かって溶媒を噴出させ、穴３０５の近傍のビーズを除去して、ステップ３でキャピラリーに取り込まれるビーズを穴に落ちたビーズ３０８だけになるようにしてもよい。穴の底面はキャピラリー保持基板３０７でふさがれた状態にある。このキャピラリー保持基板３０７には配列用キャピラリー３０６が固定されているが、ステップ１、２ではキャピラリー軸と穴３０５は一致しておらず、ビーズは穴３０５に保持された状態にある。ステップ３(図3-c)：キャピラリー保持基板３０７とシートを相対的に動かし、キャピラリー軸と穴３０５を一致させる。キャピラリー３０６の他端から吸引あるいは溶液側から圧力をかけプローブビーズ１をキャピラリー内に導入する。この場合移動は穴３０５のサイズ程度でよく、圧伝素子を使用すると便利である。ステップ４(図4-d)：キャピラリー保持基板３０７とシートを相対的に動かし、再びキャピラリー軸が穴とずれるようにする。ステップ５(図4-e)：第２のプローブのついたビーズ（第二のプローブビーズ）をセルに導入し、ビーズの内一つを穴３０５に落とし込む。ステップ６(図4-f)：ステップ２と同様に穴３０５にあるビーズ以外の余剰のビーズをセル内から除去する。ステップ７(図4-g)：キャピラリー保持基板３０７とシートを相対的に動かし、キャピラリー軸と穴を一致させ、第二のプローブビーズをキャピラリー３０６の中に導入する。この結果、キャピラリー３０６内にはプローブ１のついたビーズ（第一のプローブビーズ）とプローブ２の付いたビーズ（第二のプローブビーズ）が並ぶ。以下同様のことを繰り返してプローブ付きのビーズアレーを望む配列でつくる。尚、３０３はカバー板、３１０はストッパーである。
【００２４】
ここで用いたキャピラリーを取り外して計測時のプローブアレーホルダーとして用いてもよいが、別に用意したプローブアレーホルダーをキャピラリーの下部に取り付け、そこにビーズアレーを移して用いてもよい。プローブアレーホルダーとしては、キャピラリーあるいは溝などが挙げられる。ここでは図５に示すプローブアレーホルダーを用いた。図中左端の注入口４０３からサンプルを注入する。十分ハイブリダイゼーションを行った後、注入口４０３から洗浄液をいれて、排出口４０２から未反応のサンプルを除去する。ストッパー４０６により、ビーズの排出は阻止される。計測ユニットに装着して、ビーズ配列用溝４０４に配列させた各プローブビーズ４０５にレーザーを照射して発する蛍光を検出する。上部ウィンドー４０７を透明部材で構成すれば、検出が容易である。もちろん、レーザーを照射して蛍光を得る代わりに化学発光試薬を用いて発光させ、その光を受光してもよい。検出はハイブリダイゼーションの有無が分るものであれば何でもよい。
【００２５】
ここでは一つのキャピラリーをキャピラリー保持基板に固定した例で説明したが、複数のキャピラリーを用いて同時に大量のプローブアレーをつくる事も可能である。 この場合、キャピラリーの数に応じてシートに設けた穴の数を増やす必要があるのは言うまでもない。
【００２６】
［実施例３］
本実施例はタイタープレートに入れられたプローブビーズを含む溶液を種類ごとに決められた順番で順次穴付きシートのある部位（捕捉部位）に送り込み、キャピラリーあるいは平板に掘られた溝に並べていく装置の例である（図６）。ピペッター５０１でプローブビーズ５０８をタイタープレート５０２のウェル５０３から吸い込み、トランスファー用のビーズ保持ウェル５０５に移す。ウェル５０５の底面には捕捉用の穴があいている。捕捉部位に注入されたプローブビーズ５０８のうち１つ（穴を複数設けた場合は複数個）が穴に落ち込む（５０９）。各穴にビーズが落ち込んだ事を光学的に確認する。ついで洗浄液を流し余剰のビーズを回収または除去する。ビーズ捕捉穴とビーズアレー配列用溝５０７あるいはキャピラリーの間には圧電素子５１０などで駆動できる弁５１１が設けてあり、これを動かすことでビーズを溝５０７あるいはキャピラリー側に移動できるようにする。実際の移動は液体のフローを利用する。穴付きビーズホルダー５０４を動かし穴と溝５０７あるいはキャピラリーの中心を一致させ、捕捉したビーズを溝あるいはキャピラリーに移動させてもよい。ビーズの移動が終了後に弁５１１を動かすか、または穴とキャピラリーをずらし、ビーズを穴に捕捉できるようにする。次のプローブ付きビーズをピペッター５０１で捕捉部位に導入する。以下同様のことを繰り返してビーズアレーを作製する。作製したビーズアレーはそのままあるいは別の容器に配列を保った状態で移動してプローブアレーとして用いる。尚、５０６は配列したプローブビーズ、５１２は保持基板である。
このような操作は複数の穴をもったシステムで行い、アレー作製の時間を短縮したり、同一アレーを複数同時に作製する事もできる。
【００２７】
［実施例４］
実施例２ではセルはひとつで一回に一種類のプローブビーズを扱ったが、この例は複数のセルをもち複数種のプローブを区分けして保持する事で作製効率をあげた例である。図７に示すように回転円盤６０１に矩形のセル６０３を複数個配置する。各セル６０３の底面には実施例１と同様の穴付きシートが具備されている。シートを具備した回転円盤の下部はキャピラリーを保持した基板と接触しており、穴に捕獲されたビーズが落下しないようになっている。回転円盤６０１を移動させ穴とキャピラリー軸が一致するようになると前例と同様にしてプローブビーズをキャピラリーの中に移行する。穴はキャピラリー数に応じた数だけある。穴の配置はキャピラリーの配置に一致させてあるが回転移動時にずれることを防ぐため、CD-ROMと類似のトラッキング技術を用いてキャピラリー付きのブロックを回転円盤６０１の回転軸６０２方向に移動して調整する機構を具備している。実施例では直径１６cmの回転板を用いた。中心から５cmのところに幅１mm長さ３０mmのセルを配置してある。セルのピッチは２mmであり、円周上に１５０ほどのセルを作ることができる。セルの下面には穴付きシートが張ってあり穴のピッチは２mmである。この例では合計１０個の穴を並べ一度に１０個のキャピラリーにプローブビーズアレーを作ることができる。もちろんキャピラリーの数、一度に作製できるプローブアレーの数は必要に応じて変えられる。尚、６０４はセル６０３に設けられたビーズ保持用穴である。
【００２８】
回転板は高速回転モードとゆっくりであるが高精度で回転するモードの二つがある。セル内にビーズを溶液とともにいれる。円盤をゆするとともに穴から溶液を排出し、ビーズを穴に落とし込む。次いで高速回転モードになり、遠心力と溶液の流れで余剰のビーズをセル先端のビーズ溜に移動させる。回転を停止し、プローブビーズ１がキャピラリーの位置にあうように高精度回転モードでセットする。底面部のシャッターを開き、キャピラリー管を保持したブロックを回転板に接触させ溶液の流れと共にビーズをキャピラリー内へ移す。次いで回転板を高精度モードで回転させプローブビーズ２を含むセルがキャピラリーの位置にくるようにする。以下順次ビーズをキャピラリーに移行し、定められた順序でプローブビーズアレーを作製する。円盤を交換するか各セルに入れるプローブビーズを交換して同じ事を繰り返して多くのプローブビーズをキャピラリーに配置しながら保持できる。セルに入れるビーズの色を１０個ごとに変えておくと作製したプローブビーズアレーのプローブの位置を確認するうえで都合が良い。
【００２９】
［実施例５］
