JP3738910B2 - Hybridization-ligation analysis to detect specific nucleic acid sequences - Google Patents
Hybridization-ligation analysis to detect specific nucleic acid sequences Download PDFInfo
- Publication number
- JP3738910B2 JP3738910B2 JP52554895A JP52554895A JP3738910B2 JP 3738910 B2 JP3738910 B2 JP 3738910B2 JP 52554895 A JP52554895 A JP 52554895A JP 52554895 A JP52554895 A JP 52554895A JP 3738910 B2 JP3738910 B2 JP 3738910B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- probe
- ligation
- sequence
- label
- target
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6813—Hybridisation assays
- C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
- C12Q1/6823—Release of bound markers
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
- C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
- C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
- C07K14/4712—Cystic fibrosis
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6813—Hybridisation assays
- C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
- C12Q1/682—Signal amplification
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6813—Hybridisation assays
- C12Q1/6827—Hybridisation assays for detection of mutation or polymorphism
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/6862—Ligase chain reaction [LCR]
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Pulmonology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Description
発明の背景
遺伝子プローブ技術は、遺伝病の発症を予測したり臨床的現状を診断するのに重要な分析手段となっている。しかしながら、現在用いられている技術は、遅くて面倒であり、また、有害な化学物質を使用するものである。遺伝子プローブの分野で採用されている幾つかの手法については、最近Plaha等が検討している(14 Biotechniques 566, 1993)。現在行われている遺伝子プローブ技術は、一般に、電気泳動法を使用するものであり、多くの場合、長いポリアクリルアミドゲル上で実施される。実験者が接触する化学物質の幾つかは有害なものと考えられる。すなわち、アクリルアミドモノマー(その幾分かはポリマーゲルに残存することがある)は神経毒があると考えられている。ポリアクリルアミドゲルによる電気泳動は一般に数時間を要し、他方、Plahaに記載されている新しいゲルを使用する分析では単一の泳動実験に16時間を要する。その他の技術としては放射性マーカーを使用するので、特別の取扱い管理と廃棄技術が必要である。さらに、現行の方法は、その他の点においても比較的長時間の操作が必要となる。(例えば、サザンブロット法は終了するまで約48時間を要する。)
さらに、電気泳動は、それ自身、不確定な結果をもたらす可能性がある。先ず、エチジウムブロミドを用いる技術はそれほど感度が高くない場合が多い。第二に、いろいろな遺伝子断片を確実に分離できる条件を見出さなければならない。第三に、得られる結果は、殆どの場合、定性的なものであり、定量的なものではない。さらに、サイズが同じか類似しているが配列が1塩基だけ異なっているようなDNAフラグメントを区別することはできないことも、従来の手法の有用性に限界を与えている。
DNAをベースとする分析に固有の感度上の限界は、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によって克服し得る。PCRにより特定の配列を増幅することにより、極度に少量しか存在しない当該配列を検出することが可能となる(Saiki他、Science 1350, 1985)。このPCR法は、DNA配列を増幅して、PCRが利用できるようになる前に存在していた感度上の限界を克服できるものではあるが、PCRの使用には依然として多くの問題が伴う。PCR反応の生成物は、プライマー・ダイマーおよび非特異的プライミングにより人為構造を含んであり、特にサンプル中にターゲット配列が存在しない場合にこれが生じる。感度が鋭敏であるので、PCRは不純物による誤った陽性結果をもたらす可能性がある。PCR法そのものは、遺伝病(例えば、嚢胞性線維症)に存在しているような点突然変異のような配列間の僅かの相違を簡単に識別できるものではない。これらの限界があるため、PCRによる増幅後に特定のターゲット配列が存在していることを確認できることが所望される。これまでの研究者は、各種のゲル上でのサンプルの分析に対する前駆手段としてハイブリダイゼーション(hybridization)法とライゲーション(ligation)法を用いてきた。(Landegren他、24 1 Science, 1077, 1988参照)。しかしながら、これらの方法は、遅くて不便であり、自動化装置に簡単に使用できるものではない。
DNA配列分析用の現行の技術の欠点をなくし、より迅速でより正確な結果を与える新規な分析法がこのたび開発された。この新規な技術は、PCRと併用して、遺伝子プローブ分析における精度を向上させることができる。
【図面の簡単な説明】
図1:デルタF−508対立遺伝子(アレル)および正常対立遺伝子の検出に用いたプローブ分析フォーマット。
図2:PCRにより増幅されたヒトDNAの9つのサンプルにおけるデルタF−508対立遺伝子および正常対立遺伝子の同時分析に関するHLMの結果。デルタF−508対立遺伝子に特異的なプローブはDMAEでラベルし、正常対立遺伝子に特異的なプローブはLEAEでラベルした。
図3:デルタF−508およびデルタI−507変異部位近傍におけるCFTR遺伝子のエクソン10の配列の一部。下線を施した配列は、常磁性粒子上に固定化したプローブ(PMP.508またはPMP.507)およびアクリジニウムエステルでラベルしたプローブ(508.NORまたは507.NOR)に相補的である。
図4:デルタF−508分析およびI−507分析用プローブと各種対立遺伝子との間で作成したハイブリッド。
図5:PCRにより増幅されたヒトDNAの9つのサンプルにおけるデルタI−507変異の検出に関するHLM結果。
図6:CRにより増幅されたヒトDNAの3つのサンプルについて行った、正常、デルタF−508およびデルタI−507対立遺伝子の存在に関するHLM分析。
図7:同時ハイブリダイゼーション−ライゲーションプロトコールに従いTaqDNAリガーゼを用いて、PCR増幅ヒトDNAの3つのサンプルについて行った、正常、デルタF−508およびデルタI−507対立遺伝子の存在に関するHLM分析。
図8:G542X対立遺伝子と正常対立遺伝子のHLMによる識別。
図9:HLMによるデルタF−508変異とG542X変異の同時検出。
図10:32P−G551D.NORまたは32P−G551D.CFを用い200mM NaClでT4 DNAリガーゼを使用したHLMによる正常配列、G551D配列、G551S配列およびQ552X配列の識別。
図11:32P−G551D.NORおよび32P−G551D.CFを用い600mM NaClでT4 DNAリガーゼを使用したHLM。
図12:32P−G551D.CFまたは32P−G551D.NORを用い200mM KClでTaq DNAリガーゼを使用した正常、G551D、G551S、およびQ552X配列の識別。
図13:Taq DNAリガーゼを使用し塩の条件を変化させた場合におけるG551Dの分析の比較。
図14:ライゲーション特異性を系統的に検討するためのp53モデル。上の配列は、ターゲットの配列(p53遺伝子のコドン175の両側にある領域)である。プローブの配列は下に示す。“X”および“Y”としるした位置を系統的に変化させ4種類のヌクレオチドとした。
図15:PCR増幅サンプルのデルタF−508分析について計算したライゲーション百分率。
図16:PCR増幅ヒトDNAの遺伝子型に関してHLMから計算したライゲーション百分率の相関関係。誤差バーは99%信頼区間を表す。
図17:デルタF−508プローブを用いT4 DNAリガーゼによるデルタF−508配列とデルタI−507配列との識別能をNaCl濃度の関数として示したもの。
図18:T4 DNAリガーゼおよびTaq DNAリガーゼを用いる5′(2)および3′(2)ミスマッチの識別能をライゲーション百分率として示したもの。
図19:いろいろな塩基対について3′(1)ミスマッチの識別能をライゲーション百分率として示す。T4 DNAリガーゼの濃度が2つの異なる場合について(1nMおよび240nM)、データを示している。
図20:いろいろな塩基対について5′(1)ミスマッチの識別能をライゲーション百分率として示す。T4 DNAリガーゼの濃度が2つの異なる場合について(1nMおよび240nM)、データを示す。
発明の詳細な説明
この新規な技術は遺伝子プローブ分析用に開発されたものである。DNA分析のこの最初の段階は、一般に、目的の配列を増幅するための増幅技術(例えば、PCR)を含む。当然のことであるが、分析サンプル中に充分量の未知配列が存在している場合には、増幅が必要でないこともある。増幅工程の後、ハイブリダイゼーション−ライゲーション法(HLM:hybridization ligation method)を用いて増幅生成物の同定を行う。遺伝子配列の同定を助けるために容易に分離できる粒子(例えば、磁性粒子)を、識別性(標識となる)部分(例えば、アクリジニウムエステルのような発光性マーカー)とともに使用する。
同定すべき配列の量が充分でない場合には、当該技術の最初の部分において目的の配列を増幅するための増幅法が含まれる。PCR法はここ数年来知られている。例えば、Saikiらは、β−グロブリンのゲノム配列に対する酵素的増幅技術について記述しており、該技術では、増幅すべき領域の両側に2種類のオリゴヌクレオチドプライマーを設け、変性されたゲノムDNAの鎖にこのプライマーをアニーリングし、そして、大腸菌またはThermus acquaticus由来のDNAポリメラーゼおよびデオキシリボヌクレオチド三リン酸を用いて伸長させ、この変性、アニーリングおよび伸長から成るサイクルを繰り返している(Saiki他,230 Science 1350, 1985;Saiki他,239 Science 487, 1988)。最近、各種の増幅技術が開発されており[例えば、リガーゼ連鎖反応(LCR)やQβレプリカーゼ]、これらの増幅技術のいずれかを、PCRの代わりに、または、その他の増幅技術の1種またはそれ以上と組合せて用いることもできる。さらに、これ以外の増幅技術が開発されることも期待される。増幅に用いる厳密な技術は本発明にとって重要ではなく、遺伝子プローブ法における当業者であればここで用いる技術全般およびそれぞれの技術の利害得失について熟知しているものと推察される。重要な事実は、比較的少量のDNAサンプルが増幅されることにより、ここで用いる分析法の感度が通常よりも高くなるということである。
PCR法は一般に上述したような手法を含んでいる。この基本的技術に対して当業者に知られているような多くの変形があり、例えば、「PCRプロトコール(PCR Protocols)」[Innis(MA),Gelfand(DH),Sninsky(JJ),およびWhite(TJ)編集、Academic Press社発行,1990]に記載されている。PCR反応がどのように実施されるかの1つの例は、本明細書の実施例において詳述している。
増幅サンプルが入手できれば、該材料はHLMによって分析される。HLMにおいては、ターゲット配列に部分的または全面的に相補的な配列が、2種類またはそれ以上のプローブに導入され、該プローブがターゲットオリゴヌクレオチドと反応させられる。本明細書では多くの場合、2種類のプローブのみを用いる場合について検討するが、後述するように2以上のプローブを用いることもできる。該相補的配列の一部分は、反応混合物から容易に分離することのできる不溶性の物質(材料)に結合される。例えば、磁性粒子が用いられる。他の可能な物質としては、遠心操作により反応混合物から分離されることのできる物質が挙げられる。一方、該相補的配列の第二の部分は、分析手段により検出されることのできる物質(材料)に結合される。例えば、アクリジニウムエステルのような化学発光性物質が用いられる。他の例は、蛍光団や発色団である。これら2種類の相補的配列がターゲット配列にハイブリダイズされる。ハイブリダイゼーション溶液は塩を含有するが、これは、一般的には約500〜700mMのNaClであり、約600mMの濃度が最も好ましい。ハイブリダイゼーションは温度を上昇させて(例えば、45℃)実施される。ハイブリダイゼーションの後、プローブのうちの1つの不溶性を利用して、ラベルを有する非ハイブリダイズ化プローブからハイブリダイズされたものを分離する。その後、リガーゼを用いて、それらのプローブの2つの相補的配列が、該2つのプローブの結合部に隣接した領域において、ターゲットに正確にマッチング(適合)していれば、それらの端部核酸は互いに充分に近くにありリガーゼにより連結される。他方、ターゲット配列が予測された配列とかなり違っていれば、それらのプローブ上の端部核酸は互いに充分に離れており、その結果、リガーゼによって結合されることはできない。例えば、もしターゲットが、2種類のプローブが出会う場所においてヌクレオチド欠失していれば、一方のプローブ上の端部ヌクレオチドは他のプローブとオーバーラップし2種類のプローブはライゲーション(連結)されない。同様に、ターゲットに挿入ヌクレオチドがあれば、2種類のプローブは互いに充分に近接せずライゲーションが生じない。さらに、2種類のプローブが出会う位置でミスマッチが存在すれば、本明細書で説明するような条件下で2種類のプローブは効率的にライゲーションされない。
プローブ類の端部塩基がターゲットに結合したり結合し損なったりすることに応じてライゲーションは上述したように進行するが、当業者であれば、そのような端部から離れた位置においてプローブ上にミスマッチがあることもターゲットへのプローブの結合に何らかの影響を与えることに気がつくことであろう。例えば、端部塩基から数塩基離れた位置にあるプローブ上の塩基がターゲット上の対応する塩基に結合できない場合に、プローブとターゲットとの間に、端部プローブをライゲーションさせないような充分な不整合が生じないこともある。プローブとターゲット間の立体的な因子や全体的な結合性が、ターゲットの組成を決定するのに際して本手法の全体的な有効性に影響を与えるのである。これに対して、プローブの連結部から離れた不整合は、2種類のプローブがライゲーションされないような大きな影響を与え得る。後述の実施例は、プローブの連結部から2塩基分離れた部位における不整合が、プローブのライゲーションを充分に妨げる場合を示す。
同様にして、正常配列の一部にハイブリダイズしライゲーションすると期待できるような幾組かのプローブを用いることにより、ターゲットが変異(突然変異:mutation)を含有するか否かを決定することができる。ハイブリダイゼーションまたはライゲーションが起こらないことが見いだされたならば、調べているターゲット部分におそらく変異が生じているものと結論することができる。ターゲットの隣の部分に移動することにより、同様の実験を行うことができる。このようにして、ターゲットに沿って逐次的に移動することにより、変異が見いだされるターゲット上の単一または複数の部位を決定することができ、また、さらに進んで、各変異部位において発生した正確な変異を同定できる実験を設計することができる。
ライゲーションは、反応の特異性を確保できる条件下において実施される(後述の実施例参照)。入手できる多くのライゲーション用試薬の中の1つを用いてライゲーションは行われ、そのようなライゲーション試薬は、一般的に化学的または酵素的作用によりライゲーションを達成する。本発明において用いる条件と従来技術との間の重要な相違の一つは、かなり高い塩濃度によりライゲーション特異性を確保できることを見出したことである。従来より用いられた塩濃度(200mM NaCl)では、ミスマッチのあるプローブのライゲーションを起こしてしまうことが見出されていた。本発明においては、高い塩濃度を用いることにより、予測されないような特異性の向上が見られた。例えば、T4 DNAリガーゼを用いてきわめて特異性の高いライゲーションを得るためには、塩濃度は、典型的には約500から700mM NaClであり、約600mMの濃度が好ましく、また、約1000mMまでの濃度が使用可能である。
ライゲーション工程を各種に変更して実施することも可能である。例えば、多くの異なるライゲーション用試薬を用いることもでき、実施例ではT4DNAリガーゼとTaq DNAリガーゼを使用する場合を示している。さらに、Taqリガーゼ緩衝液に、反応の感度を増加させるような他の成分を含有させることが好ましいこともある。例えば、tRNAを含有させると、ラベル化プローブの非特異的結合によって起こされるバックグランドシグナルが減少されることが見出された。
ライゲーション工程を実施した後、変性工程により、ターゲット配列をプローブの配列から分離し、また、ライゲーション生成物を非ライゲーションプローブから分離する。次いで、遠心分離、磁場の付与またはその他の適当な手法により、不溶性物質に結合されていた物質を反応混合物から分離することができ、そして、リガーゼの作用により不溶性物質に結合したラベル(標識物)の存在を知ることができる。ここで開示した構成成分を用いれば、クロマトグラフィや電気泳動以外の手法を用いてターゲット物質の分離を行うことができる。かくして電気泳動またはクロマトグラフィが用いられていた場合よりも迅速に本方法を実行できる。更に、この検出技術は、放射活性、蛍光または発光を測定するなどにより定量性において優れている。後にラベル(標識体)を添加することのできる一般的に利用できるその他の検出法を用いてもよい。例えば、プローブにビオチンを化学的に結合させることもでき、そして、プローブの分離後、アビジンまたはストレプトアビジンに結合しているラベルをそれと反応させることにより、検出可能なラベルに結合されたプローブを構成することができる。第三に本発明の技術は、自動化装置の幾つかに利用することもでき、そのような装置の例としては、Ciba Corning Diagnostics社(米国マサチューセッツ州、Medfield)によって製造されているACS180装置がある。
