JP3723838B2 - Novel anti-hair loss peptide - Google Patents

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、抗癌剤等による脱毛に対して有効なペプチドを含有する、抗脱毛症剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
癌の治療のために、抗癌剤が単独で、あるいは外科的除去及び放射線治療と共に広く用いられている。しかしながら、適切な抗癌剤の使用は癌の治療あるいは延命の上で有効とされる一方で、ある程度の副作用をもたらすことが避けられないのが現状である。脱毛症もその副作用の一つとしてかなり高い頻度で発生する。脱毛症は生命に直接関わらず、また身体的苦痛を与えないとはいえ、患者の心理状態に及ぼす影響はきわめて大きく、臨床の場においてその軽減が望まれている。
【０００３】
大豆由来のＭｅｔ−Ｉｌｅ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕで表されるペプチド（ＭＩＴＬ）およびＭＩＴＬの配列を分子内に含むいくつかのペプチドが、免疫系の賦活作用（貪食促進作用、活性酸素促進作用、腫瘍致死因子分泌促進作用）を有する（特開平７−２２４０９３及び得開平８−７３３７４）ことが知られていた。本発明者らは上記ペプチドが、抗癌剤であるｅｔｏｐｏｓｉｄｅ（エトポシド）による脱毛を抑制することを、過去に報告した（特開平９−２４９５３５）。
【０００４】
育毛を目的とする食品としては、アマチャヅルとカキノハと昆布の抽出物を含む食品が知られている。また、抗癌剤の副作用としての脱毛症状を抑制、改善または予防する事が可能な、ウーロン茶抽出物を有効成分とする経口脱毛症剤が知られている（特開平９−３０９８４０）。また、経口の育毛医薬品として、ＴｙｐｅＩＩ５αリダクターゼ阻害剤であるフィナステライド（ｆｉｎａｓｔｅｒｉｄｅ）が知られている（Ｊ．ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆＤｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ（１９９８）３９，５７８−５８９）。しかしながら、当薬剤は男性ホルモンの代謝に作用する薬物であることから、副作用が懸念されており、使用上の注意や制限が多い。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、脱毛に対して、特に抗癌剤の副作用としての脱毛に対して有効であり、かつ安全性と有効性が高い、新規な抗脱毛剤を提供することである。個人差によって、最も有効な薬剤が異なる場合があるので、新たな抗脱毛剤を提供することにより、より広範な対応が可能となることが期待される。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
上述した様に、本発明者らは大豆蛋白質から得られる免疫促進性ペプチドであるＭＩＴＬが抗癌剤による、脱毛を防ぐことを報告した。その作用機構の解明の過程で、ＭＩＴＬによる免疫促進作用がｆｏｒｍｙｌ−Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ（ｆＭＬＰ）レセプターを介していること、およびｆＭＬＰそのものが抗脱毛作用を有していることを、初めて見出した。ｆＭＬＰは走化性ペプチドとして知られている既知の物質であるが、本発明以前に抗脱毛作用は知られていなかった。また、ｆＭＬＰのＰｈｅをＴｒｐに置換したペプチドである、Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−Ｔｒｐ（ＭＬＷ）もまた、抗脱毛作用を有していた。上記でいうＭｅｔはメチオニン、Ｌｅｕはロイシン、Ｐｈｅはフェニルアラニン、Ｔｒｐはトリプトファンを示す。かかるアミノ酸はいずれもＬ−体である。
【０００７】
【発明の実施の形態】
本発明は、ｆｏｒｍｙｌ−Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ（ｆＭＬＰ）の誘導体である新規ペプチド、Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−Ｔｒｐ（ＭＬＷ）である。この新規ペプチドは、特に抗癌剤の副作用である脱毛を防止する事に有効である。上記の脱毛防止効果のために、ＭＬＷを有効成分として含有する抗脱毛症剤を、調製することができる。ＭＬＷが抗脱毛作用を有する事はこれまで知られていなかったので、本発明によりこれまでにない機構による脱毛剤を提供することが可能である。
【０００８】
