JP3700791B2 - Ｆａｓ抗原融合蛋白、その蛋白をコードするＤＮＡ、そのＤＮＡを含むベクター、そのベクターで形質転換された宿主細胞、そのベクターを有効成分とする治療剤、およびその宿主細胞を用いるスクリーニング方法 - Google Patents
Ｆａｓ抗原融合蛋白、その蛋白をコードするＤＮＡ、そのＤＮＡを含むベクター、そのベクターで形質転換された宿主細胞、そのベクターを有効成分とする治療剤、およびその宿主細胞を用いるスクリーニング方法 Download PDFInfo
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、(i) Ｆａｓ抗原の膜貫通領域と機能発現領域を含むアミノ酸配列のＣ端末に、細胞核内受容体のリガンド結合領域を含むアミノ配列を結合させた融合蛋白、(ii)該融合蛋白をコードするＤＮＡ、(iii) 該ＤＮＡを含む発現ベクター、(iv)該発現ベクターで形質転換された形質転換体、(v) 上記発現ベクターを有効成分として含有するガンまたは自己免疫疾患の治療剤、および(vi)上記形質転換体を用いる、細胞核内受容体のリガンドの検出方法に関する。
【０００２】
【発明の背景】
最近、サイトカインやホルモンに代表される、重要な生理活性を有する液性因子の受容体が遺伝子操作によって解明されつつある。例えば、細胞核内受容体と総称される脂溶性ホルモンの受容体が挙げられる。種々の細胞核内受容体のアミノ酸配列を解析した結果、それらは共通の基本構造を有するリガンド依存性の転写因子であり、ひとつの遺伝子ファミリーを形成することが明らかとなった。すなわち、グルココルチコイド受容体、ブロジエステロン受容体、ミネラルコルチコイド受容体、アンドロジエン受容体、エストロジエン受容体などのステロイド受容体、レチノイドＸ受容体、レチノイン酸受容体等のレチノイド受容体、さらにビタミンＤ3 受容体や甲状腺ホルモン受容体からなるファミリーである。これらの受容体については、リガンド結合部位、標的ＤＮＡの配列を認識する部位などの機能領域が明確に分離していることがわかっている［Science, 240, 889 (1988)参照のこと。］が、リガンドが依然として不明である受容体も存在する。
【０００３】
一般に、細胞核内受容体の機能発現はリガンド結合領域によって制御されている。例えば、リガンド（ステロイド）不存在下におけるステロイド受容体では、そのリガンド結合領域はＨＳＰ９０というタンパク質と複合体を形成し不活性な状態にあるが、ステロイドがそのリガンド結合領域に結合すると、ＨＳＰ９０との複合体は解離し、受容体の機能発現領域（ＤＮＡ認識部位）が標的ＤＮＡに結合し、標的遺伝子の発現を調節する。
【０００４】
これに対して、レチノイド受容体、ビタミンＤ3 受容体および甲状腺ホルモン受容体における機能発現のメカニズムはまだ充分に解明されていないが、少なくともＨＳＰ９０との複合体形成は起こらないと考えられている。この点、ステロイド受容体とは大きく異なる点である。そのほかにもレチノイド受容体、ビタミンＤ3 受容体および甲状腺ホルモン受容体はステロイド受容体とは異なった幾つかの性質を有しており（例えば、ステロイド受容体に比べてＡ／Ｂ領域が短く、従って全体の分子量も小さくなっている等）、このためこれらの受容体を大きなファミリー内におけるサブファミリーとして位置づけることが提唱されている。
【０００５】
一方、Ｆａｓ抗原は、プログラムされた細胞死（アポトーシス）に関与することが明確に示された膜蛋白である。ヨネハラ（Yonehara）等は、ヒト細胞表面抗原に対するモノクローナル抗体を作製し、種々のヒト細胞に対し致死活性を示す抗Ｆａｓ抗体を得た［J. Exp. Med., 169, 1747 (1989)参照のこと］。抗Ｆａｓ抗体の認識する細胞表面分子のｃＤＮＡが単離され、ヒトＦａｓ抗原の構造が決定された［Cell, 66, 233 (1991)参照のこと］。Ｆａｓ抗原は３３５個のアミノ酸からなり、Ｎ末端側１６個のアミノ酸はシグナルペプチドと推定されている。分子の中央には疎水性アミノ酸１７個よりなる膜貫通領域が存在し、Ｎ末端側１５７個のアミノ酸が細胞外領域、Ｃ末端側１４５個のアミノ酸が細胞質領域と考えられる。
【０００６】
Ｆａｓ抗原の構造は、ガン壊死因子（ＴＮＦ）の受容体と類似しているため、Ｆａｓ抗体によるアポトーシスはＴＮＦの作用と類似したメカニズムで起こるものと推定されている。Ｆａｓ抗原の機能領域も次第に明らかにされ、アポトーシスのシグナル伝達に必須の領域（機能発現領域）は１７５番目から３０４番目までのアミノ酸配列部分であることがわかっている［J. Biol. Chem., 268, 10932 (1993) 参照のこと］。さらに、マウスのＦａｓ抗原についても、そのアミノ酸配列が明らかになっており［J. Immunology, 148, 1274 (1992) 参照のこと］、ヒトのＦａｓ抗原に対して全体として49.3％のホモロジーを有している。また機能発現領域は、ヒトＦａｓ抗原の該領域に相当する、１６６番目から２９１番目までのアミノ酸配列であると考えられている。
【０００７】
【従来の技術】
受容体はリガンド結合領域とシグナル伝達領域を有している。リガンド結合領域にリガンドが結合すると、シグナル伝達領域の立体構造が変化し、シグナルが別の蛋白やＤＮＡに伝達される。
最近、ある受容体のリガンド結合領域と、異種の蛋白質のシグナル伝達領域とを結合した融合蛋白におけるシグナル伝達に関する研究が盛んに行なわれている。
例えば、ステロイド受容体のひとつであるエストロジエン受容体のリガンド（すなわち、エストロジエン）結合領域とヒトガン遺伝子ｃ−Ｍｙｃのシグナル伝達領域との融合蛋白をコードする遺伝子で形質転換された細胞は、エストロジエンの刺激によって細胞がガン化し、異常増殖することが判明した［Nature, 340,
66 (1989)参照のこと］。
【０００８】
同様の実験が、グルココルチコイド、ミネラルコルチコイド、エストロジエンの各受容体のリガンド結合領域とＥ１Ａ（アデノウイルス）、ｃ−Ｆｏｓ、ｖ−Ｍｙｂ、Ｃ／ＥＢＰ、ｖ−Ｒｅｌ、ＧＡＴＡ−１，２，３、ＧＡＬ４−ＶＰ１６、Ｒｅｖ（ＨＩＶ）、ｃ−Ａｂ１、の各蛋白質の機能発現領域との融合蛋白において行なわれており［Cell, 54, 1073 (1988) 、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88,5114 (1991)、EMBO J., 10, 3713 (1991)、Science, 251, 288 (1991)、EMBO J., 11, 4641 (1992)、Genes Dev. (in press) 、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 1657 (1993) 、ibid., 87, 7787 (1990)、EMBO J., 12, 2809 (1993)参照のこと］、いずれも核内受容体に対応するリガンドが結合されることによってシグナルが伝達されることが確認されている。
【０００９】
【発明の目的】
本発明者らは、前記した融合蛋白をガン治療に応用する目的で検討を重ねた結果、シグナル伝達蛋白としてＦａｓ抗原を用いることにした。実験では、まずマウスのＦａｓ抗原を用いてその可能性について検討した。
マウスＦａｓ抗原の機能発現領域は１６６番目から２９１番目までのアミノ酸配列部分であると考えられている。しかしながら、この部分を、リガンド結合蛋白としての種々のホルモン受容体のリガンド結合領域と結合させてもＦａｓ抗原のシグナルは伝達されなかった（実施例４参照のこと）。そこで、機能発現領域だけでなく膜貫通領域も含めた１３６番目から３０５番目までのアミノ酸配列部分を、ホルモン受容体のリガンド結合領域と融合させることによって、初めてシグナルを伝達させることに成功し、本発明を完成した。
【００１０】
従来の技術で用いられた種々のシグナル伝達蛋白は、ｃ−Ａｂ１がキナーゼとして作用する以外はいずれも転写因子として作用し、目的とする蛋白質の機能の発現を制御するものばかりである。この点、本発明で用いられたＦａｓ抗原は細胞膜受容体であるため、膜に結合していないと、シグナルの伝達が行なわれないものと考えられる。このことは従来技術からはまったく予測されなかったことである。シグナル伝達蛋白としてＦａｓ抗原を用いた融合蛋白はこれまでまったく知られていない。従って本発明の融合蛋白および該蛋白をコードするＤＮＡは新規な発明であると考えられる。また、本発明において、リガンド結合領域として用いる細胞核内受容体に、ステロイド受容体以外のサブファミリー受容体を用いてもシグナル伝達が行われることを初めて確認することができた。
【００１１】
このサブファミリー受容体は、ステロイド受容体とは、その構成やシグナル伝達機構が異なっている点を考慮すれば、サブファミリー受容体のリガンド結合領域を結合した融合蛋白においてシグナル伝達が行なわれるかどうか不明であった。本発明はステロイド受容体だけでなく、細胞核内受容体であればいずれの受容体でもシグナル伝達のためのリガンド結合領域として用いることができることを証明したことであり、意義深いことである。
さらに、本発明者らは、該融合蛋白をコードするＤＮＡを含むプラスミドによって形質転換された細胞を用いることにより、リガンドのアゴニスト／アンタゴニストのスクリーニングも行なえることを見い出した。
【００１２】
【発明の開示】
本発明は、
(i) Ｆａｓ抗原の膜貫通領域と機能発現領域を含むアミノ酸配列のＣ末端に、細胞核内受容体のリガンド結合領域を含むアミノ酸配列を結合させた融合蛋白、
(ii) 該融合蛋白をコードするＤＮＡ、
(iii) 該ＤＮＡを含む複製または発現ベクター、
(iv) 該複製または発現ベクターで形質転換された宿主細胞、
(v) 該発現ベクターを有効成分として含有するガンまたは自己免疫疾患治療剤、または
(vi) 該宿主細胞を用いることを特徴とする細胞核内受容体に対するアゴニストまたはアンタゴニストのスクリーニング方法
に関する。
【００１３】
本発明の融合蛋白を構成するＦａｓ抗原および細胞核内受容体は、哺乳動物由来のもの、例えば、ヒト、サル、イヌ、ネコ、マウス、ラット、モルモット由来のものが用いられる。Ｆａｓ抗原および細胞核内受容体は、好ましくは互いに同じ種のものが用いられるが、異なった種のものを用いてもよい。本発明では互いに異なった種のものを用いてもシグナル伝達が行えることを確認している。例えばヒトのＦａｓ抗原とヒトの細胞核内受容体の組合せ、マウスのＦａｓ抗原とヒトの細胞核内受容体の組合せ、ヒトのＦａｓ抗原とラットの細胞核内受容体の組合せ、マウスのＦａｓ抗原とラットの細胞核内受容体の組合せ、ヒトのＦａｓ抗原とマウスの細胞核内受容体の組合せ、またはマウスのＦａｓ抗原とマウスの細胞核内受容体の組合せが好適に用いられる。
【００１４】
本発明に用いられるＦａｓ抗原の膜貫通領域と機能発現領域を含むアミノ酸配列、および細胞核内受容体のリガンド結合領域を含むアミノ酸配列としては、各領域に相当する部分だけを用いてもよいが、それ以外に、各領域に相当する部分の両端（Ｎ末端および／またはＣ末端）に、フランキング領域（機能領域に関与しない領域、アミノ酸配列にして数１０個、好ましくは６０個以下）を含んだものを用いてもよい。さらに、所望の場合には、Ｆａｓ抗原の膜貫通領域のＮ末端には、シグナルペプチド領域を含むアミノ酸配列を結合していてもよい。各領域に相当するアミノ酸配列としては、天然のアミノ酸配列だけでなく、本来のＦａｓ抗原が有するアポトーシス機能または細胞核内受容体が有するリガンド結合機能を損なわない程度に、アミノ酸が欠損、置換、付加および／または挿入されたものを用いることができる。
【００１５】
本発明に用いられるＦａｓ抗原のうち、ヒトＦａｓ抗原の膜貫通領域と機能発現領域を含むアミノ酸配列としては、１４５番目のＳｅｒから３１９番目のＶａｌであり、マウスＦａｓ抗原では１３６番目のＳｅｒから３０５番目のＬｅｕまでの配列が好適に用いられる。また、シグナルペプチド領域を含むアミノ酸配列としては、ヒトＦａｓ抗原では−１６番目から２３番目までの配列、そしてマウスＦａｓ抗原では−２１番目から１４番目までの配列が好適に用いられる。