ターゲットの配列に関する知見を得るのに本技術を変形して使用することもできる。変性後に不溶性のプローブにラベルが結合していないことが見出された場合には、未だ変性を行っていない反応混合物からの別のアリコートを分析してもよい。このサンプルでは、不溶性マーカーを分離し(例えば、磁場を付加したり遠心分離を行う等による)、ターゲットを分析してマーカープローブがターゲットに結合しているか否かを決定することができる。このような場合には、ターゲットに対する2種類のプローブがハイブリダイゼーションしていることによりターゲットポリヌクレオチドの大部分の配列を予知することができ、そして、更なる実験を工夫することによりターゲットの当該領域(例えば、ライゲーション点近傍)における配列を確認することができる。
別の方法として、ライゲーション後にサンプルを変性させ、次いで固相を分離することにより同様の分析を行うこともできる。この手法では、分離した固相と上澄液(上清)の両方を分析してラベル化されたプローブが存在しているか否かを決定する。ラベルの大部分が上澄液のみに見出される場合には、プローブのライゲーションは生じなかったと結論することができ、予定していたライゲーション点におけるミスマッチ(不適合)を示唆している。しかしながら、ラベル化プローブはターゲットに結合性となっていたので、結論づけられることは、ターゲットは所期の配列もしくは所期に近い配列を有していたということ、またはラベル化されたプローブはターゲットにハイブリダイズしていなかったということである。したがって、ライゲーションが起こらなかったとしても、ターゲットの配列に関する多くの推測が可能となる。さらに、上澄液中および固相上のラベルの総量は、分析サンプル中のターゲットの合計量に近似しているはずである。ライゲーションを受けたラベル化プローブのパーセントは、サンプルの同型(ホモ)接合性または異型(ヘテロ)接合性を示唆することになる。さらに、固相上のラベルの溶液中のラベルに対する比率から、プローブ上の配列に関する更なる知見、例えば、遺伝子物質の一部が複製されている(例えば、fragile X)ような病気の存在に関する知見を得ることができる。これらの分析を実施するに当たっては、データは理論的に予測される値に正確に一致するものではないことに留意すべきである(すなわち、ホモ接合性サンプルについて固相中に100%のラベルは見出されない)。(後の実施例参照。)
かくして、特定の部位に変異が生じる可能性があることがわかれば、特異的なプローブを作成してターゲットの配列を確認することができる。1つの部位に数種の変異の可能性がある場合には、数種のプローブを設計して各プローブに異なるラベルを施し、正常な配列であるか、または、変異配列であればどの変異が生じたかを決定することもできる。同様にして、1つのターゲット配列内の互いに近傍付近に生じている複数の変異を判断することもできる。さらに、このように2種またはそれ以上の異なるラベルが付与されたプローブを用いる手法は、上述のfragile Xのように多重型のターゲットが予想される場合にも適用することができる。
同一の分析内で用いる2種の異なるラベルとしては、例えば、蛍光性ドナーと蛍光性アクセプターの対が挙げられる。この場合、照射光を変化させることにより、2種のラベルを用いて3つの可能性を区別することもできる。もし第1のプローブに対する照射光が第1のラベルに典型的な蛍光を生じれば、第1のターゲットのみが存在していることを示すことになる。もし蛍光出力が第2のラベル由来のものであれば、2つのターゲットのいずれかが存在していることになる。もし第1のラベルを励起する照射光が第2のラベル由来の蛍光を生じれば、双方のターゲットが存在していることを示す。他方、第2のラベルを励起する照射光のみが第2のラベル由来の蛍光を生じれば、第2のターゲットのみが存在していることになる。
例えば、嚢胞性線維症の変形には1つの近傍域に多重変異が見出されている。例えば、デルタF−508およびデルタI−507変異は、いずれも3塩基対が欠失したものであり、これらの変異の位置は、CFTR遺伝子配列内で部分的にオーバラップ(重複)している。[CFTR遺伝子の配列については、Zielenski他による(10 Genomics 214, 1991)を参照されたい。]
この配列をカバーするPCR増幅生成物をポリアクリルアミドゲル電気泳動により分析しても、これらの2つの変異を簡単に分離することはできないと考えられ、それは生成物が同じ大きさを有しているからである。しかしながら、HLMによればこれらの変異は区別される。また、CFTR遺伝子のエクソン11は、塩基1756におけるG542X変異(配列番号 11参照)や塩基1784におけるG551D変異(配列番号 16参照)を含む多くのCF変異部位を含有している。これらの変異部分をカバーする配列に単一のPCR増幅を行った後、HLMにより双方の変異の存在または不存在を簡単に確認することができる。
HLM法とリガーゼ連鎖反応(LCR)との間には幾つかの類似点もあるが、実際にはこれらの技術には大きな違いがあることに留意すべきである。LCR自体は、すでに知られた増幅法である。例えば、WuおよびWallaceによる“4 Genomics 560, 1989,”さらにはBaranyによる“88 Proc. Nafl. Acad. Sci. USA 189, 1991”を参照されたい。LCRにおいては、増幅しようとするターゲット遺伝子の1断片の各鎖に相補的な2つの部分をもつオリゴヌクレオチド(2つの部分が一緒になってターゲット遺伝子全体に相応する)をリガーゼとともに、増幅すべき遺伝子サンプルに添加する。添加してオリゴヌクレオチドがターゲット遺伝子に相補的であれば、リガーゼが2つのオリゴヌクレオチドを連結する。LCRは増幅法の1つであり、この手法においては、増幅すべき配列が分かっており、ターゲットに相補的なフラグメントを反応混合物に添加することが可能であり、この結果、リガーゼが添加されたときに、ライゲーションが起こりターゲットが増幅される。LCRは数サイクル繰り返すよう意図されたものであり、これにより、所望の配列を大量に得ることができる。
これに対して、HLMは分析のための手法であり、ターゲットに見出される可能性のある1種以上の予測配列に対するプローブがターゲットに添加される。プローブは、反応混合物からの分離を助ける物質、またはラベルに結合される。さらに、反応は単一回のみ実施するよう意図されている。
HLM法には多くの変形が可能である。例えば、この検出法をカラムクロマトグラフィーと組み合わせることもできる。この手法では、オリゴヌクレオチドプローブの1つは、カラムクロマトグラフへの付着を引き起こすような置換基を含有する。例えば、プローブの1つをビオチン化すれば、ライゲーション後の生成物がアビジン−セファロース上に分離される。他のオリゴヌクレオチドとして蛍光性マーカーを含有するようにしてもよい。このようにすれば、カラムクロマトグラフ中をサンプルが通過すると、ライゲーションされたオリゴヌクレオチドはクロマトグラフに付着して蛍光性となる。したがって、カラム内で蛍光があれば、ライゲーションが起こったことを示すことになる。カラムクロマト法に上述した蛍光性ドナー/アクセプター対を使用することもできる。
他の変形においては、プローブが結合される部分(moiety)が関係する。第1のプローブがライゲーション後のプローブの分離を可能にする部分(分離性部分)に結合され、第2のプローブがラベルとなる部分に結合されるのが殆どの場合であるが、2種類のプローブを他の部分、例えば他の配列に結合させることも可能である。例えば、Qβレプリカーゼ法を採用している場合には、ミディバリアント(midivariant)配列を有する2成分にプローブを結合させることもできる。この場合には、該ミディバリアント配列の第1の部分(例えば、ミディバリアントA)に第1のプローブを結合させ、ミディバリアントの第2の部分(ミディバリアントB)に第2のプローブを結合させる。ライゲーション工程後、Qβレプリカーゼによる反応中に複製が観察されれば、2種類のプローブがライゲーション(連結)されたことになる。それらのプローブがライゲーションされたということは、該プローブはターゲットとして同じ配列を有するということである。
本発明の方法の別の変形は、アクリジニウムエステルのような特定の発光性(ルミネセンス)ラベルを使用するときのフラッシュ剤(発光剤)を添加するタイミングに関係する。ライゲーションした後のプローブを変性し分離した後、フラッシュ剤を添加する前にDNAaseを添加することができる。このようにすれば、フラッシュ剤が添加されたときに発せられる光量を不溶性プローブが干渉することもあるので、高感度のテストが可能となる。したがって、フラッシュ剤の添加前に不溶性プローブを分離することにより、特異性のより高いシグナルを発生させることができる。
さらに別の変形は、使用するプローブの数に関係する。好ましい手法は、2種類のプローブ、すなわち、分離を促進するプローブと検出を促進するプローブを使用することであるが、2種類以上のプローブを使用することもできる。この場合には、プローブの1つが分離性部分(moiety)を含有し、別の1つが検出用部分を含有する。分離性部分が一方の末端プローブ上にありラベル(検出用)部分が他方の末端プローブ上にある場合には、その間のプローブがラベルを含有する必要はなくなる。この実験においては、ライゲーション後、ラベル用プローブが分離性プローブに結合されれば、その中間のプローブもターゲットにハイブリダイズされることになる。その理由は、もしそうでなければ、ラベル用プローブは分離性プローブを含むプローブ部分にライゲーションされないからである。多数プローブ実験の他の変形においては、1つのプローブが分離性部分を含有しその他のプローブは全てラベル化されているようにする。この場合には、ライゲーション後、分離性部分に結合したラベルの量が、全てのプローブがライゲーションされたか否かを示すことになる。2種類よりも多くのプローブを用い、前述したような変形態様(例えば、ライゲーションを実施したりまたは実施しない分析、変性前の分析など)と組み合わせることにより、いろいろな形態の分析が可能となることはこの分野の当業者には明らかであろう。
さらに、分離性部分または検出用部分の位置を変えることもできる。それらはプローブの末端部にあるのが好ましいが、ハイブリダイゼーションおよびライゲーションを妨げない限り、プローブの任意の位置に結合させることもできる。
本発明に従う新規な手法のさらに別の利点は、互いに密接な関係にある2つの変異(例えば、隣接したヌクレオチドにおいて起こる変異)を区別することができるようになったことである。
本発明の他の利点は、同一の実験において異なるプローブに異なるマーカーを用いることができることである。かくして、例えば、各プローブに別異のマーカーを使用し、考えられる2つの変異のうちの1つを1回の試験で確認することができる。マーカーは両者ともサンプルから分離することができ、例えば、異なる吸収スペクトルを介して両者を区別することができる。さらに、異なる不溶性粒子を使用することにより、分析前に2種類のプローブを互いに分離することができる。例えば、一方のプローブは不溶性で非磁性の粒子に依るようにし、他方のプローブに不溶性で磁性の粒子を使用すれば、先ず磁場を付与して磁性粒子とそれに結合されたマーカーを取り除くことができ、そして、残存液を遠心分離すれば、非磁性の不溶性粒子をそれに結合されたマーカーとともに除去することができる。このような分離法のその他の変形は当業者には明らかであろう。かくして、このような2種類のマーカーは、同じラベルを有する場合であっても互いに区別することができる。分離と検出の両方に利用できる手法の変形を1つの実験において組み合わせることにより、数種の変異や遺伝子変異の1つが存在することを1つの実験で確認することが可能となる。例えば、磁性粒子(M)を幾つかのプローブに使用し、非磁性粒子(NM)をその他のプローブに使用する;そして、プローブ中の第2のオリゴヌクレオチドの幾つかに化学発光性物質Aを使用するとともに、残りに化学発光性物質Bを使用する。このようにすれば、わずかにこのような2つのパラメータを変化させることにより、1つの実験で4つの変異を検出することができる。(すなわち、この場合、プローブに対する付加物は、M−A,NM−A,M−B,NM−Bとなっている。)異なるマーカーを有し互いに分離されることのできる粒子(すなわち、異なるスペクトル特性またはその他の特性を有するもの)を用いることにより、1つの実験で多くの遺伝子変異を検出することも可能となる。
本発明の新規な手法の別の利点は、この手法は従来の手法よりも高感度であるということである。このように感度が増加したのは幾つかの因子による。例えば、ターゲット物質の存在を確認する分析法が高感度である。不溶性粒子を分離しそれに結合したマーカーを分析するという手法は、各構成成分を分離しなければならず、ターゲットの存在を定性および定量分析するのに染色に依存するという電気泳動法を用いる方法よりもはるかに高感度である。上述した手法をさらに変形することも可能である。例えば、反応混合物から不溶粒子を分離した後、不溶性粒子が沈澱させられるときに不溶性粒子に結合しているマーカーの量を測定することにより、ターゲットの量を求めることができる(例えば、不溶性物質について従来からの定量分析を適用する)。別の方法として、反応混合物から不溶性粒子を分離した後、該粒子を再懸濁させ再懸濁化粒子状のマーカーを測定することもできる。さらに、不溶性粒子からマーカーを分離し、マーカーおよび不溶性粒子の両方が溶液または懸濁状態にあるときにマーカーを測定することもできる。また、不溶性粒子からマーカーを分離した後、溶液から不溶性粒子を分離し、不溶性粒子の不存在下にマーカーを測定することもできる。
特定のDNA配列を検出すること以外に、HLMは、RNAターゲットにハイブリダイズされたプローブをリガーゼがライゲーションできるようにすれば、特定のRNA配列を検出するのに使用することもできる。本発明の手法は、さらに、ウィルス性物質およびその他のポリ核酸配列の分析に用いることもできる。さらに、実施例に示すように、HLMは、プローブのライゲーション連結部以外の部位において相違する配列を区別することができるので、この手法は、全遺伝子を含むような長大な配列セグメントをスキャンニングして正常配列と異なる変異を調べるのにも容易に適用され得る。
本発明のその他の変形は当業者には明らかであろう。以下の実施例は、本発明の各種の態様を示すものであるが、その有用性を限定するためのものではない。
実施例1:DMAEおよびLEAEをラベルしたプローブを用いる化学発光ハイブリダイゼーション−ライゲーション分析による正常およびデルタF−508対立遺伝子の同時分析
化学発光(ルミネセンス)ハイブリダイゼーション−ライゲーション法をテストして、PCRにより増幅したヒトDNAサンプル中の嚢胞性線維症におけるデルタF−508(配列番号 1)変異の検出性能を調べた。さらに、各サンプルについて正常対立遺伝子(配列番号 2)およびデルタF−508対立遺伝子の存在を測定したが、この際、各対立遺伝子に特異的であるが2種類の異なるアクリジニウムエステル(DMAEおよびLEAE)でラベルされたプローブを用いた。DMAE誘導体(ジメチルアクリジニウムエステル)は短波長域(400〜500nm)で化学発光し、LEAE[長波長発光(longer wave length emitting)アクリジニウムエステル]は長波長域(500〜600nm)で化学発光するものである。
外部研究機関から入手したヒトDNA(250ng)の9個のサンプルをポリメラーゼ連鎖反応により増幅した(Saiki他、239 Science 487, 1988参照)。用いたプライマーは、Genset(フランスのパリ在)から入手したものであり、次の配列を有した。
これらのプライマーを用いてPCR反応で増幅させたターゲット配列は、CFTR遺伝子(3)の1611〜1708塩基をカバーする97塩基対(デルタF−508対立遺伝子は94塩基対)から成るものであった。
PCR反応系(75μl)は、各プライマー30pmol、1.9mMMgCl2、ATP、TTP、GTPおよびCTPのそれぞれ200μM、および2.5UのTaq DNAポリメラーゼを含有した。95℃において5分間変性した後、60℃において45秒間のアニーリング、72℃において1分間の伸長、および95℃において45秒間の変性から成るPCRを30サイクル実施することによりサンプルを増幅した。最終サイクル後、各サンプルを72℃において5分間インキュベートした。
PCR反応液のアリコートを変性した後、以下の化学発光検出反応系に添加した:100μl TE、4X SSC、0.1%BSA、0.02%Tween−20、10μgの常磁性粒子(PMP)を含有し固定化プローブ(PMP)を有する5%硫酸デキストラン、および各アクリジニウムエステル(508.CF−DMAE及び508.NOR−LEAE)ラベル化プローブ100fmol. 検出用プローブの配列は以下のとおりであった。
可能な分析フォーマットは図1にまとめている。
プローブを45℃において15分間、PCR生成物にハイブリダイズさせた。粒子を磁性分離し、上澄液をデカンテーションすることにより未ハイバリダイズ化プローブを除去した。該粒子は、2×SSC/0.1%Tween−20で洗浄した。
50mMのトリス100μl(pH7.6)、10mM MgCl2、1mM ATP、1mM DTT、5%ポリエチレングリコール800、200mM NaCl、2UのT4 DNAリガーゼから成る溶液に粒子を再懸濁させることにより、ハイブリダイズ化プローブをライゲーションした。反応系を37℃で15分間、インキュベートした。上述したように粒子を分離し洗浄した後、ハイブリダイズ化されてはいるがライゲーションはされていないAEプローブを除去した。粒子を上述したように1回洗浄した後、10mMトリス100μl(pH7.5)、10mMMgCl2、1mM EDTAおよび0.5μg/μl DNaseI(BRL)中に再懸濁させた。この粒子懸濁液を標準的なフラッシュ剤(例えば、Law他による米国特許第5,241,070号参照)を用いてフラッシュ(発光)させ、二波長発光計で化学発光を検出することにより、異なる2種類のラベル由来の化学発光シグナルを同時測定した。
PCR増幅生成物に関するこの化学発光ハイブリダイゼーション/ライゲーション分析の結果を図1に示す。得られた化学発光シグナルからは、PCR増幅生成物中にデルタF−508対立遺伝子および正常対立遺伝子が存在していることが明瞭に確認された。予想されたように、対立遺伝子に特異的なプローブは、遺伝子型とは無関係に各サンプルにハイブリダイズしており、また、後続のライゲーション工程は2つの異なる対立遺伝子の配列を区別していた。ターゲット配列に完全に相補的なハイブリダイズ化プローブの連結部においてのみ効率的なライゲーションが認められたからである。
これらの対立遺伝子を化学発光を利用して検出することによりこれらのサンプルの診断が可能となり、その結果は、1つの例外を除き、別の研究機関による同じサンプル群の分析と完全に一致した。
