JP3722361B2 - Packing material for liquid chromatography effective for amino acid analysis - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
この発明は、液体クロマトグラフィー用充填剤に関し、より詳細には、アミノ酸分析に有効な低交換容量の液体クロマトグラフィー用充填剤、この充填剤を充填した液体クロマトグラフィー用カラム、及びこのカラムを用いた液体クロマトグラフィー装置に関する。
【０００２】
【従来の技術】
アミノ酸分析にイオン交換クロマトグラフィーは広く使われている（例えば、特開昭６０−１４３７６１、特開昭６２−１４８８５６等）。アミノ酸分析は、タンパク質の一次構造を決定するのに重要な手段であるばかりでなく、臨床医学分野においては、先天性代謝異常症のスクリーニングや疾病患者の血液や尿中の遊離アミノ酸を測定することで病状の診断など応用分野は広がっている。さらには食品・配合飼料・医薬品開発などアミノ酸組成の分析など生物化学に関する広い分野で欠かすことのできない分析である。
アミノ酸分析の機器化は、1951年アメリカロックフェラー研究所のSpackman、Moore、Steinらによる陽イオン交換カラムを用いた液体クロマトグラフィー(LC)に、フラクションコレクター、ニンヒドリンとの反応による発色系を組み、α−アミノ酸の一斉分離、定量システムを完成させたことにより始まる。基本的な原理、方式は今日のアミノ酸分析システムと変わらないものだったが、タンパク質構成アミノ酸の分析に２４時間、生体中の遊離アミノ酸の分析に２日間を要していた。その後、イオン交換樹脂の高性能化、検出器の高感度化、送液ポンプ、オートサンプラー等のハード技術の進歩、インテグレーター技術の進歩が続き、1969年の高圧（高性能）高速液体クロマトグラフィー(HPLC)の開発とともに、更にシステムの高耐圧化、高速化が進み、1958年の装置と比べると、1/20の分析時間に短縮された。1971年には、フルオレサミン、1975年にはオルトフタルアルデヒド(ＯＰＡ)によるアミノ酸の蛍光誘導体化法が確立されて検出感度は、ナノモルレベルからピコモルレベルへ飛躍的に向上した。
【０００３】
アミノ酸はアミノ基とカルボキシル基を持っているため、溶液中ではｐＨに依存して陽イオンであったり、陰イオンであったりする。現在一般的に用いられているアミノ酸分析のイオン交換樹脂は、スチレン−ジビニルベンゼン共重合体を基材として、そのベンゼン環にスルホン基（強陽イオン交換樹脂）を導入したものが用いられている。基本的なシステムは三種類の溶離液をグラジエント（ｐＨグラジエント）で流すことで分離を素早く行い、ＯＰＡ法又はニンヒドリン法により検出するものが主流となっている。
【０００４】
アミノ酸の直接分離には、イオン交換法の他に、「逆相」系の分離モードで行うイオンペアクロマトグラフィーがある。逆相カラム充填剤の固定相には、シリカゲル系固定相、有機ポリマー系固定相がある。しかし、実際は有機ポリマー系固定相の長所やシリカゲル系固定相の欠点を考慮してもシリカゲル系固定相の長所が事実上大きく、故に有機化合物の分離の殆どに使用されている。
シリカゲル系固定相の代表的な長所は、非常に堅く樹脂の大きさが揃っているので分離性能が良い、耐圧性、溶媒安定性に優れている、カラムコストが安いなどである。また、欠点は使用できるｐＨ領域が狭い、塩基性物質の非可逆的吸着、ピークのテーリング、回収率低下などである。
一方、有機ポリマー系充填剤の長所は、適応ｐＨ範囲が広い、試料負荷量が大きい、化学修飾しやすい、ポリマーの種類により極性を選択できる等である。また欠点は、分解能が低い、耐圧性が低い、溶媒に制限がある（膨潤・収縮）、カラムコストが高いなどである。
いずれにしてもイオンペア法は有機溶媒やイオンペア試薬を大量に消費し、再現性が悪いなどの欠点を有するため余り日常的には用いられない、一方イオン交換法によるアミノ酸の分離にはｐＨグラジエントが必要となり、シリカゲル系固定相はこれに適していないことから多くのカラムには有機ポリマー（スチレン−ジビニルベンゼン）を化学修飾した（イオン交換基を導入した）樹脂カラムが用いられている。しかし、このカラムは交換容量が大きく（2meq/mL以上）、溶離液濃度も高いのが実際である。
【０００５】
発明者は、近年の廃水処理など環境問題への配慮、分析コストの低減を考え、従来の高交換容量陽イオン交換カラムに代わり、低交換容量の陽イオン交換カラムでのアミノ酸分離を検討してきた。市販の無機分析用低交換容量陽イオン交換樹脂は、アミノ酸陽イオンに対する選択性に乏しく、適切なカラムは手に入らない。発明者はこれまで、ＯＤＳシリカにヘキサデシルスルホン酸ナトリウム（ＳＨＳ）を疎水吸着させた低交換容量陽イオン交換カラムを調製し、りん酸バッファーを溶離液としアミノ酸の分析を行ってきた。しかし、溶離液組成を一定にしたアイソクラティック溶離で限定されたアミノ酸に対しては良好な分離が得られたが、溶離液組成を変えるとＳＨＳの脱着が起こり、これではタンパク質を構成するアミノ酸２０種を溶離するために溶離液ｐＨを酸性から塩基性へ変化させるグラジエント溶離は行えないことが分かった。また、架橋度が４％程度の表面スルホン化型の低交換容量スチレン−ジビニルベンゼン（Ｓｔ−ＤＶＢ）陽イオン交換カラムを試作したが、市販の低交換容量カラムに比べアミノ酸陽イオンに対し優れた選択性を示したものの、カラムの分解能が低いことがわかった。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
市販の陽イオン交換型アミノ酸分析計は専用装置であり、日常分析には不可欠であるが、装置は高価なうえ汎用性に乏しく、運転コストが高く、高交換容量カラムを使用するため溶離液濃度が高く、したがって環境負荷は大きい。また、アミノ酸の分析が必要なときに誰でも手軽に実施するというわけにはいかない。一方、低交換容量カラムは各種市販されているが、いずれも無機陽イオン分析用であるため、アミノ酸陽イオンに対する選択性に乏しく、今のところ適切なカラムを入手することは困難である。