本発明の機能性ペプチドを併用投与することにより、副作用である脱毛を防止するべき抗癌剤として、植物アルカロイドのポドフィリン系化合物である、エトポシドを挙げることができる。また、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビンデシン等の他の植物アルカロイド系抗癌剤、メトトレキサート、５−フルオロウラシル、５−フルオロデオキシウリジン、テガフール、カルモフール、シトシンアバビノシド、シクロシチジン、６−メルカプトプリン、６−メルカプトプリンリボシド、６−チオグアニン等の代謝拮抗系抗癌剤、ナイトロジェンマスタード、シクロホスファミド、ニムスチン、ラニムスチン、カルボコン等のアルキル化剤系抗癌剤、アドリアマイシン、ダウノルビシン、ダウノマイシン、アクラシノマイシンＡ、アクチノマイシンＤ、マイトマイシンＣ、クロモマイシンＡ₃ 、ブレオマイシン、ペプロマイシン、ネオカルチノスタチン、オーロモマイシン等の抗生物質系抗癌剤、その他、Ｌ−アスパラギナーゼ、シスプラチン、エストラムスチン、ピシバニール、クレスチン、レンチナン、シゾフィラン、レバミゾール、ベスタチン、ホルフェニシノール等の抗癌剤も、本発明の機能性ペプチドを併用投与して脱毛を防止する抗癌剤として挙げることができる。
【０００９】
本発明のペプチドは、ペプチド合成法で取得することができる。即ち、ペプチド合成に通常用いられる方法である液相法または固相法で、ペプチド結合の任意の位置で二分される２種のフラグメントの一方に相当する反応性カルボキシル基を有する原料と、他方のフラグメントに相当する反応性アミノ基を有する原料とを、２-(1H-Benzotriazole-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium hexafluorophosphate(ＨＢＴＵ）等の活性エステルを用いた方法や、カルボジイミドを用いた方法等を用いて縮合させることができる。生成する縮合物が保護基を有する場合、その保護基を除去することによっても製造し得る。
【００１０】
この反応工程において反応に関与すべきでない官能基は、保護基により保護される。アミノ基の保護基としては、例えばベンジルオキシカルボニル（Ｂｚ）、ｔ−ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ），ｐ−ビフェニルイソプロピロオキシカルボニル、９ーフルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）等が挙げられる。カルボキシル基の保護剤としては例えばアルキルエステル、ベンジルエステル等を形成し得る基が挙げられるが、固相法の場合は、Ｃ末端のカルボキシル基はクロロトリチル樹脂、クロルメチル樹脂、オキシメチル樹脂、Ｐ−アルコキシベンジルアルコール樹脂等の担体に結合している。縮合反応は、カルボジイミド等の縮合剤の存在下にあるいはＮ−保護アミノ酸活性エステルまたはペプチド活性エステルを用いて実施する。
【００１１】
縮合反応終了後、保護基は除去されるが、固相法の場合はさらにペプチドのＣ末端と樹脂との結合を切断する。更に、本発明のペプチドは通常の方法に従い精製される。例えばイオン交換クロマトグラフィー、逆相液体クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等が挙げられる。
合成したペプチドの合成はエドマン分解法でＣ−末端からアミノ酸配列を読み取るプロティンシークエンサー、ＧＣ−ＭＳ等で分析される。
【００１２】
次に医薬品として用いる場合について説明する。
ＭＬＷの投与経路としては、経口投与、非経口投与、直腸内投与のいずれでもよく、経口的あるいは非経口的に投与することが可能である。ｆＭＬＰ及びｆＭＬＷについては腸管から吸収されないために、経口投与には適さないという性質を有する。本ペプチドの投与量は化合物の種類、投与方法、患者の症状、年齢等により異なるが、１日あたり通常は０．１ｍｇ／ｋｇ〜１０００ｍｇ／ｋｇ、好ましくは１ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇである。本発明のペプチドは通常、製剤用担体と混合して調製した製剤の形で投与される。製剤用担体としては、製剤分野において常用され、かつ本発明のペプチドと反応しない物質が用いられる。
【００１３】
