JP3712261B2 - 修飾タンパク質の製造方法 - Google Patents

Description

発明の背景
発明の分野
この発明は、修飾生体分子及びかかる修飾生体分子の製造方法の分野の発明である。より特定的には、この発明は、１又は２以上のペプチド結合が非ペプチド結合によって置換され、１又は２以上のコード化アミノ酸が非天然アミノ酸又はアミノ酸類縁体又は他の何らかの非コード化構造体によって置換された修飾タンパク質を製造する化学的手段によるタンパク質工学に関する。
関連技術
タンパク質、糖タンパク質、ヌクレオチド、多糖類、及び他の生体ポリマーの如き修飾生体分子を合成するための適切な方法を開発するために多大な試みが行われてきた。かかる修飾生体分子は、天然生体分子の構造−活性関係の研究にとって非常に貴重であり、診断及び治療目的にこれら分子を商業的に応用する数が増えている。
普通“タンパク質工学”といわれるタンパク質及びペプチドの構造修飾は、タンパク質構造及び機能を理解する目的で、また新たな望ましい特性を有するタンパク質を作る目的で、構造を理論的にデザインして変更することからなる。以前は、これは、部位特異的突然変異誘発法又は遺伝子操作を含む他の技術によって主として行われてきた。これら先行技術のアプローチの主要な欠点は、アミノ酸置換用天然アミノ酸が遺伝子的にコードされなければならないアミノ酸であることである。その結果、非天然アミノ酸又はアミノ酸類縁体の如き他の構造的変異体をタンパク質主鎖の中に導入することができない。しかしながら、最近の知見（エルマン（Ellman）ら, Science, 255:197, 1992；ノーレン（Noren）ら, Science, 24:182, 1989）は、非天然アミノ酸又はアミノ酸類縁体を部位特異的にタンパク質の中に導入するのを可能にするようである。このアプローチでは、置換すべきアミノ酸をコードするコドンを、オリゴヌクレオチド特異的突然変異誘発法によるナンセンスコドンＴＡＧによって置換する。次いで、このコドンに対して向けられたサプレッサーｔＲＮＡを目的の非天然アミノ酸で化学的にアミノアシル化する。突然変異処理されたＤＮＡでプログラムされたin vitroタンパク質合成系へこのアミノアシル化ｔＲＮＡを加えると、予定のアミノ酸がタンパク質内の標的部位に挿入される。上記著者らは、酵素Ｔ４リソザイムを採用して多くの種々のアミノ酸類縁体をこの酵素の中にアラニン８２位において取り込ませた。なお、僅かな例外はあり、例えば、Ｄ−アラニンは取り込まれなかった。
シュルツ（Schultz）のアプローチは、生合成タンパク質工学により持ち上がる問題を部分的に解決するが、１より多い標的部位においてタンパク質主鎖を変異して２又は３以上の異なる非コード化構造単位の取り込みをできるようにするものではない。また、この系の真の性質、即ち、工学的に作られるタンパク質の産生が生活系に依拠するという事実により、致死突然変異に帰着するような多くの置換又変異は行えない。（オフォード(R. E. Offord), Protein Eng., 1:151, 1987により吟味された）化学合成法は、シュルツ法により残された欠点を克服するだろう。しかしながら、化学合成法は、不要な反応性基の保護の必要性の如き多くの困難に満ちている。
全体として、望ましい特性を有する修飾タンパク質を作るための簡単で効率的な方法の必要性が明らかに存在する。本発明は、かかる必要性に向けられたものであって、新規な修飾タンパク質を提供するものである。
発明の要旨
この発明は、新規で有用な修飾生体分子を提供する。それは、かかる修飾生体分子を製造する新規な方法も提供する。一般に、この発明の修飾生体分子は、それぞれがペプチド、プソイドペプチド、又は非アミド結合によって結合してペプチド又はプソイドペプチド主鎖を形成する非ペプチド線状分子から選ばれる２つの分子セグメントを含む分子であって、これらセグメントのうち１つが少なくとも１つの非コード化構造単位を含有しかつこの非コード化構造単位は非アミド結合の一部を形成しない分子である。これら２つのセグメントの化学結合は、もう１つのセグメント分子の反応性基と反応する１つのセグメント上の末端反応性基による。
この発明の方法は、連結点において目的の結合を作る２分子セグメントの定方向連結（directed ligation）を提供し、以下の工程を含む：
ａ．少なくとも１つの非コード化構造単位を有する第１セグメントを供給し、そして第１化学選択的シントン（synthon）をこの第１セグメントにその末端位置で結合させ；
ｂ．少なくとも１つの非コード化構造単位を任意に含有する第２セグメント、及びその末端位置に第１セグメントの第１化学選択的シントンに相補的である第２化学選択的シントンを供給し；そして
ｃ．第１セグメントと第２セグメントとを連結し、それによって第１セグメントの第１シントンと第２セグメントの第２シントンに非ペプチド結合を形成させる。この際、第１セグメントと第２セグメントはそれぞれ、ペプチド、プソイドペプチド、又は非ペプチド線状分子から選ばれる。但し、両セグメントが同時に非ペプチド線状分子であることはない。
上の順序ａ〜ｃは、第２セグメント又は第２生体分子に連結する第１セグメントとして第１修飾生体分子を用いることによって繰り返すことができる。本発明の方法は、追加の末端シントンが供給された第１及び第２セグメントと追加のセグメントとを連結する工程を含むこともできる。この際、この追加の末端シントンは、第１及び第２シントンと両立できかつこの追加のセグメントのシントンと化学選択的である。
従って、本発明は、リポーター分子、放射性ヌクレオチド、細胞障害剤、ヌクレオチド、抗体、及び非タンパク質微小分子を有するタンパク質の如き種々のタンパク質複合体の化学合成に適用可能である。
好ましくは、この発明の方法は、以下の一連の工程を含む：
ａ．選択したアミノ酸又はアミノ酸類縁体を、第１樹脂支持体に結合した末端アミノ酸又はアミノ酸類縁体に順次カップリングさせて、約２〜約１００アミノ酸残基を有する第１ペプチドセグメント−樹脂を形成し；
ｂ．ハロアシル部分をこの第１ペプチドセグメント−樹脂のＮ末端に共有結合で結合させて、第１樹脂支持体に結合したハロアシルペプチドセグメントを形成し；
