JP3713065B2 - 二糖モノマー及びそのオリゴマーとオリゴマーの製造方法 - Google Patents
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、新規な二糖モノマー及びこの二糖モノマーを出発原料とし、これにセルラーゼを作用させることによって得られるオリゴマー（オリゴ糖）とその製造方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
従来より、フッ化β−Ｄ−セロビオシル（次の式中Ｉで示したもの）については、久保らの方法（日本大学獣医学部学術研究報告書，４１，９，１９８４）が知られている。また、このフッ化β−Ｄ−セロビオシルを出発原料として、これにセルラーゼを作用させることにより、セルロースオリゴマーが得られることも知られている（特願平１−２３９６１１号）。
【化３】
【０００３】
一方、キチンはＮ−アセチルグルコサミンユニットが、１，４結合した天然多糖で、甲殻類、昆虫等の生物体に広く分布しており、キチン及びキチンを脱アセチル化したキトサン及びこれらを加水分解して得られるオリゴ糖類は、安全性、生分解性、生体との親和性に優れており、医療分野、化粧品分野への応用が期待されている。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
しかし、工業的に生産されるキチンは、カニやエビの殻を原料にしているため、１）少量のキチンを得るのに大量の殻を必要とする、２）一定の品質を有するキチンを得るためには、同質の原料つまり同種のエビ又はカニを集める必要がある、３）エビやカニは繁殖期があり、漁獲量が周期的に増減し、安定供給が望めない等、主として原料確保の面で問題が多い。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者等は、上記問題点を解決すべく、鋭意検討した結果、二糖モノマーであるフッ化４−Ｏ−（２−アセトアミド−２−デオキシ−β−Ｄ−グルコピラノシル）−β−Ｄ−グルコピラノシルの合成に成功した。さらにこれを酵素触媒重合することにより新規なオリゴマーを得ることに成功し、本発明に至ったものである。なお、このオリゴマーは、キチンおよびその加水分解物であるオリゴマーそのものではないが、分子内にＮ−アセチルグルコサミンユニットを有し、同様の特性を示すと考えられる。
【０００６】
すなわち、本発明は、下記構造式で示される新規二糖モノマーであるフッ化４−Ｏ−（２−アセトアミド−２−デオキシ−β−Ｄ−グルコピラノシル）−β−Ｄ−グルコピラノシルを提供するものである。
【化４】
【０００７】
また本発明は、別の側面として下記構造式で示される新規オリゴマー（II）
【化５】
及びその製造法を提供するものである。
【０００８】
この新規オリゴマーはグルコースユニットとＮ−アセチルグルコサミンユニットとを交互に有するもので、キチン及びその加水分解物であるオリゴ糖に近い特性を示す。
【０００９】
新規二糖モノマーであるフッ化４−Ｏ−（２−アセトアミド−２−デオキシ−β−Ｄ−グルコピラノシル）−β−Ｄ−グルコピラノシル（１）は、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン（２ａ）及びグルコース（４ａ）を出発原料として以下の反応式Ａで示される経路により、合成することができる。
【化６】
この反応経路Ａは、合成経路の概要を示すものであり、後述する実施例１の記述に沿って詳細に説明される。しかし、この実施例１は最良の実施形態を提供するものの、各中間体を得るための溶媒、反応温度、反応時間、中間体に化合させる反応物等の諸要素は、当業者に公知の技術を勘案して置き換え可能であり、このように諸要素を変化させて得られる各種態様は全て本発明の技術的思想の範囲に含まれる。
【００１０】
また、下記構造式を有する新規オリゴマー（II）
【化７】
は、フッ化４−Ｏ−（２−アセトアミド−２−デオキシ−β−Ｄ−グルコピラノシル）−β−Ｄ−グルコピラノシル（１）をアセトニトリルと緩衝液（例えば酢酸緩衝液）の混合液に溶解したものにセルラーゼを緩衝液（例えば酢酸緩衝液）に溶かしたものに加え、攪拌下で反応させ、反応終了後、反応液に過剰量のアセトニトリルを加え、加熱することにより、セルラーゼを失活させ、次いで溶媒を除去したものを精製・分離することにより得ることができる。なお、反応条件を適宜設定することにより、４糖、６糖から任意の糖数のオリゴマーを得ることができる。
【００１１】
【実施例】
実施例１
フッ化４−Ｏ−（２−アセトアミド−２−デオキシ−β−Ｄ−グルコピラノシル）−β−Ｄ−グルコピラノシル（１）の製造方法（上記反応式（Ａ）を参照して説明する）
【００１２】
２−メチル（３，４，６−トリ−Ｏ−アセチル−１，２−ジデオキシ−α−Ｄ−グルコピラノ）〔２，１−ｄ〕−２−オキサゾリン〔反応式Ａの（３）〕
アルゴン雰囲気下、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン〔反応式Ａの（２ａ）〕（２０．０ｇ，９０．５ｍｍｏｌ）を塩化アセチル（８０ｍｌ）に分散させ、マグネットスターラーにより室温で３日間攪拌させた。ＴＬＣにより反応終了を確認した後、クロロホルムで希釈した水（×２）、飽和炭酸ナトリウム（×２）、水（×２）で分液し集めた有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥した。硫酸ナトリウムをろ過により除去した後溶媒をエバポレータにより除き減圧乾燥するこにより塩化Ｎ−テトラ−Ｏ−アセチル−α−Ｄ−グルコサミル〔反応式Ａの（２ｂ）〕の混合物を得た。さらにアルゴン雰囲気下、混合物をアセトニトリルに溶かした溶液を塩化テトラエチルアンモニウム（７．１ｇ，４２．９ｍｍｏｌ）と炭酸水素ナトリウム（７．１ｇ，８４．５ｍｍｏｌ）に加え３０分間反応させた。ＴＬＣにて反応終了を確認後ガラスフィルターで固体を除き、溶媒を濃縮して塩化メチレンに溶かして分液し集めた有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥した。ろ過で無水硫酸ナトリウムを除き濃縮した後、混合物をシリカゲルカラムクロマトグラフ（Ｇｅｌ：Ｍｅｒｃｋ社製 Sirica gel ６０）（展開溶媒；酢酸エチル／ヘキサン＝５／２）により精製し２−メチル（３，４，６−トリ−Ｏ−アセチル−１，２−ジデオキシ−α−Ｄ−グルコピラノ）〔２，１−ｄ〕−２−オキサゾリン〔反応式Ａの（３）〕（１５．３ｇ，４６．４ｍｍｏｌ，５１．３％）を得た。