次の実施例は、液体フローを用いてプローブビーズを一つずつ定められた順序でキャピラリー内に並べる方法および装置に関するものである。図８はこの概要を示した。プローブビーズ７０２は、ビーズ溶液溜７０１から、移送管７０３、シースフローセル７０４を介してポンプでキャピラリーに運ばれる。キャピラリーの先端部は移送液７０５の流れの中に入れられ、移送用キャピラリー７０６の先端からビーズをひとつずつ液体流中に放出する。ほぼ一定の時間間隔でビーズは液体流中に放出されるが、これを安定化するためにビーズを保持したキャピラリー７０７にはキャピラリーの軸に沿って節ができるように超音波が加えられている。超音波の強度等の条件をコントロールすることで一定時間毎にビーズを一つづつ液体の流れの中に放出する。尚、７０８は保持基板、７０９は溶液排出管である。
【００３０】
［実施例６］
これまでの例ではプローブ一種類に対して一個のビーズを対応させたが、ハイブリダイゼーション反応のばらつきを見たり検出感度を高めるには一つのプローブあたり複数個のビーズを対応させると都合がよい。各プローブで対応するビーズの個数は必ずしも同じである必要はない。この場合異なるプローブビーズ８０２の間に目印となる色またはサイズの異なる区分用ビーズ８０３を入れる必要がある。図９はこの例である。作製に要する装置は基本的には前述のものと一致するが、プローブ保持用キャピラリー８０４の内径をプローブビーズ８０２のサイズよりも数倍以上大きくして複数のビーズが穴にトラップされるようにする。以下の動作は前と同じである。尚、８０１はダミービーズ、８０５は溶液排出管である。
【００３１】
なお、前の例で述べたフローシステムを用いるとビーズアレーの作製は楽になる。ビーズ溜から少量のビーズをピペットで分取し、液体フロー中に注入する。注入されたビーズの数は確定できないが順次キャピラリーへ収納できる。別の種類のビーズを注入するまえにアイソレータとして色つきビーズあるいはサイズの違う区分用ビーズ８０３を注入することで、注目しているのが何番目のビーズでどんなプローブを持っているのか識別することができる。
【００３２】
［実施例７］
前実施例のプローブアレー作製法はキャピラリーの中に配列させる例であったが、図１０に、平面上に設けた溝にビーズを配列させ、それを密集させてプローブアレーとして用いたり、キャピラリーの中に移動してプローブアレーとして用いるための方法および装置を開示する。まず平面上に複数の溝を持つビーズアレー作製用ホルダー９０５を用意する。この溝９０６にプローブビーズ９０７を並べてキャピラリーなどに配列を保ったままビーズを移動してプローブアレーを作製するが、複数の溝９０６に入れられて配列したプローブビーズ９０７はそれぞれ異なるキャピラリー９０８に導入され、プローブアレーとして使用される。ビーズアレー作製用ホルダー９０５の上にはビーズを穴にトラップして保持し上記溝９０６まで移動するための穴付きシート９０４が置かれている。この穴付きシート９０４は図１０に示したようにビーズアレー作製用ホルダー９０５の溝９０６と直行するように作られた細溝保持板９０１の溝（ビーズ溜９０２）とその底に開けられたビーズ保持用の穴９０３を持っている。やはり複数の溝を持つがこれらにはそれぞれ異なるプローブ付きビーズが注入され、その穴に溝ごとに異なるプローブビーズ９０７を保持させるための物である。これら２つのシートあるいは平板は密着して使用されるが相互にスライドできる。まず、穴付きシート９０４の穴９０３とビーズアレー作製用ホルダー９０５の溝９０６の位置がずれた状態におかれる。プローブビーズ９０７を穴付きシート９０４の各溝にプローブの種類ごとに区分けされた状態で補給される。穴には一つのプローブビーズ９０７が入るがこの状態で底面は塞がれているのでここに保持される。穴付きシート９０４の穴９０３とビーズアレー作製用ホルダー９０５の溝９０６の位置を合わせるとビーズがそれぞれの穴９０３から１つずつ溝９０６に落ち込む。各溝９０６にはそれぞれのプローブビーズ９０７が１つずつ落ち込むので種々のプローブビーズ９０７が各溝９０６に保持される。ビーズの置かれた間隔は穴付きシート９０７のビーズ溜９０２の間隔とほぼ一致しており、この例では2mmである。ビーズアレー作製用ホルダー９０５の溝９０６に落とし込まれたプローブビーズ９０７の数はこの例では合計５０個である。また、同時に作製されるビーズアレーは１０個であるが必要に応じて増やすことができる。ビーズを落とし込んだら再び穴付きシート９０４の穴９０３とビーズアレー作製用ホルダー９０５の溝９０６の位置をずらして溝を密封型とし、溶液と共にビーズをキャピラリー９０８へ導く。プローブビーズ９０７の種類を多くする場合には上記の操作を繰り返すことで達成される。
上記実施例では一次元に配列したプローブビーズアレーを開示したが、これらを複数個並べたり、２次元に配列させることでより多くの種類のプローブを持ったプローブアレーを作れることはいうまでもない。
【００３３】
［実施例８］
本実施例はプローブビーズアレーホルダーが一次元あるいは二次元に分布した穴付きプレートとカバーグラスで構成されるセルを用いる例である。これは非常に小さなタイタープレートに似たものである。図１１に示すように、プローブビーズ１００４を入れたタイタープレートからビーズを少量マイクロピペットを用いて分取しマイクロタイタープレート１００１の穴（セル１００３）に移す。１００２はスペーサーである。ビーズについているプローブの種類とプレート上の穴の位置を対応させてプローブビーズを保持したマイクロタイタープレートに似たビーズアレーを作る。ビーズを入れたあとで光学的に透明で蛍光計測あるいは化学発光計測に支障のないカバーガラス１００５をかぶせてセルアレーとし、例えばレーザー光１００８を照射して、発光をレンズ１００９を介して検出器１０１０で検出する。カバーガラス１００５とマイクロタイタープレート状のセルアレーの各セルをしきっている壁とのあいだはビーズサイズより小さくビーズは相互に移動しない。反応液などは溶液排出口１００６及び溶液注入口１００７から自由に移動できる。使用に当たってはセルを反転させガラス面が下になるようにしてもちいる。この場合、セルの深さに関わりなくガラス面にあるビーズは反応液と十分接触してプローブはターゲットとハイブリダイゼーションを行うことができる。
【００３４】
【発明の効果】
以上述べた様に本発明によれば、ペプチドやDNAのプローブアレーを簡便に大量につくることができる。プローブを固体表面に固定するプロセスとプローブを配列するプロセスを分けることにより、それぞれを最適化して行うことができる。このため、均一で固体表面から剥がれにくい固定プローブを作る事ができ、定められた順番に並べることにより簡単に、必要な種類のプローブを持ったアレーを作ることができる。ビーズのサイズを小さくすることにより従来の方法では作製困難な微細なプローブアレーを作ることもできる。必要なDNAプローブを作製し、ビーズ表面に固定化して作製装置にセットするだけで新しい構成のプローブアレーを作製することができるので、ユーザーのほしい物をいつでも提供できる。同一プローブを持つビーズを複数個配列することにより統計平均を取ることができ再現性、定量性等をあわせて調べる事が出来、信頼のおける測定が実行できる。また、平面保持のDNAチップ等によるプローブアレーと異なり表面積がおおきく、反応をより速やかに行う事が出来るとともに高感度がえられる。ビーズのサイズは１ミクロンから３００ミクロンまで変える事ができるので、高密度のプローブアレーが必要な時でも容易に作る事ができる。たとえば、６ミクロンのビーズを用いると、キャピラリー１０ｍｍあたり１５００個のプローブを保持する事ができ、二次元のプローブアレーホルダーを用いると１平方センチあたり１００万個以上のプローブを並べる事ができる。
