JP3675828B2 - インターロイキン−1β転換酵素様アポトーシスプロテアーゼ−3および4 - Google Patents
インターロイキン−1β転換酵素様アポトーシスプロテアーゼ−3および4 Download PDFInfo
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Description
インターロイキン−1β転換酵素(ICE)は、pro-IL-1βを、成熟かつ活性型のIL-1βへ切断することに関与し、そしてまた生物体が望まない細胞を除去するプロセスであるプログラムされた細胞死(またはアポトーシス)に関与することが最近発見された。本発明は、構造的にICEと関係のあるICE-LAP-3および4に関する。
線虫caenorhabditis elegansにおいて、プログラムされた細胞死の遺伝的経路が確認された(Ellis、R.E.ら、Annu.Rev.Cell Biol.、7:663-698(1991))。2個の遺伝子(ced-3およびced-4)は、C.elegansにおいてプログラムされた細胞死を経る細胞にとって不可欠なものである(Ellis、H.M.、およびHorvitz,H.R.、Cell、44:817-829(1986))。これらの2個の遺伝子の機能を除去する劣性変異体は、C.elegansの発生の間、正常なプログラムされた細胞死を妨げる。ced-3タンパク質に対する公知の脊椎動物の対応物は、ICEである。ced-3とICEとの間の全体にわたるアミノ酸の同一性は28%であり、115個のアミノ酸の領域(ced-3の残基246-360およびICEの残基164-278)で最も高い同一性(43%)を示す。この領域は、保存されたペンタペプチドQACRG(ced-3の残基356-360)を含み、このペプチドはICE機能にとって不可欠であると知られているシステインを含む。本発明のICE-LAP-1および2ポリペプチドはまた、同じ保存されたペンタペプチドおよびICE機能にとって不可欠なシステイン残基を有する。
ced-3とICEとの間の類似性は、ced-3がシステインプロテアーゼとして機能し得ることだけでなく、ICEが脊椎動物のプログラムされた細胞死の遺伝子として作用し得ることも示唆する。ced-3および脊椎動物の対応物(ICE)は、胚発生の間、プログラムされた細胞死を制御する(Gagliarnini、V.ら、Science、263:826:828(1994))。
ICE mRNAは種々の組織で検出され、そのような組織としては、末梢血単球、末梢血リンパ球、末梢血好中球、休止または活性化された末梢血Tリンパ球、胎盤、Bリンパ芽球株CB23、および単球白血病細胞株THP-1細胞(Cerretti、D.P.、ら、Science、256:97-100(1992))が挙げられる。このことは、ICEがpro-IL-1βに加えてさらなる基質を有し得ることを示唆する。ICEが作用し、細胞死を起こす基質は、現在未知である。一つの可能性は、それが、C.elegansの細胞死遺伝子ced-4の脊椎動物ホモログであり得ることである。あるいは、ICEは、細胞生存に不可欠なタンパク質をタンパク質分解的に切断することにより、直接的に細胞死を起こし得る。
哺乳動物遺伝子bcl-2により、細胞自己不活化からリンパ球と呼ばれる免疫細胞を保護することが発見された。また、crmA(牛痘ウイルス遺伝子産生物)は、ICEのタンパク質分割活性を阻害する。
本発明の1つの局面によれば、新規の成熟ポリペプチド、ならびにこれらの生物学的に活性なおよび診断的または治療的に有用なフラグメント、アナログ、および誘導体が提供される。本発明のポリペプチドは、ヒト起源のものである。
本発明の別の局面によれば、本発明のポリペプチドをコードする単離された核酸分子が、提供され、これは、mRNA、DNA、cDNA、ゲノムDNA、ならびにそのアナログ、および生物学的に活性なおよび診断的または治療的に有用なフラグメントを包含する。
本発明のさらなる局面によれば、本発明のポリペプチドをコードする核酸分子を含む原核生物および/または真核生物の組換え宿主細胞を、タンパク質の発現を促進する条件下で培養する工程、続いてタンパク質を回収する工程を包含する組換え技術により、このようなポリペプチドを生成するプロセスが提供される。
本発明のなおさらなる局面によれば、このようなポリペプチド、またはこのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、治療目的(例えば、抗ウイルス剤、抗腫瘍剤、ならびに胚発生および組織恒常性(homeostasis)を制御することとして)のために利用するためのプロセスが提供される。
本発明のなおさらなる局面によれば、本発明の核酸配列に特異的にハイブリダイズするに十分な長さの核酸分子を含む核酸プローブもまた、提供される。
本発明のさらなる局面によれば、このようなポリペプチドに対する抗体が提供される。
本発明のさらに別の局面によれば、例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病、慢性間節リウマチ、敗血症性ショック、および頭部傷害の処置において、このようなポリペプチドの作用を阻害するために用いられ得るこのようなポリペプチドに対するアンタゴニストが提供される。
本発明のなおさらなる局面によれば、疾患または本発明のポリペプチドをコードする核酸配列における変異に関係する疾患に対する感受性を検出するための、診断アッセイが提供される。
本発明のなおさらなる局面によれば、このようなポリペプチドまたはこのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、科学的な研究(例えばDNA合成およびベクターDNAの作製)に関するインビトロの目的のために利用するプロセスが、提供される。
本発明のこれらの局面および他の局面は、本明細書中の教示から当業者には明らかであるべきである。
以下の図面は、本発明の実施態様の例示であり、請求の範囲に含まれる本発明の範囲を限定することを意図しない。
図1は、ICE-LAP-3のcDNA配列および対応する推定アミノ酸配列を示す。示されるアミノ酸配列によりコードされるポリペプチドは、ポリペプチドの推定の成熟形態(最初のメチオニン残基を除く)であり、そしてアミノ酸については、標準的な1文字略記が用いられる。
図2は、ICE-LAP-4のcDNA配列および対応する推定アミノ酸配列を示す。示されるアミノ酸配列によりコードされるポリペプチドは、ポリペプチドの推定の成熟形態(最初のメチオニン残基を除く)である。
図3は、ICE-LAP-3、ICE-LAP-4、ヒトICE、およびC.elegans細胞死遺伝子であるced-3の間のアミノ酸配列の比較を示す。影を付けた領域は、異なる配列間で一致するアミノ酸を示す。
本発明の局面によれば、図1および図2(それぞれ、配列番号2および4)の推定アミノ酸配列を有する成熟ポリペプチドをコードするか、またはATCC受託番号75875および75873として受託されたクローンのcDNAによりコードされる成熟ポリペプチドをコードする単離された核酸(ポリヌクレオチド)が提供される。ATCC受託番号75875は、ICE-LAP-3をコードするcDNAを含み、およびATCC受託番号75873は、ICE-LAP-4をコードするcDNAを含む。受託は1994年8月25日に行われた。
ICE-LAP-3をコードするポリヌクレオチドは、ヒト前立腺、ヒト子宮内膜腫瘍、ヒト膵臓腫瘍、ヒト副腎腫瘍、およびヒト扁桃腺から検出され得る。ICE-LAP-3をコードする完全長は、ヒト子宮内膜腫瘍由来のcDNAライブラリーにおいて発見された。このことは、インターロイキン−1β転換酵素ファミリーに、構造的に関係する。この完全長は、約341アミノ酸残基のタンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含む。このタンパク質は、ヒトインターロイキン−1β転換酵素のホモログであるC.elegans細胞死遺伝子に、アミノ酸配列全体にわたって68%の類似性および43%の同一性で最も高い程度の相同性を示す。ペンタペプチドQACRGは、保存され、アミノ酸259-263位に位置することが示される。
ICE-LAP-4をコードするポリヌクレオチドが、ヒト扁桃腺由来のcDNAライブラリーにおいて発見された。このことは、ICEファミリーに構造的に関係する。このポリヌクレオチドは、約277アミノ酸残基のタンパク質をコードするオープンリーディングフレームを1つ含む。このタンパク質は、C.elegansの細胞死遺伝子ced-3に、277アミノ酸残基長にわたって29%の同一性および46%の類似性で最も高い程度の相同性を示す。ペンタペプチドQACRGは保存され、アミノ161-165位に位置することもまた重要である。
本発明のポリヌクレオチドは、RNAの形態、またはDNAの形態であり得る。このDNAの形態は、cDNA、ゲノムDNA、および合成DNAを包含する。DNAは二本鎖または一本鎖であり得る。そして、一本鎖の場合、コード鎖または非コード(アンチセンス)鎖であり得る。成熟ポリペプチドをコードするコード配列は、図1および図2に示すコード配列(配列番号1および3)と同一であり得るか、または受託したクローンのコード配列と同一であり得る。あるいは、コード配列が、遺伝コードの重複または縮重の結果として、同じ成熟ポリペプチドをコードする異なるコード配列、ならびに図1および図2のDNA(配列番号1または3)または受託したcDNAのような、その誘導体であり得る。
図1および図2の成熟ポリペプチド(配列番号2または4)または受託したcDNAによりコードされる成熟ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは以下を包含し得る:成熟ポリペプチドのコード配列のみ;成熟ポリペプチドのコード配列および付加的なコード配列;成熟ポリペプチドのコード配列(および必要に応じて付加的なコード配列)および非コード配列(例えば、イントロンまたは成熟ポリペプチドのコード配列の5’および/または3’の非コード配列)。
従って、用語「ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド」は、ポリペプチドのコード配列のみを含むポリヌクレオチドならびにさらなるコード配列および/または非コード配列を含むポリヌクレオチドを包含する。
本発明はさらに、図1および図2の推定アミノ酸配列(配列番号2および4)を有するポリペプチドまたは受託したクローンのcDNAによりコードされるポリペプチドの、フラグメント、アナログ、および誘導体をコードする本明細書中上記のポリヌクレオチドの変異体に関する。ポリヌクレオチドの変異体は、ポリヌクレオチドの天然には存在しない対立遺伝子変異体またはポリヌクレオチドの天然には存在しない変異体であり得る。
