JP3695511B2 - Bone regeneration material - Google Patents

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、新生骨組織形成を促進するための骨再生材料に関し、詳しくはその材料としてポリリン酸が使用されてなる骨再生材料に関する。
【０００２】
【従来の技術】
骨は、細胞と細胞外マトリックスからなる結合組織由来の特異化された硬化されたもので、骨のマトリックス中の他の結合組織から分化したものである。その主構成物質はヒドロキシアパタイト結晶（Ca₁₀(PO₄)₆(OH)₂)からなる燐酸カルシウムである。骨は、物理的応力を支え、応力から骨を防御する極めて硬い組織であるので、骨折や病理学的変化による骨の減少または損傷は、人の能力欠如を導き時間の浪費になる。現在、何らかの理由により骨が取り除かれたとき、人工骨で接続したり、身体の他の骨を使用して骨の再置換が行われたりしている。
【０００３】
また、物理的衝撃による骨の損傷（骨折）や外科手術に伴う骨の損傷の治療には、人工骨を含む各種の補綴用器具である骨の人工的中継ぎ、骨折箇所の不動化、固定化が行われており、骨が元の形と機能を取り戻すには長い時間を要し、患者の肉体的、精神的ストレスはかなり大きいのが現状である。また治癒に至るまでの課程が長ければ長いほど細菌感染の危険性にさらされる機会が増加し、完全治癒にいたらない危険もある。現在の骨格増大および再建のための選択材料には、セラミックス、複合材料、骨誘導体並びに天然および合成ホリマ−のような骨修復のための人工充填剤として機能することができる種々の材料が研究されている。
【０００４】
歯の場合、口上顎顔面部位中の骨質の骨折や喪失、あるいは病理学的・物理学的な創傷の治療において、歯を支える歯槽骨は歯の置換等で基礎になるものである。歯槽骨は細菌感染を受けやすく、一度感染または死滅させられると元のレベルまで再生しがたい。一般に、チタンを基材とした金属移植片を顎骨に挿入して人工歯を構築する移植は本来の歯の喪失に対しては有益であるが、この移植術は移植の周囲の身体の支持には不十分であり、隣接した骨構造に過度の咬合力を引き起こして、常に成功裏に行われていない。これらの問題を解決する治療法として、組織・骨の再生を促進する方法があり、欠損骨領域中の骨の再生を促進するために脱ミネラル化した骨、ヒドロキシアパタイト、他の移植代用品が使用されたりしているが十分な成果が発現されていない。
【０００５】
理想的な充填剤または移植材料は、生体適合性、滅菌性、骨誘導活性（骨形成に関して間葉細胞を骨芽細胞に表現型変換する刺激）および骨伝導活性（新生骨形成のための格子として作用）のような性質が必要である。また、充填剤は生分解性であり、免疫源性がなく、体組織的に毒性がないのが好ましい。しかし、現実にはこれらの要件を全部満たした材料はなく部分的に満たしたものがあるにすぎない。
【０００６】
【発明が解決しょうとする課題】
本発明の目的は、これら従来の骨治療手段、あるいは代替骨材料の欠点を克服するためになされたものであって、新生骨の形成を促進し、治癒、回復にいたるまでの時間を短縮することができる骨再生材料を提供することである。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
すなわち、本発明は直鎖縮合ポリリン酸または／およびポリリン酸塩が含有されてなる新生骨組織形成を促進するための骨再生材料である。
また、本発明は前記骨再生材料において、損傷をうけた骨の再生を促進するための材料が、生体適合性を有する材料からなる基材にポリリン酸塩が含有されてなる骨再生材料である。
更に、本発明は前記骨再生材料において、新生骨組織形成を促進するための材料が整形外科用充填物にポリリン酸が含有されてなる骨再生材料である。
更にまた、本発明は前記骨再生材料において、ポリリン酸に骨誘導蛋白質または／および骨誘導因子を含有する天然物質を混合してなる骨再生材料である。
【０００８】
【発明の実施の形態】
ポリリン酸は、オルトリン酸が脱水縮合して得られる直鎖縮合ポリリン酸が挙げられ、特に一般式が（Ｐ_ｎＯ_３ｎ＋１）^{（ｎ＋２）}Ｈで表され、２個以上のＰＯ_４四面体が頂点の酸素原子を共有して直鎖状に連なった構造をした直鎖縮合ポリリン酸が挙げられる。ポリリン酸の水酸基の水素が金属と置換した分子構造をしたものがポリリン酸塩である。金属としてはナトリウム、カリウム等が挙げられる。ｎは１５〜２０００である。
【０００９】