作製するときに同じプローブ配列をもったアレーを複数個同時に作製することは非常に容易であり、量産にも向いている。
【図面の簡単な説明】
【図１】キャピラリー内に配列したプローブビーズからなるプローブアレーチップの概念図である。
【図２】キャピラリーなどに保持されたプローブビーズアレーを計測する検出システムの概念図である。
【図３】ビーズ配列装置の部分断面図である。
ａ）オフライン状態でのビーズ供給の概念図である
ｂ）穴にビーズをトラップした状態の概念図である
ｃ）ビーズをキャピラリーなどに移行する状態の概念図である
【図４】ビーズ配列装置の部分断面図である。
ｄ）キャピラリーにビーズが１個保持された状態の図
ｅ）第２のプローブビーズを捕獲する穴に落とし込んだ状態の図
ｆ）余分なビーズの除去
ｇ）捕獲されたビーズをキャピラリーに導入する図
【図５】溝型ビーズ配列治具の概念図である。
ａ）外観図
ｂ）断面図
【図６】溝と可動弁を用いたビーズアレー作製方法の概念図である。
ａ）プローブビーズの溜からビーズを吸い取り、溝に並べていくプロセスの概念図
ｂ）ビーズを１個ずつ捕獲するデバイスの断面図
【図７】円盤型プローブビーズ移送システムの概念図である。
【図８】液体フロー式ビーズアレー作製法の概念図である。
【図９】多数のプローブビーズを区分ビーズで分離したタイプのビーズアレーの概念図である。
【図１０】穴付きシートを用いたプローブビーズ配列方法の概念図である。
【図１１】マイクロタイタープレート型のビーズアレーホルダーの概念図である。ａ）概念見取り図
ｂ）断面図
ｃ）計測時の概念図
【符号の説明】
１０１：溶液および試料注入口、１０２：出口、１０３：キャピラリー、１０４：マーカービーズ、１０５：プローブビーズ、１０６：ダミーのビーズ
２０１：プローブビーズ、 ２０２：プローブアレー保持キャピラリー、２０３：プローブアレー移動板、２０４：検出位置、２０５：レンズ、２０６：照射レーザー、２０７：光学フィルター、２０８：レンズ、２０９：レーザー光源、
２１０：検出器、２１１：データー処理および検出器コントローラー、２１２：表示装置
３０１：排出口、 ３０２：溶液注入口、 ３０３：カバー板、
３０４：プローブビーズ、 ３０５：ビーズ捕捉用穴、 ３０６：配列用キャピラリー、３０７：キャピラリー保持基板、３０８：捕捉されたビーズ、
３０９：ビーズ供給用ノズル、 ３１０：ストッパー
４０１：プローブアレーホルダー、 ４０２：排出口
４０３：注入口、 ４０４：ビーズ配列用溝
４０５：プローブビーズ、 ４０６：ストッパー
４０７：上部ウィンドー
５０１：ピペッター、 ５０２：タイタープレート、 ５０３：ウェル、 ５０４： 穴付きビーズホルダー
５０５：ビーズ保持ウェル、 ５０６：配列したプローブビーズ、５０７：ビーズアレー配列用溝、 ５０８：プローブビーズ、５０９：穴に捕獲されたプローブビーズ
５１０：圧電素子、 ５１１：弁、 ５１２：保持基板
６０１：回転円盤、 ６０２：回転軸
６０３：セル、 ６０４：ビーズ保持用穴
７０１：ビーズ溶液溜、 ７０２：プローブビーズ、 ７０３：移送管
７０４：シースフローセル、 ７０５：移送液、 ７０６：移送用キャピラリー管
７０７：キャピラリー、 ７０８：支持基板
７０９：溶液排出管
８０１：ダミービーズ、８０２：プローブビーズ、８０３：区分用ビーズ、８０４：プローブ保持用キャピラリー、８０５：試料流路
９０１：細溝保持板、 ９０２：ビーズ溜、 ９０３：穴
９０４：穴付きシート、 ９０５：ビーズアレー作製用ホルダー、 ９０６：溝、 ９０７：プローブビーズ、 ９０８：キャピラリー
１００１：マイクロタイタープレート、
１００２：スペーサー、 １００３：セル、 １００４：プローブビーズ、１００５：カバーガラス、 １００６：溶液排出口、 １００７：溶液注入口、
１００８：レーザー光、 １００９：レンズ、１０１０：検出器[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a probe array used for detection and diagnosis of biological substances such as peptides, proteins, DNA and RNA, and analysis of biological substances such as DNA, and a method and apparatus for producing the same.
[0002]
[Prior art]
DNA analysis, DNA testing or diagnosis requires a method for amplifying a small amount of DNA, a method for separating and detecting the obtained DNA fragment, and the like. PCR (polymerase chain reaction) is widely used for amplification of DNA. According to this, even a very small amount of DNA can be detected by increasing its copy number by several orders of magnitude. On the other hand, DNA sequencers and fragment analyzers that combine gel electrophoresis and fluorescence detection are used for separation and detection of various DNAs. However, when the number of specimens increases or the number of examination items increases, there is a difficulty in the method using electrophoresis, and a simple method using a DNA probe has begun to attract attention. In particular, a DNA chip that produces a probe array in which multiple types of probes are immobilized on a solid surface, and causes hybridization with a specimen to trap and detect only specific DNA on the solid surface is beginning to attract attention (Nature) Medicine 2, 753 (1996)).