従って、本発明は、図1および図2に示すもの(配列番号2および4)と同じ成熟ポリペプチドまたはその受託したクローンのcDNAによりコードされる同じ成熟ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、ならびにこのようなポリヌクレオチドの変異体を包含する。これらの変異体は、図1および図2のポリペプチド(配列番号2または4)または受託したクローンのcDNAによりコードされるポリペプチドのフラグメント、誘導体、またはアナログをコードする。このようなヌクレオチド変異体は、欠失変異体、置換変異体、および付加または挿入変異体を包含する。
本明細書中上記で示したように、ポリヌクレオチドは、図1および図2に示すコード配列(配列番号1および3)または受託したクローンのコード配列の天然に存在する対立遺伝子変異体であるコード配列を有し得る。当該分野で公知であるように、対立遺伝子変異体は、ヌクレオチドの置換、欠失、または付加を有し得るポリヌクレオチド配列の別の形態であり、これはコードされるポリペプチドの機能を実質的には変化させない。ポリヌクレオチドはまた、成熟タンパク質およびさらなる5'アミノ酸残基であるプロタンパク質をコードし得る。
本発明のポリヌクレオチドはまた、本発明のポリペプチドの精製を可能にする配列にインフレームで融合されたコード配列を有し得る。マーカー配列は、細菌宿主の場合にマーカーに融合された成熟ポリペプチドの精製に備えるpQE-9ベクターにより供給されるヘキサヒスチジンタグであり得る。または、例えば、マーカー配列は、哺乳動物宿主(例えば、COS-7細胞)が使用される場合、ヘマグルチニン(HA)タグであり得る。HAタグは、インフルエンザヘマグルチニンタンパク質由来のエピトープに対応する(Wilson,I.ら、Cell、37:767 (1984))。
用語「遺伝子」は、ポリペプチド鎖の産生に関与するDNAセグメントを意味する;遺伝子は、コード領域の前および後ろの領域(リーダーおよびトレイラー)、ならびに個々のコードセグメント(エキソン)間の介在配列(イントロン)を含む。
本発明の完全長の遺伝子のフラグメントは、ハイブリダイゼーションプローブとして、完全長の遺伝子を単離するため、およびその遺伝子に高い配列類似性を有するかまたは類似の生物学的活性を有する他の遺伝子を単離するためcDNAライブラリーに対して用いられ得る。このタイプのプローブは、好ましくは少なくとも30塩基を有し、および例えば、50塩基またはそれ以上を含み得る。このプローブはまた、完全長の転写産物に対応するcDNAクローン、およびゲノムDNAクローン、または制御領域、プロモーター領域、エキソン、およびイントロンを含む完全な遺伝子を含むクローンを同定するために用いられ得る。スクリーニングの一つの例は、公知のDNA配列を用いてオリゴヌクレオチドプローブを合成することにより、その遺伝子のコード領域を単離する工程を包含する。本発明の遺伝子の配列に完全に補助的な配列を有する、標識オリゴヌクレオチドは、ヒトcDNA、またはゲノムDNA、あるいはmRNAのライブラリーをスクリーニングして、プローブがハイブリダイズするライブラリーのメンバーを決定するために用いられる。
本発明はさらに、配列間に少なくとも70%、好ましくは少なくとも90%、およびさらに好ましくは少なくとも95%の同一性が存在する場合、本明細書中上記の配列にハイブリダイズするポリヌクレオチドに関する。本発明は特に、本明細書中上記のポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドに関する。本明細書中で用いられる用語「ストリンジェントな条件」は、ハイブリダイゼーションが、配列間に少なくとも95%および好ましくは少なくとも97%の同一性が存在する場合のみに生じることを意味する。好ましい実施態様において本明細書中上記のポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドは、図1および図2(配列番号1および3)のcDNAまたは受託したcDNAによりコードされる成熟ポリペプチドと実質的に同じ生物学的機能または生物学的活性のいずれかを保持するポリペプチドをコードする。
あるいは、ポリヌクレオチドは、少なくとも20塩基、好ましくは30塩基、およびさらに好ましくは少なくとも50塩基を有し得る。これは、本発明のポリヌクレオチドおよび本明細書中上記のように本発明のポリヌクレオチドに同一性を有するポリヌクレオチド、および活性を保持し得るかまたは保持しなくてもよいポリヌクレオチドにハイブリダイズする。例えば、このようなポリヌクレオチドは、配列番号1および3のポリヌクレオチドに対するプローブとして用いられ得、例えば、ポリヌクレオチドの回収のために、または診断プローブとして、またはPCRプライマーとして用いられ得る。
従って、本発明は、配列番号2および4のポリペプチド、および、そのフラグメント(このフラグメントは少なくとも30塩基、および好ましくは50塩基を有する)に対して、ならびにこのようなオリゴヌクレオチドにコードされるポリペプチドに対して、少なくとも70%、好ましくは少なくとも90%、さらに好ましくは少なくとも95%の同一性を有するポリヌクレオチドに関する。
本明細書中でいう受託物は、特許手続きの目的のための微生物の受託の国際的承認に関するブタペスト条約の条項下に維持される。これらの受託物は、当業者に便宜上のみ提供され、そして米国特許法第112条の下で受託が必要とされることを容認するものではない。受託物に含まれるポリヌクレオチドの配列、ならびにそれによりコードされるポリペプチドのアミノ酸配列は、本明細書中に参考として援用されており、そして本明細書中の配列の記載とのいかなる矛盾の場合も制御されている。受託物を製造し、使用し、または販売するためには実施許諾が必要とされ得、そしてこのような実施許諾はこれによって与えられるわけではない。
本発明はさらに、図1および図2の推定アミノ酸配列(配列番号2および4)を有する、または受託したcDNAによりコードされるアミノ酸配列を有するICE-LAP-3およびICE-LAP-4ポリペプチド、ならびにこのようなポリペプチドのフラグメント、アナログ、および誘導体に関する。
用語「フラグメント」、「誘導体」、および「アナログ」は、図1および図2のポリペプチド(配列番号2および4)、または受託したcDNAによりコードされるポリペプチドをいう場合は、このようなポリペプチドと本質的に同じ生物学的機能または生物学的活性を保持するポリペプチドを意味する。そして、この場合、誘導体は増強したまた低減した生物学的機能を有するポリペプチドを包含する。
本発明のポリペプチドは、組換えポリペプチド、天然のポリペプチド、または合成ポリペプチドであり得、好ましくは組換えポリペプチドであり得る。
図1および図2のポリペプチド(配列番号2および4)、または受託したcDNAによりコードされるポリペプチドのフラグメント、誘導体、またはアナログは、(i)その中で1以上のアミノ酸残基が保存または非保存アミノ酸残基(好ましくは保存アミノ酸残基)で置換され、そしてこのような置換されるアミノ酸残基が、遺伝コードによりコードされるアミノ酸残基であり得るかまたはそうでなくてもよいフラグメント、誘導体、またはアナログ、または(ii)その中で1以上のアミノ酸残基が置換基を含むフラグメント、誘導体、またはアナログ、または(iii)その中で成熟ポリペプチドがポリペプチドの半減期を増加させる化合物(例えば、ポリエチレングリコール)のような別の化合物に融合されているフラグメント、誘導体、またはアナログ、または(iv)その中の1つは、成熟ポリペプチドの精製に用いるために、さらなるアミノ酸が成熟ポリペプチドに融合されているフラグメント、誘導体、またはアナログである。このようなフラグメント、誘導体、およびアナログは、本明細書中の教示から、当業者の範囲内にあると考えられる。
本発明のポリペプチドおよびポリヌクレオチドは、好ましくは単離された形態で提供され、そして好ましくは均質に精製される。用語「単離された」は、物質がその本来の環境(例えば、天然に存在する場合は、天然の環境)から取り出されていることを意味する。例えば、生きている動物に存在する天然に存在するポリヌクレオチドまたはポリペプチドは単離されていないが、天然において共存する物質の幾らかまたは全部から分離された同一のポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、単離されている。このようなポリヌクレオチドはベクターの一部であり得、および/またはこのようなポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、組成物の一部であり得、そしてさらにこのようなベクターまたは組成物がその天然の環境の一部ではないため単離されている。
本発明のポリペプチドは、以下のポリペプチドを含む;配列番号2および4(とくに成熟ポリペプチド);および配列番号2および4のポリペプチドに少なくとも70%の類似性(好ましくは少なくとも70%の同一性)を有するポリペプチド:および、さらに好ましくは配列番号2および4のポリペプチドに少なくとも90%の類似性(さらに好ましくは少なくとも90%の同一性)を有するポリペプチド:および、なおさらに好ましくは、配列番号2および4のポリペプチドに少なくとも95%の類似性(なおさらに好ましくは少なくとも95%の同一性)を有するポリペプチド。そしてさらに、本発明のポリペプチドは少なくとも30アミノ酸、さらに好ましくは少なくとも50アミノ酸を一般的に含むポリペプチドのこのような一部を有するこのようなポリペプチドを包含する。
当該分野において公知であるように、2つのポリペプチドの間の「類似性」は、アミノ酸配列の比較により決定され、その一方のポリペプチドで保存されたアミノ酸配列は、第2のポリペプチド配列を代用する。
本発明の、ポリペプチドのフラグメントまたはポリペプチドの部分は、ペプチド合成により対応の完全長のポリペプチドを生成するために用いられ得る;従って、フラグメントは、完全長のポリペプチドを生成するための中間生産物として用いられ得る。本発明の、ポリヌクレオチドのフラグメントまたはポリヌクレオチドの部分は、本発明の完全長のポリヌクレオチドを合成するために用いられ得る。
本発明はまた、本発明のポリヌクレオチドを含むベクター、本発明のベクターを用いて遺伝子操作される宿主細胞、および組換え技術による本発明のポリペプチドの生成に関する。
宿主細胞は、本発明のベクター(これは例えば、クローニングベクターまたは発現ベクターであり得る)を用いて遺伝子操作(形質導入または形質転換またはトランスフェクト)される。ベクターは、例えば、プラスミド、ウイルス粒子、ファージなどの形態であり得る。操作された宿主細胞は、プロモーターを活性化し、形質転換体を選択し、またはICE-LAP-3およびICE-LAP-4遺伝子を増幅するために適切に改変された従来の栄養培地中で培養され得る。培養条件(例えば、温度、pHなど)は、発現のために選択される宿主細胞で以前に使用された条件であり、そして当業者には明らかである。
本発明のポリヌクレオチドは、組換え技術によりポリペプチドを生成するために用いられ得る。従って、例えば、ポリヌクレオチドは、ポリペプチドを発現するための種々の発現ベクターのいずれか1つ内に含まれ得る。このようなベクターは、染色体、非染色体、および合成DNA配列を包含し、例えば、SV40の誘導体;細菌性プラスミド;ファージDNA;バキュロウイルス;酵母プラスミド;プラスミドおよびファージDNAの組み合わせに由来するベクター、ワクシニア、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、および仮性狂犬病のようなウイルスDNAである。しかし、宿主において複製可能で、そして存続可能である限り、任意の他のベクターが使用され得る。