ｃ．このハロアシルペプチドセグメントを第１樹脂支持体から切り離し；
ｄ．選択したアミノ酸又はアミノ酸類縁体を、硫黄又はセレン含有結合を介して第２樹脂支持体に結合した末端アミノ酸又はアミノ酸類縁体に順次カップリングさせて、約２〜約１００アミノ酸残基を有する第２ペプチドセグメント−樹脂を形成し；
ｅ．第２ペプチドセグメント−樹脂を開裂させて、そのＣ末端でチオール又はセレノール含有基を有する第２ペプチドセグメントを形成し；そして
ｆ．ハロアシルペプチドセグメントと第２ペプチドセグメントをカップリングして修飾ポリペプチドを形成する。
工程ａ−ｂ−ｃ−ｄ−ｅ−の配列の順序は、この発明にとって重要ではない。工程ａ−ｂ−ｃの配列と工程ｄ−ｅの配列は、続けて行っても別々に行ってもよい。この全体の配列は、連鎖反応式に繰り返してもよい。
任意に、ペプチドセグメント中に存在することができるチオールの如きいずれかの反応性基を工程（ｆ）の前に保護して工程（ｆ）が完了した後に脱保護してもよい。
この発明は、その最も広い意味において、それぞれがペプチド、プソイドペプチド、又は非アミド結合によって結合してペプチド又はプソイドペプチド主鎖を形成する非ペプチド線状分子から選ばれる２つの分子セグメントを含む生物活性なタンパク質であって、これらセグメントのうち１つが少なくとも１つの非コード化構造単位を含有しかつこの非コード化構造単位は非アミド結合の一部を形成しないタンパク質を包含する。但し、両セグメントが同時に非ペプチド線状分子であることはない。
この発明は、更に、式：
Ｒ−Ｌ−Ｒ'
（式中、ＲとＲ'は同一でも異なっていてもよく、それぞれペプチド又はプソイドペプチドの残基であり；Ｌはチオールエステル又はセレノールエステル結合を表す。）により表される修飾タンパク質を提供する。好ましくは、ＲとＲ'はいずれも約２〜約１００のアミノ酸残基を含む。
本発明の上の目的及び特徴は、添付の図面と関連させつつ好ましい態様の説明を参照することにより十分に明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
図１は、この発明によるＨＩＶ−１ ＰＲ類縁体の全化学合成の合成戦略を示すものであって、“Ａ”はＮ末端セグメントＨＩＶ−１ ＰＲ（１〜５０，Ｇｌｙ⁵¹ＳＨ）とＣ末端セグメントブロモアセチル（５３〜９９）ＨＩＶ−１ ＰＲのカップリングを図式的に表し、“Ｂ”はＮ末端セグメントＨＩＶ−１ ＰＲ（１〜５０，Ｃｙｓ⁵¹アミド）と同じＣ末端セグメントのカップリングを図式的に表す。
図２は、逆相ＨＰＬＣ（呼吸２１４ｎｍ）を用いる、この発明の実施によりＨＩＶ−１ ＰＲ（１〜５０，Ｇｌｙ⁵¹ＳＨ）とブロモアセチル（５３〜９９）ＨＩＶ−１ ＰＲを含有する連結混合液からｔ＝０、４５分、３時間、及び４８時間で採取したアリコートの溶離プロフィールを示す。
図３Ａは、精製（〔ＮＨＣＨ₂ＣＯＳＣＨ₂ＣＯ〕^51-52Ａｂａ^67,95）ＨＩＶ−１ ＰＲのイオンスプレー式マススペクトルを示す。明示したピークは過剰プロトンの数が相違する単一分子種を表す。
図３Ｂは、精製（〔ＮＨＣＨ₂ＣＯＳＣＨ₂ＣＯ〕^51-52Ａｂａ^62,95）ＨＩＶ−１ ＰＲの非回旋式（deconvoluted）マススペクトルを示す。この酵素の分子量のピークは１０，７６７ダルトンにある。
図４は、ＨＩＶ−１ ＰＲ（１〜５０，Ｃｙｓアミド）とブロモアセチル（５３〜９９）ＨＩＶ−１ ＰＲを含有する連結混合液からｔ＝０、３０分、及び１２０分で採取したアリコートの溶離プロフィールを示す。
図５は、２１４ｎｍで吸光度を追跡する逆相ＨＰＬＣを用いる、図２に示したｔ＝３時間に採取した連結混合液でのヘキサペプチドＡｃ−Ｔｈｒ−Ｉｌｅ−Ｎｌｅ−Ｎｌｅ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ；ＮＨ₂の処理前及び処理後の溶離プロフィールを示す。それぞれ、上方のパネルは処理前のピークを示し、下方のパネルは処理後のピークを示す。
図６は、図２に示した時間に採取した連結混合液のアリコートの蛍光原性（fluorogenic）アッセイを示す。蛍光単位を示すデータポイントは連続チャートレコーダー軌跡から読み取った。
好ましい態様の説明
この発明は、収束型合成によるタンパク質の如き大きな生体分子の合成への概念的に新規なアプローチに基づいている。かくして、修飾タンパク質の合成に応用する場合、この発明は、少なくとも２つのペプチドセグメントをカップリングして、非アミド結合であってもよい結合を作ることを包含する。これらペプチドセグメントは、固相ペプチド合成法、液相合成法を用いて、又はこれら方法の組み合わせを含む当該技術分野で知られている他の方法によって合成してもよい。
本発明は以下の工程を包含する：
ａ．少なくとも１つの非コード化構造単位を有する第１セグメント、及びその末端位置に第１化学選択的シントンを供給し；
ｂ．少なくとも１つの非コード化構造単位を任意に含有する第２セグメント、及びその末端位置に第１セグメントの第１化学選択的シントンに相補的である第２化学選択的シントンを供給し；そして
ｃ．第１セグメントと第２セグメントとを連結し、それによって第１セグメントの第１シントンと第２セグメントの第２シントンに非ペプチド結合を形成させる。この際、第１セグメントと第２セグメントはそれぞれ、ペプチド、プソイドペプチド、又は非ペプチド線状分子から選ばれる。但し、両セグメントが同時に非ペプチド線状分子であることはない。
好ましくは、第１及び第２セグメントのいずれもが約２〜約１００のアミノ酸残基を有するペプチド又はプソイドペプチドである。より好ましくは、これらセグメントは約４０〜約６０のアミノ酸残基から構成される。
好ましくは、形成される非ペプチド結合は次の結合部分のうちの１つにより表される：
−ＣＨ₂−Ｓ−、−ＣＨ₂−Ｓｅ−、−ＣＯ−Ｓ−、−ＣＯ−Ｓｅ−、
−ＣＨ₂−ＮＨ−、又は−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ₂−。