具体的には、その様な物質の例として乳糖、ブドウ糖、マンニット、デキストリン、シクロデキストリン、デンプン、蔗糖、メタケイ酸アルミン酸マグネシウム、合成ケイ酸アルミニウム、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ヒドロキシプロピルデンプン、カルボキシメチルセルロースカルシウム、イオン交換樹脂、メチルセルロース、ゼラチン、アラビアゴム、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、軽質無水ケイ酸、ステアリン酸マグネシウム、タルク、トラガント、ベントナイト、ビーガム、酸化チタン、ソルビタン脂肪酸エステル、ラウリル硫酸ナトリウム、グリセリン、脂肪酸グリセリンエステル、精製ラノリン、グリセロゼラチン、ポリソルベート、マクロゴール、植物油、ロウ、流動パラフィン、白色ワセリン、フルオロカーボン、非イオン性界面活性剤、プロピレングルコール、水等が挙げられる。
【００１４】
剤型としては、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、シロップ剤、懸濁剤、座剤、軟膏、クリーム剤、ゲル剤、貼付剤、吸入剤、注射剤等が挙げられる。これらの製剤は常法に従って調製される。尚、液体製剤にあっては、用時、水又は他の適当な溶媒に溶解または懸濁する形であってもよい。また錠剤、顆粒剤は周知の方法でコーティングしてもよい。注射剤の場合には、本発明のペプチドを水に溶解させて調製されるが、必要に応じて生理食塩水あるいはブドウ糖溶液に溶解させてもよく、また緩衝剤や保存剤を添加してもよい。
【００１５】
これらの製剤は、本発明のペプチドを０．０１％〜１００重量％、好ましくは１〜９０重量％の割合で含有することができる。これらの製剤はまた、治療上価値のある他の成分を含有していてもよい。
【００１６】
経口投与用の固形製剤を製造するには、有効成分と賦形剤成分例えば乳糖、澱粉、結晶セルロース、乳酸カルシウム、無水ケイ酸などと混合して散剤とするか、さらに必要に応じて白糖、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリビニルピロリドンなどの結合剤、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースカルシウムなどの崩壊剤などを加えて湿式又は乾式造粒して顆粒剤とする。錠剤を製造するには、これらの散剤及び顆粒剤をそのまま或いはステアリン酸マグネシウム、タルクなどの滑沢剤を加えて打錠すればよい。これらの顆粒又は錠剤はヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート、メタクリル酸−メタクリル酸メチルポリマーなどの腸溶剤基剤で被覆して腸溶剤製剤、あるいはエチルセルロース、カルナウバロウ、硬化油などで被覆して持続性製剤とすることもできる。また、カプセル剤を製造するには、散剤又は顆粒剤を硬カプセルに充填するか、有効成分をそのまま或いはグリセリン、ポリエチレングリコール、ゴマ油、オリーブ油などに溶解した後ゼラチン膜で被覆し軟カプセルとすることができる。
【００１７】
経口投与用の液状製剤を製造するには、有効成分と白糖、ソルビトール、グリセリンなどの甘味剤とを水に溶解して透明なシロップ剤、更に精油、エタノールなどを加えてエリキシル剤とするか、アラビアゴム、トラガント、ポリソルベート８０、カルボキシメチルセルロースナトリウムなどを加えて乳剤又は懸濁剤としてもよい。これらの液状製剤には所望により矯味剤、着色剤、保存剤などを加えてもよい。
【００１８】
注射剤を製造するには、有効成分を必要に応じて塩酸、水酸化ナトリウム、乳糖、乳酸、ナトリウム、リン酸一水素ナトリウム、リン酸二水素ナトリウムなどのｐＨ調整剤、塩化ナトリウム、ぶどう糖などの等張化剤と共に注射用蒸留水に溶解し、無菌濾過してアンプルに充填するか、更にマンニトール、デキストリン、シクロデキストリン、ゼラチンなどを加えて真空凍結乾燥し、用事溶解型の注射剤としてもよい。また、有効成分にレチシン、ポリソルベート８０、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油などを加えて水中で乳化せしめ注射剤用乳剤とすることもできる。
【００１９】
直腸投与剤を製造するには、有効成分をカカオ脂、脂肪酸のトリ、ジ及びモノグリセリド、ポリエチレングリコールなどの座剤用基材と共に加湿して溶解し型に流し込んで冷却するか、有効成分をポリエチレングリコール、大豆油などに溶解した後、ゼラチン膜で被覆すればよい。
【００２０】
皮膚用外用剤を製造するには、有効成分を白色ワセリン、ミツロウ、流動パラフィン、ポリエチレングリコールなどに加えて必要ならば加湿して練合し軟膏剤とするか、ロジン、アクリル酸アルキルエステル重合体などの粘着剤と練合した後ポリアルキルなどの不織布に展延してテープ剤とする。
【００２１】
【実施例】
次に実例を挙げて本発明を更に具体的に説明する。
（ペプチドの合成）
