JP3723204B1 - 難浸透性組織迅速固定液 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】 本発明の組織標本作製用固定液は、アルコール類とアルデヒド類の混合液と、残部の水溶液とからなる。好ましくは、実質的に、40〜95容量%の脂肪族アルコールと1〜20容量%の脂肪族アルデヒドの混合液と、残部のカルボン酸若しくはそのアルカリ金属塩、又は非金属元素の酸化物若しくはそのアルカリ金属塩などを含む水溶液とからなる。本発明の固定液は従来の固定液では標本の作成が困難、又は不可能であった難浸透性組織等を含む全ての組織を生体内の状態や抗原性をほぼ完全に保持したまま迅速に固定することが可能である。更に従来の固定液と比べると、刺激臭などの人体に対する悪影響が殆どない安全な固定液である。
【選択図】
なし
Description
本発明の難浸透性組織迅速固定液は、実質的に、脂肪族アルコール類と脂肪族アルデヒド類の混合液と、残部の水溶液とからなる。該固定液に使用される脂肪族アルコール類は試薬1級以上の飽和脂肪族アルコールであることが好ましい。更に、より生体に近い状態で組織を固定するため、残部水溶液にはカルボン酸若しくはそのアルカリ金属塩、又は非金属元素の酸化物若しくはそのアルカリ金属塩などを含む水溶液を用いることが好ましい。また、前記固定液中の最終濃度が生体とほぼ同じ浸透圧になるようにNaClなどを加えて調節してもよい。固定する組織によって、適宜飽和脂肪族アルコールの濃度を調節することが可能である。例えば、脂肪が多く含まれる組織では、飽和脂肪族アルコールと脂肪族アルデヒドの混合液の濃度を低くして使用することが望ましい。本発明の固定液に使用する飽和脂肪族アルコール類は二種以上を混合して使用することも出来る。使用まで冷暗所で保存することにより、長期間保存することが出来る。本発明の固定液は主成分が脂肪族アルコール類であるため、組織内の蛋白質(抗原)やmRNAの保存状態もよいと考えられる。
水晶体の場合、水晶体を眼球から摘出し、カプセルのついた水晶体をそのまま固定液に入れて冷所で固定する。ホルマリンを主成分とする従来の固定液と異なり、本発明の固定液は飽和脂肪族アルコール類が主成分であるため摂氏4度ないし室温の範囲では固定速度は固定温度による影響を殆ど受けない。従って冷所で固定することも出来るため、組織内の抗原が温度等により変性を受けにくい。ヒト水晶体の場合、60分程度固定することにより良好な標本作製が可能である。また、それ以上固定しても抗原性等は保持され、固定し過ぎることはない。
マウス、ラットの水晶体のみでは30分間程度、ヒト、ブタの水晶体のみでは60分間程度で迅速に固定することが出来る。水晶体以外の組織として、脳などのように脂質含量の高い組織、肺や腎臓などのように肺胞や尿細管が密に詰まっていて固定液が浸透し難い組織を固定するのに適しているがこれらに限定されず、全ての組織の迅速固定に用いることも出来る。
脂肪族アルデヒドを溶解させた溶液(パラフォルムアルデヒドのような重合体、またはその単量体、およびアセトアルデヒド、アセトンから選択される1種類又は2種類以上)に容量%で脂肪族アルデヒドの10倍量程度の飽和脂肪族アルコール(n−プロピルアルコール、イソプロピルアルコール、メチルアルコール及びエチルアルコールから選択される1種又は2種以上)を混合し、冷却して過剰発熱を抑制しながら、最終的に1リットル(1000ml)になるようにカルボン酸、非金属元素の酸化物、又はそれらのアルカリ金属塩などを含む水溶液などを加えてよく攪拌し固定液1(A液)を調製した。
(1)試料として4週令のDBA2/Crマウスの眼球を用いてパラフィン切片のH.E.染色標本を作製するために、以下の処理を行った。
(i) 固定、および固定からパラフィンブロック作製:固定液の容量は容積比で最低でも組織片:固定液を1:20以上とする。A液で15分・室温で固定した後、組織片をB液に移して15分・室温で固定した。B液で固定終了後、再度A液に眼球を入れて、再固定し、日常用いられている方法でパラフィンブロックを作成した。なお、脱水、脱脂、パラフィン浸透の各過程は全て真空式自動包埋装置で行った。