適切なDNA配列は、種々の手順によりベクターに挿入され得る。一般に、DNA配列は当該分野で公知の手順により適切な制限エンドヌクレアーゼ部位に挿入される。このような手順および他の手順は、当業者に公知の範囲内であると考えられる。
発現ベクター中のDNA配列は、適切な発現制御配列(プロモーター)に作動可能に連結され、mRNAの合成を指示する。このようなプロモーターの代表的な例としては、以下が挙げられ得る:レトロウイルス(例えば、RSV、HIV、HTLVI、CMV、またはSV40プロモーター)由来のLTR、E.coli lacまたはtrp、λファージPLプロモーター、および原核細胞または真核細胞あるいはそれらのウイルス内で遺伝子の発現を制御することが公知である他のプロモーター。しかし、細胞シグナル(例えばヒト-β-アクチンプロモーター)もまた、用いられ得る。発現ベクターはまた、翻訳開始のためのリボソーム結合部位および転写ターミネーターを含有し得る。ベクターはまた、遺伝子のコピー数を増幅するための適切な配列を含み得る。
さらに、発現ベクターは、好ましくは、形質転換された宿主細胞の選択のための表現型特性(例えば、真核細胞培養物についてはジヒドロ葉酸レダクターゼまたはネオマイシン耐性、あるいはE.coliにおけるテトラサイクリン耐性またはアンピシリン耐性)を提供する1つ以上の選択マーカー遺伝子を含有する。
本明細書中上記のような適切なDNA配列ならびに適切なプロモーター配列または制御配列を含有するベクターは、適切な宿主を形質転換して宿主にタンパク質を発現させるために用いられ得る。
適切な宿主の代表的な例としては、以下が挙げられ得る:細菌細胞(例えば、E.coli、Bacillus subtilis、Streptomyces、Salmonella typhimurium);真菌細胞(例えば酵母);昆虫細胞(例えば、DrosophilaおよびSpodoptera Sf9);アデノウイルス;動物細胞(例えば、CHO、COS、HEK 293、またはBowes黒色腫);植物細胞など。適切な宿主の選択は、本明細書中の教示から当業者の範囲内であると考えられる。
さらに詳細には、本発明はまた、上記で広範に記載した1つ以上の配列を含む組換え構築物を包含する。構築物は、ベクター(例えば、プラスミドベクターまたはウイルスベクター)を包含し、このベクターの中には本発明の配列が正方向または逆方向に挿入されている。この実施態様の好ましい局面によれば、構築物はさらに、配列に作動可能に連結された調節配列(例えば、プロモーターを包含する)を含む。多数の適切なベクターおよびプロモーターが当業者には公知であり、そして市販されている。以下のベクターが例として提供される。細菌性:pQE70、pQE60、pQE-9(Qiagen)、pbs、pD10、phagescript、psiX174、pbluescript SK、pbsks、pNH8A、pNH16a、pNH18A、pNH46A(Stratagene);ptrc99a、pKK223-3、pKK233-3、pDR540、pRIT5(Pharmacia)。真核性:pWLNEO、pSV2CAT、pOG44、pXT1、pSG(Stratagene)pSVK3、pBPV、pMSG、pSVL(Pharmacia)。しかし、宿主において複製可能で、そして存続可能である限り、任意の他のプラスミドまたはベクターも使用され得る。
プロモーター領域は、CAT(クロラムフェニコールトランスフェラーゼ)ベクターまたは選択マーカーを有する他のベクターを使用して、任意の所望の遺伝子から選択され得る。2つの適切なベクターは、pKK232-8およびpCM7である。特によく知られた細菌プロモーターは、lacI、lacZ、T3、T7、gpt、λPR、PL、およびtrpを包含する。真核プロモーターは、CMV即時初期型、HSVチミジンキナーゼ、初期SV40および後期SV40、レトロウイルス由来のLTR、およびマウスメタロチオネイン-Iを包含する。適切なベクターおよびプロモーターの選択は、十分に当業者のレベルの範囲内にある。
さらなる実施態様では、本発明は上記の構築物を含有する宿主細胞に関する。宿主細胞は、高等真核細胞(例えば、哺乳動物細胞)または下等真核細胞(例えば、酵母細胞)であり得るか、または宿主細胞は原核細胞(例えば、細菌細胞)であり得る。構築物の宿主細胞への導入は、リン酸カルシウムトランスフェクション、DEAE-デキストラン媒介トランスフェクション、リポフェクション、またはエレクトロポレーションにより達成され得る(Davis,L.、Dibner,M.、Battey,I.、Basic Methods in Molecular Biology、(1986))。
宿主細胞中の構築物は、組換え配列によりコードされる遺伝子産物を産生するために、従来の方法で使用され得る。あるいは、本発明のポリペプチドは、従来のペプチド合成機により合成的に生成され得る。
成熟タンパク質は、哺乳動物細胞、酵母、細菌、または他の細胞中で、適切なプロモーターの制御下で発現され得る。無細胞翻訳系もまた、このようなタンパク質を生成するために、本発明のDNA構築物に由来するRNAを使用して用いられ得る。原核宿主および真核宿主で使用される適切なクローニングベクターおよび発現ベクターは、Sambrookら、Molecular Cloning: A Laboratory Manual,第2版、Cold Spring Harbor、N.Y.、(1989)(この開示は、本明細書中に参考として援用されている)に記載されている。
本発明のポリペプチドをコードするDNAの高等真核生物による転写は、ベクターにエンハンサー配列を挿入することにより増大される。エンハンサーはDNAのシス作用エレメントであり、通常は約10〜約300bpであり、これはプロモーターに作用してその転写を増大させる。例としては、複製起点bp100〜270の後期側のSV40エンハンサー、サイトメガロウイルスの早期プロモーターエンハンサー、複製起点の後期側のポリオーマエンハンサー、およびアデノウイルスエンハンサーを包含する。
一般に、組換え発現ベクターは、複製起点および宿主細胞の形質転換を可能とする選択マーカー(例えば、E.coliのアンピシリン耐性遺伝子およびS.cerevisiaeのTRP1遺伝子)、および下流の構造配列の転写を指示する高発現遺伝子に由来するプロモーターを包含する。このようなプロモーターは、特に解糖酵素(例えば、3-ホスホグリセリン酸キナーゼ(PGK))、α因子、酸性ホスファターゼ、または熱ショックタンパク質などをコードするオペロンに由来し得る。異種構造配列は、翻訳開始配列および翻訳終止配列、および好ましくは翻訳されたタンパク質を細胞周辺腔または細胞外培地へ分泌することを指向し得るリーダー配列と適切な相内で組立てられる。必要に応じて、異種配列は、所望の特徴(例えば、発現された組換え産物の安定化または簡略化された精製)を与えるN末端同定ペプチドを含む融合タンパク質をコードし得る。
細菌の使用に有用な発現ベクターは、機能的なプロモーターと作動可能なリーディングフレームで、所望のタンパク質をコードする構造DNA配列を適切な翻訳開始シグナルおよび翻訳終止シグナルと共に挿入することにより構築される。ベクターは、1つ以上の表現型選択マーカー、ならびにベクターの維持を保証するため、および所望により宿主内での増幅を提供するために複製起点を含む。形質転換のために適切な原核宿主は、E.coli、Bacillus subtilis、Salmonella typhimurium、ならびにPseudomonas属、Streptomyces属、およびStaphylococcus属の種々の種を包含するが、他の種もまた選択対象として用いられ得る。
代表的な、しかし限定しない例として、細菌の使用に有用な発現ベクターは、周知のクローニングベクターpBR322(ATCC 37017)の遺伝エレメントを含む市販のプラスミドに由来する選択マーカーおよび細菌の複製起点を含み得る。このような市販のベクターは、例えば、pKK223-3(Pharmacia Fine Chemicals、Uppsala、Sweden)およびGEM1(Promega Biotec、Madison、WI、USA)を包含する。これらのpBR322「骨格」部分は、適切なプロモーターおよび発現されるべき構造配列と組み合わされる。
適切な宿主系統の形質転換および適切な細胞密度への宿主系統の増殖に続いて、選択されたプロモーターは、適切な手段(例えば、温度シフトまたは化学的誘導)により誘導され、そして細胞はさらなる期間培養される。
細胞は、代表的には遠心分離により収集され、物理的手段または化学的手段により破砕され、そして得られた粗抽出物はさらなる精製のために保持される。
タンパク質の発現において用いられる微生物細胞は、凍結融解サイクル、超音波処理、機械的破砕、または細胞溶解剤の使用を包含する任意の簡便な方法により破砕され得、このような方法は、当業者に周知である。
種々の哺乳動物細胞の培養系もまた、組換えタンパク質を発現するために用いられ得る。哺乳動物発現系の例は、Gluzman、Cell、23: 175(1981)に記載されているサル腎臓繊維芽細胞のCOS-7株、および適合性のベクターを発現し得る他の細胞株(例えば、C127、3T3、CHO、HeLa、およびBHK細胞株)を包含する。哺乳動物発現ベクターは、複製起点、適切なプロモーターおよびエンハンサー、ポリアデニル化部位、スプライスドナー部位およびスプライスアクセプター部位、転写終止配列、および5'フランキング非転写配列を包含し得る。SV40スプライスおよびポリアデニル化部位に由来するDNA配列は、必要な非転写遺伝エレメントを提供するために使用され得る。
ICE-LAP-3およびICE-LAP-4ポリペプチドは、以下に挙げる方法により組換え細胞培養物から回収され、そして精製され得る。これらの方法には、硫安沈殿またはエタノール沈殿、酸抽出、陰イオンまたは陽イオン交換クロマトグラフィー、リン酸セルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、およびレクチンクロマトグラフィーが包含される。必要に応じて、タンパク質の再折りたたみ(refolding)工程が、成熟タンパク質の配置を安全にするために使用され得る。最終的に、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)が、最終的な精製工程に用いられ得る。
本発明のポリペプチドは、天然の精製された産物、または化学合成手順の産物であり得るか、あるいは原核宿主または真核宿主(例えば、培養物中の細菌、酵母、高等植物、昆虫、および哺乳動物細胞により)から組換え技術により生成され得る。組換え産生手順に用いられる宿主に依存して、本発明のポリペプチドは、グリコシル化され得るか、あるいはグリコシル化され得ない。本発明のポリペプチドはまた、開始メチオニンアミノ酸残基を含み得る。