【００１３】
グルコースペンタアセテート〔反応式Ａの（４ｂ）〕
グルコース〔反応式Ａの（４ａ）〕（２９．８ｇ，１６６ｍｍｏｌ）にピリジン（１００ｍｌ）を加えた溶液に無水酢酸（２００ｍｌ）を滴下し２４時間反応させた。ＴＬＣにより反応終了を確認した後、エバポレートで溶液を濃縮し氷水へ投入した。１時間放置した後、ガラスフィルターろ過にて固体と水を分離しガラスフィルター上の固体をクロロホルムに溶かし、これが中性になるまで冷水で分液した。有機層を分離後無水硫酸ナトリウムにより乾燥した。無水硫酸ナトリウムをろ過により除去した後、クロロホルムをエバポレートにより除き、さらに減圧乾燥することによりグリコースペンタアセテート〔反応式Ａの（４ｂ）〕（５８．８ｇ，１５０ｍｍｏｌ，９０．９％）を得た。
【００１４】
臭化２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−α−Ｄ−グルコシル〔反応式Ａの（４ｃ）〕
グルコースペンタアセテート〔反応式Ａの（４ｂ）〕（５８．６ｇ，１５０ｍｍｏｌ）のクロロホルム溶液に３０％ＨＢｒ酢酸溶液（１０５ｍｌ）をクロロホルム（５５ｍｌ）で希釈した混合溶液を０℃で滴下し３時間反応させた。過剰量のクロロホルムで希釈しこれが中性になるまで冷水で分液した。有機層を分離後無水硫酸ナトリウムにより乾燥した。無水硫酸ナトリウムをろ過により除去した後、クロロホルムをエバポレータにより除く、さらに減圧乾燥することにより臭化２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−α−Ｄ−グルコシル〔反応式Ａの（４ｃ）〕（５７．６ｇ，１４０ｍｍｏｌ，９３％）を得た。
【００１５】
ベンジル２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−グルコシド〔反応式Ａの（４ｄ）〕
暗所、Ａｒ雰囲気下酸化銀（４２．５ｇ，１８３ｍｍｏｌ）と硫酸カルシウム（１６０℃、１時間減圧乾燥、１５０ｇ）に臭化２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−α−Ｄ−グルコシル〔反応式Ａの（４ｃ）〕（５７．６ｇ，１４０ｍｍｏｌ）をベンジルアルコール（１００ｍｌ）とクロロホルム（１３０ｍｌ）の混合溶媒に溶解し加え１２０℃で還流させながら約３時間攪拌した。セライトろ過により銀触媒と硫酸カルシウムを取り除き溶媒を減圧乾燥により除いた後エタノールから再結晶したものをろ過により収集しデシケーター乾燥することでベンジル２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−グルコシド〔反応式Ａの（４ｄ）〕（２５．９ｇ，５９．２ｍｍｏｌ，４２．３％）
【００１６】
ベンジル−β−Ｄ−グルコシド〔反応式Ａの（５）〕
ベンジル２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−グルコシド〔反応式Ａの（４ｄ）〕（２５．９ｇ，５９．１ｍｍｏｌ）を脱気後アルゴン置換し、無水メタノール（４００ｍｌ）に溶解させナトリウムメトキシドのメタノール溶液（０．０１５Ｍ，３．７ｍｌ）を加え室温にて３時間反応させた。ＴＬＣにより反応終了を確認しイオン交換樹脂［Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ ＩＲ−１２０（Ｈ+ ）］を加え攪拌した。反応溶液が中性になったのをｐＨ試験紙で確認した後、ろ過によりイオン交換樹脂を取り除きメタノールをエバポレートにより除去し減圧乾燥することでベンジル−β−Ｄ−グルコシド〔反応式Ａの（５）〕（１６．０ｇ，５９．２ｍｍｏｌ，１００％）を得た。
【００１７】
ベンジル４，６−Ｏ−ベンジリデン−β−Ｄ−グルコシド〔反応式Ａの（６）〕
アルゴン雰囲気下、ベンジル−β−Ｄ−グルコシド〔反応式Ａの（５）〕（１６．０ｇ，５９．２ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（テトラヒドロフラン）（３００ｍｌ）に溶解させ、ｐ−トルエンスルホン酸（２．３ｇ，１２．１ｍｍｏｌ）、α，α−ジメトキシトルエン（２０ｍｌ）を投入し２４時間反応させＴＬＣにて反応の終了を確認した後、ピリジン（１５ｍｌ）を投入し反応液を中和した後に濃縮、クロロホルムで希釈後中性になるまで冷水で分液した。有機層を分離後、無水硫酸ナトリウムにより乾燥させ濃縮後に得られた固体を減圧乾燥しベンジル４，６−Ｏ−ベンジリデン−β−Ｄ−グルコシド〔反応式Ａの（６）〕（２１．０ｇ，５８．５ｍｍｏｌ，９９％）を得た。
【００１８】
ベンジル４，６−Ｏ−ベンジリデン−２，３−ジ−Ｏ−ベンジル−β−Ｄ−グルコシド〔反応式Ａの（７）〕
アルゴン雰囲気下、ベンジル４，６−Ｏ−ベンジリデン−β−Ｄ−グルコシド〔反応式Ａの（６）〕（２１．０ｇ，５８．５ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（１１０ｍｌ）に溶かしＮａＨ（１３ｇ，５４２ｍｍｏｌ）を溶かしたＤＭＦ溶液に０℃で滴下する。しばらく攪拌した後にベンジルブロミド（３０ｍｌ）を滴下した。反応終了をＴＬＣにて確認した後に過剰のメタノールを反応液に投入し、グラスフィルターでろ過しグラスフィルター上の固体をクロロホルムに溶かして分液し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。ろ過にて無水硫酸ナトリウムを除きエバポレートで濃縮した後減圧乾燥させることによりベンジル４，６−Ｏ−ベンジリデン−２，３−ジ−Ｏ−ベンジル−β−Ｄ−グルコシド〔反応式Ａの（７）〕（１７．７ｇ，３２．９ｍｍｏｌ，５６％）を得た。
【００１９】
ベンジル２，３，６−トリ−Ｏ−ベンジル−β−Ｄ−グルコシド〔反応式Ａの（８）〕