On the other hand, probe detection is also used for analysis of proteins and peptides, or various biological substances that interact with these, and peptide chips corresponding to DNA chips have begun to be used.
[0003]
In this way, peptide or DNA is immobilized on a solid surface and hybridization is performed with a sample to separate and detect. The blotting method uses a radioactive label and probes for the presence of target DNA and the like using a probe immobilized on a membrane. Has been used for a long time. However, small areas of solid surfaces such as glass or silicon (1 cm 2 The DNA chip on which many probes are fixed has the advantage that the sample can be saved and at the same time it can be tested using a very large number of types of probes. There are roughly two methods for producing these DNA chips. The first is a method of synthesizing a DNA probe into a narrow, solid area (0.05mm-0.2mm square) by photochemical reaction one base at a time using a photomask method used in semiconductors (Science 251, 767 (1991)). The second is a method in which synthesized DNA, PCR-amplified DNA, or DNA obtained by cloning is immobilized in a small compartment on the solid surface for each probe compartment (Nature Biotech 16, 27 (1998)). This method has the advantage that a peptide chip or DNA chip with the necessary probes can be made relatively easily, and is used by many venture companies.
[0004]
[Problems to be solved by the invention]
Probe tips for biological materials such as DNA are a promising testing technique, but for practical use 1) To make small quantities of various products at low cost, 2) To have good uniformity of probe fixation, and 3) To reproduce data It must be good in nature, can be used repeatedly, and 4) can be heated to remove non-specific adsorption. However, since the probe is fixed on the solid surface as a droplet, it varies from section to section, and it takes time to make it, so the positioning of the probe and the fixing to the solid surface are performed at the same time. There are problems such as the fact that the probe fixing section cannot be made very fine and the uniformity of the probe is not good. In addition, many of these are fixed by adsorption or the like, have a weak binding force with a solid, and the probe may be peeled off from the surface by heating.
[0005]
[Means for Solving the Problems]
In order to solve the above-mentioned problem, the probe was fixed to the solid surface and the probe arrangement was made a separate process. Thereby, a DNA probe can be produced uniformly on a solid surface. Since the probe can be immobilized by a covalent bond, it is resistant to heat and is suitable for removing nonspecific adsorption by heating. Using a fine particle as a solid for fixing the probe, and arranging them, a probe array having a desired compartment size is prepared. The target probe array can be easily produced by exchanging the arranged fine particles with the probe. The method of arranging these fine particles can be arranged by pinching with tweezers when the fine particles are about 0.3 mm in diameter, but it is difficult when the particle size is 0.1 mm or less. Therefore, a method and apparatus for producing a probe array by using a sheet having fine holes, holding and carrying fine particles in the holes, and arranging them in a capillary or a groove provided on a flat plate are provided. As another method, a probe array is formed by flowing fine particles one by one into a liquid flow while receiving them in a capillary. In this specification, “to make an array” means to form a probe array by arranging fine particles with probes in one or two dimensions. In addition, in order to improve the reproducibility of measurement, etc., a plurality of fine particles with probes are arranged for each probe to check inspection variations and so on to obtain highly reliable data.
[0006]
That is, the present invention provides the following (1) to (18).
(1) A probe array, wherein probes are fixed to a plurality of fine particles for each type of probe, and a predetermined number of the fine particles for a plurality of probes are collected to form an array.
[0007]
(2) Probes that immobilize probes on the surface of microparticles and arrange the immobilized microparticles one-dimensionally or two-dimensionally in an order determined for each type of probe to constitute a probe array of biologically relevant substances The probe array according to claim 1, wherein fine particles serving as markers are arranged at regular intervals.
(3) A probe array in which a plurality of fine particles are held in a probe array holder for each probe, and fine particles of different sizes are used as separation partitions in order to distinguish different types of probes.
[0008]
(4) In a method of arranging fine particles on which various probes are immobilized in a capillary or an optical cell in an arrangement determined according to the type of probe, a sheet having a hole larger than the fine particles, and the sheet is contacted to hold the capillary Or a probe capable of moving relative to a substrate having a groove, controlling the position of fine particles trapped in a hole in a sheet, and sequentially transferring the fine particles to the capillary or groove. Array fabrication method.
[0009]
(5) A step of spraying fine particles on which a single type of probe is immobilized on a holed sheet and dropping it into the hole portion, a step of removing excess fine particles that did not enter the hole, and a hole portion The method for producing a probe array as described in (4) above, wherein the step of transferring fine particles to a capillary or a groove is repeated.
[0010]
(6) A plurality of microparticles each immobilizing a plurality of different probes are held in different holes on the sheet, and transferred to a probe array holder or a capillary connected to the probe array holder in a predetermined order for each type. The method for producing a probe array according to (4) above.
[0011]
(7) In a method in which fine particles with immobilized probes are arranged in a capillary or an optical cell in an arrangement determined according to the type of probe, the fine particles are held in an introduction capillary and are controlled in the solution flow while controlling the fine particles one by one together with the solution. A method of producing a probe array by releasing and introducing into a capillary tube and holding various kinds of microparticles with probes in a predetermined order.
[0012]
(8) By finely holding the fine particles on which the probes are immobilized in different compartments for each type of probe, holding the fine particles in holes in the bottom of the compartments, and dropping them into a groove dug in another substrate plane A method of producing a probe array by arranging fine particles with probes in a predetermined order and then separately transferring them to capillaries, grooves or optical cells and at the same time concentrating the intervals.
[0013]
(9) An apparatus for producing a probe array, comprising independently means for immobilizing probes on a solid surface and means for arranging probes in a predetermined order.
(10) In a probe array manufacturing apparatus in which fine particles on which various probes are immobilized are arranged in a capillary or an optical cell in an arrangement determined according to the type of probe, a sheet having a hole larger than the fine particles, and a contact with the sheet The means for holding the capillary or relatively moving the substrate having the groove and the position of the fine particle trapped in the hole of the sheet are controlled and moved, and the fine particle is sequentially transferred to the capillary or the groove. And a probe array manufacturing apparatus.
[0014]
(11) A means for spraying fine particles on which a single type of probe is immobilized on a holed sheet and dropping it into the hole part, a means for removing excess fine particles not entering the hole, and a hole part. The probe array manufacturing apparatus according to (10), further including means for transferring fine particles to a capillary or a groove.