ICE-LAP-3およびICE-LAP-4ポリペプチドは、異常に制御されたプログラム細胞死を処置するために用いられ得る。異常に制御されたプログラム細胞死は、細胞成長の異常な量によるガンの基礎的な原因であり得る。それゆえ、ICE-LAP遺伝子は、プログラムされた細胞死に関係するので、望まれない細胞(例えば、ガン細胞)を標的にするのに用いられ得る。ICE-LAP-3およびICE-LAP-4はまた、脊椎動物の成長および組織の恒常性(そのアポトーシス能による)を制御するのに用いられ得る。また、プログラム細胞死は、細胞の主要な抗ウイルス防衛メカニズムの一つであり得るので、ICE-LAP-3およびICE-LAP-4ポリペプチドは、抑制されたプログラム細胞死に打ち勝つことで、多くのウイルス感染に打ち勝つために用いられ得る。
ICE-LAP-3およびICE-LAP-4はまた、細胞死に対するウイルス感染細胞を標的することにより免疫抑制に関連する異常(例えば、AIDS)を処置するのに用いられ得る。
本発明はさらに、ICE-LAP-3およびICE-LAP-4に対するアンタゴニストを同定するための化合物をスクリーニングするためのプロセスに関する。このようなアッセイの例は、これは天然の基質と共に、基質上での作用を可能にする条件下において、ICE-LAP-3またはICE-LAP-4と、潜在的なアンタゴニスト化合物とを結合させる工程、および化合物が、ICE-LAP-3またはICE-LAP-4が基質を切断することを妨げるかどうかを決定する工程を包含する。
潜在的なアンタゴニストは、抗体、または、いくつかの場合、ポリペプチドに結合するオリゴペプチドを含む。あるいは、潜在的なアンタゴニストは、基質に結合するタンパク質に密接に関係し得るが、これらは、ポリペプチドの形態では不活性であり、それゆえ、本発明のポリペプチドの作用を妨げる。
別の潜在的なアンタゴニストは、アンチセンス技術を用いて調製されたアンチセンス構築物である。アンチセンス技術は、トリプル-ヘリックス構造あるいはアンチセンスDNAまたはRNAを介してコントロール遺伝子の発現を制御するために用いられ得る。この方法は、どちらもポリヌクレオチドをDNAまたはRNAに結合させることに基づく。例えば、ポリヌクレオチド配列の5'コード部分は、本発明の成熟ポリペプチドをコードし、約10塩基対〜40塩基対の長さのアンチセンスRNAオリゴヌクレオチドを設計するために用いられる。DNAオリゴヌクレオチドは、転写に関与する遺伝子の領域(トリプル-ヘリックス、Leeら、Nucl.Acids Res.,6:3073(1979);Cooneyら、Science,241:456(1988);およびDervanら、Science,251:1360(1991)、を参照のこと)に相補的になるように設計され、それゆえ、ICE-LAP-3およびICE-LAP-4の転写および生成を妨げる。アンチセンスRNAオリゴヌクレオチドは、インビボでmRNAにハイブリダイズし、mRNA分子のICE-LAP-3およびICE-LAP-4への翻訳をブロックする(アンチセンス-Okano,J.Neurochem.,56:560(1991);遺伝子発現のアンチセンスインヒビターとしてのオリゴヌクレオチド、CRC Press,Boca Raton,FL(1988))。上記のオリゴヌクレオチドはまた、細胞に送達され、ICE-LAP-3およびICE-LAP-4の生成を阻害するように、インビボでアンチセンスRNAまたはDNAを発現し得る。
潜在的なアンタゴニストは、ポリペプチドの触媒部位に結合して、占有する小分子を含む。それにより、提供された触媒部位を基質に対して接触不可能にして、正常な生物学的活性を妨げる。小分子の例は、小ペプチドまたはペプチド様分子を含むが、これらに限定されない。
アンタゴニストは、アンタゴニストのプログラムされない壊死(necrotic)細胞死を処置するために用いられ得る。壊死細胞死は、心臓血管疾患、発作、外傷、および他の変性疾患に関連し、ここで、ICE-LAP-3およびICE-LAP-4の異常な調節が病理学的な細胞死(例えば免疫抑制関連性障害、アルツハイマー病、パーキンソン病、および慢性関節リウマチ)を導き得る。
アンタゴニストはまた、肺、気管(airway)、中枢神経系、目および耳、関節、骨、心臓血管系、ならびに胃腸系および泌尿器系の免疫に基づく疾患を処置するために用いられ得る。アンタゴニストは、例えば本明細書に記載されるような薬学的に受容可能なキャリアと共に組成物として用いられ得る。
本発明のポリペプチドおよびアンタゴニスト化合物は、適切な薬学的キャリアと組み合わせて用いられ得る。このような組成物は、治療有効量のポリペプチドまたはアンタゴニスト、および薬学的に受容可能なキャリアまたは賦形剤を含む。このようなキャリアとしては、生理食塩水、緩衝化生理食塩水、デキストロース、水、グリセロール、エタノール、およびそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。処方は、投与の態様に合わせるべきである。
本発明はまた、本発明の薬学的組成物の1つ以上の成分で満たされた1つ以上の容器を含有する薬学的パックまたはキットを提供する。このような容器は、薬剤または生物学的製品の製造、使用、または販売を統制する政府機関により規定された形式の通知と関連し得、この通知はヒトへの投与についての製造、使用、または販売における政府機関による認可を反映する。さらに、本発明のポリペプチドまたはアンタゴニストは、他の治療用化合物と併用して用いられ得る。
薬学的組成物は、静脈内、腹腔内、筋内、皮下、鼻腔内、または皮内経路によるような、簡便な方法で投与され得る。ICE-LAP-3およびICE-LAP-4は、特定の徴候の処置および/または予防に対して有効である量で投与される。一般に、ICE-LAP-3およびICE-LAP-4は、少なくとも10μg/kg体重の量で投与され、そしてほとんどの場合、1日当たり8mg/kg体重を超えない量で投与される。ほとんどの場合、投与経路、症状などを考慮して、投薬量は毎日約10μg/kg体重〜約1mg/kg体重である。
このポリペプチドはまた、インビボでのこのようなポリペプチドの発現により本発明に従って、使用され得る。これはしばしば「遺伝子治療」と呼ばれる。
従って、例えば、患者由来の細胞は、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド(DNAまたはRNA)を用いてエキソビボで操作され得、次いで、操作された細胞はこのポリペプチドで処置されるべき患者に提供される。このような方法は当該分野で周知である。例えば、細胞は、本発明のポリペプチドをコードするRNAを含有するレトロウイルス粒子の使用により、当該分野で公知の手順によって操作され得る。
同様に、細胞は、インビボでのポリペプチドの発現のために、例えば、当該分野で公知の手順によりインビボで操作され得る。当該分野で公知のように、本発明のポリペプチドをコードするRNAを含有するレトロウイルス粒子を産生するための産生細胞は、インビボで細胞を操作するためおよびインビボでのポリペプチドの発現のために患者に投与され得る。このような方法により本発明のポリペプチドを投与するためのこれらの方法および他の方法は、本発明の教示から当業者には明らかである。例えば、細胞を操作するための発現ベヒクル(vehicle)は、レトロウイルス以外のもの(例えば、アデノウイルス)であり得る。これは、適切な送達ベヒクルと組み合わせた後、インビボで細胞を操作するために使用され得る。
本明細書上記のレトロウイルスプラスミドベクターが由来し得るレトロウィルスは、モロニーマウス白血病ウイルス、脾臓壊死(spleen necrosis)ウイルス、レトロウイルス(例えば、ラウス肉腫ウイルス、ハーベイ(Harvey)肉腫ウイルス、鳥類白血病ウイルス、テナガザル白血病ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、アデノウイルス、骨髄増殖性肉腫ウイルス、および哺乳動物腫瘍ウイルス)を含むが、これらに限定されない。一つの実施態様において、レトロウイルスプラスミドベクターは、モロニーマウス白血病ウイルスに由来する。
ベクターは一つまたはそれより多いプロモーターを含有する。使用され得る適切なプロモーターは、レトロウイルスLTR;SV40プロモーター;およびMillerら、Biotechniques,第7巻,第9号,980-990(1989)に記載のヒトサイトメガロウイルス(CMV)プロモーター、または他の任意のプロモーター(例えば、真核細胞プロモーターのような細胞プロモーター。これはヒストン、pol III、およびβ-アクチンプロモーターを含むが、これらに限定されない。)を含むが、これらに限定されない。使用され得る他のウイルスプロモーターは、アデノウイルスプロモーター、チミジンキナーゼ(TK)プロモーター、およびB19パルボウイルスプロモーターを含むが、これらに限定されない。適切なプロモーターの選択は、本明細書中に含まれる教示から当業者には明白である。
本発明のポリペプチドをコードする核酸配列は、適切なプロモーターの制御下にある。使用され得る適切なプロモーターは、アデノウイルスプロモーター(例えば、アデノウイルス主要後期プロモーター);または異種のプロモーター(例えば、サイトメガロウイルス(CMV)プロモーター);呼吸シンシチアルウイルス(RSV)プロモーター;誘導性プロモーター(例えば、MMTプロモーター、メタロチオネインプロモーター);熱ショックプロモーター;アルブミンプロモーター;ApoAIプロモーター;ヒトグロビンプロモーター;ウイルスチミジンキナーゼプロモーター(例えば、単純ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター);レトロウイルスLTR(これは本明細書上記の改変レトロウイルスLTRを含む);β-アクチンプロモーター;およびヒト成長ホルモンプロモーターを含むが、これらに限定されない。プロモーターはまた、ポリペプチドをコードする遺伝子を制御する天然のプロモーターであり得る。
レトロウイルスプラスミドベクターは、パッケージ細胞株に形質導入して、産生細胞株を形成するために使用され得る。トランスフェクトされ得るパッケージ細胞の例は、その全体が本明細書中に参考として援用されているMiller、Human Gene Therapy,第1巻,5〜14頁(1990)に記載されたPE501、PA317、Ψ-2、Ψ-AM、PA12、T19-14X、VT-19-17-H2、ΨCRE、ΨCRIP、GP+E-86、GP+envAm12、およびDAN細胞株を含むが、これらに限定されない。ベクターは、当該分野に公知の任意の手段によってパッケージ細胞に形質導入し得る。このような手段は、エレクトロポレーション、リポソームの使用、およびCaPO4沈澱を含むが、これらに限定されない。別の一つの実施態様において、レトロウイルスプラスミドベクターは、リポソーム中にカプセル化されるか、または脂質と結合され、そして次に宿主に投与され得る。