アルゴン雰囲気下、ベンジル４，６−Ｏ―ベンジリデン―２，３―ジ−ベンジル−β−Ｄ−グルコシド〔反応式Ａの（７）〕（１７．７ｇ，３２．９ｍｍｏｌ）水素化シアノホウ素ナトリウム（１８ｇ，２７２ｍｍｏｌ）及び粉末モレキュラーシーブス（３Ａ）（３５ｇ）を含むＴＨＦ（１５０ｍｌ）溶液に０℃にてエーテルの飽和無水塩酸溶液を徐々に滴下する。ＴＬＣにて反応の終了を確認した後、水で水素化シアノホウ素ナトリウムを殺し濃縮したものをエーテルで希釈し中性になるまで飽和食塩水で分液する。有機層を分離後無水硫酸ナトリウムで乾燥させる。ろ過にて固体を除去し、エバポレータにより濃縮後クロロホルムで希釈し分液して無水硫酸ナトリウムを加えて乾燥させさらに濃縮する。残留物を展開溶媒が酢酸エチル／ヘキサン＝２／９のフラッシュカラムクロマトグラフィーにて単離精製してベンジル２，３，６−トリ−Ｏ−ベンジル−β−Ｄ−グルコシド〔反応式Ａの（８）〕（９．３ｇ，１７．２ｍｍｏｌ，５２．４％）を得た。
【００２０】
ベンジル４−Ｏ−（２−アセトアミド−３，４，６−トリ−Ｏ−アセチル−２−デオキシ−β−Ｄ−グルコピラノシル）−２，３，６−トリ−Ｏ−ベンジル−β−Ｄ−グルコシド〔反応式Ａの（９）〕
アルゴン雰囲気下、２，３，６−トリ−Ｏ−ベンジル−β−Ｄ−グルコシド〔反応式Ａの（８）〕（１９５ｍｇ，０．３６０ｍｍｏｌ）の１，２ジクロロエタン（３ｍｌ）溶液にｐ−トルエンスルホン酸（３４ｍｇ，０．２ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（０．４ｍｌ）に溶かした溶液と２−メチル（３，４，６−トリ−Ｏ−アセチル−１，２−ジデオキシ−α−Ｄ−グルコピラノ）〔２，１−ｄ〕−２−オキサゾリン〔反応式Ａの（３）〕（３６６ｍｇ，１．０ｍｍｏｌ）を１，２ジクロロエタン（２．５ｍｌ）に溶かした溶液をオイルバス上６０℃において４日間反応させた。反応液をクロロホルムで希釈し分液した後、集めた有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥した。ろ過で無水硫酸ナトリウムを除き濃縮した後、混合物をシリカゲルカラムクロマトグラフ（Ｇｅｌ：Ｍｅｒｃｋ社製 Sirica gel ６０）（展開溶媒；酢酸エチル／ヘキサン＝５／２）により精製しベンジル４−Ｏ−（２−アセトアミド−３，４，６−トリ−Ｏ−アセチル−２−デオキシ−β−Ｄ−グルコピラノシル）−２，３，６−トリ−Ｏ−ベンジル−β−Ｄ−グルコシド〔反応式Ａの（９）〕（５５．０ｍｇ，０．０６３２ｍｍｏｌ，１７．６％）を得た。
【００２１】
４−Ｏ−（２−アセトアミド−３，４，６−トリ−Ｏ−アセチル−２−デオキシ−β−Ｄ―グルコピラノシル）−β−Ｄ−グルコース〔反応式Ａの（１０ａ）〕
パラジウム−カーボン（１０％）（０．３０４ｇ）とＴＨＦ（３ｍｌ）の混合物を約３０秒間脱気し、水素置換を行った。この操作を５回繰り返した後、水素雰囲気下ベンジル４−Ｏ−（２−アセトアミド−３，４，６−トリ−Ｏ−アセチル−２−デオキシ−β−Ｄ−グルコピラノシル）−２，３，６−トリ−Ｏ−ベンジル−β−Ｄ−グルコシド〔反応式Ａの（９）〕（６４２ｍｇ，０．７３８ｍｍｏｌ）のＴＨＦ溶液（１５ｍｌ）を加え２４時間反応させた。ＴＬＣにて反応終了を確認後、セライトろ過によりパラジウムを取り除きエバポレータで溶媒を除去し４−Ｏ−（２−アセトアミド−３，４，６−トリ−Ｏ−アセチル−２−デオキシ−β−Ｄ−グルコピラノシル）−β−Ｄ−グルコース〔反応式Ａの（１０ａ）〕（３７７ｍｇ，０．７４０ｍｍｏｌ，ｑｕａｎｔ．）を得た。
【００２２】
１−Ｏ−アセチル−４−Ｏ−（２−アセトアミド−３，４，６−トリ−Ｏ−アセチル−２−デオキシ−β−Ｄ−グルコピラノシル）−２，３，６−トリ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−グルコース〔反応式Ａの（１０ｂ）〕
４−Ｏ−（２−アセトアミド−３，４，６−トリ−Ｏ−アセチル−２−デオキシ−β−Ｄ−グルコピラノシル）−β−Ｄ−グルコース〔反応式Ａの（１０ａ）〕（３７７ｍｇ，０．７４０ｍｍｏｌ）の無水ピリジン（４ｍｌ）溶液に無水酢酸（６ｍｌ）を０℃で滴下した。室温で２４時間反応させ、ＴＬＣにより反応終了を確認後、エバポレートによりトルエンとの共沸で溶媒を除去し、さらに減圧乾燥することで１−Ｏ−アセチル−４−Ｏ−（２−アセトアミド−３，４，６−トリ−Ｏ−アセチル−２−デオキシ−β−Ｄ−グルコピラノシル）−２，３，６−トリ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−グルコース〔反応式Ａの（１０ｂ）〕（４７３ｍｇ，０．６９８ｍｍｏｌ，９４．３％）を得た。
【００２３】
臭化４−Ｏ−（２−アセトアミド−３，４，６−トリ−Ｏ−アセチル−２−デオキシ−β−Ｄ−グルコピラノシル）−２，３，６−トリ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−グルコシル〔反応式Ａの（１０ｃ）〕
１−Ｏ−アセチル−４−Ｏ−（２−アセトアミド−３，４，６−トリ−Ｏ−アセチル−２−デオキシ−β−Ｄ−グルコピラノシル）−２，３，６−トリ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−グルコシル〔反応式Ａの（１０ｂ）〕（４７３ｍｇ，０．６９４ｍｍｏｌ）のクロロホルム溶液（６ｍｌ）に３０％ＨＢｒ酢酸溶液（１．２ｍｌ）をクロロホルムで希釈した混合溶液を０℃で滴下し４時間反応させた。ＴＬＣにより反応終了を確認した後、クロロホルムで希釈し、これが中性になるまで冷水で分液した。有機層を分離後、無水硫酸ナトリウムにより乾燥した。無水硫酸ナトリウムを除いた後、クロロホルムをエバポレータにより除去しさらに減圧乾燥することにより臭化４−Ｏ−（２−アセトアミド−３，４，６−トリ−Ｏ−アセチル−２−デオキシ−β−Ｄ−グルコピラノシル）−２，３，６−トリ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−グルコシル〔反応式Ａの（１０ｃ）〕（４８８ｍｇ，０．６９４ｍｍｏｌ，ｑｕａｎｔ．）を得た。
【００２４】
フッ化４−Ｏ−（２−アセトアミド−３，４，６−トリ−Ｏ−アセチル−２−デオキシ−β−Ｄ−グルコピラノシル）−２，３，６−トリ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−グルコシル〔反応式Ａの（１０ｄ）〕