【００１６】
本発明に用いられる細胞核内受容体としては、グルココルチコイド受容体、ブロジエステロン受容体、ミネラルコルチコイド受容体、アンドロジエン受容体、エストロジエン受容体等のステロイド受容体、レチノイドＸ受容体、レチノイン酸受容体等のレチノイド受容体、ビタミンＤ3 受容体、または甲状腺ホルモン受容体が挙げられる。好適には、ヒトまたはラットのエストロジェン受容体、ヒトまたはマウスのレチノイドＸ受容体α、レチノイドＸ受容体βまたはレチノイドＸ受容体γあるいはヒトまたはマウスのレチノイン酸受容体α、レチノイン酸受容体βまたはレチノイン酸受容体γが用いられる。
【００１７】
それぞれ受容体のリガンド結合領域は既に知られており［Science, 240, 889 (1988)参照のこと。］、例えば、ヒトグルココルチコイド受容体では５２８番目から７７７番目まで、ヒトブロジエステロン受容体では６８０番目から９３４番目まで、ヒトミネラルコルチコイド受容体では７３４番目から９８４番目まで、ヒトアンドロジエン受容体では６７６番目から９１９番目まで、ヒトエストロジエン受容体では３１１番目から５５１番目まで、ラットエストロジエン受容体では３０７番目から５５７番目まで、ヒトレチノイドＸ受容体αでは２２５番目から４６２番目まで、ヒトレチノイドＸ受容体βでは２９７番目から５２６番目まで、マウスレチノイドＸ受容体αでは２３０番目から４６７番目まで、マウスレチノイドＸ受容体βでは１７１番目から４１０番目まで、マウスレチノイドＸ受容体γでは２２９番目から４６３番目まで、ヒトレチノイン酸受容体αでは１９８番目から４６２番目まで、ヒトレチノイン酸受容体βでは１９１番目から４４８番目まで、ヒトレチノイン酸受容体γでは２００番目から４５４番目まで、マウスレチノイン酸受容体αでは１９８番目から４６２番目まで、マウスレチノイン酸受容体βでは１９０番目から４４８番目まで、マウスレチノイン酸受容体γでは２００番目から４５８番目まで、ヒトビタミンＤ3 受容体では１９２番目から４２７番目まで、ヒト甲状腺ホルモン受容体αでは１８３番目から４１０番目まで、ヒト甲状腺ホルモン受容体βでは２３２番目から４５６番目までのアミノ酸である。
【００１８】
好適には、ヒトエストロジエン受容体の３１１番目から５５１番目まで、ラットエストロジエン受容体の３０７番目から５５７番目まで、ヒトレチノイドＸ受容体αの２２５番目から４６２番目まで、ヒトレチノイドＸ受容体βの２９７番目から５２６番目まで、マウスレチノイドＸ受容体αの２３０番目から４６７番目まで、マウスレチノイドＸ受容体βの１７１番目から４１０番目まで、マウスレチノイドＸ受容体γの２２９番目から４６３番目まで、ヒトレチノイン酸受容体αの１９８番目から４６２番目まで、ヒトレチノイン酸受容体βの１９１番目から４４８番目まで、ヒトレチノイン酸受容体γの２００番目から４５４番目まで、マウスレチノイン酸受容体αの１９８番目から４６２番目まで、マウスレチノイン酸受容体βの１９０番目から４４８番目まで、マウスレチノイン酸受容体γの２００番目から４５８番目までの配列が用いられる。より好適には、ヒトエストロジェン受容体の２８１番目から５９５番目まで、ラットエストロジエン受容体の２８６番目から６００番目まで、ヒトレチノイン酸受容体αの１７６番目から４６２番目まで、またはマウスレチノイン酸受容体αの１７７番目から４５８番目までの配列が用いられる。
【００１９】
本発明の融合蛋白中、好ましいものとしては、
(i) ヒトＦａｓ抗原の１４５番目から３１９番目までのアミノ酸配列のＣ末端に、ヒトエストロジエン受容体の３１１番目から５５１番目までのアミノ酸配列を結合させた融合蛋白、
(ii)ヒトＦａｓ抗原の１４５番目から３１９番目までのアミノ酸配列のＣ末端に、ラットエストロジエン受容体の３０７番目から５５７番目までのアミノ酸配列を結合させた融合蛋白、
(iii) ヒトＦａｓ抗原の１４５番目から３１９番目までのアミノ酸配列のＣ末端に、ヒトレチノイドＸ受容体αの２２５番目から４６２番目までのアミノ酸配列を結合させた融合蛋白、
(iv)ヒトＦａｓ抗原の１４５番目から３１９番目までのアミノ酸配列のＣ末端に、ヒトレチノイドＸ受容体βの２９７番目から５２６番目までのアミノ酸配列を結合させた融合蛋白、
(v) ヒトＦａｓ抗原の１４５番目から３１９番目までのアミノ酸配列のＣ末端に、マウスレチノイドＸ受容体αの２３０番目から４６７番目までのアミノ酸配列を結合させた融合蛋白、
【００２０】
(vi)ヒトＦａｓ抗原の１４５番目から３１９番目までのアミノ酸配列のＣ末端に、マウスレチノイドＸ受容体βの１７１番目から４１０番目までのアミノ酸配列を結合させた融合蛋白、
(vii) ヒトＦａｓ抗原の１４５番目から３１９番目までのアミノ酸配列のＣ末端に、マウスレチノイドＸ受容体γの２２９番目から４６３番目までのアミノ酸配列を結合させた融合蛋白、
(viii)ヒトＦａｓ抗原の１４５番目から３１９番目までのアミノ酸配列のＣ末端に、ヒトレチノイン酸受容体αの１９８番目から４６２番目までのアミノ酸配列を結合させた融合蛋白、
(ix)ヒトＦａｓ抗原の１４５番目から３１９番目までのアミノ酸配列のＣ末端に、ヒトレチノイン酸受容体βの１９１番目から４４８番目までのアミノ酸配列を結合させた融合蛋白、
(x) ヒトＦａｓ抗原の１４５番目から３１９番目までのアミノ酸配列のＣ末端に、ヒトレチノイン酸受容体γの２００番目から４５４番目までのアミノ酸配列を結合させた融合蛋白、
【００２１】
(xi)ヒトＦａｓ抗原の１４５番目から３１９番目までのアミノ酸配列のＣ末端に、マウスレチノイン酸受容体αの１９８番目から４６２番目までのアミノ酸配列を結合させた融合蛋白、
(xii) ヒトＦａｓ抗原の１４５番目から３１９番目までのアミノ酸配列のＣ末端に、マウスレチノイン酸受容体βの１９０番目から４４８番目までのアミノ酸配列を結合させた融合蛋白、または
(xiii)ヒトＦａｓ抗原の１４５番目から３１９番目までのアミノ酸配列のＣ末端に、マウスレチノイン酸受容体γの２００番目から４５８番目までのアミノ酸配列を結合させた融合蛋白が挙げられる。
【００２２】
また、他の好ましいものとしては、
(i) マウスＦａｓ抗原の１３６番目から３０５番目までのアミノ酸配列のＣ末端に、ヒトエストロジエン受容体の３１１番目から５５１番目までのアミノ酸配列を結合させた融合蛋白、
(ii)マウスＦａｓ抗原の１３６番目から３０５番目までのアミノ酸配列のＣ末端に、ラットエストロジエン受容体の３０７番目から５５７番目までのアミノ酸配列を結合させた融合蛋白、
(iii) マウスＦａｓ抗原の１３６番目から３０５番目までのアミノ酸配列のＣ末端に、ヒトレチノイドＸ受容体αの２２５番目から４６２番目までのアミノ酸配列を結合させた融合蛋白、
(iv)マウスＦａｓ抗原の１３６番目から３０５番目までのアミノ酸配列のＣ末端に、ヒトレチノイドＸ受容体βの２９７番目から５２６番目までのアミノ酸配列を結合させた融合蛋白、
【００２３】
(v) マウスＦａｓ抗原の１３６番目から３０５番目までのアミノ酸配列のＣ末端に、マウスレチノイドＸ受容体αの２３０番目から４６７番目までのアミノ酸配列を結合させた融合蛋白、
(vi)マウスＦａｓ抗原の１３６番目から３０５番目までのアミノ酸配列のＣ末端に、マウスレチノイドＸ受容体βの１７１番目から４１０番目までのアミノ酸配列を結合させた融合蛋白、
(vii) マウスＦａｓ抗原の１３６番目から３０５番目までのアミノ酸配列のＣ末端に、マウスレチノイドＸ受容体γの２２９番目から４６３番目までのアミノ酸配列を結合させた融合蛋白、
(viii)マウスＦａｓ抗原の１３６番目から３０５番目までのアミノ酸配列のＣ末端に、ヒトレチノイン酸受容体αの１９８番目から４６２番目までのアミノ酸配列を結合させた融合蛋白、
(ix)マウスＦａｓ抗原の１３６番目から３０５番目までのアミノ酸配列のＣ末端に、ヒトレチノイン酸受容体βの１９１番目から４４８番目までのアミノ酸配列を結合させた融合蛋白、
【００２４】
(x) マウスＦａｓ抗原の１３６番目から３０５番目までのアミノ酸配列のＣ末端に、ヒトレチノイン酸受容体γの２００番目から４５４番目までのアミノ酸配列を結合させた融合蛋白、
(xi)マウストＦａｓ抗原の１３６番目から３０５番目までのアミノ酸配列のＣ末端に、マウスレチノイン酸受容体αの１９８番目から４６２番目までのアミノ酸配列を結合させた融合蛋白、
(xii) マウスＦａｓ抗原の１３６番目から３０５番目までのアミノ酸配列のＣ末端に、マウスレチノイン酸受容体βの１９０番目から４４８番目までのアミノ酸配列を結合させた融合蛋白、または
(xiii)マウスＦａｓ抗原の１３６番目から３０５番目までのアミノ酸配列のＣ末端に、マウスレチノイン酸受容体γの２００番目から４５８番目までのアミノ酸配列を結合させた融合蛋白が挙げられる。
【００２５】
本発明の融合蛋白中、より好ましいものとしては、
(i) ヒトＦａｓ抗原の１４５番目から３１９番目までのアミノ酸配列のＣ末端に、ヒトエストロジエン受容体の２８１番目から５９５番目までのアミノ酸配列を結合させた融合蛋白、
(ii)ヒトＦａｓ抗原の１４５番目から３１９番目までのアミノ酸配列のＣ末端に、ラットエストロジエン受容体の２８６番目から６００番目までのアミノ酸配列を結合させた融合蛋白、
(iii) ヒトＦａｓ抗原の１４５番目から３１９番目までのアミノ酸配列のＣ末端に、ヒトレチノイン酸受容体αの１７６番目から４６２番目までのアミノ酸配列を結合させた融合蛋白、
(iv)ヒトＦａｓ抗原の１４５番目から３１９番目までのアミノ酸配列のＣ末端に、マウスレチノイン酸受容体αの１７７番目から４５８番目までのアミノ酸配列を結合させた融合蛋白、
【００２６】
(v) マウスＦａｓ抗原の１３６番目から３０５番目までのアミノ酸配列のＣ末端に、ヒトエストロジエン受容体の２８１番目から５９５番目までのアミノ酸配列を結合させた融合蛋白、
(vi)マウスＦａｓ抗原の１３６番目から３０５番目までのアミノ酸配列のＣ末端に、ラットエストロジエン受容体の２８６番目から６００番目までのアミノ酸配列を結合させた融合蛋白、
(vii) マウスＦａｓ抗原の１３６番目から３０５番目までのアミノ酸配列のＣ末端に、ヒトレチノイン酸受容体αの１７６番目から４６２番目までのアミノ酸配列を結合させた融合蛋白、
(viii)マウスＦａｓ抗原の１３６番目から３０５番目までのアミノ酸配列のＣ末端に、マウスレチノイン酸受容体αの１７７番目から４５８番目までのアミノ酸配列を結合させた融合蛋白が挙げられる。
【００２７】
本発明には、本発明の融合蛋白をコードするＤＮＡも含まれる。
よく知られているように、ひとつのアミノ酸をコードするコドンは１〜６種類（例えば、メチオニン（Ｍｅｔ）は１種類、ロイシン（Ｌｅｕ）は６種類）知られている。従って、アミノ酸配列を変えることなくＤＮＡの塩基配列を変えることができる。
【００２８】
本発明には、本発明の融合蛋白コードする全ての塩基配列群が含まれる。塩基配列を変えることによって、融合蛋白の生産性が向上することがある。
本発明の融合蛋白をコードするＤＮＡは、以下の方法に従って作製することができる。
すなわち、
(i) Ｆａｓ抗原と細胞核内受容体のアミノ酸配列のうち、必要とする領域を含むアミノ酸配列をコードするＤＮＡをポリメラーゼチェインリアクション（ＰＣＲ）法により増幅し、
(ii)適当なベクターに、Ｆａｓ抗原より得られたＰＣＲ生成物を組み込み、続いて、細胞核内受容体より得られたＰＣＲ生成物を組み込むことにより行なわれる。
【００２９】
より詳細に説明すると、
工程(i) は融合に必要な部品をＰＣＲ法により増幅する工程である。Ｆａｓ抗原の場合は、膜貫通領域と機能発現領域を含むアミノ酸配列をコードする塩基配列を化学合成し、プライマーとして用いる。また、細胞核内受容体の場合は、リガンド結合領域を含むアミノ酸配列をコードする塩基配列を化学合成し、プライマーとして用いる。