産生細胞株は、ポリペプチドをコードする核酸配列を含む感染性レトロウイルスベクター粒子を生じる。次に、このようなレトロウイルスベクター粒子は、インビトロまたはインビボのどちらかで真核細胞に形質導入するために使用され得る。形質導入された真核細胞は、ポリペプチドをコードする核酸配列を発現する。形質導入され得る真核細胞は、胚性幹細胞、胚性ガン細胞ならびに造血幹細胞、肝細胞、繊維芽細胞、筋芽細胞、ケラチノサイト、内皮細胞、および気管支上皮細胞を含むが、これらに制限されない。
本発明はまた、診断薬としての本発明の遺伝子の使用に関する。この遺伝子の変異形態の検出は、疾患、または本発明のポリペプチドの発現低下から生じる疾患に対する感受性の診断を可能にする。
ヒトICE-LAP 3および4遺伝子に変異を有する個体は、多様な技術によってDNAレベルで検出され得る。診断用の核酸は、患者の細胞から得られ得る。これは、血液、尿、唾液、組織生検および剖検材料を含むが、これらに制限されない。ゲノムDNAは、検出のために直接使用され得るか、または分析の前にPCR(Saikiら、Nature,324:163-166(1986))を使用して酵素的に増幅され得る。RNAまたはcDNAもまた、同じ目的に使用され得る。例として、本発明のポリペプチドをコードする核酸と相補的なPCRプライマーは、変異を同定および分析するために使用され得る。例えば、欠失および挿入は、正常な遺伝子型と比較したときの増幅産物のサイズ変化によって検出され得る。点変異は、増幅されたDNAを放射標識ICE-LAP 3および4RNA、またはあるいは放射標識ICE-LAP 3および4アンチセンスDNA配列とハイブリダイズすることによって同定され得る。完全にマッチした配列は、RNase A消化または融解温度の差によってミスマッチ二本鎖と区別され得る。
参照遺伝子と変異を有する遺伝子との間の配列の差は、直接DNA配列決定法によって明らかにされ得る。さらに、クローン化されたDNAセグメントは、特異的なDNAセグメントを検出するためのプローブとして使用され得る。この方法の感受性は、PCRと組み合わせた場合、非常に増強される。例えば、配列決定プライマーは、二本鎖PCR産物または改変PCRによって生じた一本鎖テンプレート分子と共に使用される。配列決定は、放射標識ヌクレオチドを用いる従来の手順または蛍光タグを用いる自動配列決定手順によって行われる。
DNA配列の差に基づく遺伝子試験は、変性試薬を含むかまたは含まないゲルにおけるDNAフラグメントの電気泳動移動度の変化の検出によって達成され得る。小さな配列欠失および挿入は高分解能ゲル電気泳動によって可視化され得る。異なる配列のDNAフラグメントは、変性ホルムアミド勾配ゲルで分けられ得る。そこでは異なるDNAフラグメントの移動度は、その特異的な融解温度または部分融解温度に従って、ゲル中で異なる位置で遅らされる(例えば、Myersら、Science,230:1242(1985)を参照のこと)。
特異的な位置での配列変化はまた、ヌクレアーゼ保護アッセイ(例えば、RNaseおよびS1保護または化学切断法)によって明らかにされ得る(例えば、Cottonら、PNAS,USA,85:4397-4401(1985))。
従って、特異的なDNA配列の検出は、ゲノムDNAのハイブリダイゼーション、RNase保護、化学切断、直接DNA配列決定、または制限酵素の使用(例えば、制限断片長多型(RELP))およびサザンブロッティングのような方法によって達成され得る。
さらに伝統的なゲル電気泳動およびDNA配列決定に加えて、変異はまたインサイチュ分析によって検出され得る。
本発明はまた、種々の組織におけるICE-LAP 3および4タンパク質のレベル変化を検出するための診断アッセイに関する。宿主に由来するサンプルにおけるICE-LAP 3および4タンパク質のレベルを検出するために使用されるアッセイは、当業者には周知であり、そしてラジオイムノアッセイ、競合結合アッセイ、ウエスタンブロット分析および好ましくはELISAアッセイを含む。ELISAアッセイは、初めにICE-LAP 3および4抗原に特異的な抗体、好ましくはモノクローナル抗体を調製する工程を包含する。さらにレポーター、抗体はモノクローナル抗体に対して調製される。このレポーター、抗体に検出可能な試薬(例えば、放射活性、蛍光または本実施例における西洋ワサビペルオキシダーゼ酵素)を接着させる。ここでサンプルは宿主から取り出され、そしてサンプル中のタンパク質を結合する固体支持体(例えば、ポリスチレンディッシュ)上でインキュベートされる。次に、ディッシュ上の任意の遊離タンパク質結合部位は、非特異的タンパク質(例えば、ウシ血清アルブミン)と共にインキュベートすることによって覆われる。次に、モノクローナル抗体を、このモノクローナル抗体が、ポリスチレンディッシュに装着された任意のICE-LAP 3および4タンパク質に接着する時間、ディッシュ中でインキュベートする。全ての非結合モノクローナル抗体は、緩衝液で洗い流される。西洋ワサビペルオキシダーゼに結合されたレポーター抗体は、ここでディッシュ中に入れられ、ICE-LAP 3および4に結合した任意のモノクローナル抗体へのレポーター抗体の結合を生じる。次に、非接着レポーター抗体は洗い流される。次に、ペルオキシダーゼの基質がディッシュに加えられ、そして所定の時間内での発色量が、標準曲線と比較した場合の、所定量中の患者サンプルに存在するICE-LAP 3および4タンパク質の量の測定値である。
競合アッセイが使用され得る。ここでは、ICE-LAP 3および4に特異的な抗体が固体支持体に接着し、標識ICE-LAP 3および4ならびに宿主由来のサンプルが固体支持体上を流され、固体支持体に接着した検出された標識の量が、サンプル中のICE-LAP 3および4の量と相関し得る。
本発明の配列はまた、染色体の同定に有益である。この配列は、個々のヒト染色体上の特定の位置に対して特異的に標的付けられ、そしてその位置とハイブリダイズし得る。さらに、現在、染色体上の特定の部位を同定する必要がある。現在、染色***置のマーキングに利用可能な、実際の配列データ(反復多型)に基づく染色体マーキング標識試薬はほとんどない。本発明によるDNAの染色体へのマッピングは、これらの配列と疾患に関連する遺伝子とを相関させることにおいて重要な第1段階である。
簡略に述べれば、配列は、cDNAからPCRプライマー(好ましくは15〜25bp)を調製することにより染色体にマップされ得る。遺伝子の3'非翻訳領域のコンピューター解析が、ゲノムDNA中で1つより多いエキソンにまたがらず、従って増幅プロセスを複雑化しないプライマーを迅速に選択するために使用される。次いで、これらのプライマーは、個々のヒト染色体を含有する体細胞ハイブリッドのPCRスクリーニングに使用される。プライマーに対応するヒト遺伝子を含有するハイブリッドのみが増幅フラグメントを生じる。
体細胞ハイブリッドのPCRマッピングは、特定の染色体に特定のDNAを割り当てるための迅速な手順である。本発明を同じオリゴヌクレオチドプライマーと共に使用して、類似の様式で特定の染色体由来のフラグメントのパネルまたは大きなゲノムクローンのプールを用いて下位位置決め(sublocalization)が達成され得る。染色体にマップするために同様に使用され得る他のマッピングストラテジーは、インサイチュハイブリダイゼーション、標識したフローサイトメトリーで選別した(flow-sorted)染色体を用いるプレスクリーニング、および染色体特異的cDNAライブラリーを構築するためのハイブリダイゼーションによるプレ選択を包含する。
中期染色体展開物へのcDNAクローンの蛍光インサイチュハイブリダイゼーション(FISH)は、1工程で正確な染色***置を提供するために使用され得る。この技術は、少なくとも50または60塩基を有するcDNAで使用され得る。この技術の総説としては、Vermaら、Human Chromosomes: a Manual of Basic Techniques、Pregamon Press、New York(1988)を参照のこと。
一旦配列が正確な染色***置にマップされると、染色体上での配列の物理的な位置を遺伝子地図のデータと相関させ得る。このようなデータは、例えば、V.McKusick、Mendelian Inheritance in Manに見出される(Johns Hopkins University Welch Medical Libraryからオンラインで入手可能である)。次いで、同一の染色体領域にマップされている遺伝子と疾患との関係が、連鎖解析(物理的に隣接する遺伝子の同時遺伝)により同定される。
次に、罹患個体と非罹患個体との間のcDNAまたはゲノム配列の差異を決定する必要がある。変異がいくつかまたはすべての罹患個体に観察されるが正常な個体のいずれにも観察されない場合、この変異はこの疾患の原因因子であると思われる。
物理的マッピングおよび遺伝子マッピング技術の現在の分解能では、疾患に関連する染色体領域に正確に位置決めされたcDNAは、50と500との間の可能性のある原因遺伝子の1つであり得る。(これは、1メガ塩基のマッピング分解能で、そして20kbあたり1遺伝子と仮定する。)
このポリペプチド、そのフラグメントまたは他の誘導体、またはそれらのアナログ、あるいはそれらを発現する細胞は、それらに対する抗体を生成するための免疫原として使用され得る。これらの抗体は、例えば、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体であり得る。本発明はまた、キメラ抗体、単鎖抗体およびヒト化抗体、ならびにFabフラグメント、またはFab発現ライブラリーの産物を包含する。当該分野で公知の種々の手順が、このような抗体およびフラグメントの生成のために使用され得る。
本発明の配列に対応するポリペプチドに対して生成される抗体は、動物へのポリペプチドの直接注射により、または動物(好ましくは、非ヒト)にポリペプチドを投与することにより得られ得る。次いで、このようにして得られる抗体は、ポリペプチド自体に結合する。このようにして、ポリペプチドのフラグメントのみをコードする配列でさえも、天然のポリペプチド全体に結合する抗体を生成するために使用され得る。次いで、このような抗体は、そのポリペプチドを発現する組織からそのポリペプチドを単離するために使用され得る。
モノクローナル抗体の調製のために、連続的な細胞株培養物により産生される抗体を提供する任意の技術が使用され得る。例としては、ハイブリドーマ技術(KohlerおよびMilstein、1975、Nature、256: 495-497)、トリオーマ技術、ヒトB細胞ハイブリドーマ技術(Kozborら、1983、Immunology Today 4:72)、およびヒトモノクローナル抗体を生成するためのEBVハイブリドーマ技術(Coleら、1985、Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy、Alan R.Liss,Inc.、77-96頁)が挙げられる。
単鎖抗体を生成するために記載された技術(米国特許第4,946,778号)を、本発明の免疫原性ポリペプチド産物に対する単鎖抗体を生成するために適合させ得る。また、トランスジェニックマウスが、本発明の免疫原性ポリペプチド産物に対するヒト化抗体を発現させるために使用され得る。
本発明を以下の実施例を参照にしてさらに記載する;しかし、本発明はこのような実施例に限定されないことを理解されたい。すべての部または量は、他に明記しない限り重量基準である。
以下の実施例の理解を容易にするために、現れる頻度の高い特定の方法および/または用語を記載する。
「プラスミド」は、小文字のpの前および/または後の大文字および/または数字により示される。本明細書中の出発プラスミドは、市販であるか、制限基準なく公的に入手可能であるか、または公表された手順に従って入手可能なプラスミドから構築され得るかのいずれかである。さらに、記載されるプラスミドと等価なプラスミドが当該分野で公知であり、そして当業者には明らかである。
DNAの「消化」は、DNA中の特定の配列でのみ作用する制限酵素でそのDNAを触媒的に切断することをいう。本明細書中で使用される種々の制限酵素は、市販されており、そしてそれらの反応条件、補因子、および他の必要条件は当業者に公知のものが使用された。分析目的には、代表的には1μgのプラスミドまたはDNAフラグメントを、約2単位の酵素とともに約20μlの緩衝溶液中で使用する。プラスミド構築のためのDNAフラグメントを単離する目的のために、代表的には5〜50μgのDNAを20〜250単位の酵素で、より大きな容量中で消化する。特定の制限酵素のための適切な緩衝液および基質量は、製造者により特定される。37℃での約1時間のインキュベーション時間が通常使用されるが、これは供給者の説明書に従って変化し得る。消化後、反応物をポリアクリルアミドゲルで直接電気泳動して所望のフラグメントを単離する。
切断されたフラグメントのサイズ分離は、Goeddel,D.ら、Nucleic Acids Res.、8:4057(1980)により記載された8%ポリアクリルアミドゲル、またはアガロースゲル(0.5〜1.5%)を使用して行われる。
「オリゴヌクレオチド」は、一本鎖ポリデオキシヌクレオチドまたは2つの相補的なポリデオキシヌクレオチド鎖のいずれかをいい、これらは化学的に合成され得る。このような合成オリゴヌクレオチドは、5'リン酸を有さず、従ってキナーゼの存在下でリン酸とATPとを添加しなければ別のオリゴヌクレオチドに連結しない。合成オリゴヌクレオチドは、脱リン酸化されていないフラグメントに連結する。
「連結」は、2つの二本鎖核酸フラグメントの間でリン酸ジエステル結合を形成するプロセスをいう(Maniatis,T.ら、前出、146頁)。他に提供しない限り、連結は、ほぼ等モル量の連結されるべきDNAフラグメント0.5μgあたり10単位のT4 DNAリガーゼ(「リガーゼ」)とともに、公知の緩衝液および条件を用いて達成され得る。
他に記載しない限り、形質転換はGraham,F.およびVan der Eb,A.、Virology、52:456-457(1973)の方法に記載されるように行った。
実施例1
ICE-LAP-3の細菌発現および精製
最初に、ICE-LAP-3をコードするDNA配列(ATCC第75875号)を、プロセスされたICE-LAP-3タンパク質(シグナルペプチド配列がない)の5'配列およびICE-LAP-3遺伝子に対して3'側のベクター配列に対応するPCRオリゴヌクレオチドプライマーを使用して増幅する。ICE-LAP-3に対応するさらなるヌクレオチドをそれぞれ5'および3’配列に付加する。5'オリゴヌクレオチドプライマーは、配列5'GATCGGATTCATGCGTGCGGGGACACGGGTC3’(配列番号5)を有し、BamHI制限酵素部位(下線)、続いてプロセスされたタンパク質コドンの推定末端アミノ酸から開始する18ヌクレオチドのICE-LAP-3コード配列を含む。3’配列である5’GTACTCTAGATCATTCACCCTGGTGGAGGAT3’(配列番号6)は、XbaI部位に相補的な配列(下線)に続いて21ヌクレオチドのICE-LAP-3コード配列を含む。制限酵素部位は、細菌発現ベクターpQE-9(Qiagen,Inc.9259 Eton Avenue,Chatsworth,CA,91311)の制限酵素部位に対応する。pQE-9は、抗生物質耐性(Ampr)、細菌の複製起点(ori)、IPTG調節可能プロモーターオペレーター(P/O)、リボソーム結合部位(RBS)、6-Hisタグ、および制限酵素部位をコードする。次いで、pQE-9をBamHIおよびXbaIで消化する。増幅配列をpQE-9に連結し、そしてヒスチジンタグおよびRBSをコードする配列とインフレームで挿入する。次いで、連結混合物を用いて、Qiagenから商標M15/rep4で入手可能なE.coliを、Sambrook,J.ら、Molecular Cloning: A Laboratory Manual,Cold Spring Laboratory Press,(1989)に記載の手順により形質転換する。M15/rep4はプラスミドpREP4の多数のコピーを含み、そのプラスミドは、lacIリプレッサーを発現させ、そしてカナマイシン耐性(Kanr)をも与える。形質転換体をLBプレートでのその増殖能力によって同定し、そしてアンピシリン/カナマイシン耐性コロニーを選択する。プラスミドDNAを単離し、そして制限分析によって確認する。所望の構築物を含むクローンを、Amp(100μg/ml)およびKan(25μg/ml)の両方を補充したLB培地中で液体培養で一晩(O/N)増殖させる。O/N培養物を使用して1:100から1:250の割合で大量培養物(large culture)に接種する。細胞を0.4と0.6の間の光学密度600(O.D.600)まで増殖させる。次に、IPTG(「イソプロピル-B-D-チオガラクトピラノシド」)を1mMの最終濃度まで加える。IPTGはlacIリプレッサーを不活化することによって、遺伝子発現の増加を導くP/Oの解除を誘導する。細胞を余分に3〜4時間増殖させる。次に、細胞を遠心分離によって集める。細胞ペレットをカオトロピック試薬6MグアニジンHClで可溶化する。明瞭化後、可溶化したICE-LAP-3を、6-Hisタグを含むタンパク質による堅固な結合を可能にする条件下で、ニッケルキレートカラム上でのクロマトグラフィーによってこの溶液から精製する(Hochuli,E.ら、J.Chromatography 411:177-184(1984))。ICE-LAP-3(95%純度)を、6モルのグアニジンHCl(pH5.0)でカラムから溶出し、そして再生の目的には、3MグアニジンHCl、100mMリン酸ナトリウム、10mMグルタチオン(還元型)および2mMグルタチオン(酸化型)に調整する。この溶液中で12時間インキュベートした後、タンパク質を10mMリン酸ナトリウムに透析した。
実施例2
ICE-LAP-4の細胞発現および精製
最初に、ICE-LAP-4をコードするDNA配列(ATCC第75873号)を、プロセスされたICE-LAP-4タンパク質(シグナルペプチド配列がない)の5’配列およびICE-LAP-4遺伝子に対して3'側のベクター配列に対応するPCRオリゴヌクレオチドプライマーを使用して増幅する。ICE-LAP-4に対応するさらなるヌクレオチドをそれぞれ5'および3’配列に付加する。5'オリゴヌクレオチドプライマーは、配列5'GATCGGATCCATGGAGAACACTGAAAACTCA3’(配列番号7)を有し、BamHI制限酵素部位(下線)、続いてプロセスされたタンパク質コドンの推定末端アミノ酸から開始する18ヌクレオチドのICE-LAP-4コード配列を含む。3’配列である5’GTACTCTAGATTAGTGATAAAAATAGAGTTC3’(配列番号8)は、XbaI部位に相補的な配列(下線)に続いて21ヌクレオチドのICE-LAP-4コード配列を含む。制限酵素部位は、細菌発現ベクターpQE-9(Qiagen,Inc.9259 Eton Avenue,Chatsworth,CA,91311)の制限酵素部位に対応する。pQE-9は、抗生物質耐性(Ampr)、細菌の複製起点(ori)、IPTG調節可能プロモーターオペレーター(P/O)、リボソーム結合部位(RBS)、6-Hisタグ、および制限酵素部位をコードする。次いで、pQE-9をBamHIおよびXbaIで消化する。増幅配列をpQE-9に連結し、そしてヒスチジンタグおよびRBSをコードする配列とインフレームで挿入する。次いで、連結混合物を用いて、Qiagenから商標M15/rep4で入手可能なE.coliを、Sambrook,J.ら、Molecular Cloning: A Laboratory Manual,Cold Spring Laboratory Press,(1989)に記載の手順により形質転換する。M15/rep4はプラスミドpREP4の多数のコピーを含み、そのプラスミドは、lacIリプレッサーを発現させ、カナマイシン耐性(Kanr)をも与える。形質転換体をLBプレートでのその増殖能力によって同定し、そしてアンピシリン/カナマイシン耐性コロニーを選択する。プラスミドDNAを単離し、そして制限分析によって確認する。所望の構築物を含むクローンを、Amp(100μg/ml)およびKan(25μg/ml)の両方を補充したLB培地中で液体培養で一晩(O/N)増殖させる。O/N培養物を1:100から1:250の割合で大量培養物に接種する。細胞を0.4と0.6の間の光学密度600(O.D.600)まで増殖させる。次に、IPTG(「イソプロピル-B-D-チオガラクトピラノシド」)を1mMの最終濃度まで加える。IPTGはlacIリプレッサーを不活化し、遺伝子発現の増加を導くP/Oの解除を誘導する。細胞を余分に3〜4時間増殖させる。次に、細胞を遠心分離によって集める。細胞ペレットをカオトロピック試薬6MグアニジンHClで可溶化する。明瞭化後、可溶化したICE-LAP-4を、6-Hisタグを含むタンパク質による堅固な結合を可能にする条件下で、ニッケルキレートカラム上でのクロマトグラフィーによってこの溶液から精製する(Hochuli,E.ら、J.Chromatography 411:177-184(1984))。ICE-LAP-4(95%純度)を、6MグアニジンHCl(pH5.0)でカラムから溶出し、そして再生の目的には、3MグアニジンHCl、100mMリン酸ナトリウム、10mMグルタチオン(還元型)および2mMグルタチオン(酸化型)に調整する。この溶液中で12時間インキュベートした後、タンパク質を10mMリン酸ナトリウムに透析した。
実施例3
COS細胞における組換えICE-LAP-3の実現
プラスミド(ICE-LAP-3HA)の発現は、以下を含むベクターpcDNAI/Amp(Invitrogen)に由来する:1)SV40複製起点、2)アンピシリン耐性遺伝子、3)E.coli複製起点、4)CMVプロモーター、それに続くポリリンカー領域、SV40イントロンおよびポリアデニル化部位。全ICE-LAP-3前駆体をコードするDNAフラグメントおよびその3'末端にインフレームで融合したHAタグを、ベクターのポリリンカー領域にクローン化した。従って、組換えタンパク質発現は、CMVプロモーター下の支配を受ける。HAタグは、前記のインフルエンザヘマグルチニンタンパク質由来のエピトープに対応する(I.Wilson、H.Niman、R.Heighten、A.Cherenson、M.Connolly、およびR.Lerner、1984、Cell 37、767)。本発明者らの目標であるタンパク質に対するHAタグの融合は、HAエピトープを認識する抗体を用いる、組換えタンパク質の容易な検出を可能にする。