(12) Means for holding a plurality of microparticles each immobilizing a plurality of different probes in different holes on the sheet, and means for transferring them to a probe array holder or a capillary connected to the probe array holder in the order determined for each type The probe array manufacturing apparatus according to (10) above, characterized by comprising:
[0015]
(13) In a probe array manufacturing apparatus in which fine particles with immobilized probes are arranged in a capillary or an optical cell in an array determined according to the type of probe, the fine particles are held in an introduction capillary, and the fine particles are controlled one by one together with the solution. An apparatus for producing a probe array, characterized by comprising means for discharging into a solution flow, means for introducing into a capillary tube, and means for holding the introduced microparticles with various probes arranged in a predetermined order.
[0016]
(14) Means for dividing and holding fine particles on which probes are immobilized in different sections for each type of probe, means for holding fine particles in holes in the bottom surface of the sections, and grooves dug in another substrate plane An apparatus for producing a probe array, comprising: means for arranging fine particles with a probe in a predetermined order by dropping into a tube; and means for densely spacing the gaps while transferring them to a capillary, a groove or an optical cell.
[0017]
(15) A probe that is immobilized on the surface of a fine particle, and the immobilized fine particle is arranged one-dimensionally or two-dimensionally in an order determined for each type of probe to constitute a probe array of biologically relevant substances. An analyzer with an array.
(16) The analyzer according to (15) above, wherein the probe array is fixed to fine particles for each type of probe, and a plurality of the fine particles are collected to form an array.
[0018]
(17) One-dimensional or two-dimensionally distributed cells having holes capable of holding fine particles, walls defining at least each cell, and optically transparent members spaced at a distance smaller than the size of the fine particles Probe array consisting of a fine particle array holder.
(18) An analyzer using the probe array according to any one of (1) to (3) and (17).
[0019]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
The present invention will be described below with reference to examples. The present invention is common to probe arrays of DNA, RNA, proteins, peptides and other biological substances, but here, DNA will be described as an example.
[0020]
The DNA probe array according to the present invention may be held one-dimensionally in a capillary tube or may be held two-dimensionally in a narrow gap optical cell. This will be described using the example used. Although an example using spherical beads as the fine particles will be described, a rectangular or other shape may be used. The bead size can be used up to 1-300 microns, but here, an example using 20-micron beads will be mainly described. In addition, glass or plastic can be normally used as the material of the beads, but metal such as gold can also be used. Here, plastic was used.
[0021]
[Example 1]
FIG. 1 is an example of a probe array according to the present invention. The probe beads 105 holding the probe have a diameter of 20 microns, and the capillary 103 has an inner diameter of 25 microns. In this example, about 20 dummy beads 106 are arranged at both ends, and 999 beads are arranged inside thereof. Black marker beads 104 were inserted every 10 pieces, and the 100th piece was red. Since the number of marker beads 104 is 99, the number of probe beads 105 is 900. In other words, 900 types of probes can be arranged and inspected. When these are densely packed, they fall within a width of 2 mm, but considering the hybridization reaction, etc., they were held in a region of 5 mm with a somewhat rough density. The length of the region may be longer or shorter, but if it is too long, a large amount of sample is required, and if it is short, handling is troublesome, and a sample sufficient for sufficient hybridization may not be secured. The volume of the reaction zone is about 2.3 nl. Stoppers are placed at both ends to prevent beads from flowing out. The sample and the cleaning liquid are injected from the inlet 101 and discharged from the outlet 102. Even if the number of probes is 10,000, the length of the reaction region may be 20-30 mm, which has the advantage of being compact and easy to handle.
[0022]
The fluorescence detection apparatus used for this is as shown in FIG. 2 and is obtained by relatively scanning the laser beam 206 irradiated from the laser light source 209 via the mirror and lens 205 and the probe array holding capillary 202. Measure fluorescence. The relative movement is performed by adjusting the mirror and / or the probe array moving plate 203, and the detection position 204 is irradiated with the laser. Light emitted from the detection position 204 is detected by the detector 210 via the lens 205, the optical filter 207, and the lens 208, processed by the data processing and detector controller 211, and displayed on the display device 212. In the present invention, every 10 probe beads 201 contain marker beads, and the type of probe can be easily known according to the order of each bead. The marker beads may be color-coded for easy identification of the number, or the beads with probes instead of the marker beads may be colored so that the color changes every ten. In this case, it is necessary to employ a color having a wavelength that does not hinder fluorescence detection.
[0023]
[Example 2]
The following examples relate to a method and apparatus for arranging beads one by one in a capillary in a defined order. 3 and 4 show an example of a bead array manufacturing method and apparatus. For convenience of explanation, an example in which a bead array is formed on one capillary 306 will be described. However, in practice, a material in which a large number of holes and capillaries on a sheet are arranged is used. Step 1 (FIG. 3-a): Probe beads 304 (first probe beads) with a first probe are attached to a bead capturing hole 305 together with a solvent injected from a solution injection port 302 from a bead supply nozzle 309. It introduce | transduces in the cell which has a sheet | seat which has in a bottom face. When the beads are settled and the liquid is moved back and forth and left and right, one of the beads falls into the bead capturing hole 305. Step 2 (FIG. 3-b): The remaining beads are then removed from the outlet 301 with the solvent and washed. Only the beads 308 that fall into the holes 305 remain in the cell. In this case, the solvent is ejected from the direction perpendicular to the sheet toward the hole 305, the beads near the hole 305 are removed, and the beads taken into the capillaries in step 3 become only the beads 308 that have fallen into the holes. May be. The bottom surface of the hole is covered with the capillary holding substrate 307. An arraying capillary 306 is fixed to the capillary holding substrate 307. However, in steps 1 and 2, the capillary axis and the hole 305 do not coincide with each other, and the beads are held in the hole 305. Step 3 (FIG. 3-c): The capillary holding substrate 307 and the sheet are relatively moved so that the capillary axis and the hole 305 are aligned. The probe bead 1 is introduced into the capillary by applying suction from the other end of the capillary 306 or applying pressure from the solution side. In this case, the movement may be about the size of the hole 305, and it is convenient to use a pressure transmission element. Step 4 (FIG. 4-d): The capillary holding substrate 307 and the sheet are moved relative to each other so that the capillary axis is displaced from the hole again. Step 5 (FIG. 4-e): The beads with the second probe (second probe beads) are introduced into the cell, and one of the beads is dropped into the hole 305. Step 6 (FIG. 4-f): Excess beads other than the beads in the hole 305 are removed from the cell as in Step 2. Step 7 (FIG. 4-g): The capillary holding substrate 307 and the sheet are moved relative to each other so that the capillary axis matches the hole, and the second probe bead is introduced into the capillary 306. As a result, in the capillary 306, beads with a probe 1 (first probe beads) and beads with a probe 2 (second probe beads) are arranged. Repeat the same process to create a bead array with probes in the desired sequence. Reference numeral 303 denotes a cover plate, and 310 denotes a stopper.