得られたプライマーの５′ 末端には特定の制限酵素サイトを設けておく。またＰＣＲ法のテンプレートとしては、相当する哺乳動物、例えば、ヒト、マウス等の細胞または細胞株より単離、精製したｍＲＮＡを使用することができる。ＰＣＲ法は、公知の方法により行われる。最近ではＰＣＲ自動化装置も普及しているので、該装置が好適に用いられる。
【００３０】
工程(ii)は、ベクター中で両部品を融合する工程である。本工程に用いられるプラスミドベクターとしては大腸菌内で機能するもの（例えば、ｐＢＲ３２２）や枯草菌内で機能するもの（例えば、ｐＵＢ１１０）が多数知られているが、いずれであっても好適に用いられる。
また、直接発現ベクターに組み込むことも可能である。例えば、大腸菌で発現させる場合には、適当なプロモーター（例えば、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、λＰＬプロモーター、Ｔ７プロモーター等）の下流に、Ｆａｓ抗原の当該ＰＣＲ産物を接続し、次いでその下流に細胞核内受容体の当該ＰＣＲ産物を接続して、大腸菌内で機能するベクター（例えば、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９等）に挿入して発現ベクターを作成する。また、哺乳動物細胞で発現させる場合には、適当なベクター（例えば、レトロウイルスベクター、パピローマウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、ＳＶ４０系ベクター等）中の適当なプロモーター（例えば、ＳＶ４０プロモーター、ＬＴＲプロモーター、メタロチオネインプロモーター等）の下流に、Ｆａｓ抗原の当該ＰＣＲ産物、次いで細胞核内受容体の当該ＰＣＲ産物を挿入して発現ベクターを作製する。好適には、ｐＣＭＸ（Cell, 66, 663 (1991)に記載されている。）が用いられる。
【００３１】
哺乳動物細胞で発現させる場合には、所望によりＦａｓ抗原のシグナルペプチド領域をコードする塩基配列のＰＣＲ産物をプロモーターのすぐ下流に挿入することができる。
本発明には、本発明のＤＮＡからなる複製または発現ベクターが含まれる。ベクターとしては、例えば、ｏｒｉ領域と、必要により上記ＤＮＡの発現のためのプロモーター、プロモーターの制御因子などからなるプラスミド、ウイルスまたはファージベクターが挙げられる。ベクターはひとつまたはそれ以上の選択的マーカー遺伝子（例えば、ネオマイシン耐性遺伝子、ブラスチサイジンＳ耐性遺伝子）を含んでいてもよい。
【００３２】
本発明の融合蛋白を生産するための発現系（宿主−ベクター系）としては、例えば、細菌、酵母、昆虫細胞および哺乳動物細胞の発現系が挙げられる。
例えば、大腸菌で発現させる場合には、前記の大腸菌内で機能する発現ベクターで形質転換した大腸菌（例えば、E. coli ＤＨ１、E. coli ＪＭ１０９、E. coli ＨＢ１０１株等）を適当な培地で培養して、その菌体より目的とするポリペプチドを得ることができる。また、バクテリアのシグナルペプチド（例えば、ｐｅｌＢのシグナルペプチド）を利用すれば、ペリプラズム中に目的とする融合蛋白を分泌することもできる。
【００３３】
また、哺乳動物細胞で発現させる場合には、前記の哺乳動物細胞内で機能する発現ベクターで適当な哺乳動物細胞（例えば、サルＣＯＳ−７細胞、チャイニーズハムスターＣＨＯ細胞、マウスＬ細胞、マウス繊維芽細胞、ヒトガン細胞等）を形質転換し、形質転換体を適当な培地で培養することによって、目的とする融合蛋白を生産することができる。以上のようにして得られたポリペプチドは、一般的な生化学的方法によって単離精製することができる。
本発明には、本発明のＤＮＡからなる複製または発現ベクターで形質転換された宿主細胞が含まれる。
【００３４】
【発明の効果】
このようにして得られた本発明の融合蛋白は、ガンまたは自己免疫疾患治療剤として用いることができる。すなわち、本発明の融合蛋白をコードするＤＮＡを含む発現ベクターをガン病巣部または自己免疫疾患病巣部にターゲティング法（例えば、リポソーム内に封じ込めて）により局所的に投与する。該ベクターは病巣部のガン細胞内に侵入し、遺伝子に入り込んで該融合蛋白を継続的に発現するようになる。しかる後に、本発明の融合蛋白の一部を構成する細胞核内受容体に対応するリガンド（例えば、該受容体としてレチノイドＸ受容体を用いた場合には9-cis-レチノイン酸、レチノイン酸受容体を用いた場合にはビタミンＡ）を投与する。ガン細胞内で生産された本発明の融合蛋白にリガンドが結合し、アポトーシスのシグナルが伝達される。かくしてガン細胞は死滅する。
【００３５】
さらに、本発明の融合蛋白は、細胞核内受容体に対するアゴニストまたはアンタゴニストのスクリーニング法として広範に利用することができる。すなわち、本発明の融合蛋白を常時発現している細胞に、検体を添加する。もし細胞が死ねば、検体はアゴニスト活性を有していることを示し、またアゴニスト存在下に細胞が生存すれば、検体はアンタゴニスト活性を有していることが判明する。
本発明のスクリーニング法は、大量のサンプルを短時間で処理することができるだけでなく、効果（結果）が細胞死となって表われるので、その判定が容易であるなどの点で、優れたスクリーニング法であると言える。
【００３６】
【実施例】
以下に、本発明を実施例によって、より詳細に、かつより具体的に説明するが、もちろんこれによって本発明が制限されるものではない。
【００３７】
実施例１ ＰＣＲ生成物の調製
図１にＰＣＲプライマーの調製方法の概念図を示す。図中、領域ＡはマウスＦａｓ抗原のシグナルペプチド領域を示し、領域ＢはマウスＦａｓ抗原の細胞外領域を示し、領域ＣはマウスＦａｓ抗原の膜貫通領域を示し、領域ＤはマウスＦａｓ抗原の細胞質領域を示し、領域Ｅはヒトレチノイン酸受容体αのリガンド結合領域を示し、そして領域Ｆはラットエストロジェン受容体のリガンド結合領域を示す。
【００３８】
（１） マウスＦａｓ抗原のＰＣＲ生成物の調製
フクナガ（Fukunaga）らの報告（J. Immunology, 148, 1274 (1992) ）に記載されたマウスＦａｓ抗原の構造により以下のプライマーを調製した。
Ｆ１：１３１番目から１４３番目までのアミノ酸配列：Pro Cys Thr Ala Thr Ser Asn Thr Asn Cys Arg Lys Gln の構造に相当し、５′側の一部に制限酵素ＮｃｏＩ及びＫｐｎＩのサイトを導入したプライマー（配列番号１）、
【００３９】
５′-CACCATGGGTACCAGCAATACAAACTGCAGGAAAC-3′
を合成した。
Ｆ２：２０９番目から２２１番目までのアミノ酸配列：Glu Asp Met Thr Ile Gln Glu Ala Lys Lys Phe Ala Arg の構造に相当し、５′側の一部に制限酵素NcoI及びKpnIのサイトを導入したプライマー（配列番号２）、
【００４０】
５′-GAAGCCATGGGTACCCAGGAAGCTAAAAAATTTGCTCGA-3′
を合成した。
Ｆ３：２９８番目から３０６番目（Ｃ末端）までのアミノ酸配列：Asn Glu Asn Glu Gly Gln Cys Leu Glu および３′非翻訳領域の一部に相当し、さらに３′- 側の一部にBamHI サイトを導入した３′−プライマー（配列番号３）、
【００４１】
５′-TCAGGATCCAGACATTGTCCTTCATTTTCATT-３′
を合成した。
Ｓ１：Ｆａｓ抗原ｃＤＮＡの５′非翻訳領域の一部を含み−２１番目から−１４番目までのアミノ酸配列：Met Leu Trp Ile Trp Ala Val Leu の構造に相当し、５′側に制限酵素ＨｉｎｄIII およびＮｏｔＩのサイトを導入したプライマー（配列番号４）、
【００４２】
５′-CTGAAGCTTCGCGGCCGCACCATGCTGTGGATCTGGGCTGTCCTG-3′
を合成した。
Ｓ２：Ｆａｓ抗原のｃＤＮＡの一部、５番目から１４番目までのアミノ酸配列：Ser Ile Ser Glu Ser Leu Lys Leu Arg Arg に相当し、３′側の一部にＨｉｎｄIII サイトを導入した３′−プライマー（配列番号５）、
【００４３】
５′-CCTCCTAAGCTTTAAACTCTCGGAGATGCT-３′
を合成した。
マウスＴセルライン、ＲＬＭ−１１（Cell, 68, 1109 (1992) に記載）より得られたｍＲＮＡを鋳型として用い、Ｆ１とＦ３のＰＣＲ産物をプライマーとして用いて、サーマルシークエンサー（モデルＴＳＲ−３００、イワキガラス社製）を使用して、９５℃で１８０秒×１→（９５℃で６０秒、５５℃で６０秒、７２℃で６０秒）×１５→７２℃で１８０秒の条件でＲＴ−ＰＣＲを行った結果、約５２０ｂｐの断片（以下Ｆａｓ−ＴＭと記す。）を得た。次に、前記と同じｍＲＮＡを鋳型をして用い、Ｆ２とＦ３のＰＣＲ産物をプライマーとして用いて、上記と同様の条件でＰＣＲを行った結果、約２８０ｂｐの断片（以下、Ｆａｓ−△ＴＭと記す。）を得た。さらに、前記と同じｍＲＮＡを鋳型として用い、Ｓ１とＳ２のＰＣＲ産物をプライマーとして用いて、上記と同様の条件でＰＣＲを行った結果、約１２０ｂｐの断片（以下、Ｆａｓ−ｓｉｇと記す。）を得た。
【００４４】
（２） ヒトレチノイン酸α受容体のＰＣＲ生成物の調製
ギグレ (Giguere) ら(Nature, 330, 624 (1987)) に記載されたヒトレチノイン酸αの受容体の構造より以下のプライマーを調製した。
Ｒ１：１７３番目から１８２番目までのアミノ酸配列：Glu Cys Ser Glu Ser Tyr Thr Leu Thr Pro の構造に相当し、５′側の一部に制限酵素Ｂｇｌ II のサイトを導入したプライマー（配列番号６）、
【００４５】
５′-GGCAGATCTCTCTGAGAGCTACACGCTGACGCCG-３′
を合成した。
Ｒ２：４５６番目から４６２番目（Ｃ末端）までのアミノ酸配列：Ser Pro Ala Thr His Ser Pro および３′非翻訳領域の一部に相当し、３′側の一部にBamHI サイトを導入した３′−プライマー（配列番号７）、
【００４６】
５′-CGTGGATCCTCACGGGGAGTGGGTGGCCGGGCT-3′
を合成した。
ヒト前骨骨髄性白血病細胞のＨＬ−６０より得られたｍＲＮＡを鋳型として用い、Ｒ１とＲ２をプライマーとして用いて、サーマルシークエンサー（モデルＴＳＲ−３００）を使用して、実施例１−（１）と同様の条件でＲＴ−ＰＣＲを行った結果、約８７０ｂｐの断片（以下、ＲＡＲαと記す。）を得た。
【００４７】
（３） ラットエストロジェン受容体のＰＣＲ生成物の調製
コイケ（Koike ）ら(Nucleic Acid Research, 15, 2499 (1987))に記載されたラットエストロジェン受容体の構造より以下のプライマーを調製した。
Ｒ３：２８２番目から２９２番目までのアミノ酸配列：Arg Asn Glu Met Gly Thr Ser Gly Asp Met Arg の構造に相当し、５′側の一部に制限酵素ＢａｍＨＩのサイトを導入したプライマー（配列番号８）、
【００４８】
５′-CGAAAGGATCCGGGCACTTCAGGAGACATGAGA-3′
を合成した。Ｒ４：５９８番目から６００番目（Ｃ末端）までのアミノ酸配列：Asn Thr Ile および３′非翻訳領域の一部に相当し、３′側の一部にＢａｍＨＩサイトを導入した３′プライマー（配列番号９）、
【００４９】
５′-TGGGGTACCTGGGAGTTCTCAGATGGTGTT-３′
を合成した。
ＰＵＣＥＲ６（埼玉医科大学、村松正實教授より供与された。Nucleic Acid Research, 15, 2499 (1987)に記載）より得られたｍＲＮＡを鋳型として用い、Ｒ３とＲ４をプライマーとして用いて、サーマルシークエンサー（モデルＴＳＲ−３００）を使用して、実施例１−（１）と同様の条件でＰＣＲを行った結果、約９７０ｂｐの断片（以下、ＥＲと記す。）を得た。