従って、本発明においては、簡便かつ短時間にアミノ酸の分離を行うことのできる液体クロマトグラフィー用充填剤を提供することを目的とした。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明は、平均粒径が５μｍ以下、排除限界分子量が５０，０００以下、架橋度が５０％以上のポリスチレン−ジビニルベンゼン樹脂から成る液体クロマトグラフィー用充填剤であって、該ポリスチレン−ジビニルベンゼン樹脂がアシルスルホン基を有し、交換容量が１〜１００μモル／ミリリットルである液体クロマトグラフィー用充填剤である。前記ポリスチレン−ジビニルベンゼン樹脂の平均粒径が２〜５μｍ、排除限界分子量が１，０００〜２０，０００、架橋度が９０％以上であることが好ましく、前記ポリスチレン−ジビニルベンゼン樹脂が、東ソー株式会社製ＧＰＣ用高分解能カラムG2500HHR（同社商標）、同G2000HHR（同）、同G1000HHR（同）、同SuperH2500（同）（粒径３μｍ、排除限界分子量（ポリスチレン）２０，０００、架橋度９０％以上）、同SuperH2000（同）（粒径３μｍ、排除限界分子量（ポリスチレン）１０，０００、架橋度９０％以上）、又は同SuperH1000（同）（粒径３μｍ、排除限界分子量（ポリスチレン）１，０００、架橋度９０％以上）に充填された樹脂であることが好ましい。また、前記アシルスルホン基が、前記ポリスチレン−ジビニルベンゼン樹脂をω−ハロゲン化アシルクロライド及びルイス塩基を用いてアシル化し、次にこのアシル化された樹脂の末端ハロゲンをスルホン化することにより導入されることが好ましい。
また本発明は、上記のいずれかの液体クロマトグラフィー用充填剤を充填したアミノ酸分析のための液体クロマトグラフィー用カラムであり、更にこの液体クロマトグラフィー用カラムを用いた液体クロマトグラフィー装置である。
【０００８】
【発明の実施の形態】
本発明で用いるスチレン−ジビニルベンゼン共重合体（Ｓｔ−ＤＶＢ樹脂）は、特定の平均粒径、排除限界分子量及び架橋度を有する必要がある。
即ち、本発明のＳｔ−ＤＶＢ樹脂の平均粒径は５μｍ以下、好ましくは２〜５μｍである。５μｍ以上ではアミノ酸の分離能が低下するため適当ではなく、一方２μｍ以下では充填が難しく、流量も低くする必要が生じグラジエント溶離に適しないため好ましくない。
本発明のＳｔ−ＤＶＢ樹脂の排除限界分子量は５０，０００以下、好ましくは１，０００〜２０，０００である。この排除限界分子量は実際樹脂の細孔径に相当するが、上記用件を細孔径で表現すると、７０オングストローム以下、好ましくは１０〜３０オングストロームである。
本発明のＳｔ−ＤＶＢ樹脂の架橋度は５０％以上、好ましくは９０％以上である。この架橋度はポリスチレン−ジビニルベンゼン樹脂中のジビニルベンゼンに相当するものであり、架橋度が低いと、測定時に樹脂の変形を起こし、所望の流量（特に高流量）で測定が出来ず、従って分解能も下がってしまい好ましくない。
【０００９】
Ｓｔ−ＤＶＢ樹脂をスルホン化する方法には、樹脂を濃硫酸中に入れてスルホン化する直接スルホン化法があるが、樹脂に修飾させるイオン交換容量の調節が難しく、マクロポーラス型の樹脂では高交換容量（約１ミリモル／ミリリットル程度）になってしまい不適当である。
そこで、本発明では、A.SeubertとA.Klingenbergによる方法（Journal of Chromatography A, 782 (1997) 149-157）を用いて行うのがよい。この方法によるＳｔ−ＤＶＢ樹脂のスルホン化は、以下のような２段階で行う。
１段階：Ｓｔ−ＤＶＢ樹脂をω−ハロゲン化アシルクロライド（ＸＣｎＨ２ｎＣＯＣｌ、Ｘはハロゲン原子、好ましくは塩素原子を表し、ｎは２以上の整数を表し、−ＣｎＨ２ｎ−は直鎖が好ましい。）及びルイス塩基（例えば、塩化アルミニウム）を用いてアシル化する。
２段階：アシル化されたＳｔ−ＤＶＢ樹脂の末端ハロゲンをスルホン化する。このスルホン化はいかなる公知の方法を用いてもよいが、硫化ジメチル（Ｓ（ＣＨ３）２）と亜硫酸ナトリウム（Ｎａ２ＳＯ３）を用いるのが一般的である。
このようにして生成するアシル化されたスルホン基をアシルスルホン基（−ＣＯＣ ｎ Ｈ ２ｎ ＳＯ ３ − ）とよぶ。
この方法によるスルホン化の反応機構の例を図１に示す。この方法によれば、スルホン化を制御しながら行うことができるため、上述の直接スルホン化法のようにＳｔ−ＤＶＢ樹脂を高交換容量にすることなく低交換容量のＳｔ−ＤＶＢ樹脂を製造することが可能である。
【００１０】
本発明のＳｔ−ＤＶＢ樹脂の交換容量（即ち、スルホン基の濃度）は１〜１００μモル／ミリリットル、好ましくは５〜５０μモル／ミリリットルである。上述のスルホン化の工程において、スルホン化が不完全である場合（特に上記第２段階が不完全である場合）であっても、最終的にスルホン基の濃度がこの範囲内であれば、本発明の目的には適う。
この交換容量が１００μモル／ミリリットルであってもアミノ酸の分解能はそれ程向上せず、その一方で溶離液の濃度が上がり好ましくない。また、交換容量が１μモル／ミリリットル以下のようにあまりに低くなると試料負荷量が小さすぎて実用的ではない。
また、交換容量が１００μモル／ミリリットル以下のような低交換容量のカラムを用いると、その検出に目的に応じて電気伝導率、紫外吸収、ケイ光検出などの検出方法を用いることが可能であり、検出方法に選択の余地が広がり好ましい。特に紫外吸収による検出方法を用いれば芳香族アミノ酸の分析が容易に行えることとなり好ましい。さらに、このような低交換容量のカラムを全アミノ酸を対象としない特定のアミノ酸分析に用いると、極めて簡便に低コストで特定用途のアミノ酸検出が可能になる。しかしながら、交換容量が１００μモル／ミリリットル以上の高交換容量のカラムではこのような微妙な検出方法を採用することが出来ず、一般にケイ光検出法を用いることになり、その自由度が低下する。
【００１１】
【実施例】
以下、実施例にて本発明を例証するが、本発明を限定することを意図するものではない。
実施例１
まず、Ｓｔ−ＤＶＢ樹脂として、東ソー株式会社製ＧＰＣ用高分解能カラムG1000HHR（同社商標）に充填のもの（粒径５μｍ、排除限界分子量（ポリスチレン）１，０００、架橋度９０％以上）をカラムより取り出して用いた。
このＳｔ−ＤＶＢ樹脂を以下の手順に従ってスルホン化した。
（１）２ｇのＳｔ−ＤＶＢ樹脂を300ml丸底フラスコ中で25ml 1,2-ジクロロメタンに懸濁させる（室温）。
（２）0.2ml 3-クロロプロピオニルクロライドを加えて、１５分間よく混ぜ均一にする（室温）。
（３）０．２７７ｇの無水塩化アルミニウムを加える（室温）。
（４）１０分後に反応を止めるために１００ｍｌのＴＨＦを加える（室温）。
（５）0.2μm親水性PTFE濾紙により樹脂を濾別し、THF/H2O=1/1(v/v)、2M HCl、H2O、MeOHの順にそれぞれ一時間ずつ洗浄する（室温）。
（６）アシル化した樹脂を１５ｍｌの硫化ジメチルと２０ｍｌのメタノールに懸濁し、１２時間攪拌する（室温）。
（７）樹脂を濾別し、数回メタノールで洗浄する（室温）。
（８）樹脂を１Ｍの亜硫酸ナトリウム（Ｎａ２ＳＯ３）に懸濁し、攪拌しながら８０℃で6時間加熱する。
（９）樹脂をH2O、MeOHで洗浄し、乾燥する（室温）。
（１０）（８）及び（９）の工程を２回繰り返す。
【００１２】
このようにして作製したスルホン化したＳｔ−ＤＶＢ樹脂を、図２に示すカラム充填装置を用いて、カラム（内径４．６ｍｍ、長さ１５ｃｍ、容積２．４９ｍｌ）に充填した。この際の充填溶媒として5mMりん酸（和光純薬工業製、試薬特級）を用いた。この時、りん酸を流して樹脂をカラムに充填する際、背圧が300kg/cm２を越えないようにポンプ（ＧＬサイエンス製 ＡＰＵＳ−５）の流速を調整し、また、カラム内に気泡が入らないように注意しながら充填した。