デルタF−508対立遺伝子および正常対立遺伝子の双方に特異的なAEプローブを用いて各サンプルを分析して、それらのサンプルの遺伝子型を同定した。化学発光の強さ(図2)は、また、サンプルの遺伝子型を示していた。すなわち、ヘテロ(異型)接合性の個人については、ホモ(同型)接合性の症例に比べて、中間レベルの化学発光が観察された(例えば、サンプル1、7および9における正常対立遺伝子)。サンプル7は、例外サンプルであった。508.NOR−LEAEプローブ由来の化学発光強度は、該サンプルがこの対立遺伝子についてはヘテロ接合性であることを示していたが、508.CF−DMAE由来のシグナルは、デルタF−508変異については該サンプルが陰性であることを示していたからである。これらの結果を総合すると、このサンプルにおける第2の対立遺伝子はデルタF−508および正常配列のいずれも含有しておらず、その代わりに第2の嚢胞性線維症変異を含有していると考えられた。さらに、これらのPCR生成物は、8Mの尿素/10%ポリアクリルアミドゲル上の電気泳動分析にも供され、分離バンドは、エチジウムブロミドにより可視化された(データは示さず)。正常対立遺伝子(97bp)およびCF対立遺伝子(94bp)由来の生成物は、ゲル上ではっきりと分離され、診断が可能であった。さらに、ヘテロ接合性サンプルは、見掛け上大きな生成へテロ二本鎖に起因するバンドも含有した。この点に関し、電気泳動分析に基づくと、サンプル1、7および9は同一のものと考えられ、デルタF−508/正常ヘテロ接合対であると同定できるであろう。前に指摘したように、化学発光データに基づくと、サンプル7は正常対立遺伝子についてはヘテロ接合性であったが、デルタF−508対立遺伝子を含有していないと思われた。この不一致は、実施例2において解決され、HLMが電気泳動のような標準的な分析法に比べてさらに正確な診断を与える性能を有することが示された。
実施例2:化学発光ハイブリダイゼーション−ライゲーションによるデルタF−508およびデルタI−507変異の識別
デルタF−508変異は、嚢胞性線維症(CF)において最もよく見られる変異であり、嚢胞性線維症染色体(3)の約68%に起こる。この変異は、CFTR遺伝子(3)のエクソン10において3個の塩基対が欠失したものである。この変異部位周辺のエクソン10の配列は図3に示されている。デルタI−507(配列番号 8)変異は、これよりかなり稀なCF変異であり、やはり3塩基対が欠失したものであり、デルタF−508変異と部分的にオーバーラップしている。これら2種類CF対立遺伝子の配列は1塩基が異なる。
実施例1においては化学発光ハイブリダイゼーション−ライゲーション分析がデルタF−508対立遺伝子と正常対立遺伝子とを区別する性能があることを示した。本実施例では、該分析がデルタF−508対立遺伝子とデルタI−507対立遺伝子とを区別する性能があることを示す。この応用法においては、ライゲーション工程が、単一の位置が異なるような配列を区別することが必要である。さらに、これらのハイブリッドにおけるミスマッチ部位は、ライゲーション連結部から除去された1塩基で生じる。デルタF−508プローブとデルタI−507プローブとの間で形成されたハイブリッドおよび異なるターゲット配列は図4に示す。
ポリメラーゼ連鎖反応で増幅されたヒトDNAから得た9個の臨床サンプル(実施例1と同じ)について、デルタI−507変異が存在するかの分析を行った。本分析では実施例と同様のフォーマットに従ったが、固相とアクリジニウムエステル(DMAE)ラベル化プローブは次のようにした。
PCR増幅したヒトDNAの追加の3サンプルについて、前と同じプロトコールおよびTaq DNAリガーゼ(Epicentre Technologies製)を用いるプロトコールに従って、デルタF−508、デルタI−507および正常対立遺伝子の分析を行った。Taq DNAリガーゼは熱安定性を有するので、高温でライゲーション反応が行えるようになるとともに、ハイブリダイゼーションとライゲーション工程を同時に実施することができる。この同時ハイブリダイゼーション−ライゲーションに用いた緩衝液は、20mMトリス(pH8.3)、200mMのKCl、10μMのtRNA、10mMのMgCl2、0.5mMのNAD、および0.01%のトリトン(Triton)X−100から成るものであった。反応系は100ユニットのTaq DNAリガーゼを含有した。同時ハイブリダイゼーション−ライゲーションは60℃において30分間実施した。
9サンプルの化学発光ハイブリダイゼーション−ライゲーション分析の結果を図5に示す。サンプル7のみがデルタI−507対立遺伝子に関し陽性であった。この結果と実施例1の結果を総合すると、これらのサンプルは次のように同定することができる。
追加の3サンプルに行ったデルタF−508、デルタI−507および正常対立遺伝子に関する結果は図6および図7に示す。これらのサンプルの同定は配列決定で確認した。
実施例1および2の結果は、化学発光ハイブリダイゼーション−ライゲーション分析により、ライゲーション連結部位からわずか1塩基離れたところで1塩基が異なる配列を識別できることを示している。本実施例に従う特別の応用法では、嚢胞性線維症変異のデルタF−508とデルタI−507が識別された。これにより、以前にデルタF−508/Nと考えられたサンプルは、正しくはデルタI−507/Nと同定することができた。サンプル7および30は、該サンプルのPCR生成物の電気泳動による移動性に基づいてデルタF−507/Nヘテロ接合体と考えられていた。しかし、ポリアクリルアミドゲル電気泳動によるこれらのPCR生成物の分析では、デルタF−508変異とデルタI−507変異を簡単に識別することはできない。両変異とも3個の塩基対欠失から成り、これら対立遺伝子由来のPCR生成物はサイズが同じであるからである。
実施例3:嚢胞性線維症のG542X変異分析
これまでの実施例により、化学発光ハイブリダイゼーション−ライゲーション分析が、デルタF−508およびデルタI−507変異部位における正常対立遺伝子と嚢胞性線維症対立遺伝子を識別する性能を有することを示した。第3の嚢胞性線維症変異であるG542X(配列番号11)は、CFTR遺伝子のエクソン11に生じる点(突然)変異である。この変異を検出する現行の方法は配列決定を必要として、時間を要し面倒な手法である。この変異を検出するための化学発光ハイブリダイゼーション−ライゲーション分析は、正常対立遺伝子(配列番号12)と嚢胞性線維症対立遺伝子を相違させる1個の塩基置換を識別することができなければならない。
実施例2に記載したのと同様の同時ハイブリダイゼーション−ライゲーション分析によりTaq DNAリガーゼを用いてG542Xを分析した。G542X用プローブの配列は以下のとおりであった。
分析結果は図8に示しており、G542X配列に対してはG542X.CFプローブのみがライゲーションされ、また、正常配列にはG542X.NORプローブのみがライゲーションされたことを示している。本実施例においては、ライゲーション連結部におけるT−CおよびG−Aのミスマッチは効率的にライゲーションされなかった。
実施例4:デルタF−508およびG542Xの同時分析
化学発光ハイブリダイゼーション−ライゲーション分析は、多数の配列を同時検出するのに用いることができる。このような性能の1つの例は、デルタF−508対立遺伝子と正常対立遺伝子の同時検出であった(実施例1)。他の応用例は、遺伝病やガンに潜在する2種またはそれ以上の変異を検出することである。例えば、嚢胞性線維症に潜在する変異は200以上あると報告されている。デルタF−508変異は最も一般的な変異であり、嚢胞性線維症染色体の約68%に生じる。第2番目によく起こる嚢胞性線維症変異はG542X変異であり、これはCFTR遺伝子のエクソン11に生じる点変異である。2種類の異なるアクリジニウムエステルラベルを使用して単一の遺伝子座にある正常対立遺伝子とCF対立遺伝子を検出する代わりに、単一の分析によりデルタF−508およびG542X変異を検出することもできる。原理的には、異なる化学発光性を有するアクリジニウムエステル誘導体の数に応じた数の変異を単一の分析で検出することができる。その他のラベル、例えば蛍光団によっても多数の遺伝子座を同時に分析することが可能である。
合成したターゲット配列を用いて性能試験用のモデル分析を行った。分析プロトコールは、実施例2で記載したものと同じであり、Taq DNAリガーゼを使用し、同時ハイブリダイゼーション−ライゲーションを実施した。2種類の固相および2種類のアクリジニウムエステルをラベルしたプローブを用いて、各セットをそれぞれF−508変異用およびG542X変異用とした。デルタF−508変異用のプローブは、アクリジニウムエステルラベルがLEAEであること以外は、実施例1で記載したものと同じである。G542X用プローブの配列は、実施例3で用いたものと同じである。分析結果は図1にまとめており、どの組合せのターゲットを用いてもデルタF−508配列とG542X配列が検出されたことを示している。このことは、同一の分析において多数の遺伝子変異を検出できることを示している。
実施例5:G551D、G551SおよびQ552X嚢胞性線維症変異の識別
CFTR遺伝子のエクソン11は、上述の実施例で記載したG542X以外にも多くの嚢胞性線維症変異を含有している。エクソン11の比較的短い配列内に多数の変異部位が存在しているために、これまでは、起こり得るこのような変異を検出し識別するためには該エクソン由来のPCR生成物の配列決定を行うことを必要としていた。HLMによりエクソン11嚢胞性線維症変異の分析を簡略化できるようにするには、この方法の特異性が近接密集した変異部位を識別できることを必要とした。G551D変異(配列番号16)は、最も一般的な嚢胞性線維症変異の1つであり、約0.5%の頻度で見出されている。これは、正常遺伝子におけるG1784(配列番号17)がAに変化した点(突然)変異である。このG551Dの近傍部位の塩基1783においてG551S(配列番号18)が存在し、さらに塩基178においてQ552X(配列番号19)が存在する。さらに、G551D変異の特性から、HLMによりG−Tミスマッチを識別することが必要であるが、これは識別するのに最も困難なミスマッチである(下記参照)。本実施例では、HLMが、G551D変異を検出し、且つ、該変異とその近傍にある他の変異部位を識別できる性能を有することを明らかにした。
G551D分析に用いたプローブの配列は次のとおりである。
分析に際し、G551D.CFおよびG551D.NORは、それらの5′末端に32Pでラベルした。ライゲーション生成物の検出は、液相シンチレーション計数により行った。分析は、既知のようにT4 DNAリガーゼおよびTaq DNAリガーゼを用いるプロトコールに従うか、あるいは、該プロトコールにおける塩の条件を修正してHLMの特異性を向上させて実施した。これには、T4 DNAリガーゼを用いる場合については、NaCl濃度を200mMから600mMに増加させたことを含む。Taq DNAリガーゼを用いるプロトコールにおいてはKClの代わりにNaClを用いた。ライゲーションの詳細な条件については以下に数値を示す。
T4 DNAリガーゼを用いNaClを200mMとしたHLM分析の結果を図10に示す。HLMにより、G551D配列とその他の変異配列とを識別することはできたが、G551D.CFプローブを用いてG551D配列と正常配列との間に本質的な相違は認められなかった。そこで、NaCl濃度を600mMに増加させることにより、T4 DNAリガーゼを用いるHLM特異性を向上させた(図11)。Taq DNAリガーゼを用いるHLMを実施することにより識別性能はさらに良好となり、該条件下ではG551D.CFプローブまたはG551D.NORプローブを使用して配列の相違は簡単に識別された。200mMのKClとG551D.CFを用いTaq DNAリガーゼを使用するプロトコールに従えば、G551D配列と正常配列間の識別は明白であったが、正常ターゲットについてバッグランドを超えるライゲーションが認められた。このシグナルは、Taq DNAリガーゼを使用するプロトコールにおいてNaClを代用することにより低下させることができた(図13)。
以上の結果を総合すれば、HLMは1塩基のみが異なるような配列を識別し、特に、そのような単一塩基変化部位がライゲーション連結部から離れている場所にあるようなときでも識別する性能を有することが明らかである。
実施例6:p53モデルを利用するハイブリダイゼーション−ライゲーションの特異性の系統的検討
これまでの実施例により、HLMが、欠失、挿入および点変異を含む微妙な相違のある配列を識別する性能を有することが確立された。検討した各事例において、このような配列の相違を識別できるようなライゲーション特異性が得られる条件が確立された。本実施例においては、ミスマッチのあらゆる可能な組合せにより相違しているような配列を識別する性能を調べることにより、HLMの特異性を系統的に検討する。
p53遺伝子は、腫瘍抑制物質として機能するタンパク質をコードしている。この遺伝子の変異は、広範な腫瘍において見出され、このような変異が最も多く見られる位置はコドン175、245および248の周りに密集している。ライゲーションの特異性を系統的に検討するためのモデルとして、コドン175の周りのp53遺伝子の一部を選択した(配列番号23)。このモデル用のターゲットおよびプローブの配列は図14に示す。ハイブリダイゼーションおよびライゲーションは溶液中で実施した。T4 DNAリガーゼを用いた分析を行うために、既述した濃度のNaClを含有するライゲーション緩衝液中で、プローブ(32pをラベルした配列番号24および25)をターゲットと混合した。反応系を37℃で15分間インキュベートし、T4 DNAリガーゼ(1U)を添加し、反応系をさらに15分間、37℃でインキュベートした。該反応液のアリコートを変性(8M尿素)ポリアクリルアミド(15%)ゲル電気泳動により分析した。ライゲーション生成物および未ライゲーションオリゴマーに対応するバンドを切除し液相シンチレーション計数により計測して、ライゲーションした全オリゴマーのパーセントを計算した。Taq DNAリガーゼを用いる分析も同様に行った。但し、この場合、反応の開始時に該リガーゼを添加した。
200mMのNaClを用いた場合にライゲーション連結部の5′リン酸または3′OHヌクレオチド位置において生じたミスマッチに対するT4DNAリガーゼの識別性能を表IIにまとめる。3′OHヌクレオチドにおけるミスマッチは、5′Pヌクレオチドにおけるミスマッチよりも遥かに識別が容易であった。NaCl濃度を600mMに増加させると、T4 DNAリガーゼの特異性は、200mMにおける場合よりも向上した。600mMのNaClでは、5′Pまたは3′OH位置のいずれにおいてもあらゆる可能性のミスマッチが識別され、G−TおよびC−Aミスマッチすら識別された(表III)。
200mMのKCl中45℃におけるTaq DNAリガーゼの特異性はT4 DNAリガーゼの特異性よりも優れていた。さらに、Taqリガーゼ緩衝液にNaClを含有させると、Taq DNAリガーゼの特異性は幾分向上した。
実施例7:診断基準としてライゲーション百分率を用いるPCR増幅ヒトDNA中のデルタF−508および正常対立遺伝子の分析
独立した研究機関からPCRで増幅されたヒトDNAのサンプルを入手した。これまでの実施例で記載したのと同様に、デルタF−508対立遺伝子(配列番号1)のHLM分析を行った。ハイブリダイズされてはいるがライゲーションされていないプローブを除去するための変性工程において、この放出プローブを含有する上澄液を保存して別途フラッシュ(発光)させ、ハイブリダイズされ且つライゲーションされたラベル化プローブを含有するPMPのフラッシングとは別にした。この上澄液およびPMPからの化学発光シグナルの合計が、サンプルにハイブリダイズしたラベル化プローブの総量の尺度となり、ひいては、これが、反応系中のサンプルDNAの総量の尺度となる。さらに、PMPからの化学発光シグナルを上澄液およびPMPからの化学発光シグナルの合計で除することにより、ハイブリダイズされたプローブのうちライゲーションを受けたものの分率(フラクション)が得られる。ヒトDNAの各サンプルから得られるPCR生成物の量はサンプル毎に異なっているかも知れないので、ライゲーションされたラベル化プローブの分率から、ある対立遺伝子に関してホモ接合性のサンプル、ある対立遺伝子に関してヘテロ接合性のサンプル、および、そのような対立遺伝子を含まないサンプルを明瞭に区別することができる。さらに、プローブは、デルタF−508対立遺伝子、正常対立遺伝子、およびデルタI−507対立遺伝子にハイブリダイズするものと予想されるので、変性工程において放出されたラベル化プローブの化学発光を測定することは、分析の構成成分が、ライゲーションに関して陰性であるようなサンプルに正しく作用しているかを判断する手段となる。
HLMによるデルタF−508分析の結果をパーセントライゲーション(ライゲーション百分率)として計算し図15にまとめている。ライゲーションされたラベル化プローブのパーセントを計算することにより、ホモ接合性、ヘテロ接合性、および陰性のサンプル間を明瞭に区別することができた。この計算値は、生の化学発光データよりも信頼性の高い診断指数であることがわかる。サンプルは、存在するDNAの全量において5倍以上変化していることが見出されたからである。図16においては、正常対立遺伝子について行った同様の分析の結果をデルタF−508の分析の結果と比較している。
実施例8:デルタF−508対立遺伝子とデルタI−507対立遺伝子との識別に対するNaCl濃度の影響
これらの2種類の対立遺伝子の配列は、1ヶ所において異なっている(図4参照)。200mMのNaCl中においてT4 DNAリガーゼを用いるHLMにより、これら2つの嚢胞性線維症変異間の識別を行うことが可能であった(実施例1及び2参照)。p53配列を用いるT4 DNAリガーゼの特異性に対するNaCl濃度の影響を示した実施例6の結果に照らして、デルタF−508プローブを用いデルタF−508配列とデルタI−507配列間を識別するT4 DNAリガーゼの性能に対するNaCl濃度の影響を調べた。既述のようにデルタF−508およびデルタI−507の合成ターゲット配列についてHLMを実施した。但し、ライゲーション緩衝液は、200、400、600、800または1000mMのNaClで調製した。変性工程において、上澄液を保存し、別途フラッシング(発光)させて、ハイブリダイズされているがライゲーションされていないプローブの量を測定した。実施例7のように、ハイブリダイズされた総量のうちライゲーションされた508.CF−DMAEプローブのパーセントを計算した。
結果は図17にまとめている。200mMのNaCl中、T4 DNAリガーゼにより、デルタF−508配列とデルタI−507配列とを充分に識別することができた。塩濃度600mMまで増加させるに従い、デルタI−507配列に関して認められるライゲーション量は抑制されるがデルタF−508配列に関してはライゲーションのレベルが維持されることにより、それらの配列間の識別性能は向上した。NaCl濃度が600mMを超えると、デルタF−508ターゲットについてライゲーションが低下し始める。
実施例9:ビオチン化プローブとアビジン−PMPを用いるΔF−508のハイブリダイゼーション−ライゲーション分析