本発明方法は、少なくとも２つの相違する非コード化構造単位をこれらセグメントに組み込むのを可能にし、並びに同じ非コード化構造単位を２つの部位において組み込むのを可能にする。
この発明により結合されてもよい修飾タンパク質の広くかつ多様なクラスから見て、上に定義した如き特徴を有する全ての化学修飾タンパク質は、この発明の範囲内であるとみなされる。しかしながら、明確に説明し理解を容易にする目的で、具体例として修飾ＨＩＶ−１プロテアーゼを用いて、ここにより詳細に説明する。説明の目的でこの特定の酵素を用いることは、他のタンパク質又はペプチドを用いることを制限もしないし限定もしないということが理解されるべきである。
ここで用いる場合、“修飾タンパク質”という用語は、オリゴペプチド、オリゴプソイドペプチド、ポリペプチド、プソイドポリペプチド、及び合成又は他の方法で誘導された修飾天然タンパク質を含むことを意図している。“プソイドポリペプチド”という用語は、１又は２以上のペプチド結合がエステルの如き非アミド結合によって置換されているか又は１又は２以上のアミノ酸がアミノ酸類縁体によって置換されているペプチドを意味する。“ペプチド”という用語は、全ての天然アミノ酸からなるもののみならず、非天然アミノ酸又は他の非コード化構造単位を含有するもののこともいう。“ペプチド”という用語は、単独で用いる場合は、プソイドポリペプチドも含む。“修飾タンパク質”は、in vivo分解に対する高い安定性、優れた薬物動態、及びそれらの天然同等物に比較して増進又は抑制された免疫原性の故に、多くの生物医学的適用に有用性を有している。
ＨＩＶ−１プロテアーゼ（ＨＩＶ−１ ＰＲ）は、高い特異性でポリペプチド鎖を切断し、活性ビリオンの複製に必須であるウィルスコード化酵素である（コール（N.E. Kohl）ら, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 85:4686, 1988）。２１，５００ダルトンＨＩＶ−１ ＰＲ分子は、２つの同一９９アミノ酸ポリペプチド鎖からできている。
未結合酵素（ブロダワー（A. Wlodawer）ら, Science, 245:616, 1989）と阻害物質結合酵素（例えば、ミラー（M. Miller）ら, Science, 246:1149, 1989）の結晶構造を比較して、基質由来阻害物質と結合するに際して、ＨＩＶ−１分子は、２つの外面の機能的に重要な“フラップ”領域内において特に著しい有意なコンフォメーション変化を受けることが明らかになった。これら結晶学的研究から、ＨＩＶ−１ ＰＲポリペプチド主鎖のフラップ領域内のペプチド結合が、βシート／βターン構造の形成、酵素阻害物質（基質）複合体内の各フラップの先端における活性二量体の２サブユニット間で起こる相互作用、及び結合したペプチド阻害物質（及びおそらくは基質）との相互作用に関与していることは明らかである。組換えＨＩＶ−１ ＰＲで行った突然変異誘発検討により、このフラップ領域がアミノ酸配列の変化に対して非常に敏感であることが示された（ローブ（D.D. Loeb）ら, Nature, 340:397, 1989）。
これら観察結果は、ＨＩＶ−１プロテアーゼ活性におけるペプチド結合相互作用の役割を調べるためのタンパク質主鎖修飾の標的としてこのフラップ領域を特に興味深いものにしている。
フラップ領域の修飾が望まれるＨＩＶ−１ ＰＲの場合、この発明によりプソイドポリペプチド結合をこの領域内に導入できる。ＨＩＶ−１ ＰＲのＧｌｙ⁵¹−Ｇｌｙ⁵²結合は、２つの理由で結合操作に特に好ましい。第１に、グリシンは唯一のアキラルなアミノ酸であるので、光学純度の損失についての懸念がない。第２に、このＧｌｙ⁵¹−Ｇｌｙ⁵²結合は、９９アミノ酸ＨＩＶ−１ ＰＲ単量体ポリペプチド鎖の中間近傍に位置している。これは、カップリングすべき２つのペプチドセグメントがそれぞれ約５０残基の長さであることを意味している。
固相ペプチド合成法は、次の文献に概略的に記載されている：メリフィールド(Merrifield), J. Am. Chem. Soc., 888:2149, 1963；バラニー（Barany）及びメリフィールド, In the Peptides, グロス（E. Gross）及びマイネンホファー（Meinenhofer）編, Academic Press, New York, 3:285 (1980)；ケント(S.B.H. Kent), Annu. Rev. biochem., 57:957 (1988)。固相ペプチド合成法により、固体樹脂粒子に共有結合した生長ペプチド鎖へのアミノ酸の段階的付加によって、目的の長さ及び配列のペプチドを作ることができる。この方法では自動合成法を用いることができる。
従って、これら態様を以下の工程により行うことができる：
１．樹脂支持体に結合した末端アミノ酸にアミノ酸を順次カップリングさせて、ペプチドセグメント−樹脂を形成し；そして
２．この樹脂支持体からペプチドセグメントを切り離す。
この方法の好ましい適用においては、生長ペプチド鎖のＣ末端を−ＯＣＨ₂ ＰＡＭ樹脂に共有結合させて、保護されたα−アミノ基を有するアミノ酸を上に示した段階的やり方で付加する。好ましいα−アミノ保護基は、tert−ブチルオキシカルボニル（ＢＯＣ）基である。これは、この縮合条件に対して安定でありなおかつペプチド結合の破壊もペプチド鎖のキラル中心のラセミ化もなく容易に除去可能である。この操作が終わりと、生成ペプチドを樹脂から切り離し、あらゆる残存する保護基を、例えば、臭化水素酸とトリフルオロ酢酸の混合物、トリフルオロメタンスルホン酸又は液化フッ化水素の如き酸性条件化での処理によって除去する。
ＨＩＶ−１プロテアーゼの場合、Ｃ末端セグメントは次のアミノ酸配列を含む：Ｆ⁵³ＩＫＶＲＱＹＤ⁶⁰ＱＩＰＶＥＩＣＧＨＫ⁷⁰ＡＩＧＴＶＬＶＧＰＴ⁸⁰ＰＶＮＩＩＧＲＮＬＬ⁹⁰ＴＱＩＧＣＴＬＮＦ⁹⁰。Ｎ末端セグメントは次のアミノ酸配列を含む：Ｐ¹ＱＩＴＬＷＱＲＰＬ¹⁰ＶＴＩＲＩＧＧＱＬＫ²⁰ＥＡＬＬＤＴＧＡＤＤ³⁰ＴＶＬＥＥＭＮＬＰＧ⁴²ＫＷＫＰＫＭＩＧＧＩ⁵⁰Ｇ⁵¹。これらセグメントの合成は、普通、標準的サイクルスピードで約１５時間を要する。