[0024]
The capillary used here may be removed and used as a probe array holder at the time of measurement. Alternatively, a separately prepared probe array holder may be attached to the lower part of the capillary, and the bead array may be transferred there. Examples of the probe array holder include a capillary or a groove. Here, the probe array holder shown in FIG. 5 was used. A sample is injected from the inlet 403 at the left end in the figure. After sufficient hybridization, a washing solution is introduced from the inlet 403 and unreacted sample is removed from the outlet 402. The stopper 406 prevents the beads from being discharged. The fluorescence emitted by irradiating a laser beam to each probe bead 405 that is mounted on the measurement unit and arranged in the groove for bead arrangement 404 is detected. If the upper window 407 is made of a transparent member, detection is easy. Of course, instead of irradiating a laser to obtain fluorescence, light may be emitted using a chemiluminescent reagent and the light may be received. The detection may be anything as long as the presence or absence of hybridization is known.
[0025]
Although an example in which one capillary is fixed to a capillary holding substrate has been described here, a large number of probe arrays can be simultaneously formed using a plurality of capillaries. In this case, needless to say, it is necessary to increase the number of holes provided in the sheet according to the number of capillaries.
[0026]
[Example 3]
In this example, a solution containing probe beads placed in a titer plate is sequentially fed to a site (capturing site) with a sheet with holes in the order determined for each type, and arranged in a groove dug in a capillary or a flat plate. (Fig. 6). The probe beads 508 are sucked from the wells 503 of the titer plate 502 with the pipetter 501 and transferred to the bead holding wells 505 for transfer. The bottom surface of the well 505 has a capturing hole. One of the probe beads 508 injected into the capture site (a plurality when there are a plurality of holes) falls into the hole (509). Optically confirm that the beads have fallen into each hole. Next, a washing solution is poured to recover or remove excess beads. A valve 511 that can be driven by a piezoelectric element 510 or the like is provided between the bead capturing hole and the bead array arranging groove 507 or the capillary, and by moving this, the bead can be moved to the groove 507 or the capillary side. The actual movement uses liquid flow. The bead holder 504 with a hole may be moved so that the hole and the center of the groove 507 or the capillary coincide with each other, and the captured beads may be moved to the groove or the capillary. Move the valve 511 after the bead movement is completed, or shift the hole and capillary so that the bead can be captured in the hole. The next probe-attached bead is introduced into the capture site by the pipetter 501. Thereafter, the same process is repeated to prepare a bead array. The produced bead array is moved as it is or in a state where the arrangement is maintained in another container and used as a probe array. Reference numeral 506 denotes an arrayed probe bead, and 512 denotes a holding substrate.
Such an operation can be performed by a system having a plurality of holes, so that the time required for array fabrication can be shortened or a plurality of identical arrays can be fabricated simultaneously.
[0027]
[Example 4]
In Example 2, one cell was used at a time, and one type of probe bead was handled at a time. However, in this example, a plurality of types of probes are divided and held, and the production efficiency is increased. As shown in FIG. 7, a plurality of rectangular cells 603 are arranged on the rotating disk 601. The bottom surface of each cell 603 is provided with the same sheet with holes as in the first embodiment. The lower part of the rotating disk provided with the sheet is in contact with the substrate holding the capillary so that the beads captured in the holes do not fall. When the rotating disk 601 is moved so that the hole and the capillary axis coincide with each other, the probe beads are transferred into the capillary as in the previous example. There are as many holes as there are capillaries. The hole arrangement is matched to the capillary arrangement, but in order to prevent deviation during rotational movement, the block with capillary is moved in the direction of the rotation axis 602 of the rotary disk 601 using a tracking technique similar to that of the CD-ROM. A mechanism for adjusting is provided. In the examples, a rotating plate having a diameter of 16 cm was used. A cell having a width of 1 mm and a length of 30 mm is arranged at a distance of 5 cm from the center. The cell pitch is 2 mm, and about 150 cells can be made on the circumference. A sheet with holes is stretched on the lower surface of the cell, and the pitch of the holes is 2 mm. In this example, a total of 10 holes can be arranged to make a probe bead array on 10 capillaries at a time. Of course, the number of capillaries and the number of probe arrays that can be fabricated at a time can be changed as necessary. Reference numeral 604 denotes a bead holding hole provided in the cell 603.
[0028]
The rotating plate has two modes: a high-speed rotation mode and a mode that rotates slowly but with high accuracy. Place the beads with the solution in the cell. Shake the disc and drain the solution from the hole, dropping the beads into the hole. Next, a high-speed rotation mode is set, and surplus beads are moved to the bead reservoir at the cell tip by centrifugal force and the flow of the solution. The rotation is stopped and the probe bead 1 is set in the high-accuracy rotation mode so that it is in the position of the capillary. The shutter at the bottom is opened, the block holding the capillary tube is brought into contact with the rotating plate, and the beads are transferred into the capillary along with the flow of the solution. Next, the rotating plate is rotated in the high accuracy mode so that the cell including the probe beads 2 comes to the position of the capillary. Thereafter, the beads are sequentially transferred to the capillary, and a probe bead array is prepared in a predetermined order. Many probe beads can be held while being placed in the capillary by exchanging the disk or changing the probe beads in each cell and repeating the same thing. It is convenient to confirm the position of the probe in the produced probe bead array if the color of the beads to be put in the cell is changed every ten.
[0029]
[Example 5]
The following example relates to a method and apparatus for arranging probe beads one by one in a defined order using a liquid flow. FIG. 8 shows this outline. The probe beads 702 are transported from the bead solution reservoir 701 to the capillaries by a pump via the transfer pipe 703 and the sheath flow cell 704. The tip of the capillary is placed in the flow of the transfer liquid 705, and beads are discharged from the tip of the transfer capillary 706 one by one into the liquid flow. The beads are released into the liquid stream at a substantially constant time interval, and in order to stabilize the beads, the capillary 707 holding the beads is ultrasonically applied so that nodes can be formed along the capillary axis. . By controlling conditions such as the intensity of ultrasonic waves, beads are released one by one into the liquid flow at regular intervals. Reference numeral 708 denotes a holding substrate, and 709 denotes a solution discharge pipe.
[0030]
[Example 6]
In the examples so far, one bead is associated with one type of probe, but it is convenient to associate a plurality of beads with one probe in order to see variations in the hybridization reaction and increase detection sensitivity. The number of corresponding beads in each probe is not necessarily the same. In this case, it is necessary to put a sorting bead 803 having a different color or size as a mark between different probe beads 802. FIG. 9 is an example of this. The apparatus required for the production basically matches the above-mentioned one, but the inner diameter of the probe holding capillary 804 is made several times larger than the size of the probe bead 802 so that a plurality of beads are trapped in the hole. . The following operations are the same as before. Reference numeral 801 denotes dummy beads, and 805 denotes a solution discharge pipe.