ビオチン化プローブ(Biotin-CF1)とアクリジニウムエステルラベル化プローブ(508.CF-AE)を用い溶液中でハイブリダイゼーションおよびライゲーション反応を行った。1pmolのBiotin−CF1、100fmolの508.CF−AF、および100ユニットのTaq DNAリガーゼを含有する100μl緩衝液(200mMのトリス(pH8.3)、100mMのNaCl、100mMのKCl、10mMのMgCl2、10μMのtRNA、0.05mMのNADおよび0.01%のTritonX−100)中、50℃においてハイブリダイゼーション−ライゲーション反応を実施した。反応の開始には、1)1fmolの正常ターゲット、2)1fmolのΔI−507ターゲット、3)1fmolのΔF−508ターゲットまたは4)ターゲットなしのいずれかを添加した。反応系を50℃で1時間インキュベートした。各反応系に10μgのアビジン−PMP(Promega製)を添加し、さらに10分間インキュベートした。磁性を利用して粒子を分離し、上澄液を吸引除去し、粒子を0.2×SSC/0.1%Tween−20で洗浄した。この洗浄を2回繰り返した。アビジン−PMPを150μlの洗浄緩衝液中に再懸濁し、55℃において10分間インキュベートしてハイブリダイズされてはいるがライゲーションされていないプローブを除去した。磁性作用を利用してアビジン−PMPを分離し、上澄液を除去してフラッシュ(発光)させた。このアビジン−PMPを一回洗浄し、DNase I(BRL)を含有する10mMのMgCl2および50mMのトリス(pH7.5)の100μl中に再懸濁しフラッシュさせた。分析結果を以下の表にまとめる。
この分析フォーマットは、ビオチン化プローブとともに汎用的な固相試薬(アビジン−PMP)を利用できることを示す。このフォーマットは、同一の試験管内で多数の遺伝子座の分析を行うことが求められているような多重分析を意図する場合に特に有用であろう。さらに、固相のハイブリダイゼーションおよびライゲーションは、PMP上に固定化された1つのプローブを用いる場合よりも迅速に進行することができる。
実施例10:ライゲーション特異性とG551Dモデルの結果
以上の結果を本明細書の実施例5において得られた結果に拡張する。前述したのと同様にT4 DNAリガーゼおよびTaq DNAリガーゼを用いてハイブリダイゼーション−ライゲーション分析を行った。G551D配列に特異的なAEプローブを用いた分析結果は以下の表にまとめている。R553Xと称するターゲット配列を用いることによりライゲーション特異性に関し更なる知見が得られる(表VI参照)。
G551D.NORプローブを用いる分析により、G551S配列とQ552X配列とを識別できた。このことは、T4 DNAリガーゼおよびTaq DNAリガーゼが、ライゲーション連結部以外の場所におけるミスマッチを識別する性能を有することを示している。さらに、G551D.NORを用いる分析により、T4DNAリガーゼがR553X配列を識別できるものと考えられる。これには、該酵素が、ライゲーション連結部の3′水素基側から5塩基分離れた場所におけるミスマッチを識別することが必要である。
この分析結果は、単一のミスマッチではなく2つのミスマッチが存在する場合に、識別能の向上が得られることを示している。例えば、G551D.NORを用いる分析では、TaqリガーゼによりR553X配列は識別されない。見方を変えると、3′(5)T−Gミスマッチは、Taq DNAリガーゼによりライゲーションを妨げない。G551D.CFを用いる分析において、正常ターゲット配列に対する誤ライゲーションの割合は5%であり、他方、R553Xに対する誤ライゲーションの割合は2%であった。このことは、識別能を向上させるのに、ライゲーション連結部から数塩基分離れたところにミスマッチを導入することが有用であることを示している。最終的には、このような戦略により、現在は識別されていないようなミスマッチの識別を行うことが可能となる。このような見解は、G551D.CFおよびT4 DNAリガーゼを用いる分析を考慮すれば明らかであろう。この酵素は、5′(1)におけるG−Tミスマッチを識別しなかったが、R553Xにおいて生じるミスマッチの組合せは識別された。
実施例11:ライゲーション連結部から離れた位置におけるミスマッチの識別
本明細書で既述したp53モデルを用いて、T4 DNAリガーゼおよびTaq DNAリガーゼがライゲーション連結部から1塩基離れた位置におけるミスマッチを識別する性能を系統的に検討した。これらの位置は、ライゲーション連結部がどちら側にあるかに応じて、5′(2)および3′(2)と呼称する。結果は、添付図にまとめている。いずれの酵素によっても3′(2)位置におけるミスマッチはすべて識別された。両酵素とも、5′(2)におけるミスマッチをすべて識別するわけではなかった。(図18参照)。
実施例12:ライゲーション特異性に対する酵素濃度の影響
T4 DNAリガーゼの濃度を2種類、すなわち、1nMと240nMにして比較を行った。T4 DNAリガーゼの5′(1)ミスマッチおよび3′(1)ミスマッチ識別能をp53モデルで検討した。結果は図にまとめている。明らかに、3′(1)ミスマッチに対するライゲーション特異性は、低濃度において向上しており、相補的マッチに対するライゲーションが実質的に減損していることもない。5′(1)ミスマッチについても向上が認められ、特にプリン−プリンミスマッチに対して向上しているが、3′(1)ミスマッチに対しては全体として有意な程ではなかった。(図19および図20参照。)
配列リスト
(1)一般情報
(i) 出願人:チバ・コーニング・ダイアグノスティクス・コーポレーション(Ciba Corning Diagnostics Corp.)Martinelli, Richard A. Arruda, John C.
(ii) 発明の名称:特定の核酸配列を検出するためのハイブリダイゼーション−ライゲーション分析(Hybridization-Ligation Assays for the Detection of Specific Nucleic Acid Sequences)。
(iii) 配列の数:26
(iv) 通信先住所:
(A)宛先:Ciba-Corning Dagnostics Corp.
(B)街:63 North Street
(C)市:Medfield
(D)州:Massachusetts
(E)国:USA
(F)ZIP番号:02052
(v) コンピューター解読形態
(A)媒体:3.5インチディスク、記憶容量1.44Mb
(B)IBMコンパチブル
(C)オペレーティングシステム:IBM DOS5.0
(D)ソフトウェア:WORD 6.0
(vi) 当出願に関するデータ
(A)出願番号:未入手
(B)出願日:未入手
(C)分類:未入手
(vii) 先行出願に関するデータ
(A)出願番号:US08/222、613
(B)出願日:1994年4月4日
(C)分類:未入手
(viii)代理人情報
(A)氏名:Morgenstern, A.S.
(B)登録番号:28,244
(C)整理番号:CCD−113
(ix) 通信手段情報
(A)電話:508−359−3836
(B)ファクシミリ:508−359−3885
(2)配列番号1に関する情報:
(i) 配列の特徴:
(A)長さ:47塩基
(B)種類:核酸
(C)鎖:一本鎖
(D)トポロジー:線状
(ii) 分子型:ゲノムDNA
(A)内容:デルタF−508。CFTR遺伝子の配列の一部であり、塩基番号1652を囲むが、塩基1653〜1655を欠失したもの。
(xi) 配列:配列番号:1:
(3)配列番号2に関する情報:
(i) 配列の特徴:
(A)長さ:50塩基
(B)種類:核酸
(C)鎖:一本鎖
(D)トポロジー:線状
(ii) 分子型:ゲノムDNA
(A)内容:正常。CFTR遺伝子のエクソン10の配列の一部であり、塩基番号1652を囲む。
(xi) 配列:配列番号:2:
(4)配列番号3に関する情報:
(i) 配列の特徴:
(A)長さ:24塩基
(B)種類:核酸
(C)鎖:一本鎖
(D)トポロジー:線状
(ii) 分子型:ゲノムDNA
(A)内容:C16B。CFTR遺伝子のエクソン10の塩基1611〜1634。
(xi) 配列:配列番号:3:
(5)配列番号4に関する情報:
(i) 配列の特徴:
(A)長さ:24塩基
(B)種類:核酸
(C)鎖:一本鎖
(D)トポロジー:線状
(ii) 分子型:ゲノムDNA
(A)内容:C16D。CFTR遺伝子のエクソン10の塩基1708〜1684。
(xi) 配列:配列番号:4:
(6)配列番号5に関する情報:
(i) 配列の特徴:
(A)長さ:53塩基
(B)種類:核酸
(C)鎖:一本鎖
(D)トポロジー:線状
(ii) 分子型:他のDNA/ゲノムDNA
(A)内容:PMP.508。塩基1〜29は合成DNAのスペーサー。塩基30〜53は、CFTR遺伝子のエクソン10の塩基1656〜1678から成る。
(xi) 配列:配列番号:5:
(7)配列番号6に関する情報:
(i) 配列の特徴:
(A)長さ:24塩基
(B)種類:核酸
(C)鎖:一本鎖
(D)トポロジー:線状
(ii) 分子型:ゲノムDNA
(A)内容:508.CF。CFTR遺伝子のエクソン10の塩基1629〜1652。
(xi) 配列:配列番号:6:
(8)配列番号7に関する情報:
(i) 配列の特徴:
(A)長さ:27塩基
(B)種類:核酸
(C)鎖:一本鎖
(D)トポロジー:線状
(ii) 分子型:ゲノムDNA
(A)内容:508.NOR。CFTR遺伝子のエクソン10の塩基1629〜1655。
(xi) 配列:配列番号:7:
(9)配列番号8に関する情報:
(i) 配列の特徴:
(A)長さ:47塩基
(B)種類:核酸
(C)鎖:一本鎖
(D)トポロジー:線状
(ii) 分子型:ゲノムDNA
(A)内容:デルタI−507。CFTR遺伝子のエクソン10の配列の一部であり、塩基番号1652を囲み、塩基1652〜1654を欠失したもの。
(xi) 配列:配列番号:8:
(10)配列番号9に関する情報:
(i) 配列の特徴:
(A)長さ:56塩基
(B)種類:核酸
(C)鎖:一本鎖
(D)トポロジー:線状
(ii) 分子型:ゲノムDNA/他のDNA
(A)内容:PMP.507。塩基1〜29は合成DNAのスペーサー;塩基30〜56はCFTR遺伝子のエクソン10の塩基1679〜1653から成る。
(xi) 配列:配列番号:9:
(11)配列番号10に関する情報:
(i) 配列の特徴:
(A)長さ:24塩基
(B)種類:核酸
(C)鎖:一本鎖
(D)トポロジー:線状
(ii) 分子型:ゲノムDNA
(A)内容:507.CF。CFTR遺伝子のエクソン10の塩基1626〜1649から成る。
(xi) 配列:配列番号:10:
(12)配列番号11に関する情報:
(i) 配列の特徴:
(A)長さ:54塩基
(B)種類:核酸
(C)鎖:一本鎖
(D)トポロジー:線状
(ii) 分子型:ゲノムDNA
(A)内容:G542X。CFTR遺伝子のエクソン11の塩基1731〜1784から成り、塩基1756のGがTで置換されたもの。
(xi) 配列:配列番号:11:
(13)配列番号12に関する情報:
(i) 配列の特徴:
(A)長さ:54塩基
(B)種類:核酸
(C)鎖:一本鎖
(D)トポロジー:線状
(ii) 分子型:ゲノムDNA
(A)内容:NOR1731.54。CFTR遺伝子のエクソン11の塩基1731〜1784。
(xi) 配列:配列番号:12:
(14)配列番号13に関する情報:
(i) 配列の特徴:
(A)長さ:52塩基
(B)種類:核酸
(C)鎖:一本鎖
(D)トポロジー:線状
(ii) 分子型:他のDNA/ゲノムDNA
(A)内容:PMP.G542X。塩基1〜27は合成DNAのスペーサーから成り、塩基28〜52はCFTR遺伝子のエクソン11の塩基1781〜1757から成る。
(xi) 配列:配列番号:13:
(15)配列番号14に関する情報:
(i) 配列の特徴:
(A)長さ:27塩基
(B)種類:核酸
(C)鎖:一本鎖
(D)トポロジー:線状
(ii) 分子型:ゲノムDNA
(A)内容:G542X.CF。CFTR遺伝子のエクソン11の塩基1756〜1730から成り、塩基1756におけるCがTで置換されたもの。
(xi) 配列:配列番号:14:
(16)配列番号15に関する情報:
(i) 配列の特徴:
(A)長さ:27塩基
(B)種類:核酸
(C)鎖:一本鎖
(D)トポロジー:線状
(ii) 分子型:ゲノムDNA
(A)内容:G542X.NOR。CFTR遺伝子のエクソン11の塩基1756〜1730。
(xi) 配列:配列番号:15:
(17)配列番号16に関する情報:
(i) 配列の特徴:
(A)長さ:45塩基
(B)種類:核酸
(C)鎖:一本鎖
(D)トポロジー:線状
(ii) 分子型:ゲノムDNA
(A)内容:G551D.CFTR遺伝子のエクソン11の塩基1763〜1807から成り、塩基1784におけるGがAで置換されたもの。
(xi) 配列:配列番号:16:
(18)配列番号17に関する情報:
(i) 配列の特徴:
(A)長さ:45塩基
(B)種類:核酸
(C)鎖:一本鎖
(D)トポロジー:線状
(ii) 分子型:ゲノムDNA
(A)内容:NOR17632.45。CFTR遺伝子のエクソン11の塩基1763〜1807。
(xi) 配列:配列番号:17:
(19)配列番号18に関する情報:
(i) 配列の特徴:
(A)長さ:45塩基
(B)種類:核酸
(C)鎖:一本鎖
(D)トポロジー:線状
(ii) 分子型:ゲノムDNA
(A)内容:G551S。CFTR遺伝子のエクソン11の塩基1763〜1807から成り、塩基1783におけるGがAで置換されたもの。
(xi) 配列:配列番号:18:
(20)配列番号19に関する情報:
(i) 配列の特徴:
(A)長さ:45塩基
(B)種類:核酸
(C)鎖:一本鎖
(D)トポロジー:線状
(ii) 分子型:ゲノムDNA
(A)内容:Q552X。CFTR遺伝子のエクソン11の塩基1763〜1807から成り、塩基1786におけるCがTで置換されたもの。
(xi) 配列:配列番号:19:
(21)配列番号20に関する情報:
(i) 配列の特徴:
(A)長さ:52塩基
(B)種類:核酸
(C)鎖:一本鎖
(D)トポロジー:線状
(ii) 分子型:他のDNA/ゲノムDNA
(A)内容:PMP.G551D。塩基1〜29は合成DNAのスペーサーから成り、塩基30〜52はCFTR遺伝子のエクソン11の塩基1785〜1807から成る。
(xi) 配列:配列番号:20:
(22)配列番号21に関する情報:
(i) 配列の特徴:
(A)長さ:22塩基
(B)種類:核酸
(C)鎖:一本鎖
(D)トポロジー:線状
(ii) 分子型:ゲノムDNA
(A)内容:G551D.CF。CFTR遺伝子のエクソン11の塩基1784〜1763から成り、塩基1784におけるCがTで置換されたもの。
(xi) 配列:配列番号:21:
(23)配列番号22に関する情報:
(i) 配列の特徴:
(A)長さ:22塩基
(B)種類:核酸
(C)鎖:一本鎖
(D)トポロジー:線状
(ii) 分子型:ゲノムDNA
(A)内容:G551D.NOR。CFTR遺伝子のエクソン11における塩基1784〜1763。
(xi) 配列:配列番号:22:
(24)配列番号23に関する情報:
(i) 配列の特徴:
(A)長さ:35塩基
(B)種類:核酸
(C)鎖:一本鎖
(D)トポロジー:線状
(ii) 分子型:ゲノムDNA
(A)内容:p53。p53遺伝子のコドン175の両側にある35塩基。
(xi) 配列:配列番号:23:
(25)配列番号24に関する情報:
(i) 配列の特徴:
(A)長さ:16塩基
(B)種類:核酸
(C)鎖:一本鎖
(D)トポロジー:線状
(ii) 分子型:ゲノムDNA
(A)内容:p53.5′。p53遺伝子のコドン175のCから5′に延びる16塩基の配列。
(xi) 配列:配列番号:24:
(26)配列番号25に関する情報:
(i) 配列の特徴:
(A)長さ:19塩基
(B)種類:核酸
(C)鎖:一本鎖
(D)トポロジー:線状
(ii) 分子型:ゲノムDNA
(A)内容:p53.3′。p53遺伝子のコドン175のGから3′に延びる19塩基の配列。
(xi) 配列:配列番号:25:
(27)配列番号26に関する情報:
(i) 配列の特徴:
(A)長さ:45塩基
(B)種類:核酸
(C)鎖:一本鎖
(ii) 分子型:ゲノムDNA
(A)内容:R533X。CFTR遺伝子のエクソン11の塩基1763〜1807から成り、塩基1789におけるCがTで置換されたもの。
(xi) 配列:配列番号:26
(28)配列番号27に関する情報:
(i) 配列の特徴:
(A)長さ:24塩基
(B)種類:核酸
(C)鎖:一本鎖
(ii) 分子型:ゲノムDNA
(A)内容:CF1。CFTR遺伝子のエクソン10の塩基1656〜1678。
(xi) 配列:配列番号:27:
Background of the Invention
Gene probe technology has become an important analytical tool for predicting the onset of genetic diseases and diagnosing clinical conditions. However, currently used technologies are slow and cumbersome and use harmful chemicals. Several techniques employed in the field of gene probes have recently been studied by Plaha et al. (14 Biotechniques 566, 1993). Current gene probe technology generally uses electrophoresis, and is often performed on long polyacrylamide gels. Some of the chemicals that the experimenter contacts are considered harmful. That is, acrylamide monomers (some of which may remain in the polymer gel) are believed to be neurotoxins. Electrophoresis on polyacrylamide gels generally takes several hours, while analysis using the new gel described in Plaha requires 16 hours for a single electrophoresis experiment. As other techniques, radioactive markers are used, so special handling control and disposal techniques are required. Furthermore, the current method requires a relatively long operation in other respects. (For example, Southern blotting takes about 48 hours to complete.)