所望により、上の配列のいずれかのアミノ酸を当該技術分野で知られているアミノ酸類縁体又はアミノ酸擬似化合物により置き換えてもよい。適するアミノ酸置換体には、β−アラニン、Ｌ−α−アミノイソ酪酸、Ｌ−α−アミノ−ｎ−酪酸（Ａｂａ）、３，４−デヒドロプロリン、ホモアルギニン、ホモシステイン、ホモプロリン、ホモセリン、３−メルカプトプロピオン酸、ノルロイシン（Ｎｌｅ）、ペニシラミン、ピログルタミン酸及びサルコシンが含まれる。
この発明には、Ｌ−アミノ酸及びＤ−アミノ酸を用いてもよく、特に、Ｄ−アミノ酸が“反転ペプチド配列”の形成に有用である。
上で述べた“反転”又は“逆”ペプチド配列は、アミノ酸主鎖内でのペプチド結合形成の正常なカルボキシル→アミノ方向が、慣用的な左→右方向に読み取ると、ペプチド結合のアミノ部分がカルボニル部分に（後行するというよりむしろ）先行するというふうに逆転した共有結合アミノ酸残基（又はその類縁体又は擬似体）の全体配列の一部のことをいう（概略的には、グッドマン（Goodman, M）及びコレフ(M. Chorev), Accounts of Chem. Res., 12:423, 1979を参照のこと）。
この“反転”ペプチドは、本明細書全体を通して用いられる“ペプチド”の意味の範囲内のものである。ここでは、Ｄ−アミノ酸、アミノ酸類縁体及びアミノ酸擬似化合物を総称して“非コード化アミノ酸”という。固相ペプチド合成法は理論的には当業者があらゆる長さのペプチド主鎖を調製するのを可能にするが、合成されるペプチドが１５０残基より大きい場合は、アミノ酸のカップリング（連続サイクルでのアミノ酸の付加）効率によりこの方法の使用が必然的に限定されるであろう。好ましくは、実用的及び経済的理由で、この発明の方法は約２〜約１００サイクルを用いる。
従って、この発明の方法により得られる修飾タンパク質は、式（１）に示される一般的構造を有し、Ｒ及びＲ'は先に定義した通りである。より大きなペプチドセグメント（１００アミノ酸より多く含有する）が望まれる場合には、かかるペプチドセグメントは酵素的又は化学的分解によって天然に存在するタンパク質（天然タンパク質）から得ることができる。また、そのような大きなペプチドセグメントを作り上げるには異なる連結様式で本発明方法を繰り返すことができる。
この発明の重要な特徴は、２つのペプチドセグメント（即ち、ＲとＲ'）を繋ぐ結合形成である。種々の結合形成反応を用いてこれら２つのペプチドセグメントを共有結合させることができる。かかるグループの代表的組み合わせは、２つのセグメントの間にチオールエステル結合を形成するカルボニルチオールとハロ、セレノエステルを形成するカルボニルセレノールとメロ、又はジスルフィド結合を形成するチオールとチオール、チオエーテル結合を形成するチオールとハロ、セレノールエーテルを形成するセレノールとハロ、チオ尿素結合を形成するアミノとイソチオシアネート、炭素−窒素結合に還元し得るイミン結合を形成するアミノとアルデヒド、チオエーテル結合を形成するチオールとマレイミド、及び酸素−ホウ素結合を形成するgem−ジオールとホウ素、及びエステル結合を形成するヒドロキシルとカルボキシルである。これらのうち、好ましい結合は、それらの構造によって既に列挙したものである。好ましい結合は、in vivoで簡単には加水分解しないか又はin vivoでアミノ酸よりも不安定な硫黄含有結合又はセレン含有結合である。
最も好ましい結合Ｌは、チオールエステル結合である。この結合は、まず容易に脱離する脱離基を第１ペプチドセグメントに付け、第２ペプチドセグメントにカルボニルチオール官能基を付けた後、硫黄求核体がその脱離基を攻撃する求核置換反応を行うことにより形成することができる。好ましくは、ヨード、クロロ、又はブロモアセチルの如きハロアシル（例えば、ハロアセチル）を第１ペプチドセグメントのＮ末端に付ける。適するハロアシル基は直鎖状であっても分枝状（アルキルにより置換されたもの）であってもよい。この工程は、第１ペプチドセグメントを樹脂支持体に結合させたままでも問題なく行われる。
第１ペプチドセグメントにブロモアセチル基を導入するのに、この発明ではブロム酢酸の好適な活性型を用いてもよい。この目的のために特に好ましい物質は無水ブロム酢酸である。
前述のＨＩＶ−１ ＰＲのＣ末端セグメントをＮ−ブロモアセチル化剤で誘導体にすると、樹脂で保護されたペプチドセグメントの未保護Ｎ末端が無水ブロム酢酸と縮合してブロモアセチル（５３〜９９）ＨＩＶ−１ ＰＲが生成する。樹脂支持体からの生成ペプチドセグメントの脱保護及び解放は、標準条件（例えば、１０％ｐ−クレゾールを含有する無水ＨＦで０℃で数時間処理）により行うことができる。この生成ペプチドセグメントを、当該技術分野で既知の標準的方法に従って沈殿させ、凍結乾燥により乾燥し、そして所望により逆相ＨＰＬＣにより精製する。
第２ペプチドセグメントにカルボニルチオール官能基を導入するのに、その末端カルボン酸部分をカルボニルチオール基に転化してもよい。
前述のＨＩＶ−１ ＰＲのＮ末端セグメントをそのような誘導体にする場合、４−〔α−（Ｂｏｃ−Ｇｌｙ−Ｓ）ベンジル〕フェノキシアセトアミドメチル−樹脂を樹脂支持体として用いる。グリシン以外のアミノ酸又はアミノ酸類縁体が望ましいなら、そのアミノ酸を４−〔α−（Ｂｏｃ−Ｘ−Ｓ）ベンジル〕フェノキシ酢酸（式中、Ｘはそのアミノ酸を表す。）の形でアミノメチル−樹脂上に載せてもよい。
こうして、Ｎ末端誘導ペプチドセグメントは、段階的固相合成法により容易に調製することができる。第２生成ペプチドセグメントは、上記の方法で樹脂支持体から切り離し、脱保護し、そして単離する。
チオールエステル結合は、普通の連結条件下でこれら２つのセグメントをカップリングすることによって生成させることができる。チオールエステル結合の形成は高度に化学選択的であるので、分子内に存在し得る殆どの反応性基と両立できる。
典型的な連結反応は、未保護Ｎ及びＣ末端セグメントを約ｐＨ３〜６で６Ｍ塩酸グアニジン緩衝液中で混合することによって行われる。この緩衝液中では未保護ペプチドセグメントの溶解性が非常に高いので、連結媒質中での溶解性が限られているにも拘らず保護ペプチドセグメントを用いなければならないという先行技術の主要な欠点は取り除かれる。尿素、洗浄剤、及びドデシル硫酸ナトリウムの如き他の変性物質を連結緩衝剤として用いてもよい。