[0031]
Note that the use of the flow system described in the previous example facilitates the production of a bead array. Pipette a small amount of beads from the bead reservoir and inject into the liquid flow. The number of injected beads cannot be determined, but can be sequentially stored in the capillary. Identify different probes and what type of beads are of interest by injecting colored beads or different size beads 803 as isolators before injecting different types of beads Can do.
[0032]
[Example 7]
The probe array manufacturing method of the previous example was an example of arranging in a capillary, but in FIG. 10, beads are arranged in a groove provided on a plane and the beads are densely used as a probe array. A method and apparatus for moving in and using as a probe array is disclosed. First, a bead array production holder 905 having a plurality of grooves on a plane is prepared. The probe beads 907 are arranged in the grooves 906 and the beads are moved while maintaining the arrangement in the capillaries or the like to produce a probe array. The probe beads 907 arranged in a plurality of grooves 906 are introduced into different capillaries 908, respectively. Used as a probe array. On the bead array production holder 905, a sheet 904 with a hole for trapping and holding the bead in the hole and moving it to the groove 906 is placed. As shown in FIG. 10, the sheet 904 with a hole has a groove (bead reservoir 902) of a narrow groove holding plate 901 made so as to be perpendicular to the groove 906 of the bead array production holder 905 and a bead opened at the bottom thereof. A holding hole 903 is provided. Although there are still a plurality of grooves, beads with different probes are injected into these grooves, and the different probe beads 907 for each groove are held in the holes. These two sheets or flat plates are used in close contact with each other, but can slide on each other. First, the positions of the holes 903 of the sheet 904 with holes and the grooves 906 of the holder 905 for producing the bead array are shifted. The probe beads 907 are replenished in the state where the probe beads 907 are divided into the respective grooves of the sheet 904 with a hole for each type of probe. One probe bead 907 enters the hole, but in this state, the bottom surface is closed and is held here. When the positions of the holes 903 of the sheet 904 with holes and the grooves 906 of the holder 905 for preparing the bead array are aligned, the beads fall into the grooves 906 one by one from the respective holes 903. Since each probe bead 907 falls into each groove 906 one by one, various probe beads 907 are held in each groove 906. The interval at which the beads are placed is substantially the same as the interval between the bead reservoirs 902 of the sheet 907 with a hole, and is 2 mm in this example. The total number of probe beads 907 dropped into the groove 906 of the bead array production holder 905 is 50 in this example. In addition, the number of bead arrays produced at the same time is 10, but can be increased as necessary. When the beads are dropped, the positions of the holes 903 of the sheet 904 with holes and the grooves 906 of the holder 905 for making the bead array are shifted again to make the grooves sealed, and the beads are guided to the capillary 908 together with the solution. When the number of types of probe beads 907 is increased, the above operation is repeated.
In the above embodiment, the probe bead array arranged in one dimension is disclosed, but it goes without saying that a probe array having more kinds of probes can be made by arranging a plurality of these or arranging them in two dimensions. .
[0033]
[Example 8]
In this embodiment, the probe bead array holder uses a cell composed of a plate with a hole and a cover glass distributed one-dimensionally or two-dimensionally. This is similar to a very small titer plate. As shown in FIG. 11, beads are collected from a titer plate containing probe beads 1004 using a small amount of micropipette and transferred to a hole (cell 1003) of the microtiter plate 1001. Reference numeral 1002 denotes a spacer. A bead array similar to a microtiter plate holding probe beads is made by matching the types of probes attached to the beads with the positions of holes on the plate. After the beads are inserted, a cover glass 1005 that is optically transparent and has no hindrance to fluorescence measurement or chemiluminescence measurement is covered to form a cell array. To detect. Between the cover glass 1005 and the wall defining each cell of the microtiter plate cell array, the beads are smaller than the bead size and the beads do not move relative to each other. The reaction solution and the like can freely move from the solution discharge port 1006 and the solution injection port 1007. In use, the cell is inverted so that the glass surface is on the bottom. In this case, regardless of the depth of the cell, the beads on the glass surface are in sufficient contact with the reaction solution, and the probe can hybridize with the target.
[0034]
【The invention's effect】
As described above, according to the present invention, peptide and DNA probe arrays can be easily produced in large quantities. By separating the process of fixing the probe to the solid surface and the process of arranging the probe, each can be optimized. For this reason, it is possible to make a fixed probe that is uniform and difficult to peel off from the solid surface, and it is possible to easily make an array having necessary types of probes by arranging them in a predetermined order. By reducing the size of the beads, it is possible to produce a fine probe array that is difficult to produce by conventional methods. By creating the necessary DNA probe, immobilizing it on the bead surface, and setting it on the production device, a probe array with a new configuration can be produced, so the user's desire can be provided at any time. By arranging a plurality of beads having the same probe, a statistical average can be obtained, and reproducibility, quantitativeness, etc. can be examined together, and a reliable measurement can be performed. In addition, the surface area is large, unlike a probe array using a flat-held DNA chip or the like, and the reaction can be carried out more rapidly and high sensitivity can be obtained. The bead size can be varied from 1 micron to 300 microns, so it can be easily made when a high density probe array is required. For example, if 6 micron beads are used, 1500 probes can be held per 10 mm capillary, and if a two-dimensional probe array holder is used, 1 million or more probes can be arranged per square centimeter.
It is very easy to produce a plurality of arrays having the same probe sequence at the same time, which is suitable for mass production.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a conceptual diagram of a probe array chip composed of probe beads arranged in a capillary.
FIG. 2 is a conceptual diagram of a detection system for measuring a probe bead array held in a capillary or the like.
FIG. 3 is a partial cross-sectional view of a bead arranging device.
a) Conceptual diagram of beads supply in an off-line state.
b) It is a conceptual diagram of the state which trapped the bead in the hole.
c) It is a conceptual diagram of the state which transfers a bead to a capillary etc.
FIG. 4 is a partial cross-sectional view of a bead arranging device.
d) Diagram with one bead held in a capillary
e) Diagram of the second probe bead dropped into the hole to capture it
f) Removal of excess beads
g) Diagram of introducing captured beads into a capillary
FIG. 5 is a conceptual diagram of a groove type bead arranging jig.
a) External view
b) Sectional view
FIG. 6 is a conceptual diagram of a bead array manufacturing method using a groove and a movable valve.
a) Conceptual diagram of the process of sucking beads from the reservoir of probe beads and arranging them in the groove
b) Cross-sectional view of device that captures beads one by one
FIG. 7 is a conceptual diagram of a disk-type probe bead transfer system.
FIG. 8 is a conceptual diagram of a liquid flow type bead array manufacturing method.
FIG. 9 is a conceptual diagram of a type of bead array in which a large number of probe beads are separated by segment beads.
FIG. 10 is a conceptual diagram of a probe bead arranging method using a sheet with holes.