Furthermore, electrophoresis can itself produce indeterminate results. First, techniques using ethidium bromide are often not very sensitive. Secondly, conditions must be found that can reliably separate various gene fragments. Third, the results obtained are in most cases qualitative and not quantitative. Furthermore, the inability to distinguish DNA fragments that are the same or similar in size but differ in sequence by only one base also limits the usefulness of conventional techniques.
The sensitivity limitations inherent in DNA-based analysis can be overcome by polymerase chain reaction (PCR). By amplifying a specific sequence by PCR, it is possible to detect the sequence which is present in an extremely small amount (Saiki et al., Science 1350, 1985). Although this PCR method can amplify DNA sequences and overcome the sensitivity limitations that existed before PCR was available, the use of PCR still has many problems. The product of the PCR reaction contains artifacts due to primer dimers and non-specific priming, especially when no target sequence is present in the sample. Due to the sensitivity, PCR can lead to false positive results due to impurities. The PCR method itself cannot easily distinguish slight differences between sequences such as point mutations as present in genetic diseases (eg, cystic fibrosis). Because of these limitations, it is desirable to be able to confirm the presence of a specific target sequence after amplification by PCR. Previous researchers have used hybridization and ligation methods as precursors to the analysis of samples on various gels. (See Landegren et al., 24 1 Science, 1077, 1988). However, these methods are slow and inconvenient and cannot be easily used in automated equipment.
New analytical methods have now been developed that eliminate the shortcomings of current techniques for DNA sequence analysis and give faster and more accurate results. This novel technique can be used in combination with PCR to improve the accuracy in gene probe analysis.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1: Delta F-508 allele andnormalProbe analysis format used for allele detection.
FIG. 2: Delta F-508 allele in nine samples of human DNA amplified by PCR andnormalHLM results for simultaneous analysis of alleles. Probes specific for the Delta F-508 allele are labeled with DMAE,normalAllele specific probes were labeled with LEAE.
FIG. 3: Partial sequence of
FIG. 4: Hybrids created between probes for Delta F-508 and I-507 analysis and various alleles.
FIG. 5: HLM results for detection of Delta I-507 mutation in 9 samples of human DNA amplified by PCR.
Figure 6: Performed on 3 samples of human DNA amplified by CR,normal, HLM analysis for the presence of delta F-508 and delta I-507 alleles.
FIG. 7: Three samples of PCR amplified human DNA were performed using Taq DNA ligase according to the simultaneous hybridization-ligation protocol.normal, HLM analysis for the presence of delta F-508 and delta I-507 alleles.
Figure 8: G542X allelenormalIdentification of alleles by HLM.
FIG. 9: Simultaneous detection of Delta F-508 mutation and G542X mutation by HLM.
Figure 10:32P-G551D. NOR or32P-G551D. By HLM using T4 DNA ligase with 200 mM NaCl using CFnormalIdentification of sequences, G551D sequences, G551S sequences and Q552X sequences.
Figure 11:32P-G551D. NOR and32P-G551D. HLM using T4 DNA ligase with 600 mM NaCl using CF.
Figure 12:32P-G551D. CF or32P-G551D. Taq DNA ligase was used with 200 mM KCl using NOR.normal, G551D, G551S, and Q552X sequence identification.
FIG. 13: Comparison of analysis of G551D using Taq DNA ligase and varying salt conditions.
FIG. 14: p53 model for systematically examining ligation specificity. The upper sequence is the target sequence (regions on both sides of codon 175 of the p53 gene). The sequence of the probe is shown below. The positions designated as “X” and “Y” were systematically changed to four types of nucleotides.
Figure 15: Percentage ligation calculated for Delta F-508 analysis of PCR amplified samples.
FIG. 16: Correlation of ligation percentage calculated from HLM for genotype of PCR amplified human DNA. Error bars represent 99% confidence intervals.
FIG. 17 shows the ability of T4 DNA ligase to distinguish between delta F-508 and delta I-507 sequences as a function of NaCl concentration using a delta F-508 probe.
FIG. 18: The ability to discriminate 5 ′ (2) and 3 ′ (2) mismatches using T4 DNA ligase and Taq DNA ligase as a percentage of ligation.
FIG. 19: 3 ′ (1) mismatch discrimination ability as a percentage of ligation for various base pairs. Data are shown for two different concentrations of T4 DNA ligase (1 nM and 240 nM).
FIG. 20: 5 ′ (1) mismatch discrimination ability as a percentage of ligation for various base pairs. Data are shown for two different concentrations of T4 DNA ligase (1 nM and 240 nM).
Detailed Description of the Invention
This new technique has been developed for gene probe analysis. This first stage of DNA analysis generally involves an amplification technique (eg, PCR) to amplify the sequence of interest. Of course, amplification may not be necessary if a sufficient amount of unknown sequence is present in the analytical sample. After the amplification step, the amplification product is identified using a hybridization ligation method (HLM). Easily separable particles (eg, magnetic particles) are used with discriminating (labeling) moieties (eg, luminescent markers such as acridinium esters) to help identify gene sequences.
If the amount of sequence to be identified is not sufficient, an amplification method for amplifying the sequence of interest is included in the first part of the art. The PCR method has been known for several years. For example, Saiki et al. Describe an enzymatic amplification technique for the genomic sequence of β-globulin, in which two oligonucleotide primers are provided on either side of the region to be amplified and denatured genomic DNA.MuThe primer is annealed to the strand of DNA and extended using DNA polymerase and deoxyribonucleotide triphosphate from E. coli or Thermus acquaticus, and this cycle of denaturation, annealing and extension is repeated (Saiki et al., 230 Science 1350, 1985; Saiki et al., 239 Science 487, 1988). Recently, various amplification techniques have been developed [for example, ligase chain reaction (LCR) andQβReplicase], any of these amplification techniques can be used in place of PCR or in combination with one or more of the other amplification techniques. Furthermore, it is expected that other amplification techniques will be developed. The exact technique used for amplification is not important for the present invention, and it is assumed that those skilled in the art of gene probe methods are familiar with the techniques used here and the advantages and disadvantages of each technique. The important fact is that a relatively small amount of DNA sample is amplified, which increases the sensitivity of the analytical method used here.
The PCR method generally includes a technique as described above. There are many variations on this basic technique as known to those skilled in the art, such as “PCR Protocols” [Innis (MA), Gelfand (DH), Sninsky (JJ), and White. (TJ), published by Academic Press, 1990]. One example of how a PCR reaction is performed is detailed in the examples herein.
If an amplified sample is available, the material is analyzed by HLM. In HLM, a sequence partially or wholly complementary to a target sequence is introduced into two or more types of probes, and the probes are reacted with target oligonucleotides. In this specification, the case where only two types of probes are used is considered in many cases, but two or more probes can also be used as described later. A portion of the complementary sequence is bound to an insoluble substance (material) that can be easily separated from the reaction mixture. For example, magnetic particles are used. Other possible substances include substances that can be separated from the reaction mixture by centrifugation. On the other hand, the second part of the complementary sequence is bound to a substance (material) that can be detected by the analytical means. For example, a chemiluminescent material such as an acridinium ester is used. Other examples are fluorophores and chromophores. These two complementary sequences are hybridized to the target sequence. The hybridization solution contains a salt, which is generally about 500-700 mM NaCl, with a concentration of about 600 mM being most preferred. Hybridization is performed at an elevated temperature (eg, 45 ° C.). After hybridization, the insolubility of one of the probes is utilized to separate the hybridized from the unhybridized probe with the label. Then, using ligase, if the two complementary sequences of those probes are exactly matched to the target in the region adjacent to the binding portion of the two probes, their end nucleic acids are They are close enough to each other and are connected by ligase. On the other hand, if the target sequence is significantly different from the predicted sequence, the end nucleic acids on those probes are sufficiently separated from each other so that they cannot be bound by ligase. For example, if the target has a nucleotide deletion where two probes meet, the end nucleotide on one probe overlaps with the other probe and the two probes are not ligated. Similarly, if the target has an inserted nucleotide, the two probes are not close enough to each other and ligation does not occur. Furthermore, if there is a mismatch at the position where the two types of probes meet, the two types of probes will not be efficiently ligated under the conditions described herein.
Ligation proceeds as described above in response to the end bases of the probes binding to or failing to bind to the target, but those skilled in the art will be able to place the probes on the probes at positions away from such ends. You will notice that a mismatch also has some effect on the binding of the probe to the target. For example, if the base on the probe that is several bases away from the end base cannot bind to the corresponding base on the target, there is sufficient mismatch between the probe and the target so that the end probe is not ligated. May not occur. The steric factors and overall connectivity between the probe and the target will affect the overall effectiveness of the method in determining the target composition. On the other hand, the mismatching away from the connection part of the probe can have a great influence that the two types of probes are not ligated. The examples described below show cases where mismatches at sites separated by 2 bases from the probe connecting portion sufficiently hinder probe ligation.
Similarly,normalBy using several sets of probes that can be expected to hybridize to a portion of the sequence and be ligated, it can be determined whether the target contains a mutation. If it is found that no hybridization or ligation has occurred, it can be concluded that the target portion under investigation is probably mutated. A similar experiment can be performed by moving to the part next to the target. In this way, by sequentially moving along the target, it is possible to determine the single or multiple sites on the target where mutations are found, and to go further and to determine exactly what occurred at each mutation site. Experiments can be designed that can identify unique mutations.
Ligation is carried out under conditions that can ensure the specificity of the reaction (see Examples below). Ligation is performed using one of many available ligation reagents, and such ligation reagents generally achieve ligation by chemical or enzymatic action. One important difference between the conditions used in the present invention and the prior art is that it has been found that ligation specificity can be ensured by a fairly high salt concentration. It has been found that the conventionally used salt concentration (200 mM NaCl) causes ligation of mismatched probes. In the present invention, by using a high salt concentration, an unexpected improvement in specificity was observed. For example, to obtain a highly specific ligation using T4 DNA ligase, the salt concentration is typically about 500 to 700 mM NaCl, preferably about 600 mM, and concentrations up to about 1000 mM. Can be used.
It is also possible to carry out by changing the ligation process in various ways. For example, many different ligation reagents can be used, and the examples show the use of T4 DNA ligase and Taq DNA ligase. Furthermore, it may be preferable to include other components that increase the sensitivity of the reaction in the Taq ligase buffer. For example, it has been found that the inclusion of tRNA reduces the background signal caused by non-specific binding of labeled probes.
After performing the ligation step, the denaturation step separates the target sequence from the probe sequence and the ligation product from the non-ligated probe. The substance bound to the insoluble substance can then be separated from the reaction mixture by centrifugation, application of a magnetic field or other suitable technique, and a label (labeled substance) bound to the insoluble substance by the action of ligase Can know the existence of If the constituent components disclosed herein are used, the target substance can be separated using a technique other than chromatography or electrophoresis. Thus, the method can be performed more quickly than if electrophoresis or chromatography were used. Furthermore, this detection technique is excellent in quantitativeness by measuring radioactivity, fluorescence or luminescence. Other commonly available detection methods to which a label can be added later may be used. For example, biotin can be chemically bound to the probe, and after separation of the probe, the label bound to avidin or streptavidin is reacted with it to form a probe bound to a detectable label can do. Third, the technique of the present invention can also be used in some automated equipment, an example of such equipment is the ACS180 equipment manufactured by Ciba Corning Diagnostics (Medfield, Mass., USA). .
This technique can also be modified and used to obtain knowledge about the target sequence. If it is found that the label is not bound to an insoluble probe after denaturation, another aliquot from the reaction mixture that has not yet undergone denaturation may be analyzed. In this sample, insoluble markers can be separated (eg, by applying a magnetic field or by centrifugation), and the target can be analyzed to determine whether the marker probe is bound to the target. In such a case, most of the sequence of the target polynucleotide can be predicted by the hybridization of the two types of probes to the target, and the relevant region of the target can be determined by devising further experiments. The sequence in the vicinity (for example, near the ligation point) can be confirmed.
Alternatively, a similar analysis can be performed by denaturing the sample after ligation and then separating the solid phase. In this technique, both the separated solid phase and the supernatant (supernatant) are analyzed to determine whether a labeled probe is present. If the majority of the label is found only in the supernatant, it can be concluded that probe ligation has not occurred, suggesting a mismatch at the intended ligation point. However, because the labeled probe was binding to the target, it can be concluded that the target had the desired sequence or a sequence close to the desired, or that the labeled probe had That is, it was not hybridized. Therefore, even if ligation does not occur, many inferences regarding the target sequence are possible. Furthermore, the total amount of label in the supernatant and on the solid phase should approximate the total amount of target in the analytical sample. The percentage of labeled probe that was ligated would indicate homozygous or heterozygous (hetero) zygousity of the sample. Furthermore, from the ratio of the label on the solid phase to the label in the solution, further knowledge about the sequence on the probe, eg knowledge about the presence of a disease where some of the genetic material is replicated (eg fragile X) Can be obtained. In carrying out these analyses, it should be noted that the data does not exactly match the theoretically predicted values (ie, 100% label in the solid phase for homozygous samples Not found). (See examples below.)
Thus, if it is found that there is a possibility that a mutation occurs at a specific site, a specific probe can be prepared to confirm the target sequence. If there are several types of mutations at one site, design several probes and label each probe differently,normalIt is also possible to determine which mutation has occurred if it is a simple sequence or a mutant sequence. Similarly, a plurality of mutations occurring in the vicinity of each other in one target sequence can be determined. Furthermore, the method using the probe to which two or more different labels are attached as described above can also be applied to a case where multiple targets are expected, such as fragile X described above.
Examples of two different labels used within the same analysis include a fluorescent donor and fluorescent acceptor pair. In this case, by changing the irradiation light, the three possibilities can be distinguished using two types of labels. If the illumination light for the first probe produces fluorescence typical of the first label, it indicates that only the first target is present. If the fluorescence output is from the second label, one of the two targets is present. If the irradiation light that excites the first label produces fluorescence from the second label, it indicates that both targets are present. On the other hand, if only the irradiation light that excites the second label generates fluorescence derived from the second label, only the second target is present.
For example, multiple mutations have been found in one nearby region of the cystic fibrosis variant. For example, both the Delta F-508 and Delta I-507 mutations are deletions of 3 base pairs, and the positions of these mutations partially overlap within the CFTR gene sequence. . [For the sequence of the CFTR gene, see Zielenski et al. (10 Genomics 214, 1991). ]
Analysis of the PCR amplification product covering this sequence by polyacrylamide gel electrophoresis would not be able to easily separate these two mutations, which have the same size. Because. However, according to HLM, these mutations are distinguished. In addition,
Although there are some similarities between the HLM method and the ligase chain reaction (LCR), it should be noted that there are actually significant differences between these techniques. LCR itself is an already known amplification method. See, for example, “4 Genomics 560, 1989,” by Wu and Wallace, and “88 Proc. Nafl. Acad. Sci. USA 189, 1991” by Barany. In LCR, an oligonucleotide having two parts complementary to each strand of a fragment of a target gene to be amplified (the two parts together correspond to the entire target gene) should be amplified with ligase Add to gene sample. If added and the oligonucleotide is complementary to the target gene, the ligase will link the two oligonucleotides. LCR is an amplification method in which the sequence to be amplified is known and a fragment complementary to the target can be added to the reaction mixture, resulting in the addition of ligase. Sometimes ligation occurs and the target is amplified. The LCR is intended to be repeated for several cycles, thereby allowing the desired sequence to be obtained in large quantities.
In contrast, HLM is a technique for analysis, in which probes for one or more predicted sequences that may be found on a target are added to the target. The probe is bound to a substance or label that aids in separation from the reaction mixture. Furthermore, the reaction is intended to be performed only once.
Many variations of the HLM method are possible. For example, this detection method can be combined with column chromatography. In this approach, one of the oligonucleotide probes contains a substituent that causes attachment to the column chromatograph. For example, if one of the probes is biotinylated, the product after ligation is separated on avidin-sepharose. You may make it contain a fluorescent marker as another oligonucleotide. In this way, when the sample passes through the column chromatograph, the ligated oligonucleotide adheres to the chromatograph and becomes fluorescent. Thus, fluorescence in the column indicates that ligation has occurred. The fluorescent donor / acceptor pairs described above for column chromatography can also be used.
In other variations, the moiety to which the probe is attached is involved. In most cases, the first probe is bound to a portion (separable portion) that enables separation of the probe after ligation, and the second probe is bound to a portion that becomes a label. It is also possible to couple the probe to other moieties, such as other sequences. For example,QβIf you are using the replicase method,Midi variantThe probe can also be bound to two components having a (midivariant) sequence. In this case, theMidi variantThe first part of the array (eg,Midi variantBinding the first probe to A),Midi variantSecond part of (Midi variantA second probe is bound to B). After the ligation process,QβIf replication is observed during the reaction by replicase, two types of probes have been ligated (linked). That the probes were ligated means that they have the same sequence as the target.
Another variation of the method of the present invention relates to the timing of adding a flashing agent (luminescent agent) when using a specific luminescent label such as an acridinium ester. After denaturing and separating the probe after ligation, DNAase can be added before adding the flushing agent. In this way, since the insoluble probe may interfere with the amount of light emitted when the flush agent is added, a highly sensitive test can be performed. Therefore, by separating the insoluble probe before the addition of the flushing agent, a signal with higher specificity can be generated.