ＨＩＶ−１ ＰＲ（１〜５０，Ｇｌｙ−ＳＨ）とブロモアセチル（５３〜９９）ＨＩＶ−１ ＰＲとのカップリングは数時間で完結する。生成ペプチド〔（ＮＨＣＨ₂ＣＯＳＣＨ₂ＣＯ）^51-52〕ＨＩＶ−１ ＰＲは、標準法によって単離し、精製し、そして特徴を明らかにすることができる。
これらペプチドセグメントのうち１つがチオールエステル形成を妨害し得る何らかの反応性基を有する場合は、それら基を当該技術分野で知られている適当な保護基で保護するか、又はそのような基を有するアミノ酸を、反応不活性でありなおかつ生成タンパク質の生物活性に逆に影響しない他のアミノ酸又はアミノ酸類縁体により置き換えてもよい。
例えば、実施例において、ＨＩＶ−１ ＰＲのＣ末端セグメントは位置６７と９５に２つのシステイン残基を有する。これらシステイン位は、天然プロテアーゼの酵素活性を損なうことなくＬ−α−アミノ−ｎ−酪酸（Ａｂａ）により置換できることが分かっている。この発明の１態様においては、ブロモアセチル〔（５３〜９９）Ａｂａ^67,95〕ＨＩＶ−１ ＰＲを用いる。一方、カップリング反応前にシステイン残基のチオール基を保護するには、連結条件に適合する保護基を用いるのが好ましい。しかしながら、現在の経験では、Ｎ末端セグメントのチオールエステル基は、システイン残基のチオール側鎖が非反応性である低ｐＨ条件でもブロモアセチル基を攻撃するので、これら用心は必要ではないかも知れない。
本発明の他の態様においては、結合Ｌはチオエーテル結合であってもよい。この結合は、チオール官能基を第２ペプチドセグメントに付けることを除いては、チオールエステル結合の形成について説明したのと実質的に同じ方法で形成することができる。これは、システイン残基のチオール側鎖を用いることによって問題なく行われる。かくして、システインを第２ペプチドセグメント（Ｎ末端セグメント）のＣ末端アミノ酸として用いることができる。ここに記載するＨＩＶ−１ ＰＲ（１〜５０，Ｃｙｓ⁵¹アミド）は、システインのカルボン酸がアミドとして保護されたかかる誘導第２ペプチドセグメントの一例に相当する。このペプチドセグメントをブロモアセチル（５３〜９９）ＨＩＶ−１ ＰＲの存在下で先に記載した連結条件に付すると、これら２つのペプチドセグメントのカップリングが速やかに起こって｛〔ＮＨＣＨ（ＣＯＮＨ₂）ＣＨ₂ＳＣＨ₂ＣＯ〕^51-52｝ＨＩＶ−１ ＰＲが得られる。この連結された生成タンパク質は、標準的方法により単離し、精製し、そして特徴を明らかにすることができる。本発明の更なる態様においては、この結合は、セレノールエステル及びセレノエーテルの如きセレン含有結合であってもよい。同じような方法で、セレノシステインをシステインの代わりに用いることができる。
この発明の方法は、あらゆる生体分子の合成に応用可能であって、２つの構成成分フラグメントが化学合成法又は他の生合成法により得られる限り、タンパク質に限定されない。特に、本方法は：(１)修飾タンパク質の速やかな合成を可能にする；(２)少なくとも最も重要な結合形成段階において保護基の併用を回避する：そして(３)タンパク質主鎖中にＤ−アミノ酸及びアミノ酸類縁体の如き構造単位を取り入れる。
以下に、前述の態様によってこの発明を更に詳細に説明するが、これら態様は本発明の範囲を限定するものと解されるべきではない。
実施例１
〔（ＮＨＣＨ ₂ ＣＯＳＣＨ ₂ ＣＯ） ^51-52 Ａｂａ ^67,95 〕ＨＩＶ−１ ＰＲの合成
２つのペプチドセグメント、つまりＨＩＶ−１ ＰＲ（１〜５０，Ｇｌｙ⁵¹ＳＨ）（調製例１）とブロモアセチル（５３〜９９）ＨＩＶ−１ ＰＲ（調製例２）とを６Ｍ塩酸グアニジン０．１Ｍリン酸ナトリウム中、ｐＨ４．３でこれらセグメントを連結することによってカップリングした。これらセグメントを連結緩衝液中に２０ｍｇ／ｍｌの濃度で別々に溶解した。
連結の過程は、緩衝液Ａ（０．１％トリフルオロ酢酸）中における３０〜６０％緩衝液Ｂ（９０％アセトニトリル／０．０９％トリフルオロ酢酸）の一次勾配を用いるバイダック（Vydac）Ｃ₁₈カラムでの３０分間の逆相ＨＰＬＣにより追跡した。流速は１ｍｌ／分で、吸光度は２１４ｎｍで追跡した。結果を図２に示す。
生成した連結ペプチドを、０．１％ＴＦＡ水溶液中における９０％アセトニトリル／０．０９％ＴＦＡの種々の一次勾配を用いる半分取バイダックＣ₁₈カラムでの逆相ＨＰＬＣにより精製した。生成ペプチドの純度は、分析用ＨＰＬＣ並びにイオンスプレー式質量分析法によってチェックした。この生成ペプチドは、１０，７６８．６±１．１Ｄａ（モノアイソトープ体についての計算値；１０，７６３．９Ｄａ；（平均）１０，７７０．８Ｄａ）の予想分子量を有した。表題のペプチドのマススペクトルを図３Ａ及び３Ｂに示す。
実施例２
〔（ＮＨＣＨ（ＣＯＮＨ ₂ ）ＣＨ ₂ ＳＣＨ ₂ ＣＯ〕 ^51-52 Ａｂａ ^67,95 ）ＨＩＶ−１ ＰＲの合成
２つのペプチドセグメント、つまりＨＩＶ−１ ＰＲ（１〜５０，Ｇｌｙ⁵¹アミド）（調製例１）とブロモアセチル（５３〜９９）ＨＩＶ−１ ＰＲ（調製例３）とを、ｐＨが７．０を上回ったことを除いては実質的に実施例１の操作に従ってカップリングした。連結反応をＨＰＬＣで追跡した。結果を図３に示す。反応を終えて精製した後、生成ペプチドは、１０，８００．３１±０．７５Ｄａ（モノアイソトープ体についての計算値；１０，７９２．９Ｄａ；（平均）１０，７９９．８Ｄａ）の予想分子量を有した。
実施例３
〔ＮＨＣＨ ₂ ＣＯＳＣＨ ₂ ＣＯ） ^51-52 Ａｂａ ^67,95 〕ＨＩＶ−１ ＰＲの酵素活性
３時間連結後の連結反応混合液（実施例１）のアリコートを、Ａｃ−Ｔｈｒ−Ｉｌｅ−Ｎｌｅ−Ｎｌｅ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ．ＮＨ₂（Ｎｌｅ：Ｌ−ノルロイシン）の配列を有するペプチド基質（１ｍｇ／ｍｌ）でｐＨ６．５で処理した。バイダックＣ₁₈カラムを用いる逆相ＨＰＬＣにより反応を追跡した。結果を図５に示す。図５において、上方のパネルは処理前のペプチド基質ピークを示す。下方のパネルは１５分処理後の開裂生成物のピークを示す。