FIG. 11 is a conceptual diagram of a microtiter plate type bead array holder. a) Conceptual sketch
b) Sectional view
c) Conceptual diagram during measurement
[Explanation of symbols]
101: solution and sample inlet, 102: outlet, 103: capillary, 104: marker beads, 105: probe beads, 106: dummy beads
201: Probe beads, 202: Probe array holding capillaries, 203: Probe array moving plate, 204: Detection position, 205: Lens, 206: Irradiation laser, 207: Optical filter, 208: Lens, 209: Laser light source,
210: Detector, 211: Data processing and detector controller, 212: Display device
301: Discharge port 302: Solution injection port 303: Cover plate
304: Probe beads, 305: Bead capture holes, 306: Capillaries for arrangement, 307: Capillary holding substrate, 308: Captured beads,
309: Nozzle for supplying beads, 310: Stopper
401: Probe array holder 402: Discharge port
403: injection port 404: groove for bead arrangement
405: Probe beads, 406: Stopper
407: Upper window
501: Pipetter, 502: Titer plate, 503: Well, 504: Bead holder with hole
505: Bead holding well, 506: Arranged probe beads, 507: Groove for bead array arrangement, 508: Probe beads, 509: Probe beads captured in holes
510: Piezoelectric element, 511: Valve, 512: Holding substrate
601: rotating disk, 602: rotating shaft
603: Cell, 604: Bead holding hole
701: Bead solution reservoir, 702: Probe beads, 703: Transfer tube
704: Sheath flow cell, 705: Transfer liquid, 706: Capillary tube for transfer
707: Capillary, 708: Support substrate
709: Solution discharge pipe
801: Dummy beads, 802: Probe beads, 803: Sorting beads, 804: Probe holding capillaries, 805: Sample flow path
901: Fine groove holding plate, 902: Bead reservoir, 903: Hole
904: Sheet with hole, 905: Holder for preparing bead array, 906: Groove, 907: Probe bead, 908: Capillary
1001: microtiter plate,
1002: Spacer, 1003: Cell, 1004: Probe beads, 1005: Cover glass, 1006: Solution outlet, 1007: Solution inlet,
1008: Laser light, 1009: Lens, 1010: Detector

Claims (9)

表面にプローブを固定化した固定化微粒子を前記プローブの種類ごとに決められた順序で配列させ、マーカーとなる微粒子を前記決められた順序の間に一定間隔で配置したことを特徴とするプローブアレー。  A probe array in which immobilized microparticles having probes immobilized on their surfaces are arranged in a predetermined order for each type of probe, and microparticles serving as markers are arranged at regular intervals between the predetermined orders. . 前記マーカーとなる微粒子は、有色ビーズであることを特徴とする請求項１に記載のプローブアレー。  2. The probe array according to claim 1, wherein the fine particles serving as the marker are colored beads. 表面にプローブを固定化した複数の微粒子を、大きさの異なる微粒子を分離隔壁として用い、前記プローブの種類ごとに区分して保持することを特徴とするプローブアレー。  A probe array characterized in that a plurality of fine particles having probes immobilized on their surfaces are classified and held for each type of probe using fine particles having different sizes as separation partitions. 種々のプローブを固定化した微粒子を穴を持つシートを用いて捕捉し、溝を有する基板もしくはキャピラリーと前記シートとを相対的に移動させ、前記穴に捕捉された微粒子を前記溝もしくは前記キャピラリーへ移送し、前記微粒子を前記プローブの種類に従って決められた配列で並べることを特徴とするプローブアレーの作製方法。  Fine particles on which various probes are immobilized are captured using a sheet having holes, the substrate or capillary having grooves and the sheet are relatively moved, and the fine particles captured in the holes are transferred to the grooves or capillaries. A method for producing a probe array, comprising transporting and arranging the fine particles in an array determined according to a type of the probe. １の種類の前記プローブを固定化した複数の微粒子を、前記シート上に供給して前記穴に移送する工程と、前記穴に入らなかった微粒子を除去する工程とを有することを特徴とする請求項４に記載のプローブアレーの作製方法。  The method includes a step of supplying a plurality of fine particles on which one kind of the probe is immobilized onto the sheet and transferring the fine particles to the hole, and a step of removing the fine particles that have not entered the hole. Item 5. A method for producing a probe array according to Item 4. プローブを固定化した微粒子を前記プローブの種類ごとに異なる区画に保持する工程と、前記区画の壁面に設けられた穴に前記微粒子を保持する工程と、前記穴に保持された微粒子を基板に設けられた溝に移送させ、前記微粒子を定められた順序で配列させる工程とを有することを特徴とするプローブアレーの作製方法。A step of holding fine particles with immobilized probes in different compartments for each type of probe, a step of holding the fine particles in holes provided in the wall surfaces of the compartments, and providing fine particles held in the holes on a substrate And a step of transferring the fine particles to a groove and arranging the fine particles in a predetermined order. 種々のプローブを固定化した微粒子を捕捉する穴を具備するシートと、A sheet having a hole for capturing fine particles having various probes immobilized thereon;
前記微粒子を納めるための、溝を有する基板もしくはキャピラリーと、A substrate or capillary having a groove for containing the fine particles;
前記溝を有する基板もしくは前記キャピラリーと前記シートとを相対的に移動させる手段とを有することを特徴とするプローブアレーの作製装置。A probe array manufacturing apparatus comprising: a substrate having the groove or means for relatively moving the capillary and the sheet. １の種類の前記プローブを固定化した複数の微粒子を、前記シート上に供給する手段と、前記穴に入らなかった微粒子を除去する手段とをさらに有することを特徴とする請求項７に記載のプローブアレーの作製装置。8. The method according to claim 7, further comprising: means for supplying a plurality of fine particles on which one kind of the probe is immobilized onto the sheet; and means for removing the fine particles that have not entered the hole. Probe array production equipment. 壁面に穴を設けられ、かつプローブを固定化した微粒子を前記プローブの種類ごとに保持する複数の区画を具備する容器と、A container provided with a plurality of compartments each having a hole provided in the wall surface and holding the fine particles to which the probe is immobilized for each type of the probe;
壁面に穴を設けられ、かつ前記容器から移送した前記微粒子を納める微粒子保持容器と、A fine particle holding container which is provided with a hole in a wall surface and stores the fine particle transferred from the container;
前記微粒子を定められた順序で配列して納めるための溝を有する基板もしくはキャピラリーとを有し、A substrate or a capillary having a groove for arranging and storing the fine particles in a predetermined order;
前記穴は前記微粒子を捕捉し、前記穴に捕捉された微粒子は前記溝もしくは前記キャピラリーに移送されて前記順序で配列することを特徴とするプローブアレーの作製装置。The probe array manufacturing apparatus, wherein the holes capture the fine particles, and the fine particles captured in the holes are transferred to the grooves or the capillaries and arranged in the order.
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