市販のＦｍｏｃ−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）−Ｗａｎｇ樹脂（置換率０．５０ｍｅｑ／ｇ）０．６０ｇをＰＳ３型ペプチド合成機（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）の反応槽に分取し、新規ペプチドについて以下のように合成を行った。
まず、上記の樹脂を反応容器に入れて、１ｍｍｏｌのＦｍｏｃ−Ｌｅｕと、活性化剤として、１ｍｍｏｌのＨＢＴＵを１０ｍｌの０．４Ｍ Ｎ−メチルモルフォリンを含むジメチルフォルムアミドに溶解したものを反応槽に加え、室温にて２０分攪拌反応させた。
【００２２】
得られた樹脂を２０重量％ピペリジンを含むジメチルフォルムアミド２０ｍｌ中で、Ｆｍｏｃ基を除去し、ついで上記のＦｍｏｃ−Ｌｅｕをカップリングさせた方法と同様にＦｍｏｃ−Ｍｅｔをカップルさせて、Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）−樹脂を得た。さらにｆｏｒｍｙｌ化する場合はこの樹脂と１ｍｍｏｌの蟻酸と１ｍｍｏｌのＨＢＴＵを上記同様に反応させた。該樹脂を１０ｍｌの脱保護液（８２容量％トリフルオロ酢酸、５容量％チオアニソール、３容量％エタンジオール、２容量％エチルメチルスルフィド、３容量％フェノール、５容量％水）中で室温にて１時間攪拌し、ペプチドを樹脂から遊離させた。
【００２３】
ここに４０ｍｌの冷エーテルを添加し、ペプチドを沈殿させ、さらに冷エーテルにて３回洗浄し粗ペプチドを得た。これをＯＤＳカラム（Ｃｏｓｍｏｓｉｌ５Ｃ₁₈−ＡＲ，２０×２５０ｍｍ）による逆相クロマトグラフィーにより０．１重量％トリフルオロ酢酸を含むアセトニトリルの直線的濃度勾配にて展開、精製し、Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−Ｔｒｐ（ＭＬＷ）を得た。
本品をプロテインシーケンサー（アプライド バイオシステムズ社製４７７Ａ型）により分析した結果、上記の組成であることが判明した。ｆｏｒｍｙｌ−Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−Ｔｒｐ（ｆＭＬＷ）も同様に得た。なお、ｆＭＬＰについてはシグマ社の市販品を使用した。
【００２４】
（抗脱毛活性の評価）
検体として６日齢のＳＤ系ラットを用いた。この検体を以下の（Ａ）〜（Ｄ）の４群に分けた。各群には母親を一匹つけ、自由に哺乳させた。母親には日本クレア製の固形食ＣＥ２を自由に接種させ、飲水も自由にさせた。薬剤の投与は１日１回、朝１０時より１１時の間に行った。尚、ペプチドの投与は、腹腔内投与（ｉｐ）の場合には生後１０日目から４日間、経口投与（ｐｏ）の場合には生後６日目から８日間というプロトコールに従って、１日１回行った。エトポシドは、２０ｍｇ／ｍｌの注射薬を０．９％生理食塩水にて２ｍｇ／ｍｌに希釈し、１．５ｍｇ／ｋｇ体重の用量で、腹腔内に生後１１日目から３日間連続して投与した。
（Ａ）エトポシド（日本化薬製 ラステット：抗癌剤） 単独投与群
（Ｂ）エトポシドとｆＭＬＰ 併用投与群
（Ｃ）エトポシドとＭＬＷ 併用投与群
（Ｄ）エトポシドとｆＭＬＷ 併用投与群
【００２５】
上記４群の投与検体について、２０日齢に、肉眼下観察により脱毛度を検討した。脱毛度の判定は、下記の基準に従って行った。試験結果を表１に示す。なお、表１に示す結果は、各濃度においてｎ＝４で試験を行った平均値である。
脱毛判定基準
０：０〜１０％脱毛
１：１１〜３０％脱毛
２：３１〜５０％脱毛
３：５１〜７０％脱毛
４：７１〜９０％脱毛
５：９１〜１００％脱毛
【００２６】
【表１】

【００２７】
表１の結果より、既知物質であるｆＭＬＰは、１０ｍｇ／ｋｇ×４日の腹腔内投与により、抗癌剤エトポシドによる脱毛を完全に抑制した。また、新規に合成した物質であるＭＬＷは、３０ｍｇ／ｋｇ×４日の腹腔内投与又は１００ｍｇ／ｋｇの経口投与で、ほぼ同様の効果を示した。またｆＭＬＷは、１０ｍｇ／ｋｇ×４日の腹腔内投与により、やはりエトポシドによる脱毛を完全に抑制した。尚、ｆＭＬＰの抗脱毛効果は、ＩＬ−１（インターロイキン１）阻害剤であるＫ（Ｄ）ＰＴを腹腔内投与する事により阻害された。この知見は、ｆＭＬＰの抗脱毛効果はＩＬ−１を介していることを示唆している。
【００２８】
【発明の効果】
ｆＭＬＰ及びその誘導体ペプチドであるＭＬＷが、抗癌剤による脱毛を抑制する効果を有する事が示された。よって本発明により、そのペプチドを用いて新規な抗脱毛剤を提供することができる。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to an anti-hair loss agent containing a peptide effective against hair loss caused by an anticancer agent or the like.
[0002]
[Prior art]
For the treatment of cancer, anticancer agents are widely used alone or in conjunction with surgical removal and radiation therapy. However, while the use of an appropriate anticancer agent is effective in treating cancer or prolonging life, it is unavoidable that it causes some side effects. Alopecia also occurs at a fairly high frequency as one of its side effects. Although alopecia is not directly related to life and does not cause physical distress, it has a great influence on the patient's psychological state, and its reduction is desired in the clinical setting.
[0003]
Met-Ile-Thr-Leu-derived peptide derived from soybean (MITL) and some peptides containing MITL in the molecule have an immune system stimulating action (phagocytosis promoting action, active oxygen promoting action, tumor lethality It has been known to have a factor secretion promoting action (JP-A-7-224093 and Tokuhei 8-73374). The present inventors have reported in the past that the above-mentioned peptide suppresses hair loss caused by ethoside (etoposide), which is an anticancer agent (Japanese Patent Laid-Open No. 9-249535).
[0004]
As food for the purpose of hair growth, foods containing extracts of Achacharu, Kakinoha and kelp are known. An oral alopecia agent containing oolong tea extract as an active ingredient that can suppress, ameliorate, or prevent alopecia as a side effect of an anticancer agent is also known (Japanese Patent Laid-Open No. 9-309840). Further, finasteride, which is a Type II 5α reductase inhibitor, is known as an oral hair restoration drug (J. of American Academy of Dermatology (1998) 39, 578-589). However, since this drug is a drug that acts on the metabolism of male hormones, there are concerns about side effects, and there are many precautions and restrictions on use.
[0005]
[Problems to be solved by the invention]
An object of the present invention is to provide a novel anti-hair loss agent that is effective against hair loss, particularly against hair loss as a side effect of an anticancer agent, and has high safety and effectiveness. Since the most effective drug may vary depending on individual differences, it is expected that a wider range of measures can be taken by providing a new anti-hair loss agent.
[0006]
[Means for Solving the Problems]
As described above, the present inventors have reported that MITL, which is an immunostimulatory peptide obtained from soybean protein, prevents hair loss caused by anticancer agents. In the process of elucidating the mechanism of action, we found for the first time that the immunostimulatory action by MITL is via the formyl-Met-Leu-Phe (fMLP) receptor and that fMLP itself has an anti-hair loss action. . Although fMLP is a known substance known as a chemotactic peptide, no anti-hair loss action was known prior to the present invention. In addition, Met-Leu-Trp (MLW) , which is a peptide obtained by substituting Trp for Phe of fMLP, also had an anti-hair loss action. Met is methionine, Leu is leucine, Phe is phenylalanine, and Trp is tryptophan. All of these amino acids are L-forms.
[0007]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
The present invention is a novel peptide, Met-Leu-Trp (MLW), which is a derivative of formyl-Met-Leu-Phe (fMLP). This novel peptide is particularly effective in preventing hair loss, which is a side effect of anticancer agents. For the above-mentioned hair loss preventing effect, an anti-hair loss agent containing MLW as an active ingredient can be prepared. Since it has not been known so far that MLW has an anti-hair removal action, the present invention can provide a hair removal agent with an unprecedented mechanism.
[0008]
By co-administering the functional peptide of the present invention, etoposide, which is a podophylline-based compound of plant alkaloids, can be mentioned as an anticancer agent to prevent hair loss that is a side effect. In addition, other plant alkaloid anticancer agents such as vincristine, vinblastine, vindesine, methotrexate, 5-fluorouracil, 5-fluorodeoxyuridine, tegafur, carmofur, cytosine ababinoside, cyclocytidine, 6-mercaptopurine, 6-mercaptopurine ribonucleic acid Antimetabolite anticancer agents such as sid, 6-thioguanine, nitrogen mustard, cyclophosphamide, nimustine, ranimustine, carbocon and other alkylating agent anticancer agents, adriamycin, daunorubicin, daunomycin, aclacinomycin A, actinomycin D, mitomycin C, chromomycin a _3, bleomycin, peplomycin, neocarzinostatin, antibiotic anticancer agent such as O-Romo hygromycin, other, L- asparaginase, Supurachin, estramustine, picibanil, krestin, lentinan, schizophyllan, levamisole, bestatin, also anticancer agents such as formyl phenylene maytansinol can be mentioned as anticancer agents for preventing hair loss of functional peptide combined administration to the present invention.
[0009]
The peptide of the present invention can be obtained by a peptide synthesis method. That is, in a liquid phase method or a solid phase method, which is a method usually used for peptide synthesis, a raw material having a reactive carboxyl group corresponding to one of two kinds of fragments bisected at an arbitrary position of the peptide bond, and the other A method using an active ester such as 2- (1H-Benzotriazole-1-yl) -1,1,3,3-tetramethyluronium hexafluorophosphate (HBTU) with a raw material having a reactive amino group corresponding to the fragment, or carbodiimide The condensation can be carried out using a method using When the resulting condensate has a protecting group, it can also be produced by removing the protecting group.
[0010]
Functional groups that should not participate in the reaction in this reaction step are protected by protecting groups. Examples of the amino-protecting group include benzyloxycarbonyl (Bz), t-butyloxycarbonyl (Boc), p-biphenylisopropyloxycarbonyl, 9-fluorenylmethyloxycarbonyl (Fmoc) and the like. Examples of the carboxyl group-protecting agent include groups capable of forming alkyl esters, benzyl esters and the like. In the solid phase method, the C-terminal carboxyl group is a chlorotrityl resin, chloromethyl resin, oxymethyl resin, P- It is bound to a carrier such as an alkoxybenzyl alcohol resin. The condensation reaction is carried out in the presence of a condensing agent such as carbodiimide or using an N-protected amino acid active ester or peptide active ester.
[0011]
After completion of the condensation reaction, the protecting group is removed, but in the solid phase method, the bond between the C-terminal of the peptide and the resin is further cleaved. Furthermore, the peptides of the present invention are purified according to conventional methods. Examples thereof include ion exchange chromatography, reverse phase liquid chromatography, affinity chromatography and the like.
Synthesis of the synthesized peptide is analyzed by a protein sequencer that reads the amino acid sequence from the C-terminal by the Edman degradation method, GC-MS, or the like.
[0012]
Next, the case where it uses as a pharmaceutical is demonstrated.
The administration route of MLW may be any of oral administration, parenteral administration, and rectal administration, and can be administered orally or parenterally. Since fMLP and fMLW are not absorbed from the intestinal tract, they are not suitable for oral administration. The dosage of this peptide varies depending on the type of compound, administration method, patient symptoms, age, etc., but is usually 0.1 mg / kg to 1000 mg / kg, preferably 1 mg / kg to 100 mg / kg per day. The peptide of the present invention is usually administered in the form of a preparation prepared by mixing with a pharmaceutical carrier. As a pharmaceutical carrier, a substance that is commonly used in the pharmaceutical field and does not react with the peptide of the present invention is used.
[0013]
Specifically, examples of such substances are lactose, glucose, mannitol, dextrin, cyclodextrin, starch, sucrose, magnesium aluminate metasilicate, synthetic aluminum silicate, sodium carboxymethylcellulose, hydroxypropyl starch, carboxymethylcellulose calcium. , Ion exchange resin, methylcellulose, gelatin, gum arabic, hydroxypropylcellulose, hydroxypropylmethylcellulose, polyvinylpyrrolidone, polyvinyl alcohol, light anhydrous silicic acid, magnesium stearate, talc, tragacanth, bentonite, bee gum, titanium oxide, sorbitan fatty acid ester, Sodium lauryl sulfate, glycerin, fatty acid glycerin ester, purified lanolin, glycerogelatin, polyso Bate, macrogol, vegetable oils, waxes, liquid paraffin, white petrolatum, fluorocarbons, nonionic surfactants, propylene glycol, water and the like.
[0014]
Examples of the dosage form include tablets, capsules, granules, powders, syrups, suspensions, suppositories, ointments, creams, gels, patches, inhalants, injections, and the like. These preparations are prepared according to a conventional method. The liquid preparation may be dissolved or suspended in water or other appropriate solvent at the time of use. Tablets and granules may be coated by a known method. In the case of injection, it is prepared by dissolving the peptide of the present invention in water, but it may be dissolved in physiological saline or glucose solution as necessary, and a buffer or preservative may be added. Good.
[0015]
These preparations can contain the peptide of the present invention in a proportion of 0.01% to 100% by weight, preferably 1 to 90% by weight. These formulations may also contain other therapeutically valuable ingredients.
[0016]
In order to produce a solid preparation for oral administration, an active ingredient and excipient components such as lactose, starch, crystalline cellulose, calcium lactate, anhydrous silicic acid and the like are mixed to form a powder, or if necessary, sucrose, Add a binder such as hydroxypropylcellulose and polyvinylpyrrolidone, a disintegrant such as carboxymethylcellulose and carboxymethylcellulose calcium, and wet or dry granulate to form granules. In order to produce tablets, these powders and granules may be tableted as they are or after adding a lubricant such as magnesium stearate or talc. These granules or tablets should be coated with an enteric solvent base such as hydroxypropylmethylcellulose phthalate or methacrylic acid-methyl methacrylate polymer and coated with an enteric solvent preparation, or with ethylcellulose, carnauba wax, hydrogenated oil, etc. You can also. In order to produce capsules, powders or granules are filled into hard capsules, or active ingredients are dissolved as they are or dissolved in glycerin, polyethylene glycol, sesame oil, olive oil, etc., and then coated with a gelatin film to form soft capsules. Can do.
[0017]
In order to produce a liquid preparation for oral administration, an active ingredient and a sweetener such as sucrose, sorbitol, and glycerin are dissolved in water to add a transparent syrup, further essential oil, ethanol, etc. to make an elixir, Gum arabic, tragacanth, polysorbate 80, sodium carboxymethyl cellulose and the like may be added to form an emulsion or suspension. These liquid preparations may contain a flavoring agent, a coloring agent, a preservative and the like as desired.
[0018]
In order to produce injections, active ingredients such as hydrochloric acid, sodium hydroxide, lactose, lactic acid, sodium, sodium monohydrogen phosphate, sodium dihydrogen phosphate, pH adjusters, sodium chloride, glucose etc. It can be dissolved in distilled water for injection together with an isotonic agent, filtered aseptically and filled into ampoules, or further lyophilized by adding mannitol, dextrin, cyclodextrin, gelatin, etc. . In addition, reticin, polysorbate 80, polyoxyethylene hydrogenated castor oil and the like may be added to the active ingredient and emulsified in water to give an emulsion for injection.
[0019]
To produce a rectal dosage form, the active ingredient is moistened with a suppository base material such as cacao butter, fatty acid tri, di- and monoglycerides, polyethylene glycol, etc., dissolved, poured into a mold and cooled, or the active ingredient is made of polyethylene. What is necessary is just to coat | cover with a gelatin film | membrane after melt | dissolving in glycol, soybean oil, etc.
[0020]
In order to produce an external preparation for skin, the active ingredient is added to white petrolatum, beeswax, liquid paraffin, polyethylene glycol, etc., and if necessary, moistened and kneaded to make an ointment, or rosin, alkyl acrylate polymer After being kneaded with an adhesive such as polyalkyl, it is spread on a non-woven fabric such as polyalkyl to obtain a tape.
[0021]
【Example】
Next, the present invention will be described more specifically with examples.
(Synthesis of peptides)
0.60 g of commercially available Fmoc-Trp (Boc) -Wang resin (substitution rate 0.50 meq / g) was dispensed into a reaction vessel of a PS3-type peptide synthesizer (manufactured by Protein Technologies), and the new peptide was as follows. Synthesis was performed.
First, the above resin is put into a reaction vessel, and 1 mmol of Fmoc-Leu and 1 mmol of HBTU as an activator dissolved in 10 ml of dimethylformamide containing 0.4 M N-methylmorpholine are used as a reaction vessel. And stirred at room temperature for 20 minutes.
[0022]
Fmoc-Met was coupled with Met-Leu in the same manner as in the above-mentioned method in which Fmoc group was removed in 20 ml of dimethylformamide containing 20% by weight piperidine, and then Fmoc-Leu was coupled. -Trp (Boc) -resin was obtained. In the case of further forming, this resin, 1 mmol of formic acid and 1 mmol of HBTU were reacted in the same manner as described above. The resin was placed in 10 ml of deprotection solution (82% by volume trifluoroacetic acid, 5% by volume thioanisole, 3% by volume ethanediol, 2% by volume ethylmethyl sulfide, 3% by volume phenol, 5% by volume water) at room temperature. Stir for 1 hour to release the peptide from the resin.
[0023]
40 ml of cold ether was added thereto to precipitate the peptide, which was further washed 3 times with cold ether to obtain a crude peptide. This was developed and purified by reverse phase chromatography using an ODS column (Cosmosil 5C ₁₈ -AR, 20 × 250 mm) with a linear concentration gradient of acetonitrile containing 0.1% by weight of trifluoroacetic acid, and Met-Leu-Trp (MLW )
As a result of analyzing this product with a protein sequencer (type 477A manufactured by Applied Biosystems), it was found to have the above composition. formyl-Met-Leu-Trp (fMLW) was also obtained in the same manner. For fMLP, a commercially available product from Sigma was used.
[0024]
(Evaluation of anti-hair loss activity)
Six-day-old SD rats were used as specimens. This specimen was divided into the following four groups (A) to (D). Each group had a mother and was allowed to feed freely. The mother was allowed to inoculate the solid food CE2 made by CLEA Japan and drink freely. The drug was administered once a day between 10 am and 11 am. The peptide is administered once a day according to the protocol of 10 days after birth for 4 days in the case of intraperitoneal administration (ip) and 8 days after the day of birth for oral administration (po). It was. Etoposide is 20 mg / ml injection diluted to 2 mg / ml in 0.9% saline and administered intraperitoneally for 3 consecutive days from the 11th day after birth to the abdominal cavity. did.
(A) Etoposide (Nippon Kayaku lastest: anticancer agent) Single administration group (B) Etoposide and fMLP combination administration group (C) Etoposide and MLW combination administration group (D) Etoposide and fMLW combination administration group
About the administration sample of the said 4 groups, the degree of hair loss was examined by visual observation at 20 days of age. The determination of the degree of hair loss was performed according to the following criteria. The test results are shown in Table 1. In addition, the result shown in Table 1 is the average value which tested by n = 4 in each density | concentration.
Hair removal criteria 0: 0-10% hair removal 1: 11-30% hair removal 2: 31-50% hair removal 3: 51-70% hair removal 4: 71-90% hair removal 5: 91-100% hair removal
[Table 1]

[0027]
From the results shown in Table 1, fMLP, which is a known substance, completely suppressed hair loss caused by the anticancer drug etoposide by intraperitoneal administration at 10 mg / kg × 4 days. MLW, which is a newly synthesized substance, showed almost the same effect when administered intraperitoneally at 30 mg / kg × 4 days or orally at 100 mg / kg. Moreover, fMLW completely suppressed hair loss caused by etoposide by intraperitoneal administration at 10 mg / kg × 4 days. The anti-hair loss effect of fMLP was inhibited by intraperitoneally administering K (D) PT, which is an IL-1 (interleukin 1) inhibitor. This finding suggests that the anti-hair loss effect of fMLP is mediated by IL-1.
[0028]
【The invention's effect】
It was shown that fMLP and its derivative peptide MLW have the effect of suppressing hair loss by anticancer agents. Thus the present invention can provide a novel anti-alopecia agent with the peptide.

Claims (1)

Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−Ｔｒｐで表されるペプチドを有効成分として含有することを特徴とする、抗脱毛症剤。  An anti-hair loss agent comprising a peptide represented by Met-Leu-Trp as an active ingredient.