この開裂生成物を逆相ＨＰＬＣ（バイダックＣ₁₈カラム；緩衝液Ａ（０．１％トリフルオロ酢酸）中０〜４０％緩衝液Ｂ（９０％アセトニトリル／０．０９％トリフルオロ酢酸）の一次勾配で２０分間；流速，１ｍｌ／分；２１４ｎｍで吸光度追跡）により分離した。これらペプチド生成物は、イオンスプレー式質量分析法により（Ｈ）−Ｎｌｅ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ．ＮＨ₂（早い溶出物）及びＡｃ−Ｔｈｒ−Ｉｌｅ−Ｎｌｅ−（ＯＨ）（遅い溶出物）と同定された。
かくして、表題のペプチドは、このアッセイで用いた基質ペプチドに対して天然酵素ＨＩＶ−１ ＰＲと実質的に同じ特異性を示す。
更に、連結反応混合液のアリコートを、１００ｍＭ ＭＥＳ緩衝液中に蛍光原性基質を含有する溶液でｐＨ６．５で処理した。用いた蛍光原性基質は、２−アミノベンゾイル−Ｔｈｒ−Ｉｌｅ−Ｎｌｅ−Ｐｈｅ（ｐ−ＮＯ₂）−Ｇｌｎ−Ａｒｇ．−ＮＨ₂であった。インキュベーション時間に対して蛍光を記録した。図６Ｂに示したデータポイントは、連続チャートレコーダー軌跡から読み取った。（〔ＮＨＣＨ₂ＣＯＳＣＨ₂ＣＯ〕^51-52Ａｂａ^67,95）ＨＩＶ−１ ＰＲと等量の〔Ａｂａ^{67,95,167,195}〕ＨＩＶ−１ ＰＲとの量的比較により、活性が同一であることが示された。セグメント単独、即ち、ＨＩＶ−１ ＰＲ（１〜５０，Ｇｌｙ⁵¹ＳＨ）もブロモアセチル（５３〜９９；Ａｂａ^67,95）ＨＩＶ−１ ＰＲも、如何なる活性も示さなかった（検出限界，＜１／１，０００）。
調製例１
ＨＩＶ−１ ＰＲ（１〜５０，Ｃｙｓ ⁵¹ アミド）
表題のペプチドの合成をアプライド・バイオシステム４３０Ａペプチド合成装置で行った。送出ラインフィルターを上部及び下部反応器バルブブロックに移動し、送出ライン内のフィルターをカートリッジニードルに移動することによって、この装置に手を加えた。大きなチュービング（内径１．２ｍｍ）をＤＭＦレザバーから下部反応器バルブブロックにかけて用いた。直接移送ラインをアクティベーター（カートリッジ）バルブブロックから反応器バルブブロックにかけて用いた（即ち、コンセントレーターバルブブロックにバイパスを付けて、活性化アミノ酸溶液をカートリッジから反応器に直接移送できるようにした）。試薬位置２及び３をＴＦＡの共通レザバーとして働くように接続し、９００ｍｌの容量（４０＋サイクル）にした。ＴＦＡ送出用のＡレギュレーター圧を１８ｍｌ／分の送出速度になるように５ｐｓｉ（０．３５ｋｇ／ｃｍ²）に２倍にした。漏れを防止するためにＴＦＡボトル用のポリプロピレンボトルシールをビトン（Viton）ガスケットに換えた。試薬位置７（カートリッジへの送出用ＤＩＥＡ）用の計量ループを０．７２ｇ（５．６０mmol）ＤＩＥＡを送出する長さにカットした。試薬位置８（ＤＭＦ中０．４８Ｍ ＨＢＴＵ）用の計量ループを２．２２ｍｌを送出する長さにカットした。試薬位置１はＤＩＥＡであり、ＤＩＥＡを樹脂サンプラーを経由してフラクションコレクターに送出するためだけに用いた。試薬位置９はＤＣＭであり、再使用のため乾燥する前にカートリッジからの残留ＤＭＦを洗浄するために用いた。試薬位置１０はＤＭＦである。試薬位置４、５、及び６は使用しなかった。全ての合成について、注文設計した２０ｍｌ反応器を用いた。
４３０Ａで使用するための合成サイクルを全く無から書き込んだ。開始サイクルは、トグル機能をセットして出発樹脂をＤＭＦで洗浄しただけだった。最終サイクルは、生成ペプチド−樹脂をＤＭＦで２回洗浄してから、ＤＣＭで洗浄して窒素気流下でこのペプチド−樹脂を乾燥した。アクティベータープログラム（即ち、カートリッジ内の事柄）が反応器プログラムとコーディネートされるように、特殊機能をコンセントレーターとアクティベーターのために書き込んだ。これらコーディネート機能は、レイド（Reid）とシンプソン（Simpson）により記載された特殊機能及び早期急速二重カップルサイクル（earlier rapid double couple cycles）において用いられた機能（“Peptides: Chemistry and Biology”, Procc. 10th Amer. Peptide Syn.におけるケント（Kent）らの報文）に原則的に類似していた。アクティベータープログラム中の特殊機能をカートリッジへの送出試薬８（０．４８Ｍ ＨＢＴＵ）にも書き込んだ。用いた合成手順は次の通りである：

最初のＴＦＡ処理は、２×３０秒で各上向き渦巻き流し洗浄、それに続くガスの短時間パルスからなるものであった。１分間のバッチ処理後、ＤＭＦでの１分間上向き渦巻き流し洗浄により反応器からＴＦＡを除去した。このＤＭＦ流し洗浄の最中に、樹脂サンプラースイッチングバルブからのラインをＤＭＦで反応器内に洗い流した。活性化Ｂｏｃ−アミノ酸の希釈を最小にするために、カップリング工程前に窒素圧下で濾過することによりペプチド−樹脂を液切りした。活性化Ｂｏｃ−アミノ酸溶液は移送時０．２５Ｍであった。膨張したペプチド−樹脂内の保持ＤＭＦが反応器内で約０．１５〜０．２Ｍに濃度を低下させた。短時間でＤＭＦラインを洗浄して（各０．３ｍｌ）、カートリッジニードルへのＨＢＴＵ溶液送出後及びこのカートリッジへのＤＩＥＡ添加後の送出ラインを清浄にした。アクティベーターバルブブロックから反応器への移送ラインも、活性化Ｂｏｃ−アミノ酸溶液の移送前及び移送後にＤＭＦで洗浄した。ペプチド−樹脂サンプル（５〜７ｍｇ）をＤＭＦ中に取り、分析までＤＩＥＡ／ＤＭＦ中に貯蔵した。乾燥及び定量的ニンヒドリン分析前にサンプルをＤＣＭ−ＭｅＯＨ（１：１ｖ／ｖ）で徹底的に洗浄した。１アミノ酸残基の付加のためのサイクル全体の時間は、１６分３０秒＋移送時間（カートリッジから反応器へ：洗浄時間２分を含む）＋４３０Ａのソフトウェアーの作動により生じる各サイクルの開始時における４５秒の人為的不動時間であった。全サイクル時間は１９分１５秒（１日当たり約７５残基）であった。