【００５０】
実施例２ 融合蛋白をコードするｃＤＮＡの構築
融合蛋白質の検出用シーケンスとしてインフルエンザ・ヘマグルチニンの構造の一部（Ｅｐｉ）を含む発現ベクターｐＣＭＸＥＰＩを作製した。融合蛋白をコードするｃＤＮＡの構築図を図２に示す（図中、＊は融合配列５のＤＮＡを作製するときの（ＮｈｅＩ）を示す。）。
まず、ｐＣＭＸベクター（Cell, 66, 663 (1991)に記載）をＨｉｎｄIII-ＫｐｎＩで開き、次の配列を有する合成ヌクレオチド（配列番号１０）、
【００５１】
５′-AGCTTGGCGCCACCATGGTGTACCCCTACGACGTGCCCGACTATGCCAGCCTGGGTAC-３′
を挿入したのち（ｐＣＭＸＥＰＩ）、ベクターをＫｐｎＩ−ＢａｍＨＩで開き、Ｆａｓ抗原の膜貫通領域と機能発現領域を含むＰＣＲ生成物（Ｆａｓ−ＴＭ）および機能発現領域のみを含むＰＣＲ生成物（Ｆａｓ−△ＴＭ）（いずれも実施例１（１）で調製した。）のそれぞれのＫｐｎＩ−ＢａｍＨＩ断片を組み込んだ。これによって、Ｅｐｉが直接、Ｆａｓ抗原の膜貫通領域および機能発現領域、または機能発現領域と融合した配列が得られた。次にベクターをBamHI で開き、レチノイン酸受容体のリガンド結合領域（ＲＡＲα、実施例１（２）で調製した。）のＢｇｌ II −ＢａｍＨＩ断片を組み込んだ。必要な方向に組み込まれたプラスミドから、Ｅｐｉ−Ｆａｓ−ＲＡＲαの融合配列が得られた（以後、Ｅｐｉ−Ｆａｓ−ＴＭ−ＲＡＲαを融合配列１、またＥｐｉ−Ｆａｓ−△ＴＭ−ＲＡＲαを融合配列２と表わす）。一方、融合配列１、２それぞれの上流域のHind IIIサイトに、同末端を持つＦａｓ抗原のシグナル配列（Ｆａｓ−ｓｉｇ）を導入した。方向を確認し、それぞれ融合配列１および２に相当するＦａｓ抗原のシグナル配列を持つ融合配列３および４を得た。
同様にして、Ｅｐｉ−Ｆａｓ−ＴＭ−ＥＲの融合配列を得た（以後、融合配列５と表わす）。
【００５２】
実施例３ 融合蛋白発現系の構築
融合蛋白発現系の概念を図３に示す（図中、＊は融合配列５のＤＮＡを作製するときの（ＮｈｅＩ）を示す）。
イズミ（Izumi ）らによって報告されているベクターｐＳＶ２ｂｓｒ（Exp. Cell. Res.,197, 229, (1991)に記載）よりブラスチサイジンＳ耐性部分（EcoRI-PvuII 断片）を切り出した。発現ベクターｐＥＦＢＯＳ（Nuc. Acid Res., 18, 5322 (1990)に記載）の２箇所のＥｃｏＲＩサイトのうち、ＥＦ−１αプロモーターの３′側にあるもののみ欠失させ、残りのサイトに上記の断片（ブラスチサイジンＳ耐性部分）を平滑末端化した後に導入した。融合配列１、２をＨｉｎｄＩＩＩ−ＢａｍＨＩで、融合配列３、４をＮｏｔＩ−ＢａｍＨＩで、さらに融合配列５をＨｉｎｄＩＩＩ−ＮｈｅＩで切り出し、それぞれ平滑化した。ベクターｐＥＦＢＯＳｂｓｒのマルチクローニングサイトにおけるＢｓｔＸＩサイトを平滑化し、上記の融合配列を導入した。
【００５３】
得られた発現ベクターはＥｃｏＲＩで線形化し、通常のカルシウムホスフェート法にてマウス繊維芽細胞、Ｌ９２９及びヒト癌細胞、ＨｅＬａに導入した。Exp. Cell. Res., 197, 229, (1991) に記載されている方法（プラスチサイジンＳ選択）にて、融合蛋白を常時発現している細胞を選択した。
【００５４】
実施例４ ビタミンＡによる殺細胞アッセイ
それぞれの融合蛋白を常時発現している細胞、例えばＬ９２９を2.5 ×１０4 個／１００μｌの割合で１０％のＦＣＳ（牛胎児血清）を含むＤＭＥＭ（ダルベッコ変法イーグル培地）に浮遊させ、９６穴のマイクロタイタープレートに分配した。５％炭酸ガス中に、３７℃にて２４時間培養した。ビタミンＡの最終濃度の２倍の濃度の試料を同培養液中に調整し、１００μl を加えた。そのまま更に１５時間培養し、上清を捨てた後にクリスタル・バイオレット（0.75％クリスタルバイオレットの５０％エタノール溶液、0.25％のＮａＣｌ、1.75％のホルムアルデヒド、室温、２０分）で生細胞を染色した（Cell, 66, 233 (1991)に記載の方法）Ｉｔｏｈらの文献記載の方法）。ＰＢＳ（フォスフェートバッファーセーライン）で２回洗浄した後、直接マイクロＥＬＩＳＡリーダーで５４０ｎｍの吸光度を測定した。
【００５５】
図４にビタミンＡ処理時の生細胞数の経時変化を示す。また、図５にビタミンＡの濃度変化を示す（図中、黒丸は融合蛋白発現系を導入した細胞であり、白丸は融合蛋白発現系を導入していない細胞である）。これらの結果は融合配列１を導入した細胞を用いた実験から得られたものである。１μＭのビタミンＡで誘発させた細胞死は、８時間後に９０％以上完結する。また、１５時間後検定におけるビタミンＡの作用は濃度依存性であり、その５０％作用濃度（ＩＣ５０）は約0.1 μＭであった。
【００５６】
なお、融合配列２または４を導入した細胞では、上記の「リガンド特異的細胞死の誘導」現象は全く観測されなかった。Ｆａｓ抗原のシグナル配列（Ｓｉｇ）を付加した融合配列３に於ける結果は、上記の融合配列１による結果と同様であり両者の効果は、ビタミンＡの濃度依存性、反応の経時変化において区別出来ないものであった。
【００５７】
以上の結果は、従来報告されていた転写因子等を用いた融合蛋白と異なり、Ｆａｓ抗原の場合は、機能発現領域だけを融合させてもシグナル伝達は行われず、膜貫通領域が必須であることを示している。また、細胞核内受容体のサブファミリーのリガンド結合領域を結合された融合蛋白でもシグナルが伝達されることを示している。さらに、Ｆａｓ抗原と細胞核内受容体が互いに異種動物のものであってもシグナルが伝達されること、および異種動物の細胞にアポトーシスを起こすことも確認された。
【００５８】
実施例５ エストロジェンによる殺細胞アッセイ
実施例４と同様にして、それぞれの融合蛋白を常時発現している細胞を培養し、エストロジェンの添加後、培養、染色して吸光度を測定した。
図６にエストロジェンの濃度変化を示す（図中、黒四角は融合蛋白発現系を導入した細胞であり、白四角は融合蛋白発現系を導入していない細胞である）。１５時間後検定におけるエストロジェンの作用は濃度依存性であり、その５０％作用濃度（ＩＣ５０）は約0.1 ｎＭであった。この結果は、Ｆａｓ抗原のアポトーシス機能は、ステロイド受容体のリガンド結合領域を結合した融合蛋白でも発現することを示している。
【００５９】
【配列表】
配列番号：１
配列の長さ：３５
配列の型：核酸
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列
CACCATGGGT ACCAGCAATA CAAACTGCAG GAAAC
【００６０】
配列番号：２
配列の長さ：３９
配列の型：核酸
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列
GAAGCCATGG GTACCCAGGA AGCTAAAAAA TTTGCTCGA
【００６１】
配列番号：３
配列の長さ：３２
配列の型：核酸
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列
TCAGGATCCA GACATTGTCC TTCATTTTCA TT
【００６２】
配列番号：４
配列の長さ：４５
配列の型：核酸
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列
CTGAAGCTTC GCGGCCGCAC CATGCTGTGG ATCTGGGCTG TCCTG
【００６３】
配列番号：５
配列の長さ：３０
配列の型：核酸
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列
CCTCCTAAGC TTTAAACTCT CGGAGATGCT
【００６４】
配列番号：６
配列の長さ：３４
配列の型：核酸
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列
GGCAGATCTC TCTGAGAGCT ACACGCTGAC GCCG
【００６５】
配列番号：７
配列の長さ：３３
配列の型：核酸
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列
CGTGGATCCT CACGGGGAGT GGGTGGCCGG GCT
【００６６】
配列番号：８
配列の長さ：３３
配列の型：核酸
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列
CGAAAGGATC CGGGCACTTC AGGAGACATG AGA
【００６７】
配列番号：９
配列の長さ：３０
配列の型：核酸
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列
TGGGGTACCT GGGAGTTCTC AGATGGTGTT
【００６８】
配列番号：１０
配列の長さ：５８
配列の型：核酸
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列
AGCTTGGCGC CACCATGGTG TACCCCTACG ACGTGCCCGA CTATGCCAGC CTGGGTAC
【図面の簡単な説明】
【図１】 ＰＣＲプライマーの調製方法の概念図である。
【図２】 融合蛋白をコードするｃＤＮＡの構築図である。
【図３】 融合蛋白発現系の概念図である
【図４】 ビタミンＡによるアポトーシスアッセイにおける投与時間と生細胞数の関係を示すグラフである。
【図５】 ビタミンＡによるアポトーシスアッセイにおけるビタミンＡの濃度と生細胞数の関係を示すグラフである。
【図６】 エストロジェンによるアポトーシスアッセイにおけるエストロジェンの濃度と生細胞数の関係を示すグラフである。
【産業上の利用分野】
本発明は、(i) Ｆａｓ抗原の膜貫通領域と機能発現領域を含むアミノ酸配列のＣ端末に、細胞核内受容体のリガンド結合領域を含むアミノ配列を結合させた融合蛋白、(ii)該融合蛋白をコードするＤＮＡ、(iii) 該ＤＮＡを含む発現ベクター、(iv)該発現ベクターで形質転換された形質転換体、(v) 上記発現ベクターを有効成分として含有するガンまたは自己免疫疾患の治療剤、および(vi)上記形質転換体を用いる、細胞核内受容体のリガンドの検出方法に関する。
【０００２】
【発明の背景】
最近、サイトカインやホルモンに代表される、重要な生理活性を有する液性因子の受容体が遺伝子操作によって解明されつつある。例えば、細胞核内受容体と総称される脂溶性ホルモンの受容体が挙げられる。種々の細胞核内受容体のアミノ酸配列を解析した結果、それらは共通の基本構造を有するリガンド依存性の転写因子であり、ひとつの遺伝子ファミリーを形成することが明らかとなった。すなわち、グルココルチコイド受容体、ブロジエステロン受容体、ミネラルコルチコイド受容体、アンドロジエン受容体、エストロジエン受容体などのステロイド受容体、レチノイドＸ受容体、レチノイン酸受容体等のレチノイド受容体、さらにビタミンＤ3 受容体や甲状腺ホルモン受容体からなるファミリーである。これらの受容体については、リガンド結合部位、標的ＤＮＡの配列を認識する部位などの機能領域が明確に分離していることがわかっている［Science, 240, 889 (1988)参照のこと。］が、リガンドが依然として不明である受容体も存在する。
【０００３】
一般に、細胞核内受容体の機能発現はリガンド結合領域によって制御されている。例えば、リガンド（ステロイド）不存在下におけるステロイド受容体では、そのリガンド結合領域はＨＳＰ９０というタンパク質と複合体を形成し不活性な状態にあるが、ステロイドがそのリガンド結合領域に結合すると、ＨＳＰ９０との複合体は解離し、受容体の機能発現領域（ＤＮＡ認識部位）が標的ＤＮＡに結合し、標的遺伝子の発現を調節する。
【０００４】
これに対して、レチノイド受容体、ビタミンＤ3 受容体および甲状腺ホルモン受容体における機能発現のメカニズムはまだ充分に解明されていないが、少なくともＨＳＰ９０との複合体形成は起こらないと考えられている。この点、ステロイド受容体とは大きく異なる点である。そのほかにもレチノイド受容体、ビタミンＤ3 受容体および甲状腺ホルモン受容体はステロイド受容体とは異なった幾つかの性質を有しており（例えば、ステロイド受容体に比べてＡ／Ｂ領域が短く、従って全体の分子量も小さくなっている等）、このためこれらの受容体を大きなファミリー内におけるサブファミリーとして位置づけることが提唱されている。
【０００５】
一方、Ｆａｓ抗原は、プログラムされた細胞死（アポトーシス）に関与することが明確に示された膜蛋白である。ヨネハラ（Yonehara）等は、ヒト細胞表面抗原に対するモノクローナル抗体を作製し、種々のヒト細胞に対し致死活性を示す抗Ｆａｓ抗体を得た［J. Exp. Med., 169, 1747 (1989)参照のこと］。抗Ｆａｓ抗体の認識する細胞表面分子のｃＤＮＡが単離され、ヒトＦａｓ抗原の構造が決定された［Cell, 66, 233 (1991)参照のこと］。Ｆａｓ抗原は３３５個のアミノ酸からなり、Ｎ末端側１６個のアミノ酸はシグナルペプチドと推定されている。分子の中央には疎水性アミノ酸１７個よりなる膜貫通領域が存在し、Ｎ末端側１５７個のアミノ酸が細胞外領域、Ｃ末端側１４５個のアミノ酸が細胞質領域と考えられる。
【０００６】
Ｆａｓ抗原の構造は、ガン壊死因子（ＴＮＦ）の受容体と類似しているため、Ｆａｓ抗体によるアポトーシスはＴＮＦの作用と類似したメカニズムで起こるものと推定されている。Ｆａｓ抗原の機能領域も次第に明らかにされ、アポトーシスのシグナル伝達に必須の領域（機能発現領域）は１７５番目から３０４番目までのアミノ酸配列部分であることがわかっている［J. Biol. Chem., 268, 10932 (1993) 参照のこと］。さらに、マウスのＦａｓ抗原についても、そのアミノ酸配列が明らかになっており［J. Immunology, 148, 1274 (1992) 参照のこと］、ヒトのＦａｓ抗原に対して全体として49.3％のホモロジーを有している。また機能発現領域は、ヒトＦａｓ抗原の該領域に相当する、１６６番目から２９１番目までのアミノ酸配列であると考えられている。
【０００７】
【従来の技術】
受容体はリガンド結合領域とシグナル伝達領域を有している。リガンド結合領域にリガンドが結合すると、シグナル伝達領域の立体構造が変化し、シグナルが別の蛋白やＤＮＡに伝達される。
最近、ある受容体のリガンド結合領域と、異種の蛋白質のシグナル伝達領域とを結合した融合蛋白におけるシグナル伝達に関する研究が盛んに行なわれている。
例えば、ステロイド受容体のひとつであるエストロジエン受容体のリガンド（すなわち、エストロジエン）結合領域とヒトガン遺伝子ｃ−Ｍｙｃのシグナル伝達領域との融合蛋白をコードする遺伝子で形質転換された細胞は、エストロジエンの刺激によって細胞がガン化し、異常増殖することが判明した［Nature, 340,
66 (1989)参照のこと］。
【０００８】
同様の実験が、グルココルチコイド、ミネラルコルチコイド、エストロジエンの各受容体のリガンド結合領域とＥ１Ａ（アデノウイルス）、ｃ−Ｆｏｓ、ｖ−Ｍｙｂ、Ｃ／ＥＢＰ、ｖ−Ｒｅｌ、ＧＡＴＡ−１，２，３、ＧＡＬ４−ＶＰ１６、Ｒｅｖ（ＨＩＶ）、ｃ−Ａｂ１、の各蛋白質の機能発現領域との融合蛋白において行なわれており［Cell, 54, 1073 (1988) 、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88,5114 (1991)、EMBO J., 10, 3713 (1991)、Science, 251, 288 (1991)、EMBO J., 11, 4641 (1992)、Genes Dev. (in press) 、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 1657 (1993) 、ibid., 87, 7787 (1990)、EMBO J., 12, 2809 (1993)参照のこと］、いずれも核内受容体に対応するリガンドが結合されることによってシグナルが伝達されることが確認されている。
【０００９】
【発明の目的】
本発明者らは、前記した融合蛋白をガン治療に応用する目的で検討を重ねた結果、シグナル伝達蛋白としてＦａｓ抗原を用いることにした。実験では、まずマウスのＦａｓ抗原を用いてその可能性について検討した。
マウスＦａｓ抗原の機能発現領域は１６６番目から２９１番目までのアミノ酸配列部分であると考えられている。しかしながら、この部分を、リガンド結合蛋白としての種々のホルモン受容体のリガンド結合領域と結合させてもＦａｓ抗原のシグナルは伝達されなかった（実施例４参照のこと）。そこで、機能発現領域だけでなく膜貫通領域も含めた１３６番目から３０５番目までのアミノ酸配列部分を、ホルモン受容体のリガンド結合領域と融合させることによって、初めてシグナルを伝達させることに成功し、本発明を完成した。
【００１０】
従来の技術で用いられた種々のシグナル伝達蛋白は、ｃ−Ａｂ１がキナーゼとして作用する以外はいずれも転写因子として作用し、目的とする蛋白質の機能の発現を制御するものばかりである。この点、本発明で用いられたＦａｓ抗原は細胞膜受容体であるため、膜に結合していないと、シグナルの伝達が行なわれないものと考えられる。このことは従来技術からはまったく予測されなかったことである。シグナル伝達蛋白としてＦａｓ抗原を用いた融合蛋白はこれまでまったく知られていない。従って本発明の融合蛋白および該蛋白をコードするＤＮＡは新規な発明であると考えられる。また、本発明において、リガンド結合領域として用いる細胞核内受容体に、ステロイド受容体以外のサブファミリー受容体を用いてもシグナル伝達が行われることを初めて確認することができた。
【００１１】
このサブファミリー受容体は、ステロイド受容体とは、その構成やシグナル伝達機構が異なっている点を考慮すれば、サブファミリー受容体のリガンド結合領域を結合した融合蛋白においてシグナル伝達が行なわれるかどうか不明であった。本発明はステロイド受容体だけでなく、細胞核内受容体であればいずれの受容体でもシグナル伝達のためのリガンド結合領域として用いることができることを証明したことであり、意義深いことである。
さらに、本発明者らは、該融合蛋白をコードするＤＮＡを含むプラスミドによって形質転換された細胞を用いることにより、リガンドのアゴニスト／アンタゴニストのスクリーニングも行なえることを見い出した。
【００１２】
【発明の開示】
本発明は、
(i) Ｆａｓ抗原の膜貫通領域と機能発現領域を含むアミノ酸配列のＣ末端に、細胞核内受容体のリガンド結合領域を含むアミノ酸配列を結合させた融合蛋白、
(ii) 該融合蛋白をコードするＤＮＡ、
(iii) 該ＤＮＡを含む複製または発現ベクター、
(iv) 該複製または発現ベクターで形質転換された宿主細胞、
(v) 該発現ベクターを有効成分として含有するガンまたは自己免疫疾患治療剤、または
(vi) 該宿主細胞を用いることを特徴とする細胞核内受容体に対するアゴニストまたはアンタゴニストのスクリーニング方法
に関する。
【００１３】
本発明の融合蛋白を構成するＦａｓ抗原および細胞核内受容体は、哺乳動物由来のもの、例えば、ヒト、サル、イヌ、ネコ、マウス、ラット、モルモット由来のものが用いられる。Ｆａｓ抗原および細胞核内受容体は、好ましくは互いに同じ種のものが用いられるが、異なった種のものを用いてもよい。本発明では互いに異なった種のものを用いてもシグナル伝達が行えることを確認している。例えばヒトのＦａｓ抗原とヒトの細胞核内受容体の組合せ、マウスのＦａｓ抗原とヒトの細胞核内受容体の組合せ、ヒトのＦａｓ抗原とラットの細胞核内受容体の組合せ、マウスのＦａｓ抗原とラットの細胞核内受容体の組合せ、ヒトのＦａｓ抗原とマウスの細胞核内受容体の組合せ、またはマウスのＦａｓ抗原とマウスの細胞核内受容体の組合せが好適に用いられる。
【００１４】
本発明に用いられるＦａｓ抗原の膜貫通領域と機能発現領域を含むアミノ酸配列、および細胞核内受容体のリガンド結合領域を含むアミノ酸配列としては、各領域に相当する部分だけを用いてもよいが、それ以外に、各領域に相当する部分の両端（Ｎ末端および／またはＣ末端）に、フランキング領域（機能領域に関与しない領域、アミノ酸配列にして数１０個、好ましくは６０個以下）を含んだものを用いてもよい。さらに、所望の場合には、Ｆａｓ抗原の膜貫通領域のＮ末端には、シグナルペプチド領域を含むアミノ酸配列を結合していてもよい。各領域に相当するアミノ酸配列としては、天然のアミノ酸配列だけでなく、本来のＦａｓ抗原が有するアポトーシス機能または細胞核内受容体が有するリガンド結合機能を損なわない程度に、アミノ酸が欠損、置換、付加および／または挿入されたものを用いることができる。
【００１５】
本発明に用いられるＦａｓ抗原のうち、ヒトＦａｓ抗原の膜貫通領域と機能発現領域を含むアミノ酸配列としては、１４５番目のＳｅｒから３１９番目のＶａｌであり、マウスＦａｓ抗原では１３６番目のＳｅｒから３０５番目のＬｅｕまでの配列が好適に用いられる。また、シグナルペプチド領域を含むアミノ酸配列としては、ヒトＦａｓ抗原では−１６番目から２３番目までの配列、そしてマウスＦａｓ抗原では−２１番目から１４番目までの配列が好適に用いられる。
【００１６】
本発明に用いられる細胞核内受容体としては、グルココルチコイド受容体、ブロジエステロン受容体、ミネラルコルチコイド受容体、アンドロジエン受容体、エストロジエン受容体等のステロイド受容体、レチノイドＸ受容体、レチノイン酸受容体等のレチノイド受容体、ビタミンＤ3 受容体、または甲状腺ホルモン受容体が挙げられる。好適には、ヒトまたはラットのエストロジェン受容体、ヒトまたはマウスのレチノイドＸ受容体α、レチノイドＸ受容体βまたはレチノイドＸ受容体γあるいはヒトまたはマウスのレチノイン酸受容体α、レチノイン酸受容体βまたはレチノイン酸受容体γが用いられる。
【００１７】
それぞれ受容体のリガンド結合領域は既に知られており［Science, 240, 889 (1988)参照のこと。］、例えば、ヒトグルココルチコイド受容体では５２８番目から７７７番目まで、ヒトブロジエステロン受容体では６８０番目から９３４番目まで、ヒトミネラルコルチコイド受容体では７３４番目から９８４番目まで、ヒトアンドロジエン受容体では６７６番目から９１９番目まで、ヒトエストロジエン受容体では３１１番目から５５１番目まで、ラットエストロジエン受容体では３０７番目から５５７番目まで、ヒトレチノイドＸ受容体αでは２２５番目から４６２番目まで、ヒトレチノイドＸ受容体βでは２９７番目から５２６番目まで、マウスレチノイドＸ受容体αでは２３０番目から４６７番目まで、マウスレチノイドＸ受容体βでは１７１番目から４１０番目まで、マウスレチノイドＸ受容体γでは２２９番目から４６３番目まで、ヒトレチノイン酸受容体αでは１９８番目から４６２番目まで、ヒトレチノイン酸受容体βでは１９１番目から４４８番目まで、ヒトレチノイン酸受容体γでは２００番目から４５４番目まで、マウスレチノイン酸受容体αでは１９８番目から４６２番目まで、マウスレチノイン酸受容体βでは１９０番目から４４８番目まで、マウスレチノイン酸受容体γでは２００番目から４５８番目まで、ヒトビタミンＤ3 受容体では１９２番目から４２７番目まで、ヒト甲状腺ホルモン受容体αでは１８３番目から４１０番目まで、ヒト甲状腺ホルモン受容体βでは２３２番目から４５６番目までのアミノ酸である。
【００１８】