(ii) パラフィン切片標本の作製と標本の染色前処理:パラフィンブロックを氷水中に入れて充分に冷やした後、通常のミクロトーム(滑走式・回転式など)を使用して薄切切片を作製した。その際、使用するミクロトームの刃は硬組織用の替刃を用いた。切片の乾燥、および脱パラフィン・脱キシレン・親水化処理などは通常の方法で行った。
(iii) 染色
ヘマトキシリン・エオジン染色:通常のヘマトキシリン・エオジン染色(H.E.染色)を行い、マイヤーのヘマトキシリンで細胞核を、エオジンで細胞質を染色した。染色後は通常の封入剤を使用してカバーガラスで封入した。
光学顕微鏡観察では、マウス眼球の角膜、水晶体、虹彩、毛様体、網膜の全組織において、従来の固定液で観察されていた組織の微細構造の崩壊を完全に防ぐことができた。図1は、上記方法により固定した水晶体の(a)角膜、(b)水晶体、(c)毛様体、(d)網膜、及び(e)眼球全体の標本の写真を示す。
図1(c)に示したように、本固定液、及び固定法で固定した毛様体、虹彩、毛様体と網膜との接合部などの細胞同士や細胞層の間に隙間が出来ることなく、従来法によるパラフィン切片で観察することが出来なかった微細構造まで初めて観察することが出来るようになった。
眼の切片標本を従来法、又は本発明の方法を用いて作製し、顕微鏡観察により組織学的な比較を行った。図2(a)は[実施例2]と同じ4週齢のDBA2/Cマウスの眼球を従来法の10%中性緩衝ホルマリンで固定し、実施例2と同様の方法でパラフィン切片標本を作製し、H.E.染色を行った。水晶体上皮細胞が水晶体嚢(カプセル)から離れてしまっており、水晶体線維細胞同士の間や1個の水晶体線維細胞の中にも亀裂が入ってしまっている。このような亀裂は生体内における水晶体では存在しないため、標本作製時のアーティファクトである。
(1) 従来法で固定した正常水晶体の標本
〔方法〕従来法の10%中性緩衝ホルマリンで固定し、実施例2と同じ方法でパラフィン切片標本を作製し、免疫組織化学染色を行った。免疫組織化学染色の方法としては、一般的な方法であるが、パラフィン切片を脱パラフィン、脱キシレン処理をして親水化した後、内因性ペルオキシダーゼの処理、及びブロッキング処理をしてから、一次抗体を反応させた。一次抗体は正常(透明)水晶体では分子生物学的研究の結果から発現していないことが解っている細胞膜・細胞質蛋白と反応する抗体を使用し、一次抗体反応終了後、洗浄してからパーオキシダーゼ標識二次抗体を使用し、二次抗体反応終了後、一次抗体の時と同様に洗浄してからDABによる発色(茶色)・可視化を行った。
〔方法〕本発明の固定液で固定し、実施例2と同じ方法でパラフィン切片標本を作製し、免疫組織化学染色を行った。免疫組織化学染色は実施例4の(1)の方法と全て同じ試薬、同じ方法で行った。
〔結果〕図3(b)に示したように、従来法でみられたような非特異的な反応は一切みられなかった。免疫組織化学染色陽性の細胞は全く観察されていないが、この染色結果は分子生物学的研究の結果と一致しているため、この染色結果は正しいといえる。
〔方法〕本発明の固定液で固定し、実施例2と同じ方法でパラフィン切片標本を作製し、免疫組織化学染色を行った。免疫組織化学染色は実施例4の(1及び2)で使用した抗体とは異なる細胞膜・細胞質蛋白に反応する抗体を使用した。また、一次抗体以外は実施例4の(1及び2)と同じ試薬、同じ方法で免疫組織化学染色を行った。
〔方法〕本発明の固定液で固定し、実施例2と同じ方法でパラフィン切片標本を作製し、免疫組織化学染色を行った。一次抗体は細胞核内蛋白質と反応する抗体を使用し、一次抗体以外の試薬は実施例4の(1)の方法と同じ試薬で免疫組織化学染色を行った。その結果を図3(d)に示した。
(1)試料として軽度白内障のみられる40週令のNC/Ngaマウスの眼球を用いてパラフィン切片標本を作製した。標本の作製方法は実施例2と同じ方法でパラフィン切片のH.E.染色を実施した。
肉眼的・実体顕微鏡下での観察では、供試マウスの加令に伴うと思われる水晶体中心部(水晶体核)に僅かに混濁(軽度白内障)が観察された。そこで、観察した眼球について本固定液、及び固定法で固定した眼球全体のパラフィン切片のH.E.染色標本の弱拡大の写真を図4に示した。肉眼的・実体顕微鏡下で観察された僅かな混濁に一致した箇所がH.E.染色で濃染しているのが観察された(図4aの矢印)。また、加令に伴う水晶体の硬化や白内障を発症した眼球(水晶体)ついても、従来の固定液や固定方法ではパラフィン切片で観察することが出来なかったが、本固定液、及び固定法で固定した場合、眼球全体の微細構造までパラフィン切片で初めて観察することが出来るようになった。白内障を発症した水晶体について、実施例4−(3)で示したように免疫組織化学染色も可能であったため、組織や細胞の抗原性の維持が非常に良好であったことも解った。今後の白内障発症原因の解明に対する研究の為の有用な固定液、及び固定法であると思われる。なお
図4bに同じ40週令の正常(透明)な水晶体、および眼球周辺組織の標本を示した。
(1)試料として生後6日目のニワトリの眼球を用いてパラフィン切片標本を作製した。標本の作製方法は実施例2と同じ方法でパラフィン切片のH.E.染色を実施した。
図5に示したように、本固定液、及び固定法で固定した場合、ニワトリの眼球に特有の眼胚裂(optic fissure)とよばれる組織(図5の矢印)や、ヒト、マウスとは異なるニワトリ特有の水晶体の構造、及び神経網膜層と網膜色素上皮細胞層などの微細構造が完全に保存されたままの状態でパラフィン切片標本を作製することが出来た。
(1)試料として胎生4日目の発生過程におけるニワトリの眼球を用いてパラフィン切片標本を作製した。標本の作製方法は実施例2と同じ方法でパラフィン切片のH.E.染色を実施した。
図6に示したように、発生過程の水晶体や網膜神経細胞層の微細構造などを観察することが出来た。
(1)試料として8週令のDBA2/Crマウスの各種組織を用いて従来の固定液と本固定液の固定能力についての比較実験を行った。
(2)固定:本固定液(A液)と従来の固定液の20%中性緩衝ホルマリン液(F液)で2時間、室温で固定し、肉眼的、及び実体顕微鏡下での組織への固定液の浸透、及び固定状態について観察した。
図7(a)は、A液で2時間固定した眼球を示す。水晶体が固定されているため、白濁しているのが解る。眼球の形態も球状を維持している。一方、(b)は、F液で2時間固定した眼球を示す。角膜が固定されているため、僅かに水晶体の上の部分が混濁しているようにも見えるが、実際には水晶体が未固定のため、水晶体自体は透明のままである。このまま固定を続けてもA液のように水晶体が固定されることはなく、未固定のままである。眼球自体も少し変形しており、角膜にも凹凸が観察された。
Claims (6)
- 実質的に、40〜95容量%の飽和脂肪族アルコールと1〜20容量%の脂肪族アルデヒド(但し、パラホルムアルデヒド及び10容量%以上のホルマリンを除く)の混合液と、残部の水溶液とからなることを特徴とする組織迅速固定液。
- 前記飽和脂肪族アルコールが炭素数1〜3の一価の低級アルコールからなる群より選択される1種又は2種以上である請求項1に記載の組織迅速固定液。
- 残部水溶液にカルボン酸若しくはそのアルカリ金属塩、又は非金属元素の酸化物若しくはそのアルカリ金属塩を含む請求項1又は2に記載の組織迅速固定液。
- 実質的に、40〜95容量%の脂肪族アルコールと1〜20容量%の脂肪族アルデヒド(但し、パラホルムアルデヒド及び10容量%以上のホルマリンを除く)の混合液と、残部の水溶液とからなる第一の固定液を用いて組織を固定する工程と、
必要に応じて、1〜10重量%の第一の固定液とは異なるアルデヒド類とカルボニル化合物を含む第二の固定液で前記組織を固定する工程と、を含むことを特徴とする組織の固定方法。 - 実質的に、40〜95容量%の脂肪族アルコールと1〜20容量%の脂肪族アルデヒド(但し、パラホルムアルデヒド及び10容量%以上のホルマリンを除く)の混合液と、残部の水溶液とからなる第一の固定液と、
1〜10重量%の第一の固定液とは異なるアルデヒド類とカルボニル化合物を含む第二の固定液と、を含むことを特徴とする固定液セット。 - 前記第一、及び/又は第二の固定液の残部水溶液にカルボン酸若しくはそのアルカリ金属塩、又は非金属元素の酸化物若しくはそのアルカリ金属塩を含む請求項5に記載の固定液セット。
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