Yet another variation relates to the number of probes used. A preferred approach is to use two types of probes: a probe that promotes separation and a probe that facilitates detection, although two or more types of probes can also be used. In this case, one of the probes contains a separable moiety and the other one contains a detection moiety. If the separable moiety is on one end probe and the label (detection) moiety is on the other end probe, the probe in between need not contain a label. In this experiment, if the labeling probe is bound to the separable probe after ligation, the intermediate probe is also hybridized to the target. The reason is that if not, the label probe is not ligated to the probe portion containing the separable probe. In other variations of multiple probe experiments, one probe contains a separable moiety and all other probes are labeled. In this case, after ligation, the amount of label bound to the separable moiety will indicate whether all probes have been ligated. By using more than two types of probes and combining with the above-described deformation modes (for example, analysis with or without ligation, analysis before denaturation, etc.), various forms of analysis can be performed. Will be apparent to those skilled in the art.
Furthermore, the position of the separable part or the detection part can be changed. They are preferably at the end of the probe, but can be attached at any position on the probe as long as they do not interfere with hybridization and ligation.
Yet another advantage of the novel approach according to the present invention is that it is now possible to distinguish between two mutations that are closely related to each other (eg, mutations that occur in adjacent nucleotides).
Another advantage of the present invention is that different markers can be used for different probes in the same experiment. Thus, for example, using different markers for each probe, one of two possible mutations can be confirmed in a single test. Both markers can be separated from the sample and can be distinguished, for example, via different absorption spectra. Furthermore, by using different insoluble particles, the two types of probes can be separated from each other before analysis. For example, if one probe depends on insoluble and non-magnetic particles and the other probe uses insoluble and magnetic particles, a magnetic field can be applied first to remove the magnetic particles and their associated markers. Then, if the remaining liquid is centrifuged, the non-magnetic insoluble particles can be removed together with the marker bound thereto. Other variations of such separation methods will be apparent to those skilled in the art. Thus, these two types of markers can be distinguished from each other even if they have the same label. By combining a variation of the technique that can be used for both separation and detection in one experiment, it is possible to confirm in one experiment that one of several mutations or genetic mutations is present. For example, magnetic particles (M) are used for some probes, non-magnetic particles (NM) are used for other probes; and chemiluminescent substance A is used for some of the second oligonucleotides in the probes. In addition to the use, the remaining chemiluminescent substance B is used. In this way, it is possible to detect four mutations in one experiment by slightly changing these two parameters. (Ie, in this case, the adduct to the probe is MA, NM-A, MB, NM-B). Particles that have different markers and can be separated from each other (ie, different It is also possible to detect many genetic mutations in one experiment by using spectral characteristics or other characteristics.
Another advantage of the novel approach of the present invention is that it is more sensitive than conventional approaches. This increase in sensitivity is due to several factors. For example, an analysis method for confirming the presence of the target substance is highly sensitive. The method of separating the insoluble particles and analyzing the markers bound to them is more than the method using electrophoresis, which must separate each component and rely on staining to qualitatively and quantitatively analyze the presence of the target. Is much more sensitive. The above-described method can be further modified. For example, after separating insoluble particles from the reaction mixture, the amount of target can be determined by measuring the amount of marker bound to the insoluble particles when the insoluble particles are precipitated (eg, for insoluble materials). Apply traditional quantitative analysis). Alternatively, after separating insoluble particles from the reaction mixture, the particles can be resuspended and the resuspended particulate marker can be measured. It is also possible to separate the marker from the insoluble particles and measure the marker when both the marker and the insoluble particles are in solution or suspension. In addition, after separating the marker from the insoluble particles, the insoluble particles can be separated from the solution, and the marker can be measured in the absence of the insoluble particles.
In addition to detecting a specific DNA sequence, the HLM can also be used to detect a specific RNA sequence if the ligase can be ligated with a probe hybridized to the RNA target. The techniques of the present invention can also be used for the analysis of viral material and other polynucleic acid sequences. Furthermore, as shown in the examples, HLM can distinguish sequences that differ at sites other than the probe ligation junction, so this approach scans long sequence segments that contain the entire gene. ThenormalIt can be easily applied to examine mutations different from the sequence.
Other variations of the invention will be apparent to those skilled in the art. The following examples illustrate various aspects of the present invention, but are not intended to limit their usefulness.
Example 1: Simultaneous analysis of normal and delta F-508 alleles by chemiluminescence hybridization-ligation analysis using probes labeled with DMAE and LEAE
Delta F-508 in cystic fibrosis in human DNA samples tested by chemiluminescence (luminescence) hybridization-ligation method and amplified by PCRSequence number 1) The detection performance of the mutation was examined. In addition, for each samplenormalAlleles (Sequence number 2) and the presence of the delta F-508 allele was determined using probes specific for each allele but labeled with two different acridinium esters (DMAE and LEAE). DMAE derivatives (dimethylacridinium esters) chemiluminescent in the short wavelength region (400-500 nm), and LEAE [longer wave length emitting acridinium esters] chemically in the long wavelength region (500-600 nm) It emits light.
Nine samples of human DNA (250 ng) obtained from an external research institution were amplified by the polymerase chain reaction (see Saiki et al., 239 Science 487, 1988). The primers used were obtained from Genset (located in Paris, France) and had the following sequences:
The target sequence amplified by PCR reaction using these primers consisted of 97 base pairs covering 1611 to 1708 bases of the CFTR gene (3) (the delta F-508 allele was 94 base pairs). .
PCR reaction system (75 μl) was prepared using 30 pmol of each primer, 1.9 mM MgCl.2, ATP, TTP, GTP and CTP each contained 200 μM and 2.5 U Taq DNA polymerase. After denaturing at 95 ° C. for 5 minutes, the samples were amplified by performing 30 cycles of PCR consisting of annealing at 60 ° C. for 45 seconds, extension at 72 ° C. for 1 minute, and denaturation at 95 ° C. for 45 seconds. After the final cycle, each sample was incubated at 72 ° C. for 5 minutes.
An aliquot of the PCR reaction solution was denatured and then added to the following chemiluminescence detection reaction system: 100 μl TE, 4 × SSC, 0.1% BSA, 0.02% Tween-20, 10 μg paramagnetic particles (PMP). 5% dextran sulfate with immobilized probe (PMP) and each acridinium ester (508.CF-DMAE and 508.NOR-LEAE) labeled
Possible analysis formats are summarized in FIG.
The probe was hybridized to the PCR product at 45 ° C. for 15 minutes. The particles were magnetically separated and the unhybridized probe was removed by decanting the supernatant. The particles were washed with 2 × SSC / 0.1% Tween-20.
100 μl of 50 mM Tris (pH 7.6), 10 mM MgCl2The hybridized probe was ligated by resuspending the particles in a solution consisting of 1 mM ATP, 1 mM DTT, 5
The results of this chemiluminescence hybridization / ligation analysis for the PCR amplification products are shown in FIG. From the resulting chemiluminescent signal, the delta F-508 allele and the PCR amplification productnormalIt was clearly confirmed that the allele was present. As expected, allele-specific probes hybridized to each sample regardless of genotype, and the subsequent ligation step distinguished the sequences of two different alleles. This is because efficient ligation was observed only at the junction of the hybridizing probe completely complementary to the target sequence.
Detection of these alleles using chemiluminescence enabled the diagnosis of these samples, and the results were in complete agreement with the analysis of the same group of samples by another laboratory with one exception.
Delta F-508 allele andnormalEach sample was analyzed using AE probes specific for both alleles to identify the genotype of those samples. The intensity of chemiluminescence (FIG. 2) also indicated the genotype of the sample. That is, for heterozygous individuals, intermediate levels of chemiluminescence were observed (eg, in
Example 2: Discrimination of Delta F-508 and Delta I-507 mutations by chemiluminescence hybridization-ligation
The Delta F-508 mutation is the most common mutation in cystic fibrosis (CF) and occurs in about 68% of the cystic fibrosis chromosome (3). This mutation is a deletion of 3 base pairs in
In Example 1, chemiluminescence hybridization-ligation analysis was performed with the Delta F-508 allele.normalIt showed the ability to distinguish from alleles. In this example, we show that the analysis is capable of distinguishing between the Delta F-508 allele and the Delta I-507 allele. In this application, it is necessary for the ligation process to distinguish sequences that differ in a single position. Furthermore, the mismatch site in these hybrids occurs with one base removed from the ligation junction. Hybrids and different target sequences formed between the Delta F-508 and Delta I-507 probes are shown in FIG.
Nine clinical samples (same as Example 1) obtained from human DNA amplified by polymerase chain reaction were analyzed for the presence of Delta I-507 mutation. In this analysis, the same format as in the example was followed, but the solid phase and acridinium ester (DMAE) labeled probe were as follows.
For the additional 3 samples of PCR amplified human DNA, Delta F-508, Delta I-507 and Delta F-508 and the same protocol as before and using Taq DNA ligase (Epicentre Technologies)normalAllele analysis was performed. Since Taq DNA ligase has thermal stability, the ligation reaction can be performed at a high temperature, and the hybridization and ligation steps can be performed simultaneously. The buffer used for this simultaneous hybridization-ligation was 20 mM Tris (pH 8.3), 200 mM KCl, 10 μM tRNA, 10 mM MgCl.2, 0.5 mM NAD, and 0.01% Triton X-100. The reaction system contained 100 units of Taq DNA ligase. Simultaneous hybridization-ligation was performed at 60 ° C. for 30 minutes.
The results of nine samples of chemiluminescence hybridization-ligation analysis are shown in FIG.
Delta F-508, Delta I-507 andnormalThe results for alleles are shown in FIG. 6 and FIG. The identity of these samples was confirmed by sequencing.
The results of Examples 1 and 2 show that chemiluminescence hybridization-ligation analysis can identify sequences that differ by one base at a distance of only one base from the ligation junction. In a special application according to this example, the cystic fibrosis mutations Delta F-508 and Delta I-507 were distinguished. This allowed a sample previously considered Delta F-508 / N to be correctly identified as Delta I-507 /
Example 3: G542X mutation analysis of cystic fibrosis
According to previous examples, chemiluminescence hybridization-ligation analysis has been performed at delta F-508 and delta I-507 mutation sites.normalIt showed the ability to discriminate between alleles and cystic fibrosis alleles. G542X, a third cystic fibrosis mutation (Sequence number11) is a point (sudden) mutation occurring in
G542X was analyzed using Taq DNA ligase by the same simultaneous hybridization-ligation analysis as described in Example 2. The sequence of the G542X probe was as follows.
The analysis results are shown in FIG. 8, and for the G542X sequence, G542X. Only the CF probe is ligated, andnormalThe sequence includes G542X. Only the NOR probe is ligated. In this example, the TC and GA mismatches at the ligation junction were not efficiently ligated.
Example 4: Simultaneous analysis of Delta F-508 and G542X
Chemiluminescence hybridization-ligation analysis can be used to detect multiple sequences simultaneously. One example of such performance is the delta F-508 allele andnormalIt was simultaneous detection of alleles (Example 1). Another application is to detect two or more mutations latent in genetic diseases and cancer. For example, it has been reported that there are more than 200 mutations latent in cystic fibrosis. The Delta F-508 mutation is the most common mutation and occurs in about 68% of the cystic fibrosis chromosome. The second most common cystic fibrosis mutation is the G542X mutation, which is a point mutation that occurs in
A model analysis for performance testing was performed using the synthesized target sequences. The analysis protocol was the same as that described in Example 2, and simultaneous hybridization-ligation was performed using Taq DNA ligase. Each set was used for F-508 mutation and G542X mutation, respectively, using two types of solid phase and two types of probes labeled with acridinium ester. The probe for Delta F-508 mutation is the same as that described in Example 1, except that the acridinium ester label is LEAE. The sequence of the probe for G542X is the same as that used in Example 3. The analysis results are summarized in FIG. 1 and show that delta F-508 and G542X sequences were detected using any combination of targets. This indicates that multiple gene mutations can be detected in the same analysis.
Example 5: Identification of G551D, G551S and Q552X cystic fibrosis mutations
The probe sequences used in the G551D analysis are as follows.
In the analysis, G551D. CF and G551D. NOR at their 5 'end32Labeled with P. Detection of the ligation product was performed by liquid phase scintillation counting. The analysis was performed according to known protocols using T4 DNA ligase and Taq DNA ligase, or by modifying the salt conditions in the protocol to improve the specificity of the HLM. This includes increasing the NaCl concentration from 200 mM to 600 mM when using T4 DNA ligase. In the protocol using Taq DNA ligase, NaCl was used instead of KCl. The detailed conditions for ligation are shown below.
FIG. 10 shows the results of HLM analysis using T4 DNA ligase and NaCl of 200 mM. Although it was possible to distinguish the G551D sequence from other mutant sequences by HLM, G551D. G551D sequence with CF probenormalThere was no substantial difference between the sequences. Therefore, the HLM specificity using T4 DNA ligase was improved by increasing the NaCl concentration to 600 mM (FIG. 11). By performing HLM using Taq DNA ligase, the discrimination performance is further improved, and under these conditions, G551D. CF probe or G551D. Sequence differences were easily identified using NOR probes. 200 mM KCl and G551D. According to the protocol using Taq DNA ligase with CF, the G551D sequence andnormalThe distinction between sequences was obvious,normalLigation beyond the bagland was observed for the target. This signal could be reduced by substituting NaCl in the protocol using Taq DNA ligase (FIG. 13).
Taking the above results together, HLM can identify sequences that differ by only one base, especially when such single base change sites are located away from the ligation junction. It is clear that
Example 6: Systematic examination of the specificity of hybridization-ligation using the p53 model
The previous examples established that HLM has the ability to identify subtle differences in sequences including deletions, insertions and point mutations. In each of the cases examined, conditions were established that allowed ligation specificity to be able to distinguish such sequence differences. In this example, the specificity of the HLM is systematically examined by examining the ability to identify sequences that differ by every possible combination of mismatches.
The p53 gene encodes a protein that functions as a tumor suppressor. Mutations in this gene are found in a wide range of tumors, and the positions where such mutations are most common are clustered around codons 175, 245 and 248. A part of the p53 gene around codon 175 was selected as a model for systematically examining the ligation specificity (Sequence numbertwenty three). The target and probe sequences for this model are shown in FIG. Hybridization and ligation were performed in solution. In order to perform analysis using T4 DNA ligase, the probe (in the ligation buffer containing NaCl at the aforementioned concentration was used.32labeled pSequence number24 and 25) were mixed with the target. The reaction was incubated for 15 minutes at 37 ° C., T4 DNA ligase (1 U) was added, and the reaction was incubated for an additional 15 minutes at 37 ° C. An aliquot of the reaction was analyzed by denaturing (8M urea) polyacrylamide (15%) gel electrophoresis. Bands corresponding to ligated product and unligated oligomers were excised and counted by liquid phase scintillation counting to calculate the percentage of total ligated oligomers. Analysis using Taq DNA ligase was performed in the same manner. However, in this case, the ligase was added at the start of the reaction.
Table II summarizes the ability of T4 DNA ligase to discriminate against mismatches that occurred at the 5 'phosphate or 3' OH nucleotide position of the ligation junction when 200 mM NaCl was used. Mismatches at 3'OH nucleotides were much easier to distinguish than mismatches at 5'P nucleotides. Increasing the NaCl concentration to 600 mM improved the specificity of T4 DNA ligase over that at 200 mM. At 600 mM NaCl, all possible mismatches were identified at either the 5'P or 3'OH positions, and even GT and CA mismatches were identified (Table III).
The specificity of Taq DNA ligase at 45 ° C. in 200 mM KCl was superior to that of T4 DNA ligase. Furthermore, the presence of NaCl in the Taq ligase buffer improved the specificity of Taq DNA ligase somewhat.
Example 7: Delta F-508 in PCR amplified human DNA using percentage of ligation as diagnostic criteria andnormalAllele analysis
A sample of human DNA amplified by PCR was obtained from an independent research institution. As described in the previous examples, the delta F-508 allele (Sequence numberThe HLM analysis of 1) was performed. In the denaturation step to remove the hybridized but not ligated probe, the supernatant containing this released probe is stored and flashed separately, hybridized and ligated labeled Apart from flushing PMP containing probe. The sum of the chemiluminescent signals from the supernatant and PMP is a measure of the total amount of labeled probe hybridized to the sample, which in turn is a measure of the total amount of sample DNA in the reaction system. Further, by dividing the chemiluminescence signal from the PMP by the sum of the chemiluminescence signal from the supernatant and the PMP, the fraction (fraction) of the hybridized probes that have undergone ligation can be obtained. Since the amount of PCR product obtained from each sample of human DNA may vary from sample to sample, the fraction of ligated labeled probes indicates that the sample is homozygous for one allele, Heterozygous samples and samples that do not contain such alleles can be clearly distinguished. Further, the probe can be a delta F-508 allele,normalMeasuring the chemiluminescence of the labeled probe released in the denaturation step is negative for the ligation, as it is expected to hybridize to the allele and the Delta I-507 allele It becomes a means to judge whether it is acting on such a sample correctly.
The results of Delta F-508 analysis by HLM are calculated as percent ligation (percent ligation) and are summarized in FIG. By calculating the percentage of labeled probe that was ligated, it was possible to clearly distinguish between homozygous, heterozygous, and negative samples. It can be seen that this calculated value is a more reliable diagnostic index than raw chemiluminescence data. This is because the sample was found to change more than 5 times in the total amount of DNA present. In FIG.normalThe results of a similar analysis performed on the allele are compared with the results of the Delta F-508 analysis.