暗所アルゴン雰囲気下、微粉砕したフッ化銀（０．４ｇ，３．１５ｍｍｏｌ，１２０℃，１時間脱気）に臭化４−Ｏ−（２−アセトアミド−３，４，６−トリ−Ｏ−アセチル−２−デオキシ−β−Ｄ−グルコピラノシル）−２，３，６−トリ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−グルコシル〔反応式Ａの（１０ｃ）〕（４８８ｍｇ，０．６９４ｍｍｏｌ）のアセトニトリル溶液（８ｍｌ）を加え、マグネットスターラーにより室温で１２時間反応させた。ＴＬＣにより反応終了を確認した後、セライトろ過により銀触媒を取り除き、次いでエバポレータによりクロロホルムを除去した後シリカゲルカラムクロマトグラフ（Ｇｅｌ：Ｍｅｒｃｋ社製 Sirica gel ６０）（展開溶媒；酢酸エチル／ヘキサン＝７／１）により精製しフッ化４−Ｏ−（２−アセトアミド−３，４，６−トリ−Ｏ−アセチル−２−デオキシ−β−Ｄ−グルコピラノシル）−２，３，６−トリ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−グルコシル〔反応式Ａの（１０ｄ）〕（２５１ｍｇ，０．３９４ｍｍｏｌ，５６．３％）を得た。
【００２５】
フッ化４−Ｏ−（２−アセトアミド−２−デオキシ−β−Ｄ−グルコピラノシル）−β−Ｄ−グルコシル〔反応式Ａの（１ｂ）〕
フッ化４−Ｏ−（２−アセトアミド−３，４，６−トリ−Ｏ−アセチル−２−デオキシ−β−Ｄ−グルコピラノシル）−２，３，６−トリ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−グルコシル〔反応式Ａの（１０ｄ）〕（２５１ｍｇ，０．３９４ｍｍｏｌ）を１０分間脱気した後、アルゴン置換し無水メタノール（１０ｍｌ）に溶解させ、ナトリウムメトキシドのメタノール溶液（０．０８Ｍ，０．１１ｍｌ）を加えた後０℃にて４５分間反応させた。ＴＬＣにより反応終了を確認しイオン交換樹脂［Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ ＩＲ−１２０（Ｈ+ ）］を加え攪拌した。反応溶液が中性になったのをｐＨ試験紙で確認した後、ろ過によりイオン交換樹脂を取り除きメタノールをエバポレートにより除去し減圧乾燥することでフッ化４−Ｏ−（２−アセトアミド−２−デオキシ−β−Ｄ−グルコピラノシル）−β−Ｄ−グルコシル〔反応式Ａの（１ｂ）〕（１５１ｍｇ，０．３９４ｍｍｏｌ，ｑｕａｎｔ．）を得た。
【００２６】
得られたフッ化４−Ｏ−（２−アセトアミド−２−デオキシ−β−Ｄ−グルコピラノシル）−β−Ｄ−グルコシル〔反応式Ａの（１ｂ）〕の 1Ｈ ＮＭＲ及び13Ｃ ＮＭＲは次の通りである。
1Ｈ ＮＭＲ（Ｄ2 Ｏ，δ）
５．２（ｄ，ｄ；Ｊ1,F ＝53.01,d;J1,2＝7.19；１Ｈ）
還元末端のアノメリック プロトン
４．６（ｄ；Ｊ1 ′,2′＝８．３６；１Ｈ）
非還元末端ユニットのアノメリック
２．０（ｓ；３Ｈ）アセチル基プロトン
13Ｃ ＮＭＲ（Ｄ2 Ｏ，δ）
１７４（１Ｃ） アセチル基のカルボニル 13Ｃ
１０９（１Ｃ） （ｄ；Ｊ1,F ＝214.40；１Ｃ）１（β）−13Ｃ
１０１（１Ｃ） １′−13Ｃ
７６．５（１Ｃ） ４− 13Ｃ
７６．０（１Ｃ） ５′−13Ｃ
７４．８（１Ｃ）（ｄ；Ｊ5,F ＝4.59；１Ｃ）５（β）−13Ｃ
７３．５（１Ｃ） ３′−13Ｃ
７３．４（１Ｃ）（ｄ；Ｊ3,F ＝9.68；１Ｃ）３（β）−13Ｃ
７２．８（１Ｃ）（ｄ；Ｊ2,F ＝19.4；１Ｃ）２（β）−13Ｃ
７０．０（１Ｃ） ４′−13Ｃ
６１．０（１Ｃ） ６−13Ｃ
６１．５（１Ｃ） ６′−13Ｃ
５６．０（１Ｃ） ２′−13Ｃ
２０．５〜２３．１（１Ｃ） アセチル基のメチル13Ｃ
【００２７】
実施例２
実施例１で得られたフッ化４−Ｏ−（２−アセトアミド−２−デオキシ−β−Ｄ−グルコピラノシル）−β−Ｄ−グルコピラノシル１０１ｍｇをアセトニトリル２ｍｌと酢酸緩衝液（０．０１Ｍ，ｐＨ５）４ｍｌとの混合液に溶解させた。別容器にTrichoderma Viride由来のセルラーゼ５ｍｇを酢酸緩衝溶液（０．０１Ｍ、ｐＨ５）２ｍｌに加えたものを調製し、これをフッ化４−Ｏ−（２−アセトアミド−２−デオキシ−β−Ｄ−グルコピラノシル）−β−Ｄ−グルコピラノシル溶液に加え温度３０℃で２時間、マグネチックスターラーにより攪拌した。反応終了後、反応液に過剰量のアセトニトリルを加え、１００℃油浴中に１０分間浸すことにより、セルラーゼを失活させ、エバポレーターにより溶媒を除去し、粗反応生成物を高性能液体クロマトグラフィーにより分解し、４糖オリゴマー２ｍｇと６糖オリゴマー３ｍｇを得た。４糖オリゴマーの 1Ｈ ＮＭＲは、図１に示す通りであり、13Ｃ ＮＭＲは後述する通りであった。また、６糖オリゴマーの 1Ｈ ＮＭＲは、図２に示す通りであった。
【００２８】
４糖オリゴマー
1Ｈ ＮＭＲ（Ｄ2 Ｏ，δ）の結果は、図１に示す通りであり。この４糖オリゴマーの化学式は、以下の通りである。
【化８】
【００２９】
図１は以下のように解析される。
４．５〜４．６ｐｐｍ：非還元末端及び内部グルコースユニットのアノメリックプロトン
３．２〜４．２ｐｐｍ：グルコースユニットの２，３，４，６位プロトン
２．０ｐｐｍ：アセチルのメチルプロトン
【００３０】
13Ｃ ＮＭＲ（Ｄ2 Ｏ，δ）
１７５（１Ｃ） アセチル基のカルボニル
１７４（１Ｃ） アセチル基のカルボニル
１０２（３Ｃ） 非還元末端
９７（１Ｃ） 還元末端アノメリック （α体）
９３（１Ｃ） 還元末端アノメリック （β体）
２３（２Ｃ） アセチル基のメチル
【００３１】
６糖オリゴマー
1Ｈ ＮＭＲ（Ｄ2 Ｏ，δ）の結果は、図２に示す通りである。この化学式は、以下の通りである。
【化９】
図２は以下のように解析される。
４．５〜４．６ｐｐｍ：非還元末端グルコース及び内部グルコースユニットのアノメリック１位プロトン
３．２〜４．２ｐｐｍ：グルコースユニットの２，３，４，６位プロトン
２．０ｐｐｍ：アセチルのメチルプロトン
【００３２】
【発明の効果】
以上のように、本発明によれば、分子内にＮ−アセチルグルコサミンユニットを有し、キチンおよびその加水分解物と同様の特性を備えるオリゴマー及びその原料として有用な２糖モノマーが提供される。提供されるオリゴマーは、キチン、キトサンと同様に安全性、生分解性、生体との親和性に優れており、キチン、キトサンと同様な医療分野、化粧品分野等への幅広い応用を行うことができる。すなわち、例えば、生体適合性を活用して、手術用縫合糸、創傷被覆剤として活用することができる。