生体適合性を有する材料からなる基材としては、生体適合性を有する合成高分子、天然材料等からなるシ−ト、フイルム、繊維、多孔体等が挙げられる。ポリリン酸は、これらの材料に混合されたり、基材の表面にコ−チングされたり、繊維および多孔体に含浸されたりして使用される。合成高分子としては、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリ塩化ビニル、ポリエステル、ポリカ−ボネ−ト、セルロ−ス、ポリアミド、ポリフッ化エチレン、ポリウレタン等のような生体非吸収高分子、あるいはポリグリコ−ル酸、ポリラクチド、コラ−ゲン、ポリビニルアルコ−ル、ポリビニルピロリドン、ポリアミノ酸、ポリカプロラクトン、ポリジオキサノン、酢酸ピニルと不飽和カルボン酸共重合体等のような生体吸収性高分子等が挙げられる。これらの生体適合性を有する材料にポリリン酸が含有されてなるが、生体適合性を有する材料に含有されるポリリン酸の含量は、 0.001〜20重量％、好ましくは 0.005〜10重量％、更に好ましくは１〜５重量％である。ポリリン酸の含量が20重量％を超えると、細胞が壊死する傾向があり、 0.001重量％未満であると、骨再生効果が少ない。
【００１０】
また、整形外科用充填物は、整形外科領域で骨充填剤として使用されている人工骨成分であって、ヒドロキシアパタイト、第２リン酸カルシウム、第３リン酸カルシウム、第４リン酸カルシウム等が挙げられる。また、骨誘導蛋白質としては、ＢＭＰ−１，ＢＭＰ−２，ＢＭＰ−３等の骨形態形成蛋白質(Bone Morphogenetic Protein)，ＴＧＦ−βのような形質転換成長因子（Transforming Growth Factor）、オステオポンチン、オステオカルシン等が挙げられる。更に、骨誘導因子を含む天然物質としては、動物骨粉砕物、鉱質消失骨基質等が挙げらる。骨誘導因子を含む天然物質は、骨誘導蛋白質と併用してポリリン酸に混合してインプラントまたはデバイスとして局所投与することができる。この場合、投与物質は発熱性物質を含まない、生理的に許容できる形態で骨損傷部位への供給に適した粘稠性形態で封入または注射される。それによって、骨損傷部位に硬骨、軟骨構造を形成し、最適状態で体内に再吸収されることができるマトリックスが形成される。
【００１１】
本発明の骨再生材料は、ポリリン酸を含有した骨原性製剤として、閉鎖骨折、複雑骨折の縮小、人工関節の固定改善等の予防的用途に使用される。また、骨原性製剤によって新たに骨形成が誘導され、先天的、外傷性、腫瘍切除による欠損箇所の修復に使用されたり、美容形成外科、歯周病の処置、他の歯修復プロセス等に使用されたりする。更に、本発明の骨再生材料は、シ−ト、フイルム、繊維、多孔体等の生体適合性を有する材料からなる基材の表面に、ポリリン酸を含有した材料がコ−チングされて使用される。
【００１２】
【実施例】
以下、本発明の一例を実施例にて説明する。
【実施例１】
白兎（ニュ−ジランド産、体重３kg）を麻酔注射をして大腿骨を露出させた。滅菌したドリル（直径３mm）を用いて、ドリルの先端が大腿骨の中の軟組織に達するまで大腿骨頭と大腿骨の末端である関節丘付近に２つの穴をあけた。１cm×１cmのコラ−ゲンテ−プ（CollaTape 、Calcitec社製）に30μl の２％ポリリン酸ナトリウム塩（平均鎖長75）水溶液をしみこませ、無菌的に乾燥させた。そのコラ−ゲンテ−プを白兎の右脚の大腿骨にあけた穴に詰めた。また、対照品として滅菌水をしみこませたコラ−ゲンテ−プを左脚の大腿骨にあけた穴に詰めた。この状態で切開部分を縫合し、１週間および２週間後の大腿骨部の穴における新生骨再生の状態を観察した。観察のため摘出した大腿骨を10％ホルマリンで固定した。
【００１３】
図１および図２は、１週間後の穴の部分を縦方向に切断し実体顕微鏡で観察したものである。図１は滅菌水をしみこませたコラ−ゲンテ−プで処理したもの、図２はポリリン酸水溶液をしみこませたコラ−ゲンテ−プで処理したものである。図１の滅菌水をしみこませたコラ−ゲンテ−プでは新生骨の形成は全く観察されなかったが、図２のポリリン酸水溶液をしみこませたコラ−ゲンテ−プは穴の底縁周辺に相当量の新生骨の形成が確認され軟組織にまで伸びているのが観察された。
【００１４】
前記と同じ滅菌水をしみこませたコラ−ゲンテ−プとポリリン酸水溶液をしみこませたコラ−ゲンテ−プを用いて、１週間および２週間後の大腿骨部の穴における新生骨再生の要すを組織学的に観察する目的で大腿骨の穴の部分の組織サンプルの一部を取り出し、10％EDTAで２ケ月間処理し脱石灰化を行った。脱石灰化を行ったサンプルは、種々の濃度のエタノ−ルと最終段階としてキシレンで脱水しパラフィンで包埋した。包埋したサンプルを５μm の厚さで切片を切り、Azan染色を行い顕微鏡下で観察した。１週間後の組織状態について、滅菌水をしみこませたコラ−ゲンテ−プで処理したものを図３、ポリリン酸水溶液をしみこませたコラ−ゲンテ−プで処理したものを図４に示した。
【００１５】
滅菌水をしみこませたコラ−ゲンテ−プで処理したものでは、図３で明らかなように、コラ−ゲンテ−プ（Ｃ）は繊維状組織（Ｆ）に覆われ、緻密骨（Ｂ）の骨内膜由来の骨小柱（ＴＢ）がその繊維性組織に接近しつつあった。これに対し、ポリリン酸水溶液をしみこませたコラ−ゲンテ−プで処理した図４のものでは、コラ−ゲンテ−プは殆ど吸収され、繊維状組織（Ｆ）に置換していた。また、緻密骨（Ｂ）由来ではなく、穴中の新生繊維状組織に由来する未熟な繊維状骨小柱の塊（＊）が既に繊維状組織中の６ケ所に確認できた。
【００１６】
次に、２週間後の状態については、滅菌水をしみこませたコラ−ゲンテ−プで処理したものは図５に、ポリリン酸水溶液をしみこませたコラ−ゲンテ−プで処理したものは図６に示した。滅菌水をしみこませたコラ−ゲンテ−プで処理したものでは図５に示すように、穴の両端は骨小柱（TB）によってつながっているが、コラ−ゲンテ−プ（Ｃ）は完全に吸収されておらず、骨内膜由来の骨小柱(TB)がコラ−ゲンテ−プ（Ｃ）を取り囲んで仮骨を形成していた。これに対し、ポリリン酸水溶液をしみこませたコラ−ゲンテ−プで処理したものは、図６に示すようにコラ−ゲンテ−プはほぼ完全に吸収され確認できなかった。また、新たに形成された１次骨である骨小柱が互いに接着しコラ−ゲンテ−プと置換していた。コラ−ゲンテ−プと置換した新生繊維組織に由来する骨小柱（＊）は、骨内膜由来の骨小柱と結合し、２つの異なった起源の骨小柱によって仮骨が形成され、それらが穴の両端を繋ぐ形で穴を修復していた。
【００１７】
【実施例２】
実施例１と同様にして白兎の大腿骨に穴をあけ、脱ミネラル化したヒトの骨粉砕物（粒径 250〜300 μm)10mgに、２％ポリリン酸ナトリウム塩（平均鎖長75）水溶液30μl をしみこませ無菌的に乾燥させた。その骨粉砕物を白兎の右脚の大腿骨にあけた穴につめた。また、対照品として滅菌水をしみこませた骨粉砕物を白兎の左脚の大腿骨にあけた穴に詰めた。この状態で切開部分を縫合し、実施例１と同様な方法で２週間後の大腿骨部の穴における新生骨再生の様子を組織学的に観察した。図７は、滅菌水をしみこませた骨粉砕物で処理した顕微鏡写真の結果で、穴は主に骨粉(DB)と繊維状組織(F) によって満たされ、まばらに新生骨小柱が観察される程度であった。図８は、ポリリン酸水溶液をしみこませた骨粉砕物で処理した顕微鏡写真の結果で、穴は新生骨小柱（＊）および骨粉(DB)で満たされていた。
【００１８】
【実施例３】
実施例１と同様にして白兎の大腿骨に穴をあけ、コラ−ゲンテ−プに種々の鎖長のポリリン酸ナトリウム塩（Polyphosphate glass, Sigma社製）の２％水溶液30μl をしみこませ、無菌的に乾燥させた。そのコラ−ゲンテ−プを白兎の右脚の大腿骨にあけた穴に詰めた。また、対照品として滅菌水をしみこませたコラ−ゲンテ−プを白兎の左脚の大腿骨にあけた穴に詰めた。この状態で切開部分を縫合し、２週間後の大腿骨部の穴における新生骨再生の様子を組織学的に観察した。使用したポリリン酸ナトリウム塩の鎖長は、リン酸基に換算して(1) 平均鎖長15(Na₁₇P₁₅O₄₆) (2)平均鎖長 25 (Na₂₇P₂₅O₇₆)(3) 平均鎖長 35 (Na₃₇P₃₅O₁₀₆) (4) 平均鎖長 65 (Na₆₇P₆₅O₁₉₆) であった。
いずれのポリリン酸を使用して行った実験においても新生骨形成は促進され、ポリリン酸の鎖長に影響されないで新生骨形成は促進された。
【００１９】
【実施例４】
ポリリン酸の骨分化誘導効果を確かめるために、正常ヒト骨芽細胞(Bio Whittaker社製）を培養し、ポリリン酸添加時の細胞の骨分化の度合いを、アルカリ性フオスフアタ−ゼ活性を指標として測定することにより、in vitroの系で評価した。
細胞が新生骨を形成する際に、骨芽細胞のアルカリ性フオスフアタ−ゼ活性が上昇する性質はよく知られており、この活性の上昇が新生骨形成の指標となる。正常ヒト骨芽細胞を10,000 cells/cm²で35mmカルチア−デイッシュに撒き、10％子牛血清を含む骨芽細胞基本培地(Bio Whittaker社）で48時間培養した。その後１mMのポリリン酸ナトリウム塩（平均鎖長75）を含む培養液と交換し、細胞のアルカリ性フオスフアタ−ゼ活性を１日毎に測定した。また、ポリリン酸を含む培養液は、測定開始後３日毎に交換した。
【００２０】
アルカリ性フオスフアタ−ゼ活性は下記の方法で測定した。
細胞をPBS[20mM Na₃PO₄ 緩衝液(pH 7.0)と150mM NaClの混合液]で洗浄後、トリプシンEDTAにてデイッシュより剥離し、PBSに懸濁した。遠心分離により細胞を分離し、上清液を除去した。この細胞を含有する液１mlのTBS[20mM Tris-HCl(pH 7.5)と150mM NaClの混合液〕に懸濁した。超音波細胞破砕装置を用いて細胞を破砕した後、この懸濁液を再度遠心分離し、その上清液を粗酵素液とした。粗酵素液中の蛋白濃度（Ａ）をバイオラッド・プロテインアッセイキット(BIORAD社製）を用いて測定した。次に、1.2M Tris-HCl(pH 8.2)と20mM p-Nitrophenyl phosphate disodiumを１：１の比で混合した基質溶液に、粗酵素液を適当量加え、28℃で所定時間（Δｔ）反応させ、2M K₂HPO₄を加えて反応を停止させた後、410nmの吸光度（Ｂ）を測定して、以下の式に従ってアルカリ性フオスフアタ−ゼ活性を算出した。
【００２１】
【数１】

【００２２】
培養時間を増やしていった際におけるポリリン酸ナトリウム塩のアルカリ性フオスフアタ−ゼ活性の経時変化を図９に示す。
【００２３】
【比較例１】
実施例４で使用したポリリン酸ナトリウム塩（平均鎖長75）の代わりに、リン酸ナトリウム緩衝液を、リン酸濃度に換算してポリリン酸と同濃度培養液に加えて所定時間培養し、アルカリ性フオスフアタ−ゼ活性を測定した。
リン酸ナトリウム緩衝液のアルカリ性フオスフアタ−ゼ活性の経時変化を図９に示す。
図９から明らかなように、ポリリン酸処理した実施例４の細胞は、１週間後から顕著な酵素活性の上昇がみられたが、リン酸緩衝液で処理した比較例１の細胞は顕著な酵素活性の上昇はみられなかった。すなわち、細胞にポリリン酸を添加することによって骨芽細胞の分化（骨形成）が促進されたことを示している。
【００２４】
【発明の効果】
本発明の骨再生材料を、物理的衝撃による骨折や損傷、外科手術によって損傷した骨の治療に、新生骨の形成を促進し、治癒、回復にいたるまでの時間を短縮することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】 滅菌水をしみこませたコラ−ゲンテ−プで処理した１週間後の大腿骨の穴の顕微鏡の実体を示す図面に変わる写真である。
【図２】 ポリリン酸水溶液をしみこませたコラ−ゲンテ−プで処理した１週間後の大腿骨の穴の顕微鏡の実体を示す図面に変わる写真である。
【図３】 滅菌水をしみこませたコラ−ゲンテ−プで処理した１週間後の大腿骨の穴における新生骨再生の様子を組織学的に顕微鏡で観察した図面に変わる写真である。
【図４】 ポリリン酸水溶液をしみこませたコラ−ゲンテ−プで処理した１週間後の大腿骨の穴における新生骨再生の様子を組織学的に顕微鏡で観察した図面に変わる写真である。
【図５】 滅菌水をしみこませたコラ−ゲンテ−プで処理した２週間後の大腿骨の穴における新生骨再生の様子を組織学的に顕微鏡で観察した図面に変わる写真である。
【図６】 ポリリン酸水溶液をしみこませたコラ−ゲンテ−プで処理した２週間後の大腿骨の穴における新生骨再生の様子を組織学的に顕微鏡で観察した図面に変わる写真である。
【図７】 滅菌水をしみこませた骨粉砕物で処理した２週間後の大腿骨の穴における新生骨再生の様子を組織学的に顕微鏡で観察した図面に変わる写真である。
【図８】 ポリリン酸水溶液をしみこませた骨粉砕物で処理した２週間後の大腿骨の穴における新生骨再生の様子を組織学的に顕微鏡で観察した図面に変わる写真である。
【図９】 ポリリン酸ナトリウム塩およびリン酸ナトリウム緩衝液のアルカリ性フオスフアタ−ゼ活性の経時変化。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a bone regeneration material for promoting the formation of new bone tissue, and particularly relates to a bone regeneration material using polyphosphoric acid as the material.
[0002]
[Prior art]
Bone is a specific, hardened bone derived from connective tissue consisting of cells and extracellular matrix, and differentiated from other connective tissue in the bone matrix. Its main constituent is calcium phosphate composed of hydroxyapatite crystals (Ca ₁₀ (PO ₄ ) ₆ (OH) ₂ ). Since bone is a very hard tissue that supports physical stress and protects bone from stress, bone loss or damage due to fractures or pathological changes leads to lack of human ability and wasted time. Currently, when a bone is removed for some reason, it is connected with an artificial bone, or another bone of the body is used for resubstitution.
[0003]
In addition, for the treatment of bone damage (fractures) caused by physical impact and bone damage caused by surgery, various types of prosthetic devices, including artificial bones, artificial joints for bones, immobilization and fixation of fractures It takes a long time for the bone to regain its original shape and function, and the physical and mental stress of the patient is quite large. Also, the longer the course to cure, the greater the chances of being exposed to the risk of bacterial infection and the risk of not being completely cured. Various materials that can function as artificial fillers for bone repair, such as ceramics, composite materials, bone derivatives and natural and synthetic polymers, have been studied as current selection materials for skeletal augmentation and reconstruction. ing.
[0004]
In the case of teeth, the alveolar bone that supports the teeth is the basis for tooth replacement in the treatment of bone fractures or loss in the maxillofacial region or pathological / physical wounds. Alveolar bone is susceptible to bacterial infection and is difficult to regenerate to its original level once infected or killed. In general, transplantation in which a titanium-based metal implant is inserted into the jawbone to construct an artificial tooth is beneficial for the loss of the original tooth, but this transplantation is used to support the body surrounding the implant. Is inadequate and causes excessive occlusal forces in adjacent bone structures and has not always been successful. As a treatment method to solve these problems, there is a method of promoting tissue / bone regeneration, and demineralized bone, hydroxyapatite, and other transplant substitutes to promote bone regeneration in the defective bone region. Although it has been used, sufficient results have not been achieved.
[0005]
The ideal filler or graft material is biocompatible, sterilizable, osteoinductive activity (stimulation that phenotypes mesenchymal cells into osteoblasts for bone formation) and osteoconductive activity (lattice for new bone formation) As a function). The filler is preferably biodegradable, has no immunogenicity, and is not toxic to the body tissue. However, in reality, there are no materials that satisfy all of these requirements, but only partially.
[0006]
[Problems to be solved by the invention]
The object of the present invention is to overcome the disadvantages of these conventional bone treatment means or alternative bone materials, and promotes the formation of new bone and shortens the time until healing and recovery. It is to provide a bone regeneration material that can be used.
[0007]
[Means for Solving the Problems]
That is, the present invention is a bone regeneration material for promoting new bone tissue formation containing a linear condensed polyphosphate or / and a polyphosphate.
In the bone regeneration material according to the present invention, the material for promoting regeneration of damaged bone is a bone regeneration material in which a polyphosphate is contained in a base material made of a biocompatible material. .
Furthermore, the present invention is the bone regeneration material according to the above-mentioned bone regeneration material, wherein the material for promoting the formation of new bone tissue is an orthopedic filler containing polyphosphoric acid.
Furthermore, the present invention provides a bone regeneration material obtained by mixing a natural substance containing an osteoinductive protein or / and an osteoinductive factor in polyphosphoric acid.
[0008]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
Examples of polyphosphoric acid include linear condensed polyphosphoric acid obtained by dehydration condensation of orthophosphoric acid. Particularly, the general formula is represented by (P _n O _{3n + 1} ) ^{(n + 2)} H, and two or more PO ₄ tetrahedra are apexes. linear condensed polyphosphate sharing of oxygen atoms to the continuous structure to a linear thereof. Polyphosphate has a molecular structure in which hydrogen of hydroxyl group of polyphosphoric acid is substituted with metal. Examples of the metal include sodium and potassium. n is 15-2000.
[0009]
Examples of the substrate made of a biocompatible material include sheets, films, fibers, porous bodies, and the like made of biocompatible synthetic polymers, natural materials, and the like. Polyphosphoric acid is mixed with these materials, coated on the surface of a substrate, or impregnated into fibers and porous materials. Synthetic polymers include non-bioabsorbable polymers such as polypropylene, polyethylene, polyvinyl chloride, polyester, polycarbonate, cellulose, polyamide, polyfluorinated ethylene, polyurethane, etc., or polyglycolic acid, polylactide And bioabsorbable polymers such as collagen, polyvinyl alcohol, polyvinylpyrrolidone, polyamino acid, polycaprolactone, polydioxanone, pinyl acetate and unsaturated carboxylic acid copolymer, and the like. Polyphosphoric acid is contained in these biocompatible materials. The content of polyphosphoric acid contained in the biocompatible material is 0.001 to 20% by weight, preferably 0.005 to 10% by weight, and more preferably. Is 1 to 5% by weight. If the polyphosphoric acid content exceeds 20 % by weight, the cells tend to be necrotic, and if it is less than 0.001% by weight, the bone regeneration effect is small.
[0010]
The orthopedic filler is an artificial bone component used as a bone filler in the orthopedic field, and examples thereof include hydroxyapatite, dicalcium phosphate, tricalcium phosphate, and tetracalcium phosphate. In addition, examples of osteoinductive proteins include Bone Morphogenetic Proteins such as BMP-1, BMP-2, and BMP-3, Transforming Growth Factors such as TGF-β, Osteopontin, and Osteocalcin. Etc. Furthermore, examples of natural substances containing osteoinductive factors include animal bone pulverized products and mineral-depleted bone matrix. Natural substances containing osteoinductive factors can be mixed with polyphosphoric acid in combination with osteoinductive proteins and administered locally as implants or devices. In this case, the administration substance is encapsulated or injected in a viscous form suitable for delivery to the bone injury site in a physiologically acceptable form, free from pyrogens. Thereby, a bone and cartilage structure is formed at the site of bone damage, and a matrix that can be resorbed into the body in an optimal state is formed.
[0011]
The bone regeneration material of the present invention is used as an osteogenic preparation containing polyphosphoric acid for preventive uses such as closed fractures, reduction of complicated fractures, and improvement of fixation of artificial joints. In addition, new osteogenesis is induced by osteogenic preparations, which are used for congenital, traumatic, tumor repair, and for restoration of defects, for cosmetic plastic surgery, treatment of periodontal disease, other dental restoration processes, etc. Or used. Furthermore, the bone regeneration material of the present invention is used by coating a material containing polyphosphoric acid on the surface of a base material made of a biocompatible material such as a sheet, a film, a fiber, or a porous material. The
[0012]
【Example】
Hereinafter, an example of the present invention will be described with reference to examples.
[Example 1]
A white rabbit (New Zealand, 3 kg body weight) was injected with anesthesia to expose the femur. Using a sterilized drill (3 mm in diameter), two holes were drilled near the femoral head and the condyle at the end of the femur until the tip of the drill reached the soft tissue in the femur. A 1 cm × 1 cm collagen tape (CollaTape, manufactured by Calcitec) was impregnated with 30 μl of a 2% aqueous solution of sodium polyphosphate (average chain length 75) and dried aseptically. The collagen tape was packed into a hole in the femur of the right leg of the white rabbit. In addition, a collagen tape soaked with sterilized water as a control product was packed in a hole formed in the femur of the left leg. In this state, the incised portion was sutured, and the state of new bone regeneration in the femoral hole after 1 week and 2 weeks was observed. The femur removed for observation was fixed with 10% formalin.
[0013]
FIG. 1 and FIG. 2 are the ones after one week, in which the hole is cut in the vertical direction and observed with a stereomicroscope. FIG. 1 shows a treatment with a collagen tape soaked with sterilized water, and FIG. 2 shows a treatment with a collagen tape soaked with a polyphosphoric acid aqueous solution. No formation of new bone was observed in the collagen tape soaked with sterilized water in FIG. 1, but the collagen tape soaked with the polyphosphate aqueous solution in FIG. 2 corresponds to the periphery of the bottom edge of the hole. It was observed that an amount of new bone was formed and extended to soft tissue.
[0014]
Using the collagen tape soaked with the same sterile water and the collagen tape soaked with the polyphosphate aqueous solution as described above, regeneration of new bone in the femoral hole after 1 and 2 weeks is necessary. For histological observation, a part of the tissue sample of the femoral hole was taken out and treated with 10% EDTA for 2 months for decalcification. The decalcified samples were dehydrated with various concentrations of ethanol and xylene as a final step and embedded in paraffin. The embedded sample was cut at a thickness of 5 μm, stained with Azan, and observed under a microscope. The tissue state after 1 week was treated with a collagen tape soaked with sterilized water, and FIG. 4 shows the tissue treated with a collagen tape soaked with a polyphosphoric acid aqueous solution.
[0015]
In the collagen tape soaked with sterilized water, the collagen tape (C) is covered with the fibrous tissue (F) as shown in FIG. 3, and the dense bone (B) The trabecular bone (TB) from the endosteum was approaching its fibrous tissue. In contrast, in the case of FIG. 4 treated with a collagen tape soaked with an aqueous polyphosphoric acid solution, the collagen tape was almost absorbed and replaced with a fibrous structure (F). In addition, immature fibrous bone trabecular clumps (*) derived not from the dense bone (B) but derived from the new fibrous tissue in the hole were already confirmed at six locations in the fibrous tissue.
[0016]
Next, with regard to the state after 2 weeks, FIG. 5 shows that treated with a collagen tape soaked with sterilized water, and FIG. 6 shows that treated with a collagen tape soaked with a polyphosphoric acid aqueous solution. It was shown to. As shown in Fig. 5, the collagen tape treated with sterilized water is connected to both ends of the hole by the trabecular bone (TB), but the collagen tape (C) is completely The bone trabeculae (TB) derived from the endosteum surrounded the collagen tape (C) and formed a callus bone. On the other hand, the collagen tape treated with the collagen tape soaked with the polyphosphoric acid aqueous solution was almost completely absorbed as shown in FIG. 6 and could not be confirmed. In addition, bone trabeculae, which are newly formed primary bones, adhered to each other and replaced with collagen tape. Bone trabeculae (*) derived from neoplastic tissue replaced with collagen tape are combined with bone trabeculae derived from endosteum, and callus is formed by bone trabeculae of two different origins, They repaired the hole by connecting the ends of the hole.
[0017]
[Example 2]
In the same manner as in Example 1, a femur of white birch was punctured and demineralized human bone crushed material (particle size 250-300 μm) 10 mg 2% sodium polyphosphate (average chain length 75) aqueous solution 30 μl And aseptically dried. The bone crush was pinched in a hole in the femur of the right leg of the white rabbit. Further, as a control, a pulverized bone soaked with sterilized water was packed in a hole formed in the femur of the left leg of the white rabbit. In this state, the incised portion was sutured, and the appearance of new bone regeneration in the femoral hole two weeks later was observed histologically in the same manner as in Example 1. Fig. 7 shows the result of a micrograph processed with a crushed bone soaked in sterile water. The holes were mainly filled with bone powder (DB) and fibrous tissue (F), and new bone trabeculae were observed sparsely. It was about. FIG. 8 is a result of a micrograph treated with a bone pulverized product impregnated with an aqueous polyphosphoric acid solution. The holes were filled with new bone trabeculae (*) and bone powder (DB).
[0018]
[Example 3]
In the same manner as in Example 1, a hole was made in the femur of a white rabbit, and a collagen tape was soaked with 30 μl of a 2% aqueous solution of polyphosphate sodium salt (Polyphosphate glass, manufactured by Sigma) with various chain lengths and aseptic Dried. The collagen tape was packed into a hole in the femur of the right leg of the white rabbit. Further, a collagen tape soaked with sterilized water as a control product was packed in a hole formed in the femur of the left leg of the white rabbit. In this state, the incised portion was sutured, and the appearance of new bone regeneration in the femoral hole 2 weeks later was observed histologically. The chain length of the polyphosphate sodium salt used was calculated as (1) average chain length 15 (Na ₁₇ P ₁₅ O ₄₆ ) (2) average chain length 25 (Na ₂₇ P ₂₅ O ₇₆ ) (3 ) Average chain length 35 (Na ₃₇ P ₃₅ O ₁₀₆ ) (4) Average chain length 65 (Na ₆₇ P ₆₅ O ₁₉₆ ).
In experiments conducted using any of the polyphosphates, new bone formation was promoted, and new bone formation was promoted without being affected by the chain length of the polyphosphate.
[0019]
[Example 4]
In order to confirm the bone differentiation-inducing effect of polyphosphate, normal human osteoblasts (manufactured by Bio Whittaker) are cultured, and the degree of bone differentiation of the cells when polyphosphate is added is measured using alkaline phosphatase activity as an index. Therefore, it was evaluated in an in vitro system.
It is well known that the alkaline phosphatase activity of osteoblasts increases when cells form new bone, and this increase in activity is an indicator of new bone formation. Normal human osteoblasts were seeded on a 35 mm culture dish at 10,000 cells / cm ² and cultured in osteoblast basic medium (Bio Whittaker) containing 10% calf serum for 48 hours. Thereafter, the medium was replaced with a culture solution containing 1 mM sodium polyphosphate (average chain length 75), and the alkaline phosphatase activity of the cells was measured every day. The culture solution containing polyphosphoric acid was changed every 3 days after the start of measurement.
[0020]
The alkaline phosphatase activity was measured by the following method.
The cells were washed with PBS [mixture of 20 mM Na ₃ PO ₄ buffer (pH 7.0) and 150 mM NaCl], detached from the dish with trypsin EDTA, and suspended in PBS. Cells were separated by centrifugation and the supernatant was removed. The cell-containing solution was suspended in 1 ml of TBS [mixture of 20 mM Tris-HCl (pH 7.5) and 150 mM NaCl]. After disrupting the cells using an ultrasonic cell disrupter, the suspension was centrifuged again, and the supernatant was used as a crude enzyme solution. The protein concentration (A) in the crude enzyme solution was measured using a Bio-Rad protein assay kit (BIORAD). Next, an appropriate amount of the crude enzyme solution is added to a substrate solution in which 1.2 M Tris-HCl (pH 8.2) and 20 mM p-Nitrophenyl phosphate disodium are mixed at a ratio of 1: 1, and reacted at 28 ° C. for a predetermined time (Δt). Then, 2M K ₂ HPO ₄ was added to stop the reaction, the absorbance (B) at 410 nm was measured, and the alkaline phosphatase activity was calculated according to the following formula.
[0021]
[Expression 1]

[0022]
FIG. 9 shows the time course of the alkaline phosphatase activity of sodium polyphosphate when the culture time was increased.
[0023]
[Comparative Example 1]
Instead of the polyphosphate sodium salt (average chain length 75) used in Example 4, the sodium phosphate buffer was converted to the phosphate concentration and added to the culture solution having the same concentration as the polyphosphate, and cultured for a predetermined time. The phosphatase activity was measured.
FIG. 9 shows the time course of the alkaline phosphatase activity of the sodium phosphate buffer.
As is clear from FIG. 9, the cells of Example 4 treated with polyphosphate showed a marked increase in enzyme activity after 1 week, but the cells of Comparative Example 1 treated with phosphate buffer were marked. There was no increase in enzyme activity. That is, it is shown that osteoblast differentiation (bone formation) was promoted by adding polyphosphoric acid to the cells.
[0024]
【The invention's effect】
The bone regenerating material of the present invention can promote the formation of new bone and shorten the time required for healing and recovery in the treatment of bone fractures and injuries caused by physical impact and bones damaged by surgery.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a photograph instead of a drawing showing the microscopic substance of a femoral hole one week after treatment with a collagen tape soaked with sterilized water.
FIG. 2 is a photograph instead of a drawing showing the substance of a microscopic view of a femoral hole one week after treatment with a collagen tape soaked with an aqueous polyphosphoric acid solution.
FIG. 3 is a photograph changed to a drawing obtained by histologically observing a state of new bone regeneration in a hole of a femur one week after treatment with a collagen tape soaked with sterilized water.
FIG. 4 is a photograph changed to a drawing in which a state of new bone regeneration in a femoral hole one week after treatment with a collagen tape soaked with an aqueous polyphosphoric acid solution is observed histologically under a microscope.
FIG. 5 is a photograph in place of a drawing in which the appearance of new bone regeneration in the femoral hole two weeks after treatment with collagen tape soaked with sterilized water was observed histologically under a microscope.
FIG. 6 is a photograph changed to a drawing in which the appearance of new bone regeneration in a hole in a femur two weeks after treatment with a collagen tape soaked with an aqueous solution of polyphosphoric acid is observed histologically under a microscope.
FIG. 7 is a photograph in place of a drawing obtained by histologically observing a state of regenerating new bone in a hole of a femur two weeks after treatment with a bone pulverized product soaked with sterilized water.
FIG. 8 is a photograph in place of a drawing obtained by histologically observing a state of new bone regeneration in a hole of a femur two weeks after treatment with a bone pulverized product soaked with an aqueous polyphosphate solution.
FIG. 9: Time course of alkaline phosphatase activity of polyphosphate sodium salt and sodium phosphate buffer.

Claims (9)

一般式
（Ｐ _ｎ Ｏ _３ｎ＋１ ） ^{（ｎ＋２）} Ｈ〔式中、ｎは１５〜２０００を示す〕で表される、オルトリン酸が脱水縮合して得られる直鎖縮合ポリリン酸が含有されてなる新生骨組織形成を促進するための骨再生材料。 General formula
(P _n O _{3n + 1} ) ^{(n + 2)} H ^(where n represents 15 to 2000), and a new bone tissue formation containing a linear condensed polyphosphoric acid obtained by dehydration condensation of orthophosphoric acid To promote bone regeneration material. ポリリン酸がポリリン酸塩である請求項１記載の骨再生材料。The bone regeneration material according to claim 1, wherein the polyphosphoric acid is a polyphosphate. ポリリン酸塩がポリリン酸ナトリウムまたはカリウムである請求項２記載の骨再生材料。The bone regeneration material according to claim 2, wherein the polyphosphate is sodium or potassium polyphosphate. 生体適合性を有する材料からなる基材にポリリン酸が含有されてなる請求項１〜３のいずれかに記載の骨再生材料。The bone regeneration material according to any one of claims 1 to 3 , wherein polyphosphoric acid is contained in a base material made of a biocompatible material. ポリリン酸が生体適合性を有する材料に０．００１〜２０重量％含有されてなる請求項４記載の骨再生材料。The bone regeneration material according to claim 4, wherein the polyphosphoric acid is contained in a biocompatible material in an amount of 0.001 to 20% by weight. 生体適合性を有する材料からなる基材が、シート状に形成されてなる請求項１〜５のいずれかに記載の骨再生材料。The bone regeneration material according to any one of claims 1 to 5 , wherein the base material made of a biocompatible material is formed into a sheet shape. 整形外科用充填物にポリリン酸が含有されてなる請求項１または２に記載の骨再生材料。The bone regeneration material according to claim 1 or 2 , wherein the orthopedic filling contains polyphosphoric acid. ポリリン酸にＢＭＰ−１、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−３、ＴＧＦ−β、オステオポンチン及びオステオカルシンから選択される骨誘導蛋白質が混合されてなる請求項１〜７のいずれかに記載の骨再生材料。The bone regeneration material according to any one of claims 1 to 7 , wherein a bone induction protein selected from BMP-1, BMP-2, BMP-3, TGF-β, osteopontin and osteocalcin is mixed with polyphosphoric acid. ポリリン酸に動物骨粉砕物及び鉱質消失骨気質から選択される骨誘導因子を含有する天然物質が混合されてなる請求項１〜８記載の骨再生材料。Bone regeneration material of animal bones pulverized and natural materials containing osteoinductive factor selected from mineral loss bone disposition is formed by mixing claims 1-8, wherein the polyphosphoric acid.

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