Example 8: Effect of NaCl concentration on discrimination between Delta F-508 allele and Delta I-507 allele
The sequences of these two types of alleles differ at one place (see FIG. 4). It was possible to distinguish between these two cystic fibrosis mutations by HLM using T4 DNA ligase in 200 mM NaCl (see Examples 1 and 2). In light of the results of Example 6 showing the effect of NaCl concentration on the specificity of T4 DNA ligase using the p53 sequence, T4 discriminates between the Delta F-508 and Delta I-507 sequences using the Delta F-508 probe. The effect of NaCl concentration on the performance of DNA ligase was investigated. HLM was performed on the synthetic target sequences of Delta F-508 and Delta I-507 as previously described. However, the ligation buffer was prepared with 200, 400, 600, 800 or 1000 mM NaCl. In the denaturation step, the supernatant was stored and separately flushed (luminescent) to measure the amount of hybridized but not ligated probe. As in Example 7, ligated 508. of the total hybridized amount. The percent of CF-DMAE probe was calculated.
The results are summarized in FIG. Delta F-508 and Delta I-507 sequences could be fully distinguished by T4 DNA ligase in 200 mM NaCl. As the salt concentration was increased to 600 mM, the amount of ligation observed for the Delta I-507 sequence was suppressed, but the level of ligation for the Delta F-508 sequence was maintained, thereby improving the discrimination performance between those sequences. . When the NaCl concentration exceeds 600 mM, ligation begins to decrease for the Delta F-508 target.
Example 9: Hybridization-ligation analysis of ΔF-508 using biotinylated probe and avidin-PMP
Hybridization and ligation reactions were performed in solution using a biotinylated probe (Biotin-CF1) and an acridinium ester labeled probe (508.CF-AE). 1 pmol Biotin-CF1, 100
This analysis format shows that a universal solid phase reagent (avidin-PMP) can be used with a biotinylated probe. This format may be particularly useful when intended for multiplex analysis where it is desired to perform analysis of multiple loci in the same test tube. Furthermore, solid phase hybridization and ligation can proceed more rapidly than with a single probe immobilized on PMP.
Example 10: Ligation specificity and G551D model results
The above results are extended to the results obtained in Example 5 herein. Hybridization-ligation analysis was performed using T4 DNA ligase and Taq DNA ligase as described above. The results of analysis using an AE probe specific for the G551D sequence are summarized in the following table. Further knowledge regarding ligation specificity is obtained by using a target sequence designated R553X (see Table VI).
G551D. Analysis using a NOR probe could distinguish between the G551S and Q552X sequences. This indicates that T4 DNA ligase and Taq DNA ligase have the ability to identify mismatches at locations other than the ligation junction. Furthermore, G551D. It is considered that T4 DNA ligase can distinguish the R553X sequence by analysis using NOR. For this purpose, it is necessary to identify a mismatch at a position where the enzyme is separated by 5 bases from the 3 ′ hydrogen group side of the ligation junction.
This analysis shows that improved discrimination can be obtained when there are two mismatches instead of a single mismatch. For example, G551D. In analysis using NOR, Taq ligase does not identify the R553X sequence. In other words, the 3 ′ (5) TG mismatch does not interfere with ligation by Taq DNA ligase. G551D. In analysis using CF,normalThe rate of misligation for the target sequence was 5%, while the rate of misligation for R553X was 2%. This indicates that it is useful to introduce a mismatch at a place where several bases are separated from the ligation junction in order to improve the discrimination ability. Ultimately, such a strategy makes it possible to identify mismatches that are not currently identified. Such views are discussed in G551D. It will be apparent when considering analysis using CF and T4 DNA ligase. This enzyme did not identify a GT mismatch at 5 '(1), but the mismatch combination that occurred at R553X was identified.
Example 11: Identification of a mismatch at a position away from the ligation connection
Using the p53 model described earlier in this specification, the ability of T4 DNA ligase and Taq DNA ligase to discriminate mismatches at positions one base away from the ligation junction was systematically examined. These positions are referred to as 5 '(2) and 3' (2) depending on which side the ligation link is on. The results are summarized in the attached figure. All mismatches at the 3 '(2) position were identified by either enzyme. Neither enzyme identified all mismatches at 5 '(2). (See FIG. 18).
Example 12: Effect of enzyme concentration on ligation specificity
Comparison was made with two concentrations of T4 DNA ligase, namely 1 nM and 240 nM. The ability to discriminate 5 '(1) mismatches and 3' (1) mismatches of T4 DNA ligase was examined using the p53 model. The results are summarized in the figure. Clearly, the ligation specificity for 3 '(1) mismatches is improved at low concentrations and the ligation for complementary matches is not substantially impaired. An improvement was also observed for the 5 '(1) mismatch, especially for the purine-purine mismatch, but overall it was not significantly significant for the 3' (1) mismatch. (See FIGS. 19 and 20.)
Array list
(1) General information
(i) Applicant: Ciba Corning Diagnostics Corp. Martinelli, Richard A. Arruda, John C.
(ii) Title of invention: Hybridization-Ligation Assays for the Detection of Specific Nucleic Acid Sequences.
(iii) Number of sequences: 26
(iv) Contact address:
(A) Address: Ciba-Corning Dagnostics Corp.
(B) City: 63 North Street
(C) City: Medfield
(D) State: Massachusetts
(E) Country: USA
(F) ZIP number: 02052
(v) Computer decoding format
(A) Medium: 3.5 inch disk, storage capacity 1.44 Mb
(B) IBM compatible
(C) Operating system: IBM DOS5.0
(D) Software: WORD 6.0
(vi) Data related to this application
(A) Application number: Not yet available
(B) Application date: Not yet available
(C) Classification: Not available
(vii) Data on prior applications
(A) Application number: US08 / 222,613
(B) Application date: April 4, 1994
(C) Classification: Not available
(viii) Agent information
(A) Name: Morgenstern, A.S.
(B) Registration number: 28,244
(C) Reference number: CCD-113
(ix) Communication method information
(A) Telephone: 508-359-3836
(B) Facsimile: 508-359-3895
(2)Sequence numberInformation about 1:
(i) Sequence features:
(A) Length: 47 bases
(B) Type: Nucleic acid
(C) Chain: Single chain
(D) Topology: Linear
(ii) Molecular type: genomic DNA
(A) Content: Delta F-508. A part of the sequence of the CFTR gene, which surrounds base number 1652 but lacks bases 1653 to 1655.
(xi) Array:Sequence number: 1:
(3)Sequence numberInformation about 2:
(i) Sequence features:
(A) Length: 50 bases
(B) Type: Nucleic acid
(C) Chain: Single chain
(D) Topology: Linear
(ii) Molecular type: genomic DNA
(A) Contents:normal. Part of the sequence of
(xi) Array:Sequence number: 2:
(Four)Sequence numberInformation about 3:
(i) Sequence features:
(A) Length: 24 bases
(B) Type: Nucleic acid
(C) Chain: Single chain
(D) Topology: Linear
(ii) Molecular type: genomic DNA
(A) Content: C16B. Bases 1611 to 1634 of
(xi) Array:Sequence number: 3:
(Five)Sequence numberInformation about 4:
(i) Sequence features:
(A) Length: 24 bases
(B) Type: Nucleic acid
(C) Chain: Single chain
(D) Topology: Linear
(ii) Molecular type: genomic DNA
(A) Content: C16D. Bases 1708-1684 of
(xi) Array:Sequence number: 4:
(6)Sequence numberInformation about 5:
(i) Sequence features:
(A) Length: 53 bases
(B) Type: Nucleic acid
(C) Chain: Single chain
(D) Topology: Linear
(ii) Molecular type: other DNA / genomic DNA
(A) Content: PMP. 508. Bases 1-29 are synthetic DNA spacers. Bases 30-53 consist of bases 1656-1678 of
(xi) Array:Sequence number: 5:
(7)Sequence numberInformation about 6:
(i) Sequence features:
(A) Length: 24 bases
(B) Type: Nucleic acid
(C) Chain: Single chain
(D) Topology: Linear
(ii) Molecular type: genomic DNA
(A) Contents: 508. CF. Bases 1629-1652 of
(xi) Array:Sequence number: 6:
(8)Sequence numberInformation about 7:
(i) Sequence features:
(A) Length: 27 bases
(B) Type: Nucleic acid
(C) Chain: Single chain
(D) Topology: Linear
(ii) Molecular type: genomic DNA
(A) Contents: 508. NOR. Bases 1629-1655 of
(xi) Array:Sequence number: 7:
(9)Sequence numberInformation about 8:
(i) Sequence features:
(A) Length: 47 bases
(B) Type: Nucleic acid
(C) Chain: Single chain
(D) Topology: Linear
(ii) Molecular type: genomic DNA
(A) Content: Delta I-507. A part of the sequence of
(xi) Array:Sequence number: 8:
(Ten)Sequence numberInformation about 9:
(i) Sequence features:
(A) Length: 56 bases
(B) Type: Nucleic acid
(C) Chain: Single chain
(D) Topology: Linear
(ii) Molecular type: genomic DNA / other DNA
(A) Content: PMP. 507.
(xi) Array:Sequence number: 9:
(11)Sequence numberInformation about 10:
(i) Sequence features:
(A) Length: 24 bases
(B) Type: Nucleic acid
(C) Chain: Single chain
(D) Topology: Linear
(ii) Molecular type: genomic DNA
(A) Contents: 507. CF. It consists of bases 1626-1649 of
(xi) Array:Sequence number: 10:
(12)Sequence numberInformation about 11:
(i) Sequence features:
(A) Length: 54 bases
(B) Type: Nucleic acid
(C) Chain: Single chain
(D) Topology: Linear
(ii) Molecular type: genomic DNA
(A) Content: G542X. This consists of bases 1731 to 1784 of
(xi) Array:Sequence number: 11:
(13)Sequence numberInformation about 12:
(i) Sequence features:
(A) Length: 54 bases
(B) Type: Nucleic acid
(C) Chain: Single chain
(D) Topology: Linear
(ii) Molecular type: genomic DNA
(A) Content: NOR1731.54. Bases 1731 to 1784 of
(xi) Array:Sequence number: 12:
(14)Sequence numberInformation about 13:
(i) Sequence features:
(A) Length: 52 bases
(B) Type: Nucleic acid
(C) Chain: Single chain
(D) Topology: Linear
(ii) Molecular type: other DNA / genomic DNA
(A) Content: PMP. G542X.
(xi) Array:Sequence number: 13:
(15)Sequence numberInformation about 14:
(i) Sequence features:
(A) Length: 27 bases
(B) Type: Nucleic acid
(C) Chain: Single chain
(D) Topology: Linear
(ii) Molecular type: genomic DNA
(A) Content: G542X. CF. This consists of bases 1756 to 1730 of
(xi) Array:Sequence number: 14:
(16)Sequence numberInformation about 15:
(i) Sequence features:
(A) Length: 27 bases
(B) Type: Nucleic acid
(C) Chain: Single chain
(D) Topology: Linear
(ii) Molecular type: genomic DNA
(A) Content: G542X. NOR. Bases 1756-1730 of
(xi) Array:Sequence number: 15:
(17)Sequence numberInformation about 16:
(i) Sequence features:
(A) Length: 45 bases
(B) Type: Nucleic acid
(C) Chain: Single chain
(D) Topology: Linear
(ii) Molecular type: genomic DNA
(A) Content: G551D. This consists of bases 1763 to 1807 of
(xi) Array:Sequence number: 16:
(18)Sequence numberInformation about 17:
(i) Sequence features:
(A) Length: 45 bases
(B) Type: Nucleic acid
(C) Chain: Single chain
(D) Topology: Linear
(ii) Molecular type: genomic DNA
(A) Content: NOR17632.45. Bases 1763-1807 of
(xi) Array:Sequence number: 17:
(19)Sequence numberInformation about 18:
(i) Sequence features:
(A) Length: 45 bases
(B) Type: Nucleic acid
(C) Chain: Single chain
(D) Topology: Linear
(ii) Molecular type: genomic DNA
(A) Content: G551S. This consists of bases 1763 to 1807 of
(xi) Array:Sequence number: 18:
(20)Sequence numberInformation about 19:
(i) Sequence features:
(A) Length: 45 bases
(B) Type: Nucleic acid
(C) Chain: Single chain
(D) Topology: Linear
(ii) Molecular type: genomic DNA
(A) Content: Q552X. This consists of bases 1763 to 1807 of
(xi) Array:Sequence number: 19:
(twenty one)Sequence numberInformation about 20:
(i) Sequence features:
(A) Length: 52 bases
(B) Type: Nucleic acid
(C) Chain: Single chain
(D) Topology: Linear
(ii) Molecular type: other DNA / genomic DNA
(A) Content: PMP. G551D.
(xi) Array:Sequence number: 20:
(twenty two)Sequence numberInformation about 21:
(i) Sequence features:
(A) Length: 22 bases
(B) Type: Nucleic acid
(C) Chain: Single chain
(D) Topology: Linear
(ii) Molecular type: genomic DNA
(A) Content: G551D. CF. This consists of bases 1784 to 1763 of
(xi) Array:Sequence number: 21:
(twenty three)Sequence numberInformation about 22:
(i) Sequence features:
(A) Length: 22 bases
(B) Type: Nucleic acid
(C) Chain: Single chain
(D) Topology: Linear
(ii) Molecular type: genomic DNA
(A) Content: G551D. NOR. Bases 1784-1763 in
(xi) Array:Sequence number: 22:
(twenty four)Sequence numberInformation about 23:
(i) Sequence features:
(A) Length: 35 bases
(B) Type: Nucleic acid
(C) Chain: Single chain
(D) Topology: Linear
(ii) Molecular type: genomic DNA
(A) Content: p53. 35 bases on both sides of codon 175 of p53 gene.
(xi) Array:Sequence number: 23:
(twenty five)Sequence numberInformation about 24:
(i) Sequence features:
(A) Length: 16 bases
(B) Type: Nucleic acid
(C) Chain: Single chain
(D) Topology: Linear
(ii) Molecular type: genomic DNA
(A) Content: p53.5 ′. A 16-base sequence extending from C to 5 'of codon 175 of the p53 gene.
(xi) Array:Sequence number: 24:
(26)Sequence numberInformation about 25:
(i) Sequence features:
(A) Length: 19 bases
(B) Type: Nucleic acid
(C) Chain: Single chain
(D) Topology: Linear
(ii) Molecular type: genomic DNA
(A) Content: p53.3 '. A 19-base sequence extending 3 'from G of codon 175 of the p53 gene.
(xi) Array:Sequence number: 25:
(27)Sequence numberInformation about 26:
(i) Sequence features:
(A) Length: 45 bases
(B) Type: Nucleic acid
(C) Chain: Single chain
(ii) Molecular type: genomic DNA
(A) Content: R533X. This consists of bases 1763 to 1807 of
(xi) Array:Sequence number: 26
(28)Sequence numberInformation about 27:
(i) Sequence features:
(A) Length: 24 bases
(B) Type: Nucleic acid
(C) Chain: Single chain
(ii) Molecular type: genomic DNA
(A) Content: CF1. Bases 1656 to 1678 of
(xi) Array:Sequence number: 27:
Claims (24)
(a)前記ターゲットポリ核酸配列が正常配列を有する場合には第1のプローブおよび第2のプローブが前記ターゲットポリ核酸配列に完全に相補的であり、前記ターゲットポリ核酸配列が変異配列を有する場合には第1のプローブまたは第2のプローブが前記ターゲットポリ核酸配列に対してミスマッチを有するように、分離性部分に結合させた第1のプローブと、ラベルに結合させた第2のプローブとを用意し、
(b)前記第1のプローブおよび前記第2のプローブが前記ターゲットポリ核酸配列にハイブリダイズするような条件下で、前記第1のプローブおよび前記第2のプローブと前記ターゲットポリ核酸配列とを混合して第1の反応混合物を形成し、
(c)前記第1のプローブおよび前記第2のプローブが前記ターゲットポリ核酸配列にマッチングしている場合に前記第1のプローブと前記第2のプローブが連結されるような条件下で、ライゲーション用試薬を添加して第2の反応混合物を形成し、
(d)前記第1のプローブの前記分離性部分を利用して反応混合物から前記第1のプローブを分離し、さらに
(e)分離後の第1のプローブを分析して、前記第2のプローブのラベルが結合されているか否かを決定する工程、を含み、必要に応じて、前記工程(c)と(d)の順序は逆であってよく、あるいは前記工程(c)を前記工程(b)と同時に行ってよく、
前記ライゲーション工程(c)において、前記第2の反応混合物中に200から1000mMの塩化ナトリウムが含まれるか、あるいは100mMから200mMの塩化カリウムが含まれ、
ライゲーションが起こらないことが見出される場合には、前記ターゲットポリ核酸配列に変異が生じていると特定されることを特徴とする方法。A method for identifying a target polynucleic acid sequence comprising:
(a) When the target polynucleic acid sequence has a normal sequence, the first probe and the second probe are completely complementary to the target polynucleic acid sequence, and the target polynucleic acid sequence has a mutated sequence The first probe or the second probe has a first probe bound to the separable moiety so that the first probe or the second probe has a mismatch with the target polynucleic acid sequence, and a second probe bound to the label. Prepare
(b) mixing the first probe, the second probe and the target polynucleic acid sequence under conditions such that the first probe and the second probe hybridize to the target polynucleic acid sequence To form a first reaction mixture,
(c) For ligation under conditions such that the first probe and the second probe are linked when the first probe and the second probe match the target polynucleic acid sequence Adding a reagent to form a second reaction mixture;
(d) separating the first probe from the reaction mixture using the separable portion of the first probe;
(e) analyzing the first probe after separation to determine whether the label of the second probe is bound, and if necessary, the steps (c) and (d ) May be reversed, or step (c) may be performed simultaneously with step (b) ,
In the ligation step (c), the second reaction mixture contains 200 to 1000 mM sodium chloride, or 100 mM to 200 mM potassium chloride ,
A method characterized in that if it is found that ligation does not occur, the target polynucleic acid sequence is identified as mutated.