しかも、従来のキチン等に比べ、安定供給を望むことができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、本発明によって得られた４糖オリゴマーの 1Ｈ ＮＭＲの結果を示すグラフである。
【図２】図２は、本発明によって得られた６糖オリゴマーの 1Ｈ ＮＭＲの結果を示すグラフである。
【産業上の利用分野】
本発明は、新規な二糖モノマー及びこの二糖モノマーを出発原料とし、これにセルラーゼを作用させることによって得られるオリゴマー（オリゴ糖）とその製造方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
従来より、フッ化β−Ｄ−セロビオシル（次の式中Ｉで示したもの）については、久保らの方法（日本大学獣医学部学術研究報告書，４１，９，１９８４）が知られている。また、このフッ化β−Ｄ−セロビオシルを出発原料として、これにセルラーゼを作用させることにより、セルロースオリゴマーが得られることも知られている（特願平１−２３９６１１号）。
【化３】
一方、キチンはＮ−アセチルグルコサミンユニットが、１，４結合した天然多糖で、甲殻類、昆虫等の生物体に広く分布しており、キチン及びキチンを脱アセチル化したキトサン及びこれらを加水分解して得られるオリゴ糖類は、安全性、生分解性、生体との親和性に優れており、医療分野、化粧品分野への応用が期待されている。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
しかし、工業的に生産されるキチンは、カニやエビの殻を原料にしているため、１）少量のキチンを得るのに大量の殻を必要とする、２）一定の品質を有するキチンを得るためには、同質の原料つまり同種のエビ又はカニを集める必要がある、３）エビやカニは繁殖期があり、漁獲量が周期的に増減し、安定供給が望めない等、主として原料確保の面で問題が多い。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者等は、上記問題点を解決すべく、鋭意検討した結果、二糖モノマーであるフッ化４−Ｏ−（２−アセトアミド−２−デオキシ−β−Ｄ−グルコピラノシル）−β−Ｄ−グルコピラノシルの合成に成功した。さらにこれを酵素触媒重合することにより新規なオリゴマーを得ることに成功し、本発明に至ったものである。なお、このオリゴマーは、キチンおよびその加水分解物であるオリゴマーそのものではないが、分子内にＮ−アセチルグルコサミンユニットを有し、同様の特性を示すと考えられる。
【０００６】
すなわち、本発明は、下記構造式で示される新規二糖モノマーであるフッ化４−Ｏ−（２−アセトアミド−２−デオキシ−β−Ｄ−グルコピラノシル）−β−Ｄ−グルコピラノシルを提供するものである。
【化４】
また本発明は、別の側面として下記構造式で示される新規オリゴマー（II）
【化５】
【０００８】
この新規オリゴマーはグルコースユニットとＮ−アセチルグルコサミンユニットとを交互に有するもので、キチン及びその加水分解物であるオリゴ糖に近い特性を示す。
【０００９】
新規二糖モノマーであるフッ化４−Ｏ−（２−アセトアミド−２−デオキシ−β−Ｄ−グルコピラノシル）−β−Ｄ−グルコピラノシル（１）は、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン（２ａ）及びグルコース（４ａ）を出発原料として以下の反応式Ａで示される経路により、合成することができる。
【化６】
【００１０】
また、下記構造式を有する新規オリゴマー（II）
【化７】
【００１１】
【実施例】
実施例１
フッ化４−Ｏ−（２−アセトアミド−２−デオキシ−β−Ｄ−グルコピラノシル）−β−Ｄ−グルコピラノシル（１）の製造方法（上記反応式（Ａ）を参照して説明する）
【００１２】
２−メチル（３，４，６−トリ−Ｏ−アセチル−１，２−ジデオキシ−α−Ｄ−グルコピラノ）〔２，１−ｄ〕−２−オキサゾリン〔反応式Ａの（３）〕
アルゴン雰囲気下、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン〔反応式Ａの（２ａ）〕（２０．０ｇ，９０．５ｍｍｏｌ）を塩化アセチル（８０ｍｌ）に分散させ、マグネットスターラーにより室温で３日間攪拌させた。ＴＬＣにより反応終了を確認した後、クロロホルムで希釈した水（×２）、飽和炭酸ナトリウム（×２）、水（×２）で分液し集めた有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥した。硫酸ナトリウムをろ過により除去した後溶媒をエバポレータにより除き減圧乾燥するこにより塩化Ｎ−テトラ−Ｏ−アセチル−α−Ｄ−グルコサミル〔反応式Ａの（２ｂ）〕の混合物を得た。さらにアルゴン雰囲気下、混合物をアセトニトリルに溶かした溶液を塩化テトラエチルアンモニウム（７．１ｇ，４２．９ｍｍｏｌ）と炭酸水素ナトリウム（７．１ｇ，８４．５ｍｍｏｌ）に加え３０分間反応させた。ＴＬＣにて反応終了を確認後ガラスフィルターで固体を除き、溶媒を濃縮して塩化メチレンに溶かして分液し集めた有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥した。ろ過で無水硫酸ナトリウムを除き濃縮した後、混合物をシリカゲルカラムクロマトグラフ（Ｇｅｌ：Ｍｅｒｃｋ社製 Sirica gel ６０）（展開溶媒；酢酸エチル／ヘキサン＝５／２）により精製し２−メチル（３，４，６−トリ−Ｏ−アセチル−１，２−ジデオキシ−α−Ｄ−グルコピラノ）〔２，１−ｄ〕−２−オキサゾリン〔反応式Ａの（３）〕（１５．３ｇ，４６．４ｍｍｏｌ，５１．３％）を得た。
【００１３】
グルコースペンタアセテート〔反応式Ａの（４ｂ）〕
グルコース〔反応式Ａの（４ａ）〕（２９．８ｇ，１６６ｍｍｏｌ）にピリジン（１００ｍｌ）を加えた溶液に無水酢酸（２００ｍｌ）を滴下し２４時間反応させた。ＴＬＣにより反応終了を確認した後、エバポレートで溶液を濃縮し氷水へ投入した。１時間放置した後、ガラスフィルターろ過にて固体と水を分離しガラスフィルター上の固体をクロロホルムに溶かし、これが中性になるまで冷水で分液した。有機層を分離後無水硫酸ナトリウムにより乾燥した。無水硫酸ナトリウムをろ過により除去した後、クロロホルムをエバポレートにより除き、さらに減圧乾燥することによりグリコースペンタアセテート〔反応式Ａの（４ｂ）〕（５８．８ｇ，１５０ｍｍｏｌ，９０．９％）を得た。
【００１４】
臭化２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−α−Ｄ−グルコシル〔反応式Ａの（４ｃ）〕
グルコースペンタアセテート〔反応式Ａの（４ｂ）〕（５８．６ｇ，１５０ｍｍｏｌ）のクロロホルム溶液に３０％ＨＢｒ酢酸溶液（１０５ｍｌ）をクロロホルム（５５ｍｌ）で希釈した混合溶液を０℃で滴下し３時間反応させた。過剰量のクロロホルムで希釈しこれが中性になるまで冷水で分液した。有機層を分離後無水硫酸ナトリウムにより乾燥した。無水硫酸ナトリウムをろ過により除去した後、クロロホルムをエバポレータにより除く、さらに減圧乾燥することにより臭化２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−α−Ｄ−グルコシル〔反応式Ａの（４ｃ）〕（５７．６ｇ，１４０ｍｍｏｌ，９３％）を得た。
【００１５】
ベンジル２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−グルコシド〔反応式Ａの（４ｄ）〕
暗所、Ａｒ雰囲気下酸化銀（４２．５ｇ，１８３ｍｍｏｌ）と硫酸カルシウム（１６０℃、１時間減圧乾燥、１５０ｇ）に臭化２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−α−Ｄ−グルコシル〔反応式Ａの（４ｃ）〕（５７．６ｇ，１４０ｍｍｏｌ）をベンジルアルコール（１００ｍｌ）とクロロホルム（１３０ｍｌ）の混合溶媒に溶解し加え１２０℃で還流させながら約３時間攪拌した。セライトろ過により銀触媒と硫酸カルシウムを取り除き溶媒を減圧乾燥により除いた後エタノールから再結晶したものをろ過により収集しデシケーター乾燥することでベンジル２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−グルコシド〔反応式Ａの（４ｄ）〕（２５．９ｇ，５９．２ｍｍｏｌ，４２．３％）
【００１６】
ベンジル−β−Ｄ−グルコシド〔反応式Ａの（５）〕
ベンジル２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−グルコシド〔反応式Ａの（４ｄ）〕（２５．９ｇ，５９．１ｍｍｏｌ）を脱気後アルゴン置換し、無水メタノール（４００ｍｌ）に溶解させナトリウムメトキシドのメタノール溶液（０．０１５Ｍ，３．７ｍｌ）を加え室温にて３時間反応させた。ＴＬＣにより反応終了を確認しイオン交換樹脂［Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ ＩＲ−１２０（Ｈ+ ）］を加え攪拌した。反応溶液が中性になったのをｐＨ試験紙で確認した後、ろ過によりイオン交換樹脂を取り除きメタノールをエバポレートにより除去し減圧乾燥することでベンジル−β−Ｄ−グルコシド〔反応式Ａの（５）〕（１６．０ｇ，５９．２ｍｍｏｌ，１００％）を得た。
【００１７】
ベンジル４，６−Ｏ−ベンジリデン−β−Ｄ−グルコシド〔反応式Ａの（６）〕
アルゴン雰囲気下、ベンジル−β−Ｄ−グルコシド〔反応式Ａの（５）〕（１６．０ｇ，５９．２ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（テトラヒドロフラン）（３００ｍｌ）に溶解させ、ｐ−トルエンスルホン酸（２．３ｇ，１２．１ｍｍｏｌ）、α，α−ジメトキシトルエン（２０ｍｌ）を投入し２４時間反応させＴＬＣにて反応の終了を確認した後、ピリジン（１５ｍｌ）を投入し反応液を中和した後に濃縮、クロロホルムで希釈後中性になるまで冷水で分液した。有機層を分離後、無水硫酸ナトリウムにより乾燥させ濃縮後に得られた固体を減圧乾燥しベンジル４，６−Ｏ−ベンジリデン−β−Ｄ−グルコシド〔反応式Ａの（６）〕（２１．０ｇ，５８．５ｍｍｏｌ，９９％）を得た。
【００１８】
ベンジル４，６−Ｏ−ベンジリデン−２，３−ジ−Ｏ−ベンジル−β−Ｄ−グルコシド〔反応式Ａの（７）〕
アルゴン雰囲気下、ベンジル４，６−Ｏ−ベンジリデン−β−Ｄ−グルコシド〔反応式Ａの（６）〕（２１．０ｇ，５８．５ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（１１０ｍｌ）に溶かしＮａＨ（１３ｇ，５４２ｍｍｏｌ）を溶かしたＤＭＦ溶液に０℃で滴下する。しばらく攪拌した後にベンジルブロミド（３０ｍｌ）を滴下した。反応終了をＴＬＣにて確認した後に過剰のメタノールを反応液に投入し、グラスフィルターでろ過しグラスフィルター上の固体をクロロホルムに溶かして分液し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。ろ過にて無水硫酸ナトリウムを除きエバポレートで濃縮した後減圧乾燥させることによりベンジル４，６−Ｏ−ベンジリデン−２，３−ジ−Ｏ−ベンジル−β−Ｄ−グルコシド〔反応式Ａの（７）〕（１７．７ｇ，３２．９ｍｍｏｌ，５６％）を得た。
【００１９】
ベンジル２，３，６−トリ−Ｏ−ベンジル−β−Ｄ−グルコシド〔反応式Ａの（８）〕
アルゴン雰囲気下、ベンジル４，６−Ｏ―ベンジリデン―２，３―ジ−ベンジル−β−Ｄ−グルコシド〔反応式Ａの（７）〕（１７．７ｇ，３２．９ｍｍｏｌ）水素化シアノホウ素ナトリウム（１８ｇ，２７２ｍｍｏｌ）及び粉末モレキュラーシーブス（３Ａ）（３５ｇ）を含むＴＨＦ（１５０ｍｌ）溶液に０℃にてエーテルの飽和無水塩酸溶液を徐々に滴下する。ＴＬＣにて反応の終了を確認した後、水で水素化シアノホウ素ナトリウムを殺し濃縮したものをエーテルで希釈し中性になるまで飽和食塩水で分液する。有機層を分離後無水硫酸ナトリウムで乾燥させる。ろ過にて固体を除去し、エバポレータにより濃縮後クロロホルムで希釈し分液して無水硫酸ナトリウムを加えて乾燥させさらに濃縮する。残留物を展開溶媒が酢酸エチル／ヘキサン＝２／９のフラッシュカラムクロマトグラフィーにて単離精製してベンジル２，３，６−トリ−Ｏ−ベンジル−β−Ｄ−グルコシド〔反応式Ａの（８）〕（９．３ｇ，１７．２ｍｍｏｌ，５２．４％）を得た。
【００２０】
ベンジル４−Ｏ−（２−アセトアミド−３，４，６−トリ−Ｏ−アセチル−２−デオキシ−β−Ｄ−グルコピラノシル）−２，３，６−トリ−Ｏ−ベンジル−β−Ｄ−グルコシド〔反応式Ａの（９）〕
アルゴン雰囲気下、２，３，６−トリ−Ｏ−ベンジル−β−Ｄ−グルコシド〔反応式Ａの（８）〕（１９５ｍｇ，０．３６０ｍｍｏｌ）の１，２ジクロロエタン（３ｍｌ）溶液にｐ−トルエンスルホン酸（３４ｍｇ，０．２ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（０．４ｍｌ）に溶かした溶液と２−メチル（３，４，６−トリ−Ｏ−アセチル−１，２−ジデオキシ−α−Ｄ−グルコピラノ）〔２，１−ｄ〕−２−オキサゾリン〔反応式Ａの（３）〕（３６６ｍｇ，１．０ｍｍｏｌ）を１，２ジクロロエタン（２．５ｍｌ）に溶かした溶液をオイルバス上６０℃において４日間反応させた。反応液をクロロホルムで希釈し分液した後、集めた有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥した。ろ過で無水硫酸ナトリウムを除き濃縮した後、混合物をシリカゲルカラムクロマトグラフ（Ｇｅｌ：Ｍｅｒｃｋ社製 Sirica gel ６０）（展開溶媒；酢酸エチル／ヘキサン＝５／２）により精製しベンジル４−Ｏ−（２−アセトアミド−３，４，６−トリ−Ｏ−アセチル−２−デオキシ−β−Ｄ−グルコピラノシル）−２，３，６−トリ−Ｏ−ベンジル−β−Ｄ−グルコシド〔反応式Ａの（９）〕（５５．０ｍｇ，０．０６３２ｍｍｏｌ，１７．６％）を得た。
【００２１】
４−Ｏ−（２−アセトアミド−３，４，６−トリ−Ｏ−アセチル−２−デオキシ−β−Ｄ―グルコピラノシル）−β−Ｄ−グルコース〔反応式Ａの（１０ａ）〕
パラジウム−カーボン（１０％）（０．３０４ｇ）とＴＨＦ（３ｍｌ）の混合物を約３０秒間脱気し、水素置換を行った。この操作を５回繰り返した後、水素雰囲気下ベンジル４−Ｏ−（２−アセトアミド−３，４，６−トリ−Ｏ−アセチル−２−デオキシ−β−Ｄ−グルコピラノシル）−２，３，６−トリ−Ｏ−ベンジル−β−Ｄ−グルコシド〔反応式Ａの（９）〕（６４２ｍｇ，０．７３８ｍｍｏｌ）のＴＨＦ溶液（１５ｍｌ）を加え２４時間反応させた。ＴＬＣにて反応終了を確認後、セライトろ過によりパラジウムを取り除きエバポレータで溶媒を除去し４−Ｏ−（２−アセトアミド−３，４，６−トリ−Ｏ−アセチル−２−デオキシ−β−Ｄ−グルコピラノシル）−β−Ｄ−グルコース〔反応式Ａの（１０ａ）〕（３７７ｍｇ，０．７４０ｍｍｏｌ，ｑｕａｎｔ．）を得た。
【００２２】
１−Ｏ−アセチル−４−Ｏ−（２−アセトアミド−３，４，６−トリ−Ｏ−アセチル−２−デオキシ−β−Ｄ−グルコピラノシル）−２，３，６−トリ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−グルコース〔反応式Ａの（１０ｂ）〕
４−Ｏ−（２−アセトアミド−３，４，６−トリ−Ｏ−アセチル−２−デオキシ−β−Ｄ−グルコピラノシル）−β−Ｄ−グルコース〔反応式Ａの（１０ａ）〕（３７７ｍｇ，０．７４０ｍｍｏｌ）の無水ピリジン（４ｍｌ）溶液に無水酢酸（６ｍｌ）を０℃で滴下した。室温で２４時間反応させ、ＴＬＣにより反応終了を確認後、エバポレートによりトルエンとの共沸で溶媒を除去し、さらに減圧乾燥することで１−Ｏ−アセチル−４−Ｏ−（２−アセトアミド−３，４，６−トリ−Ｏ−アセチル−２−デオキシ−β−Ｄ−グルコピラノシル）−２，３，６−トリ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−グルコース〔反応式Ａの（１０ｂ）〕（４７３ｍｇ，０．６９８ｍｍｏｌ，９４．３％）を得た。
【００２３】
臭化４−Ｏ−（２−アセトアミド−３，４，６−トリ−Ｏ−アセチル−２−デオキシ−β−Ｄ−グルコピラノシル）−２，３，６−トリ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−グルコシル〔反応式Ａの（１０ｃ）〕
１−Ｏ−アセチル−４−Ｏ−（２−アセトアミド−３，４，６−トリ−Ｏ−アセチル−２−デオキシ−β−Ｄ−グルコピラノシル）−２，３，６−トリ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−グルコシル〔反応式Ａの（１０ｂ）〕（４７３ｍｇ，０．６９４ｍｍｏｌ）のクロロホルム溶液（６ｍｌ）に３０％ＨＢｒ酢酸溶液（１．２ｍｌ）をクロロホルムで希釈した混合溶液を０℃で滴下し４時間反応させた。ＴＬＣにより反応終了を確認した後、クロロホルムで希釈し、これが中性になるまで冷水で分液した。有機層を分離後、無水硫酸ナトリウムにより乾燥した。無水硫酸ナトリウムを除いた後、クロロホルムをエバポレータにより除去しさらに減圧乾燥することにより臭化４−Ｏ−（２−アセトアミド−３，４，６−トリ−Ｏ−アセチル−２−デオキシ−β−Ｄ−グルコピラノシル）−２，３，６−トリ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−グルコシル〔反応式Ａの（１０ｃ）〕（４８８ｍｇ，０．６９４ｍｍｏｌ，ｑｕａｎｔ．）を得た。
【００２４】
フッ化４−Ｏ−（２−アセトアミド−３，４，６−トリ−Ｏ−アセチル−２−デオキシ−β−Ｄ−グルコピラノシル）−２，３，６−トリ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−グルコシル〔反応式Ａの（１０ｄ）〕
暗所アルゴン雰囲気下、微粉砕したフッ化銀（０．４ｇ，３．１５ｍｍｏｌ，１２０℃，１時間脱気）に臭化４−Ｏ−（２−アセトアミド−３，４，６−トリ−Ｏ−アセチル−２−デオキシ−β−Ｄ−グルコピラノシル）−２，３，６−トリ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−グルコシル〔反応式Ａの（１０ｃ）〕（４８８ｍｇ，０．６９４ｍｍｏｌ）のアセトニトリル溶液（８ｍｌ）を加え、マグネットスターラーにより室温で１２時間反応させた。ＴＬＣにより反応終了を確認した後、セライトろ過により銀触媒を取り除き、次いでエバポレータによりクロロホルムを除去した後シリカゲルカラムクロマトグラフ（Ｇｅｌ：Ｍｅｒｃｋ社製 Sirica gel ６０）（展開溶媒；酢酸エチル／ヘキサン＝７／１）により精製しフッ化４−Ｏ−（２−アセトアミド−３，４，６−トリ−Ｏ−アセチル−２−デオキシ−β−Ｄ−グルコピラノシル）−２，３，６−トリ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−グルコシル〔反応式Ａの（１０ｄ）〕（２５１ｍｇ，０．３９４ｍｍｏｌ，５６．３％）を得た。