次の鎖保護基を用いた：Ｄ及びＥ，シクロヘキシル；Ｎ，キサンチル；Ｑ及びＭ，未保護；Ｋ，２−クロロベンジルオキシカルボニル（２ＣｌＺ）；Ｒ，トシル；Ｙ，ブロモベンジルオキシカルボニル（ＢｒＺ）；Ｈ，２，４−ジニトロフェニル（ＤＮＰ）；Ｔ，ベンジル。Ｗ（Ｔｒｐ）を保護するのにホルミル基を用いた。１０％ｐ−クレゾールの存在下、ＨＦで０℃で１時間処理することによってペプチドを樹脂から切り離した。Ｎα−Ｂｏｃ基はＨＦ処理前に切り離した。上の操作では、４−ＭｅＢＨＡ−樹脂（４−メチルベンジルヒドリルアミン）を樹脂支持体として用いた。
生成したペプチドをエーテルで沈殿させて最終的に５０％酢酸に溶解させ、水で希釈して凍結乾燥した。かくして、２１６ｍｇの樹脂で出発して１．３６ｇのペプチド樹脂が生成した。このペプチド樹脂３８５ｍｇから表題のペプチド（１８１ｍｇ）が得られた。
このペプチドを、０．１％ＴＦＡ水溶液中における９０％アセトニトリル／０．０９％ＴＦＡの種々の一次勾配を用いる半分取バイダックＣ₁₈カラムでの逆相ＨＰＬＣにより精製した。この純度は、分析用ＨＰＬＣ並びにイオンスプレー式質量分析法によってチェックした。
調製例２
ブロモアセチル〔（５３〜９９）Ａｂａ ^67,95 〕ＨＩＶ−１ ＰＲ
調製例１に記載した固相タンパク質合成操作を用いることによって、表題のペプチドを調製した。Ｂｏｃ Ｐｈｅ （ＯＣＨ₂）−フェニルアセトアミドメチル−樹脂（ＰＡＭ樹脂）を樹脂支持体として用いた。かくして、２１４ｍｇの樹脂で出発し段階的仕上げ（４６サイクル）を通してペプチド−樹脂が得られた。ＤＮＰ及びＮα−Ｂｏｃ基は、ブロモアセチル化前に切り離した。保護ペプチド（Ｐｈｅ⁵³−Ｐｈｅ⁹⁹）は、ロベイ（F.A. Robey）ら, Anal. Biochem., 177:373（1989）に従う条件を用いてブロモアセチル化した。
５２５ｍｇ保護ペプチド−樹脂に、２ｍｌＤＣＭ／ＤＭＦ（１：１ｖ／ｖ）中の０．４mmol無水ブロモ酢酸を添加した。２５℃で３０分間震盪しながら反応を進行させた後、フリーアミンの消失からして反応が完結したようであった。樹脂を濾過し、ＤＭＦで洗浄してからＤＣＭ／Ｔ６０Ｗ（５０：５０ｖ／ｖ）で洗浄し減圧乾燥した。１０％ｐ−クレゾールの存在下、ＭＦで０℃で１時間処理することによってペプチドを樹脂から切り離した。生成したペプチドをエーテルで沈殿させて最終的に５０％酢酸に溶解させ、水で希釈し凍結乾燥して２５９ｍｇの表題のペプチドが得られた。
このペプチドを、０．１％ＴＦＡ水溶液中の９０％アセトニトリル／０．０９％ＴＦＡの種々の一次勾配を用いる半分取バイダックＣ₁₈カラムでの逆相ＨＰＬＣにより精製した。純度は、分析用ＨＰＬＣ並びにイオンスプレー式質量分析法によってチェックした。精製サンプルは、５２３５．８±０．２ダルトンの分子量〔モノアイソトープ体についての計算値；５２３１．８ダルトン；（平均）５２３６．０ダルトン〕を有した。
調製例３
ＨＩＶ−１ ＰＲ（１〜５０，Ｇｌｙ ⁵¹ ＳＨ）
調製例１に記載した固相タンパク質合成操作を用いることによって、表題のペプチドを調製した。４−〔α（Ｂｏｃ−Ｇｌｙ−Ｓ）ベンジル〕フェノキシアセトアミドメチル−樹脂をヤマシロら, Int. J. Peptide Protein Res., 31:322,（1988）に記載されたようにして調製し、樹脂支持体として用いた。３５９ｍｇの４−〔α（Ｂｏｃ−Ｇｌｙ−Ｓ）ベンジル〕フェノキシアセトアミドメチル−樹脂で出発し保護ペプチド鎖の段階的仕上げ（５０サイクル）を通して、１．１ｇのペプチド−樹脂が得られた。この合成では、Ｇｌｎ、Ｔｒｐ及びＭｅｔは保護しなかった。生成したペプチドをエーテルで沈殿させて最終的に５０％酢酸に溶解させ、水で希釈し凍結乾燥した。このペプチドを、０．１％ＴＦＡ水溶液中の９０％アセトニトリル／０．０９％ＴＦＡの種々の一次勾配を用いる半分取バイダックＣ₁₈カラムでの逆相ＨＰＬＣにより精製した。この純度は、分析用ＨＰＬＣ並びにイオンスプレー式質量分析法によってチェックした。
これまで本発明を十分に説明してきたが、本発明の精神及び範囲から逸れることなく、多くの変更及び修飾をなし得ることが当業者に理解できるであろう。

Claims (38)

1. 以下の工程；
   ａ．アミノ酸又はアミノ酸類縁体を、第１樹脂支持体に結合した末端アミノ酸又はアミノ酸類縁体に順次カップリングさせて、約２〜約１００アミノ酸残基を含む第１ペプチドセグメント−樹脂を形成する工程；
   ｂ．ハロアシル部分をこのペプチドセグメント−樹脂のＮ末端に共有結合で結合させて、第１樹脂支持体に結合したハロアシルペプチドセグメントを形成する工程；
   ｃ．このハロアシルペプチドセグメントを第１樹脂支持体から切り離して、前記ペプチドのＮ−末端にハロアシル部分を有するハロアシルペプチドセグメントを形成する工程；
   ｄ．アミノ酸又はアミノ酸類縁体を、硫黄又はセレン含有結合を介して第２樹脂支持体に結合したＣ−末端システインアミド又はシステインアミドのＣ−末端Ｓ−Ｈ又はＳｅ−Ｈ含有類縁体に順次カップリングさせて、約２〜約１００アミノ酸残基を含む第２ペプチドセグメント−樹脂を形成する工程；
   ｅ．第２ペプチドセグメント−樹脂を、硫黄又はセレン含有結合の位置で、開裂させて、Ｃ−末端において、システインアミド又はシステインアミド結合のＳ−Ｈ又はＳｅ−Ｈ含有類縁体を有する第２ペプチドセグメントを形成する工程；及び
   ｆ．ハロアシルペプチドセグメントのＮ−末端ハロアシル部分を、前記第２ペプチドセグメントのＣ−末端システインアミド又はシステインアミドのＣ−末端Ｓ−Ｈ又はＳｅ−Ｈ含有類縁体とカップリングさせる工程；
   を含むことを特徴とする修飾タンパク質の製造方法。
2. ハロアシルがブロモアセチルである、請求項１に記載の方法。
3. ブロモアセチルペプチドセグメントがブロモアセチル（５３〜９９）ＨＩＶ−１ ＰＲである、請求項２に記載の方法。
4. ブロモアセチルペプチドセグメントがブロモアセチル〔（５３〜９９）Ａｂａ^67,95〕ＨＩＶ−１ ＰＲである、請求項２に記載の方法。
5. 第２ペプチドセグメントがＨＩＶ−１ ＰＲ（１〜５０，Ｇｌｙ⁵¹ アミド）で
   ある、請求項１に記載の方法。
6. 前記第１樹脂支持体がＣＯＣＨ₂−ＰＡＭ樹脂である、請求項１に記載の方法。