好適には、ヒトエストロジエン受容体の３１１番目から５５１番目まで、ラットエストロジエン受容体の３０７番目から５５７番目まで、ヒトレチノイドＸ受容体αの２２５番目から４６２番目まで、ヒトレチノイドＸ受容体βの２９７番目から５２６番目まで、マウスレチノイドＸ受容体αの２３０番目から４６７番目まで、マウスレチノイドＸ受容体βの１７１番目から４１０番目まで、マウスレチノイドＸ受容体γの２２９番目から４６３番目まで、ヒトレチノイン酸受容体αの１９８番目から４６２番目まで、ヒトレチノイン酸受容体βの１９１番目から４４８番目まで、ヒトレチノイン酸受容体γの２００番目から４５４番目まで、マウスレチノイン酸受容体αの１９８番目から４６２番目まで、マウスレチノイン酸受容体βの１９０番目から４４８番目まで、マウスレチノイン酸受容体γの２００番目から４５８番目までの配列が用いられる。より好適には、ヒトエストロジェン受容体の２８１番目から５９５番目まで、ラットエストロジエン受容体の２８６番目から６００番目まで、ヒトレチノイン酸受容体αの１７６番目から４６２番目まで、またはマウスレチノイン酸受容体αの１７７番目から４５８番目までの配列が用いられる。
【００１９】
本発明の融合蛋白中、好ましいものとしては、
(i) ヒトＦａｓ抗原の１４５番目から３１９番目までのアミノ酸配列のＣ末端に、ヒトエストロジエン受容体の３１１番目から５５１番目までのアミノ酸配列を結合させた融合蛋白、
(ii)ヒトＦａｓ抗原の１４５番目から３１９番目までのアミノ酸配列のＣ末端に、ラットエストロジエン受容体の３０７番目から５５７番目までのアミノ酸配列を結合させた融合蛋白、
(iii) ヒトＦａｓ抗原の１４５番目から３１９番目までのアミノ酸配列のＣ末端に、ヒトレチノイドＸ受容体αの２２５番目から４６２番目までのアミノ酸配列を結合させた融合蛋白、
(iv)ヒトＦａｓ抗原の１４５番目から３１９番目までのアミノ酸配列のＣ末端に、ヒトレチノイドＸ受容体βの２９７番目から５２６番目までのアミノ酸配列を結合させた融合蛋白、
(v) ヒトＦａｓ抗原の１４５番目から３１９番目までのアミノ酸配列のＣ末端に、マウスレチノイドＸ受容体αの２３０番目から４６７番目までのアミノ酸配列を結合させた融合蛋白、
【００２０】
(vi)ヒトＦａｓ抗原の１４５番目から３１９番目までのアミノ酸配列のＣ末端に、マウスレチノイドＸ受容体βの１７１番目から４１０番目までのアミノ酸配列を結合させた融合蛋白、
(vii) ヒトＦａｓ抗原の１４５番目から３１９番目までのアミノ酸配列のＣ末端に、マウスレチノイドＸ受容体γの２２９番目から４６３番目までのアミノ酸配列を結合させた融合蛋白、
(viii)ヒトＦａｓ抗原の１４５番目から３１９番目までのアミノ酸配列のＣ末端に、ヒトレチノイン酸受容体αの１９８番目から４６２番目までのアミノ酸配列を結合させた融合蛋白、
(ix)ヒトＦａｓ抗原の１４５番目から３１９番目までのアミノ酸配列のＣ末端に、ヒトレチノイン酸受容体βの１９１番目から４４８番目までのアミノ酸配列を結合させた融合蛋白、
(x) ヒトＦａｓ抗原の１４５番目から３１９番目までのアミノ酸配列のＣ末端に、ヒトレチノイン酸受容体γの２００番目から４５４番目までのアミノ酸配列を結合させた融合蛋白、
【００２１】
(xi)ヒトＦａｓ抗原の１４５番目から３１９番目までのアミノ酸配列のＣ末端に、マウスレチノイン酸受容体αの１９８番目から４６２番目までのアミノ酸配列を結合させた融合蛋白、
(xii) ヒトＦａｓ抗原の１４５番目から３１９番目までのアミノ酸配列のＣ末端に、マウスレチノイン酸受容体βの１９０番目から４４８番目までのアミノ酸配列を結合させた融合蛋白、または
(xiii)ヒトＦａｓ抗原の１４５番目から３１９番目までのアミノ酸配列のＣ末端に、マウスレチノイン酸受容体γの２００番目から４５８番目までのアミノ酸配列を結合させた融合蛋白が挙げられる。
【００２２】
また、他の好ましいものとしては、
(i) マウスＦａｓ抗原の１３６番目から３０５番目までのアミノ酸配列のＣ末端に、ヒトエストロジエン受容体の３１１番目から５５１番目までのアミノ酸配列を結合させた融合蛋白、
(ii)マウスＦａｓ抗原の１３６番目から３０５番目までのアミノ酸配列のＣ末端に、ラットエストロジエン受容体の３０７番目から５５７番目までのアミノ酸配列を結合させた融合蛋白、
(iii) マウスＦａｓ抗原の１３６番目から３０５番目までのアミノ酸配列のＣ末端に、ヒトレチノイドＸ受容体αの２２５番目から４６２番目までのアミノ酸配列を結合させた融合蛋白、
(iv)マウスＦａｓ抗原の１３６番目から３０５番目までのアミノ酸配列のＣ末端に、ヒトレチノイドＸ受容体βの２９７番目から５２６番目までのアミノ酸配列を結合させた融合蛋白、
【００２３】
(v) マウスＦａｓ抗原の１３６番目から３０５番目までのアミノ酸配列のＣ末端に、マウスレチノイドＸ受容体αの２３０番目から４６７番目までのアミノ酸配列を結合させた融合蛋白、
(vi)マウスＦａｓ抗原の１３６番目から３０５番目までのアミノ酸配列のＣ末端に、マウスレチノイドＸ受容体βの１７１番目から４１０番目までのアミノ酸配列を結合させた融合蛋白、
(vii) マウスＦａｓ抗原の１３６番目から３０５番目までのアミノ酸配列のＣ末端に、マウスレチノイドＸ受容体γの２２９番目から４６３番目までのアミノ酸配列を結合させた融合蛋白、
(viii)マウスＦａｓ抗原の１３６番目から３０５番目までのアミノ酸配列のＣ末端に、ヒトレチノイン酸受容体αの１９８番目から４６２番目までのアミノ酸配列を結合させた融合蛋白、
(ix)マウスＦａｓ抗原の１３６番目から３０５番目までのアミノ酸配列のＣ末端に、ヒトレチノイン酸受容体βの１９１番目から４４８番目までのアミノ酸配列を結合させた融合蛋白、
【００２４】
(x) マウスＦａｓ抗原の１３６番目から３０５番目までのアミノ酸配列のＣ末端に、ヒトレチノイン酸受容体γの２００番目から４５４番目までのアミノ酸配列を結合させた融合蛋白、
(xi)マウストＦａｓ抗原の１３６番目から３０５番目までのアミノ酸配列のＣ末端に、マウスレチノイン酸受容体αの１９８番目から４６２番目までのアミノ酸配列を結合させた融合蛋白、
(xii) マウスＦａｓ抗原の１３６番目から３０５番目までのアミノ酸配列のＣ末端に、マウスレチノイン酸受容体βの１９０番目から４４８番目までのアミノ酸配列を結合させた融合蛋白、または
(xiii)マウスＦａｓ抗原の１３６番目から３０５番目までのアミノ酸配列のＣ末端に、マウスレチノイン酸受容体γの２００番目から４５８番目までのアミノ酸配列を結合させた融合蛋白が挙げられる。
【００２５】
本発明の融合蛋白中、より好ましいものとしては、
(i) ヒトＦａｓ抗原の１４５番目から３１９番目までのアミノ酸配列のＣ末端に、ヒトエストロジエン受容体の２８１番目から５９５番目までのアミノ酸配列を結合させた融合蛋白、
(ii)ヒトＦａｓ抗原の１４５番目から３１９番目までのアミノ酸配列のＣ末端に、ラットエストロジエン受容体の２８６番目から６００番目までのアミノ酸配列を結合させた融合蛋白、
(iii) ヒトＦａｓ抗原の１４５番目から３１９番目までのアミノ酸配列のＣ末端に、ヒトレチノイン酸受容体αの１７６番目から４６２番目までのアミノ酸配列を結合させた融合蛋白、
(iv)ヒトＦａｓ抗原の１４５番目から３１９番目までのアミノ酸配列のＣ末端に、マウスレチノイン酸受容体αの１７７番目から４５８番目までのアミノ酸配列を結合させた融合蛋白、
【００２６】
(v) マウスＦａｓ抗原の１３６番目から３０５番目までのアミノ酸配列のＣ末端に、ヒトエストロジエン受容体の２８１番目から５９５番目までのアミノ酸配列を結合させた融合蛋白、
(vi)マウスＦａｓ抗原の１３６番目から３０５番目までのアミノ酸配列のＣ末端に、ラットエストロジエン受容体の２８６番目から６００番目までのアミノ酸配列を結合させた融合蛋白、
(vii) マウスＦａｓ抗原の１３６番目から３０５番目までのアミノ酸配列のＣ末端に、ヒトレチノイン酸受容体αの１７６番目から４６２番目までのアミノ酸配列を結合させた融合蛋白、
(viii)マウスＦａｓ抗原の１３６番目から３０５番目までのアミノ酸配列のＣ末端に、マウスレチノイン酸受容体αの１７７番目から４５８番目までのアミノ酸配列を結合させた融合蛋白が挙げられる。
【００２７】
本発明には、本発明の融合蛋白をコードするＤＮＡも含まれる。
よく知られているように、ひとつのアミノ酸をコードするコドンは１〜６種類（例えば、メチオニン（Ｍｅｔ）は１種類、ロイシン（Ｌｅｕ）は６種類）知られている。従って、アミノ酸配列を変えることなくＤＮＡの塩基配列を変えることができる。
【００２８】
本発明には、本発明の融合蛋白コードする全ての塩基配列群が含まれる。塩基配列を変えることによって、融合蛋白の生産性が向上することがある。
本発明の融合蛋白をコードするＤＮＡは、以下の方法に従って作製することができる。
すなわち、
(i) Ｆａｓ抗原と細胞核内受容体のアミノ酸配列のうち、必要とする領域を含むアミノ酸配列をコードするＤＮＡをポリメラーゼチェインリアクション（ＰＣＲ）法により増幅し、
(ii)適当なベクターに、Ｆａｓ抗原より得られたＰＣＲ生成物を組み込み、続いて、細胞核内受容体より得られたＰＣＲ生成物を組み込むことにより行なわれる。
【００２９】
より詳細に説明すると、
工程(i) は融合に必要な部品をＰＣＲ法により増幅する工程である。Ｆａｓ抗原の場合は、膜貫通領域と機能発現領域を含むアミノ酸配列をコードする塩基配列を化学合成し、プライマーとして用いる。また、細胞核内受容体の場合は、リガンド結合領域を含むアミノ酸配列をコードする塩基配列を化学合成し、プライマーとして用いる。
得られたプライマーの５′ 末端には特定の制限酵素サイトを設けておく。またＰＣＲ法のテンプレートとしては、相当する哺乳動物、例えば、ヒト、マウス等の細胞または細胞株より単離、精製したｍＲＮＡを使用することができる。ＰＣＲ法は、公知の方法により行われる。最近ではＰＣＲ自動化装置も普及しているので、該装置が好適に用いられる。
【００３０】
工程(ii)は、ベクター中で両部品を融合する工程である。本工程に用いられるプラスミドベクターとしては大腸菌内で機能するもの（例えば、ｐＢＲ３２２）や枯草菌内で機能するもの（例えば、ｐＵＢ１１０）が多数知られているが、いずれであっても好適に用いられる。
また、直接発現ベクターに組み込むことも可能である。例えば、大腸菌で発現させる場合には、適当なプロモーター（例えば、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、λＰＬプロモーター、Ｔ７プロモーター等）の下流に、Ｆａｓ抗原の当該ＰＣＲ産物を接続し、次いでその下流に細胞核内受容体の当該ＰＣＲ産物を接続して、大腸菌内で機能するベクター（例えば、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９等）に挿入して発現ベクターを作成する。また、哺乳動物細胞で発現させる場合には、適当なベクター（例えば、レトロウイルスベクター、パピローマウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、ＳＶ４０系ベクター等）中の適当なプロモーター（例えば、ＳＶ４０プロモーター、ＬＴＲプロモーター、メタロチオネインプロモーター等）の下流に、Ｆａｓ抗原の当該ＰＣＲ産物、次いで細胞核内受容体の当該ＰＣＲ産物を挿入して発現ベクターを作製する。好適には、ｐＣＭＸ（Cell, 66, 663 (1991)に記載されている。）が用いられる。
【００３１】
哺乳動物細胞で発現させる場合には、所望によりＦａｓ抗原のシグナルペプチド領域をコードする塩基配列のＰＣＲ産物をプロモーターのすぐ下流に挿入することができる。
本発明には、本発明のＤＮＡからなる複製または発現ベクターが含まれる。ベクターとしては、例えば、ｏｒｉ領域と、必要により上記ＤＮＡの発現のためのプロモーター、プロモーターの制御因子などからなるプラスミド、ウイルスまたはファージベクターが挙げられる。ベクターはひとつまたはそれ以上の選択的マーカー遺伝子（例えば、ネオマイシン耐性遺伝子、ブラスチサイジンＳ耐性遺伝子）を含んでいてもよい。