【００１３】
カラムの交換容量の測定には、図３に示す交換容量測定装置（ポンプ：日立 L-7110、カラム恒温槽：ADVANTEC LS-180、電気伝導率検出器：東ソー CM-8000、インテグレーター：日立 D-2000）を用いた。測定方法は以下の通りである。なお、検出器の出力範囲が広いのでインテグレーターを検出器のレコーダー端子に繋げた。測定条件は、ポンプ流速1.0ml/min、カラム温度30℃、電気伝導率GAIN0.5、RANGE500×10μSとした。
10mM硝酸ナトリウムをカラムに電気伝導率検出器の出力変化がなくなるまで、流した。これは、イオン交換体をナトリウム型にするためである。また、カラム内の硝酸ナトリウムを追い出すため、水を電気伝導率検出器の出力変化がなくなるまで流した（洗浄）。
ナトリウム型のカラムに10mM硝酸を流し、最終的に電気伝導率検出器の出力変化がなくなるまで流した。最初は水が溶出しているため電気伝導率は低く、イオン交換基のナトリウムイオンがプロトンに置き換えられ、ナトリウムイオンが溶出してくると電気伝導率が上がる。最終的にイオン交換基がすべてプロトンに置き換わり、プロトンが溶出するとさらに電気伝導率が上がる。流速（１．０ｍｌ／分）とナトリウムイオンが溶出している時間（５．５分）と硝酸の濃度（１０ｍＭ）の積から、このカラムの交換容量５５μモル／カラム（２２μモル／ミリリットル）を得た。
【００１４】
実施例２
次に、Ｓｔ−ＤＶＢ樹脂として、東ソー株式会社製ＧＰＣ用高分解能カラムG1000HHR（同社商標）に充填のもの（粒径５μｍ、排除限界分子量（ポリスチレン）１，０００、架橋度９０％以上）、同G2000HHR（同）に充填のもの（粒径５μｍ、排除限界分子量（ポリスチレン）１０，０００、架橋度９０％以上）及び同G2500HHR（同）に充填のもの（粒径５μｍ、排除限界分子量（ポリスチレン）２０，０００、架橋度９０％以上）を用いて、実施例１と同様にしてカラムを作成した。但し、それぞれのＳｔ−ＤＶＢ樹脂をスルホン化する工程で、（１）〜（９）を行ったものと（即ち、亜硫酸ナトリウムに懸濁し８０℃で6時間加熱する工程を１回しか行なわないもの）、（１）〜（１０）を行ったもの（即ち、亜硫酸ナトリウムに懸濁し８０℃で6時間加熱する工程を３回行なったもの）の２種類を作成して、それらの交換容量と性能を比較した。その交換容量を下表に示す（単位：μモル／カラム（μモル／ミリリットル））。
それぞれの樹脂で（１）〜（１０）を行ったものに更に（８）及び（９）の工程（即ち、亜硫酸ナトリウムに懸濁し８０℃で6時間加熱する工程）を行っても、交換容量はこれら以上に増加しなかったため、これらのスルホン化は完全に行われたものと考えることができる。その反対に（１）〜（９）のみを行ったものはスルホン化が不完全であったと考えられる。
これらの樹脂を用いて実施例３と同様のアミノ酸の分離分析を行ったところ（詳細な結果は省略する。）、交換容量が２８〜９６μモル／カラムのカラムについては後述の実施例３や４で示す分解能を得ることが出来たが、交換容量が１４７μモル／カラムのカラムについてはこれらに比べ分解能は向上せず、一方溶離液の濃度が上昇するなど好ましくない現象が確認された。この結果から、スルホン化が完全に行われなくとも本発明の目的を達成するのに差は無いことと、本実施例で用いたカラム容量においては交換容量が５０μモル／ミリリットル以下であることが好ましいことがわかる。但し、５０μモル／ミリリットル以上の樹脂をより容量の小さいカラムに充填して用いた場合には、より分解能が上がることが予想される。
【００１６】
実施例３
本実施例では、実施例１で作成したカラムを用いて、図４に示す液体クロマトグラフィー装置（デガッサ−：ERMA ERC-3510、ポンプ：島津 LC-9A 2台、サンプルループインジェクター：Rheodyne 7725I、カラム恒温槽：TOYO KAGAKU SANGYO F1-45、反応恒温槽：東ソー CO‐8000、反応溶液ポンプ：Lab-Quatec MP311、デジタルマルチメーター：ADVANTEST R6441A、検出器：紫外吸収検出器 島津 SPD-10A；蛍光検出器 東ソー FS-8010、データ処理：デルコンピュータ Latitude Xpi、DIMENSION XPS D233（Win98、Excel2000））を用いて標準アミノ酸１７種（株式会社味の素タカラコーポレーション試薬アミノ酸セット）の分離を行った。
溶離液A：20mM H3PO4（和光純薬工業製、試薬特級）（ｐＨ2.6）
溶離液B：20mM Na2HPO4（和光純薬工業製、試薬特級）−20％アセトニトリル（関東化学製、ＨＰＬＣ用） （ｐＨ8.6）
カラム：実施例１で作成のカラム（交換容量55μmol/column）
カラム恒温槽：30℃
溶離液流速：0.6ml/min
ＯＰＡ反応試薬流速：0.5ml/min
注入量：50μL
【００１７】
本実施例で用いたアミノ酸分析システムによる現時点で最良と考えられる条件で測定した標準アミノ酸（アミノ酸17種各1μM、ただしヒスチジンは20μM、リジンは10μM）のクロマトグラムを図５に示す。また、対照として島津高速液体クロマトグラフLC-6Aアミノ酸分析システムによる標準アミノ酸試料（アミノ酸17種各10μM、注入量50μL）のクロマトグラムを図６に示す。
市販のアミノ酸分析システムのクロマトグラムはおよそ60分でアルギニンまでの16種が溶出し、当然ながら良好な分離が得られた。ただし、トリプトファンは設定された溶離条件では溶出しなかった。本研究による現在のアミノ酸溶離系では、L、Yが分離しないなどまだ不十分な点もあるが、50分程度でトリプトファンまで溶出し、更にグラジエントプログラムを改良することによって、時間短縮と分離改善の可能性が高い。尚、いずれの場合もプロリンは感度が悪く検出されていない。なお、市販のアミノ酸分析計ではアミノ酸の分析時間は約70分で、カラムの再平衡化（初期状態に戻す）に要する時間は約30分なので、サイクルタイムは約100分である。本実施例ではそれぞれ50分と20分なので、サイクルタイムは70分である。
【００１８】
両者によるクロマトグラムを比較すると、アミノ酸の溶出順序にいくつか異なる点が見られた。市販のアミノ酸分析計では、最後に溶出するのが塩基性アミノ酸で、本研究のアミノ酸分析ではフェニルアラニン、トリプトファンであることから、前者の分離ではイオン交換作用が支配的で（従ってトリプトファンが溶出しない）、後者ではどちらかというと疎水性相互作用が強く働いていると考えられる。また、グリシンとアラニンの位置が異なるのも同様の理由と考えられる。あるいは、本カラムの交換容量に比べて溶離液濃度が高いため、塩基性アミノ酸がフェニルアラニンとトリプトファンを追い越して早く溶出していることも解釈できる。
【００１９】