7. 前記第２樹脂支持体が４−ＭｅＢＨＡ樹脂（４−メチルベンジルヒドリルアミン）である、請求項１に記載の方法。
8. ハロアシルペプチドセグメントが保護されていない、請求項１に記載の方法。
9. 第２ペプチドセグメントが保護されていない、請求項１に記載の方法。
10. 修飾タンパク質が−ＮＨ−ＣＨ（ＣＯ−ＮＨ₂）−ＣＨ₂−Ｓ−ＣＨ₂−ＣＯ−の
    結合を有する、請求項１に記載の方法。
11. 修飾タンパク質が｛〔ＮＨＣＨ（ＣＯＮＨ₂）ＣＨ₂ＳＣＨ₂ＣＯ〕^51-52Ａｂａ^67,95｝ＨＩＶ−１ ＰＲである、請求項10に記載の方法。
12. 以下の工程；
    ａ．アミノ酸又はアミノ酸類縁体を、第１樹脂支持体に結合した末端アミノ酸又はアミノ酸類縁体に順次カップリングさせて、約２〜約１００アミノ酸残基を含む第１ペプチドセグメント−樹脂を形成する工程；
    ｂ．ハロアシル部分を該ペプチドセグメント−樹脂のＮ末端に共有結合で結合させて、第１樹脂支持体に結合したハロアシルペプチドセグメントを形成する工程；
    ｃ．該ハロアシルペプチドセグメントを第１樹脂支持体から切り離して、前記ペプチドのＮ−末端にハロアシル部分を有するハロアシルペプチドセグメントを形成する工程；
    ｄ．アミノ酸又はアミノ酸類縁体を、硫黄又はセレン含有結合を介して第２樹脂支持体に結合した非システインＣ−末端アミノ酸又は非システインアミノ酸類縁体に順次カップリングさせて、約２〜約１００アミノ酸残基を含む第２ペプチドセグメント−樹脂を形成する工程；
    ｅ．前記第２ペプチドセグメント−樹脂を開裂させて、Ｃ−末端において、カルボニルチオール含有又はカルボニルセレノール含有基を有する第２ペプチドセグメントを形成する工程；及び
    ｆ．前記ハロアシルペプチドセグメントのＮ−末端ハロアシル部分を、前記第２ペプチドセグメントのＣ−末端カルボニルチオール含有基又はＣ−末端カルボニルセレノール含有基とカップリングさせて、チオエステル又はセレノエステル結合を有する修飾タンパク質を形成する工程；
    を含むことを特徴とする修飾タンパク質の製造方法。
13. ハロアシルがブロモアシルである、請求項12に記載の方法。
14. ブロモアセチルペプチドセグメントがブロモアセチル（５３〜９９）ＨＩＶ−１ ＰＲである、請求項13に記載の方法。
15. ブロモアセチルペプチドセグメントがブロモアセチル〔（５３〜９９）Ａｂａ^67,95〕ＨＩＶ−１ ＰＲである、請求項13に記載の方法。
16. 第２ペプチドセグメントがＨＩＶ−１ ＰＲ（１〜５０，Ｇｌｙ⁵¹ＳＨ）である、請求項12に記載の方法。
17. 前記第１樹脂支持体がＣＯＣＨ₂−ＰＡＭ樹脂である、請求項12に記載の方法。
18. 前記第２樹脂支持体が４−〔α（Ｂｏｃ−アミノ酸−Ｓ）ベンジル〕フェノキシアセトアミドメチル樹脂である、請求項12に記載の方法。
19. ハロアシルペプチドセグメントが保護されていない、請求項12に記載の方法。
20. 第２ペプチドセグメントが保護されていない、請求項12に記載の方法。
21. 修飾タンパク質が−ＣＯ−Ｓ−ＣＨ₂−ＣＯ−の結合を有する、請求項12に記載の方法。
22. 修飾タンパク質が〔（ＮＨＣＨ₂ＣＯＳＣＨ₂ＣＯ）^51-52〕ＨＩＶ−１ ＰＲである、請求項21に記載の方法。
23. 修飾タンパク質が〔（ＮＨＣＨ₂ＣＯＳＣＨ₂ＣＯ）^51-52〕Ａｂａ^67,95〕ＨＩＶ−１ ＰＲである、請求項21に記載の方法。
24. 下式により表される修飾タンパク質。
    Ｒ−Ｌ−Ｒ'
    （式中、ＲとＲ'は同一でも異なっていてもよく、それぞれ２〜１００アミノ酸残基を有するペプチド又はプソイドペプチドの残基であり；Ｌは修飾タンパク質を形成するチオールエステル、セレノールエステル、チオエーテル又はセレノエーテル結合を表し、Ｒ及びＲ'の少なくとも一方は、少なくとも４０アミノ酸残基を有す。）
25. プロテアーゼである、請求項24に記載の修飾タンパク質。
26. 前記チオールエステル結合が−ＣＯ−Ｓ−ＣＨ₂−ＣＯ−である、請求項25に記載の修飾タンパク質。
27. Ｒ及びＲ'が一緒になって４〜２００アミノ酸残基を有する、請求項26に記載の修飾タンパク質。
28. ペプチドが天然ペプチドであり、プソイドペプチドが天然ペプチドの類縁体である、請求項26に記載の修飾タンパク質。
29. ＲがＨＩＶ−１ ＰＲ（１〜５１）である、請求項24に記載の修飾タンパク質。
30. Ｒ'がＨＩＶ−１ ＰＲ（５３〜９９）である、請求項24に記載の修飾タンパク質。
31. Ｒ'がＨＩＶ−１ ＰＲ〔(５３〜９９)Ａｂａ^67,95〕である、請求項24に記載の修飾タンパク質。
32. 〔（ＮＨＣＨ₂ＣＯＳＣＨ₂ＣＯ）^51-52Ａｂａ^67,95〕ＨＩＶ−１ ＰＲにより特徴付けられる修飾タンパク質。
33. ｛〔ＮＨＣＨ（ＣＯＮＨ₂）ＣＨ₂ＳＣＨ₂ＣＯ〕^51-52Ａｂａ^67,95｝ＨＩＶ−１ ＰＲにより特徴付けられる修飾タンパク質。
34. それぞれがペプチド、プソイドペプチド及び非ペプチド線状分子からなる群から選ばれる２つの分子セグメントを含む生物活性なタンパク質であって、各セグメントが、約２〜約１００アミノ酸残基を含み、かつこれら２つのセグメントのうち１つが少なくとも４０アミノ酸残基を有し、前記２つのセグメントが、チオールエステル、セレノールエステル、チオエーテル又はセレノエーテル結合によって結合されて、ペプチド又はプソイドペプチド骨格を形成し、前記セグメントの１つが、少なくとも１つの非コード化構造単位を含有しかつ該コード化構造単位が、チオールエステル、セレノールエステル、チオエーテル又はセレノエーテル結合部分を形成せず、前記２つのセグメントが、同時に非ペプチド線状分子であることはないことを特徴とするタンパク質。
35. 異なる非コード化構造単位を含有する、請求項34に記載の生物活性なタンパク質。
36. ２より多くの同じ非コード化構造単位を含有する、請求項34に記載の生物活性なタンパク質。
37. プロテアーゼである、請求項34に記載の生物活性なタンパク質。
38. 前記チオールエステルが−ＣＯ−Ｓ−ＣＨ₂ＣＯである、請求項34に記載の生物活性なタンパク質。

Images