【００３２】
本発明の融合蛋白を生産するための発現系（宿主−ベクター系）としては、例えば、細菌、酵母、昆虫細胞および哺乳動物細胞の発現系が挙げられる。
例えば、大腸菌で発現させる場合には、前記の大腸菌内で機能する発現ベクターで形質転換した大腸菌（例えば、E. coli ＤＨ１、E. coli ＪＭ１０９、E. coli ＨＢ１０１株等）を適当な培地で培養して、その菌体より目的とするポリペプチドを得ることができる。また、バクテリアのシグナルペプチド（例えば、ｐｅｌＢのシグナルペプチド）を利用すれば、ペリプラズム中に目的とする融合蛋白を分泌することもできる。
【００３３】
また、哺乳動物細胞で発現させる場合には、前記の哺乳動物細胞内で機能する発現ベクターで適当な哺乳動物細胞（例えば、サルＣＯＳ−７細胞、チャイニーズハムスターＣＨＯ細胞、マウスＬ細胞、マウス繊維芽細胞、ヒトガン細胞等）を形質転換し、形質転換体を適当な培地で培養することによって、目的とする融合蛋白を生産することができる。以上のようにして得られたポリペプチドは、一般的な生化学的方法によって単離精製することができる。
本発明には、本発明のＤＮＡからなる複製または発現ベクターで形質転換された宿主細胞が含まれる。
【００３４】
【発明の効果】
このようにして得られた本発明の融合蛋白は、ガンまたは自己免疫疾患治療剤として用いることができる。すなわち、本発明の融合蛋白をコードするＤＮＡを含む発現ベクターをガン病巣部または自己免疫疾患病巣部にターゲティング法（例えば、リポソーム内に封じ込めて）により局所的に投与する。該ベクターは病巣部のガン細胞内に侵入し、遺伝子に入り込んで該融合蛋白を継続的に発現するようになる。しかる後に、本発明の融合蛋白の一部を構成する細胞核内受容体に対応するリガンド（例えば、該受容体としてレチノイドＸ受容体を用いた場合には9-cis-レチノイン酸、レチノイン酸受容体を用いた場合にはビタミンＡ）を投与する。ガン細胞内で生産された本発明の融合蛋白にリガンドが結合し、アポトーシスのシグナルが伝達される。かくしてガン細胞は死滅する。
【００３５】
さらに、本発明の融合蛋白は、細胞核内受容体に対するアゴニストまたはアンタゴニストのスクリーニング法として広範に利用することができる。すなわち、本発明の融合蛋白を常時発現している細胞に、検体を添加する。もし細胞が死ねば、検体はアゴニスト活性を有していることを示し、またアゴニスト存在下に細胞が生存すれば、検体はアンタゴニスト活性を有していることが判明する。
本発明のスクリーニング法は、大量のサンプルを短時間で処理することができるだけでなく、効果（結果）が細胞死となって表われるので、その判定が容易であるなどの点で、優れたスクリーニング法であると言える。
【００３６】
【実施例】
以下に、本発明を実施例によって、より詳細に、かつより具体的に説明するが、もちろんこれによって本発明が制限されるものではない。
【００３７】
実施例１ ＰＣＲ生成物の調製
図１にＰＣＲプライマーの調製方法の概念図を示す。図中、領域ＡはマウスＦａｓ抗原のシグナルペプチド領域を示し、領域ＢはマウスＦａｓ抗原の細胞外領域を示し、領域ＣはマウスＦａｓ抗原の膜貫通領域を示し、領域ＤはマウスＦａｓ抗原の細胞質領域を示し、領域Ｅはヒトレチノイン酸受容体αのリガンド結合領域を示し、そして領域Ｆはラットエストロジェン受容体のリガンド結合領域を示す。
【００３８】
（１） マウスＦａｓ抗原のＰＣＲ生成物の調製
フクナガ（Fukunaga）らの報告（J. Immunology, 148, 1274 (1992) ）に記載されたマウスＦａｓ抗原の構造により以下のプライマーを調製した。
Ｆ１：１３１番目から１４３番目までのアミノ酸配列：Pro Cys Thr Ala Thr Ser Asn Thr Asn Cys Arg Lys Gln の構造に相当し、５′側の一部に制限酵素ＮｃｏＩ及びＫｐｎＩのサイトを導入したプライマー（配列番号１）、
【００３９】
５′-CACCATGGGTACCAGCAATACAAACTGCAGGAAAC-3′
を合成した。
Ｆ２：２０９番目から２２１番目までのアミノ酸配列：Glu Asp Met Thr Ile Gln Glu Ala Lys Lys Phe Ala Arg の構造に相当し、５′側の一部に制限酵素NcoI及びKpnIのサイトを導入したプライマー（配列番号２）、
【００４０】
５′-GAAGCCATGGGTACCCAGGAAGCTAAAAAATTTGCTCGA-3′
を合成した。
Ｆ３：２９８番目から３０６番目（Ｃ末端）までのアミノ酸配列：Asn Glu Asn Glu Gly Gln Cys Leu Glu および３′非翻訳領域の一部に相当し、さらに３′- 側の一部にBamHI サイトを導入した３′−プライマー（配列番号３）、
【００４１】
５′-TCAGGATCCAGACATTGTCCTTCATTTTCATT-３′
を合成した。
Ｓ１：Ｆａｓ抗原ｃＤＮＡの５′非翻訳領域の一部を含み−２１番目から−１４番目までのアミノ酸配列：Met Leu Trp Ile Trp Ala Val Leu の構造に相当し、５′側に制限酵素ＨｉｎｄIII およびＮｏｔＩのサイトを導入したプライマー（配列番号４）、
【００４２】
５′-CTGAAGCTTCGCGGCCGCACCATGCTGTGGATCTGGGCTGTCCTG-3′
を合成した。
Ｓ２：Ｆａｓ抗原のｃＤＮＡの一部、５番目から１４番目までのアミノ酸配列：Ser Ile Ser Glu Ser Leu Lys Leu Arg Arg に相当し、３′側の一部にＨｉｎｄIII サイトを導入した３′−プライマー（配列番号５）、
【００４３】
５′-CCTCCTAAGCTTTAAACTCTCGGAGATGCT-３′
を合成した。
マウスＴセルライン、ＲＬＭ−１１（Cell, 68, 1109 (1992) に記載）より得られたｍＲＮＡを鋳型として用い、Ｆ１とＦ３のＰＣＲ産物をプライマーとして用いて、サーマルシークエンサー（モデルＴＳＲ−３００、イワキガラス社製）を使用して、９５℃で１８０秒×１→（９５℃で６０秒、５５℃で６０秒、７２℃で６０秒）×１５→７２℃で１８０秒の条件でＲＴ−ＰＣＲを行った結果、約５２０ｂｐの断片（以下Ｆａｓ−ＴＭと記す。）を得た。次に、前記と同じｍＲＮＡを鋳型をして用い、Ｆ２とＦ３のＰＣＲ産物をプライマーとして用いて、上記と同様の条件でＰＣＲを行った結果、約２８０ｂｐの断片（以下、Ｆａｓ−△ＴＭと記す。）を得た。さらに、前記と同じｍＲＮＡを鋳型として用い、Ｓ１とＳ２のＰＣＲ産物をプライマーとして用いて、上記と同様の条件でＰＣＲを行った結果、約１２０ｂｐの断片（以下、Ｆａｓ−ｓｉｇと記す。）を得た。
【００４４】
（２） ヒトレチノイン酸α受容体のＰＣＲ生成物の調製
ギグレ (Giguere) ら(Nature, 330, 624 (1987)) に記載されたヒトレチノイン酸αの受容体の構造より以下のプライマーを調製した。
Ｒ１：１７３番目から１８２番目までのアミノ酸配列：Glu Cys Ser Glu Ser Tyr Thr Leu Thr Pro の構造に相当し、５′側の一部に制限酵素Ｂｇｌ II のサイトを導入したプライマー（配列番号６）、
【００４５】
５′-GGCAGATCTCTCTGAGAGCTACACGCTGACGCCG-３′
を合成した。
Ｒ２：４５６番目から４６２番目（Ｃ末端）までのアミノ酸配列：Ser Pro Ala Thr His Ser Pro および３′非翻訳領域の一部に相当し、３′側の一部にBamHI サイトを導入した３′−プライマー（配列番号７）、
【００４６】
５′-CGTGGATCCTCACGGGGAGTGGGTGGCCGGGCT-3′
を合成した。
ヒト前骨骨髄性白血病細胞のＨＬ−６０より得られたｍＲＮＡを鋳型として用い、Ｒ１とＲ２をプライマーとして用いて、サーマルシークエンサー（モデルＴＳＲ−３００）を使用して、実施例１−（１）と同様の条件でＲＴ−ＰＣＲを行った結果、約８７０ｂｐの断片（以下、ＲＡＲαと記す。）を得た。
【００４７】
（３） ラットエストロジェン受容体のＰＣＲ生成物の調製
コイケ（Koike ）ら(Nucleic Acid Research, 15, 2499 (1987))に記載されたラットエストロジェン受容体の構造より以下のプライマーを調製した。
Ｒ３：２８２番目から２９２番目までのアミノ酸配列：Arg Asn Glu Met Gly Thr Ser Gly Asp Met Arg の構造に相当し、５′側の一部に制限酵素ＢａｍＨＩのサイトを導入したプライマー（配列番号８）、
【００４８】
５′-CGAAAGGATCCGGGCACTTCAGGAGACATGAGA-3′
を合成した。Ｒ４：５９８番目から６００番目（Ｃ末端）までのアミノ酸配列：Asn Thr Ile および３′非翻訳領域の一部に相当し、３′側の一部にＢａｍＨＩサイトを導入した３′プライマー（配列番号９）、
【００４９】
５′-TGGGGTACCTGGGAGTTCTCAGATGGTGTT-３′
を合成した。
ＰＵＣＥＲ６（埼玉医科大学、村松正實教授より供与された。Nucleic Acid Research, 15, 2499 (1987)に記載）より得られたｍＲＮＡを鋳型として用い、Ｒ３とＲ４をプライマーとして用いて、サーマルシークエンサー（モデルＴＳＲ−３００）を使用して、実施例１−（１）と同様の条件でＰＣＲを行った結果、約９７０ｂｐの断片（以下、ＥＲと記す。）を得た。
【００５０】
実施例２ 融合蛋白をコードするｃＤＮＡの構築
融合蛋白質の検出用シーケンスとしてインフルエンザ・ヘマグルチニンの構造の一部（Ｅｐｉ）を含む発現ベクターｐＣＭＸＥＰＩを作製した。融合蛋白をコードするｃＤＮＡの構築図を図２に示す（図中、＊は融合配列５のＤＮＡを作製するときの（ＮｈｅＩ）を示す。）。
まず、ｐＣＭＸベクター（Cell, 66, 663 (1991)に記載）をＨｉｎｄIII-ＫｐｎＩで開き、次の配列を有する合成ヌクレオチド（配列番号１０）、
【００５１】
５′-AGCTTGGCGCCACCATGGTGTACCCCTACGACGTGCCCGACTATGCCAGCCTGGGTAC-３′
を挿入したのち（ｐＣＭＸＥＰＩ）、ベクターをＫｐｎＩ−ＢａｍＨＩで開き、Ｆａｓ抗原の膜貫通領域と機能発現領域を含むＰＣＲ生成物（Ｆａｓ−ＴＭ）および機能発現領域のみを含むＰＣＲ生成物（Ｆａｓ−△ＴＭ）（いずれも実施例１（１）で調製した。）のそれぞれのＫｐｎＩ−ＢａｍＨＩ断片を組み込んだ。これによって、Ｅｐｉが直接、Ｆａｓ抗原の膜貫通領域および機能発現領域、または機能発現領域と融合した配列が得られた。次にベクターをBamHI で開き、レチノイン酸受容体のリガンド結合領域（ＲＡＲα、実施例１（２）で調製した。）のＢｇｌ II −ＢａｍＨＩ断片を組み込んだ。必要な方向に組み込まれたプラスミドから、Ｅｐｉ−Ｆａｓ−ＲＡＲαの融合配列が得られた（以後、Ｅｐｉ−Ｆａｓ−ＴＭ−ＲＡＲαを融合配列１、またＥｐｉ−Ｆａｓ−△ＴＭ−ＲＡＲαを融合配列２と表わす）。一方、融合配列１、２それぞれの上流域のHind IIIサイトに、同末端を持つＦａｓ抗原のシグナル配列（Ｆａｓ−ｓｉｇ）を導入した。方向を確認し、それぞれ融合配列１および２に相当するＦａｓ抗原のシグナル配列を持つ融合配列３および４を得た。
同様にして、Ｅｐｉ−Ｆａｓ−ＴＭ−ＥＲの融合配列を得た（以後、融合配列５と表わす）。
【００５２】
実施例３ 融合蛋白発現系の構築
融合蛋白発現系の概念を図３に示す（図中、＊は融合配列５のＤＮＡを作製するときの（ＮｈｅＩ）を示す）。