セリンとグリシン及びイソロイシンとロイシンの分離は現カラムの分解能の問題であって、より高性能のカラムを調製できれば、例えば、6000段以上／カラム（可能な数字）のカラムを調製できれば今の条件でも分離が改善可能である。ロイシンとチロシンの分離に関しては、有機溶媒の種類やグラジエントプログラム、緩衝液の種類などを変更して、特にチロシンの選択性を変えてやれば分離できる可能性がある。ただ、グルタミン酸とバリンの間に蛍光ベースラインの大きな変動が見られ、プロリンの検出定量に影響する問題がある。ＵＶ検出では溶離液組成の急な変化によって、検出セル内で起こる光の散乱現象によってベースライン変動に伴うシステムピークが現れたが、蛍光検出でも見かけ上同様の現象が観測されており、溶離液中の不純物の影響も考えられる。
【００２０】
実施例４
すいか果汁を用いて実施例３と同様にして分析を行ったところ、アミノ酸を適正に分離した。この果汁に含まれるアミノ酸のクロマトグラムを図７に示す。
【００２１】
【発明の効果】
本発明の液体クロマトグラフィー用充填剤は、優れたアミノ酸の分離能を示した。上記実施例３において、標準アミノ酸１７種では、ロイシンとチロシンが重なるほかは、セリンからトリプトファンまで約５０分で良好な分離を示した。また上記実施例４においては果汁中の遊離アミノ酸を分析すると、その果実特有のアミノ酸分布を示すなど、食品科学分野で品質管理などに応用できる。ＰＫＵ患者尿を紫外吸収検出により溶離液組成一定のアイソクラチック分析をすると、短時間でクレアチニンとフェニルアラニンを同時に定量し（一般には同時定量は難しい）、クレアチニン比を容易に決定できるため、先天性代謝異常症スクリーニングや診断が可能など、臨床化学や医学生理学分野に応用できる。
本発明の液体クロマトグラフィー用充填剤は、イオン交換基の導入及び交換容量が制御されているため、安定した低交換容量の液体クロマトグラフィー用充填剤を提供することができる。また、充填カラムの耐久性も高く、1年以上性能を維持することを確認した。劣化の際は、再充填することで性能を回復できる。分析コストパフォーマンスに優れ、誰でも手軽にアミノ酸分析を実施できる。溶離液濃度が低いので、多用される蛍光検出法のほかに、汎用の紫外吸収や電気伝導率検出器も使用可能になり、方法の適用範囲が広がる。溶離液濃度は通常の1/10以下なので環境負荷は小さい。
【図面の簡単な説明】
【図１】Ｓｔ−ＤＶＢ樹脂をスルホン化する反応機構の例を示す図である。
【図２】カラム充填装置を示す図である。
【図３】交換容量測定装置を示す図である。
【図４】液体クロマトグラフィー装置を示す図である。
【図５】本発明のカラムを用いた標準アミノ酸（アミノ酸17種各1μM、ただしヒスチジンは20μM、リジンは10μM）のクロマトグラムである。
【図６】島津高速液体クロマトグラフLC-6Aアミノ酸分析システムによる標準アミノ酸試料（アミノ酸17種各10μM、注入量50μL）のクロマトグラムである。陽イオン交換カラムの交換容量：2 mmol/ml、溶離液流速：0.3 ml/min
【図７】本発明のカラムを用いたすいか果汁のクロマトグラムである。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a packing material for liquid chromatography, and more specifically, a low-exchange capacity packing material for liquid chromatography effective for amino acid analysis, a column for liquid chromatography packed with this packing material, and the use of this column. The present invention relates to a liquid chromatography apparatus.
[0002]
[Prior art]
Ion exchange chromatography is widely used for amino acid analysis (for example, JP-A-60-143761, JP-A-62-148856, etc.). Amino acid analysis is not only an important tool for determining the primary structure of proteins, but also in the field of clinical medicine, screening for inborn errors of metabolism and measuring free amino acids in the blood and urine of sick patients. Applications such as diagnosis of medical conditions are expanding. Furthermore, this analysis is indispensable in a wide field related to biochemistry, such as analysis of amino acid composition such as food, compound feed and drug development.
For instrumentation of amino acid analysis, liquid chromatography (LC) using a cation exchange column by Spackman, Moore, Stein et al. Of the American Rockefeller Institute in 1951, and a coloring system by reaction with a fraction collector, ninhydrin, It begins with the complete separation and quantification system of α-amino acids. The basic principle and method were the same as those of today's amino acid analysis system, but it took 24 hours to analyze protein-constituting amino acids and 2 days to analyze free amino acids in the living body. This was followed by high-performance ion chromatography, high-sensitivity detectors, advancements in hardware technology such as liquid pumps and autosamplers, and advances in integrator technology. In 1969, high-pressure (high-performance) high-performance liquid chromatography ( With the development of HPLC), the pressure resistance and speed of the system further increased, and compared with the 1958 system, the analysis time was reduced to 1/20. In 1971, a fluorescence derivatization method of amino acids with fluorescamine and in 1975 with orthophthalaldehyde (OPA) was established, and the detection sensitivity improved dramatically from nanomolar level to picomolar level.
[0003]
Since amino acids have an amino group and a carboxyl group, they are cations or anions depending on pH in the solution. Currently used ion exchange resins for amino acid analysis that are generally used are those in which a styrene-divinylbenzene copolymer is used as a base material and a sulfone group (strong cation exchange resin) is introduced into the benzene ring. . A basic system is one in which separation is performed quickly by flowing three types of eluents in a gradient (pH gradient), and detection is performed by the OPA method or the ninhydrin method.
[0004]
In addition to the ion exchange method, there is ion pair chromatography performed in a “reverse phase” system separation mode for the direct separation of amino acids. The stationary phase of the reverse phase column filler includes a silica gel stationary phase and an organic polymer stationary phase. In practice, however, the advantages of the silica gel stationary phase are practically great even considering the advantages of the organic polymer stationary phase and the disadvantages of the silica gel stationary phase, and are therefore used for most organic compound separations.
Typical advantages of the silica gel stationary phase are that it is very hard and the resin size is uniform, so that the separation performance is good, the pressure resistance and the solvent stability are excellent, and the column cost is low. Disadvantages include a narrow pH range that can be used, irreversible adsorption of basic substances, tailing of peaks, and a reduction in recovery rate.
On the other hand, the advantages of the organic polymer filler include a wide adaptive pH range, a large sample load, easy chemical modification, and polarity selection according to the type of polymer. Disadvantages include low resolution, low pressure resistance, limited solvent (swelling / shrinking), and high column cost.
In any case, the ion pair method consumes a large amount of organic solvent and ion pair reagent and has disadvantages such as poor reproducibility, so it is not used on a daily basis. On the other hand, separation of amino acids by the ion exchange method has a pH gradient. Since a silica gel-based stationary phase is not suitable for this, a resin column in which an organic polymer (styrene-divinylbenzene) is chemically modified (an ion exchange group is introduced) is used in many columns. However, this column actually has a large exchange capacity (2 meq / mL or more) and a high eluent concentration.
[0005]
The inventor has been considering amino acid separation on a low exchange capacity cation exchange column instead of the conventional high exchange capacity cation exchange column in consideration of environmental issues such as wastewater treatment in recent years and reduction of analysis cost. . Commercially available low exchange capacity cation exchange resins for inorganic analysis have poor selectivity for amino acid cations, and no suitable column is available. The inventor has so far prepared a low exchange capacity cation exchange column in which sodium hexadecylsulfonate (SHS) is hydrophobically adsorbed on ODS silica and analyzed amino acids using a phosphate buffer as an eluent. However, although good separation was obtained for amino acids limited by isocratic elution with a constant eluent composition, desorption of SHS occurred when the eluent composition was changed. It was found that gradient elution which changes the eluent pH from acidic to basic in order to elute 20 species was not possible. In addition, a surface sulfonated low exchange capacity styrene-divinylbenzene (St-DVB) cation exchange column with a degree of cross-linking of about 4% was prototyped, but it was superior to amino acid cations compared to commercially available low exchange capacity columns. Although it showed selectivity, it was found that the resolution of the column was low.
[0006]
[Problems to be solved by the invention]
Commercially available cation exchange type amino acid analyzers are specialized equipment and are indispensable for daily analysis, but the equipment is expensive, lacks versatility, has high operating costs, and uses a high exchange capacity column, so the eluent concentration Therefore, the environmental load is large. Also, it is not easy for anyone to carry out amino acid analysis when necessary. On the other hand, although various low exchange capacity columns are commercially available, all of them are used for inorganic cation analysis, so that selectivity for amino acid cations is poor, and it is difficult to obtain an appropriate column at present.
Accordingly, an object of the present invention is to provide a packing material for liquid chromatography that can easily and easily separate amino acids in a short time.
[0007]
[Means for Solving the Problems]
The present invention relates to a packing material for liquid chromatography comprising a polystyrene-divinylbenzene resin having an average particle size of 5 μm or less, an exclusion limit molecular weight of 50,000 or less, and a degree of crosslinking of 50% or more, and the polystyrene-divinylbenzene resin Is a packing material for liquid chromatography having an acylsulfone group and an exchange capacity of 1 to 100 μmol / ml. The polystyrene-divinylbenzene resin preferably has an average particle diameter of 2 to 5 μm, an exclusion limit molecular weight of 1,000 to 20,000, and a crosslinking degree of 90% or more. The polystyrene-divinylbenzene resin is Tosoh Corporation. G2500HHR (trademark), G2000HHR (same), G1000HHR (same), SuperH2500 (same) (particle size 3μm, exclusion limit molecular weight (polystyrene) 20,000, crosslinking degree 90% or more) SuperH2000 (same particle size 3 μm, exclusion limit molecular weight (polystyrene) 10,000, crosslinking degree 90% or more) or SuperH1000 (same particle size 3 μm, exclusion limit molecular weight (polystyrene) 1,000, crosslinking It is preferable that the resin is filled at a degree of 90% or more. The acylsulfone group is also introduced by acylating the polystyrene-divinylbenzene resin with ω-halogenated acyl chloride and a Lewis base, and then sulfonating the terminal halogen of the acylated resin. It is preferable.
Further, the present invention is a liquid chromatography column for amino acid analysis packed with any of the above liquid chromatography packing materials, and further a liquid chromatography apparatus using the liquid chromatography column.
[0008]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
The styrene-divinylbenzene copolymer (St-DVB resin) used in the present invention needs to have a specific average particle size, exclusion limit molecular weight, and degree of crosslinking.
That is, the average particle diameter of the St-DVB resin of the present invention is 5 μm or less, preferably 2 to 5 μm. If it is 5 μm or more, it is not suitable because the resolution of amino acids is lowered. On the other hand, if it is 2 μm or less, it is difficult to pack, and it is necessary to reduce the flow rate.
The exclusion limit molecular weight of the St-DVB resin of the present invention is 50,000 or less, preferably 1,000 to 20,000. This exclusion limit molecular weight actually corresponds to the pore diameter of the resin, but when the above requirement is expressed in terms of pore diameter, it is 70 angstroms or less, preferably 10 to 30 angstroms.
The degree of crosslinking of the St-DVB resin of the present invention is 50% or more, preferably 90% or more. This degree of crosslinking is equivalent to divinylbenzene in polystyrene-divinylbenzene resin. If the degree of crosslinking is low, the resin will be deformed during measurement and measurement at the desired flow rate (especially high flow rate) will not be possible. Is also undesirable.
[0009]
There is a direct sulfonation method in which St-DVB resin is sulfonated by placing the resin in concentrated sulfuric acid, but it is difficult to adjust the ion exchange capacity to modify the resin. The exchange capacity (about 1 mmol / ml) is not suitable.
Therefore, in the present invention, it is preferable to use the method by A. Seubert and A. Klingenberg (Journal of Chromatography A, 782 (1997) 149-157). The sulfonation of St-DVB resin by this method is performed in the following two steps.
One step: St-DVB resin is converted to ω-halogenated acyl chloride (XC n H 2n COCl, X represents a halogen atom, preferably a chlorine atom, n represents an integer of 2 or more, and —C n H 2n − represents Chain is preferred) and Lewis bases (eg, aluminum chloride) are used for acylation.
Step 2: Sulfonate the terminal halogen of the acylated St-DVB resin. This sulfonation may be carried out by any known method, but dimethyl sulfide (S (CH 3 ) 2 ) and sodium sulfite (Na 2 SO 3 ) are generally used.
The acylated sulfone group thus generated is called an acyl sulfone group (—COC n H 2n SO 3 − ).
An example of the reaction mechanism of sulfonation by this method is shown in FIG. According to this method, since the sulfonation can be controlled, a St-DVB resin having a low exchange capacity can be produced without making the St-DVB resin a high exchange capacity as in the direct sulfonation method described above. It is possible.
[0010]
The exchange capacity (that is, the concentration of the sulfone group) of the St-DVB resin of the present invention is 1 to 100 μmol / ml, preferably 5 to 50 μmol / ml. Even if the sulfonation process is incomplete (especially when the second stage is incomplete) in the above-described sulfonation step, the final sulfonation group concentration is within this range. Suitable for the purposes of the invention.
Even when the exchange capacity is 100 μmol / ml, the resolution of amino acids is not improved so much, while the concentration of the eluent is undesirably increased. On the other hand, if the exchange capacity is too low, such as 1 μmol / milliliter or less, the sample load is too small to be practical.
In addition, when a column with a low exchange capacity such as an exchange capacity of 100 μmol / milliliter or less is used, detection methods such as electrical conductivity, ultraviolet absorption, and fluorescence detection can be used depending on the purpose. Therefore, it is preferable that the detection method has a room for selection. In particular, it is preferable to use an ultraviolet absorption detection method because aromatic amino acids can be easily analyzed. Further, when such a low exchange capacity column is used for a specific amino acid analysis not targeting all amino acids, it is possible to detect an amino acid for a specific purpose very easily and at low cost. However, such a delicate detection method cannot be used for a column with a high exchange capacity of 100 μmol / milliliter or more, and generally the fluorescence detection method is used, and the degree of freedom is reduced.
[0011]
【Example】
The following examples illustrate the invention, but are not intended to limit the invention.
Example 1
First, as St-DVB resin, a high resolution column for GPC manufactured by Tosoh Corporation G1000HHR (trademark) (particle size 5 μm, exclusion limit molecular weight (polystyrene) 1,000, crosslinking degree 90% or more) is used from the column. It was taken out and used.
The St-DVB resin was sulfonated according to the following procedure.
(1) 2 g of St-DVB resin is suspended in 25 ml of 1,2-dichloromethane in a 300 ml round bottom flask (room temperature).
(2) Add 0.2 ml 3-chloropropionyl chloride, mix well for 15 minutes and homogenize (room temperature).
(3) Add 0.277 g of anhydrous aluminum chloride (room temperature).
(4) Add 100 ml THF to stop the reaction after 10 minutes (room temperature).
(5) The resin is filtered off with 0.2 μm hydrophilic PTFE filter paper and washed with THF / H 2 O = 1/1 (v / v), 2M HCl, H 2 O, and MeOH in this order for 1 hour each (room temperature). .
(6) The acylated resin is suspended in 15 ml of dimethyl sulfide and 20 ml of methanol and stirred for 12 hours (room temperature).
(7) The resin is filtered off and washed several times with methanol (room temperature).
(8) The resin is suspended in 1M sodium sulfite (Na 2 SO 3 ) and heated at 80 ° C. for 6 hours with stirring.
(9) The resin is washed with H 2 O, MeOH and dried (room temperature).
(10) Repeat steps (8) and (9) twice.
[0012]
The sulfonated St-DVB resin thus produced was packed in a column (inner diameter 4.6 mm, length 15 cm, volume 2.49 ml) using the column packing apparatus shown in FIG. As the filling solvent at this time, 5 mM phosphoric acid (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, reagent special grade) was used. At this time, when the resin is packed into the column by flowing phosphoric acid, the flow rate of the pump (APUS-5 manufactured by GL Science) is adjusted so that the back pressure does not exceed 300 kg / cm 2, and there are bubbles in the column. Filled with care not to enter.
[0013]
To measure the exchange capacity of the column, the exchange capacity measurement device shown in Fig. 3 (pump: Hitachi L-7110, column thermostatic chamber: ADVANTEC LS-180, conductivity detector: Tosoh CM-8000, integrator: Hitachi D- 2000) was used. The measuring method is as follows. Since the output range of the detector is wide, the integrator was connected to the recorder terminal of the detector. The measurement conditions were a pump flow rate of 1.0 ml / min, a column temperature of 30 ° C., an electrical conductivity of GAIN 0.5, and a RANGE of 500 × 10 μS.
10 mM sodium nitrate was allowed to flow through the column until there was no change in the output of the conductivity detector. This is to make the ion exchanger sodium. Further, in order to drive out sodium nitrate in the column, water was flowed until there was no change in the output of the conductivity detector (washing).
10 mM nitric acid was allowed to flow through a sodium-type column until the output change of the conductivity detector disappeared. At first, since water is eluted, the electrical conductivity is low, and sodium ions of the ion exchange group are replaced with protons, and when sodium ions are eluted, the electrical conductivity increases. Eventually, all ion exchange groups are replaced with protons, and when the protons elute, the electrical conductivity further increases. From the product of the flow rate (1.0 ml / min), the elution time of sodium ions (5.5 min) and the concentration of nitric acid (10 mM), the exchange capacity of this column is 55 μmol / column (22 μmol / ml). Obtained.
[0014]
Example 2
Next, as St-DVB resin, a high resolution column for GPC manufactured by Tosoh Corporation G1000HHR (trademark) (particle size 5 μm, exclusion limit molecular weight (polystyrene) 1,000, crosslinking degree 90% or more), G2000HHR (same) filled (particle size 5μm, exclusion limit molecular weight (polystyrene) 10,000, crosslinking degree 90% or more) and G2500HHR (same) filled (particle size 5μm, exclusion limit molecular weight (polystyrene) A column was prepared in the same manner as in Example 1 using 20,000 and a crosslinking degree of 90% or more. However, in the step of sulfonating each St-DVB resin, the steps (1) to (9) were performed (ie, the step of suspending in sodium sulfite and heating at 80 ° C. for 6 hours was performed only once). ), (1) to (10) (ie, three times the process of suspending in sodium sulfite and heating at 80 ° C. for 6 hours), and their exchange capacity and performance Compared. The exchange capacity is shown in the table below (unit: μmol / column (μmol / ml)).
Even if the steps (1) to (10) were performed on each resin and the steps (8) and (9) (ie, the steps suspended in sodium sulfite and heated at 80 ° C. for 6 hours) were performed, the exchange capacity Since these did not increase further than these, it can be considered that these sulfonations were completely carried out. On the other hand, it was considered that those subjected to only (1) to (9) had incomplete sulfonation.
Using these resins, the same amino acid separation and analysis as in Example 3 was performed (detailed results are omitted). As for columns having an exchange capacity of 28 to 96 μmol / column, Examples 3 and 4 described later are used. However, it was confirmed that the column with an exchange capacity of 147 μmol / column did not improve the resolution compared to these columns, while an undesirable phenomenon such as an increase in the concentration of the eluent was confirmed. From this result, it can be seen that there is no difference in achieving the object of the present invention even if the sulfonation is not completely carried out, and that the exchange capacity is 50 μmol / milliliter or less in the column capacity used in this example. It turns out that it is preferable. However, when a resin having 50 μmol / milliliter or more is packed in a column having a smaller capacity, it is expected that the resolution will be further improved.
[0016]
Example 3
In this example, using the column prepared in Example 1, the liquid chromatography apparatus (degasser: ERMA ERC-3510, pump: Shimadzu LC-
Eluent A: 20 mM H 3 PO 4 (Wako Pure Chemical Industries, reagent special grade) (pH 2.6)
Eluent B: 20 mM Na 2 HPO 4 (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, reagent special grade) -20% acetonitrile (manufactured by Kanto Chemical, for HPLC) (pH 8.6)
Column: Column prepared in Example 1 (exchange capacity 55 μmol / column)
Column thermostat: 30 ° C
Eluent flow rate: 0.6ml / min
OPA reaction reagent flow rate: 0.5ml / min
Injection volume: 50μL
[0017]
FIG. 5 shows a chromatogram of standard amino acids (17 amino acids each 1 μM,
The chromatogram of a commercially available amino acid analysis system eluted 16 species up to arginine in about 60 minutes, and of course a good separation was obtained. However, tryptophan did not elute under the set elution conditions. In the current amino acid elution system according to this study, there are still some points that L and Y are not separated, but tryptophan elutes in about 50 minutes, and the gradient program is further improved to shorten time and improve separation. Probability is high. In either case, proline has low sensitivity and is not detected. In a commercially available amino acid analyzer, the amino acid analysis time is about 70 minutes, and the time required to re-equilibrate the column (return to the initial state) is about 30 minutes, so the cycle time is about 100 minutes. In this embodiment, the cycle time is 70 minutes because they are 50 minutes and 20 minutes, respectively.
[0018]
When the chromatograms of the two were compared, there were some differences in the amino acid elution order. In the commercially available amino acid analyzer, the basic amino acid is eluted last, and in the amino acid analysis in this study, phenylalanine and tryptophan, so the ion exchange action is dominant in the former separation (and therefore tryptophan does not elute). In the latter case, it is considered that hydrophobic interaction is working strongly. Also, the same reason is considered that the positions of glycine and alanine are different. Alternatively, since the eluent concentration is higher than the exchange capacity of this column, it can be interpreted that the basic amino acid is quickly eluted by overtaking phenylalanine and tryptophan.
[0019]
Separation of serine and glycine and isoleucine and leucine is a matter of resolution of the current column. If a higher-performance column can be prepared, for example, a column with more than 6000 plates / column (possible numbers) can be prepared under the present conditions Separation can be improved. Regarding the separation of leucine and tyrosine, there is a possibility that separation can be achieved by changing the type of organic solvent, gradient program, type of buffer, etc., and in particular changing the selectivity of tyrosine. However, a large fluctuation in the fluorescence baseline is observed between glutamic acid and valine, which has a problem influencing the detection and quantification of proline. In UV detection, due to a sudden change in the eluent composition, a system peak due to baseline fluctuations appeared due to the light scattering phenomenon that occurs in the detection cell. The influence of impurities inside can also be considered.
[0020]
Example 4
When watermelon juice was used and analyzed in the same manner as in Example 3, amino acids were properly separated. A chromatogram of amino acids contained in this fruit juice is shown in FIG.
[0021]
【The invention's effect】
The packing material for liquid chromatography of the present invention showed excellent amino acid separation ability. In Example 3 above, 17 standard amino acids showed good separation from serine to tryptophan in about 50 minutes except that leucine and tyrosine overlapped. Further, in Example 4 described above, when free amino acids in fruit juice are analyzed, the distribution of amino acids peculiar to the fruits is shown, and this can be applied to quality control in the food science field. When isocratic analysis of PKU patient urine with ultraviolet absorption detection is performed with a constant eluent composition, creatinine and phenylalanine can be quantified simultaneously in a short time (generally, simultaneous quantification is difficult), and the creatinine ratio can be easily determined. It can be applied to clinical chemistry and medical physiology fields such as metabolic screening and diagnosis.
Since the introduction and exchange capacity of the ion exchange group is controlled, the liquid chromatography filler of the present invention can provide a stable and low exchange capacity liquid chromatography filler. In addition, it was confirmed that the packed column is highly durable and maintains its performance for more than one year. In the case of deterioration, performance can be recovered by refilling. Excellent analysis cost performance, anyone can easily perform amino acid analysis. Since the eluent concentration is low, general-purpose ultraviolet absorption and electrical conductivity detectors can be used in addition to the frequently used fluorescence detection method, and the applicable range of the method is expanded. The environmental load is small because the eluent concentration is less than 1/10 of the normal concentration.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a diagram showing an example of a reaction mechanism for sulfonating a St-DVB resin.
FIG. 2 is a view showing a column packing apparatus.
FIG. 3 is a diagram showing an exchange capacity measuring device.
FIG. 4 is a diagram showing a liquid chromatography apparatus.
FIG. 5 is a chromatogram of standard amino acids (1 μM each for 17 amino acids, 20 μM for histidine and 10 μM for lysine) using the column of the present invention.
FIG. 6 is a chromatogram of a standard amino acid sample (17 amino acids each 10 μM,
FIG. 7 is a chromatogram of watermelon juice using the column of the present invention.
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