(i) 分離性部分を含有するプローブを分離し;さらに
(ii)分離後のプローブを分析して、それにラベルが結合されているか否かを決定する;により、ラベルがターゲットにハイブリダイズされたか否かを決定する工程を追有することを特徴とする請求の範囲第2項記載の方法。Prior to denaturation, an aliquot of the reaction solution is removed and analyzed to perform the following operations:
(i) separating the probe containing the separable moiety;
(ii) analyzing the probe after separation to determine whether or not a label is bound thereto; thereby further comprising the step of determining whether or not the label is hybridized to the target. The method according to claim 2, wherein
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US22261394A | 1994-04-04 | 1994-04-04 | |
US08/222,613 | 1994-04-04 | ||
PCT/IB1995/000226 WO1995027078A1 (en) | 1994-04-04 | 1995-04-03 | Hibridization-ligation assays for the detection of specific nucleic acid sequences |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH09510878A JPH09510878A (en) | 1997-11-04 |
JP3738910B2 true JP3738910B2 (en) | 2006-01-25 |
Family
ID=22832958
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP52554895A Expired - Fee Related JP3738910B2 (en) | 1994-04-04 | 1995-04-03 | Hybridization-ligation analysis to detect specific nucleic acid sequences |
Country Status (9)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US5800994A (en) |
EP (1) | EP0754241B1 (en) |
JP (1) | JP3738910B2 (en) |
AT (1) | ATE174066T1 (en) |
BR (1) | BR9507343A (en) |
CA (1) | CA2186465A1 (en) |
DE (1) | DE69506393T2 (en) |
PL (1) | PL316611A1 (en) |
WO (1) | WO1995027078A1 (en) |
Families Citing this family (58)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US6270961B1 (en) * | 1987-04-01 | 2001-08-07 | Hyseq, Inc. | Methods and apparatus for DNA sequencing and DNA identification |
US6401267B1 (en) | 1993-09-27 | 2002-06-11 | Radoje Drmanac | Methods and compositions for efficient nucleic acid sequencing |
USRE43097E1 (en) | 1994-10-13 | 2012-01-10 | Illumina, Inc. | Massively parallel signature sequencing by ligation of encoded adaptors |
GB9507238D0 (en) * | 1995-04-07 | 1995-05-31 | Isis Innovation | Detecting dna sequence variations |
US5888731A (en) * | 1995-08-30 | 1999-03-30 | Visible Genetics Inc. | Method for identification of mutations using ligation of multiple oligonucleotide probes |
US6297006B1 (en) * | 1997-01-16 | 2001-10-02 | Hyseq, Inc. | Methods for sequencing repetitive sequences and for determining the order of sequence subfragments |
US6309824B1 (en) * | 1997-01-16 | 2001-10-30 | Hyseq, Inc. | Methods for analyzing a target nucleic acid using immobilized heterogeneous mixtures of oligonucleotide probes |
CA2291180A1 (en) * | 1997-05-23 | 1998-11-26 | Lynx Therapeutics, Inc. | System and apparatus for sequential processing of analytes |
CN1273609A (en) * | 1997-08-15 | 2000-11-15 | 希斯克有限公司 | Method and compositions for detection or quantification of nucleic acid species |
JP2001526045A (en) * | 1997-12-12 | 2001-12-18 | ダイジーン・コーポレーション | Evaluation of human papillomavirus-related diseases |
US7060431B2 (en) | 1998-06-24 | 2006-06-13 | Illumina, Inc. | Method of making and decoding of array sensors with microspheres |
US5998175A (en) * | 1998-07-24 | 1999-12-07 | Lumigen, Inc. | Methods of synthesizing and amplifying polynucleotides by ligation of multiple oligomers |
US6232067B1 (en) * | 1998-08-17 | 2001-05-15 | The Perkin-Elmer Corporation | Adapter directed expression analysis |
US6180408B1 (en) | 1998-08-21 | 2001-01-30 | Washington University | Fluorescence polarization in nucleic acid analysis |
EP1271154A3 (en) | 1998-09-18 | 2005-08-17 | Massachusetts Institute Of Technology | Biological applications of semiconductor nanocrystals |
EP1190100B1 (en) | 1999-05-20 | 2012-07-25 | Illumina, Inc. | Combinatorial decoding of random nucleic acid arrays |
AU6638000A (en) * | 1999-08-13 | 2001-03-13 | Yale University | Binary encoded sequence tags |
WO2001025481A1 (en) * | 1999-10-04 | 2001-04-12 | Olympus Optical Co., Ltd. | Method of detecting nucleic acid |
US6569685B1 (en) * | 1999-10-05 | 2003-05-27 | The Molecular Sciences Institute, Inc. | Protein fingerprint system and related methods |
US7371584B2 (en) * | 1999-10-15 | 2008-05-13 | Wavesence, Inc. | Multi-functional and configurable assay |
US6136549A (en) * | 1999-10-15 | 2000-10-24 | Feistel; Christopher C. | systems and methods for performing magnetic chromatography assays |
US7390675B2 (en) * | 1999-10-15 | 2008-06-24 | Christopher Feistel | Multi-functional and configurable assay |
US6368801B1 (en) | 2000-04-12 | 2002-04-09 | Molecular Staging, Inc. | Detection and amplification of RNA using target-mediated ligation of DNA by RNA ligase |
AU2001265121A1 (en) * | 2000-05-30 | 2001-12-11 | Applera Corporation | Methods for detecting target nucleic acids using coupled ligation and amplification |
US7601497B2 (en) | 2000-06-15 | 2009-10-13 | Qiagen Gaithersburg, Inc. | Detection of nucleic acids by target-specific hybrid capture method |
US7439016B1 (en) | 2000-06-15 | 2008-10-21 | Digene Corporation | Detection of nucleic acids by type-specific hybrid capture method |
US6562575B1 (en) | 2000-06-26 | 2003-05-13 | Epicentre Technologies Corporation | Analyte-specific assays based on formation of a replicase substrate |
JP4755755B2 (en) * | 2000-12-15 | 2011-08-24 | 独立行政法人産業技術総合研究所 | Multiple inspection multiplexing suspension and multiple inspection multiplexing method using the suspension |
US20040266021A9 (en) * | 2001-01-26 | 2004-12-30 | Andras Guttman | Multicapillary fraction collection system and method |
US20030003476A1 (en) * | 2001-03-23 | 2003-01-02 | Fuji Photo Film Co., Ltd. | Waste water inspecting agent and waste water inspecting apparatus using the same |
US7077982B2 (en) * | 2001-03-23 | 2006-07-18 | Fuji Photo Film Co., Ltd. | Molecular electric wire, molecular electric wire circuit using the same and process for producing the molecular electric wire circuit |
US20020168756A1 (en) * | 2001-03-23 | 2002-11-14 | Fuji Photo Film Co., Ltd. | Particle size variable reactor |
US7018795B2 (en) * | 2001-03-23 | 2006-03-28 | Fuji Photo Film Co., Ltd. | Hybridization probe and target nucleic acid detecting kit, target nucleic acid detecting apparatus and target nucleic acid detecting method using the same |
US20020168667A1 (en) * | 2001-03-23 | 2002-11-14 | Fuji Photo Film Co., Ltd. | Antigen detecting agent and antigen detecting kit, antigen detecting apparatus and antigen detecting method using the same |
WO2003045310A2 (en) * | 2001-11-21 | 2003-06-05 | Applera Corporation | Digital assay |
WO2003078587A2 (en) * | 2002-03-13 | 2003-09-25 | Syngenta Participations, Ag. | Nucleic acid detection method |
US20030179381A1 (en) * | 2002-03-18 | 2003-09-25 | Fuji Photo Film Co., Ltd. | Sensor, color sensor and apparatus for inspection using the same |
US20060105337A1 (en) * | 2002-08-30 | 2006-05-18 | Brian Warner | Solid phase based nucleic acid assays combining high affinity and high specificity |
US8394944B2 (en) * | 2002-09-20 | 2013-03-12 | Siemens Healthcare Diagnostics Inc. | Dual-purpose primers and probes for providing enhanced hybridization assays by disruption of secondary structure formation |
US20040235005A1 (en) * | 2002-10-23 | 2004-11-25 | Ernest Friedlander | Methods and composition for detecting targets |
JP4294946B2 (en) * | 2002-12-13 | 2009-07-15 | 富士フイルム株式会社 | Target detection apparatus, target detection method, and target detection substrate |
US9487823B2 (en) | 2002-12-20 | 2016-11-08 | Qiagen Gmbh | Nucleic acid amplification |
US7076127B2 (en) * | 2003-01-14 | 2006-07-11 | Fuji Photo Film Co., Ltd. | Optical switch and safety apparatus using the same |
US8043834B2 (en) | 2003-03-31 | 2011-10-25 | Qiagen Gmbh | Universal reagents for rolling circle amplification and methods of use |
US20050239089A1 (en) * | 2003-06-06 | 2005-10-27 | Johnson Martin D | Mobility cassettes |
US20060008823A1 (en) * | 2004-05-12 | 2006-01-12 | Kemp Jennifer T | DNA profiling and SNP detection utilizing microarrays |
US8309303B2 (en) | 2005-04-01 | 2012-11-13 | Qiagen Gmbh | Reverse transcription and amplification of RNA with simultaneous degradation of DNA |
US20070020699A1 (en) * | 2005-07-19 | 2007-01-25 | Idexx Laboratories, Inc. | Lateral flow assay and device using magnetic particles |
EP1762627A1 (en) | 2005-09-09 | 2007-03-14 | Qiagen GmbH | Method for the activation of a nucleic acid for performing a polymerase reaction |
JP2012506705A (en) | 2008-10-27 | 2012-03-22 | キアジェン ゲイサーズバーグ インコーポレイテッド | Hybrid capture analysis and system for quick results |
JP6108661B2 (en) * | 2009-01-28 | 2017-04-05 | キアジェン ゲイサーズバーグ インコーポレイテッド | Sequence-specific mass sample preparation and assay methods |
JP5738278B2 (en) | 2009-05-01 | 2015-06-24 | キアジェン ゲイサーズバーグ インコーポレイテッド | Non-target amplification method for detecting RNA splicing morphology in a sample |
JP5826752B2 (en) | 2009-09-14 | 2015-12-02 | キアジェン ゲイサーズバーグ インコーポレイテッド | Compositions and methods for recovering nucleic acids or proteins from tissue samples fixed in cytological media |
ES2615728T3 (en) * | 2010-01-29 | 2017-06-08 | Qiagen Gaithersburg, Inc. | Methods and compositions for purification and specific multiple nucleic acid sequence analysis |
US9605303B2 (en) | 2010-01-29 | 2017-03-28 | Qiagen Gaithersburg, Inc. | Method of determining and confirming the presence of an HPV in a sample |
CA2799200A1 (en) | 2010-05-19 | 2011-11-24 | Qiagen Gaithersburg, Inc. | Methods and compositions for sequence-specific purification and multiplex analysis of nucleic acids |
EP2678442B1 (en) | 2011-02-24 | 2019-01-16 | QIAGEN Gaithersburg, Inc. | Materials and methods for detection of hpv nucleic acid |
US9447458B2 (en) * | 2011-11-16 | 2016-09-20 | Canon U.S. Life Sciences, Inc. | Detection of neighboring variants |
Family Cites Families (15)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
FI63596C (en) * | 1981-10-16 | 1983-07-11 | Orion Yhtymae Oy | MICROBIA DIAGNOSIS FOERFARANDE SOM GRUNDAR SIG PAO SKIKTSHYBRIDISERING AV NUCLEINSYROR OCH VID FOERFARANDET ANVAENDA KOMBINATIONER AV REAGENSER |
US5242794A (en) * | 1984-12-13 | 1993-09-07 | Applied Biosystems, Inc. | Detection of specific sequences in nucleic acids |
US4883750A (en) * | 1984-12-13 | 1989-11-28 | Applied Biosystems, Inc. | Detection of specific sequences in nucleic acids |
US4925785A (en) * | 1986-03-07 | 1990-05-15 | Biotechnica Diagnostics, Inc. | Nucleic acid hybridization assays |
US5312910A (en) * | 1987-05-26 | 1994-05-17 | Monsanto Company | Glyphosate-tolerant 5-enolpyruvyl-3-phosphoshikimate synthase |
US4988617A (en) * | 1988-03-25 | 1991-01-29 | California Institute Of Technology | Method of detecting a nucleotide change in nucleic acids |
CA1341584C (en) * | 1988-04-06 | 2008-11-18 | Bruce Wallace | Method of amplifying and detecting nucleic acid sequences |
WO1989009835A1 (en) * | 1988-04-08 | 1989-10-19 | The Salk Institute For Biological Studies | Ligase-based amplification method |
US5241070A (en) * | 1988-09-26 | 1993-08-31 | Ciba Corning Diagnostics Corp. | Nucleophilic polysubstituted aryl acridinium esters and uses thereof |
EP0528882B1 (en) * | 1990-05-03 | 2007-10-10 | Cornell Research Foundation, Inc. | A thermostable ligase mediated dna amplification system for the detection of genetic diseases |
CA2049879A1 (en) * | 1990-08-30 | 1992-03-01 | Keith C. Backman | Controlled initial target-dependent production of templates for ligase chain reaction |
CA2046713A1 (en) * | 1990-10-16 | 1992-04-17 | Richard M. Martinelli | Amplification of midivariant dna templates |
NZ245242A (en) * | 1992-01-17 | 1994-12-22 | Pioneer Hi Bred Int | Identifying variations between organisms by detecting polymorphisms in single sequence repeats |
WO1993020236A1 (en) * | 1992-04-03 | 1993-10-14 | Applied Biosystems, Inc. | Probe composition and method |
AU4848393A (en) * | 1992-09-25 | 1994-04-26 | Abbott Laboratories | Ligase chain reaction method for detecting small mutations |
-
1995
- 1995-04-03 CA CA002186465A patent/CA2186465A1/en not_active Abandoned
- 1995-04-03 DE DE69506393T patent/DE69506393T2/en not_active Expired - Lifetime
- 1995-04-03 JP JP52554895A patent/JP3738910B2/en not_active Expired - Fee Related
- 1995-04-03 BR BR9507343A patent/BR9507343A/en not_active IP Right Cessation
- 1995-04-03 AT AT95912383T patent/ATE174066T1/en not_active IP Right Cessation
- 1995-04-03 EP EP95912383A patent/EP0754241B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1995-04-03 PL PL95316611A patent/PL316611A1/en unknown
- 1995-04-03 WO PCT/IB1995/000226 patent/WO1995027078A1/en active IP Right Grant
-
1996
- 1996-07-24 US US08/685,793 patent/US5800994A/en not_active Expired - Lifetime
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
EP0754241B1 (en) | 1998-12-02 |
ATE174066T1 (en) | 1998-12-15 |
BR9507343A (en) | 1997-09-16 |
JPH09510878A (en) | 1997-11-04 |
EP0754241A1 (en) | 1997-01-22 |
AU684915B2 (en) | 1998-01-08 |
DE69506393T2 (en) | 1999-07-01 |
DE69506393D1 (en) | 1999-01-14 |
WO1995027078A1 (en) | 1995-10-12 |
PL316611A1 (en) | 1997-01-20 |
US5800994A (en) | 1998-09-01 |
AU1958595A (en) | 1995-10-23 |
CA2186465A1 (en) | 1995-10-12 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP3738910B2 (en) | Hybridization-ligation analysis to detect specific nucleic acid sequences | |
US5830665A (en) | Contiguous genomic sequence scanning | |
US6146828A (en) | Methods for detecting differences in RNA expression levels and uses therefor | |
JP4216333B2 (en) | Nucleic acid detection and amplification by chemical bonding of oligonucleotides | |
US7033757B2 (en) | Mutation scanning array, and methods of use thereof | |
EP0664339A1 (en) | Method of discriminating nucleic acid and testing set for discriminating nucleic acid | |
US20040086944A1 (en) | Detection of methylated dna molecules | |
JPH06505394A (en) | Nucleic acid classification by polymerase extension of oligonucleotides using terminator complexes | |
JP2005527220A (en) | Method and apparatus using single polymer analysis | |
SE516272C2 (en) | Methods and kits for analyte detection using proximity probing | |
JP2023179416A (en) | Method, system, and composition for counting nucleic acid molecules | |
AU2006236031A1 (en) | Quantification of microsphere suspension hybridization and uses thereof | |
JP3752466B2 (en) | Genetic testing method | |
US20220298569A1 (en) | Highly sensitive methods for accurate parallel quantification of nucleic acids | |
US6270972B1 (en) | Kit for detecting nucleic acid sequences using competitive hybridization probes | |
US6027879A (en) | Detection and isolation of nucleic acid sequences using a bifunctional hybridization probe | |
AU684915C (en) | Hibridization-ligation assays for the detection of specific nucleic acid sequences | |
JPH0775560B2 (en) | Method for detecting target nucleic acid in sample | |
JP2024035110A (en) | Highly sensitive methods for accurate parallel quantification of variant nucleic acids | |
MXPA96004607A (en) | Hybridization-ligation tests for the detection of nucleic acid sequences specifi | |
JP2001522243A (en) | Amplification-based mutation detection | |
JP2007282570A (en) | DETECTION OF SNPs (SINGLE NUCLEOTIDE POLYMORPHISM) BY FLUORESCENT INTERCALATOR | |
WO1995011990A1 (en) | Assay for the detection of genetic abnormalities |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20050215 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20050516 |
|
A602 | Written permission of extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602 Effective date: 20050627 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20050815 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20050927 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20051027 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20081111 Year of fee payment: 3 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20091111 Year of fee payment: 4 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20101111 Year of fee payment: 5 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20101111 Year of fee payment: 5 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20111111 Year of fee payment: 6 |
|
LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |