JP3686482B2 - Control sample of hemoglobin A1C - Google Patents

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ヘモグロビンＡ_1Cの凍結乾燥復元後の保存性を格段に向上させたヘモグロビンＡ_1C の管理試料に関する技術分野に属する。
【０００２】
【従来の技術】
血液中のヘモグロビンは、α鎖Ｎ末端のアミノ酸のバリンのアミノ基とグルコースのアルデヒド基の間の非酵素的な反応によりグルコースと結合する。この結合の第一段階は、可逆的なシッフ塩基反応であるが、さらにアマドリ転移反応を経て不可逆的なケトアミンを形成する。このようにして生成するヘモグロビンとグルコースの結合物は、ヘモグロビンＡ_1C（以下、ＨｂＡ_1Cともいう）として知られている。
ヘモグロビンの血液中での寿命は約３ヵ月であり、その間グルコースと結合して生成するＨｂＡ_1Cが徐々に蓄積するが、その一方で寿命が尽きたＨｂＡ_1Cは逐次分解されていく。すなわち、ある時点で血液中に存在しているＨｂＡ_1Cの濃度は、その時点からヘモグロビンの寿命のおよそ半分の１〜２ヵ月程遡った過去の血液中のグルコース濃度、すなわち血糖濃度を平均的に反映するものである。
【０００３】
このような特徴を有するＨｂＡ_1Cは、一般的な糖尿病の指標である血糖濃度等のように一時的な変動が無く過去の血糖状態を正確に把握できる。そのため、血中のＨｂＡ_1C濃度は糖尿病患者の血糖コントロール指標として、今日重要である。
ＨｂＡ_1Cの定量法には、イオン交換カラムを使用した高速液体クロマトグラフィー（以下、ＨＰＬＣという），ｍ−アミノフェニルボロン酸をリガンドとして固定したアフィニティクロマトグラム担体を用いたアフィニティーカラム法，，ラテックス凝集法，免疫比濁法，等電点電気泳動法，フィチン酸法，チオバルビツール酸法等があるが、感度，特異性，再現性に優れており、また専用の簡便な自動分析機が普及したこともあって、ＨＰＬＣ法が臨床検査においては標準的な測定法となっている。
【０００４】
ここで問題となるのは、ＨｂＡ_1C測定における標準としたり、また測定機器や施設間、あるいはデータの継続性等の精度管理の基準として使用する「管理試料」を得ることである。ＨｂＡ_1C管理試料の製造方法についてはいくつかの検討例がある。例えば、赤血球の溶血液に保存料を添加して製造する方法（東独特許第１５０５４３号，米国特許第３５１９５７２号，英国特許第９３４４６１号）、シアンメトヘモグロビン，オキシヘモグロビン−ポリヒドロキシ化合物，一酸化炭素ヘモグロビンを用いて製造する方法〔ドイツ特許第３３１１４５８号，ヨーロッパ特許第７２４４０号，“Mosca.A.,et al., J.Clin.Chem. Clin. Biochem.23:361-364(1985)”〕、Ｎ−〔５−ニトロトロポン−２−イル〕ヘモグロビンとヘモグロビンとの混合物からなるもの（特公昭６３−１９８２８号公報）、ポリヒドロキシ化合物により全血から得られる溶血液を脱脂する方法（特開昭５８−３７５６１号公報）、シアンメトヘモグロビンに変換し凍結乾燥する方法（特開昭５９−１８３３７０号公報）、ＨｂＡ_1Cの代用としてアセチル化ヘモグロビンより製造する方法（特開平３−２２０４５７号公報）、ヘモグロビンを一酸化炭素ヘモグロビン，アザイドメトヘモグロビン又はシアンメトヘモグロビンに変換した状態でインビトロでグルコースとヘモグロビンとを結合させた後，不安定なシッフ塩基結合のものを還元剤により分解し，安定なＨｂＡ_1Cを回収して製造する方法（特表平６−５０８６９０号公報）等を挙げることができる。
なお、現在Ｂｉｏ−Ｒａｄ社の製品〔Bio-Rad Laboratories. Hemoglobin A1cMicro Column test Instruction Manual. March 1990〕をはじめとして、いくつかの製品が市販されているが、これらの製品の製法は明らかにされていない。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
このＨｂＡ_1Cの管理試料においては、実際の検体である新鮮血液と分析時の挙動が同等であることが必要である。
何故なら、ヘモグロビンは、時間，温度等の負荷によって、主に酸化による変性を起こし、酸化されたヘモグロビンであるメトヘモグロビンと、酸化していないヘモグロビンであるオキシヘモグロビンとは、その電荷が異なるからである。
【０００６】
ＨｂＡ_1Cの主流である上記のイオン交換ＨＰＬＣ法は、ＨｂＡ_1Cをその他のヘモグロビンとの電荷の差により分離するものであるが、上述のように酸化されたヘモグロビン（酸化されたＨｂＡ_1Cを含む）が混合すると、クトマトグラムの分離パターンが乱れ、非常に鋭敏なＨＰＬＣにおいては、新鮮血液本来のものとはかなり異なるものとなる。
よって、ＨｂＡ_1Cの管理試料としては、個々のロットが長期に継続することが要求される。また、この管理試料が凍結乾燥品の場合には、凍結乾燥時の安定性のみならず、使用時に精製水等を加え溶解し復元した後の安定性も要求される。
【０００７】
なお、このＨｂＡ_1Cの管理試料に要求される安定性を満たす従来の手段としては、例えば▲１▼始めから全成分をメトヘモグロビンとして、ヘモグロビンをそれ以上酸化変性する余地をなくし、全成分中での電荷の差を、ＨｂＡ_1Cとその他のヘモグロビンとの間のものだけとし、ＨｂＡ_1Cとその他のヘモグロビンとの分離を明確にする方法；▲２▼一酸化炭素と２価の状態のヘム鉄との結合が酸素のほぼ数万倍は強いことに着目し、全成分を一酸化炭素ヘモグロビンとして、ヘム鉄が３価に変わるヘモグロビンの酸化を防ぐ方法〔▲１▼▲２▼に該当する先行技術文献としては、前出のドイツ特許第３３１１４５８号，ヨーロッパ特許第７２４４０号，“Mosca.A.,et al., J.Clin.Chem. Clin. Biochem.23:361-364(1985)”；特開昭５９−１８３３７０号公報；特表平６−５０８６９０号公報〕等を挙げることができる。
【０００８】
しかしながら、これらの方法における問題点として、全体がメトヘモグロビンの場合は、ＨＰＬＣ法の分離パターンが新鮮血液と同一であっても全体的にリテンションタイムが新鮮血液のリテンションタイムから外れるために、新鮮血液のための機器調整等に必ずしも適合するものではなく、メト化したＨｂＡ_1Cのリテンションタイムに基づき機器の調整をした場合、新鮮血液の本来のＨｂＡ_1CのピークをＨｂＡ_1Cのものとして機器が識別することができないという点が挙げられる。また、新鮮血液のＨｂＡ_1Cのピークに異常が現れるようなＨＰＬＣのカラムの劣化等の異常がある場合に、メトヘモグロビンの管理試料ではこのような異常をモニターすることができないという点も挙げることができる（▲１▼）。
そして、一酸化炭素ヘモグロビンを用いる場合においても、次の製造工程において、グルコースと反応させるために加温したりした場合には、完全に変性を防ぐことはできない（▲２▼）。
【０００９】
さらに、上記に例示した方法の他に、電荷がＨｂＡ_1Cと等しく、ＨＰＬＣ法において、ＨｂＡ_1Cと同じ位置にピークを示すため、ＨｂＡ_1Cの代用としてアセチル化ヘモグロビンを用いる方法も挙げられるが、この場合のＨＰＬＣのクロマトグラムのパターンもまたＨｂＡ_1Cと同一とはいえない。
すなわち、これらの従来のいずれの方法によって製造されたＨｂＡ_1C管理試料も、ＨｂＡ_1C測定の主流である上記のＨＰＬＣ法に適しているとはいえない。
【００１０】
そこで、本発明の解決すべき課題は、長期間安定で、かつ新鮮血液のＨＰＬＣクロマトグラムパターンを示す糖尿病診断等において極めて有用なＨｂＡ_1Cの管理試料を提供する手段を見出すことにある。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、上記課題の解決に向けて鋭意検討を行った。その結果、通常検体の安定剤としてサッカロースをＨｂＡ_1Cと共存させることにより、ＨｂＡ_1Cの安定性，特に凍結乾燥復元後の保存性を格段に向上させることができることを見出し本発明を完成した。
【００１２】
また、このサッカロースと共存させる、糖尿病診断に特に有用なＨｂＡ_1Cの調製方法として、ｍ−アミノフェニルボロン酸をリガンドとして固定したアフィニティクロマトクロマトグラム担体を用いた特定の手段を用いることで、極めて優れたＨｂＡ_1Cの管理試料を提供し得ることを見出して本発明を完成した。
すなわち本発明者は、以下の発明を提供する。
【００１３】
請求項１において、ヘモグロビンＡ_1C及びサッカロースを含んでなるヘモグロビンＡ_1C組成物の管理試料を提供する。
【００１４】
請求項２において、ヘモグロビンＡ_1Cが、血液試料をｍ−アミノフェニルボロン酸をリガンドとして固定したアフィニティクロマトグラム担体で捕捉して得られるヘモグロビンＡ_1Cである前記請求項１記載の管理試料を提供する。
【００１５】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の実施の形態について説明する。
Ａ．本発明ヘモグロビンＡ_1C 管理試料（以下、本発明試料ともいう）は、ＨｂＡ_1Cとサッカロースとを含んでなる。本発明試料中におけるＨｂＡ_1Cの形態は、特に限定されない。すなわち、新鮮血中のＨｂＡ_1Cをそのまま用いることもできるし、上記のように、メトヘモグロビンとグルコースとが結合したＨｂＡ_1C等も許容され、一酸化炭素結合ヘモグロビンとグルコースとが結合したＨｂＡ_1Cも許容され、ＨｂＡ_1Cの代用物質、例えばアセチル化ヘモグロビン等も許容される。
【００１６】
しかしながら、可能な限り生体内のＨｂＡ_1Cの状態を反映させたＨＰＬＣクロマトグラムを得ることが検査の信頼性を向上させる上で好ましいことを考慮すると、新鮮血中のＨｂＡ_1Cをそのまま用いることが好ましい。
【００１７】
そして、この新鮮血中のＨｂＡ_1Cを得る手段は特に限定されるものではなく、公知のＨｂＡ_1Cの入手手段を用いることができる。すなわち、血液試料をｍ−アミノフェニルボロン酸をリガンドとして固定したアフィニティクロマトグラム担体で捕捉して得る方法；イオン交換カラムで分離して得る方法；電気泳動で分離して得る方法等を挙げることができる。
【００１８】
これらのＨｂＡ_1Cの入手法のうちでも、特に前述したＨｂＡ_1Cの管理試料を得る場合には、血液試料をｍ−アミノフェニルボロン酸をリガンドとして固定したアフィニティクロマトグラム担体で捕捉して得る方法を選択することが好ましい。
このＨｂＡ_1Cの調製方法については、後述する。
【００１９】
本発明試料中に上記ＨｂＡ_1Cと共に配合するサッカロースは、総ヘモグロビン１重量部に対して０．３重量部以上，同１０重量部以下の範囲で配合される。総ヘモグロビン１重量部に対して０．３重量部未満では所望するＨｂＡ_1Cの安定効果が十分に発揮されずに好ましくなく、同１０重量部を越えて配合すると凍結乾燥の際、余剰のサッカロースに対する結合水が気化せずバイアルに水分が残留し、好ましくない。
【００２０】
また、好適なサッカロースの配合量は、総ヘモグロビンの濃度によって異なる。具体的には、総ヘモグロビン濃度が通常の検体程度，すなわち１０〜１５g ／dl程度のものには、総ヘモグロビン１重量部に対して１重量部程度が適当であり、総ヘモグロビン濃度がさらに希薄な場合，すなわち１．０g ／dl程度のものには、総ヘモグロビン１重量部に対して５重量部程度が適当である。
【００２１】
このように、ＨｂＡ_1Cとサッカロースを組み合わせて配合することにより、ＨｂＡ_1Cの安定性、特に凍結乾燥後のＨｂＡ_1Cの安定性を飛躍的に向上させることができる。
【００２２】
なお、本発明試料中には、上記必須成分の他に、ヘモグロビンの酸化防止等を目的として、本発明の所期の効果を損なわない範囲で他の任意成分を配合することが可能である。例えば、アスコルビン酸，三リン酸塩，カテキン，亜硫酸ナトリウム，亜硫酸水素ナトリウム，硫酸第一鉄，グルタチオン等を本発明試料中に配合することができる。
【００２３】
なお、本発明試料の所期の経時的安定効果を発揮させる最も好適な形態は、凍結乾燥品としての形態であるが、この凍結乾燥品の調製に際しては通常公知の方法を採ることができる。
【００２４】
例えば、−３０℃〜−４０℃で試料を凍結し、減圧し、棚温−２０℃〜４℃で５〜１００時間程度乾燥することにより所望する凍結乾燥製剤を得ることができる。なお、本発明においては、特に本発明試料中のサッカロースを乾燥させるために、９０〜１００時間程度乾燥させることが好ましい。
【００２５】
このように調製した本発明試料は、格段に経時的な安定性に優れており、後述するごとくＨｂＡ_1Cの管理試料として特に優れた組成物である。また、その特性を生かして、本発明はＨｂＡ_1Cの検出を目的とする検体試料にも適用することができる。すなわち、ＨｂＡ_1Cの検出を目的とする後述する溶血処理を施した血液検体に、上記の配合割合でサッカロースを添加することによって、従来のＨｂＡ_1Cの検出を目的とする血液検体よりも保存性が格段に向上した本発明試料としての血液検体を得ることができる。なお、この本発明試料としての血液検体は、上記の管理試料と同様の凍結乾燥品としての形態を採ることも可能であるが、凍結乾燥処理を省略した液状形態や乾燥処理を省略した凍結形態としての形態を採ることも可能である。
【００２６】
Ｂ．本発明試料を構成するＨｂＡ_1Cの最も好ましい調製方法は、血液試料をｍ−アミノフェニルボロン酸をリガンドとして固定したアフィニティクロマトグラム担体で捕捉して得る方法である。特に、ＨｂＡ_1Cの管理試料の製造を前提とする場合には、この手段を選択することが特に有効である。
【００２７】
これは、以下に掲げる理由による。
▲１▼従来のＨｂＡ_1Cの管理試料は、一般的にそのレベル調製の際に問題がある。特に、高いＨｂＡ_1Cレベルを得る必要性がある場合に問題がある。
すなわち、ＨｂＡ_1Cのレベルの正常値は、ヘモグロビン全量に対して４．０〜５．８重量％程度であるが、糖尿病の発病に伴い生体の血糖コントロールが悪化するとこれより高値となり、同１０重量％を越える場合もある。これに対応して臨床検査用のＨｂＡ_1Cの管理試料としてのふさわしいレベルとしては、低値用でヘモグロビン全量に対して４．０〜５．０重量％程度であり、高値用としては、同１０〜１５重量％程度である。
【００２８】
どのような手段を採るにしても、ＨｂＡ_1Cの原材料は、人血をはじめとする哺乳動物の新鮮血なのであるから、新鮮血中のある程度のＨｂＡ_1C量のばらつきは避けることができない。特に、高値用の管理試料を製造する場合にはＨｂＡ_1C量が高値である糖尿病患者の血液を用いる必要があり、これの確保には非常な困難を伴うのが常である。また、インビトロでヘモグロビンとグルコースを人為的に結合させるためには、時間とある程度の温度が必要になり、前述のようなヘモグロビンの変性を伴うことは避けがたいことである。
【００２９】
この点において、上記の担体捕捉法を用いることにより、健常人の新鮮血を原材料として、ヘモグロビンを変性させずにＨｂＡ_1Cを高値に加工することが容易である。
【００３０】
▲２▼検体のヘモグロビン濃度に応じた管理試料が必要である。
すなわち、ＨｂＡ_1C量の測定においては、検体として全血又は沈降赤血球を用い、ここから得られるヘモグロビン溶液の全ヘモグロビン中におけるＨｂＡ_1Cの相対量（％）として測定される。この検体は通常全ヘモグロビン濃度を希釈するが、この希釈倍率がそれぞれの測定法毎に大きく異なる。従って、ＨｂＡ_1Cの管理試料は、相対的にＨｂＡ_1Cが高濃度で存在しても低濃度で存在しても、少なくともあらゆる測定法に対応できるだけの濃度、具体的には１．０g/dl以上の濃度であることが理想的である。
【００３１】
上記の担体捕捉法は、ＨｂＡ_1Cの高値成分の分画を得る場合も低値成分の分画を得る場合にも、アフィニティカラムがＨｂＡ_1Cを特異的に吸着する。そのために、ＨｂＡ_1Cとそれ以外のヘモグロビンとを両者の溶出速度の差を用いて分離する必要がなく、単にＨｂＡ_1C以外のヘモグロビンを溶出液で押し出すことのみにより両者を分離することができる。すなわち、上記の担体捕捉法においては、イオン交換樹脂等による分離の場合に比べて、ＨｂＡ_1Cとそれ以外のヘモグロビンとを分離する際に用いる溶出液量を格段に節約することが可能になるため、結果としてＨｂＡ_1Cの高値成分の分画を得る場合も低値成分の分画を得る場合にも、試料における総ヘモグロビン濃度を１．０g/dl以上の濃度とすることができる。
【００３２】
上記の担体捕捉法において用いる血液試料は、通常溶血試料を用いる。この溶血試料の調製工程は、常法に従い行われる。すなわち、採取した新鮮血液から分離した赤血球の細胞膜を破壊することにより行うことができる。この破壊手段は、例えば激しく振盪して細胞膜を破壊する振盪法，超音波で細胞膜を破壊する超音波法，低張溶液中で細胞膜を破壊する浸透圧法，界面活性剤で膜を溶解する方法等通常公知の破壊手段を用いることが可能である。通常この溶血を行った後、破断した赤血球膜脂質等を脱脂処理等の手段により除去する。
【００３３】
なお、この赤血球の細胞膜の破壊に先立ち、予め赤血球を十分に洗浄して遊離のグルコースを除去し、Labile ＨｂＡ_1C（シッフ塩基結合の段階のグルコースとヘモグロビンとの結合物、可逆性がある）を分解しておくことが好ましい。
このようにして、通常は１０g/dl以上のヘモグロビン濃度の精製溶血液を得ることができる。
【００３４】
次に、上記血液試料（精製溶血液）をｍ−アミノフェニルボロン酸をリガンドとして固定したアフィニティクロマトグラム担体で捕捉処理を行い、この担体に捕捉されたＨｂＡ_1Cを選択的に分離する。
ｍ−アミノフェニルボロン酸は、シスジオール基と結合する性質を有するために、このｍ−アミノフェニルボロン酸をアガロースやポリアクリルアミド等の担体にリガンドとして固定したアフィニティクロマトグラフィーにかけることにより、全ヘモグロビンの中から、シスジオール基を有するグルコースと結合しているＨｂＡ_1Cを選択的に捕捉して分離することができる。
【００３５】
上記のｍ−アミノフェニルボロン酸を担体に固定するためのスペーサーは、通常公知のものを用いることが可能であり、例えばＮＨ₂(ＣＨ₂)_nＣＯＯＨ等をスペーサーとして用いることができる。
なお、このようなスペーサーを用いずに活性化したアガロースにｍ−アミノフェニルボロン酸を結合させることも可能である。
【００３６】
また、ｍ−アミノフェニルボロン酸は、ＨｂＡ_1Cを特異的に捕捉することができるリガンドとして最も好ましいものであるが、この他の（オルト）ほう酸基を有する物質や抗ＨｂＡ_1C抗体等のＨｂＡ_1Cを特異的に吸着することができる物質をリガンドとすることができる。
【００３７】
このｍ−アミノフェニルボロン酸をリガンドとして固定した担体は、通常公知の方法を組み合わせて調製することも可能であるが、市販品を用いることも可能である。例えばシグマ社からｍ−アミノフェニルボロン酸をリガンドとして固定した担体が市販されている。
【００３８】
さらに、コンディショニングしたｍ−アミノフェニルボロン酸をリガンドとして固定した担体に、上記血液試料を仕込み、この担体に選択的に捕捉されたＨｂＡ_1Cを個別的に溶出させて分離することができる。
【００３９】
この工程では、先ず担体に吸着するＨｂＡ_1Cが変性しない条件（２〜８℃程度の低温及び遮光条件下）で、十分な時間をかけて血液試料中のＨｂＡ_1Cを担体に吸着させる。
このような条件で、選択的に担体に吸着させたＨｂＡ_1Cを溶出させて所望するＨｂＡ_1Cを得ることができる。
【００４０】
この溶出の際の溶出液は、通常ＨｂＡ_1Cと同じくシスジオール基を有する成分，例えばソルビトール等を含むものを用いる。
なお、上記のＨｂＡ_1Cの選択的な吸着−溶出工程において、血液試料をｍ−アミノフェニルボロン酸をリガンドとして固定した担体に仕込む際に、過剰量の血液試料を仕込むことで、所望する濃度でＨｂＡ_1Cを含む管理試料を容易に調製することができる。
【００４１】
すなわち、過剰の血液試料を仕込んで、ゲルベットの部分に残っている血液試料を低値用管理試料と高値用管理試料とに分別して、原料ヒト健常者血液のままのＨｂＡ_1C濃度の精製溶血液と両者の試料とを任意の比率で混合することにより所望するＨｂＡ_1C濃度の管理試料を調製することができる。
【００４２】
低値用管理試料については、例えばゲルベットの部分に残っているが担体に吸着されていない血液試料を、ＨｂＡ_1Cと担体との吸着状態を保持できる溶液で溶出させて、これを低値用管理試料として用いることができる（この血液試料は、血液試料中に存在する本来の濃度のＨｂＡ_1Cの一部分が担体に吸着されているので、ＨｂＡ_1Cの存在量が血液試料本来のものよりも低濃度となる。）。
また、高値用管理試料は、例えば前記のように担体に選択的に吸着されたＨｂＡ_1Cを溶出させることにより得ることができる。
【００４３】
なお、このようにして得たＨｂＡ_1Cが高値と低値の溶液を透析にかけることにより、前記したＨｂＡ_1Cの安定剤であるサッカロースを添加して試料を凍結乾燥にかける際の水分の蒸発を妨げるマグネシウムイオンやソルビトール等の成分を除去することが好ましい（なお、この透析における希釈を考慮して、透析試料をさらに濃縮することが好ましい）。
【００４４】
【実施例】
以下、本発明を実施例等によりさらに具体的に説明するが、本発明の技術的範囲がこの実施例等により限定されるものではない。
【００４５】
〔製造例〕本発明試料の製造
（１）溶血液の調製４５０mlの健常人のヒト全血を、５０ml容遠沈管に約４５mlずつ分注し、遠心分離器（１２５０×ｇ，５min ，４℃）にかけ、上清の血漿，血小板，白血球を除去して赤血球を分離した。この分離した赤血球に３／２容量の生理食塩水を加えて混合し、これを再び遠心分離器（１２５０×ｇ，５min ，４℃）にかけ、生理食塩水を除去した。この生理食塩水による洗浄操作を８回繰り返した（８回目の遠心時間は１０分間）。このようにして、洗浄赤血球２００mlを調製した。得られた洗浄赤血球に等量の氷冷した精製水を加え、激しく振盪して赤血球を溶血させて溶血液４００mlを調製した。
【００４６】
次に、上記の溶血液に対して、１／４容量のトルエンを加えて激しく振盪し、遠心分離（１８００×ｇ，３０min ，４℃）にかけ、３層に分離したうちの下層部分を回収した。回収した画分を再び遠心分離（１８００×ｇ，１５min ，４℃）にかけ、上層に浮くか又は底に沈澱した不溶解物を除き、透明な部分のみを回収して、これを精製溶血液とした〔この精製溶血液のうち１５０mlを取り，安定剤（サッカロースの５０重量％水溶液）を，１６．７ml加え均一になるまで混合して、これを「原料血液そのままのＨｂＡ_1C濃度の溶液」とした。
【００４７】
（２）ゲルの調製
内径５０mmのカラムに、ｍ−アミノフェニルボロン酸アガロースゲル（シグマ社製）を約２５０ml充填した。
ゲル調整液として水酸化ナトリウム０．０８重量％溶液を流速約５０ml／min で約１０００ml流した後、同じくゲル調整液として酢酸０．３重量％溶液を流速約５０ml／min で約１２５０ml流した。次いで、精製水を流速約５０ml／min で約２５００ml流した。なお、このゲルの調整工程を通じて、カラムジャケットには循環ポンプで約２０℃の冷却水を流した。
【００４８】
このようにして調整したゲルに、平衡化液〔ＥＰＰＳ（０．５０５重量％），水酸化ナトリウム（ｐＨ８．６とするための必要量），塩化ナトリウム（０．８７７重量％），塩化マグネシウム・６水塩（０．２０３重量％），精製水（残量）〕を流速約５０ml／min で約２５００ml流してゲルを平衡化した。なお、このゲルの平衡化工程を通じて、カラムジャケットには循環ポンプで約２０℃の冷却水を流した。
【００４９】
（３）ＨｂＡ_1Cのゲル吸着
上記（２）において平衡化したゲルに上記（１）で調製した精製溶血液を３０００ml混合し、垂直に立てたカラム内で２〜８℃で遮光し、１６〜２４時間静置した。
次に、ゲルベットの上に溜まった精製溶血液を駒込ピペットでカラム上から排出した。なお、この排出工程を通じて、カラムジャケットには循環ポンプで約２〜８℃の冷却水を流した。
【００５０】
（４）ＨｂＡ_1C低値溶液の溶出
上記（２）と同一の組成の平衡化液を流速約５０ml／min で１０００ml流して、溶出した液をフラクションコレクターで試験管に約１０mlずつ分画して回収した。なお、この溶出工程を通じて、カラムジャケットには循環ポンプで約２〜８℃の冷却水を流した。
０．５g ／dlのヘモグロビン水溶液を用意し、これを対照として目視により、およそこの対照よりも濃い分画をビーカーにプールした。
【００５１】
（５）ＨｂＡ_1C高値溶液の溶出
上記（４）に引続き、上記（２）と同一の組成の平衡化液を流速約５０ml／min で１５００ml流した（この工程を通じて、カラムジャケットには循環ポンプで約２〜８℃の冷却水を流した）。なお、この工程の間に溶出した液は廃棄した。
【００５２】
次に、分離液〔ＥＰＰＳ（０．５０５重量％），水酸化ナトリウム（ｐＨ８．６とするための必要量），Ｄ−ソルビトール（１．８２２重量％），精製水（残量）〕を流速約２５ml／min で１５００〜２０００ml流して、溶出した液をフラクションコレクターで試験管に約１０mlずつ分画して回収した。なお、この溶出工程を通じて、カラムジャケットには循環ポンプで約２〜８℃の冷却水を流した。 ０．５g ／dlのヘモグロビン水溶液を用意し、これを対照として目視により、およそこの対照よりも特に濃い分画から約１００mlまでプールした。
【００５３】
（６）透析及び濃縮
上記（４）（５）により得られたＨｂＡ_1C低値溶液及び同高値溶液をそれぞれ透析チューブに詰め（低値溶液約180 ml/ チューブ，高値溶液約100ml/ チューブ ）
、精製水にこの透析チューブを浸漬して、２〜８℃で遮光し、約２時間スターラーで精製水を攪拌した〔低値溶液の精製水約２０l ，高値溶液の精製水約１０l 〕。この透析の終了後、精製水にこの透析チューブを浸漬して、２〜８℃で遮光し、約１６時間静置した〔低値溶液の精製水約２０l ，高値溶液の精製水約１０l 〕。
【００５４】
上記透析工程の終了したそれぞれの透析チューブを、約５l の濃縮剤〔ポリエチレングリコール20000 の３０重量％水溶液〕に浸漬し、２〜８℃で遮光してスターラーで濃縮剤を攪拌した。
ＨｂＡ_1C低値溶液の透析チューブは、約２時間後に上記濃縮剤から取り出し、表面に付着した濃縮剤を氷冷した精製水で洗い流した後、表面の水分をペーパータオルで拭き取り、透析チューブ中の液体をメスシリンダーに採取して、その液量を定量し、これに１／９容量の安定剤（サッカロースの５０重量％水溶液）を加え、均一になるまで混合し、下記の濃度調整工程を経て後述の凍結乾燥工程に処した。
【００５５】
また、ＨｂＡ_1C高値溶液の透析チューブは、約４時間後に上記濃縮剤から取り出し、表面に付着した濃縮剤を氷冷した精製水で洗い流した後、表面の水分をペーパータオルで拭き取り、透析チューブ中の液体をメスシリンダーに採取して、その液量を定量し、これに１／９容量の上記安定剤を加え、均一になるまで混合し、下記の濃度調整工程を経て後述の凍結乾燥工程に処した。
【００５６】
（７）ＨｂＡ_1C及び総ヘモグロビン量の濃度調製
前記（１）において調製した「原料血液そのままのＨｂＡ_1C濃度の溶液」並びに前記（６）において調製した「ＨｂＡ_1C低値溶液」及び「ＨｂＡ_1C高値溶液」の総ヘモグロビン量をアザイドメトヘモグロビン法により定量し、次にＨｂＡ_1C濃度をＨＰＬＣ法〔ＨＬＣ−７２３ＨｂIII 型ＨｂＨｂＡ_1C自動分析機（東ソー社製）による〕により定量した。
【００５７】
次いで、「原料血液そのままのＨｂＡ_1C濃度の溶液」と「ＨｂＡ_1C低値溶液」又は「ＨｂＡ_1C高値溶液」を混合して、それぞれ所望のＨｂＡ_1C濃度に調整した上で、安定剤（サッカロースの５重量％水溶液）を加えて総ヘモグロビン濃度を１．０g/dlに合わせた。
【００５８】
（８）凍結乾燥
上記（７）で濃度調整した「ＨｂＡ_1C低値溶液」及び「ＨｂＡ_1C高値溶液」を１０ml容褐色バイアルに２mlずつ分注し、これらのバイアルを凍結乾燥機に入れ、制御運転〔第１段階：−２０℃・１０時間，第２段階：−２０℃・１０時間，第３段階：−４℃・１０時間，最終制御：４℃・６０〜７０時間；到達真空度：約１０mTorr 〕を行い、凍結乾燥品を得た。凍結乾燥が終了したそれぞれのバイアルに窒素を充填し、封栓しアルミシールを施した。このように、ＨｂＡ_1Cの管理試料を得た。
【００５９】
〔試験例〕本発明試料の凍結乾燥前後における経時的安定性の検討
（１）本発明試料においてＨｂＡ_1Cの安定剤として配合するサッカロースの凍結乾燥前後における経時的安定性を、他の糖類を配合した場合との比較において検討した。すなわち、予め凍結乾燥前の全ヘモグロビン量を１０g/dlに調整した各試料における全ヘモグロビン量中のＨｂＡ_1C量を上記製造例（７）で示したと同様の方法で測定した。
【００６０】
次に、これらの各試料を上記製造例（８）に示したと同様の方法で凍結乾燥した後、これらの凍結乾燥品に精製水０．５mlを加えて、各試料における全ヘモグロビン量中のＨｂＡ_1C量を上記と同じく測定した。
この結果を第１表に示す。
【００６１】
【表１】

【００６２】
この第１表において、糖類を添加しなかった試料は、凍結乾燥後は、この凍結乾燥操作自体によるヘモグロビンの変性が著しく、ＨＰＬＣ分析に耐えられないものとなった。
また、アルドース系単糖類であるＤ−キシロース又はＤ−アラビノースを添加した群は、凍結乾燥操作によるヘモグロビンの変性は抑制されたが、凍結乾燥中の反応により凍結乾燥前後でＨｂＡ_1C値が大きく異なるものとなった。
【００６３】
この結果より、ＨｂＡ_1Cの凍結乾燥における安定性を付与するための安定剤としては、アルドース単糖類は不適当であることが明らかになった。
なお、Ｄ−ガラクトース，Ｄ−マンニトール，ラクトースはヘモグロビン溶液における溶解度が低いのでこの試験系からは除外した。
【００６４】
（２）次に、この試験系で安定性に優れていたＤ−ソルビトール添加群とサッカロース添加群の凍結乾燥後における経時的安定性を検討した。
すなわち、Ｄ−ソルビトール添加群とサッカロース添加群の凍結乾燥直後におけるＨｂＡ_1Cの安定性を、試料の凍結乾燥直後のＨｂＡ_1C値と凍結乾燥後１ヵ月後（室温）のＨｂＡ_1C値をＨＰＬＣ法により比較した。
この結果を第２表に示す。
【００６５】
【表２】

この結果、凍結乾燥後長期間経過時におけるＨｂＡ_1Cを安定に保つためには、安定剤としてサッカロースを添加することが最適であることが明らかになった。
【００６６】
【発明の効果】
本発明により、長期間安定で、かつ新鮮血液のＨＰＬＣクロマトグラムパターンを示す糖尿病診断等において極めて有用なＨｂＡ_1C の管理試料が提供される。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to hemoglobin A_1CHemoglobin A with significantly improved storage stability after freeze-drying_1C Control samplesBelongs to the technical field.
[0002]
[Prior art]
Hemoglobin in the blood binds to glucose by a non-enzymatic reaction between the amino group of valine of the α-chain N-terminal amino acid and the aldehyde group of glucose. The first step of this coupling is a reversible Schiff base reaction, but further forms an irreversible ketoamine via an Amadori rearrangement reaction. The combined product of hemoglobin and glucose thus produced is hemoglobin A._1C(Hereafter, HbA_1CAlso known as).
The life span of hemoglobin in blood is about 3 months, during which HbA produced by binding to glucose_1CGradually accumulates, but on the other hand, HbA has run out of life_1CAre decomposed sequentially. That is, HbA present in blood at a certain time_1CThe blood glucose concentration on average reflects the blood glucose concentration in the past, that is, the blood glucose concentration, which goes back about one to two months, which is approximately half the life of hemoglobin from that time point.
[0003]
HbA having such characteristics_1CCan accurately grasp the past blood glucose state without temporary fluctuations such as blood glucose concentration which is a general index of diabetes. Therefore, HbA in the blood_1CConcentration is important today as a glycemic control index for diabetics.
HbA_1CThe quantification method includes high performance liquid chromatography using an ion exchange column (hereinafter referred to as HPLC), affinity column method using an affinity chromatogram carrier immobilized with m-aminophenylboronic acid as a ligand, latex agglutination method, Immunoturbidimetric method, isoelectric focusing method, phytic acid method, thiobarbituric acid method, etc., but excellent sensitivity, specificity, and reproducibility, and the use of dedicated simple automated analyzers For this reason, the HPLC method has become a standard measurement method in clinical examinations.
[0004]
The problem here is HbA_1CTo obtain a “control sample” to be used as a standard in measurement, and as a standard for accuracy control between measurement equipment and facilities, or data continuity. HbA_1CThere are several examples of the production method of the control sample. For example, a method in which a preservative is added to lysed blood of red blood cells (East German Patent No. 150543, US Pat. No. 3,519,572, British Patent No. 934461), cyanmethemoglobin, oxyhemoglobin-polyhydroxy compound, carbon monoxide Production method using hemoglobin (German Patent No. 311458, European Patent No. 72440, “Mosca. A., et al., J. Clin. Chem. Clin. Biochem. 23: 361-364 (1985)”) N- [5-nitrotropon-2-yl] hemoglobin and hemoglobin mixture (Japanese Examined Patent Publication No. 63-19828), a method of defatting hemolyzed blood obtained from whole blood with a polyhydroxy compound 58-37561), a method of converting into cyanmethemoglobin and freeze-drying (Japanese Patent Laid-Open No. 59-183370), HbA_1CAs a substitute for acetylated hemoglobin (JP-A-3-220457), in which glucose and hemoglobin were combined in vitro in a state where hemoglobin was converted to carbon monoxide hemoglobin, azaid methemoglobin or cyanmethemoglobin After that, the unstable Schiff base bond is decomposed with a reducing agent, and stable HbA_1CAnd the like (Japanese Patent Publication No. 6-508690) and the like.
There are several products on the market, including Bio-Rad products (Bio-Rad Laboratories. Hemoglobin A1c Micro Column test Instruction Manual. March 1990). The production methods for these products have been clarified. Absent.
[0005]
[Problems to be solved by the invention]
This HbA_1CIn the control sample, it is necessary that the behavior at the time of analysis is equivalent to that of fresh blood as an actual specimen.
This is because hemoglobin undergoes denaturation mainly due to oxidation due to time, temperature, etc., and methemoglobin, which is oxidized hemoglobin, and oxyhemoglobin, which is non-oxidized hemoglobin, have different charges. is there.
[0006]
HbA_1CThe above ion exchange HPLC method, which is the mainstream of_1CIs separated by the charge difference from other hemoglobins, but is oxidized hemoglobin (oxidized HbA as described above)._1CMixing), the separation pattern of the tomatogram is disturbed, and in very sensitive HPLC, it is quite different from the original of fresh blood.
Therefore, HbA_1CAs a control sample, individual lots are required to continue for a long time. In addition, when the control sample is a freeze-dried product, not only the stability during freeze-drying but also the stability after dissolving and restoring by adding purified water during use is required.
[0007]
This HbA_1CAs a conventional means for satisfying the stability required for the control sample of (1), for example, (1) from the beginning all components are methemoglobin, there is no room for further oxidative modification of hemoglobin, and the difference in charge among all components is eliminated. , HbA_1CAnd only between HbA and other hemoglobins_1CTo clarify the separation of selenium from other hemoglobins; (2) Focusing on the fact that the bond between carbon monoxide and divalent heme iron is about tens of thousands of times stronger than oxygen; As prior art documents corresponding to the method for preventing the oxidation of hemoglobin in which heme iron is changed to trivalent as hemoglobin [(1), (2)], the aforementioned German Patent No. 331458, European Patent No. 72440, “Mosca. A., et al., J. Clin. Chem. Clin. Biochem. 23: 361-364 (1985) ”; JP-A-59-183370; JP-A-6-508690]. it can.
[0008]
However, as a problem in these methods, in the case of methemoglobin as a whole, even if the separation pattern of the HPLC method is the same as that of fresh blood, the retention time is entirely deviated from the retention time of fresh blood. HbA is not always suitable for equipment adjustment for_1CWhen the device is adjusted based on the retention time, the original HbA of fresh blood_1CThe peak of HbA_1CThe point is that the device cannot be identified. Also, fresh blood HbA_1CIt can also be pointed out that such abnormalities cannot be monitored with the methemoglobin control sample when there is an abnormality such as deterioration of the HPLC column in which an abnormality appears in the peak of (1).
Even in the case where carbon monoxide hemoglobin is used, denaturation cannot be completely prevented if it is heated to react with glucose in the next production step ((2)).
[0009]
Further, in addition to the method exemplified above, the charge is HbA_1CIn the HPLC method, HbA_1CShows a peak at the same position as HbA_1CA method using acetylated hemoglobin as an alternative to the above method is also mentioned, but the HPLC chromatogram pattern in this case is also HbA._1CIs not the same.
That is, HbA produced by any of these conventional methods_1CThe control sample is also HbA_1CIt cannot be said that it is suitable for the above HPLC method which is the mainstream of measurement.
[0010]
  Therefore, the problem to be solved by the present invention is HbA which is stable for a long period of time and is extremely useful in diabetes diagnosis and the like showing an HPLC chromatogram pattern of fresh blood._1CofmanagementIt is to find a means to provide a sample.
[0011]
[Means for Solving the Problems]
The inventor has intensively studied to solve the above problems. As a result, saccharose was converted to HbA as a stabilizer for normal specimens._1CBy coexisting with HbA_1CThe present invention has been completed by finding that the stability of the resin, particularly the storage stability after freeze-drying can be remarkably improved.
[0012]
In addition, HbA particularly useful for diagnosis of diabetes coexisting with this saccharose_1CAs a preparation method of HbA, a specific means using an affinity chromatogram carrier in which m-aminophenylboronic acid is immobilized as a ligand is used._1CThe present invention has been completed by finding that a control sample can be provided.
That is, the present inventor provides the following inventions.
[0013]
  In Claim 1, hemoglobin A_1CAnd hemoglobin A comprising saccharose_1CCompositionControl samplesI will provide a.
[0014]
  In Claim 2, hemoglobin A_1CIs obtained by capturing a blood sample with an affinity chromatogram carrier in which m-aminophenylboronic acid is immobilized as a ligand._1CThe claim of claim 1 whereinControl sampleI will provide a.
[0015]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
Embodiments of the present invention will be described below.
A. The present hemoglobin A_1C Control sample(Hereinafter, the present inventionsampleHbA)_1CAnd sucrose. The present inventionsampleHbA in_1CThe form of is not particularly limited. That is, HbA in fresh blood_1CHbA in which methemoglobin and glucose are combined as described above._1CHbA in which carbon monoxide-bound hemoglobin and glucose are bound_1CIs also acceptable, HbA_1CSubstitute substances such as acetylated hemoglobin are also acceptable.
[0016]
However, as much as possible in vivo HbA_1CConsidering that it is preferable to obtain an HPLC chromatogram reflecting the state of the above in order to improve the reliability of the test, HbA in fresh blood_1CIs preferably used as it is.
[0017]
And this fresh blood HbA_1CThere is no particular limitation on the means for obtaining the known HbA._1CCan be used. That is, a method of obtaining a blood sample by capturing it with an affinity chromatogram carrier immobilized with m-aminophenylboronic acid as a ligand; a method of obtaining by separating with an ion exchange column; a method of obtaining by separating by electrophoresis, etc. it can.
[0018]
These HbA_1CAmong the methods for obtaining HbA, in particular, the aforementioned HbA_1CIn the case of obtaining a control sample, it is preferable to select a method of capturing a blood sample with an affinity chromatogram carrier immobilized with m-aminophenylboronic acid as a ligand.
This HbA_1CThe preparation method will be described later.
[0019]
  The present inventionsampleInside HbA_1CThe saccharose to be blended together is blended in the range of 0.3 to 10 parts by weight with respect to 1 part by weight of total hemoglobin. Desirable HbA at less than 0.3 part by weight relative to 1 part by weight of total hemoglobin_1CIf the amount exceeds 10 parts by weight, it is not preferable because the water bound to the excess saccharose does not evaporate and water remains in the vial.
[0020]
Further, a suitable amount of saccharose varies depending on the concentration of total hemoglobin. Specifically, about 1 part by weight per 1 part by weight of total hemoglobin is appropriate for a sample having a total hemoglobin concentration of about 10 to 15 g / dl, and the total hemoglobin concentration is further diluted. In this case, that is, about 1.0 g / dl, about 5 parts by weight is appropriate for 1 part by weight of total hemoglobin.
[0021]
Thus, HbA_1CAnd saccharose in combination to produce HbA_1CStability, especially HbA after lyophilization_1CThe stability of can be dramatically improved.
[0022]
  The present inventionsampleIn addition to the essential components described above, other optional components can be blended for the purpose of preventing the oxidation of hemoglobin and the like as long as the desired effects of the present invention are not impaired. For example, ascorbic acid, triphosphate, catechin, sodium sulfite, sodium bisulfite, ferrous sulfate, glutathione, etc.sampleCan be blended in.
[0023]
  The present inventionsampleThe most suitable form for exhibiting the desired effect of stabilizing over time is a form as a freeze-dried product, and generally known methods can be employed for the preparation of this freeze-dried product.
[0024]
  For example, the sample can be frozen at −30 ° C. to −40 ° C., decompressed, and dried at a shelf temperature of −20 ° C. to 4 ° C. for about 5 to 100 hours to obtain a desired freeze-dried preparation. In the present invention, in particular, the present inventionsampleIn order to dry the saccharose therein, it is preferable to dry it for about 90 to 100 hours.
[0025]
  The present invention thus preparedsampleIs remarkably excellent in stability over time, and as will be described later, HbA_1CIt is a particularly excellent composition as a control sample. In addition, taking advantage of its characteristics, the present invention provides HbA_1CThe present invention can also be applied to a specimen sample for the purpose of detecting the above. That is, HbA_1CBy adding saccharose at the above blending ratio to a blood sample that has been subjected to hemolysis described below for the purpose of detection of_1CThe present invention has significantly improved storage stability compared to blood samples intended for detection ofsampleA blood sample can be obtained. The present inventionsampleThe blood sample can be in the form of a freeze-dried product similar to the above-mentioned control sample, but it can be in a liquid form in which the freeze-drying process is omitted or a frozen form in which the drying process is omitted. Is also possible.
[0026]
B. The present inventionsampleHbA constituting_1CThe most preferable preparation method is to obtain a blood sample by capturing it with an affinity chromatogram carrier immobilized with m-aminophenylboronic acid as a ligand. In particular, HbA_1CThis method is particularly effective when it is assumed that the control sample is manufactured.
[0027]
This is due to the following reasons.
(1) Conventional HbA_1CThis control sample generally has problems in its level preparation. Especially high HbA_1CThere is a problem when you need to get a level.
That is, HbA_1CThe normal level is about 4.0 to 5.8% by weight with respect to the total amount of hemoglobin. However, when the blood glucose control of the living body deteriorates due to the onset of diabetes, it becomes higher than this and exceeds 10% by weight. There is also. Correspondingly, HbA for clinical testing_1CThe appropriate level for the control sample is about 4.0 to 5.0% by weight with respect to the total amount of hemoglobin for low values, and about 10 to 15% by weight for high values.
[0028]
Whatever means is used, HbA_1CSince the raw material is fresh blood of mammals including human blood, some HbA in fresh blood_1CVariations in quantity are inevitable. In particular, when manufacturing a control sample for high value, HbA_1CIt is necessary to use the blood of a diabetic patient whose amount is high, and ensuring this is usually accompanied by great difficulty. In addition, in order to artificially bind hemoglobin and glucose in vitro, time and a certain temperature are required, and it is inevitable that the above-described degeneration of hemoglobin is involved.
[0029]
In this regard, by using the above-described carrier capture method, HbA can be used without degenerating hemoglobin using fresh blood of a healthy person as a raw material._1CIs easily processed to a high value.
[0030]
(2) A control sample according to the hemoglobin concentration of the specimen is necessary.
That is, HbA_1CIn the measurement of the amount, whole blood or precipitated red blood cells are used as a specimen, and HbA in the hemoglobin of the hemoglobin solution obtained therefrom is used._1CIs measured as a relative amount (%). This specimen usually dilutes the total hemoglobin concentration, but this dilution factor varies greatly depending on each measurement method. Therefore, HbA_1CThe control sample is relatively HbA_1CIt is ideal that at least a concentration sufficient to support all measurement methods, specifically, a concentration of 1.0 g / dl or more, is present at a high concentration or a low concentration.
[0031]
The carrier capture method described above is HbA_1CIn the case of obtaining the fraction of the high-value component and the fraction of the low-value component, the affinity column is HbA_1CIs adsorbed specifically. To that end, HbA_1CIt is not necessary to separate hemoglobin from other hemoglobins using the difference in elution rate between them._1CBoth can be separated only by extruding hemoglobin other than that with an eluate. That is, in the above carrier capture method, HbA is compared with the case of separation using an ion exchange resin or the like._1CAs a result, it is possible to significantly reduce the amount of eluate used for separating hemoglobin from other hemoglobin._1CIn both cases of obtaining a fraction of high value components and obtaining a fraction of low value components, the total hemoglobin concentration in the sample can be 1.0 g / dl or more.
[0032]
As a blood sample used in the carrier capturing method, a hemolyzed sample is usually used. This process of preparing the hemolyzed sample is performed according to a conventional method. That is, it can be performed by destroying the cell membrane of red blood cells separated from the collected fresh blood. This disruption means is, for example, a shaking method that vigorously shakes to break the cell membrane, an ultrasonic method that breaks the cell membrane with ultrasound, an osmotic pressure method that breaks the cell membrane in a hypotonic solution, a method that dissolves the membrane with a surfactant, etc. Ordinarily known destructive means can be used. Usually, after this hemolysis, the ruptured erythrocyte membrane lipid and the like are removed by means such as degreasing treatment.
[0033]
Prior to the destruction of the cell membrane of red blood cells, the red blood cells were thoroughly washed to remove free glucose, and Labile HbA_1CIt is preferable to decompose (combined glucose and hemoglobin at the stage of Schiff base binding, which is reversible) in advance.
In this manner, purified hemolyzate having a hemoglobin concentration of usually 10 g / dl or more can be obtained.
[0034]
Next, the blood sample (purified hemolyzed blood) is subjected to a capture treatment with an affinity chromatogram carrier immobilized with m-aminophenylboronic acid as a ligand, and HbA captured on the carrier is captured._1CIs selectively separated.
Since m-aminophenylboronic acid has a property of binding to a cisdiol group, it is subjected to affinity chromatography in which this m-aminophenylboronic acid is immobilized as a ligand on a carrier such as agarose or polyacrylamide. Among them, HbA bound to glucose having a cisdiol group_1CCan be selectively captured and separated.
[0035]
As the spacer for fixing the m-aminophenylboronic acid to the carrier, a generally known spacer can be used. For example, NH₂(CH₂)_nCOOH or the like can be used as a spacer.
It is also possible to bind m-aminophenylboronic acid to activated agarose without using such a spacer.
[0036]
In addition, m-aminophenylboronic acid is HbA_1CIs most preferable as a ligand capable of specifically trapping, but other substances having (ortho) borate groups and anti-HbA_1CHbA such as antibodies_1CA substance capable of specifically adsorbing can be used as a ligand.
[0037]
The carrier on which m-aminophenylboronic acid is immobilized as a ligand can be prepared by combining generally known methods, but a commercially available product can also be used. For example, a carrier having m-aminophenylboronic acid immobilized as a ligand is commercially available from Sigma.
[0038]
Furthermore, the above-described blood sample was charged into a carrier in which conditioned m-aminophenylboronic acid was immobilized as a ligand, and HbA selectively captured by this carrier._1CCan be individually eluted and separated.
[0039]
In this step, first, HbA adsorbed on the carrier_1CHbA in a blood sample over a sufficient period of time under conditions that do not denature (low temperature of about 2 to 8 ° C. and light shielding conditions)_1CIs adsorbed on a carrier.
Under such conditions, HbA selectively adsorbed on the carrier_1CTo elute the desired HbA_1CCan be obtained.
[0040]
The eluate used for this elution is usually HbA._1CSimilarly, a component having a cisdiol group, for example, one containing sorbitol or the like is used.
The above HbA_1CIn the selective adsorption-elution step, when the blood sample is charged into a carrier on which m-aminophenylboronic acid is immobilized as a ligand, an excessive amount of the blood sample is charged to obtain a HbA at a desired concentration._1CCan be easily prepared.
[0041]
That is, an excessive blood sample is charged, and the blood sample remaining in the gerbet portion is separated into a low-value control sample and a high-value control sample, and HbA as the raw human human healthy blood remains._1CThe desired HbA can be obtained by mixing the purified hemolysate at a concentration and the samples in an arbitrary ratio._1CConcentration control samples can be prepared.
[0042]
For the low-value control sample, for example, a blood sample remaining in the gel bed portion but not adsorbed on the carrier is used as the HbA._1CAnd can be used as a low-value control sample (this blood sample is the HbA of the original concentration present in the blood sample)._1CIs adsorbed on the carrier, so HbA_1CIs present at a lower concentration than the original blood sample. ).
Further, the high-value management sample is, for example, HbA selectively adsorbed on the carrier as described above._1CCan be obtained by eluting.
[0043]
HbA obtained in this way_1CHbA is obtained by subjecting high and low solutions to dialysis._1CIt is preferable to remove components such as magnesium ions and sorbitol that prevent evaporation of water when the sample is freeze-dried by adding saccharose, a dialysis sample in consideration of dilution in this dialysis. Is preferably further concentrated).
[0044]
【Example】
EXAMPLES Hereinafter, although an Example etc. demonstrates this invention further more concretely, the technical scope of this invention is not limited by this Example etc.
[0045]
[Production Example] The present inventionsampleManufacturing of
(1) Preparation of hemolyzed blood 450 ml of healthy human whole blood was dispensed into a 50 ml centrifuge tube about 45 ml at a time, and centrifuged (1250 × g, 5 min, 4 ° C.) to obtain supernatant plasma and platelets. , White blood cells were removed and red blood cells were separated. 3/2 volumes of physiological saline was added to the separated erythrocytes and mixed, and this was again centrifuged (1250 × g, 5 min, 4 ° C.) to remove the physiological saline. This washing operation with physiological saline was repeated eight times (the eighth centrifugation time was 10 minutes). In this way, 200 ml of washed erythrocytes was prepared. An equal amount of ice-cooled purified water was added to the obtained washed erythrocytes, and the erythrocytes were hemolyzed by shaking vigorously to prepare 400 ml of hemolyzed blood.
[0046]
Next, ¼ volume of toluene was added to the above-mentioned hemolyzed blood, and the mixture was vigorously shaken and centrifuged (1800 × g, 30 min, 4 ° C.) to recover the lower layer portion separated into three layers. . The collected fraction is centrifuged again (1800 × g, 15 min, 4 ° C.) to remove insoluble matter floating on the upper layer or settled on the bottom, and only the transparent part is recovered. [150 ml of this purified hemolyzed blood was taken, 16.7 ml of a stabilizer (50% by weight aqueous solution of saccharose) was added and mixed until uniform,_1CConcentration solution ".
[0047]
(2) Preparation of gel
About 250 ml of m-aminophenylboronic acid agarose gel (manufactured by Sigma) was packed in a column having an inner diameter of 50 mm.
After a flow rate of about 1000 ml of a sodium hydroxide 0.08 wt% solution as a gel adjusting solution was flowed, about 1250 ml of a 0.3 wt% acetic acid solution was also flowed at a flow rate of about 50 ml / min. Subsequently, about 2500 ml of purified water was flowed at a flow rate of about 50 ml / min. In addition, the cooling water of about 20 degreeC was poured through the column jacket with the circulation pump through this gel adjustment process.
[0048]
The gel thus prepared was mixed with an equilibration liquid [EPPS (0.505 wt%), sodium hydroxide (necessary amount to make pH 8.6), sodium chloride (0.877 wt%), magnesium chloride, The gel was equilibrated by flowing about 2500 ml of hexahydrate (0.203 wt%), purified water (remaining amount)] at a flow rate of about 50 ml / min. Through this gel equilibration step, cooling water at about 20 ° C. was passed through the column jacket with a circulation pump.
[0049]
(3) HbA_1CGel adsorption
3000 ml of the purified hemolyzed blood prepared in (1) above was mixed with the gel equilibrated in (2) above, shielded from light at 2-8 ° C. in a vertical column, and allowed to stand for 16-24 hours.
Next, the purified hemolyzed blood collected on the gel bed was discharged from the column with a Komagome pipette. In addition, through this discharge process, about 2-8 degreeC cooling water was poured into the column jacket with the circulation pump.
[0050]
(4) HbA_1CElution of low value solution
The equilibrated liquid having the same composition as the above (2) was allowed to flow at 1000 ml at a flow rate of about 50 ml / min, and the eluted liquid was fractionated and collected in a test tube by a fraction collector. Throughout this elution step, cooling water of about 2 to 8 ° C. was passed through the column jacket with a circulation pump.
A 0.5 g / dl hemoglobin aqueous solution was prepared, and this was used as a control. By visual observation, fractions approximately darker than this control were pooled in a beaker.
[0051]
(5) HbA_1CElution of high value solution
Subsequent to (4) above, 1500 ml of equilibrated liquid having the same composition as in (2) above was flowed at a flow rate of about 50 ml / min (through this step, cooling water of about 2-8 ° C. was supplied to the column jacket with a circulation pump. Flowed). The liquid eluted during this step was discarded.
[0052]
Next, the separation liquid [EPPS (0.505 wt%), sodium hydroxide (necessary amount to make pH 8.6), D-sorbitol (1.822 wt%), purified water (remaining amount)] was flowed. A flow of 1500 to 2000 ml at a flow rate of about 25 ml / min was performed, and the eluted liquid was fractionated and collected in a test tube by a fraction collector. Throughout this elution step, cooling water of about 2 to 8 ° C. was passed through the column jacket with a circulation pump. A 0.5 g / dl hemoglobin aqueous solution was prepared, which was visually pooled as a control from a fraction that was approximately darker than this control to about 100 ml.
[0053]
(6) Dialysis and concentration
HbA obtained by the above (4) and (5)_1CFill the dialysis tube with the low value solution and the same high value solution (low value solution approx. 180 ml / tube, high value solution approx. 100 ml / tube)
The dialysis tube was immersed in purified water, shielded from light at 2 to 8 ° C., and purified water was stirred with a stirrer for about 2 hours (about 20 l of purified water of a low-value solution and about 10 l of purified water of a high-value solution). After completion of the dialysis, the dialysis tube was immersed in purified water, shielded from light at 2 to 8 ° C., and allowed to stand for about 16 hours (about 20 l of purified water of a low-value solution and about 10 l of purified water of a high-value solution).
[0054]
Each dialysis tube after the completion of the dialysis step was immersed in about 5 liters of a concentrating agent (30% by weight aqueous solution of polyethylene glycol 20000), and the concentrating agent was stirred with a stirrer at 2 to 8 ° C.
HbA_1CAfter about 2 hours, the dialysis tube of the low-value solution is removed from the above-mentioned concentrate. After the concentrate adhering to the surface is washed away with ice-cooled purified water, the surface moisture is wiped off with a paper towel, and the liquid in the dialysis tube is removed. Collect in a cylinder, quantify the amount of the solution, add 1/9 volume of stabilizer (50% by weight aqueous solution of saccharose) to this, mix until uniform, and perform freezing as described below through the following concentration adjustment process. It was subjected to a drying process.
[0055]
HbA_1CAfter about 4 hours, the dialysis tube of the high-value solution is removed from the above-mentioned concentrate. After the concentrate adhering to the surface is washed away with ice-cooled purified water, the moisture on the surface is wiped off with a paper towel, and the liquid in the dialysis tube is removed from the graduated cylinder. The amount of the solution was quantified, 1/9 volume of the stabilizer was added thereto, mixed until uniform, and subjected to the freeze-drying step described below through the following concentration adjustment step.
[0056]
(7) HbA_1CAnd concentration adjustment of total hemoglobin
“HbA as raw material blood as prepared in (1)”_1CConcentration solution "and" HbA "prepared in (6) above._1CLow value solution "and" HbA_1CThe total hemoglobin content of the “high-value solution” is quantified by the azide methemoglobin method, and then HbA_1CConcentration was determined by HPLC method [HLC-723HbIII type HbHbA_1CQuantified by an automatic analyzer (manufactured by Tosoh Corporation).
[0057]
Next, “HbA as raw blood”_1CConcentration solution "and" HbA_1CLow value solution "or" HbA_1CHigh-value solution "and mixed with each desired HbA_1CAfter adjusting the concentration, a stabilizer (5% by weight aqueous solution of saccharose) was added to adjust the total hemoglobin concentration to 1.0 g / dl.
[0058]
(8) Freeze drying
  “HbA” whose density is adjusted in (7) above._1CLow value solution "and" HbA_1CDispense 2 ml each of the “high-value solution” into 10 ml brown vials, put these vials in a freeze dryer, and control operation [first stage: −20 ° C. · 10 hours, second stage: −20 ° C. · 10 hours, Third stage: −4 ° C. · 10 hours, final control: 4 ° C. · 60 to 70 hours; ultimate vacuum: about 10 mTorr] to obtain a freeze-dried product. Each vial after lyophilization was filled with nitrogen, sealed and sealed with aluminum. Thus, HbA_1CofControl sampleObtained.
[0059]
  [Test Example] The present inventionsampleOf stability over time before and after freeze-drying
(1) The present inventionsampleHbA_1CThe stability over time before and after lyophilization of saccharose blended as a stabilizer was examined in comparison with the case of blending with other saccharides. That is, HbA in the total hemoglobin amount in each sample in which the total hemoglobin amount before lyophilization was adjusted to 10 g / dl in advance._1CThe amount was measured by the same method as shown in the above production example (7).
[0060]
Next, each of these samples was freeze-dried by the same method as shown in the above Production Example (8), and then 0.5 ml of purified water was added to these freeze-dried products, and HbA in the total hemoglobin amount in each sample._1CThe amount was measured as above.
The results are shown in Table 1.
[0061]
[Table 1]

[0062]
In Table 1, the sample to which no saccharide was added had a remarkable denaturation of hemoglobin due to the lyophilization operation itself after lyophilization, and was unable to withstand HPLC analysis.
In addition, in the group to which D-xylose or D-arabinose, which is an aldose monosaccharide, was added, hemoglobin denaturation by lyophilization operation was suppressed, but HbA before and after lyophilization due to the reaction during lyophilization._1CThe values were very different.
[0063]
From this result, HbA_1CIt was revealed that aldose monosaccharides are unsuitable as stabilizers for imparting stability during freeze-drying.
D-galactose, D-mannitol, and lactose were excluded from this test system because of their low solubility in hemoglobin solutions.
[0064]
(2) Next, the stability over time after freeze-drying of the D-sorbitol added group and the saccharose added group, which were excellent in stability in this test system, was examined.
That is, HbA immediately after lyophilization in the D-sorbitol added group and the saccharose added group_1CThe stability of HbA immediately after lyophilization of the sample_1CValue and HbA one month after lyophilization (room temperature)_1CValues were compared by HPLC method.
The results are shown in Table 2.
[0065]
[Table 2]

As a result, HbA after a long period of time after lyophilization_1CIt became clear that it is optimal to add sucrose as a stabilizer in order to keep the stability of the composition.
[0066]
【The invention's effect】
According to the present invention, HbA that is stable for a long time and is extremely useful in diabetes diagnosis and the like showing an HPLC chromatogram pattern of fresh blood._1C Control samplesIs provided.

Claims (2)

ヘモグロビンＡ_1C及びサッカロースを含んでなるヘモグロビンＡ_1Cの管理試料。A control sample of hemoglobin A _1C comprising hemoglobin A _1C and saccharose. ヘモグロビンＡ_1Cが、血液試料をｍ−アミノフェニルボロン酸をリガンドとして固定したアフィニティクロマトグラム担体で捕捉して得られるヘモグロビンＡ_1Cである請求項１記載の管理試料。Hemoglobin A _1C is, control sample of claim 1 wherein the blood sample m- aminophenylboronic acid is hemoglobin A _1C obtained by capturing by affinity chromatogram carrier fixed as a ligand.