イズミ（Izumi ）らによって報告されているベクターｐＳＶ２ｂｓｒ（Exp. Cell. Res.,197, 229, (1991)に記載）よりブラスチサイジンＳ耐性部分（EcoRI-PvuII 断片）を切り出した。発現ベクターｐＥＦＢＯＳ（Nuc. Acid Res., 18, 5322 (1990)に記載）の２箇所のＥｃｏＲＩサイトのうち、ＥＦ−１αプロモーターの３′側にあるもののみ欠失させ、残りのサイトに上記の断片（ブラスチサイジンＳ耐性部分）を平滑末端化した後に導入した。融合配列１、２をＨｉｎｄＩＩＩ−ＢａｍＨＩで、融合配列３、４をＮｏｔＩ−ＢａｍＨＩで、さらに融合配列５をＨｉｎｄＩＩＩ−ＮｈｅＩで切り出し、それぞれ平滑化した。ベクターｐＥＦＢＯＳｂｓｒのマルチクローニングサイトにおけるＢｓｔＸＩサイトを平滑化し、上記の融合配列を導入した。
【００５３】
得られた発現ベクターはＥｃｏＲＩで線形化し、通常のカルシウムホスフェート法にてマウス繊維芽細胞、Ｌ９２９及びヒト癌細胞、ＨｅＬａに導入した。Exp. Cell. Res., 197, 229, (1991) に記載されている方法（プラスチサイジンＳ選択）にて、融合蛋白を常時発現している細胞を選択した。
【００５４】
実施例４ ビタミンＡによる殺細胞アッセイ
それぞれの融合蛋白を常時発現している細胞、例えばＬ９２９を2.5 ×１０4 個／１００μｌの割合で１０％のＦＣＳ（牛胎児血清）を含むＤＭＥＭ（ダルベッコ変法イーグル培地）に浮遊させ、９６穴のマイクロタイタープレートに分配した。５％炭酸ガス中に、３７℃にて２４時間培養した。ビタミンＡの最終濃度の２倍の濃度の試料を同培養液中に調整し、１００μl を加えた。そのまま更に１５時間培養し、上清を捨てた後にクリスタル・バイオレット（0.75％クリスタルバイオレットの５０％エタノール溶液、0.25％のＮａＣｌ、1.75％のホルムアルデヒド、室温、２０分）で生細胞を染色した（Cell, 66, 233 (1991)に記載の方法）Ｉｔｏｈらの文献記載の方法）。ＰＢＳ（フォスフェートバッファーセーライン）で２回洗浄した後、直接マイクロＥＬＩＳＡリーダーで５４０ｎｍの吸光度を測定した。
【００５５】
図４にビタミンＡ処理時の生細胞数の経時変化を示す。また、図５にビタミンＡの濃度変化を示す（図中、黒丸は融合蛋白発現系を導入した細胞であり、白丸は融合蛋白発現系を導入していない細胞である）。これらの結果は融合配列１を導入した細胞を用いた実験から得られたものである。１μＭのビタミンＡで誘発させた細胞死は、８時間後に９０％以上完結する。また、１５時間後検定におけるビタミンＡの作用は濃度依存性であり、その５０％作用濃度（ＩＣ５０）は約0.1 μＭであった。
【００５６】
なお、融合配列２または４を導入した細胞では、上記の「リガンド特異的細胞死の誘導」現象は全く観測されなかった。Ｆａｓ抗原のシグナル配列（Ｓｉｇ）を付加した融合配列３に於ける結果は、上記の融合配列１による結果と同様であり両者の効果は、ビタミンＡの濃度依存性、反応の経時変化において区別出来ないものであった。
【００５７】
以上の結果は、従来報告されていた転写因子等を用いた融合蛋白と異なり、Ｆａｓ抗原の場合は、機能発現領域だけを融合させてもシグナル伝達は行われず、膜貫通領域が必須であることを示している。また、細胞核内受容体のサブファミリーのリガンド結合領域を結合された融合蛋白でもシグナルが伝達されることを示している。さらに、Ｆａｓ抗原と細胞核内受容体が互いに異種動物のものであってもシグナルが伝達されること、および異種動物の細胞にアポトーシスを起こすことも確認された。
【００５８】
実施例５ エストロジェンによる殺細胞アッセイ
実施例４と同様にして、それぞれの融合蛋白を常時発現している細胞を培養し、エストロジェンの添加後、培養、染色して吸光度を測定した。
図６にエストロジェンの濃度変化を示す（図中、黒四角は融合蛋白発現系を導入した細胞であり、白四角は融合蛋白発現系を導入していない細胞である）。１５時間後検定におけるエストロジェンの作用は濃度依存性であり、その５０％作用濃度（ＩＣ５０）は約0.1 ｎＭであった。この結果は、Ｆａｓ抗原のアポトーシス機能は、ステロイド受容体のリガンド結合領域を結合した融合蛋白でも発現することを示している。
【００５９】
【配列表】
配列番号：１
配列の長さ：３５
配列の型：核酸
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列
CACCATGGGT ACCAGCAATA CAAACTGCAG GAAAC
【００６０】
配列番号：２
配列の長さ：３９
配列の型：核酸
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列
GAAGCCATGG GTACCCAGGA AGCTAAAAAA TTTGCTCGA
【００６１】
配列番号：３
配列の長さ：３２
配列の型：核酸
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列
TCAGGATCCA GACATTGTCC TTCATTTTCA TT
【００６２】
配列番号：４
配列の長さ：４５
配列の型：核酸
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列
CTGAAGCTTC GCGGCCGCAC CATGCTGTGG ATCTGGGCTG TCCTG
【００６３】
配列番号：５
配列の長さ：３０
配列の型：核酸
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列
CCTCCTAAGC TTTAAACTCT CGGAGATGCT
【００６４】
配列番号：６
配列の長さ：３４
配列の型：核酸
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列
GGCAGATCTC TCTGAGAGCT ACACGCTGAC GCCG
【００６５】
配列番号：７
配列の長さ：３３
配列の型：核酸
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列
CGTGGATCCT CACGGGGAGT GGGTGGCCGG GCT
【００６６】
配列番号：８
配列の長さ：３３
配列の型：核酸
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列
CGAAAGGATC CGGGCACTTC AGGAGACATG AGA
【００６７】
配列番号：９
配列の長さ：３０
配列の型：核酸
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列
TGGGGTACCT GGGAGTTCTC AGATGGTGTT
【００６８】
配列番号：１０
配列の長さ：５８
配列の型：核酸
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列
AGCTTGGCGC CACCATGGTG TACCCCTACG ACGTGCCCGA CTATGCCAGC CTGGGTAC
【図面の簡単な説明】
【図１】 ＰＣＲプライマーの調製方法の概念図である。
【図２】 融合蛋白をコードするｃＤＮＡの構築図である。
【図３】 融合蛋白発現系の概念図である
【図４】 ビタミンＡによるアポトーシスアッセイにおける投与時間と生細胞数の関係を示すグラフである。
【図５】 ビタミンＡによるアポトーシスアッセイにおけるビタミンＡの濃度と生細胞数の関係を示すグラフである。
【図６】 エストロジェンによるアポトーシスアッセイにおけるエストロジェンの濃度と生細胞数の関係を示すグラフである。
Claims (22)
- マウスＦａｓ抗原の１３６番目から３０５番目までのアミノ酸配列またはヒトＦａｓ抗原の１４５番目から３１９番目までのアミノ酸配列を含むアミノ酸配列（ただし、Ｆａｓ抗原の細胞外領域を含まない。）のＣ末端に、細胞核内受容体のリガンド結合領域を含むアミノ酸配列を結合させた融合蛋白。
- マウスＦａｓ抗原の１３６番目から３０５番目までのアミノ酸配列またはヒトＦａｓ抗原の１４５番目から３１９番目までのアミノ酸配列を含むアミノ酸配列（ただし、Ｆａｓ抗原の細胞外領域を含まない。）のＮ末端に、マウスＦａｓ抗原の−２１番目から１４番目までのアミノ酸配列またはヒトＦａｓ抗原の−１６番目から２３番目までのアミノ酸配列を結合させた請求項１記載の融合蛋白。
- 細胞核内受容体がステロイド受容体である請求項１または２項に記載の融合蛋白。
- 細胞核内受容体がエストロジェン受容体である請求項３記載の融合蛋白。
- 細胞核内受容体のリガンド結合領域を含むアミノ酸配列がヒトエストロジエン受容体の３１１番目から５５１番目までのアミノ酸配列、またはラットエストロジエン受容体の３０７番目から５５７番目までのアミノ酸配列である請求項４記載の融合蛋白。
- 細胞核内受容体がレチノイド受容体である請求項１または２項に記載の融合蛋白。
- 細胞核内受容体がレチノイドＸ受容体である請求項６記載の融合蛋白。
- 細胞核内受容体のリガンド結合領域を含むアミノ酸配列が、ヒトレチノイドＸ受容体αの２２５番目から４６２番目までのアミノ酸配列、ヒトレチノイドＸ受容体βの２９７番目から５２６番目までのアミノ酸配列、マウスレチノイドＸ受容体αの２３０番目から４６７番目までのアミノ酸配列、マウスレチノイドＸ受容体βの１７１番目から４１０番目までのアミノ酸配列、またはマウスレチノイドＸ受容体γの２２９番目から４６３番目までのアミノ酸配列である請求項７記載の融合蛋白。
- 細胞核内受容体がレチノイン酸受容体である請求項６記載の融合蛋白。
- 細胞核内受容体のリガンド結合領域を含むアミノ酸配列が、ヒトレチノイン酸受容体αの１９８番目から４６２番目までのアミノ酸配列、ヒトレチノイン酸受容体βの１９１番目から４４８番目までのアミノ酸配列、ヒトレチノイン酸受容体γの２００番目から４５４番目までのアミノ酸配列、マウスレチノイン酸受容体αの１９８番目から４６２番目までのアミノ酸配列、マウスレチノイン酸受容体βの１９０番目から４４８番目までのアミノ酸配列、またはマウスレチノイン酸受容体γの２００番目から４５８番目までのアミノ酸配列である請求項９記載の融合蛋白。
- 細胞核内受容体がビタミンＤ3受容体である請求項１または２項に記載の融合蛋白。
- 細胞核内受容体が甲状腺ホルモン受容体である請求項１または２項に記載の融合蛋白。
- マウスＦａｓ抗原の１３６番目から３０５番目までのアミノ酸配列のＣ末端に、またはヒトＦａｓ抗原の１４５番目から３１９番目までのアミノ酸配列のＣ末端に、ヒトエストロジエン受容体の２８１番目から５９５番目までのアミノ酸配列、またはラットエストロジエン受容体の２８６番目から６００番目までのアミノ酸配列を結合させた請求項１記載の融合蛋白。
- マウスＦａｓ抗原の１３６番目から３０５番目までのアミノ酸配列のＣ末端に、またはヒトＦａｓ抗原の１４５番目から３１９番目までのアミノ酸配列のＣ末端に、ヒトレチノイン酸受容体αの１７６番目から４６２番目までのアミノ酸配列、またはマウスレチノイン酸受容体αの１７７番目から４５８番目までのアミノ酸配列を結合させた請求項１記載の融合蛋白。
- 請求項１に記載された融合蛋白をコードするＤＮＡ。
- 請求項１乃至１２のいずれかの項に記載された融合蛋白をコードするＤＮＡ。
- 請求項１３または１４に記載された融合蛋白をコードするＤＮＡ。
- 請求項１５に記載されたＤＮＡを含む複製または発現ベクター。
- 請求項１８に記載された複製または発現ベクターで形質転換された宿主細胞。
- 請求項１８に記載された発現ベクターを有効成分として含有するガンまたは自己免疫疾患の治療剤。
- 請求項１９に記載された宿主細胞を用いることを特徴とする細胞核内受容体に対するアゴニストまたはアンタゴニストのスクリーニング方法。
- 請求項１９に記載された宿主細胞が、マウス繊維芽細胞Ｌ９２９またはヒトガン細胞ＨｅＬａであることを特徴とする、エストロジェン受容体、レチノイドＸ受容体またはレチノイン酸受容体に対するアゴニストまたはアンタゴニストのスクリーニング方法。
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