プラスミド構築ストラテジーは、以下の通りである:
ICE-LAP-3をコードするDNA配列(ATCC第75875号)を、2つのプライマーを用いて、完全長のICE-LAP-3に対するPCRにより構築した:5'プライマー(5'GACTATGCGTGCGGGGACACGG3'(配列番号9))は、ICE-LAP-3翻訳開始部位ATG、続いて開始コドンから始まるICE-LAP-3コード配列の5ヌクレオチドを含有する;3'配列である5'AATCAAGCGTAGTCTGGGACGTCGTATGGGTATTCACCCTGGTGGAGGATTTG3'(配列番号10)は、翻訳停止コドン、HAタグおよびICE-LAP-3コード配列の最後の21ヌクレオチド(停止コドンを含まない)を含有する。従って、PCR産物は、ICE-LAP-3コード配列、続いてインフレームに融合したHAタグ、およびHAタグに隣接する翻訳終止停止コドンを含有する。PCR増幅DNAフラグメントを、平滑末端連結によりpcDNAI/Ampと連結した。連結混合物を、E.coli株SURE(Stratagene Cloning Systems、11099 North Torrey Pines Road、La Jolla、CA 92037から入手可能)に形質転換した。形質転換培養物をアンピシリン培地プレート上に播種して、そして耐性コロニーを選択した。プラスミドDNAを、形質転換体から単離し、そして正しいフラグメントの存在について制限分析により検査した。組換えICE-LAP-3の発現のために、COS細胞を、DEAEデキストラン法により発現ベクターを用いてトランスフェクトした(J.Sambrook、E.Fritsch、T.Maniatis、Molecular Cloning:A Laboratory Manual、Cold Spring Laboratory Press、(1989))。ICE-LAP-3HAタンパク質の発現を、放射標識法および免疫沈降法により検出した(E.Harlow、D.Lane、Antibodies:A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Laboratory Press、(1988))。細胞を、トランスフェクションの2日後に35S-システインで8時間標識した。次いで培養培地を採集し、そして細胞を界面活性剤で溶解した(RIPA緩衝液(150mM NaCl、1%Np-40、0.1%SDS、1%NP-40、0.5%DOC、50mM Tris、pH 7.5)(Wilson,I.ら、前出37:767(1984))。細胞溶解物および培養培地の両方を、HA特異的モノクローナル抗体で沈澱させた。沈澱したタンパク質を、15%SDS-PAGEゲルで分析した。
実施例4
COS細胞における組み換えICE-LAP-4の発現
プラスミド(ICE-LAP-4HA)発現は、以下を含むベクターpcDNAI/Amp(Invitrogen)に由来する:1)SV40複製起点、2)アンピシリン耐性遺伝子、3)E.coli複製起点、4)CMVプロモーター、それに続くポリリンカー領域、SV40イントロンおよびポリアデニル化部位。全ICE-LAP-4前駆体およびその3'末端にインフレームで融合したHAタグをコードするDNAフラグメントを、ベクターのポリリンカー領域にクローン化した。従って、組換えタンパク質発現は、CMVプロモーター下の支配を受ける。HAタグは、前記のインフルエンザヘマグルチニンタンパク質由来のエピトープに対応する(I.Wilson、H.Niman、R.Heighten、A.Cherenson、M.Connolly、およびR.Lerner、1984、Cell 37、767)。本発明者らの目標タンパク質に対するHAタグの融合は、HAエピトープを認識する抗体を用いる、組換えタンパク質の容易な検出を可能にする。
プラスミド構築ストラテジーは、以下の通りである:
ICE-LAP-4(ATCC # 75873)をコードするDNA配列を、2つのプライマーを用いて、完全長のICE-LAP-4に対するPCRにより構築した:5'プライマー(5'ACCATGGAGAACACTGAAAAC3'(配列番号11))は、ICE-LAP-4翻訳開始部位(ATG)、続いて開始コドンから始まるICE-LAP-4コード配列の15ヌクレオチドを含有する;3'配列(5'AATCAAGCGTAGTCTGGGACGTCGTATGGGTAGTGATAAAAATAGAGTTCTTT 3'(配列番号12))は、翻訳停止コドン、HAタグおよびICE-LAP-4コード配列の最後の21ヌクレオチド(停止コドンを含まない)を含有する。従って、PCR産物は、ICE-LAP-4コード配列、続いてインフレームに融合したHAタグ、およびHAタグに隣接する翻訳終止停止コドンを含有する。PCR増幅DNAフラグメントを、平滑末端連結によるpcDNAI/Ampと連結した。連結混合物を、E.coli株SURE(Stratagene Cloning Systems、11099 North Torrey Pines Road、La Jolla、CA 92037から入手可能)に形質転換した。形質転換培養物をアンピシリン培地プレート上に播種し、そして耐性コロニーを選択した。プラスミドDNAを、形質転換体から単離し、そして正しいフラグメントの存在について制限分析により検査した。組換えICE-LAP-4の発現のために、COS細胞を、DEAEデキストラン法により発現ベクターを用いてトランスフェクトした(J.Sambrook、E.Fritsch、T.Maniatis、Molecular Cloning:A Laboratory Manual、Cold Spring Laboratory Press、(1989))。ICE-LAP-4HAタンパク質の発現を、放射標識法および免疫沈降法により検出した(E.Harlow、D.Lane、Antibodies:A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Laboratory Press、(1988))。細胞を、トランスフェクションの2日後に35S-システインで8時間標識した。次いで培養培地を採集し、そして細胞を界面活性剤で溶解した(RIPA緩衝液(150mM NaCl、1%NP-40、0.1%SDS、1%NP-40、0.5%DOC、50mM Tris、pH 7.5)(Wilson,I.ら、前出37:767(1984))。細胞溶解物および培養培地の両方を、HA特異的モノクローナル抗体で沈澱させた。沈澱したタンパク質を15%SDS-PAGEゲルで分析した。
実施例5
ヒト組織におけるICE-LAP-3の発現パターン
ノーザンブロット分析を行い、ヒト組織におけるICE-LAP-3の発現レベルを検査した。細胞の全RNAサンプルを、RNAzolTMBシステム(Biotecx Laboratories,Inc.6023 South Loop East、Houston、TX 77033)で単離した。指定のヒト組織それぞれから単離された約10μgの全RNAを1%アガロースゲルで分離し、そしてナイロンフィルター上にブロットした(Sambrook、Fritsch、およびManiatis、Molecular Cloning、Cold Spring Harbor Press、(1989))。標識反応を、50ngのDNAフラグメントを用いてStratagene Prime-Itキットに従って行った。標識されたDNAを、Select-G-50カラムで精製した。(5Prime−3Prime,Inc.5603 Arapahoe Road、Boulder、CO 80303)。次いで、フィルターを、1,000,000cpm/mlで放射活性標識された完全長のICE-LAP-3遺伝子と、0.5M NaPO4(pH7.4)および7%SDS中、65℃で一晩、ハイブリダイズした。0.5×SSC、0.1%SDSを用いて、室温で2回、そして60℃で2回洗浄した後、次いでフィルターを、-70℃で増感スクリーン(intensifying screen)とともに一晩曝した。ICE-LAP-3のメッセージRNAは、肝臓において豊富である。
実施例6
ヒト組織におけるICE-LAP-4の発現パターン
ノーザンブロット分析を行い、ヒト組織におけるICE-LAP-4の発現レベルを検査した。細胞の全RNAサンプルを、RNAzolTMBシステム(Biotecx Laboratories,Inc.6023 South Loop East、Houston、TX 77033)で単離した。指定のヒト組織それぞれから単離された約10μgの全RNAを1%アガロースゲルで分離し、そしてナイロンフィルター上にブロットした。(Sambrook、Fritsch、およびManiatis、Molecular Cloning、Cold Spring Harbor Press、(1989))。標識反応を、50ngのDNAフラグメントを用いてStratagene Prime-Itキットに従って行った。標識されたDNAを、Select-G-50カラムで精製した。(5Prime−3Prime,Inc.5603 Arapahoe Road、Boulder、CO 80303)。次いで、フィルターを、1,000,000cpm/mlで放射活性標識された完全長のICE-LAP-4遺伝子と、0.5M NaPO4(pH7.4)および7%SDS中、65℃で一晩、ハイブリダイズした。0.5×SSC、0.1%SDSを用いて、室温で2回、そして60℃で2回洗浄した後、次いでフィルターを、−70℃で増感スクリーンとともに一晩曝した。
実施例7
遺伝子治療による発現
線維芽細胞を皮膚生検により被験体から得る。得られた組織を組織培養培地に置き、そして小片に分離する。組織の小片を組織培養フラスコの湿潤表面に置き、約10個の小片を各フラスコに置く。フラスコを上下逆にして、きつく閉め、そして一晩室温に放置する。室温で24時間後、フラスコを逆にし、組織の小片をフラスコの底に固定したままにし、そして新鮮な培地(例えば、10%FBS、ペニシリンおよびストレプトマイシンを含むHam's F12培地)を加える。次に、これを約1週間37℃でインキュベートする。この時に、新鮮な培地を加え、その後、数日毎に培地を変える。その培養でさらに2週間後、単層の線維芽細胞が現れる。単層をトリプシン処理し、そしてより大きなフラスコに落とす。
モロニーマウス肉腫ウイルスの長末端反復の側面に位置するpMV-7(Kirschmeier,P.T.ら、DNA,7:219-25(1988))をEcoRIおよびHindIIIで消化し、そしてその後、子牛腸ホスファターゼで処理する。線状ベクターをアガロースゲルで分画し、そしてガラスビーズを使用して精製する。
本発明のポリペプチドをコードするcDNAを、それぞれ5’および3’末端配列に対応するPCRプライマーを使用して増幅する。EcoRI部位を含む5’プライマーおよび3’プライマーはさらにHindIII部位を含む。等量のモロニーマウス肉腫ウイルス線状骨格ならびに増幅されたEcoRIおよびHindIIIフラグメントを、T4DNAリガーゼの存在下で共に加える。得られた混合物を、2つのフラグメントの連結に適切な条件下で維持する。連結混合物を使用して、細菌HB101を形質転換し、次にそれをベクターが適切に挿入された目的の遺伝子を有することを確認する目的のために、カナマイシンを含む寒天に播種する。