【００２５】
フッ化４−Ｏ−（２−アセトアミド−２−デオキシ−β−Ｄ−グルコピラノシル）−β−Ｄ−グルコシル〔反応式Ａの（１ｂ）〕
フッ化４−Ｏ−（２−アセトアミド−３，４，６−トリ−Ｏ−アセチル−２−デオキシ−β−Ｄ−グルコピラノシル）−２，３，６−トリ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−グルコシル〔反応式Ａの（１０ｄ）〕（２５１ｍｇ，０．３９４ｍｍｏｌ）を１０分間脱気した後、アルゴン置換し無水メタノール（１０ｍｌ）に溶解させ、ナトリウムメトキシドのメタノール溶液（０．０８Ｍ，０．１１ｍｌ）を加えた後０℃にて４５分間反応させた。ＴＬＣにより反応終了を確認しイオン交換樹脂［Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ ＩＲ−１２０（Ｈ+ ）］を加え攪拌した。反応溶液が中性になったのをｐＨ試験紙で確認した後、ろ過によりイオン交換樹脂を取り除きメタノールをエバポレートにより除去し減圧乾燥することでフッ化４−Ｏ−（２−アセトアミド−２−デオキシ−β−Ｄ−グルコピラノシル）−β−Ｄ−グルコシル〔反応式Ａの（１ｂ）〕（１５１ｍｇ，０．３９４ｍｍｏｌ，ｑｕａｎｔ．）を得た。
【００２６】
得られたフッ化４−Ｏ−（２−アセトアミド−２−デオキシ−β−Ｄ−グルコピラノシル）−β−Ｄ−グルコシル〔反応式Ａの（１ｂ）〕の 1Ｈ ＮＭＲ及び13Ｃ ＮＭＲは次の通りである。
1Ｈ ＮＭＲ（Ｄ2 Ｏ，δ）
５．２（ｄ，ｄ；Ｊ1,F ＝53.01,d;J1,2＝7.19；１Ｈ）
還元末端のアノメリック プロトン
４．６（ｄ；Ｊ1 ′,2′＝８．３６；１Ｈ）
非還元末端ユニットのアノメリック
２．０（ｓ；３Ｈ）アセチル基プロトン
13Ｃ ＮＭＲ（Ｄ2 Ｏ，δ）
１７４（１Ｃ） アセチル基のカルボニル 13Ｃ
１０９（１Ｃ） （ｄ；Ｊ1,F ＝214.40；１Ｃ）１（β）−13Ｃ
１０１（１Ｃ） １′−13Ｃ
７６．５（１Ｃ） ４− 13Ｃ
７６．０（１Ｃ） ５′−13Ｃ
７４．８（１Ｃ）（ｄ；Ｊ5,F ＝4.59；１Ｃ）５（β）−13Ｃ
７３．５（１Ｃ） ３′−13Ｃ
７３．４（１Ｃ）（ｄ；Ｊ3,F ＝9.68；１Ｃ）３（β）−13Ｃ
７２．８（１Ｃ）（ｄ；Ｊ2,F ＝19.4；１Ｃ）２（β）−13Ｃ
７０．０（１Ｃ） ４′−13Ｃ
６１．０（１Ｃ） ６−13Ｃ
６１．５（１Ｃ） ６′−13Ｃ
５６．０（１Ｃ） ２′−13Ｃ
２０．５〜２３．１（１Ｃ） アセチル基のメチル13Ｃ
【００２７】
実施例２
実施例１で得られたフッ化４−Ｏ−（２−アセトアミド−２−デオキシ−β−Ｄ−グルコピラノシル）−β−Ｄ−グルコピラノシル１０１ｍｇをアセトニトリル２ｍｌと酢酸緩衝液（０．０１Ｍ，ｐＨ５）４ｍｌとの混合液に溶解させた。別容器にTrichoderma Viride由来のセルラーゼ５ｍｇを酢酸緩衝溶液（０．０１Ｍ、ｐＨ５）２ｍｌに加えたものを調製し、これをフッ化４−Ｏ−（２−アセトアミド−２−デオキシ−β−Ｄ−グルコピラノシル）−β−Ｄ−グルコピラノシル溶液に加え温度３０℃で２時間、マグネチックスターラーにより攪拌した。反応終了後、反応液に過剰量のアセトニトリルを加え、１００℃油浴中に１０分間浸すことにより、セルラーゼを失活させ、エバポレーターにより溶媒を除去し、粗反応生成物を高性能液体クロマトグラフィーにより分解し、４糖オリゴマー２ｍｇと６糖オリゴマー３ｍｇを得た。４糖オリゴマーの 1Ｈ ＮＭＲは、図１に示す通りであり、13Ｃ ＮＭＲは後述する通りであった。また、６糖オリゴマーの 1Ｈ ＮＭＲは、図２に示す通りであった。
【００２８】
４糖オリゴマー
1Ｈ ＮＭＲ（Ｄ2 Ｏ，δ）の結果は、図１に示す通りであり。この４糖オリゴマーの化学式は、以下の通りである。
【化８】
図１は以下のように解析される。
４．５〜４．６ｐｐｍ：非還元末端及び内部グルコースユニットのアノメリックプロトン
３．２〜４．２ｐｐｍ：グルコースユニットの２，３，４，６位プロトン
２．０ｐｐｍ：アセチルのメチルプロトン
【００３０】
13Ｃ ＮＭＲ（Ｄ2 Ｏ，δ）
１７５（１Ｃ） アセチル基のカルボニル
１７４（１Ｃ） アセチル基のカルボニル
１０２（３Ｃ） 非還元末端
９７（１Ｃ） 還元末端アノメリック （α体）
９３（１Ｃ） 還元末端アノメリック （β体）
２３（２Ｃ） アセチル基のメチル
【００３１】
６糖オリゴマー
1Ｈ ＮＭＲ（Ｄ2 Ｏ，δ）の結果は、図２に示す通りである。この化学式は、以下の通りである。
【化９】
４．５〜４．６ｐｐｍ：非還元末端グルコース及び内部グルコースユニットのアノメリック１位プロトン
３．２〜４．２ｐｐｍ：グルコースユニットの２，３，４，６位プロトン
２．０ｐｐｍ：アセチルのメチルプロトン
【００３２】
【発明の効果】
以上のように、本発明によれば、分子内にＮ−アセチルグルコサミンユニットを有し、キチンおよびその加水分解物と同様の特性を備えるオリゴマー及びその原料として有用な２糖モノマーが提供される。提供されるオリゴマーは、キチン、キトサンと同様に安全性、生分解性、生体との親和性に優れており、キチン、キトサンと同様な医療分野、化粧品分野等への幅広い応用を行うことができる。すなわち、例えば、生体適合性を活用して、手術用縫合糸、創傷被覆剤として活用することができる。
しかも、従来のキチン等に比べ、安定供給を望むことができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、本発明によって得られた４糖オリゴマーの 1Ｈ ＮＭＲの結果を示すグラフである。
【図２】図２は、本発明によって得られた６糖オリゴマーの 1Ｈ ＮＭＲの結果を示すグラフである。
Claims (3)
- 下記構造式で示される二糖モノマーであるフッ化４−Ｏ−（２−アセトアミド−２−デオキシ−β−Ｄ−グルコピラノシル）−β−Ｄ−グルコピラノシル。
- 下記構造式で示されるオリゴマー。
- アセトニトリルと緩衝液との混合液中で請求項１の二糖モノマーにセルラーゼを作用させることを特徴とする請求項２のオリゴマーの製造方法。
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