両種性pA317またはGP+am12パッケージ細胞を、10%子牛血清(CS)、ペニシリンおよびストレプトマイシンを含むDulbecco改変Eagles培地(DMEM)中で密集密度まで組織培養で増殖させる。次に、遺伝子を含むMSVベクターを培地に加え、パッケージ細胞をベクターで形質導入する。パッケージ細胞は、この時点で遺伝子を含む感染性ウイルス粒子を産生する(ここで、パッケージ細胞は産生細胞と呼ばれる)。
新鮮な培地を形質導入された産生細胞に加え、その後、その培地を密集産生細胞の10cmプレートから集める。感染性ウイルス粒子を含む消費された培地を、分離した産生細胞を取り出すためにミリポアフィルターに通して濾過し、次にこの培地を線維芽細胞を感染させるために使用する。培地を線維芽細胞の亜密集プレートから取り除き、そして素早く産生細胞からの培地と取り替える。この培地を取り除き、そして新鮮な培地に取り替える。ウイルスの力価が高ければ、実質的に全ての線維芽細胞が感染し、そして選択を必要としない。力価が非常に低ければ、選択マーカー(例えば、neoまたはhis)を有するレトロウイルスベクターを使用する必要がある。
次に、操作された線維芽細胞を、単独またはcytodex3マイクロキャリアービーズ上で密集するまで増殖させた後のいずれかで宿主に注射する。ここで、線維芽細胞はタンパク質産物を産生する。
本発明の多くの改変および変形は、上記の教示に照らして可能であり、従って添付の請求の範囲内で、本発明は、具体的に記載される以外にも実施し得る。
配列表
(1)一般的情報:
(i)出願人:リーら
(ii)発明の名称:インターロイキン-1β転換酵素様アポトーシスプロテアーゼ-3および4
(iii)配列数:12
(iv)連絡住所:
(A)名称:カレラ,バーン,ベイン,ギルフィラン,ケッチ,スチュワート アンド オルステイン
(B)番地:ベッカー ファーム ロード 6
(C)市:ローズランド
(D)州:ニュージャージー
(E)国:アメリカ合衆国
(F)郵便番号:07068
(v)コンピューター読み出し形態:
(A)媒体型:3.5インチ ディスケット
(B)コンピューター:IBM PS/2
(C)OS:MS-DOS
(D)ソフトウェア:ワードパーフェクト5.1
(vi)現在の出願データ
(A)出願番号:
(B)出願日:同時
(C)分類:
(vii)先願データ:
(A)出願番号:08/334,251
(B)出願日:1994年11月1日
(viii)代理人/事務所情報:
(A)氏名:フェラロ,グレゴリー ディー.
(B)登録番号:36,134
(C)照会/記録番号:325800-???
(ix)電話回線情報:
(A)電話:201-994-1700
(B)テレファックス:201-994-1744
(2)配列番号1の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:1371塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:cDNA
(xi)配列:配列番号1:
(2)配列番号2の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:341アミノ酸
(B)型:アミノ酸
(C)鎖の数:
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:タンパク質
(xi)配列:配列番号2:
(2)配列番号3の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:1159塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:cDNA
(xi)配列:配列番号3:
(2)配列番号4の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:277アミノ酸
(B)型:アミノ酸
(C)鎖の数:
(D)トポロジー:直鎖状2
(ii)配列の種類:タンパク質
(xi)配列:配列番号4:
(2)配列番号5の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:31塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:オリゴヌクレオチド
(xi)配列:配列番号5:
(2)配列番号6の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:31塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:オリゴヌクレオチド
(xi)配列:配列番号6:
(2)配列番号7の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:31塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:オリゴヌクレオチド
(xi)配列:配列番号7:
(2)配列番号8の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:31塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:オリゴヌクレオチド
(xi)配列:配列番号8:
(2)配列番号9の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:22塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:オリゴヌクレオチド
(xi)配列:配列番号9:
(2)配列番号10の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:53塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:オリゴヌクレオチド
(xi)配列:配列番号10:
(2)配列番号11の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:21塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:オリゴヌクレオチド
(xi)配列:配列番号11:
(2)配列番号12の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:53塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:オリゴヌクレオチド
(xi)配列:配列番号12:
Claims (22)
- 単離されたポリヌクレオチドであって、以下からなる群より選択されるメンバーを含有するポリヌクレオチド:
(a)配列番号4に記載のアミノ酸1〜アミノ酸277を含有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド;および
(b)(a)のポリヌクレオチドに対して少なくとも95%の同一性があるポリヌクレオチドであって、該ポリヌクレオチドは、異常に制御されたアポトーシスを処置する能力を有するポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド。 - 前記ポリヌクレオチドがDNAである、請求項1に記載のポリヌクレオチド。
- 前記ポリヌクレオチドがRNAである、請求項1に記載のポリヌクレオチド。
- 前記ポリヌクレオチドがゲノムDNAである、請求項1に記載のポリヌクレオチド。
- 単離されたポリヌクレオチドであって、以下からなる群より選択されるメンバーを含有するポリヌクレオチド:
(a)ATCC受託番号75873に含まれるDNAにより発現されるアミノ酸配列を有する成熟ポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド;および
(b)(a)のポリヌクレオチドに対して少なくとも95%の同一性があるポリヌクレオチドであって、該ポリヌクレオチドは、異常に制御されたアポトーシスを処置する能力を有するポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド。 - 請求項2に記載のDNAを含有するベクター。
- 請求項6に記載のベクターにより遺伝子操作される宿主細胞。
- ポリペプチドを生成する方法であって、前記DNAによりコードされるポリペプチドが、請求項7に記載の宿主細胞から発現される工程を包含する、方法。
- 請求項6に記載のベクターで、細胞を遺伝子操作する工程を包含する、ポリペプチドを発現し得る細胞を作製するための方法。
- ポリペプチドであって、以下からなる群より選択されるポリペプチド:
(i)請求項1〜5のいずれか1項に記載のポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド;(ii)配列番号4の推定アミノ酸配列を有するポリペプチド;および(iii)ATCC受託番号75873のcDNAによりコードされるポリペプチド。 - 請求項10に記載のポリペプチドを阻害する化合物を同定するための方法であって、該ポリペプチドとその天然の基質および化合物とを、該基質が該ポリペプチドにより正常に切断される条件下で接触させる工程、および切断された基質が存在しないことを検出することにより、該化合物が該ポリペプチドを阻害するかどうかを決定する工程を包含する、方法。
- 異種ポリヌクレオチドに融合された、請求項1〜2および5のいずれか1項に記載のポリヌクレオチド。
- 前記異種ポリヌクレオチドが異種ポリペプチドをコードする、請求項12に記載のポリヌクレオチド。
- 前記異種ポリペプチドが、前記ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドに融合される、請求項13に記載のポリヌクレオチド。
- 前記ポリヌクレオチドが、調節制御配列に作動可能に連結される、請求項6に記載のベクター。
- 原核生物細胞、真核生物細胞、脊椎動物細胞、Cos細胞、CHO細胞またはE.coli細胞である、請求項7に記載の宿主細胞。
- 標識されるか、またはポリエチレングリコールに融合される、請求項10に記載のポリペプチド。
- 異種ポリペプチドに融合される、請求項10に記載のポリペプチド。
- N末端メチオニンを欠失する、請求項10に記載のポリペプチド。
- N末端メチオニンを有する、請求項10に記載のポリペプチド。
- 請求項10に記載のポリペプチドに特異的に結合する、抗体。
- ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、単鎖抗体、単鎖Fv抗体またはFabフラグメントである、請求項21に記載の抗体。
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